i T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
advertisement
i T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ( YÜKSEK LİSANS TEZİ ) TÜBERKÜLOZ DIŞI MASTİTLERİN ETİYOLOJİSİNDE ROL ALAN AEROP VE ANAEROP BAKTERİLERİN DAĞILIMI VE ANTİMİKROBİK MADDELERE DİRENÇ DURUMLARI ZEYNEP TANER DANIŞMAN PROF. DR. HRİSİ BAHAR TOKMAN TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI MİKROBİYOLOJİ PROGRAMI İSTANBUL-2015 ii TEZ ONAYI iii BEYAN iv İTHAF Anneme ve Babama ithaf ediyorum. v TEŞEKKÜR Eğitim ve öğrenimim boyunca değerli bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım hocamız, Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Nuri KİRAZ'a, Yüksek lisans eğitimime başladığım günden itibaren sevgisini, hoşgörüsünü, disiplinini ve azmini örnek aldığım, tezimin planlanmasında ve yüksek lisans eğitimimin her aşamasında benden desteğini esirgemeyen, bilgi ve tecrübeleriyle beni yönlendiren, her konuda ilgi, şefkat ve anlayış gösteren değerli danışman hocam Sayın Prof. Dr. Hrisi BAHAR TOKMAN’a, Yetişmemde çok emekleri geçen değerli hocalarımız Sayın Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK, Prof.Dr.Arif KAYGUSUZ, Prof. Dr. Murat HÖKELEK, Prof. Dr. Gökhan AYGÜN, Prof. Dr. Ömer KÜÇÜKBASMACI, Prof. Dr. Nevriye GÖNÜLLÜ, Prof. Dr. Murat GÜNAYDIN,Prof. Dr. Kenan MİDİLLİ, Doç.Dr. Fatma KÖKSAL ÇAKIRLAR,Doç. Dr. Yavuz UYAR, Doç. Dr. Sevgi ERGİN, Doç. Dr. Mustafa ASLAN, Doç. Dr. Suat SARIBAŞ, Yrd. Doç. Dr. Erdal POLAT ve PhD. Mert Ahmet KUŞKUCU 'ya, Tez çalışmam için gereken desteği esirgemeyen İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof. Dr. Ertuğrul GÖKSOY’a ayrıcaGenel Cerrahi Anabilim Dalı’ndan, Prof. Dr. Varol ÇELİK, Uzman Dr. Mehmet VELİDEDEOĞLU, Asistan Dr. Fatih DAL, Asistan Dr. Yasemin KÜÇÜK ve çalışma arkadaşlarına ve Enfeksiyon Hastalıkları Anabilim Dalı’ndan Doç. Dr. Birgül METE’ye, Bana olan desteklerini ile sürekli yanımda hissettiğim, tez çalışmamın laboratuvar aşamasında yardımlarını benden esirgemeyen çok değerli doktora öğrencisi Msc. Mehmet DEMİRCİ’ye, İlgi ve desteklerini benden esirgemeyen çok sevgili arkadaşlarım, Msc. Fatma KALAYCI, Biy. Harika Öykü DİNÇ, Ecz. Nergiz İMAMOVA, Msc. Esra BAKIR, Biy. Eylül Yağmur DOĞANTÜRK, Biy. Ezgi Gözün ŞAYLAN ve Biy. Okan AYDOĞAN’a, Tecrübelerinden her zaman faydalandığımız sevgili doktora öğrencilerine ve çok değerli uzmanlık öğrencilerine, vi Çalıştığı laboratuvarın kapılarını ardına kadar açan sevgili Nida KÜÇÜK AYDIN’a, yardımlarını esirgemeyen sevgili Nuray KÜRK, Tuba SOYSAL, Mustafa KIRKAN, Orhan YATMAZ, Nihat DOĞAN ve Yılmaz TAŞDEMİR’e ve tüm mikrobiyoloji kürsüsü emekçilerine, Moral desteğini ve yardımlarını esirgemeyen sevgili Msc. Aykut KURT’a, Ve tabii ki bugüne kadar her zaman desteklerini arkamda hissettiğim iyi ki var dediğim sevgili ailem, özellikle tezimin her aşamasında emeği geçen sevgili kardeşim Ece TANER´e ve kıymetli dostum Beril KALEAĞASI’na, Sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 48735 vii İÇİNDEKİLER TEZ ONAYI ..................................................................................................................... İ BEYAN ...........................................................................................................................İİİ İTHAF ............................................................................................................................ İV TEŞEKKÜR..................................................................................................................... V İÇİNDEKİLER ............................................................................................................. Vİİ TABLOLAR LİSTESİ ..................................................................................................... X ŞEKİLLER LİSTESİ ..................................................................................................... Xİ SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ ............................................................... Xİİ ÖZET .......................................................................................................................... XİV ABSTRACT.................................................................................................................. XV 1. GİRİŞ VE AMAÇ .........................................................................................................1 2. GENEL BİLGİLER ......................................................................................................3 2.1. Tarihçe .....................................................................................................................3 2.2. Memenin Anatomik Yapısı ......................................................................................3 2.3. Meme Hastalıkları ....................................................................................................5 2.3.1. Mastit ..................................................................................................................5 2.3.1.1. Laktasyonel Mastit .........................................................................................6 2.3.1.2. Non-laktasyonel Mastit ..................................................................................7 2.3.1.3. Meme Apsesi ..................................................................................................8 2.3.2. Mastitlerin Patogenezi.........................................................................................9 2.3.2.1. Laktasyonel Mastit Patogenezi ......................................................................9 2.3.2.2. Non-laktasyonel Mastitlerin Patogenezi ........................................................9 2.3.2.3. Meme Apseleri Patogenezi ..........................................................................11 2.3.3. Mastit Etiyolojisinde Rol Alan Bakteriler ........................................................11 2.4. Biyofilm .................................................................................................................16 2.5. Bakteri Tanımlaması ..............................................................................................17 2.5.1. Konvansiyonel Yöntemlerle Tanı .....................................................................17 2.5.2. Yarı -Otomatize Yöntemlerle Tanı ...................................................................19 2.5.3. Otomatize Sistemlerle Tanı ...............................................................................20 2.5.4. Moleküler Yöntemlerle Tanı .............................................................................20 viii 2.5.4.1. 16S rRNA Analizi ........................................................................................21 2.6. Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri ........................................................................21 2.7. Duyarlılık testlerinde kullanılan antibiyotikler ......................................................24 2.8. İstatistiksel yöntemler ............................................................................................31 3. GEREÇ VE YÖNTEM ...............................................................................................32 3.1. Gereçler ..................................................................................................................33 3.1.1. Kullanılan Besiyerleri .......................................................................................33 3.1.1.1. Aerop Kültürler İçin Kullanılan Besiyerleri ................................................33 3.1.1.2. Anaerop Kültürler İçin Kullanılan Besiyerleri .............................................38 3.1.2. Kullanılan Stok Solüsyonlar .............................................................................42 3.1.3. Kullanılan Ayıraçlar ..........................................................................................42 3.1.4. Bakterilerin Tanımlanmasında Kullanılan Diskler ...........................................43 3.1.4.1. Antibiyotik diskleri ......................................................................................43 3.1.5. Aerop ve Anaerop Bakterilerin Moleküler Yöntemlerle Tanımlanmasında Kullanılan Gereçler .....................................................................................................44 3.1.5.1. DNA İzolasyonunda Kullanılan Kit .............................................................44 3.1.5.2. Agaroz Jel Hazırlanmasında Kullanılan Gereçler ........................................44 3.1.5.3. 16S rRNA'nın PZR Amplifikasyonunda Kullanılan Gereçler .....................44 3.1.5.4. 16S rRNA Gen Bölgesinin Dizileme Çalışmasında Kullanılan Gereçler ....45 3.2. Yöntemler ..............................................................................................................45 3.2.1. Hastalara Ait Formların Doldurulması .............................................................45 3.2.2. Hastalardan Örnek Alınması ve Laboratuvara Taşınması ................................46 3.2.3. Besiyerlerine ekim, aerop/anaerop ortamların sağlanması ve inkübasyon .......46 3.2.4. Aerop Bakterilerin İzolasyon ve Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler......46 3.2.4.1. Gram Pozitif Diplokokların Tanımlanması ..................................................47 3.2.4.2. Gram Negatif Çomakların Tanımlanması ....................................................49 3.2.4.3. Gram Pozitif Çomakların Tanımlanması .....................................................51 3.2.5. Anaerop Bakterilerin İzolasyon ve Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler ..51 3.2.6. Aerop ve Anaerop Bakterilerin Tanısında Kullanılan Moleküler Yöntemler...51 3.2.6.1. DNA İzolasyonu...........................................................................................51 3.2.6.2. DNA Miktar Tayini ve DNA Saflık Derecesinin Belirlenmesi ...................52 3.2.6.3. Agaroz Jel Elektroforezi ..............................................................................52 3.2.6.4. 16S rRNA'nın PZR Amplifikasyonu............................................................52 ix 3.2.6.5. 16S rRNA Gen Bölgesinin Dizileme Çalışması ..........................................54 3.2.6.6. 16S rRNA Sekans Verilerinin Analizi .........................................................54 3.2.7. Aerop ve Anaerop Bakterilerin Antimikrobiyal Duyarlılığının Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler ..................................................................................................54 3.2.8. İstatistiksel yöntemler .......................................................................................55 4. BULGULAR ...............................................................................................................56 5. TARTIŞMA ................................................................................................................70 KAYNAKLAR ...............................................................................................................90 FORMLAR ...................................................................................................................101 ETİK KURUL KARARI ..............................................................................................102 ÖZGEÇMİŞ ..................................................................................................................103 x TABLOLAR LİSTESİ Tablo 3-1: 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu için kullanılacak reaksiyon karışımının hazırlanışı ........................................................................................................................ 53 Tablo 3-2: 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu için kullanılacak reaksiyon karışımının transfer işleminden sonra PZR reaksiyonu için belirtilen şartlar. ................................... 54 Tablo 4-1: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hastalarda yaş aralığı ve yaş ortalaması. ....................................................................................................................... 57 Tablo 4-2: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hastalara ait özelliklerin dağılımı. . ........................................................................................................................................ 58 Tablo 4-3: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalarda üreyen aerop bakterilerin dağılımı. ....................................................................................................... 61 Tablo 4-4: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalarda üreyen anaerop bakterilerin dağılımı. ....................................................................................................... 62 Tablo 4-5: Mastit hastalarına ait 10 örnekte saptanan bakteri birliktelikleri. ................. 63 Tablo 4-6:ABI 3730XL cihazında elde edilen kromatogramlardan çıkan Fasta dizilerinin NCBI ve DSMZ veri bankalarına göre sonuçları. ......................................... 65 Tablo 4-7: Mastitli hastalarda üreyen aerop bakterilerin antibiyotiklere direnç durumları ........................................................................................................................................ 68 Tablo 4-8: Mastitli hastalarda üreyen anaerop bakterilerin antibiyotiklere direnç durumları ve denenen antibiyotiklerin MİK değerleri ................................................... 69 xi ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2-1: Memenin normal anatomik yapısı .................................................................... 4 Şekil 2-2: Mastitlerin sınıflandırılması ............................................................................. 6 Şekil 4-1: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış hastaların dağılımı. ....... 56 Şekil 4-2: Non-laktasyonel mastitli 56 hastada granülomatöz mastitli ve periduktal mastitli olguların dağılımı. .............................................................................................. 56 Şekil 4-3:Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hastalarda yaş gruplarının dağılımı. 57 Şekil 4-4: Laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde bakteri üremesi saptananların oranı ................................................................................................................................ 59 Şekil 4-5: Non-laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde bakteri üremesi saptananların oranı ........................................................................................................ 59 Şekil 4-6: Kültürde üreme olmadığı halde Gram boyamada bakteri görülen örneklerin hasta gruplarına göre dağılımı. ....................................................................................... 60 Şekil 4-7: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 genomu. ..................................... 64 Şekil 4-8: Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385 genomu. ................................ 64 xii SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ İGM : İdiyopatik granülomatöz mastit TDLU : Terminal duktolobüler ünit MRSA : Metisilin dirençli Staphylococcus aureus MSSA : Metisilin duyarlı Staphylococcus aureus USG : Ultrasonografi DM : Diyabetes mellitus GM : Granülomatöz mastit TNF-α : Tümör nekroz faktör alfa INF-γ : İnterferon gamma TSI : Three sugar iron agar (üç şekerli demirli agar) MIO : Hareket indol ornitin besiyeri TAE : Tris bazı, asetik asit ve EDTA içeren tampon solüsyon 16S- rRNA : 16 Swedberg birimi büyüklüğünde prokaryot ribozomal RNA’sı dATP : Deoksiadenozin trifosfat dCTP : Deoksisitidin trifosfat dGTP : Deoksiguanozin trifosfat DNA : Deoksiribonükleik asit RNA : Ribonükleik asit dNTP : Deoksiribonükleotit trifosfat dTTP : Deoksitimidin trifosfat DDH : DNA-DNA hibridizasyonu MİK : Minimal inhibitör konsantrasyonu MBK : Minimal bakterisidal konsantrasyon PBP : Penisilin bağlayıcı proteinler xiii CRF : Koagülaz reaktan faktör PYR : L-Pirolidonil-β-Naftilamid IL : İnterlökin pH : Asitlik –bazlık birimi [H+] iyonlarının - logaritması PZR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu P : Penisilin A : Ampisilin CRO : Seftriakson CAZ : Seftazidim AMC : Amoksisilin/ Klavulonik Asit IPM : İmipenem MEM : Meropenem DA : Klindamisin E : Eritromisin SXT : Trimetoprim/sulfametoksazol CN : Gentamisin CIP : Siprofloksasin VA : Vankomisin LZD : Linezolid xiv ÖZET Taner, Z. Tüberküloz dışı mastitlerin etiyolojisinde rol alan aerop ve anaerop bakterilerin dağılımı ve antimikrobik maddelere direnç durumları. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Mikrobiyoloji ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. 2015. Mastit memenin inflamatuar hastalığını ifade eden, çoğu zaman patojen mikroorganizmaların çoğalması sonucu gelişen bir hastalıktır. Mastite neden olan bakterilerin tanısı ve antimikrobiyal duyarlılıkları hastalığın tedavisi ve takibi açısından büyük önem taşımaktadır. Bu bakterilerin hastaların cerahat veya doku örneklerinden tanımlanması için başta aerop ve anaerop kültür yöntemleri kullanılmaktadır. Ancak birçok kaynakta belirtildiği gibi, etkenlerin konvansiyonel bakteriyolojik tekniklerle izolasyonunda her zaman başarı sağlanamadığı için günümüzde moleküler yöntemlerden de yararlanılmaktadır. Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Acil Cerrahi ve Genel Cerrahi Meme Polikliniği’ne başvuran ve klinik muayeneleri ve/veya histopatolojik incelemeleri sonuçlarına göre mastit tanısı almış olan, 44 laktasyonel mastit ve 56 non-laktasyonel mastitli 100 hastaya ait doku ve/veya apse cerahatleri ile gerçekleştirdiğimiz çalışmada aerop ve anaerop kültürler, antimikrobiyal duyarlılık testleri ve moleküler testler sonucunda, laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde en yüksek oranda üretilen bakterilerin Gram pozitif diplokoklardan Staphylococcus aureus (%43,1) olduğu, non-laktasyonel mastitli hastalardan granülomatöz mastitli olanlarda ise en yüksek oranda üretilen bakterilerin Corynebacterium türleri (%26,1) olduğu belirlenmiştir. Granülomatöz mastitli hastaların cerahatlerinde, gerek kültür gerek 16S rRNA ve dizi analizi ile Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium amycolatum ve Corynebacterium pseudotuberculosis ülkemizde ilk defa bu çalışma ile belirlenmiş ve granülomatöz mastit ile Gram pozitif çomakların varlığı arasında anlamlı bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Ayrıca aynı gruptaki hasta örneklerinde yine aynı yöntemle Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus capitis, Lactococcus lactis ve Bifidobacterium breve de ilk defa saptanmıştır. Bunun yanı sıra, düşük oranda da olsa mastitlerde peptostreptokokların en baskın üreyen anaerop bakteri olduğu belirlenmiştir. Mastitli hastalara uygulanan tedavilere, hastalarda sık üretilen bakteriler olan Gram pozitif diplokoklar ve Gram pozitif çomaklara etkili ve yağ dokuya penetrasyonu güçlü olan antibiyotiklerin eklenmesinin yararlı olacağı görüşündeyiz. Anahtar Kelimeler: Mastit, aerop bakteriler, anaerop bakteriler, antimikrobiyal direnç, PZR, 16S rRNA, dizi analizi Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 48735 xv ABSTRACT Taner, Z. The distribution of aerobic and anaerobic bacteria in the etiology of nontuberculous mastitis and their resistance to antimicrobial agents. Istanbul University, Institute of Health Science, Department of Medical Microbiology. Thesis of Master of science. Istanbul. 2015. Mastitis is an inflammatory disease of the breast, often develops as a result of the proliferation of pathogenic microorganisms. The diagnosis of the bacteria that causes mastitis is very important due to the treatment and the monitoring of the disease. For the identification of these bacteria from patients pus or tissue samples, aerobic and anaerobic culture methods are used. However, as mentioned in many sources, it is not always possible to identify the agents by conventional bacteriological methods, today molecular methods are also utilized. Between November 2015 and June 2015, pus and tissue samples of the 44 lactational mastitis patient and 56 non-lactational mastitis patients who were diagnosed with mastitis disease by clinical examinations and/or histopathological examinations and admitted to Istanbul University Medical Faculty, Emergency Surgery and General Surgery Breast outpatient department were collected and examined. As a result of our aerobic and anaerobic culture studies, antimicrobial sensitivity studies and molecular tests, we found that S. aureus (%43,1) is the most common bacteria which is isolated from the lactational mastitis patient samples and Corynebacterium spp. (%26,1) is the most common bacteria which is isolated from the non-lactational mastitis patient samples. In the pus of granulomatous mastitis patients, both with culture and 16S rRNA sequencing methods, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium amycolatum andCorynebacterium pseudotuberculosiswere determined by this study and a significant correlation between granulomatous mastitis and Gram positive rods were shown for the first time in our country. Also in the samples of the same patient group, S. saprophyticus, S. capitis, Lactococcus lactis andBifidobacterium brevewere determined for the first time again with the same method. In addition, eventhough with the low levels, peptostreptococci is determined as the most dominant anaerobic bacteria isolated on mastitis. We believe that it would be beneficial with the addition of the antibiotics which were effective on the most common isolated bacteria such as Gram positive diplococci and Gram positive rods and were penetrating strongly to the adipose tissue to the treatment of the patients with mastitis. Keywords:Mastitis, aerobic bacteria, anaerobic bacteria, antimicrobial resistance, PCR, 16S rRNA, sequence analysis The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No. 48735 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Mastit memenin inflamatuar hastalığını ifade eden, genellikle kadınları etkileyen ve çoğu zaman patojen mikroorganizmaların çoğalmasının sonucu gelişen bir hastalıktır (1). Mastitler; laktasyonel mastit, non-laktasyonel mastit ve meme apsesi olmak üzere üç grupta incelenmektedir. Non-laktasyonel mastit, kendi içinde santral veya subareolar enfeksiyon, periferal enfeksiyon ve granülamatöz enfeksiyon olmak üzere üç gruba ayrılır (1). Laktasyon süresinde kadınların %33 kadarında laktasyonel mastit (enfeksiyöz mastit) görülmektedir. Güncel verilerin ışığında enfeksiyöz bakteriyel mastitlerin etiyolojisinde genellikle stafilokok, streptokok ve/veya Corynebacterium türlerinin rol oynadığı, Staphylococcus aureus ile Staphylococcus epidermidis’in temel etiyolojik etkenler olduğu gösterilmiştir (2). Özellikle laktasyonel mastitte, antibiyotik tedavisine istenilen yanıtın alınamaması, bu iki stafilokok türünde görülen çoklu antibiyotik direnci ve biyofilm oluşturabilme özellikleri ile ilişkilendirilmiştir (3). Bunun dışında laktasyonel mastitte başta Bacteroides spp. ve Propionibacterium spp. olmak üzere anaerop bakterilerin de etkenler arasında yer alabileceği gösterilmiştir (3).Laktasyonel mastitin aksine non-laktasyonel mastitte ise bakteriyel etkenlerin nadir görüldüğü bildirilmektedir. Non-laktasyonel mastitin en sık rastlanılan türü olan granülomatöz mastitte ise etiyolojik rolü olan bakteriler tam olarak bilinmemektedir. Araştırmalarda başta Corynebacterium türleri olmak üzere, Escherichia coli, Bifidobakteriler, anaerobik streptokoklar, Clostridium türleri ve Propionibacterium acnes etkenler arasında gösterilmiştir (4). Mastite neden olan bakteriyel etkenlerin tanısı hastalığın tedavisi ve takibi açısından büyük önem taşımaktadır. Mastit tanısı almış hastaların apse ve doku örneklerinden bakterilerin tanımlanması için başta aerop ve anaerop kültür yöntemleri kullanılmaktadır (1). Ancak birçok kaynakta belirtildiği gibi, etkenlerin konvansiyonel bakteriyolojik tekniklerle izolasyonunda her zaman başarı sağlanamadığı için günümüzde moleküler yöntemlerden (polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), multiplex PZR, gerçek zamanlı PZR) de yararlanılmaktadır (1, 2, 4). Mastit tedavi edilmediğinde hastalarda meme apseleri ve geniş meme dokusu nekrozları gelişebilmektedir. Tüberküloz dışı bakteriyel mastitli hastalara uygulanan tedavi merkezden merkeze değişebileceği gibi genelde apse drenajı yanı sıra ampirik 2 olarak penisilinler, sefalosporinler, beta laktam inhibitörleri ve klindamisine başvurulmaktadır (5). Bunun yanı sıra, son yapılan çalışmalarda sağlıklı annelerin sütlerinden izole edilen bazı Lactobacillus türlerinin (Lactobacillus salivarus, Lactobacillus gasseri) tedavide kullanıldığı ve olumlu yanıtlar alındığı bildirilmiştir (5). Ayrıca etki mekanizmaları tam olarak bilinmemekle beraber özellikle granülomatöz mastitlerin tedavisinde steroidler de kullanılmaktadır (6). Ülkemizde ve dünyada mastit oldukça yaygın olmasına ve kadınlara ciddi psikolojik ve fiziksel güçlükler yaşatmasına karşın etiyolojisinde rol oynayan ya da klinik tabloya sekonder olarak eklenerek hastalığın şiddetini arttıran bakterilere yönelik araştırmalar ülkemizde yok denilecek kadar azdır. Biz bu araştırmamızda mastit tanısı almış hastalarda infeksiyona neden olabilen Mycobacterium tuberculosis dışındaki aerop ve anaerop bakterileri başta kültür yöntemleri olmak üzere imkanlarımız dahilinde moleküler yöntemleri de kullanarak saptamayı ve üretebildiğimiz etkenlerin antibiyotik duyarlılıklarını belirleyerek ampirik tedavide kullanılan antibiyotiklere yönelik yeni yaklaşımlar getirebilmeyi amaçlamaktayız. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Tarihçe Meme muayene edilirken göz ve elle ulaşılması en kolay organlardan biridir. Dolayısıyla bu organda ortaya çıkan patolojik değişiklikler ilk çağlardan beri insanların ve hekimlerin dikkatini çekmiş ve önemli gözlemlerin yapılmasına olanak sağlamıştır (7). Meme hastalıkları ile ilgili ilk yazılı kayıtlara Mısır’da 1829 yılında rastlanmıştır. M.Ö. 3000 yıllarına ait bu papiruslar Edwin Smith tarafından bulunup okunmuştur. 48 vakaya ait bilgi içeren bu papiruslarda apse, travma, infekte yaralar ve tümör hakkında bilgiler verilmiştir. 16.ve 17. yy’da önce Fabry sıkıştırarak meme amputasyonu yapan bir alet geliştirmiş daha sonra Arceo ilk kez memenin cerrahi yolla çıkarıldığı mastektomi ameliyatını tarif etmiş; Cabrol buna büyük pektoral kasın çıkarılmasını eklemiştir. Kısa bir sure sonra ise Severinus koltuk altı disseksiyonunu eklemiştir (8). İlk defa 1862’da Sir Astley Cooper tarafından tanımlanan meme tüberkülozu, günümüzde en sık görülen spesifik granülomatöz mastit tipidir (6). 1894 yılında hem Halsted hem de Mayer; günümüzde hala uygulanan radikal mastektomiyi tarif etmişlerdir. Daha sonra, bir yandan çıkarılan kısımlar genişletilirken (geniş radikal mastektomi) diğer yanda modifiye radikal mastektomi, basit mastektomi gibi sınırlı amputasyonlar yapılmaya başlanmıştır. İlk uygulamaları 1940’lı yıllarda başlayan ve ameliyattan sonra memenin ışınlanmasını gerektiren meme koruyucu ameliyatlar o zamanki ışınlama tekniğinin komplikasyonları sonucu yaygın kullanım alanı bulamamıştır. İdiyopatik granülomatöz mastit (İGM) 1970 yılında Milward ve Gough tarafından tanımlanmasına rağmen ilk kez 1972 yılında Kessler ve Woolloch tarafından çok sayıda granülom ve apse formasyonları ile karekterize beş olgu üzerinden klinik ve patolojik bulguları ile tariflenmiştir (6). 1980’lerden itibaren mastit enfeksiyöz ve nonenfeksiyöz olmak üzere iki alt grupta incelenmeye başlamıştır (1). Meme hastalıkları ile ilgili çalışmalar bu tarihsel sürecin ardından günümüz tıbbında dadurmaksızın sürmektedir. 2.2. Memenin Anatomik Yapısı Meme, modifiye bir ter bezidir (9). Anterior torasik duvarın en ön kesiminde bulunur. Laktasyon dönemi dışında bir meme ortalama 10-12 cm çapında ve 150-400 g ağırlığındadır (10). Meme şekli genetik faktörler tarafından etkilenir ve diskoid, konik, 4 hemisferik gibi şekillerde olabilir (11). Meme boyutları ve ağırlığı kişiden kişiye, hatta aynı kişide sağ ile sol arasında ve hayatın değişik dönemlerinde farklılık gösterebilir (12). Vücutta, klavikula ile altıncı-sekizinci kostalar arasında yer alırlar. Mediolateral yerleşimleri de sternum ile midaksiller çizgi arasındadır (13). Toraksın önünde yüzeyel fasyadadırlar ve derinde pektoral kaslardan derin fasya ile ayrılırlar. Meme Cooper ligamanları ile cilde sıkıca bağlanmıştır ancak derin fasyadan kolayca ayrılabilir (14). Memenin büyük kesimi pektoralis major kası üzerindedir. Lateralde serratus anterior kasının, medialde rektus kası kılıfının üst kısmını örter (15). Şekil 2-1: Memenin normal anatomik yapısı (1: Göğüs duvarı, 2: Pektoral kas ve fasyası, 3: Lob, 4: Meme başı, 5: Areola, 6: Segmental duktus, 7: Retro/Periglandüler yağ dokusu, 8: Cilt ) (10) Meme glandüler doku, fibröz doku ve yağ dokusundan meydana gelir ve 15-20 lobdan (segmentten) oluşur (9,12). Her bir lob meme başından başlayarak ışınsal tarzda doku içine dağılmıştır. Her bir lobun meme başına doğru yönelmiş olan ayrı bir kanalı ve her bir lob 20-40 lobulus içerir. Her lobulusta da 10-100 adet asinus (duktül) vardır. Asinuslar birleşerek terminal duktusa (intralobüler ve ekstralobüler segmentten oluşur) açılırlar (16). Bir terminal duktusun intralobüler segmenti ile buna açılan asinuslar lobulusu oluşturur. Bu yapıya terminal duktolobüler ünit adı verilmiştir (TDLU) (17, 18). Terminal duktuslar birleşerek subsegmental duktusu oluştururlar. Bunlar da 5 birleşerek segmental (laktifer) duktusu meydana getirirler. Laktifer duktus meme başında genişler, laktifer sinüs olarak isimlendirilir. Laktifer sinüs de ampulla ile meme başından dışarı açılır (16). Laktasyonda sütün toplandığı yer bu laktifer sinüstür (14). Areolada sebase glandlar bulunur, bunlar gebelikte areola ve meme başını koruyan bir madde salgılar. Areola altında yağ bulunmaz. Meme başı areola orta kesiminde yerleşmiş koni ya da silindir şeklinde çıkıntıdır ve 4. interkostal aralıkta bulunur. Ancak bireyden bireye farklılık gösterebilir. Meme başının ucunda laktifer sinüslerin açıldığı yerler bulunur (14). 2.3. Meme Hastalıkları Meme hastalıkları denildiğinde akla ilk gelen meme kanseri olmasına karşın meme kistleri, fibroadenomlar, filloid tümörler, duktalektazi, intraduktal papillom, yağ nekrozları, mondor hastalığı ve meme enfeksiyonları anlamına gelen mastit gibi iyi huylu meme hastalıklar da bulunmaktadır (19). Mastiti de kapsayan pek çok benign meme hastalığı, oluşan yapısal ve kimyasal değişiklikler nedeni ile gebelik ve laktasyon dönemlerinde daha sık görülür(19). 2.3.1. Mastit Mastit meme dokusunun tamamının veya bir bölümünün çeşitli nedenlerle oluşan inflamasyonunu ifade eder. Meme dokusundaki bu inflamasyon, basit mastit olarak tanımlanan tedavisi kolay enfeksiyöz bir ajana sekonder oluşabileceği gibi inflamatuar meme kanseri gibi ciddi bir hastalığın klinik bulgusu da olabilir. Mastit genellikle laktasyon dönemindeki kadınlarda olmak üzere üreme çağındaki kadınlarda daha sık görülür(20, 21). Etkene bağımlı olarak inflamasyonun klinik ve histopatolojik özellikleri farklılıklar göstermekle birlikte en sık rastlanılan fizik muayene bulguları; memenin bir bölümünde veya tamamında sertlik, hassasiyet, ödem ve ciltte renk değişikliğidir. Sıcaklık artışı, kitle formasyonu, fluktuasyon, ciltte portakal kabuğu görünümü ve akıntılı sinüsler gibi bulgular nadiren saptanabilir (22, 23). Mastitte etkili tedavi, tanımlanmış patojen etkene spesifik tedavinin uygulanması esasına dayanır. Mastit tedavisi laktasyonel dönemde görülen mastitlerde anamnez ve fizik muayene ile ileri tetkik yapmadan başlanacak kadar basit olabileceği gibi, tekrarlayan görüntüleme ve biyopsilere rağmen tanı konulamayan, etkeni izole 6 edilemediği için genellikle non-spesifik tedavi denemeleri yapılan (granülomatöz mastitte olduğu gibi) sıkıntılı bir süreçle seyredebilir (6). Mastitler; laktasyonel mastit, non-laktasyonel mastit ve meme apsesi olmak üzere üç grupta incelenmektedir. Non-laktasyonel mastit, kendi içinde santral veya subareolar enfeksiyon oluşturabilen periduktal mastit, periferal enfeksiyon ve granülamatöz mastit olmak üzere üç gruba ayrılır(1). Şekil 2-2: Mastitlerin sınıflandırılması 2.3.1.1. Laktasyonel Mastit Laktasyonel mastit en sık görülen mastit şeklidir ve ana nedenlerin süt stazı ve enfeksiyon olduğu düşünülmektedir (2, 24). Primer neden süt stazıdır, bunu takiben IL8 gibi sitokinlerin de etkisiyle enflamasyon gelişir ve mastitin klinik bulguları ortaya çıkar, bakterilerin gelişebileceği uygun ortam oluşur ve enfeksiyon da eklenir. Laktasyonel mastitin sınıflandırılmasında, vakaların sütlerinde lökosit ve bakteri sayılarının hesaplanmasına dayanan bir yöntem de önerilmiştir (3). Enfeksiyon gelişme halinde, enfeksiyonun memeye hangi yoldan ulaştığı belirsizdir, ancak meme başı çatlağı majör risk faktörü olarak düşünülmektedir (25). En sık görülen enfeksiyöz 7 etkenlerin başında Staphylococcus aureus (Metisilin dirençli Staphylococccus aureus)yer almaktadır, bunu streptokoklar ve Staphylococcus epidermidis izlemektedir (26, 27, 28). 2.3.1.2. Non-laktasyonel Mastit Non-laktasyonel mastitler santral veya subareolar enfeksiyon oluşturan periduktal mastitler, periferal enfeksiyonlar ve granülomatöz mastitler olmak üzere üç grupta incelenmektedir. Genelde neden periduktal mastittir ve dilate duktuslar etrafındaki enflamasyon olarak tanımlanır (1). Periduktal Mastit Periduktal mastitte duktal ektazi sürecin ilk adımıdır (29). Keratin üretimiyle tıkanan kanalda, sekretuar materyal birikimi ile dilatasyon olur, epitel rüptürüyle periduktal doku hasarı gelişir, dolayısıyla bakteriyel gelişim için uygun ortam oluşur. Enfeksiyöz etkenler arasında anaerop ve aerop bakteriler belirtilmiştir (30). Periduktal mastitlerde hormonal değişimler (prolaktin, östrojen), vitamin A eksikliği ve sigara başlatıcı faktörler olarak düşünülmektedir (4). Özellikle sigara kullananlarda subareoler kanallarda daha yoğun olarak bulunan nikotinin doğrudan toksik etki veya hipoksi ile zarar verdiği düşünülmektedir (4). Periduktal mastitler non-laktasyonel apselerin çoğunu oluştururlar. Erkeklerde de görülebilirler ve bilateral olabilirler. En sık şikâyet ağrı ve meme başı akıntısıdır. Kitle, meme başı çekintisi, apse ya da fistül görülebilir. Enfeksiyon ve apse sık tekrarlar (29). Anamnezde benzer şikâyetlerin daha önce geçirilip geçirilmediği sorgulanmalıdır. Klinik tanıda ultrasonografi (USG) bulguları nonspesifiktir dolayısıyla karsinomla karışabilir (30). Periferal enfeksiyon Periferal enfeksiyon nadir görülür ve genelde idiyopatiktir. Diyabet, romatoid artrit, steroid kullanımı, travma veya karsinom ile ilişkili olabileceği bildirilmiştir (4). Etkenler Staphylococcus aureus, streptokoklar ve bazen de anaeroplardır(26, 27, 28). Laktasyon dışı dönemdeki periferal enfeksiyonlar için en önemli risk faktörü diyabetes mellitus (DM) olarak bildirilmektedir (31). Granülamatöz mastit Granülomatöz mastit (GM) memenin nadir görülen kronik inflamatuar bir hastalığıdır. Genellikle 50 yaş altı kadınlarda görülür. Etiyolojik nedenleri tam olarak 8 bilinmemektedir. Klinik ve radyolojik bulguları meme kanseri ile karışabilmektedir. Granülomatöz mastitlerin spesifik granülomatöz mastitler ve idiyopatik granülomatöz mastitler olmak üzere iki klinik görüntüsü bildirilmiştir (1). Spesifik granülomatöz mastitlerde Mycobacterium tuberculosis en sık rastlanılan etken olarak belirtilmiştir. Bunu takiben Salmonella typhi, Brucella spp., Mycobacterium leprae ve nadir olarak da parazitler, mantarlar ve virüsler enfeksiyon etkenleri olarak bildirilmiştir. Enfeksiyon dışı faktörler olarak da yabancı cisim, Wegener granülomatozu ve sarkoidoz bildirilmiştir (6). İdiyopatik granülamatöz mastit ilk kez 1972 yılında Kessler ve Wolloch tarafından tanımlanmış ve granülomatoz reaksiyon yapabilen enfeksiyoz (tüberküloz, bazı mantar enfeksiyonları) ve non-enfeksiyoz (sarkoidoz, vaskülit) nedenler ekarte edildikten sonra histopatolojik incelemede granülomatöz inflamasyonun bulunması tanı kriteri olarak belirtilmiştir (6). İdiyopatik granülamatöz mastit en sık görülen granülomatöz mastit türüdür. İnsidansı literatürde değişik sıklıkta verilmekle beraber cerrahi olarak tedavi edilen meme hastalıklarının %3’ünde rastlanıldığı bildirilmiştir (1). Lokal otoimmun reaksiyon sonucu veya doğuma sekonder reaksiyon sonucu oluştuğu ileri sürülen bu mastit türüne neden olan belirli bir etken saptanamamıştır. Klinik tanıda, ağrılı veya ağrısız olarak ele gelen kitle önem taşır. Genellikle genç kadınlarda, tek taraflı olarak ortaya çıkan bu mastit türünün ultrasonografik ve mammografik olarak meme kanserini taklit edebildiği bildirilmiştir (1). 2.3.1.3. Meme Apsesi Apse meme enfeksiyonunun ciddi bir komplikasyonudur; meme parankimi içinde sınırlayıcı pü koleksiyonudur. Memede fluktuasyon veren kitle şeklinde karşımıza çıkar. Meme apseleri genellikle gebe ve laktasyon dönemindeki kadınlarda görülür. Laktasyon dışı dönemde nadiren görülmektedir(1). Meme apseleri laktasyonel mastit veya non-laktasyonel mastitlerin bir sonucu olarak da gelişebilir. Laktasyon döneminde ortaya çıkan meme apseleri genellikle travma veya piyojenik mastitin komplikasyonu olarak ortaya çıkmaktadır(33, 34). Meme apselerinde en sık izole edilen etkenlerin başında Staphylococcus aureus bildirilmiştir (31). Bunun dışında nadiren de olsa Escherichia coli etken olarak karşımıza çıkmaktadır (35). 9 2.3.2. Mastitlerin Patogenezi 2.3.2.1. Laktasyonel Mastit Patogenezi Mastit meme bezinin parenkim enfeksiyonudur. Emziren kadınların %2-10’unda görülür. Laktasyonun ilk haftalarında süt birikmesi ve sütün dışardan kontaminasyonu ile epidemik yada sporadik tipte mastit gelişebilir. İlk çocuk, ağır uzamış tek taraflı meme angorjmanı, zayıf süt drenajı, meme başı çatlağının varlığı mastit için risk faktörleridir (25). Laktasyonel mastit ilk gebeliklerde ve çoğu zaman emziren annelerde daha sık görülür. Emzirilen bebeğin burun ve boğaz florası mastite neden olan mikroorganizmaların kaynağı olarak belirtilmiştir. Bakterilerin meme başındaki bir çatlak veya küçük sıyrıktan girerek enfeksiyona neden olduğu bildirilmiştir (26). Annenin otuz yaş üzerinde olması, ilk gebelik, jestasyonel yaşın kırkbir haftanın üzerinde olması, mastit varlığı laktasyonel mastit için risk faktörleridir (36). Laktasyonel mastitin primer nedeni süt kanallarının tıkanmasıdır. Bunu takiben IL-8, IL-2, IL-10, IL-6, TNFα, INFγ gibi sitokinlerin de etkisiyle inflamasyon gelişir ve mastitin klinik bulguları ortaya çıkar, bakterilerin gelişebileceği uygun ortamın da oluşmasıyla kliniğe enfeksiyon da eklenir (27, 32). Doğum ardından 10. ile 15. günler arasında enfeksiyon varlığındamemede hassasiyet, sertlik, ödem, kızarıklık gibi bölgesel semptomların yanısıra ateş, gibi semptomların da ortaya çıkabileceği gösterilmiştir (37). Enfeksiyonun memeye hangi yoldan ulaştığı belirsizdir, ancak meme başı çatlağı majör risk faktörüdür (25). Bebeğin hipofarenksindeki mikroorganizmalar ya da hijyen kurallarına uymayan annenin meme başı etrafında bulunan mikroorganizmalar meme başı çatlaklarından süt kanallarına ve lenfatiklere geçerek üreme için uygun ortamı bulduğu belirtilmiştir (25). 2.3.2.2. Non-laktasyonel Mastitlerin Patogenezi Periduktal mastit dilate duktuslar etrafında oluşan inflamasyonu tanımlayan mastittir. Zuska hastalığı, kronik piyojenik mastit, komedomastit gibi isimlerde verilmiştir. Patofizyolojisinde duktal ektazi ve tekrarlayan apselerin, duktusun kolumnar epitelinin epidermalizasyonu ve squamoz metaplazi sonucu duktal tıkanma olduğu düşünülmektedir. Keratin üretimiyle tıkanan kanalda, sekretuar materyal birikimi dilatasyon yapar, basınç artışı ile epitel rüptürü, ardından periduktal hasar ve keratin irritasyonu ile inflamasyon gelişir (29). Duktal epidermalizasyonu ve squamoz metaplaziyi uyaran neden tam bilinmemektedir. Hormonal değişimler (östrojen, 10 prolaktin), vitamin A eksikliği, sigara başlatıcı faktörler olarak bildirilmiştir (4). Periferal enfeksiyon ise diyabet, romatoid artrit, steroid kullanımı, travma ve karsinom ile ilişkili olabileceği gibi, genellikle idiyopatiktir. Otuz beş yaşını geçmiş risk faktörü bulunmayan hastalarda mamografi çekilmesi duktal karsinoma in situ ayrımı için önerilmektedir. Etken Staphylococcus aureus, streptokoklar, bazen anaeroplardır (31). Granülomatöz mastitte memenin inflamatuar lezyonları genellikle nadirdir. Çoğunlukla postpartum dönemde veya laktasyonun başlangıcında görülür. Dilate olan kanallardaki süt akımının yavaşlaması enfeksiyon için predispozandır. Her ne kadar kesin nedeni bilinmese de subareolar kanal ektazisi ve majör duktusların obstrüksiyonunun bakteriyel proliferasyona ve takibinde apse oluşumuna yol açabileceği ileri sürülmüştür (38). Akut inflamasyon, yaralanma, mikroorganizma veya diğer yabancı maddelere karşı hızlı bir şekilde oluşan lökosit ve plazma hücre cevabı ile oluşur. Etken uzaklaştırıldıktan sonra geride nekrotik doku kalır. İnflamasyona neden olan etkenin dirençli olması ya da normal iyileşme süreci olarak akut cevap ile çözülememesi ile akut inflamasyon zaman içerisinde kronik inflamasyona dönüşebilir. Kronik inflamasyon, haftalar, aylar veya yıllar içerisinde devam eden ve akut inflamasyondan farklı olarak makrofaj, lenfosit ve plazma hücrelerini içeren mononükleer hücre infiltrasyonu ile karakterizedir (32). Granülomatöz inflamasyon aktive olmuş makrofajların agregatlar haline gelmesiyle oluşan özel bir kronik inflamasyondur. Granülomlar dirençli inflamasyon halinde T hücrelerinin uzun süreli makrofajları uyarması sonucu oluşur. Elimine edilmeye dirençli durumlarda granülom oluşumu ile inflamasyon alanı sınırlandırılmaya çalışılır. Çoğu zaman granülom oluşumu tüberküloz gibi hastalıklarda organ disfonksiyonuna yol açmaktadır (38). Etiyolojisi net olarak bilinmeyen granülomatöz mastit non-kazeöz granülomlarla karekterize, nekroz, dev hücre fomasyonu, nötrofil infiltrasyonunun görüldüğü, meme dokusunda lokalize bir immün reaksiyon olarak başlamaktadır. Oluşum mekanizması dikkate alındığında etiyolojik faktör olarak oral kontraseptiflere karşı oluşan kimyasal reaksiyon, otoimmünite, duktuslarda artan kimyasal sekresyonlara karşı lokal reaksiyon ve hormonal dengesizlikler gibi etkenler suçlanmaktadır (39, 40). Hastalığın patofizyolojisinde otoimmun hipotezler günümüzde yaygın olarak kabul edilmektedir. Duktal epitel hasarıdan oluşan proteinden zengin sekresyonun çevre yağ dokusuna ve 11 lobuler konnektiv dokuya geçmesi ile lenfosit ve makrofaj migrasyonu sonucu granülomatöz reaksiyon oluştuğu düşünülmektedir. Laktasyon, lokal travma ya da diğer enfeksiyonlar bunu tetikleyebilmektedir. Yapılan immunohistokimyasal çalışmalarda T hücre varlığı gösterilmiştir (38). Gram pozitif basil olan Coryneabacterium cinsleri ile GM arasında olası bir ilişki düşünülmektedir. Korinebakterilerin histolojik olarak zor gösterilmesi ve genellikle normal cilt florası ile kontaminasyon düşündürmesi nedeniyle etyolojide çok fazla incelenmemiştir (41, 42). 2.3.2.3. Meme Apseleri Patogenezi Cerrahi enfeksiyonların oluşumu için doğal savunma engeli olan deri-mukoza epitel devamlılığının bozulması, enfeksiyon etkenlerinin bulaşması ve potansiyel virülansın aktif hale geçmesi, bir diğer deyişle, saldırı-savunma dengesinin saldıran lehine bozulması gerekmektedir. Böyle bir durumda, enfeksiyon etkenlerinin sayısı ve virülansı yani kontaminasyon karşısında vücudun doğal dengesinin yenik düşmesi söz konusudur (43). Apseler ayrıca sebase kist, hidradenitis supüritiva gibi kutanöz lezyonlara ikincil olarak da gelişebilir. Bu apse tipleri cilt lezyonlarının varlığı ile ayırt edilebilir. Meme apseleri genellikle gebe ve laktasyon dönemindeki kadınların hastalığıdır. Laktasyon dışı dönemde nadiren görülmektedir (31). 2.3.3. Mastit Etiyolojisinde Rol Alan Bakteriler Laktasyonel mastitlerde en sık rastlanılan etken Staphylococcus aureus’tur (MRSA dahil), Streptokok ve Staphylococcus epidermidis de günümüzde sıkça ortaya çıkan etkenlerdendir (26). Güncel verilerin ışığında enfeksiyöz bakteriyel mastitlerin etiyolojisinde genellikle stafilokok, streptokok ve/veya Corynebacterium türlerinin rol oynadığı gösterilmiştir (5, 32). Bunun dışında enfeksiyöz mastit olarak da kabul edilen laktasyonel mastitte başta Bacteroides spp. ve Propionibacterium spp. olmak üzere anaerop bakterilerin de etkenler arasında yer alabileceği gösterilmiştir (37). Non-laktasyonel periferal enfeksiyonlarda etken Staphylococcus aureus, streptokoklar ve bazen de anaeroplardır. Non-laktasyonel mastitin en sık rastlanılan türü olan granülomatöz mastitte ise etiyolojik rolü olan bakteriler tam olarak bilinmemektedir. Escherichia coli, Araştırmalarda başta Bifidobakteriler, Corynebacterium peptostreptokoklar, türleri olmak Clostridium üzere, türleri ve 12 Propionibacterium acnes etkenler arasında gösterilmiştir (4). Spesifik granülomatöz mastitlerde ise olası bakteriyel etkenler Mycobacterium tuberculosis,Salmonella typhi, Brucella spp., Mycobacterium leprae olarak sıralanmıştır (4). Meme apselerinde ise Staphylococcus aureus en sık rastlanılan etken olarak bildirilmiştir. Bunu takiben Staphlococcus epidermidis, Escherichia coli gibi aerob ve Bacteroides fragilis, Peptostreptokoklar, Propionibacterium acnes gibi anaerop bakteriler meme apselerinden izole edilmiştir (44). Staphylococcus cinsi Stafilokok cinsi bakteriler Micrococcaceaefamilyası içinde yer almaktadır. Düzensiz üzüm salkımına benzer kümeler, bazen 3-5 koktan ibaret veya ikişerli gruplar oluşturan, tüm hücreleri birbirine benzerlik gösteren, sporsuz, hareketsiz ve kapsülsüz Gram pozitif koklardır(45).Tüm stafilokoklar ve mikrokoklar özellikle glikozlu besiyerlerinde katalaz pozitiftirler. Stafilokoklar klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında primer olarak koagülaz enzimi üretip üretmemelerine göre sınıflandırılırlar (45).Koagülaz pozitif stafilokoklar ve Staphylococcus aureus dışındaki tüm stafilokok türleri genel olarak koagülaz negatif stafilokoklar adı altında toplanmaktadır. Bazı kökenlerinde belirgin bir kapsül veya mukus katmanı oluşur. Stafilokoklar başta glikoz olmak üzere birçok karbonhidratları fermentatif olarak parçalarlar ve son ürün olarak laktik asit yaparlar. Gaz oluşturmazlar. Mannitole etkileri değişken olup özellikle S. aureus bu şekere etkilidir. Diğerlerinin etkisi değişkendir. Stafilokoklar başta burun mukozası, nazofarinks, deri ve daha az olmak üzere bağırsak ve diğer mukozaların normal floralarında bulunan bakterilerdir (45).Staphylococcus aureus özellikle laktasyon döneminde görülen mastit türlerinde olmak üzere tüm mastit türlerinde en sık izole edilen etkendir (4). Streptococcus cinsi Streptokok cinsi bakteriler Streptocococcaceae familyası içinde yer almaktadır. Yuvarlak veya oval şekilli, tek tek, ikişer ikişer bir arada bulunan veya kısa-uzun zincir teşkil eden, Gram pozitif, katalaz negatif, kok şeklinde mikroorganizmalardır. Streptokoklar kanlı agardaki hemolizlerine göre sınıflandırılmışlardır (45).Ağız, boğaz, burun ve diğer mukozal alanlar yanı sıra deri ile sindirim ve genital sistemin normal florasında bulunabilen streptokoklar, insanlarda çok çeşitli enfeksiyonlar da meydana getirmektedirler. Streptokokkal farenjit, impetigo, bakteriyel endokardit ve idrar yolu 13 enfeksiyonları, deri ve derialtı enfeksiyonları, apseler yanında akut romatizmal ateş, romatizmal kalp hastalığı ve akut glomerulonefrit gibi çok ciddi postenfeksiyöz sendromlara yol açmaktadırlar. Streptokokların çoğu aerob veya fakültatif anaerob iken bir kısmı zorunlu anaeroptur (Peptostreptococcus spp.) (45). Streptokoklar genellikle hayvanlarda mastit etkeni olmakla beraber insanlarda da meme enfeksiyonlarında da primer veya sekonder etken olarak izole edilmiştir (31). Corynebacterium cinsi Korinebakteriler Gram pozitif, aerob, hareketsiz, çomak şeklinde olup, katalaz enzimine sahiptirler ve normal uygun gelişme koşullarında düzensiz şekilli, golf sopası veya V-şeklinde karakteristik düzenlemeleri gösteren mikroorganizmalardır. V-şekilli hücre grupları, hücre bölünmesinin hemen sonrasında kırılma hareketi sonucu meydana gelmektedir. Kırılarak bölünme, hücre duvarının iki tabakadan oluşmasından kaynaklanmaktadır; yalnızca içteki tabaka çapraz-duvar oluşumuna katılır, böylece çapraz-duvar oluşumu tamamlandıktan sonra hücre duvarının dıştaki tabakasına tutunmuş iki yeni hücre oluşur. Hücre duvarının dış tabakasındaki kırılma ile kırılan kısımdan itibaren iki hücre birbirinden uzaklaşır ve bu şekilde V-şekilli formlar oluşur (46). Korinebakterilerdeki ana cinsler Corynebacterium ve Arthrobacter’dir. Corynebacterium cinsi hayvan ve bitkilerde patojen olan, aynı zamanda saprofit çok çeşitli bakteri gruplarını bulundurur. C. diphteriae, C.ulcerans, C. equi, C. ovis, C.haemolyticum gibi bazı türler patojendir. Korinebakterilerin bazı üyeleri gelişim süreçlerinde kok veya pleomorfik olabilirler, bakterilerin genellikle uç kısımları şişkin hücrelerdir, bu onlara golf sopası şeklinde bir görüntü verir (cins adı olan koryne Yunanca ‘sopa’ anlamındadır) (46). Korinebakterlerin patojen türleri apse oluşumunda önemli rol oynamakta bu nedenle mastitlerde de sıklıkla karşımıza çıkmaktadır. Özellikle non-laktasyonel granülomatöz mastitlerde sıklıkla izole edilmektedir (6). Klebsiella cinsi Gram negatif, sporsuz, kapsüllü, hareketsiz ve çomak şeklinde bakterilerdir. Besiyerlerinde mukoid koloniler yaparlar. O ve K antijenlerine göre ayrılırlar. Klebsiella cinsinin besiyerlerinde kolay üremesi, spesifik koloni biçimi, hareketsiz olması ve laktozu parçalama özelliği nedeniyle bakteriyolojik tanısı kolaydır. Bağışık serumlar sayesinde kapsül şişme deneyi ile tipi de kolayca tayin edilebilir ve bu hastane 14 enfeksiyonlarının izlenmesinde faydalı olabilir. K. pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae, K. granulomatis gibi patojen türler insanda bronşit, bronkopnömoni, otitis media, mastoidit, sinüzit, beyin ve diğer dokularda apseler, menenjit, plevra-perikard-peritonprostat-safra yolu iltihapları, septisemi, idrar yolu enfeksiyonları ve mastite neden olabilmektedir (47). Escherichia cinsi Escherichia cinsi üyeleri evrensel olarak insan ve sıcakkanlı hayvanların bağırsak kanalında bulunmakla birlikte bu habitatlardaki baskın organizmalar değildir. Gram negatif çomak şeklinde, hareketli, glikoz, laktoz ve sukrozu fermente edebilen bakterilerdir. Bağırsak kanalında Escherichia cinsi üyeleri tarafından sentezlenen vitaminler ve özellikle de K vitamini beslenmede önemli rol oynar. Escherichia suşları şekerler, amino asitler, organik asitler ve diğer çok çeşitli karbon ve enerji kaynakları üzerinde gelişebilmektedirler (46). Bazı Escherichia suşları patojendir. Bu suşlar bebeklik çağındaki çocuklarda ishale neden olur. Bu tip ishal vakalarıçocuk yuvalarında ve doğum koğuşlarında sıklıkla epidemik boyuta ulaşabilir. Escherichia, yaşlılarda ve cerrahi operasyon geçirdiği ya da iyonizan radyasyona maruz kaldığı için bağışıklığı baskılanmış bireylerde idrar yolu enfeksiyonlarına da neden olabilir. Enteropatojenik E.coli suşları sıklıkla dizanteri benzeri enfeksiyonlara ve ateşin yükselmesine neden olur. Bu suşlar, ince bağırsağa yapışıp kolonize olmalarını sağlayan K antijeni ve ishal belirtilerinden sorumlu olan enterotoksin oluştururlar (46). Bunun dışında nadiren de olsa laktasyon dışı dönemde meme apselerinden izole edilebilmektedirler (35). Proteus cinsi Proteus cinsindeki bakteriler pleomorfik, Gram negatif, sporsuz, kapsülsüz ve hareketli bakterilerdir. Genel olarak insan barsak florasında, lağım sularında, kokmuş organik maddelerde ve kirli sularda bulunurlar. Enterobacteriaceae ailesinde yer alırlar (45). Proteus cinsi bakteriler özellikle üriner sistem infeksiyonları başta olmak üzere yara enfeksiyonları, organ apseleri, pnömoni, septisemi olgularından sıklıkla ve nadiren mastitlerden izole edilirler. Tek başlarına veya başka bakterilerle birlikte hastane infeksiyonlarına sebep olabilirler. Proteus bakterilerinin de dahil olduğu Enterobactericeae ailesinde yer alan bakterilerde geniş spektrumlu beta-laktamlar, 15 florokinolonlar ve aminoglikozidleri kapsayan çoğu antimikrobiyale direnç gelişimi önemli bir problemdir (46). Propionibacteriumcinsi Propionibacterium cinsi bakteriler Propionibacteriaceae ailesi içinde yer almaktadır. Propionibakteriler geç üreyen, sporsuz, Gram pozitif, anaerobik bakterilerdir. Çomak şeklinde veya dallanmış, tek tek, çiftler halinde veya grup halinde görülebilirler. Glukozdan propionik asit, laktik asit ve asetik asit üretirler. Gram pozitif hücre duvarları bakteriye yapısal kararlılık kazandırarak, kuruluğa, osmotik basınca ve mekanik strese karşı dirençli olmalarını sağlar(45).Propionibacterium cinsi bakteriler genellikle patojen değildirler bununla birlikte, kan kültürü ve vücut sıvılarında kotaminant olarak üreyebilirler ve başta akne vulgaris olmak üzere birçok enfeksiyona yol açabilirler. Propionibacterium cinsinde bulunan P.acnes anaerop ya da aerotoleran olabilen hareketsiz, sporsuz, Gram pozitif, pleomorfik bir çomaktır. Bu bakteri, deri, ağız, nazofarenks, gastrointestinal sistem, ürogenital sistem ve konjonktivanın normal florasında yer almaktadır. P.acnes kan kültürlerinden sıklıkla kontaminant olarak üretilmektedir. Bunun dışında P. acnes ve P. granulosum gibi patojen türler korneal apselere, kalp kapaklarında ve prostetik kalp kapaklarında apselere, memede apse oluşumlarına neden olmaktadır (48). Bacteroides cinsi Bacteroides cinsi, zorunlu anaerobik, sporlanmayan sakkarolitik, şeker ya da proteinleri fermente ederek türe bağlı olarak asetat ve süksinatı son ürün olarak oluşturan türleri içerir. Bacteroides normalde kommensal olarak insan ve diğer hayvanlarda bulunur. Aslında Bacteroides türleri insan kalın bağırsağında sayı olarak baskın olup, yapılan ölçümlerle insan dışkısının bir gramında 1010 kadar hücrenin varlığı gösterilmiştir (46). Bacteroides türleri, sifingolipidleri sentezleyen çok az birkaç gruptan biridir. Sifingolipidler, gliserol yerine uzun-zincirli amino grup alkol sifingozinin yer aldığı lipidlerin heterojen toplamıdır. Sifingolipidler, sifingomiyelin, serebrositler ve gangliyositler gibi, memelilerin özellikle beyin ve diğer sinir dokularında yaygın olarak bulunurlar (46). Bacteroides cinsi safraya dirençli ve duyarlı olanlar şeklinde iki gruba ayrılır. %20 oranında safraya dirençli olanlar Bacteroides fragilis grubu olarak tanımlanır ve kanamisin, vankomisin ve kolistin tanı disklerine dirençlidirler. Gram boyamada soluk, 16 düzensiz boyanma özelliğindedirler. B.fragilis karaciğer, akciğer ve beyin apseleri yapabilir. Anaerop bakteriyemilerin %70’inden sorumlu olan bu bakterinin nonlaktasyonel mastitli hastaların apselerinden de izole edildiğini belirten kaynaklar bulunmaktadır (4, 44, 49). Clostridium cinsi Clostridium cinsinde bulunan bakteriler sporlu, iri veya irice, düz veya hafif bükük, bazen limon, lobut ve iğ şeklinde zorunlu anaerop çomakcıklardır. Bunlar Gram pozitif ve genellikle hareketli bakterilerdir. Sporlar genellikle hücreden daha geniştir, ya içte uca yakın veya uçta olurlar (50). Clostridium türleri toprakta, suda ayrıca C. perfringens ve C. sporogene gibi bazıları insan ve hayvanların bağırsaklarında bulunur. Bu türler ölüm sonrası kan ve dokuları sarar ve Proteus’larla birlikte ölünün kokuşmasına ve parçalanmasına neden olurlar (50). Clostridium türleri canlı dokuda çoğalmazlar, fakat ölü dokuya yerleşince ürer ve saldıkları toksinlerle hastalığa neden olurlar. Clostridium türleri vücut direncinin kırıldığı hallerde bulundukları bağırsak boşluğu ve diğer yerlerden dokulara geçerek endojen enfeksiyonlara yol açarlar (50). Clostridium bakterileri bakteriyemi ve sepsis yaptıkları gibi deride ve yumuşak dokularda irin yapan enfeksiyonlar, anaerobik selülit, perirektal apse, diyabetlilerin yatak ülserleri, bası yaraları, konjonktüvit, gazlı gangren veya miyonekroz da yaparlar. C. perfringens hayvanlarda ve insanlarda mastite neden olmaktadır (50). Bakterilerde antimikrobiyal direncin giderek yaygınlaştığı ve gerek bakterinin direnç profili gerekse biyofilm oluşturma özelliği nedeni ile tedavide güçlükler yaşandığı birçok kaynakta belirtilmektedir. Mastit etiyolojisinde rol oynayan tüberküloz dışı bakterilerin de antimikrobiyal direnç durumları hakkında bilgi sahibi olunması yeni tedavi seçeneklerinin belirlenmesi bakımından büyük önem taşımaktadır (51, 52). 2.4. Biyofilm Biyofilm, canlı veya cansız bir yüzeye yapışarak kendi ürettikleri organik bir ekzopolisakkarid matriks içine gömülü ve hareketsiz olarak birbirine, bir katı yüzeye veya bir ara yüzeye geri dönüşümsüz olarak tutunmuş halde yaşayan mikroorganizmaların oluşturduğu topluluktur (52). Biyofilm, insan vücudunda kateterler, kontakt lensler, protez kalp kapakçıkları ve kalp pilleri, rahim içi araçlar, böbrek taşı, akciğer dokusu, meme dokusu gibi canlı ve cansız birçok yüzeyde 17 bulunabilir (51). Tıbbi uygulamalarda girişimsel tekniklerin ve kalıcı tıbbi araçların kullanımının artışı biyofilm enfeksiyonlarının da artışına neden olmuştur. Kalıcı tıbbi araçlar üzerinde gelişen biyofilmler Gram pozitif ve/veya Gram negatif bakteriler ve/veya mayalardan oluşur (52). Biyofilmde yer alan mikroorganizmalar antimikrobiyal ajanlara, planktonik şekillerine göre 200-500 kat daha dirençlidir (53).Biyofilm ortamı sadece antibiyotiklere karşı değil, dezenfektanlara karşı da direnç gelişmesinde rol oynamaktadır. Biyofilm tabakası içindeki bakteriler sıvı ortamda serbest üreyen bakterilere göre, dezenfektanlara 10-100 kat daha dirençlidir. Biyofilm üreten bakteriler antiseptik solüsyonlar içinde uzun süre canlı kalabilmektedir. Dezenfektanlara dirençli biyofilm üreten kökenlerin yol açtığı salgınlar bildirilmiştir (54). Biyofilm hücrelerinin kendi aralarındaki etkileşimlerisonucunda genetik yapılarında değişiklikler gözükmektedirve biyofilmler ekstrakromozomal DNA değişimleri için ideal ortamlar oluşturur. Direnç plazmidlerininaktarılması sayesinde genetik yapısı değişen hücrelerantimikrobiyal ajanlara karşı daha fazla direnç geliştirmişolurlar (55). Staphylococcus aureus veStaphylococcus epidermidis’in temel etiyolojik etkenler olarak kabul edildiği laktasyonel mastitte, antibiyotik tedavisine istenilen yanıtın alınamaması, bu iki stafilokok türünde görülen çoklu antibiyotik direnci ve biyofilm oluşturabilme özellikleri ile de ilişkilendirilmiştir (1). 2.5. Bakteri Tanımlaması Günümüzde teknolojik ilerlemelerle birlikte bakteri tanımlamasında kullanılan yöntemler hızla gelişmektedir. Konvansiyonel yöntemler tamamen terk edilmemekle birlikte çoğunlukla yarı otomatize ya da otomatize sistemlerle hatta daha da ileri giderek moleküler yöntemlerle bakterilerin tanımlamasına gidildiği görülmektedir. 2.5.1. Konvansiyonel Yöntemlerle Tanı Konvansiyonel yöntemler bakterinin fenotipik ve biyokimyasal özelliklerine göre bakterinin tanımlanmasını amaçlamaktadır. Mikrobiyoloji laboratuvarında bakteri tanımlanmasında konvansiyonel yöntem olarak mikroskobi, kültür ve serolojik tanı yöntemleri kullanılmakta ayrıca moleküler yöntemlerle de tanıya gidilebilmektedir. 18 Mikroskopi Bu yöntemde, mikroorganizmaların büyütülerek gözle görülebilmesi ve ayrıntıların incelenebilmesi amaçlanmıştır. Mikroskobik incelemelerde aydınlatma, ışık kaynağı ya da elektron yığınları aracılığı ile sağlanmaktadır. İstenen incelemenin özelliğine göre aerop ve anaerop bakterilerin incelenmesinde genellikle ışık mikroskopları kullanılmaktadır (56). Klinik mikrobiyolojide mikroskopi örneklerin değerlendirilmesi aşamasında en temel yöntemlerin başında gelmektedir. Bu yöntem faydalı ve çabuk bilgiler sağlayabilir. Mikroskobik incelemelerde çeşitli boyama yöntemleri kullanılmakta ve bunların başında Gram boyama yöntemi gelmektedir. Hazırlanan ve Gram yöntemiyle boyanan preparatlar önce küçük büyütme ile incelenmeli, hücre dağılımı ve oranları konusunda fikir edinilmeli ve özellikle araştırılacak alanlar böylece belirlenmelidir. Örneğin bir apse örneğinde yoğun lökosit kümelerinin belirlendiği alanlar daha özenle taranmalıdır. Gram incelemelerde bakterilerin morfoloji ve boyutları da belirlenebilir ve boyanma özelliklerine ek olarak şekil özellikleri de belirlenerek ileri tanımlayıcı işlemler yapılır ayrıca kültür sonuçları buna göre yorumlanır (57). Kültür Aerop ve anaerop bakterilere ait özelliklerin incelenebilmesi, metabolik aktiviteleri sonucu oluşan ürünlerin belirlenebilmesi ve bu ürünlere göre tanımlanabilmeleri için üretilmeleri gerekmektedir. In vitro koşullarda saf kültür şeklinde üretim besiyerlerinde mümkün olabilmektedir. Bakterilerin üreyebilmesi için gereksinim duydukları maddeleri içeren ortamlarda yalnızca tek türe ait bir mikroorganizmanın üretilebilmesi sonucu o mikroorganizmanın saf kültürü elde edilir (50). Aerop bakterlerin üretilebilmesi için genelde %5 oranında katılan koyun kanı ile zenginleştirilmiş genel üretim besiyerlerinden olan, koyun kanlı agar, çukulatamsı agar ve seçerek üretici bir besiyeri olan MacConkey agar tercih edilmektedir. Bakteri tanımlamasında tanıtıcı besiyeri olarak başta üç şekerli demirli agar (TSI) besiyeri olmak üzere hareket besiyeri, üre besiyeri gibi aranan özelliğe spesifik olan pek çok besiyeri kullanılabilmektedir (50). Anaerop bakterilerin üretilmesi ve tanımlanması için ise seçerek üretici besiyerleri olan kanlı, kanamisin-vankomisinli anaerop agar, kanlı, fenil etil alkollü anaerop agar, kanlı anaerop agar ve zenginlestirilmiş tiyoglikolatlı sıvı 19 besiyerleri kullanılmaktadır. Aerop ve anaerop bakterilerin üretilmeleri için uygun atmosferin sağlanmasına özen gösterilmektedir (50). Seroloji Mikrobiyoloji laboratuvarında bakteri tanımlanmasında mikroskopi ve kültür yöntemlerinin yanı sıra hasta serumunda etkene özgül bağışık yanıtın belirlenmesine dayanan bir yöntem olan seroloji de kullanılmaktadır. Hasta serumunda etkene özgü bağışık yanıtın belirlenmesi, immün sistemin hücreleriyle gerçekleşmektedir. İmmün sistem yanıtının belirlenmesinde kullanılan temel hücreler antijene karşı gelişen antikorlardır. Serolojik testler; enfeksiyon hastalıklarının tanısında, bilinen mikroorganizmaya özgün antijenlerin kullanılmasıyla hasta serumundaki antikorların saptanmasında, bilinen antikorlar içeren bağışık serumların kullanılarak hasta materyalindeki mikroorganizma antijenlerinin belirlenmesinde, kişinin bağışıklık durumunun saptanmasında ve etken olan mikroorganizmanın serogrup, serotip, immünotipinin saptanmasında kullanılmaktadır. Klinik mikrobiyolojide immünolojik tanıda; antijen antikor reaksiyonları ile tanımlama, monoklonal antikorlarla tanımlama, katı faz immünoassey yöntemleri ve immünofloresans teknikleri ile tanımlama şeklinde 4 temel yöntem kullanılmaktadır (58). 2.5.2. Yarı -Otomatize Yöntemlerle Tanı Bakterilerin tanımlanmasında API kitleri Mikrobiyoloji laboratuvarında bakterilerin konvansiyonel yöntemlerle tanımlanmasında kullanılan geleneksel biyokimyasal testlerde yoğun işgücü, yüksek miktarda ayıraç ve besiyeri tüketilmektedir. Bundan kaçınmak için minyatürize biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir. Son yıllarda API kitleri aerop ve anaerop bakterilerin tanımlanmasında sıklıkla kullanılmaktadır. Kitler (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France) özel olarak hazırlanmış bir veritabanı ile birlikte standartlaştırılmış ve minyatür hale getirilmiş biyokimyasal testler kullanarak hazırlanmış bir tanımlama sistemidir. Dehidrate test maddelerini içeren 20 mikrotüp içeren bir stripten oluşmuştur. Bu mikrotüpler, özel medyumu ile hazırlanmış bir bakteri süspansiyonu ile ekilir. İnkübasyon sırasında, enzim substrat reaksiyonları sonucunda oluşan değişiklikler, kendiliğinden veya ilave testler sonucunda oluşan renk değişikliği ile görülür hale gelir. Bu reaksiyonlar okuma tablosuna göre okunur ve analitik profil indeksi veya bilgisayar tanımla programı ile tanımlanır(59). 20 2.5.3. Otomatize Sistemlerle Tanı Bakterilerin Tanımlanmasında VITEK, PHOENIX yöntemleri Otomatize yöntemlerle tanı, yarı otomatize yöntemlerle bakteri tanımlanmasında olduğu gibi yoğun işgücü, yüksek miktarda ayıraç ve besiyeri tüketiminden kaçınmak için geliştirilmiştir. Bu tip minyatürize biyokimyasal yöntemlerde dehidrate ayıraçlar veya kullanıma hazır besiyerleri kullanılmktadır. Bu yöntemler, pleytlerde hazır bulunan sıvı veya katı besyerlerine saf kültürlerin inoküle edilip inkübe edilmesi ve enzim-substrat ilişkisine bağlı oluşan renk değişimleri veya gaz oluşumuyla bakterilerin belirlenmesini esas almaktadır. Son yıllarda tam otomatize tanı yöntemlerinden olan VITEK ve PHOENIX yöntemi aerop ve anaerop bakterilerin tanımlanmasında sıklıkla kullanılmaktadır (60). 2.5.4. Moleküler Yöntemlerle Tanı Başta tıp olmak üzere moleküler teknikler, hızlı sonuç vermeleri ve özgüllükleri nedeni ile pek çok alanda kullanılmaktadır. Enfeksiyon hastalıklarında moleküler tekniklerin kullanıma girmesiyle, etkeni üretilemeyen ya da geç üreyen mastit gibi pek çok hastalığın etkenleri tespit edilmiştir. Bunun dışında, bakteriyel enfeksiyonlarda etkenlerin tanımlanıp direnç haritalarının belirlenmesinde de moleküler yöntemler kullanılabilmektedir. Enfeksiyon hastalıklarının moleküler tanısında kullanılan başlıca teknikler; nükleik asit probları ile tanı, amplifikasyon teknikleri ile tanı ve DNA dizi analizi ile tanıdır (61). Nükleik asit probları ile tanıda; tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesini tamamlayıcı olan ve belirleyici olarak kullanılan tek iplikli, özgün ‘’prob’’ adı verilen nükleik asit parçaları kullanılmaktadır. Bu problar, enzim, radyoizotop gibi maddelerle işaretlenerek tamamlayıcı oldukları nükleik asit dizileriyle hibridize olmaktadır. Ancak bu yöntem apse gibi klinik örneklere sık uygulanmamaktadır. Amplifikasyon teknikleri ile tanıda, yöntem direkt olarak klinik örnekte var olan bir nükleik asit bölgesinin çoğaltılmasına dayanır. Kültürün zor olduğu durumlarda özellikle tercih edilir. DNA dizi analizi yönteminde ise DNA’nın nükleotid dizilerinin saptanması esas alınmıştır. Bu yöntem dizi analizi yapılacak DNA’nın hazırlanması, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi olmak üzere üç ana aşamadan oluşmaktadır. DNA dizi analizi ilaç dirençlerine neden olan mutasyonların saptanmasında da moleküler altın standart olarak kabul edilmektedir (61). 21 2.5.4.1. 16S rRNA Analizi 16S rRNA gen bölgesi filogenetik ilişkinin belirlenmesinde ve bakteriyal tanımlama çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. 16S rRNA gen bölgesi RNA’nın bir alt birimi olup toplam uzunluğu yaklaşık 1540 nükleotittir. Yüksek oranda korunmuş bölgeleri içeren 16S rRNA gen bölgesi tüm türlerin tanımlanmasında oldukça yararlıdır ve bu bölgeler türe spesifiktir (62). Korunmuş bölgeler yavaş evrimleştikleri için taksonomik karşılaştırmaları sağlayacak verileri içermektedir. 16S rRNA sekans verileri gen bankalarında biriktirilmekte ve ihtiyaç duyulduğunda bu veriler gen bankalarından kolaylıkla elde edilebilmektedir (62, 63, 64). 16S rRNA dizisinde saptanan bir farklılığın %3’ten fazla olması yeni bir tür olarak yorumlanabilmektedir. Bunu destekleyen en önemli veri, 16S rRNA dizisinde %97’den az benzerlik gösteren iki prokaryotun genomik DNA’larının genelde %70’ten az hibridize olduğudur (65, 66, 67). 16S rRNA dizisi, cinsler ve doğru kararlaştırılmış türler arasında ilişki kurmak ve onları birbirlerinden ayırt etmek için kullanılmaktadır. Ancak son dönemde yapılan bazı çalışmalar sadece 16S rRNA gen bölgesinin yeni bir türü belirlemek için yeterli olamayabileceğini de göstermiştir (68). 16S rRNA gen sekansları, fizyolojik testler ve DNA-DNA hibridizasyon (DDH) analizlerinde, cins içerisindeki türlerin filogenetik olarak sınıflandırılmasında kullanılan başlıca metodlardır. 16S rRNA gen analizleri ve DNA-DNA hibridizasyonu, modern bakteriyal taksonominin “altın standardı” olmalarına rağmen bazı dezavantajları da olduğu bilinmektedir. 16S rRNA molekülünün yüksek oranda korunmuş yapısı bakterilerin cins seviyesinde ve cins içindeki türlerin %98,7 sekans benzerliğinin üzerindeki değerlerle ayrımında oldukça faydalı olduğu halde, 16S rRNA gen sekans karşılaştırmaları çok yakın ilişkili türler arasında kesin bir ayırım için yeterli olamayabilmektedir (68, 69, 70). 2.6. Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Antibiyotikler mikroorganizma türleri tarafından sentezlenen ve diğer mikroorganizmaları öldüren ya da üremelerini durduran doğal maddelerdir. Geçmişte sentetik olarak üretilen benzer etkideki maddelere kemoteröpetik adı verilmiş olsa da, günümüzde üretilen antibiyotiklerin de sentetik olması nedeniyle ‘antibiyotik’ tanımı tümünü kapsamaktadır (47). Günümüz mikrobiyoloji uygulamalarında bir bakterinin tanımlanması ne kadar önemli ise, o bakterinin antibiyotiklere olan direncinin 22 öğrenilmesi de aynı derecede önem kazanmıştır. Bakterilerde antibiyotik direnci, antibiyotik kullanımını takiben başlamış ve günümüzde oldukça önemli bir sorun haline gelmiştir. Bu sorun günümüzde, var olan tüm antibiyotiklere dirençli bakterilerle gelişen enfeksiyonlara neden olmaktadır. Yetersiz doz ve sürede uygulanan antibiyotik tedavisi ve kullanılan uygunsuz antibiyotikler, dirençli suşların ortamda çoğalması ve yayılması açısından büyük öneme sahiptirler. Antibiyotik direnci doğal ya da kazanılmış olabilir (47). Mikrobiyoloji laboratuvarında bakterilerin antimikrobiyal duyarlılığı/direnci çeşitli yöntemlerle test edilebilir. Disk Difüzyon Yöntemi Bu test antibiyotiklerin bakterilere karşı etkinliklerini saptamada en yaygın şekilde kullanılan ve uygulaması en kolay olan testtir. Test belirlenmiş yoğunluktaki bakteri süspansiyonunun yayıldığı besiyeri yüzeyine standart miktarda antibiyotik emdirilmiş disklerin konulması ile uygulanır. 37 °C’de 24 saatlik inkübasyon sırasında antibiyotik agar içinde giderek azalan gradyent oluşturacak şekilde difüze olurken bakteriler de üremektedir. Sonuç olarak, antibiyotik diski etrafında bakterilerin üreyemediği bir zon oluşur ve bu zona inhibisyon zonu adı verilir. Testin sonucunda elde edilen zon çapı değerleri uluslararası geçerli kılavuzlarda belirtilen değerlerden büyükse bakteri antibiyotiğe duyarlı küçükse dirençli olarak yorumlanır. İki değer arasında kalan sonuçlar orta duyarlı olarak verilir. Bu yöntemle Petri kutusunda bakterinin birçok antibiyotiğe karşı duyarlılığı belirlenebilmektedir (47). Dilüsyon Testleri Bu yöntemle, bakterilerin üremesini durduran en küçük değer (minimal inhibitör konsantrasyon: MİK) ya da bakteriyi öldüren en küçük değer (minimal bakterisidal konsantrasyon: MBK) saptanır. Test, sıvı veya katı besiyerlerinde yapılabilir. Sıvı dilüsyon testlerinin uygulaması için antibiyotiğin belirli oranlarda dilüsyonları hazırlanır ve tüplere dağıtılır. İşlemler steril koşullarda gerçekleştirilmelidir. Daha sonra hazırlanan 105 bakteri/mL içeren süspansiyondan eşit hacimde her tüpe dağıtılır. Pozitif kontrol için hiç antibiyotik içermeyen besiyerine de ekim yapılır ve negatif kontrol için bir adet bakteri eklenmemiş antibiyotik süspansiyonu da inkübasyona kaldırılır. 24 - 48 saat sonra değerlendirme yapılır. Gözle görülebilir üremeyi engelleyen en küçük değer o antibiyotiğin MİK’i olarak belirlenir. Bakterilerin ölüp ölmediğinin anlaşılması için 23 üreme görülmeyen tüplerden katı besiyerlerine pasajlar alınır. Üreme görülmeyen veya <10 koloni belirlenen tüpler MBK değerini verir. Agar dilüsyon testlerinde de temel yöntem aynıdır, antibiyotiği belirli oranlarda içeren plaklar dökülür ve bakteri süspansiyonundan bu plaklara ekim yapılır. Üremenin görülmediği plaktaki antibiyotik yoğunluğu MİK değerini verir (47). E-test Yöntemi MİK değerini tayin eden bir diğer yöntem E-test yöntemidir. Belirli bir antibiyotiğin bir şeride belirli oranlarda emdirilmesi sonucu elde edilir. Besiyeri disk difüzyon yöntemindeki gibi hazırlanır ve diskler yerine konulan E-test şeritleri değerlendirilir. Ürememe zonunun şeridi kestiği yerde okunan oran MİK değeridir. Antibiyotiğin MİK değerinin belirlemesinde kullanılan yeni ve en kolay yöntemdir. Dezavantajları standartlarının henüz oturmamış olması ve pahalı bir yöntem oluşudur (47). Otomatize Ticari Sistemler Bu sistemler, bir bilgisayar ya da kitapçıklar yardımıyla bir kerede bakterinin, pek çok özelliğine bakarak tanımlanmasını sağlayan ticari sistemlerdir. Bu sistemlerin bazılarında (Phoenix vb.) bakterinin belirli antibiyotikler için MİK değerini de belirleme imkanı vardır (47). Biyokimyasal Testler ile Antibiyotik Direnci Araştırılması Bu yöntemlerde bakterilerin antibiyotikleri parçalamak amacıyla oluşturdukları enzimlerin saptanması amaçlanmaktadır. Beta laktamaz yapımı ile direnç gelişimi özel olarak pH değişikliğini yani beta laktamın yıkımını gösteren maddeler emdirilmiş çubukçuklar ve diskler kullanılarak araştırılır. Bazen bir deney tüpünde bakteri ve penisilin karıştırılarak yapılsa da testler için en çok nitrosefin disk ve çubukçukları kullanılır. Gonokok, enterokok, stafilokok, gibi pek çok bakteri için kullanılabilirler (47). Moleküler Metodlarla Direnç Araştırılması Bakteri kromozomunda olan mutasyonlar ya da bakterilere dışarıdan ulaşan genetik elemanlar dirence yol açarlar. Direnç, bu mutasyonu ya da genetik elemanları ortaya çıkararak belirlenebilir. Fakat bu direnç geninin varlığı mutlaka direnç anlamına gelmez çünkü bu gen aktif değilse bakteri dirençli olmayabilir. Bu şekilde direnç 24 belirlenmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), DNA dizileme metodları, DNA probları, gibi pek çok yöntem kullanılmaktadır. Günümüzde moleküler metodlar M. tuberculosis gibi geç üreyen bakterilerin direncinin belirlenmesi ve en sık olarak da dirençli bakterilerin epidemiyolojik olarak izlenmesinde kullanılmaktadırlar (47). 2.7. Duyarlılık testlerinde kullanılan antibiyotikler β-Laktamlar Yapılarında β-laktam halkası taşımaları nedeniyle bu ismi almışlardır. β-laktam antibiyotikler peptidoglikan sentezinin son aşamasında rol alan transpeptidaz enzimlerine bağlanarak bakteri hücre duvarı sentezini durdururlar. Bu nedenle transpeptidaz enzimleri ‘Penisilin Bağlayan Proteinler (PBP)’ olarak da adlandırılmaktadır. Hücreyi bir kafes gibi sararak osmotik basınçla patlamasını önleyen peptidoglikan tabakasının, β-laktam antibiyotikler tarafından bozulması hücrenin erimesine neden olurlar (47). Penisilinler Penisilinler bakteri hücre duvarı sentezini durdurarak etki gösteren antibiyotiklerdir. Doğal penisilinler, bazı Penicillium cinsi küflerin fermentasyonu ile elde edilir. Özellikle aerop ve anaerop Gram pozitif bakterilere etkilidir bunun dışında Neisseria ve spiroketlere de etkilidir. Buna karşın doğal penisilinlere dirençli olanlar Bacteroides fragilis ve aerop Gram negatif çomakların çoğudur (47). Doğal penisilinler, oral ve parenteral olarak kullanılabilir ve iki çeşittir. Penisilin G mide asidi ile inaktive olduğundan yalnızca parenteral olarak uygulanabilmektedir. Aynı zamanda penisilin G böbreklerden hızla atıldığından tedavide sık aralıklarla uygulanması gerekmektedir. Kandaki düzeyini yüksek tutarak uygulama sıklığını azaltan prokain penisilin ve benzatin pensilin gibi sadece kas içi uygulanan bileşikleri de vardır. Penisilin V mide asidine dirençlidir ve oral kullanılır (47). Yarı sentetik penisilinler, doğal olarak elde edilen penisilinlerin antimikrobik aktivitelerini, vücutta dağılım ve atılımlarını, mide asidine dirençlerini ve bakeriler tarafından sagılanan enzimlere dayanıklılıkları arttırılmak üzere, bazı kimyasal gruplar eklenerek sentez penisilinlergrubunda bulunmaktadır (47). edilen penisilinlerdir. aminopenisilinler, Geniş spektrumlu karboksipenisilinler, yarı sentetik üreidopenisilinler 25 Aminopenisilinler Gram pozitif bakterilerden enterokoklara ve Listeria monocytogenes’e penisilin G’den daha etkilidir. Bunun dışında Escherichia coli, Salmonella, Shigella Karboksipenisilinler gibi Gram Enterobacter, negatif barsak Citrobacter, bakterilerine Serratia de üzerinde etkilidir. etkilidirler. Üreidopenisilinlerin ise etki spektrumu karboksipenisilinlere oranla daha geniştir ve streptokok ve enterokoklara daha iyi etkilidirler (47). Sefalosporinler Penisilindeki tiazolidin halkasının yerinde dihitrotiazin halkası içerirler. Sefalosporinler de penisilinler gibi bakteri hücre duvarı sentezini durdurarak etki eden antibiyotiklerdendir. Sefaosporinler genel özelliklerine ve antibakteriyel spektrumlarına göre 5 kuşağa ayrılmışlardır. Birinci kuşak sefalosporinler özellikle aerop ve anaerop Gram pozitif kok şeklinde bakterilere etkilidirler. Fakat Enterobacteriaceae üyelerine ve Pseudomonas cinsinden bakterilere etkisizdirler. İkinci kuşak sefalosporinler Gram negatif bakterilere karşı 1. kuşak sefalosporinlerden daha etkilidirler. Oral ve parenteral formları bulunmaktadır ve beyin-omurilik sıvısına geçebilirler. Üçüncü kuşak sefalosporinler özellikle antibiyotiklere dirençli Gram negatif çomaklar ile oluşan ciddi enfeksiyonların tedavisinde kullanılırlar. Gram pozitif bakterilere karşı 1. kuşak sefalosporinler kadar etkili değildirler. Dördüncü kuşak sefalosporinler genel olarak üçüncü kuşak sefalosporinlere benzer etki gösterirler ancak kromozomal β-laktamazlara karşı daha dirençlidirler. Beşinci kuşak sefalosporinler Gram negatif çomaklara, Pseudomonas’lara ve metisiline dirençli stafilokoklar dahil Gram pozitif bakterilere etkilidirler (47). Monobaktamlar Grubun tek üyesi aztreonamdır ve yalnızca Gram negatif aerop bakterilere etkilidir. Enterobacteriaceae ailesindeki bakterilere, Pseudomonas, Neisseria ve Haemophilus cinslerine etkilidir. Gram pozitif bakteriler ile anaerop bakterilere etkisizdir. Etki mekanizması bakteri hücre duvarı sentezini durdurmaktır (47). Karbapenemler Gram pozitif ve Gram negatif, aerop ve anaerop bakterilerin çoğuna etkili, bilinen en geniş spektrumlu β-laktam antibiyotiklerdir. Kromozomal veya plazmid kaynaklı β-laktamaz oluşturan birçok bakteriye karşı etkilidirler. Ancak karbapenemaz özelliğinde β-laktamaz oluşturan Stenotrophomonas maltophilia’ya ve bazı 26 Bacteroidesfragilis suşlarına etkisizdir. İmipenem böbrekte bulunan dehidropeptidaz enzimi ile hızla hidrolize olur. Bunu önlemek için dehidropeptidazın spesifik inhibitörü olan silastatin ile birlikte kullanılır. Meropenem dehidropeptidaz enzimine dirençlidir. İmipenem menenjitli hastalarda konvulziyonlara neden olduğundan, menenjit tedavisinde kullanılmaz. Doripenemin etkinliği hemen hemen imipenem ve meropenem ile aynıdır. Ertapenem, Enterobacteriaceae üyelerine, Haemophilus, Moraxella, Neisseria, Pasteurella gibi zor üreyen Gram negatif çomaklara diğerlerinden daha etkilidir. Ancak Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter’lere etkisizdir (47). Glikopeptidler ve Lipopeptidler Glikopeptidler hücre duvarı sentezini, peptidoglikanın yapısındaki N-asetil müramik aside bağlı pentapeptidin son iki amino asidine (D-Ala-D-Ala) bağlanarak önlerler. Glikopeptidler yalnızca Gram pozitif aerop ve anaerop bakterilere etkilidirler. Gram negatif bakterilere etkisizdirler bunun nedeni glikopeptid yapıdaki antibiyotik moleküllerinin Gram negatif bakteri hücre duvarındaki dış zardan geçemeyecek kadar büyük olmasıdır. Bu grubun halen tedavide kullanılan iki üyesi vankomisin ve teikoplanindir. Metisiline dirençli stafilokok enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılan başlıca antibiyotikler vankomisin ve teikoplanindir. Ayrıca penisiline direçli enterokok enfeksiyonlarında ve Clostridium difficile’nin oluşturduğu psödomembranöz enterokolit tedavisinde de kullanılmaktadırlar. Vankomisin türevi olan oritavansin ve telavansin ile teikoplanin türevi olan dalbavansin yeni kullanıma giren lipoglikopeptid antibiyotiklerdir. Bunların dışında siklik lipopeptid grubunun tek üyesi olan daptomisin, Gram pozitif bakteri sitoplazmik zarının fonksiyonlarını bozarak hücre ölümüne neden olur (47). Aminoglikozidler Aminoglikozidler ribozomun 30S alt ünitesine bağlanarak protein sentezini inhibe ederler. Streptomisin, aminoglikozidlerin ilk üyesidir ve tüberküloz tedavisinde bir devrim yaratmıştır. Daha sonra neomisin, kanamisin, gentamisin, tobramisin, amikasin, netilmisin ve isepamisin kullanıma girmiştir. Aminoglikozidler anaerop bakterilere etkisizdir. Aminoglikozidler, aerop Gram negatif çomaklara çok etkilidirler. Ancak Gram pozitif bakterilere olan etkinlikleri oldukça sınırlıdır. Streptomisin ve amikasin Mycobacterium tuberculosis’e etkilidir ve minör antitüberküloz ilaçlar 27 grubunda yer alır. Aminoglikozidlerin doz ve süre ile ilişkili ototoksisite ve nefrotoksisite gibi iki önemli yan etkileri vardır ve bu nedenle tedavi sırasında izlem önemlidir (47). Tetrasiklinler Tetrasiklinler de ribozomun 30S alt ünitesine bağlanmak suretiyle protein sentezini inhibe ederek etki gösterirler. Bu grupta bulunan antibiyotikler klortetrasiklin, oksitetrasiklin, tetrasiklin, demetilklortetrasiklindir. Doksisiklin ve minosiklin ise yarı sentetik tetrasiklinlerdir. Tetrasiklinler sitoplazma zarından hem enerjiye bağımlı aktif transport sistemleri hem de enerjiden bağımsız mekanizmalarla hücre içine girer ve ribozomların 30S alt ünitine bağlanıp aminoaçil tRNA’nın ribozoma bağlanmasını engelleyerek, protein sentezini durdururlar. Tetrasiklinler geniş spektrumludur. Gram pozitif ve Gram negatif aerop ve anaerop bakterilere etkilidirler. Ancak birçok Gram negatif çomak cinsi, stafilokoklar, pnömokoklar ve gonokoklar tetrasikline direnç kazamıştır. Ayrıca metisiline dirençli stafilokokların tedavisinde kullanılabilirler (47). Kloramfenikol Bakteri ribozomunun 50S alt ünitinin peptidiltransferaz bölgesine reversibl olarak bağlanarak transpeptidasyonu önlerler ve bakteriyostatik etki meydana getirirler. Gram pozitif ve Gram negatif aerop ve anaerop bakterilere, Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia cinslerine de etkili olan, bilinen en geniş spektrumlu antibiyotiklerden biridir. Ancak bazı hastalarda kemik iliği inhibisyonu sonucu aplastik anemi yapar dolayısıyla kullanımı sınırlıdır. Pratikte pek kullanımı olmasa da tifo tedavisinde en etkili antibiyotiklerden olması ve ucuz olması nedeniyle halen kitaplarda ve tedavi rehberlerinde yer almaktadır. Tiamfenikol kloramfenikolden türetilmiştir ve etki spektrumu kloramfenikole benzer, daha az toksiktir (47). Makrolidler Makrolidler bakteri ribozomunun 50S alt ünitine bağlanır ve tRNA’nın ribozomdan ayrılmasını önleyerek protein sentezini inhibe ederler. Makrolid antibiyotikler özellikle Gram pozitif bakterilere etkilidirler. Yarı sentetik makrolidlerden H. influenza’ya ekili olanlar klaritromisin ve azitromisindir. Bu antibiyotiklerin özellikle solunum yolu enfeksiyonlarında kullanılmasının nedeni alveolar makrofajlarda yüksek konsantrasyona ulaşmaları ve spektrumlarının solunum sistemi enfeksiyonu etkeni bakterilerin neredeyse tamamını kapsamasıdır. Eritromisin, 28 klaritromisin, azitromisin günümüzde en sık kullanılanlardır. Eski makrolidlerden spiramisin halen toksoplazmoz tedavisinde kullanılmaktadır (47). Linkozamidler Etkilerini bakteri ribozomunun 50S alt ünitesine bağlanıp protein sentezini inhibe ederek gösterirler. Bu grubun iki üyesi vardır, ilki linkomisin diğeri klindamisindir. Bu iki üyenin etki spektrumları benzerdir. Ancak klindamisinin antimikrobiyal etkisi daha kuvvetlidir. Klindamisin Gram pozitif aerop bakterilere ve özellikle de Gram pozitif ve Gram negatif anaerop bakterilere etkilidir. Anaerop enfeksiyonların tedavisinde sıkça tercih edilmektedir. Ancak uzun süre kullanımında psödomembranöz kolite neden olabilirler. Penisilin duyarlılığı olan hastalardaki Gram pozitif kok enfeksiyonlarında alternatif olarak kullanılabilmektedir (47). Streptograminler Bakteri ribozomunun 50S alt ünitesine bağlanarak hem aminoaçil tRNA’nın ribozoma bağlanmasını, hem de mRNA’nın translasyonunu inhibe eder. Doza bağımlı olarak bakterisit etkileri vardır. Günümüzde özellikle metisiline dirençli S.aureus ve vankomisine dirençli enterokok tedavisinde yarı sentetik bir streptogramin olan kinupristin/dalfopristin kullanılmaktadır (47). Oksazolidinonlar Sentetik bir antibiyotik grubu olan oksazolidinonlardan günümüzde halen kullanımda olan yalnız linezolid vardır. Bakterinin 50S ribozomuna bağlanarak tRNA’ların buraya bağlanmasını engeller. Gram pozitif bakterilerin birçoğuna etkilidir. Metisiline dirençli stafilokok ve vankomisine dirençli enterokok enfeksiyonlarında kullanılmaktadır (47). Fusidik Asit Bakteriyostatik etki gösterir. Elongasyon faktörü 2, guanozin difosfat ve ribozom ile stabil bir kompleks oluşturma sonucunda, gelişmekte olan polipeptit zincirinin uzamasını inhibe eder. Gram negatif koklara ve stafilokoklara etkilidir. Ancak Gram negatif çomaklara karşı etkisizdir. Stafilokok enfeksiyonlarının tedavisi sırasında fusidik aside karşı direnç çok çabuk gelişir ve bu nedenle genellikle diğer antistafilokok özelliği olan antibiyotiklerle birlikte kombinasyon şeklinde kullanılır (47). 29 Kinolonlar Kinolonlar bakterilerde DNA replikasyonu, rekombinasyonu ve tamirinden sorumlu olan topoizomeraz enzimlerine bağlanarak nükleik asit sentezini ve fonsiyonunu bozarak etki göstermektedirler. Kinolonlar Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere karşı etkilidir. Kinolonlar DNA sentez ve onarımını bozarak bakterisit etki oluştururlar. Kinolonlar yüksek selektif toksisite gösterirler bunun nedeni, kinolonların bakteri topoizomerazlarına olan afinitesinin, ökaryot hücre enzimlerine oranla çok daha yüksek olmasıdır. İlk bulunan nalidiksik asittir ve bunu takiben Gram negatif bakterilere etkili, idrar yolu enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılan kinolonlar bulunmuştur. Günümüzde kullanılan kinolonlar iki halkalı kinolon nükleusuna fluor eklenerek sentez edilirler ve fluorokinolon olarak adlandırılırlar. En sık kullanılanlar siprofloksasin, ofloksasin, norfloksasin, levofloksasindir. Fluorokinolonlar Gram pozitif ve negatif aerop ve anaerop bakterilere etkilidirler (47). Rifamisinler mRNA sentezini, bakteri RNA polimeraz enzimine bağlanarak durdurur ve bakterisit etki gösterirler. Yüksek selektif toksisite gösterirler, bunun nedeni ökaryot hücrede mRNA sentezi inhibisyonu için gereken konsantrasyonun, bakteri hücresi için gerekenden 10,000 kat daha fazla olmasıdır. Rifampisin günümüzde en sık kullanılan rifamisindir. Gram pozitif ve negatif koklara etkilidir. Ayrıca tüberküloz tedavisinde kullanılan major ilaçlardan biridir. Buna ek olarak, vankomisin ile birlikte kombine şekilde metisiline dirençli stafilokok enfeksiyonlarında kullanılabilir (47). Sülfanomidler Sülfanomidler bakteri hücresindeki dihidropteroat sentetaz enzimi ile birleşekerek folik asit sentezini bozar. Selektif toksisite gösterirler. Sülfanomidlerin günümüzdeki kullanımı gelişen bakteri dirençleri nedeniyle kısıtlanmış olsa dahi geçmişte streptokok, stafilokok, meningokok, gonokok enfeksiyonlarında ve idrar yolları enfeksiyonlarında çok sık kullanılmışlardır. Ayrıca başka ilaçlarla kombine edilerek çeşitli protozoon cinsleri ile oluşan enfeksiyonların tedavisinde de kullanılırlar. Sülfanomid türevlerine örnek olarak sulfodiazin, sülfisoksazol ve sulfametoksazol verilebilir (47). 30 Trimetoprim Folik asit sentezinin son aşamasında yer alan dihidrofolat redüktaz enzimini inhibe edip dihidrofolik asidin tetrahidrofolik aside dönüşmesini engelleyerek etki göstermektedir. Ancak trimetoprim insandaki folik asit metabolizmasınıda etkiler. Bununla birlikte bakterideki hedef enzime uygunluğu, insandakinden 50,000 kat daha fazladır. Dolayısıyla insan için toksik değildir ve tedavi dozunda selektif toksisite gösterir. Sülfametoksazol/trimetoprim ile kombine edildiğinde folik asit sentezinin iki aşaması durdurularak sinerjik etki elde edilmektedir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan bu kombinasyon geniş spektrumlu ve birçok bakteriye etkilidir. Ancak anaerop bakterilere ve P.aeruginosa’ya etkisizdir. Üriner sistem enfeksiyonlarında sıklıkla kullanılır (47). Nitroimidazoller Mikroorganizma DNA’sına, kimyasal yapısındaki nitro grubundan hücre içinde yüksek derecede toksik metabolitlerin ortaya çıkması sonucu zarar verir. Güçlü bakterisit etki gösterirler. Zorunlu anaerop bakterilere karşı etkilidir. Tedavide en sık kullanılan türleri metronidazol, ornidazol ve tinidazoldür. Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis ve Entamoeba histolytica’ya etkilidir (47). Kloramfenikol Bakteri ribozomunun 50S alt ünitinin peptidiltransferaz bölgesine reversibl olarak bağlanarak transpeptidasyonu önlerler ve bakteriyostatik etki meydana getirirler. Gram pozitif ve Gram negatif aerop ve anaerop bakterilere, Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia cinslerine de etkili olan, bilinen en geniş spektrumlu antibiyotiklerden biridir. Ancak bazı hastalarda kemik iliği inhibisyonu sonucu aplastik anemi yapar dolayısıyla kullanımı sınırlıdır. Pratikte pek kullanımı olmasa da tifo tedavisinde en etkili antibiyotiklerden olması ve ucuz olması nedeniyle halen kitaplarda ve tedavi rehberlerinde yer almaktadır. Tiamfenikol kloramfenikolden türetilmiştir ve etki spektrumu kloramfenikole benzer, daha az toksiktir (47). Kolistin Kolistin polimiksinler grubuna ait polimiksin E olarak da adlandırılan parenteral olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Proteus, Providencia, Serratia ve Neisseria dışındaki Gram negatif bakterilere ve özellikle Pseudomonas’lara iyi etkili, Gram 31 pozitif bakterilere ve anaeroplara karşı etkisizdir. Kolistinin ciddi nörotoksik ve nefrotoksik etkileri olduğu bilinmekte ve dolayısıyla sistemik tedavide kullanılması tercih edilmemektedir. Kolistin çoğul dirençli Pseudomonas ve Acinetobacter ile oluşan hastane enfeksiyonlarında sistemik olarak da kullanılmaktadır (47). 2.8. İstatistiksel yöntemler Araştırmamızda laktasyonel mastitli hastalarda ve non-laktasyonel mastitli hastalardan granülomatöz mastitli olanlarda üretilen bakterilerle hasta grupları arasında bir ilişki (korelasyon) olup olmadığı SPSS ile Spearman’s korelasyon analizi yapılarak belirlenmiştir.Analizde bakteriler ve bu bakterilerin üretildiği hasta sayıları değişkenler olarak kullanılmıştır. 32 3. GEREÇ VE YÖNTEM Çalışmamız, Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Acil Cerrahi ve Genel Cerrahi Meme Polikliniği’ne başvuran ve klinik muayeneleri ve/veya histopatolojik inceleme sonuçlarına göre mastit tanısı almış olan 100 hastaya ait doku ve/veya apse cerahatleri ile gerçekleştirilmiştir. Örnekler Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı laboratuarlarında aerop ve anaerop bakterilerin varlığı yönünden incelenmiştir. Moleküler testler Roche Ar-Ge Laboratuvarlarında gerçekleştirilmiş (Y.L.Ö Zeynep Taner tarafından) ve sonuçlar danışman hoca (H.Bahar Tokman) tarafından değerlendirilmiştir. Çalışmamız, İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Etik kurulunca onaylanmıştır (Onay no:76624604/050.99–1465). Çalışmaya dahil olacak hastalar için temel kriterlerimiz: 1-Ergenliğe girmiş olmak. 2-Laktasyonel mastit tanısı almış olmak (Emzirme döneminde 38 ◦C üzerine çıkan ateş, memede eritem, hassasiyet ve şişkinlik belirtilerinden en az ikisinin varlığı ile) (2,23). 3-Non-laktasyonel mastit tanısı almış olmak (Meme dokusundan alınan örneğin histopatolojik incelemesinde yoğun inflamatuar reaksiyon ile hastalığın karakteristik özelliği olan non-kazeifiye granülomların görülmesi ve granülomatöz reaksiyon yapabilen diğer etiyolojilerin var olmadığının gösterilmesi ile ya da periareolar bölgede ciltte eritem, meme başında şişkinlik, sertlik, akıntı varlığı ile) (1,6, 29). 4-Tüberküloz mastit tanısı almamış olmak. 5-Meme kanseri tanısı almamış olmak. 6-Son 72 saatte antibiyotik kullanmamış olmak. Çalışmamızda aşağıda belirtilen gereçler kullanılmıştır. 33 3.1. Gereçler 3.1.1. Kullanılan Besiyerleri 3.1.1.1. Aerop Kültürler İçin Kullanılan Besiyerleri Koyun Kanlı Agar Besiyeri Agar base (oxoid) Defibrine koyun kanı Distile Su 40 g 50 mL 1000mL Üretici firmadan (Oxoid) toz besiyeri 500 g'lık kutuda hazır olarak alındı. 1000 ml distile suda 40 g toz besiyeri [(Tripton (14 g), nötralize pepton (4,5 g), maya özütü (4,5 g), sodyum klorit (5 g), agar (12 g)] eritildi. pH 7,3 ± 0,2’e ayarlandı ve 121 ˚C’de 15 dakika otoklavlandıktan sonra 45˚C’ye kadar soğutuldu. 50 mL defibrine koyun kanı ilave edilerek iyice karıştırıldı. 4 mm kalınlıkta olacak şekilde Petri kutularına dökülerek donduruldu. Koyun kanlı agar besiyeri bakterilerin hemoliz özelliklerini araştırmak amacıyla kullanıldı (71). Çukulatamsı Agar Besiyeri Agar base (oxoid) Defibrine koyun kanı Distile Su 40 g 50 mL 1000mL Üretici firmadan (Oxoid) toz besiyeri 500 g'lık kutuda hazır olarak alındı 1000 mL distile suda 40 g toz besiyeri [(Tripton (14 g), nötralize pepton (4,5 g), maya özütü (4,5 g), sodyum klorit (5 g), agar (12 g)] eritildi . pH 7,3 ± 0,2’e ayarlandı ve 121˚C’de 15 dakika otoklavlandıktan sonra 45˚C’ye kadar soğutuldu. 50 mL defibrine koyun kanı ilave edilerek iyice karıştırıldı.2 dakika boyunca kaynayan suda tutuldu. İyice karıştırıldıktan sonra 4 mm kalınlıkta olacak şekilde Petri kutularına döküldü. Bu besiyeri genel üretim amaçlı kullanıldı (72). MacConkey Agar Besiyeri Pepton 20 g Laktoz 10 g NaCl 5g 34 Agar 15 g Safra tuzları 1,5 g Nötral kırmızısı 0,03 g Kristal viyole 0,001 g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (Oxoid) toz besiyeri 500 g’lık kutuda hazır olarak alındı. 1000 ml distile suda 51,5 g toz besiyeri eritildi. pH 7,1 ± 0,2’e ayarlandı ve121 ºC’de 15 dakika otoklavlandı. 45°C’ye kadar soğutulduktan sonra4 mm kalınlıkta olacak şekilde Petri kutularına döküldü. Bu besiyeri, içerdiği kristal viyole ve safra tuzlarının etkisiyle Gram pozitif bakterilere karşı inhibitör etki göstemekte, buna karşın Gram negatif çomakların üremesine uygun ortam sağlamaktadır. İçerdiği laktoz sayesinde de özellikle laktozu kullanan Gram negatif çomaklar bu besiyerinde belirlenebilmektedir. Bu besiyeri hasta örneklerinden Gram negatif çomakların ayırımında kullanıldı (48). Safralı Eskülin Agar Pepton 14 g Safra tuzları 15 g Ferrik sitrat 0.5 g Eskülin 1g Agar 14 g Üretici firmadan (Oxoid) toz besiyeri 500 g’lık kutuda hazır olarak alındı. 44,5 g toz besiyeri 1000 mL distile suda eritildi. pH 7,1 ± 0,2’e ayarlandı, 121 ºC’de 15 dakika otoklavlandı. 45°C’ye kadar soğutulduktan sonra 4 mm kalınlıkta olacak şekilde Petri kutularına döküldü.Bu besiyeri enterokokların/Grup D streptokokların ayırımında kullanıldı (72). DNaz Besiyeri Deoksiribonukleikasit 2g Triptoz 20 g Sodyum klorür 5g 35 Agar 15 g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (Oxoid) toz besiyeri 500 g'lık kutuda hazır olarak alındı. 42 g toz besiyeri 1000 ml distile suda eritildi, pH 7,3 ± 0,2’e ayarlandı ve 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. 45 °C’ye kadar soğutulduktan sonra 4 mm kalınlıkta olacak şekilde Petri kutularına dökülerek donduruldu. Bu besiyeri bakterinin DNAz aktivitesini göstermek için kullanıldı (72). Mueller Hinton Agar Besiyeri Sığır et suyu (B-21) 300 mL Kazein hidrolizatı 17 g Nişasta 1,5 g Agar 17g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (Oxoid) toz besiyeri 500 g'lık kutuda hazır olarak alındı. 38 g toz besiyeri 1000 ml distile suda eritildi, pH 7,4 ± 0,2’e ayarlandı ve 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. 45 °C’ye kadar soğutulduktan sonra 4 mm kalınlıkta olacak şekilde Petri kutularına dökülerek donduruldu. Bu besiyeri, aerop bakterilerin antibiyotiklere duyarlılıklarının belirlenmesinde disk difüzyon yönteminin uygulanması için kullanıldı (72). Üç Şekerli Demirli Agar Besiyeri (TSI) ‘Lab- Lemco’ tozu 3g Maya özü 3g Pepton 20 g Sodyum klorit 5g Laktoz 10 g Sükroz 10 g Glikoz 1g Ferrik sitrat 0,3 g 36 Sodyum tiyosülfat 0,3 g Fenol kırmızısı 0,024 g Agar 12 g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (Oxoid) 2,5 kg’lık kutuda hazır olarak alındı. 64,52 g toz besiyeri 1000 mL distile suda eritildi ve tüplere 2,5 mL dağıtıldı. pH 7,3 ± 0,2’e ayarlandı. Besiyeri içeren tüpler, 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. Otoklavdan çıkarıldıktan sonra yatık konumda soğutuldu. Bu besiyeri, Gram negatif çomakların dekstroz, laktoz ve sükroz fermentasyonu ile hidrojen sülfid üretimi özelliklerinin belirlenmesinde kullanıldı (45). Hareket, İndol, Ornitin Besiyeri (MIO) Pepton 10 g Maya özü 3g Tripton 10 g Dekstroz 1g L-ornitin HCl 5g Brom krezol moru 0,02 g Agar 2g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (Difco) 500 g’lık kutuda hazır olarak alındı. Üzerindeki prosedüre göre 31 g toz besiyeri 1000 mL distile suda eritildi ve tüplere dağıtıldı. pH’sı 6,5’e ayarlandı ve tüpler, 121°C’de 15 dakika otoklavda steril edildi. Hareket, indol, ornitin besiyeri Enterobacteriaceae üyelerinin ornitin dekarboksilaz aktivitesi, indol üretimi ve hareket özelliklerinin belirlenmesinde kullanılmıştır (73). Christensen Besiyeri (Üre Besiyeri) Pepton 1g Glikoz 1g Sodyum klorit 5g 37 Disodyum fosfat 1,2 g Potasyum dihidrojen fosfat 0,8 g Fenol kırmızısı 0,012 g Agar 15 g Distile su 1000 mL Glikoz ve üre dışındaki maddeler suda eritildi. pH 6,8 ± 0.2’e ayarlandı besiyeri 121 °C’de 15 dakika steril edildi. 50°C’ye kadar soğuyunca besiyerine, süzülerek steril edilen glikoz ve üre eriyikleri katılarak iyice karıştırıldı ve steril şartlarda steril tüplere 1’er ml dağıtıldı.Besiyerinin dik olarak katılaşması sağlandı. Bu besiyeri üreaz enziminin varlığının saptanmasında kullanıldı (45). Sitrat Besiyeri Sodyum klorit 5g Amonyum dihidrojen fosfat 1g Dipotasyum fosfat 1g Magnezyum sülfat 0,2 g Sodyum sitrat 3g Bromtimol mavisi eriyiği 0,08 g Agar 20 g Distile su 1000 mL Maddeler karıştırılıp eritildikten sonra tüplere 5’er ml dağıtıldı. pH’sı 6,8 ± 0,2’ye ayarlandı, 100°C’de 1 saat steril edildi. Tüpler yatık konumda tutularak soğutuldu. Bu besiyeri Gram negatif bakterilerin karbon kaynağı olarak sitrattan yararlanıp yararlanmadıklarını belirlemek amacıyla kullanıldı (45). Dekstroz (D) Besiyeri Bromtimol mavisi eriyiği 0.04 g Kazeinin pankreatik dijesti 10 g Glikoz 5g 38 Agar 15 g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (BD Diagostic Systems) alınan hazır besiyeri 1000 mL distile su içerisinde ertildi. 100°C’de, 1 saat tutularak steril edildi. pH 6,9 ± 0,2’e ayarlandı ve tüplere 5’er ml olarak bölündü. Tüpler, 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. Bu besiyeri Gram negatif çomakların dekstroza oksitleyici ve fermentleyici etkisinin, asit, gaz ve asetoin yapımının araştırılmasında kullanıldı (72). 3.1.1.2. Anaerop Kültürler İçin Kullanılan Besiyerleri Zenginlestirilmiş Tiyoglikolatlı Sıvı Besiyeri Maya özütü 5g Tripton 15 g Glikoz 5,5 g Sodyum tiyoglikolat 0,5 g Sodyum klorit 2,5 g L-sistein 0,5 g Resazurin 0,001 g Hemin stok solüsyon 1mL Agar 0,75 g Distile su 1000 mL Besiyeri (Oxoid) 1000 mL distile suda ısıtılarak eritildikten sonra pH 7,1 ± 0,2’e ayarlandı ve tüplere 10 mL dağıtıldı. 121 °C’de 15 dakika otoklavlandıktan sonra 45°C ’ye gelinceye kadar soğutuldu. Bu besiyeri parafilm ile kapatılıp 4°C’de saklandı (72,74). Schaedler AgarBesiyeri Schaedler agar 41,9 g Distile su 1000 mL Üretici firmadan (Acumedia) alınan hazır besiyeri, [Kazeinin pankreatik dijesti (10 g), hayvan dokusunun peptik dijesti (10 g), maya özütü (2 g), sodyum klorür (5 g), dekstroz 39 (1 g), sodyum bisülfit (0,1 g), agar (15 g)]1000 mL distile suda ısıtılarak eritildikten sonra pH 7,6 ± 0,2’e ayarlandı ve tüplere 10 mL dağıtıldı. 121°C’de 15 dakika otoklavlandıktan sonra 45°C ’ye gelinceye kadar soğutuldu,içine süzülerek steril edilen vitamin K1 solüsyonu (10 mg/mL) eklendi. Bu besiyeri parafilm ile kapatılıp 4°C’de saklandı (72,74). Brusella agar besiyerine yayılacak olan 0,5 Mac Farland bulanıklığındaki anaerop bakteri süspansiyonu bu besiyerinde hazırlandı. Kanlı Anaerop Agar Besiyeri Schaedler agar 45 g Distile su 1000 mL 45 g Schaedler agar (Oxoid)[(Tripton Soya Agar (10 g), pepton (5 g), maya özütü (5 g), glikoz (5 g), hemin (0,01 g), tris buffer (0,75 g), agar (13,5 g)], 1000 mL distile suda eritildikten sonra 250 mL’lik balonlara bölündü. pH 7,4 ± 0,2’e ayarlandı 121°C’de 15 dakika steril edildi. Kullanılacağı zaman 250 mL’lik besiyeri eritilip, 45°C’ye kadar soğutuldu. Soğuyunca içine; Vitamin K1 solüsyonu 0,25 mL Koyun kanı 12,5 mL İlave edildi, iyice karıştırıldıktan sonra 4 mm kalınlığında olacak şekilde Petri kutularına dağıtıldı. Bu besiyeri anaerop bakterilerin üretimi için kullanıldı (74). Kanlı, Fenil Etil Alkollü Anaerop Besiyeri Schaedler agar 45 g Fenil etil alkol 2,5 mL Distile su 1000 mL 45 g Schaedler agar (Oxoid) [(Tripton Soya Agar (10 g), pepton (5 g), maya özütü (5 g), glikoz (5 g), hemin (0,01 g), tris buffer (0,75 g), agar (13,5 g)], 1000 mL distile suda eritildikten sonra içine 2,5 mL fenil-etil alkol ilave edildi ve 250 mL’lik balonlara bölündü. 121°C’de 15 dakika steril edildi. Kullanılacağı zaman 250 mL’lik besiyeri eritilip 45°C’ye soğutulup içine süzülerek steril edilen vitamin K1 solüsyonu (10 mg/mL) ve koyun kanı eklendi. 40 Vitamin K1 solüsyonu (10 mg/ml) 0,25 mL Koyun kanı 12,5 mL İyice karıştırıldıktan sonra 4 mm kalınlığında olacak şekilde Petri kutularına döküldü. Bu besiyeri, içerdiği fenil etil alkol nedeniyle fakültatif anaerop Gram negatif çomakların üremesini baskılamaktadır. Besiyeri Gram negatif ve Gram pozitif zorunlu anaerop bakterileri üretmek amacıyla kullanıldı (74). Kanlı, Kanamisin-Vankomisinli Anaerop Besiyeri Schaedler agar 45 g Distile su 1000 mL 45 g Schaedler agar (Oxoid) [(Tripton soya agar (10 g), pepton (5 g), maya özütü (5 g), glikoz (5 g), hemin (0,01 g), tris buffer (0,75 g), agar (13,5 g)], 1000 ml distile suda eritildi ve pH 7,1 ± 0,2’ye ayarlandı. 250 mL’lik balonlara bölünüp 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. Kullanılacağı zaman 250 mL’lik besiyeri eritilip 45°C’ye soğuyunca içine: süzülerek steril edilmiş olan vitamin K1 solüsyonu (10 mg/mL), kanamisin (100 mg/mL), vankomisin (7,5 mg/mL) ayrıca koyun kanı ilave edildi. Vitamin K1 solüsyonu (10 mg/mL) 0,25 mL Kanamisin (100 mg/mL) 0,25 mL Vankomisin (7,5 mg/mL) 0,17 mL Koyun kanı 12,5 mL İyice karıştırıldıktan sonra 4 mm kalınlığında olacak şekilde Petri kutularına döküldü. Anaerop bakterilerin üretiminde seçici besiyeri olarak kullanıldı (74). Modifiye Brucella Agar Besiyeri Brusella agar 43 g Distile su 1000 mL L-sistein 0,5 g Sodium tiyoglikolat 0,5 g Hemin stok solüsyon 1mL 41 43 g Brusella agar (Acumedia), 1000 mL distile suda eritildi ve pH 7,1 ± 0,2’ye ayarlandı. 250 mL’lik balonlara bölünüp 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. Kullanılacağı zaman 250 mL’lik besiyeri eritilip 45°C’ye soğuyunca içine: süzülerek steril edilmiş olan vitamin K1 solüsyonu (10 mg/mL) ve koyun kanı ilave edildi. Vitamin K1 solüsyonu (10 mg/mL) 0,25 mL Koyun kanı 12,5 mL İyice karıştırıldıktan sonra 4 mm kalınlığında olacak şekilde Petri kutularına döküldü. Anaerop bakterilerin antimikrobiyal duyarlılığının belirlenmesinde E test için kullanıldı (74). Gliserollü sıvı Brucella besiyeri (Brucella broth) Brucella Broth 28 g Gliserin 100 mL Distile su 900 mL Üretici firmadan (Acumedia) 500 g'lık kutuda hazır olarak alındı. Belirtilen prosedüre göre 28 g toz besiyeri 900 mL distile suda eritildi, 100 mL gliserin eklendi ve pH 7.5 ± 0.2’e ayarlandı, 121°C’de 15 dakika otoklavlandı. 45°C’ye kadar soğutulduktan sonra steril ependorf tüplerine aktarıldı. Bu besiyeri kültürde üretilen aerop bakterileri -70 ˚C’de saklamak amacıyla kullanıldı (72). %10 Gliserollü Yağsız Süt Besiyeri Yağsız Süt Besiyeri 10g Distile su 100 mL Üretici firmadan (Oxoid) alınan toz halindeki yağsız süt (skim milk powder) besiyeri az miktarda distile su ile karıştırıldı, daha sonra %10 w/v karışım elde edilene kadar distile su ilave edilmeye devam edildi karışıma %10 gliserol eklendi ve 121°C’de 5 dakika otoklavlandı. 45°C’ye kadar soğutulduktan sonra steril ependorf tüplerine dağıtıldı. Bu besiyeri kültürde üretilen anaerop bakterileri -70˚C’de saklamak amacıyla kullanıldı (74). 42 3.1.2. Kullanılan Stok Solüsyonlar Hemin Stok Solüsyonu (5 mg/ml) Hemin 0,5 g NaOH (1N solüsyon) 10 mL Distile su 90 mL Hemin 10 mL 1 N NaOH solüsyonunda çözündürüldü. 90 mL distile su ilave edildikten sonra 121 °C’de 15 dakika otoklavlanıp soğutuldu ve buzdolabında saklandı (72). Vitamin K1 Stok Solüsyonu (10 mg/ml) K1 vitamini 0,1 g Saf etanol 100 mL K1 vitamini (Sigma) saf etanol ile karıştırılarak koyu renkli bir şişede buzdolabında saklandı. Dilüsyonu distile su ile yapıldı (74). Kanamisin Stok Solüsyonu (100 mg/ml) Kanamisin 1g Steril fosfat tampon (pH= 8) 10 mL Kanamisin (Sigma) fosfat tamponda çözündürüldükten sonra tüplere 0,5’er mL dağıtıldı ve derin dondurucuda saklandı (74). Vankomisin Stok Solüsyon (7.5 mg/ml) Vankomisin Hidroklorik asit ( N/20) 75 mg 5 mL Distile su 5 mL Vankomisin hidroklorik asitte çözündürüldü ve distile su ilave edildi. Tüplere 0,5’er mL dağıtıldı ve derin dondurucuda saklandı (74). 3.1.3. Kullanılan Ayıraçlar Katalaz Ayıracı Aerop bakteriler için %3’lük H2O2 (hidrojen peroksit) kullanıldı (63). Anaerop bakteriler için %15’lik H2O2 kullanıldı (74). 43 Oksidaz Ayıracı (Kovacs Oksidaz Ayıracı) Tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür 0,1 g Distile su 10 mL Tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür distile su ile karıştırılarak hazırlandı (72). İndol Ayıracı Aerop bakteriler için; Para-dimetil aminobenzaldehid 5g Amil alkol 75 mL HCl (konsantre) 25 mL Maddeler karıştırılarak damlalıklı şişeye konuldu (72). Anaerop bakteriler için; Paradimetilamino-sinnamaldehit 0,1 g HCI 1 mL Distile su 9 mL Koyu renkli şişede oda ısısında saklandı (74). 3.1.4. Bakterilerin Tanımlanmasında Kullanılan Diskler Optokin (Etilhidrokuprein hidroklorit) Diski Optokin antibiyotik diski (BBL); S.pneumoniae’nin viridans streptokoklardan ayırımında 6 mm’lik (5 μg etilhidrokuprein içeren) diskler kullanıldı (45). PYR (L-pirolidonil-β-naftilamid) Testi DrySlide PYR (OXOİD) kiti, Enterokoklar ve A Grubu beta hemolitik streptokokların identifikasyonunda kullanıldı. 3.1.4.1. Antibiyotik diskleri Çalışmada, amoksisilin/ klavulonik asit (20/ 10 μg), siprofloksasin (5 μg), sefoksitin (30 vankomisin (30 μg), klindamisin (2 μg), eritromisin (15 μg), meropenem (10 μg), imipenem (10 μg), seftazidim (30 μg), seftriakson (30 μg), penisilin (10 μg), kotrimoksazol (1.25/ 23.75 μg), gentamisin (10 μg), linezolid (10 μg) 44 disklerikullanılmıştır. Diskler üretici firma tarafından (Oxoid)belirtilen koşullarda muhafaza edilmiştir.Sefoksitin (30 μg) diski ise metisilin dirençli stafilokokların belirlenmesinde ve geniş spektrumlu beta laktamaz varlığının saptanmasında kullanılmıştır. Anaerop bakterilerin duyarlılıklarının belirlenebilmesi için ise penisilin, amoksisilin/ klavulonik asit, imipenem, klindamisin, metronidazol ve sefoksitin Etestleri kullanılmıştır(bioMerieux, Marcy l’Etoile, France). 3.1.5. Aerop ve Anaerop Bakterilerin Moleküler Yöntemlerle Tanımlanmasında Kullanılan Gereçler 3.1.5.1. DNA İzolasyonunda Kullanılan Kit Magna Pure 96 DNA/Viral NA Small volume kiti (Roche Diagnostics GmBH / Mannheim–Almanya) DNA izolasyonu için kullanıldı. Çalışmada, üretici firma direktifleri doğrultusunda Magna Pure 96 cihazında (Roche Diagnostics GmBH / Mannheim – Almanya) pathogen universal 200 2.0 protokolü kullanıldı. 3.1.5.2. Agaroz Jel Hazırlanmasında Kullanılan Gereçler DNA örneklerinin kalitesi ve miktarı %1’lik agaroz jelde incelenmistir. Bunun için; 1,5 g agaroz, 150 μl 1x Tris-asetat(TAE) tamponunda kaynatılarak çözülmüstür. Agaroz çözeltisi 40°C’ ye kadar soğutulmuştur. Soğutmadan sonra 10 μl etidyum bromür çözeltisi (10 mg/mL) eklenmistir. 3.1.5.3. 16S rRNA'nın PZR Amplifikasyonunda Kullanılan Gereçler 1. Primer stoklar (20 μM, Invitrogen) : 27f (forward primer: 16S rRNA'nın başlangıç bölgesine bağlanan evrensel primer, 5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 1525r (reverse primer: 16S rRNA'nın son bölgesine bağlanan evrensel primer 5’AAGGAGGTGWTCCARCC-3’) 2. dNTP mix stok (100 μl’lik stok solüsyonda her biri 25 mM olacak şekilde dATP, dCTP, dGTP ve dTTP karışımı; Promega) 3. Taq DNA polimeraz (HotStarTaq®, QIAGEN) 10xTaq DNA polimeraz tampon (HotStarTaq®) 4. 5 - 10 μl DDH2O içinde çözülmüş, saf genomik DNA (50-300 ng) 45 3.1.5.4. 16S rRNA Gen Bölgesinin Dizileme Çalışmasında Kullanılan Gereçler 16S rRNA, baz dizileme analizinde kullanılan oligonükleotit primerler, bu primerlerin nükleotit dizileri ve bağlanma bölgeleri aşağıda verilmiştir. Primer Adı:27f – 5’ AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’ Bağlanma Bölgesi 8 - 27 Primer Adı : MG3f- 5’ CAGCAGCCGCGGTAATAC-3’ Bağlanma Bölgesi 520 - 536 Primer Adı: MG5f- 5’ AAACTCAAAGGAATTGACGG-3’ Bağlanma Bölgesi 907 - 926 Primer Adı: 1525R – 5’AAGGAGGTGWTCCARCC-3’ Bağlanma Bölgesi 1544 - 1525 3.2. Yöntemler Çalışmamızda örnek alımından bakteri türlerinin PZR ile tanımlanmasına kadar olan aşamalarda kullanılan yöntemler aşağıda belirtilmiştir. 1-Hastalara ait bilgilerin yer aldığı formların doldurulması 2-Hastalardan örneklerin alınması ve laboratuvara taşınması 3-Besiyerlerine ekim, aerop/anaerop ortamların sağlanması ve inkübasyon 4-Üretilen bakterilerin tanımlanması 5-Kültürde üretilen bakterilerin antimikrobik maddelere dirençlerinin belirlenmesi 6-Gram preparasyonlarda bakteri görüldüğü halde kültürlerde bakteri üretilemeyen örneklerin PZR ile incelenmesi. 3.2.1. Hastalara Ait Formların Doldurulması Çalışmamızda İstanbul Üniversitesi Tıbbi Etik Kurul Yönergesi’ne göre hastaların yasal temsilcilerinin bilgilendirilmiş onayları alındı. Genel Cerrahi Meme Polikliniği’ne gelen mastitli hastalara ait bilgilerin yer aldığı formlar dolduruldu. Bu formlarda; çalışmaya dahil edilen hastaların; yaş, cinsiyet, doğurma şekli ve kaçıncı doğumları olduğu, emzirme süreleri, emzirme döneminde pompa kullanılıp 46 kullanılmadıkları, mastite bağlı süt miktarındaki değişim, apsenin başlangıç tarihi, apsenin tahmini nedeni, sigara ve alkol kullanımı, aile içi stres durumları, yakın zamanda geçirilmiş ya da var olan önemli hastalıkları, kullanmakta oldukları antibiyotik veya diğer ilaçlar, üriner enfeksiyon geçirip geçirmedikleri, ailede mastit öyküsü varlığı sorgulandı. Hekimin klinik tanısına göre mastitin (laktasyonel/non-laktasyonel) tipi kaydedildi (Form 1). 3.2.2. Hastalardan Örnek Alınması ve Laboratuvara Taşınması Apseden alınan cerahat örnekleri, Genel Cerrahi Meme Polikliniği’ne başvuran mastitli hastalardan, cerrahi hekimleri tarafından, steril enjektör ile herhangi bir anestezik madde kullanılmadan alındı. Alınan örnekler zaman kaybedilmeden derhal laboratuvara getirildi. Doku biyopsileri ise derhal Carry & Blair transport besiyerine alınarak laboratuvara getirildi. 3.2.3. Besiyerlerine ekim, aerop/anaerop ortamların sağlanması ve inkübasyon Aerop kültüre alınacak cerahat örnekleri, azaltma yöntemi ile direkt olarak, doku örnekleri ise steril bir Petri kutusu içinde, steril bistüri ile küçük parçalara ayrılarak %5 koyun kanlı agara, çukulatamsı agar ve MacConkey agar besiyerlerine ekildi. Besiyerleri 37°C’ de 24 saat inkübe edildi. 24 saat sonucunda üreme görülmemesi halinde inkübasyon 72 saate kadar uzatıldı. Anaerop kültüre alınacak cerahatler ve küçük biyopsi parçaları, kanlı, kanamisin-vankomisinli anaerop agar, kanlı, fenil etil alkollü anaerop agar, kanlı anaerop agar, zenginlestirilmiş tiyoglikolatlı sıvı besiyerlerine ekilerek, anaerop jarlarda anaerop ortam sağlayıcılar (Oxoid AnaerogenTM, BD GasPak EZ Anaerobe Container System) ile 37°C’ de en az 72 saat inkübe edildi. Cerahatten bir miktar steril bir ependorfa alındı ve ihtiyaç duyulması halinde moleküler testlerde kullanılmak üzere -80°C’ de saklandı. 3.2.4. Aerop Bakterilerin İzolasyon ve Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler Cerahat ve doku parçalarından yapılan ekimlerden sonra direkt örnekten Gram preparasyonları hazırlandı. Ayrıca inkübasyon sonrası örneklerin ekildiği besiyerlerindeki üreyen kolonilerden hazırlanan kültür preparasyonları Gram yöntemi ile boyandı ve değerlendirildi. 47 Gram boyama Cerahat örneği ya da doku parçası direkt lama sürülerek kurumaya bırakıldı ve daha sonra Gram yöntemi ile boyandı. Kültür preparatlarının hazırlanması için üreyen kolonilerden alınarak bir damla tuzlu su konmuş lama yayıldı ve kurumaya bırakıldı. Daha sonra bu preparatlar Gram yöntemi ile boyandı. Gram boyama yönteminde havada kurutulup alevde tespit edilen preparatlar üzerine; kristal viyole damlatılıp 2 dakika beklendi. Daha sonra su ile yıkandı. Lugol damlatılıp 2 dakika bekletildikten sonra tekrar su ile yıkandı. Alkol ile renkli sıvı akana kadar renk giderildi ve su ile yıkandı. Son olarak, sulu fuksin damlatılıp 30 saniye beklendi ve su ile yıkandı. Boyamanın ardından preparatlar havada kurutuldu. Hazırlanan preparatlar immersiyon yağı damlatılarak 100’lük büyütmeli objektif ile ışık mikroskobunda incelendi (45). Preparatta görülen mikroorganizmaların Gram boyanma özellikleri, morfolojileri, miktarları ve lökosit varlığı kaydedildi. 3.2.4.1. Gram Pozitif Diplokokların Tanımlanması 24 saatlik kültürlerden hazırlanan Gram preparasyonların incelenmesi sonucu, kültürlerde Gram pozitif diplokok olduğu saptanan bakterilerin tanımlanmasında; katalaz, Dnaz testi, koagülaz deneyi, novobiosin, basitrasin ve optokin disklerine olan duyarlılık veya dirençlerinin belirlenmesi, PYR testi ve gereğinde APİ kitleri ile Phoenix cihazı kullanıldı. Katalaz Enziminin Belirlenmesi Gram pozitif kok morfolojisine sahip olan Streptococcaceaeve Micrococcaceaefamilyasındaki etkenleri ayırt edebilmek için katalaz testi uygulandı. 18–24 saatlik inkübasyonundan sonra çukulatamsı besiyerinden steril plastik bir özeyle alınan koloniler lama sürüldü, üzerine 1 damla %3’lük H2O2 damlatıldı. Katalaz enzimi oluşturan bakteriler H2O2’yi su ve oksijene ayrıştırdığı için ortamdaki oksijen çıkışı kabarcık oluşumu ile belirlendi. Kabarcıklar oluşmadığında ise katalaz negatif olarak degerlendirildi (48). 48 Dnaz Testi 24 saatlik kültürlerden hazırlanan Gram preparasyonların incelenmesi sonucu Stafilokok olduğu belirlenen kökenlerden DNaz besiyerine çizgi ekimi yapıldı. Besiyeri 37°C’de 18-24 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra besiyerinin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde %1’lik HCl döküldü. Üreme çizgisinin çevresinde saydam bölgenin oluşması kökenin DNaz pozitif olduğunu gösterdi. Saydam bölge oluşturmayan kökenler ise DNaz negatif olarak kabul edildi (45). Koagülaz Deneyi Staphylococcus aureus’un diğer stafilokoklardan ayırt edilmesinde kullanıldı. Koagülaz deneyi iki yöntemle yapıldı. Tüp Deneyi: Bu deney ile besiyerinde üreyen Stafilokokların oluşturdukları ve besiyerine saldıkları bağımsız koagülaz araştırıldı. Koagülaz enzimi plazmada bulunan Coagulase reacting factor (CRF) ile ilişki kurarak fibrinojeni pıhtılaştırmayı sağladı. Bir deney tüpü içerisine 1 mL fizyolojik tuzlu su konuldu ve stafilokoklarla yoğun bir süspansiyon hazırlandı. Bu süspansiyondan 0,5 mL alınarak, içinde 0,5 mL 1:5 oranında sulandırılmış sitratlı plazma bulunan tübe aktarıldı. 37°C’de beklettiktensonra 1. ve 4. saatlerde ekim yapılmış tüpler kontrol edildi. Pıhtı oluşmamasıdurumunda tüpler oda ısısında bir gece bekletildi. Pıhtının oluşması pozitif oluşmaması ise negatif sonuç olarak değerlendirildi (45). Lam Deneyi: Bu deney ile bağlı koagülaz=kümeleştirici faktör=clamping factor ortaya konuldu. Bakteri yüzeyindeki faktör plazmadaki fibrinojeni pıhtılaştırarak stafilokokların kümelenmesini sağladı. Temiz bir lamın bir ucuna 1 damla fizyolojik tuzlu su, diğer ucuna da bir damla plazma damlatıldı. 24 saatlik kültürlerden hazırlanan Gram preparasyonların incelenmesi sonucu Stafilokokolduğu belirlenen kökenlerden öze ile alındı ve bu iki damlaya karıştırılıp homojen süspansiyon haline getirildi. Çevirme hareketleri ile karıştırıldı. 1,0-3,0 saniye içinde stafilokoklarda gözle görülen kümelerin oluştuğu kökenler pozitif olarak değerlendirildi (45). Optokin (etilhidrokuprein hidroklorit) Duyarlılık Testi Streptokok morfolojisine sahip olan ve alfa hemoliz yapan birkaç koloni öze yardımı ile alınarak %5 koyun kanlı besiyerine homojen olacak şekilde ekildi. Ekimi yapılan plaklar üzerine, 5 μg optokin içeren Taxo ‘P’ diski (BBL) yerleştirilerek 35 49 °C’de %5 CO2’li etüvde 18-24 saat inkübasyona bırakıldı. Diskin etrafında 14 mm’ye eşit ya da daha fazla inhibisyon zonu oluşturarak üreyen bakteriler, S. pneumoniae olarak tanımlandı (45). PYR (L-pirolidonil-β-naftilamid) Testi: PYR testi ile bakterideL-pyrrolidonyl arylamidase varlığı araştırıldı. Bu enzim L-pirolidonil-β-naftilamid’i hidroliz eder. Hızlı testte (BBL DrySlide PYR Kit), PYR maddesi emdirilmiş filtre kağıdına Enterokok morfolojisine sahip olan birkaç koloni öze yardımı ile alınarak konuldu, önce bir damla solvent ayıracı damlatıldı ve 5 dakika beklendi. Ardından üzerine bir damla PYR ayıracı kondu. 30-60 saniye içinde reaksiyon için beklendi.L-pyrrolidonyl-beta-naphthylamide hidrolizi sonucunda açığa çıkan betanaphthylamine spesifik renk indikatörü varlığında kırmızı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirildi. Kırmızı renk oluşturan koloniler Enterococcus spp. olarak tanımlandı. Sarı veya portakal rengi negatif olarak değerlendirildi (45). 3.2.4.2. Gram Negatif Çomakların Tanımlanması 24 saatlik kültürlerden hazırlanan Gram preparasyonların icelenmesi sonucu, kültürlerde Gram negatif çomak olduğu saptanan ve MacConkey agarda üreyen farklı morfolojilerdeki kolonilerden; üç şekerli demirli agar (TSI), hareket-indol-ornitin (MİO), Christensen, sitrat ve Dekstroz (D) besiyerlerine ekim yapıldı ve oksidaz özellikleri incelendi. Gereğinde Phoenix cihazı kullanıldı (45). Oksidaz Özelliğinin İncelenmesi Petri kutusu içine süzgeç kâğıdı yerleştirildi ve ortasına 2-3 damla Kovaks ayıracı damlatıldı. Gram negatif bakterilerin 18-24 saatlik saf kültürlerinden, tek kullanımlık plastik steril öze ile alınarak ayıracın damlatıldığı yere sürüldü. Koyu mor rengin oluşumu oksitlenmenin varlığını ifade ettiğinden pozitif sonuç olarak değerlendirildi (45). Üç Şekerli Demirli Agar (TSI) Besiyerinde Üremenin Değerlendirilmesi D-Glikoz ve sükroz fermantasyonunun varlığı, 18-24 saatlik inkübasyondan sonra, besiyerinin kırmızımsı renginin, tüpün dip kısmından başlayarak sarıya dönüşmesi ile değerlendirildi. Sarı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirildi. Laktoz fermantasyonunun varlığı, 18-24 saatlik inkübasyondan sonra, besiyerinin eğik yüzeyinin kırmızıdan sarıya dönüşmesi ile değerlendirildi. H2S oluşumu, 18-24 saatlik 50 inkübasyondan sonra, besiyerinde yüzeyden başlayıp derine doğru ilerleyen siyahlaşma ile tanımlandı (45). Hareket, İndol, Ornitin Özelliklerinin Değerlendirilmesi Bakterilerde hareket özelliği: Gram negatif bakterilerin MİO besiyerinde 18–24 saatlik inkübasyonundan sonra, besiyerinin tam ortasında, inokulasyon hattı boyunca sınırlı bir üreme gösteren ve besiyerine dağılmayan kökenler hareketsiz, besiyerinde dağılarak homojen bir bulanıklığın oluşmasına neden olan kökenler ise hareketli bakteriler olarak değerlendirildi. (45,73). İndol oluşumunun belirlenmesi: Gram negatif bakterilerin MİO besiyerinde 18– 24 saatlik inkübasyonundan sonra besiyerine 0,2-0,3 ml Kovacs indol ayıracı eklendi; kırmızı renk oluşumu indol varlığını gösterdi (73). Ornitin varlığının belirlenmesi: Gram negatif bakterilerin MİO besiyerinde 18– 24 saatlik inkübasyonundan sonra oluşan sarı rengin, mora dönüşümü ornitin dekarboksilaz varlığında putresin oluşumunu gösterdi. Ornitin dekarboksilaz oluşmazsa ortam sarı kalır (73). Üreaz Aktivitesinin İncelenmesi Gram negatif bakterilerin Christensen besiyerinde 18–24 saatlik inkübasyonundan sonra üreaz enziminin aktivitesi ile ürenin hidrolizi sonucu amonyak ve karbondioksit oluşur ve ortam alkalileşir. Besiyerinin renginin pembeye dönüşmesi, üreaz enziminin varlığını gösterdi (45). Sitrat Özelliğinin İncelenmesi Gram negatif bakterilerin sitrat besiyerinde 18–24 saatlik inkübasyonundan sonra bakterilerin sitrat kullanımı sonucunda amonyum tuzlarından nitrojen açığa çıkması ile besiyeri alkalileşir ve besiyerinde bulunan bromtimol mavisinden dolayı alkalen ortamda yeşil renkli besiyeri maviye döner. Besiyerinin renginin koyu maviye dönmesi pozitif sonuç olarak yorumlandı (45). Glikoz Fermantasyonunun İncelenmesi Gram negatif bakterilerin dekstroz besiyerinde 18–24 saatlik inkübasyonundan sonra bakterilerin glikoza etkisi nedeniyle ayıraç asit reaksiyon vererek yeşilden sarıya 51 döner. Bu durumda glükoz fermantasyonu pozitif kabul edildi. Besiyerinin parçalanmış olması, gaz oluşumu olarak değerlendirildi (45). 3.2.4.3. Gram Pozitif Çomakların Tanımlanması 24 saatlik kültürlerden hazırlanan Gram preparasyonların incelenmesi sonucu, kültürlerde Gram pozitif çomak olduğu saptanan bakterilerin tanımlanması; Gram preparasyondaki görünümleri (Çin harfleri gibi şekiller çizecek tarzda dizilmeleri, dallanma varlığı) ve spor oluşturup oluşturmamalarına göre yapıldı (24). Gereğinde Phoenix cihazı kullanıldı (72). 3.2.5. Anaerop Bakterilerin İzolasyon ve Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler Anaerop besiyerlerinde üreyen her farklı koloniden Gram preparasyonları hazırlandı ayrıca eş zamanlı olarak bir kanlı anaerop besiyerine ve iki çukulatamsı agar besiyerine saf kültürler elde edilmek üzere pasajlar alındı. Kanlı anaerop besiyeri derhal jara kaldırıldı ve oksijensiz ortam sağlayıcı AnaeroGen ile 37°C’de en az 72 saat inkübe edilerek muhtemel anaerop bakterilerin saf kültür şeklinde üretimi için gereken şartlar sağlandı. Pasaj alınan çukulatamsı besiyerlerinden biri 37°C’de etüvde tutularak muhtemel aerop bakterilerin üremesi, diğeri ise 37°C’de karbondioksitli ortamda 72 saat tutularak muhtemel aerotoleran bakterilerin üremesi sağlandı (75, 76, 77).Aerop şartlarda ve karbondioksitli ortamda tutulan besiyerlerinde üremeyen yalnızca anaerop şartlarda tutulan besiyerlerinde üreyen bakteriler anaerop bakteri olarak değerlendirildi. Bakterilerin tanımında APİ 20 A kiti ve gereğinde moleküler yöntemler kullanıldı (74). 3.2.6. Aerop ve Anaerop Bakterilerin Tanısında Kullanılan Moleküler Yöntemler 3.2.6.1. DNA İzolasyonu DNA izole edeceğimiz apse cerahatinden ya da cerahatin ekildiği tiyoglikolatlı sıvı besiyerinden 200 µl alınarak Magna Pure 96 (Roche Diagnostics GmBH, Mannheim – Almanya) cihazı kartuşlarına eklendi ve üretici firma direktifleri doğrultusunda Magna Pure 96 cihazında (Roche Diagnostics GmBH / Mannheim – Almanya), Magna Pure 96 DNA/Viral NA Small volume kiti (Roche Diagnostics GmBH/Mannheim – Almanya) ile Pathogen universal 200 2.0 protokolü kullanılarak çalışıldı. İşlem tamamlandığında sistemden 100 µl DNA elde edildi. Bu elde edilen DNA’lar Nanodrop spektrofotometre (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA) 52 aracılığıyla 260 nm’de kontrol edilerek konsantrasyonlarının ve 260/280 nm’de kontrol edilerek saflıklarının ölçümü yapıldı. Örnekler spektrofotometrede ve agaroz jelde yapılan kontrollerden sonra 1,5 ml’lik steril ependorf tüplere alınıp -20 °C’de DNA dizi analizi için 16S rRNA amplifikasyonu gerçekleştirilinceye kadar saklandı. 3.2.6.2. DNA Miktar Tayini ve DNA Saflık Derecesinin Belirlenmesi DNA örneklerinin miktar tayini ve saflık derecesi, UV spektrofotometrede sulandırılmış örneklerin 260 ve 280 nm dalga boylarında okuma değerleri alınarak belirlendi. 260 nm dalga boyunda ölçülen absorbsiyon değerleri (A260) DNA solüsyonu içerisindeki DNA miktarını ve 280 nm dalga boyunda ölçülen absorbsiyon değerleri (A280) ise protein miktarını göstermektedir. DNA örneğinin saflık derecesi 260 ve 280 nm dalga boylarında okunan değerler arasındaki oran (A260 / A280) hesaplanarak belirlendi (78). 3.2.6.3. Agaroz Jel Elektroforezi Agaroz jel, jel tankına dökülmüs ve taraklar yerlestirilmistir. Jel katılaştıktan sonra taraklar çıkarılmıs, 1x TAE tamponu ile doldurulan elektroforez sistemine yerleştirilmistir. 5 μl DNA örnegi, 1 μl 6x yürütme tamponuyla yüklenmiştir. Örneklerin yüklenmesinden sonra 500ng DNA moleküler agırlık belirteci (GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas, 1 kb) ilk kuyuya yüklenmiştir. 50 mA ’de 3 saat süreyle elektroforez yapılmış ve DNA miktar ve kalitesi jel dokümantasyon sisteminde (GeneLine, ABD) incelenmiştir. 3.2.6.4. 16S rRNA'nın PZR Amplifikasyonu 16S rRNA'nın polimeraz zincir reaksiyon işlemleri 0,5 ml 'lik PZR tüplerinde Thermal Cycler (T100 Biorad, Fransa)’da yapıldı. DNA örneklerinin 16S rRNA genini kodlayan DNA bölgesinin amplifikasyonu için evrensel iki primer (27f ve 1525r) kullanıldı (79). PZR reaksiyonu için hazırlanan bütün stok solüsyonlar otoklav edilmiş DDH2O ile hazırlandı. Stok solüsyonlar kontaminasyon riskine karşılık küçük miktarlarda (25–100 μl) steril ependorflara bölünerek kullanıma kadar tüm stok solüsyonlarla birlikte -18°C'de saklandı. Hedef DNA bölgesinin amplifikasyonundan otomatik sekanslama aşamasına kadar olan tüm işlem basamakları aşağıda belirtilmiştir. 53 1. dNTP mix, primer solüsyonları, MgCl2 ve 10xTaq tampon buz üzerinde çözüldü ve buzda tutulmaya devam edildi. Taq DNA polimeraz gereksinim duyuluncaya kadar -18°C’ de tutuldu. 2. PZR amplifikasyonu için kullanılan bir örnek için 50 μl ölçüdeki reaksiyon karışımı örnek sayısınca artırılarak Taq DNA polimeraz ve DNA örnekleri hariç 1,5 ml steril ependorf tüpü içerisine buz üzerinde transfer edildi. 3. Reaksiyon karışımından ayrı olarak her bir örnek için DDH2O ve DNA örnekleri toplam 10 μl olacak şekilde steril PZR tüpü içerisine transfer edildi ve T100 (Biorad Fransa) Thermal Cycler’da 95°C' de 5 dk ön denatürasyona tabi tutuldu. 4. Ön denatürasyonu takiben tüpler buz ortamına alınıp 5 dk bekletildi. 5. -18°C’den Taq DNA polimeraz alınarak buzda bekletilen reaksiyon karışımına hızlı bir şekilde ilave edildi. 6. Reaksiyon karışımı her bir örnek için toplam hacim 50 μl olacak şekilde tüplere buz üzerinde transfer edildi (Tablo 1). 7. Transfer işleminden hemen sonra PZR reaksiyonu (T100 Biorad Fransa) Tablo 2’de belirtilen şartlarda başlatıldı. Tablo 3-1: 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu için kullanılacak reaksiyon karışımının hazırlanışı 10xTaq tampon MgCl2 dNTP (25 mM) 5 μl 1,5 μl 1 μl 27f (20 μM) 2,5 μl 1525r (20 μM) 2,5 μl Taq DNA polimeraz (HotStarTaq®, QIAGEN) 0,25 μl DNA (50–300 ng) 1 μl DDH2O X μl Toplam hacim 50 μl 54 Tablo 3-2: 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu içim kullanılacak reaksiyon karışımının transfer işlemnden sonra PZR reaksiyonu için belirtilen şartlar. Ön Denatürasyon Ön Denatürasyon Amplifikasyon Denatürasyon Bağlanma Elongasyon Bitiş Soğuma Son Uzama Uzatma 95°C 95°C 55°C 72°C 72°C 4°C 5 dk 1 dk 2 dk 3 dk 10 dk 1 dk 1 döngü 1 döngü 1 döngü 35 döngü 3.2.6.5. 16S rRNA Gen Bölgesinin Dizileme Çalışması PZR amplifikasyon ürünleri elde edildikten sonra çalışma izolatlarımızın 16Sgen bölgesinin saflaştırılması ve baz dizi analizi, farklı 4 oligonükleotit primeri ile ABI 3730XL (otomatik baz dizileme) cihazı ile üretici firma direktifleri doğrultusunda okunmuş ve kromatogramları alınmıştır. 3.2.6.6. 16S rRNA Sekans Verilerinin Analizi ABI formatındaki kromatogram dosyaları fasta formatına dönüştürüldükten sonra Sequencer 4.10.1, MEGA 4.1, Finch TV programları kullanılarak karşılaştırmalı ve manuel olarak dört farklı primerden elde edilen diziler birleştirildi ve 16S rRNA dizileri elde edildi(80). 4 farklı primer kullanılarak hazırlanan 1446–1515 nt uzunluğundaki 16S rRNA gen fasta dizileri analizlerde kullanıldı(80). 16S rRNA gen dizileri http://www.ncbi.nlm.nih.govweb adresinden tek tek indirilerek elde edilen bakteri tip örneği 16S rRNA nükleotit baz dizileri ile test örneklerinin baz dizileri MEGA 4.1 programı kullanılarak dizilendi. DNA dizilerinin biyoenformatik programları tarafından okunması içi belli standart formatlar oluşturulmuştur ve bunların en yaygını fasta dizileridir (80).Elde edilen bu fasta dizileri NCBI ve DSMZ gibi gen bankalarından kontrol edildikten sonra bakteri isimlendirilmesinde kullanıldı. 3.2.7. Aerop ve Anaerop Bakterilerin Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler Antimikrobiyal Duyarlılığının Disk difüzyon testi Çalışmada, amoksisilin/klavulonik asit (20/ 10 μg), siprofloksasin (5 μg), vankomisin (30 μg), klindamisin (2 μg), eritromisin (15 μg), meropenem (10 μg), 55 imipenem (10 μg), seftazidim (30 μg), seftriakson (30 μg), penisilin (10 μg), kotrimoksazol (1.25/ 23.75 μg), gentamisin (10 μg), linezolid (10 μg) diskleri kullanıldı ve test Mueller-Hinton agar besiyeri üzerinde yapıldı. Zor üreyen mikroorganizmalar için kan ilave edildi. Besiyeri Petri kutularına 4 mm kalınlığı geçmeyecek şekilde döküldü ve bakteri steril serum fizyolojik içinde 108 bakteri/ml olacak şekilde süspansiyon haline getirildi. Bunun için McFarland tüpleri kullanıldı. Müeller-Hinton agar besiyeri üzerine 3 öze bakteri süspansiyonu konduktan sonra steril bireküvyon yardımıile süspansiyon besiyeri yüzeyine yayıldı ve antibiyotik diskleri besiyeri üzerine aralarında en az 24 mm ve Petri kutusu kenarlarına 14 mm uzaklık olacak şekilde yerleştirildi (63). Besiyerleri, 18-24 saat 37 ºC’de inkübe edildi ve duyarlılık ürememe zonlarına göre değerlendirildi. Zonlar ölçüldü ve sonuçlar European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) standartlarına göre, duyarlı, orta duyarlı ya da dirençli olarak değerlendirildi (63,81). E-test Dilüsyon ve disk difüzyon tekniklerinin belirli dezavantajları elimine edilerek MİK sonuçları elde etmek amacıyla geliştirilmiştir. Anaerop bakterilerin duyarlılığının belirlenmesinde MİK belirlemeye yönelik testler önerildiğinden, uygulaması en kolay olan E test yöntemi kullanılmıştır. Penisilin, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, klindamisin, metronidazol ve sefoksitin E-test stripleri ile, antibiyotiklerin anaeroplara karşı MIK değerleri belirlenmiştir. E-test uygulanmadan önce bakteri suşlarından 0.5 Mc Farland bulanıklığındaki süspansiyon Schaedler broth besiyerinde hazırlanmıştır. Hazırlanan süspansiyon modifiye Brusella Agar besiyerinin yüzeyine yayılmış ve kuruması için birkaç dakika beklendikten sonra E-test şeritleri yerleştirilmiştir. Besiyerleri jara kaldırılarak oksijensiz ortam sağlayıcı AnaeroGen ile 37 °C’ de en az 72 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında elips şeklindeki inhibisyon zonunun strip ile kesiştiği nokta MİK değeri olarak değerlendirilmiştir (66). 3.2.8. İstatistiksel yöntemler Araştırmamızda laktasyonel mastitli hastalarda ve non-laktasyonel mastitli hastalardan granülomatöz mastitli olanlarda üretilen bakterilerle hasta grupları arasında bir ilişki olup olmadığı SPSS ile Spearman’s korelasyon analizi yapılarak belirlenmiştir.Analizde bakteriler ve bu bakterilerin üretildiği hasta sayıları değişkenler olarak kullanılmıştır. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. 56 4. BULGULAR Çalışmamızda mastit tanısı almış olan 100 hastanın cerahat/doku örneklerinden yapılan aerop, anaerop kültür, PZR ve antimikrobial duyarlılık çalışmaları sonucunda elde edilen veriler aşağıda açıklanmıştır. Araştırmaya dahil edilen 100 mastit hastasından 44’ü laktasyonel mastit 56’sı non-laktasyonel mastit tanısı almıştır (Şekil 4–1).Tüberküloz mastiti saptanmış hastalar çalışmaya dahil edilmemiştir. Şekil 4-1: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış hastaların dağılımı. Non-laktasyonel mastit tanısı almış 56 hastanın 10 (%17,8)’u periduktal mastit, 46 (%82,1)’sı ise granülomatöz mastit olarak tanımlanmıştır. Bu tanımlama hastaların klinik özellikleri ve her bir hastaya ait histopatolojik inceleme raporu sonucuna göre genel cerrahi anabilim dalında sorumlu uzman tarafından yapılmıştır. Periferal enfeksiyonlu hastaya rastlanmamıştır (Şekil 4-2). Şekil 4-2: Non-laktasyonel mastitli 56 hastada granülomatöz mastitli ve periduktal mastitli olguların dağılımı. 57 Çalışmaya alınan laktasyonel mastitli 44 hastanın yaşlarının 22 ile 34 arasında değiştiği ve yaş ortalamasının 29 olduğu buna karşın non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalardan periduktal mastitli grupta yaş aralığının 38 ile 41 arasında değiştiği ve yaş ortalamasının 39,5 olduğu, granülomatöz mastitli grupta ise yaş aralığının 23 ile 55 arasında değiştiği ve yaş ortalamasının 34,5 olduğu saptanmıştır.Laktasyonel mastitli 40 yaş üstü hastaya rastlanmamasına karşın non-laktasyonel mastitli hasta grubunda 40 yaş üstü hastaların bulunduğu ve %25-30’unu oluşturdukları belirlenmiştir (Tablo 4–1, Şekil 4-3). Tablo 4-1: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hastalarda yaş aralığı ve yaş ortalaması. Hastalar Laktasyonel Mastit (44) Yaş aralığı Yaş ortalaması 22–34 29 38- 41 39,5 23–55 34,5 Nonlaktasyonel mastit (56 ) Periduktal mastit (10) Nonlaktasyonel mastit (56 ) Granülomatöz mastit (46) Şekil 4-3:Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hastalarda yaş gruplarının dağılımı. 58 Tablo 4-2: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hastalara ait özelliklerin dağılımı. s(%). Hastaların özellikleri Laktasyonel mastitli hastalar s:44 Non-laktasyonel mastitli hastalar s:56 Periduktal mastit s:10 Granülomatöz mastit s:46 21 (47,7) 23 (52,3) 3 (30) 7 (70) 18 (39,1) 28 (60,8) 10 (23) 34 (77,2) 2 (20) 8 (80) 21 (45,6) 25 (54,3) 2 (4,5) 42 (95,4) 0 10 (100) 4 (8,4) 42 (91,3) Var Yok 10 (23) 34 (77,2) 6 (60) 4 (40) 28 (60,8) 18 (39,1) Var Yok 33 (75) 11 (25) 7 (70) 3 (30) 27 (58,6) 19 (41,3) Var Yok 0 44 (%100) 0 10 (%100) 0 46 (%100) Var Yok 7 (15,9) 37 (84) 9 (90) 1 28 (60,8) 18 (39,1) Var Yok 12 (27,2) 32 (72,7) 3 (30) 7 (70) 11(23,9) 35 (76) Var Yok 26 (59) 18 (40,9) 6 (60) 4 (40) 24 (52,1) 22 (47,8) Var Yok 20 (45,4) 24 (54,5) 5 (50) 5 (50) 10 (21,7) 36 (78,2) Doğurma şekli Normal Sezaryen Pompa kullanımı ile travma Var Yok Darbe ile travma Var Yok Hastada geçirilmiş mastit öyküsü Mastitle birlikte üriner enfeksiyon Otoimmün hastalık Sigara Kullanımı Alkol Kullanımı Aile içi stres Ailede mastit öyküsü 59 Hastaların sosyodemografik özellikleri incelendiğinde non-laktasyonel mastitli hastalardan özellikle periduktal mastitlilerde sigara kullanımının belirgin şekilde yüksek olduğu (9/10) laktasyonel mastitlilerde ise çok düşük olduğu (7/44) belirlenmiştir.Gerek laktasyonel (12/44) gerekse non-laktasyonel mastitli (15/56) hastalarda alkol kullananların sayısında benzerlik olduğu görülmüştür. Aile içi stres laktasyonel mastitli hastaların 26 (%59)’sında, non-laktasyonel mastitli hastalardan periduktal mastitli olguların 6 (%60)’sında ve granülomatöz mastitli olguların 24 (%52,1)’ünde belirlenmiştir. Çalışmaya aldığımız hastaların diğer aile bireylerinde mastit öyküsü olup olmadığı araştırıldığında laktasyonel mastitli 20 (%45,4) hastanın ve non-laktasyonel mastitli 15 (%26,7) hastanın abla,kardeş ya da teyzelerinin mastit geçirmiş olduğu saptanmıştır(Tablo 4- 2). Araştırmamızda mastit tanısı almış hastaların kültür sonuçları değerlendirildiğinde, laktasyonel mastit tanısı almış 44 hastanın 38 (%86,4)’inde bakteri ürediği, 6 (%13,6) ’sında ise bakteri üremediği tespit edilmiştir (Şekil 4–4). Şekil 4-4: Laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde bakteri üremesi saptananların oranı Non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalardan periduktal mastitli olan grupta 4 (%40) hastada ve granülomatöz mastitli grupta 20 (%43,7) hastada üreme görülmüştür (Şekil 4–5). Şekil 4-5: Non-laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde bakteri üremesi saptananların oranı(A:Periduktal mastitli grup, B: Granülomatöz mastitli grup) 60 Araştırmamızda, laktasyonel mastitli 1 hastanın ve non-laktasyonel mastitli olgulardan granülomatöz mastitli 19 (%28) hastanın örneklerinde üreme olmadığı halde bu örneklerden hazırlanan Gram preparasyonlarda bakteri görülmüştür (Şekil 4–6). Şekil 4-6: Kültürde üreme olmadığı halde Gram boyamada bakteri görülen örneklerin hasta gruplarına göre dağılımı. Çalışmaya dahil ettiğimiz laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış 100 hastada üreyen aerop bakterilerin dağılımı incelendiğinde Gram pozitif diplokokların en yüksek oranda üreyen bakteriler olduğu belirlenmiştir. Bu oranı ikinci sırada Gram pozitif çomaklar takip etmektedir; üçüncü sırada ise Gram negatif çomaklar yer almaktadır. Gram pozitif diplokoklardan Staphylococcus aureus’un özellikle laktasyonel mastitli hastalarda çok yüksek oranda olduğu(%43,1), non-laktasyonel mastitli hastalarda ise Staphylococcus aureus’un periduktal mastitlilerde %40, granülomatöz mastitlilerde ise %4,3 oranında ürediği saptanmıştır. Gram pozitif diplokoklarda üreme oranı bakımından ikinci sırada yer alan Staphylococcus epidermidis’inlaktasyonel mastitli hasta grubunda %9 oranında ürerken non-laktasyonel mastitli hasta grubunda hiç üremediği gözlenmiştir. Buna karşın, Staphylococcus saprophyticus laktasyonel mastitli yalnızca 2 hastada ve granülomatöz mastitli yalnızca 1 hastada saptanmıştır. Streptokokların laktasyonel mastitli hastalarda hiç bulunmadığı gözlenirken, non-laktasyonel mastitli hastalarda Streptococcus pyogenes 1 periduktal mastit olgusunda ve 1 granülomatöz mastit olgusunda ayrı ayrı üremiştir. Non-hemolitik streptokok ise yalnızca 1 granülomatöz mastitli olguda üremiştir. Bu durumda streptokok türlerinin stafilokoklara göre mastitli hastalarda çok daha düşük oranda ürediği belirlenmiştir (Tablo 4–3). 61 Gram pozitif diplokokları, Gram pozitif çomaklardan özellikle Corynebacterium türleri takip etmiştir. Corynebacterium kroppenstedtii laktasyonel mastitli hiçbir hastada üremezken granülomatöz mastitli 7 (%15,2) hastada üremiş, Corynebacterium urealyticum ve Corynebacterium amycolatum iselaktasyonel mastitli yalnızca birer hastada ürerken C. urealyticum granülomatiz mastitli 3 (%6,5), C. amycolatum ise 2 (%4,3) hasta örneğinde üremiştir. Bu türlerin non-laktasyonel mastitli hastalardan granülomatöz mastit tanısı almış grupta %26,1 oranda üremesi, buna karşın periduktal mastitli hiçbir hastada ürememesi ve laktasyonel mastitli 2 hastada üremesi dikkat çekmiştir(Tablo 4–3).. Araştırmamızda, Gram negatif çomaklardan başta Escherchia coli olmak üzere Proteusmirabilisve Klebsiella pneumoniaetürlerinin ürediği saptanmıştır. Escherchia coli yalnızca laktasyonel mastitli olgularda üremiştir (%6,8). Klebsiella spp. yalnız 1 granülomatöz mastitli olguda üremiştir. Buna karşın, Proteus mirabilisher hasta grubundan 1’er kişide üremiştir (Tablo 4–3). Tablo 4-3: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalarda üreyen aerop bakterilerin dağılımı. Aerop bakteriler Laktasyonel mastitli hastalar s:44 Non-laktasyonel mastitli hastalar s:56 Periduktal mastit Granülomatöz mastit s:10 s:46 25 (%56) 5 (%50) 5 (%10,9) 19 (%43,1) 4 (%40) 2 (%4,3) 4 (%9) - - 2 (%4,5) - 1 Non-hemolitik Streptokok - - 1 Streptococcus pyogenes - 1 1 Gram negatif çomaklar Escherichia coli 4 (%9) 3 (%6,8) 1 - 2 (%4,3) - Proteus mirabilis 1 1 1 Klebsiella pneumoniae - - 1 2 (%4,5) - - 12 (%26,1) 7 (%15,2) Corynebacterium urealyticum 1 - 3 (%6,5) Corynebacterium amycolatum 1 - 2 (%4,3) Gram pozitif diplokoklar Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Gram pozitif çomaklar Corynebacterium kroppenstedtii 62 Çalışmaya dahil ettiğimiz mastitli hastalarda üreyen anaerop bakterilerin dağılımını incelediğimizde gerek laktasyonel mastit gerek non-laktasyonel mastitli hasta gruplarımızda en fazla peptostreptokok türlerinin ürediği dikkati çekmiştir. Peptostreptococcus spp. laktasyonel mastitli 5 hastada ürerken, 1’i periduktal mastitli diğer 3’ü granülomatöz mastitli hastalar olmak üzere non-laktasyonel mastitli 4 hastada üremiştir. Anaerop Gram negatif çomaklar mastitli 2 hastamızda üremiştir. Granülomatöz mastit tanısı almış olan bu 2 hastada etkenin Bacteroides fragilis olduğu saptanmıştır. Bununla birlikte, anaerop Gram pozitif çomaklar yalnızca 4 hastada üremiştir. Bu hastalardan 3’ü laktasyonel mastit tanısı almıştır ve üreyen bakterinin Propionibacterium acnes olduğu belirlenmiştir. Diğer bir tür ise granülomatöz mastitli 1 hastada üremiş olan Clostridium spp.’dir (Tablo 4–4). Tablo 4-4: Laktasyonel ve non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalarda üreyen anaerop bakterilerin dağılımı. Anaerop bakteriler Laktasyonel mastitli Non-laktasyonel mastitli hastalar hastalar s:44 s:56 Periduktal mastit Granülomatöz mastit s:10 s:46 1 3 (%6,5) - - 2 (%4,3) 3 (%6,8) - - - - 1 Gram pozitif diplokoklar Peptostreptococcus spp. 5 (%11,3) Gram negatif çomaklar Bacteroides fragilis Gram pozitif çomaklar Propionibacterium acnes Clostridium spp. Çalışmaya dahil ettiğimiz 100 mastit hastasından alınan örneklerin 6’sında iki farklı bakteri türü birlikte, 3’ünde ise üç farklı bakteri türü birlikte üremiştir. İki tip bakteri birlikteliği laktasyonel mastitli 2 hasta örneğinde ve non-laktasyonel mastitli 4 hasta örneğinde buna karşın üç tip bakteri birlikteliği laktasyonel mastitli 1 hasta örneğinde ve non-laktasyonel mastitli 2 hasta örneğinde saptanmıştır (Tablo 4–5). Diğer örneklerde ya tek bir bakteri türü etken olarak üremiş ya da bakteri ürememiştir. 63 Tablo 4-5: Mastit hastalarına ait 10 örnekte saptanan bakteri birliktelikleri. Bakteri birliktelikleri Laktasyonel mastitli hastalar s:44 Non-laktasyonel mastitli hastalar s:56 Periduktal Granülomatöz mastit mastit İki bakteri türü birlikteliği S. aureus + Peptostreptococcus spp. 1 - - Corynebacteriumkroppenstedtii+ Peptostreptococcus spp. Corynebacterium urealyticum+ Proteus mirabilis - - 3 - - 1 Escherichia coli + Propionibacterium acnes 1 - - S. aureus+ B.fragilis+ Proteus mirabilis - - 1 Corynebacteriumurealyticum + Bacteroides fragilis + Clostridium spp. - - 1 Corynebacterium amycolatum+Peptostreptococcus spp. + Propionibacterium acnes 1 - - Üç bakteri türü birlikteliği Araştırmamızda, direkt Gram boyamada bakteri görüldüğü halde kültürlerde bakterilerin üretilemediği 20 cerahat örneğinden ya da bunların ekildiği tiyoglikolatlı sıvı besiyerlerinden yapılan 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu sonucunda elde edilen bakteri DNA larının fasta dizilerine göre 2 örnekte Staphyloccoccus aureus, 3 örnekte Staphyloccoccus epidermidis, 1 örnekte Staphyloccoccus capitis,2 örnekte Streptococcus spp., 1 örnekte Lactococcus lactis, 1 örnekte Klebsiella pneumoniaeve 5 örnekte Corynebacterium spp. (C.kroppenstedtii, C. urealyticum ve C. amycolatum) saptanmıştır. Anaerop bakterilerden ise 1 örnekte Peptostreptococcaceae bacterium, 1 örnekte Propionibacterium spp.,2 örnekte Propionibacterium acnes ve 1 örnekte Bifidobacterium brevesaptanmıştır.Moleküler yöntemlerle yapılan çalışmalara dahil edilen her bir örnekte yalnızca bir tür saptanabilmiştir. PZR ile, saptanan 1 P.acnes NC_018707.1 DNA sı laktasyonel mastitli bir hasta örneğinden saptanmıştır, diğer bakteri DNA ları non-laktasyonel mastitli hastalardan granülomatöz mastitli hasta grubuna ait örneklerdebelirlenmiştir (Tablo 4-6). 64 Spearman’s korelasyon analizi aerop ve anaerop kültürler ve PZR ile saptanan türler dikkate alınarak yapılmıştır.Laktasyonel mastitli 44 hastanın 29 (%65.9) unda aerop ve anaerop kültürler sonucunda Gram pozitif diplokok saptanmış, PZR ile saptanmamıştır.Laktasyonel mastitli hastalarlaGram pozitif diplokokların varlığı arasında güçlü bir korelasyon olmasa da istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu(rs= 0,544, p<0,05 ) belirlenmiştir. Bunun yanı sıra non-laktasyonel mastitli hastalardan granülomatöz mastitli 46 hastanın 20(%43,4)’sinde aerop ve anaerop kültürler ve PZR ile Gram pozitif çomaklar saptanmış ve granülomatöz mastitli hastalarla Gram pozitif çomaklar arasında güçlü bir korelasyon olmasa da istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu (rs=0,392, p<0,05) belirlenmiştir. Periduktal mastitli hasta sayımız ve üretilebilen ya da PZR ile saptanabilen Gram negatif çomak sayımız az olduğundan bunlar istatistiksel incelemelere alınmamıştır Araştırmamızda 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu sonucunda elde edilen bakteri DNA larının fasta dizilerine göre bakteri türlerinin saptanmasında örnek alınan bakteri genomlarından bazıları aşağıda belirtilmiştir (Şekil 4-7, Şekil 4-8). Şekil 4-7: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 genomu (83). Şekil 4-8: Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385 genomu (84). 65 Tablo 4-6:ABI 3730XL cihazında elde edilen kromatogramlardan çıkan Fasta dizilerinin NCBI ve DSMZ veri bankalarına göre sonuçları. Accession no. Bakteriler Aerop bakteriler 1 NZ_CP010297.1 Staphyloccoccus aureus 2 NZ_CP010297.1 Staphyloccoccus aureus 3 NC_004461.1 Staphyloccoccus epidermidis 4 NC_004461.1 Staphyloccoccus epidermidis 5 NC_004461.1 Staphyloccoccus epidermidis 6 NZ_HG7377333.1 Staphyloccoccus capitis 7 NZ_CP007628 Streptococcus spp. 8 NZ_JYGR010000005.1 Streptococcus mitis 9 NZ_JNLP010000001.1 Lactococcus lactis 10 NZ_CP011313.1 Klebsiella pneumonia subsp. pneumonia 11 NZ_CP010889.1 Corynebacterium pseudotuberculosis 12 NC_012704.1 Corynebacterium kroppenstedtii 13 NC_012704.1 Corynebacterium kroppenstedtii 14 NC_012704.1 Corynebacterium kroppenstedtii 15 NC_020230.1 Corynebacterium urealyticum Anaerop bakteriler 16 NZ_JH815225.1 Peptostreptococcaceae bacterium 17 NZ_KI515698.1 Propionibacterium spp. 18 NC_018707.1 Propionibacterium acnes* 19 NC_018707.1 Propionibacterium acnes 20 NZ_CP006716.1 Bifidobacterium breve *Laktasyonel mastitli hastaya ait örnekten PZR ile izole edilmiştir.Saptanan diğer türler nonlaktasyonel mastitli (granülomatöz mastitli ) hasta örneklerine aittir. 66 Çalışmaya dahil ettiğimiz mastitli hastalarda üreyen aerop bakterilerin antibiyotiklere direnç durumlarını belirlemek için yaptığımız disk difüzyon yöntemi sonuçları EUCAST 2015 dokümanına göre değerlendirilmiştir (81). Buna göre Gram pozitif diplokoklardan, metisilin-dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) kökenlerinde,penisilin, seftriakson ve amoksisilin/klavulonik asit direnci 9 kökende, eritromisin direnci 4 kökende, klindamisin direnci 3 kökende ve siprofloksasin direnci 1 kökende saptanmıştır. Buna karşın, trimetoprim/sülfametoksazol, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci hiçbir kökende tespit edilmemiştir. Metisilin duyarlı Staphylococcus aureus (MSSA) kökenlerinde eritromisin direnci 2 kökende, klindamisin ve linezolid direnci 1’er kökende saptanmıştır. Diğer bir safilokok türü olan metisilin duyarlı Staphylococcus epidermidis kökenlerinde eritromisin ve siprofloksasin direncine 1’er kökende rastlanırken, penisilin, seftriakson, amoksisilin/klavulonik asit, klindamisin trimetoprim/sülfametoksazol, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci hiçbir kökende saptanmamıştır. Metisilin duyarlı Staphylococcus saprophyticus kökenlerinde ise klindamisin direnci 1, eritromisin direnci yine 1 kökende belirlenmiştir. İzole edilen amoksisilin/klavulonik 1 non-hemolitik aside, streptokok klindamisine, kökeni penisiline, eritromisine ve trimetoprim/sülfametoksazol dirençli olarak tespit edilmiştir. Diğer bir streptokok türü olan Streptococcus pyogenes kökenlerinin birinde eritromisin direnci saptanmıştır. Bu kökenler denenen diğer antibiyotiklere duyarlı bulunmuştur. Gram negatif çomaklardan Escherichia coli kökenlerinde ampisilin direnci 1 kökende, seftriakson direnci 1 kökende, trimetoprim/sülfametoksazol direnci 1 kökende ve siprofloksasin direnci yine 1 kökende saptanmıştır. İzole edilen Proteusmirabilis kökenlerinde yine ampisilin direnci 1 kökende, seftriakson direnci 1 kökende, meropenem direnci 1 kökende, trimetoprim/sülfametoksazol direnci 1 kökende görülürken, Proteusmirabilis’de seftazidim, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, gentamisin ve siprofloksasin direnci gözlenmemiştir. İzole edilen 1 Klebsiellapneumoniae kökeni ise trimetoprim/sülfametoksazol ve siprofloksasine dirençli olarak bulunmuştur. Aerop Gram pozitif çomaklardan üretebildiğimiz Corynebacteriumkroppenstedtii, C. urealyticum ve C. amycolatum kökenlerinde siprofloksasin direncine 5 kökende, klindamisin direncine 3 kökende rastlanmış, buna karşın penisilin, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci hiçbir kökende saptanmamıştır (Tablo 4-7). 67 Tüm bu bulgularımıza göre trimetoprim/sülfametoksazol, gentamisin, siprofloksasin, vankomisin ve linezolidin aerop Gram pozitif diplokoklara, seftazidim, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem ve gentamisinin aerop Gram negatif çomaklara, penisilin, gentamisin, vankomisin ve linezolidin Gram pozitif difteroid çomaklara en etkili antibiyotikler olduğu belirlenmiştir. Çalışmaya dahil ettiğimiz mastitli hastalarda üreyen anaerop bakterilere karşı antibiyotiklerin MİK değerlerini belirlemek için yaptığımız E-test sonuçları EUCAST 2015 dokümanına göre değerlendirilmiştir (81). Yalnızca sefoksitinin MİK sınırları bu dokümanda henüz belirtilmediğinden değerlendirme CLSI M11 A8 dokümanına göre yapılmıştır. (82). Buna göre izole edilen Peptostreptococcus spp. kökenlerinden tümünün amoksisilin/klavulonik asit, imipenem ve klindamisine duyarlı olduğu, 3’ünün penisiline, 1’inin metronidazol ve 3’ünün sefoksitine dirençli kökenler olduğu saptanmıştır. Penisilin, klindamisin, metronidazol ve sefoksitine dirençli Peptostreptococcus spp. nin dirençli olduğu antibiyotikler için saptanan MİK değerleri sırası ile 2 mg/L, 6 mg/L, 8 mg/L, 128 mg/L’dir. İzole edilen 2 Bacteroides fragilis kökeni amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, klindamisin ve metronidazole duyarlı, penisiline ve sefoksitine dirençli bulunmuştur. Bacteroides fragilis’in dirençli olduğu antibiyotikler için saptanan MİK değerleri sırası ile 4 mg/L, 128 mg/L ´dir (Tablo 4-8). İzole edilen anaerop Gram pozitif çomaklardan 3Propionibacterium acnes kökeninin penisiline, amoksisilin/klavulonik aside, imipeneme, klindamisine, metrondazole ve sefoksitine duyarlı kökenler olduğu saptanmıştır. Benzer şekilde, izole edilen diğer bir anaerop Gram pozitif çomak olan 1 Clostridium spp. kökenide penisiline, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, klindamisin, metrondazol ve sefoksitine duyarlı bulunmuştur (Tablo 4-8). Amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, klindamisin ve metronidazolün izole ettiğimiz anaerop bakterilere en etkin antibiyotikler olduğu saptanmıştır. 68 Tablo 4-7: Mastitli hastalarda üreyen aerop bakterilerin antibiyotiklere direnç durumları ANTİBİYOTİK DİSKLERİ (μg) P/A (10) s CRO (30) s CAZ (30) s AMC (20/ 10) s IPM (10) s MEM (10) s DA (2) s E (15) s SXT (1.25/23.75) s CN (10) s CIP (5) s VA (30) s LZD (10) s S.aureus (MSSA) (16) 9 0 9 0 - 9 0 - - 3 1 4 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 S.epidermidis (MS) (4) 0 0 - 0 - - 0 1 0 0 1 0 0 S. saprophyticus (MS) (3) 0 0 - 0 - - 1 1 0 0 0 0 0 Non-hemolitik Streptokok (1) 1 0 - 1 0 0 1 1 1 - - 0 0 S. pyogenes (2) 0 - - - - - 0 1 - - - - 0 E. coli (3) 1 1 0 0 0 0 - - 1 0 1 - - Proteus mirabilis (3) 1 1 0 0 0 1 - - 1 0 0 - - Klebsiella pneumoniae (1) 0 0 0 0 0 0 - - 1 0 1 - - 0 - - - - - 3 - - 0 5 0 0 Aerop bakteriler (Toplam köken sayısı) Gram pozitif diplokoklar S.aureus (MRSA) (9) Gram negatif çomaklar Gram pozitif çomaklar Corynebacterium spp. (14) s : Dirençli köken sayısı , (-): Denenmedi P: Penisilin, A: Ampisilin, CRO: Seftriakson, CAZ: Seftazidim, AMC: Amoksisilin/ Klavulonik Asit, IPM: İmipenem, MEM: Meropenem, DA: Klindamisin, E: Eritromisin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol, CN: Gentamisin, CIP: Siprofloksasin, VA: Vankomisin, LZD: Linezolid MRSA: Metisilin dirençli Staphylococcus aureus, MSSA: Metisilin duyarlı Staphylococcus aureus, MR: Metisilin dirençli, MS: Metisilin duyarlı Corynebacterium spp: C. kroppenstedtii, C. urealyticum, C. amycolatum 69 Tablo 4-8: Mastitli hastalarda üreyen anaerop bakterilerin antibiyotiklere direnç durumları ve denenen antibiyotiklerin MİK değerleri (81, 82). MİK (mg/L) Antibiyotikler 1.k 2.k 3.k 4.k 5.k 6.k 7.k 8.k 9.k D 0,125 0,125 1 0,19 2 2 4 - - - - - - - 2 Propionibacterium acnes(3) 0,006 0,032 0,19 - - - - - - 0 Clostridium spp.(1) 0,125 - - - - - - - - 0 Peptostreptococcus spp. (9) 0,125 0,19 0,38 0,19 2 0,5 0,125 1 0,75 0 Bacteroides fragilis (2) 0,25 0,125 - - - - - - - 0 Propionibacterium acnes(3) 0,012 0,032 0,125 - - - - - - 0 Clostridium spp.(1) 0,25 - - - - - - - - 0 Peptostreptococcus spp. (9) 0,06 0,125 0,25 0,125 0,5 0,38 0,19 0 Bacteroides fragilis (2) 0,25 0,5 - - - - - - - 0 Propionibacterium acnes(3) 0,125 0,032 0,25 - - - - - - 0 Clostridium spp.(1) 0,125 - - - - - - - - 0 Peptostreptococcus spp. (9) 0,125 0,125 0,38 0,125 6 0,25 0,19 1 0,5 1 Bacteroides fragilis (2) 0,125 0,5 - - - - - - - 0 Propionibacterium acnes(3) 0,38 0,19 0,25 - - - - - - 0 Clostridium spp.(1) 0,5 - - - - - - - - 0 Peptostreptococcus spp. (9) 2 2 0,75 0,25 8 0,75 0,25 0,25 0,38 1 Bacteroides fragilis (2) 2 1,5 - - - - - - - 0 Propionibacterium acnes(3) 1 0,5 0,25 - - - - - - 0 0,38 - - - - - - - - 0 Peptostreptococcus spp. (9) 2 1,5 8 4 128 96 2 1,5 0,5 2 Bacteroides fragilis (2) 96 128 - - - - - - - 2 Propionibacterium acnes(3) 0,38 0,125 0,19 - - - - - - 0 Clostridium spp.(1) 0,25 - - - - - - - - 0 Penisilin (MİK >0.5mg/L)* Peptostreptococcus spp. (9) Bacteroides fragilis (2) 0,75 0,125 0,25 0,125 3 Amoksisilin/ Klavulonik Asit (MİK > 8 mg/L)* İmipenem (MİK > 8 mg/L)* 0,125 0,19 Klindamisin (MİK >4 mg/L)* Metronidazol (MİK >4 mg/L)* Clostridium spp.(1) Sefoksitin (MİK > 64 mg/L)** *EUCAST duyarlılık MIK sınırı , **CLSI duyarlılık MİK sınırı, D: Dirençli köken sayısı, k:köken 70 5. TARTIŞMA Mastit olarak bilinen meme enflamasyonu enfektif ya da non enfektif olabilmektedir. Toplumumuzda emziren annelerde en sık rastlanan enfeksiyonlardan biri laktasyonel mastit olarak bilinen enfektif mastittir. Ancak enfektif olsun ya da olmasın mastitin klinik belirtileri olan enflamasyonun yarattığı kızarma, sıcaklık, hassasiyet gibi hafif semptomlar kadınlarda güç kaybı, moral bozukluğu gibi etkilerde de bulunabilmektedir. Mastitli hastalarda, hafif belirtiler dışında ateş, apse gelişimi ve septisemi gibi hospitalizasyon gerektirebilecek komplikasyonlar da sık olmamakla beraber görülebilmektedir. Özellikle doğum sonrası ilk 3 ay içinde görülen enfektif mastit (laktasyonel mastit) anneyi yatağa bağlar, aktivitesini kısıtlar ve moral bozukluğuna neden olur. Ayrıca, enfektif mastit (laktasyonel mastit) süt azalmasına da neden olacağından bebeğin bakımında zorluk yaşanmasına yol açar. Emzirmenin sürdürülmesine karşı olan negatif etkisi ve annede yarattığı sıkıntının yanı sıra septisemi gibi ciddi komplikasyonlara da neden olması mastitte erken tanı ve etkin tedavi gereksinimini ortaya çıkartmaktadır (85). Non enfeksiyöz mastit (non-laktasyonel mastit) memenin lobüllerinde genişleme ile seyreden nedeni henüz kesin olarak belirlenememiş bir mastit türüdür. Özellikle granülomatöz mastit bu grupta en sık rastlanan kliniktir. Sarkoidoz, histoplazmos, wegener granülomatözü, bruselloz, tifo gibi patolojik durumlarda granülomatöz mastit gelişebilmektedir. En sık rastlanan granülomatöz mastit tipi idiyopatik granülomatöz mastittir. Patogenezi belirsizdir. Otoimmün hastalıklarla beraber olabileceği belirtilmiştir (86). Toplumumuzda granülomatöz mastitli hastalar memede ağrılı kitle, apse oluşumu, fistül, başvurabilmektedir karışabilmektedir. ve meme başında çoğunlukla Non-laktasyonel çekilme olgular mastitli gibi şikayetlerle başlangıçta hastalarda, meme memede hastaneye kanseri gelişen ile abse odaklarından izole edilen etkenlerin patolojiye sekonder olarak eklendiği ileri sürülmektedir (1). Ülkemizde mastitli hastaların kliniğine yönelik araştırmaların çoğunlukta olmasına karşın, gerek laktasyonel gerekse non-laktasyonel mastitli hastalarda enfeksiyona neden olan mikroorganizmaların oranına ve tür dağılımına yönelik araştırmalar yok denecek kadar azdır. 71 Araştırmaya dahil ettiğimiz 100 mastit hastasından 44 (%44)’ü laktasyonel mastit, 56 (%56)’sı ise non-laktasyonel mastit tanısı almıştır. Jafanhar, 2013 yılında, 213 mastitli olgudan 100 (% 46,9)’ünün enfektif mastitli (laktasyonel mastit), 113 (%53)’ünün ise non enfektif mastitli (non-laktasyonel mastit) olduğunu belirtmiştir (87).Bu oranların, bizim 100 hastayla çalıştığımız grupta yer alan laktasyonel ve nonlaktasyonel mastitli hasta oranlarına oldukça yakın olduğu görülmektedir. Çalışmamıza dahil ettiğimiz non-laktasyonel mastit hastalarından 10 (%17,8)’u periduktal mastit, 46 (%82,1)’sı ise granülomatöz mastit tanısı almıştır. Nair ve ark. 2013’te 50 nonlaktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada hastaların 12 (%24)’sinin periduktal mastit, 38 (%76) ’inin ise granülomatöz mastit tanısı aldığını belirtmişlerdir (88). Bu oranlar, hasta grubumuzun bir bölümünü oluşturan non-laktasyonel mastitli olgularımız arasında periduktal mastit ve granülomatöz mastit tanısı alan olgularımızın oranları ile benzeşmektedir. Ülkemizin bulunduğu coğrafik konum yanı sıra, ülkemizdeki beslenme alışkanlıkları, kadınların doğum yapma sayısı, kadının aile içindeki yeri ve çalışan kadın olarak toplumdaki yeri göz önünde bulundurulduğunda, mastit tanısı almış hasta gruplarında yaş ortalamalarını belirten veriler, farklı ülkelerden yine mastitli hastalar için bildirilen yaş ortalaması verileri ile karşılaştırmalar yapılabilesi ve zaman içinde toplumumuzda mastitli hastaların yaş ortalamalarında görülebilecek değişimlerin izlenebilmesi açısından önem taşımaktadır. Araştırmamızda, laktasyonel mastit tanısı almış 44 hastamızda yaş ortalamasının 29 olduğu belirlenmiştir. 2014 yılında Mediano ve ark. İspanya’da 368 laktasyonel mastitli hastayla yaptıkları çalışmada yaş ortalamasının 33,7 olduğunu bildirmişlerdir (89). Amir ve ark. 2007 yılında Avustralya’da, 3 farklı merkezde bulunan laktasyonel mastitli hastalarla yaptıkları araştırmada, 1. merkezde bulunan 112 mastit hastasının yaş ortalamasının 29,6, 2.merkezde bulunan 192 mastit hastasında yaş ortalamasının 32,6 ve 3. merkezde 889 hastada yaş ortalamasının 28,5 olduğunu belirtmişlerdir (90).Ülkemizde ise laktasyonel mastitli hastaların yaş ortalaması, 2003 yılında Dener ve ark’nın 128 hastayla yaptığı çalışmada, 28 olarak bulunmuş yaş aralığı ise 17-43 yaşlar olarak bildirilmiştir (91). 1996 yılında Kurt ve ark. 18 laktasyonel mastit olgusu ile yaptıkları çalışmada yaş ortalamasını 21,2 + 4,2 olarak saptamışlardır (92). Bu veriler ışığında araştırmamızda 29 olarak belirlediğimiz laktasyonel mastitli hastaların yaş ortalamasının ülkemizde yapılmış farklı araştırmalarda bildirilen oranlarla uyum sağladığı, Avrupa 72 ülkesiİspanya’dan bildirilen oranlardan biraz daha düşük olduğu ve coğrafik bölgemizden oldukça uzakta olan Avustralya’dan bildirilen oranlarla da yine uyum sağladığı anlaşılmaktadır. Yukarıda da belirttiğimiz gibi ülkelerin coğrafik konumu dışında bu oranları etkileyen bir çok faktörün bulunduğu kanaatindeyiz. Araştırmamızda non-laktasyonel mastit tanısı almış hastalarda yaş aralığının 34,5 ile 40 arası olduğu belirlenmiştir. Bu veri dahilinde periduktal mastitli 10 hastamızda yaş ortalaması 39,5; granülomatöz mastitli 46 hastayı kapsayan grupta ise yaş ortalaması 34,5 olarak saptanmıştır. Kok ve ark, 2010 yılında Brunei’den yayınladıkları araştırmalarında 43 non-laktasyonel mastit (granülomatöz mastit) tanısı almış hastada yaş ortalamasını 34 olarak bildirmişlerdir (93).Hovanessian Larsen ve ark., 2009 yılında yaptıkları araştırmada non-laktasyonel mastitli (granülomatöz mastit) hastalarının yaşlarınının 22-44 arasında olduğunu belirtmişlerdir (94).Ülkemizde Akbulut ve ark., 2011 yılında yaptıkları araştırmada çalışmaya dahil ettikleri 4 granülomatöz mastitli olguda yaş ortalamasını 33,2 olarak saptamışlardır (95). 2012 yılında Parlakgümüş ve ark. 47 non-laktasyonel mastit (granülomatöz mastit) tanısı almış hastada yaş ortalamasının 36 olduğunu belirtmişlerdir (96). Bu veriler ışığında non-laktasyonel mastitli hasta grubumuzu teşkil eden hastaların yaş ortalamasının gerek ulusal gerek uluslararası kaynaklarda belirtilen yaş ortalaması ile uyum gösterdiği görülmektedir. Laktasyonel mastitli 44 hastanın 21 (%47,7)’i normal doğum 23 (%52,3)’ü ise sezaryenle doğum yapmıştır. Non-laktasyonel mastitli hastalarda ise periduktal mastili ve granülomatöz mastitli grupların her ikisinde de sezaryenle doğum yapanların normal doğum yapanlara göre daha yüksek oranda olduğu saptanmıştır [Periduktal mastitli 7 hasta (%70), granülomatöz mastitli 28 hasta (%60,8)]. Amir ve ark 2007’de 3 farklı merkezde bulunan 1193 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştridikleri çalışmada, 1. merkezde bulunan 112 mastit hastasının %64,4’ünün, 2. merkezde bulunan 192 mastit hastasının %31,3’ünün, 3. merkezde 889 hastanın % 47,8’inin normal doğum yaptığını belirtmiştir (90). Kurt ve ark. ülkemizde 18 laktasyonel mastit olgusu ile gerçekleştirdikleri çalışmada olgulardan 16 (%88,8)’sının normal doğum gerçekleştirdiklerini belirtmişlerdir (92). Dolayısıyla, laktasyonel mastitli hasta grubumuzu teşkil eden hastaların doğum şekilleri uluslararası kaynaklarda belirtilen verilere göre biraz daha yüksek çıkmıştır. 73 Araştırmamızda, laktasyonel mastitli hastaların 10 (%23)’unda, periduktal mastili hastaların 6 (%60)’sında ve granülomatöz mastitli hastaların 28 (%60,8)’inde önceden geçirilmiş mastit öyküsü belirlenmiştir. Foxman ve ark Michigan ve Nebraska’da 946 laktasyonel mastit hastası ile gerçekleştirdikleri çalışmada 134 (%14,2) hastanın önceden geçirilmiş mastit öyküsü bulunduğunu belirtmişlerdir (97). Scott ve ark 2008’de 70 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada hastaların %16’sının önceden geçirilmiş mastit öyküsü bulunduğunu belirtmişlerdir (98). Ammari ve ark. 2002 yılında gerçekleştirdikleri çalışmada, 29 non-laktasyonel mastitli hastadan 4 (%11)’ünün önceden geçirilmiş mastit öyküsü bulunduğunu bildirmişlerdir (99). Bu sonuçlara göre araştırmamıza dahil olan mastitli hastalarda diğer uluslarası verilere göre daha yüksek oranda önceden geçirilmiş bir mastit öyküsü olduğu dikkati çekmektedir. Bu durumun, ülkemizde hanımların yaptıkları doğum sayısı ile tedavideki aksamalarla ve buna bağlı gelişen nükslerle ilişkili olabileceği görüşündeyiz. Üriner sistem enfeksiyonu ise laktasyonel mastitli hastaların 33 (%75)’ünde, periduktal mastili hastaların 7 (%70)’sinde ve granülomatöz mastitli hastaların 27 (%58,6)’sinde görülmüştür. Şimşek ve ark. 2014 yılında yaptıkları bir olgu sunusunda nonlaktasyonel mastitli bir hastada E.coli’ye bağlı bilateral meme apsesi tespit etmiş ve bunun muhtemel nedeninin hastanın yakın zamanda geçirdiği tam tedavi edilmemiş bir idrar yolu enfeksiyonu olduğunu öne sürmüşlerdir (100). Sandhu ve ark. 50 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada, hastaların %6’sının üriner sistem enfeksiyonu geçirmekte olduğunu bildirmişlerdir (44). Mediano P ve ark. 2014’te 368 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada 79 (%21,64)’unun üriner sistem enfeksiyonu geçirmekte olduğunu belirtmişlerdir (89). Bu çalışmamızda mastit sırasında üriner sistem enfeksiyonu geçiren hasta oranımız oldukça yüksek çıkmıştır. Araştırmaların sonuçlarına göre, mastit ile üriner sistem enfeksiyonu arasında bir ilişki olabileceği öne sürülse de bu durumu destekleyici daha spesifik araştırmalara gerek olduğu kanaatindeyiz. Güncel çalışmalarda, periduktal mastitin etiyolojisinde sigaranın önemli bir faktör olduğu periduktal mastitli hastaların %90‘ının sigara kullanmakta olduğu, nikotinin direkt veya indirekt olarak subareolar meme kanallarına zarar verdiği ve zarar görmüş dokuların aerop ve anaerop bakteri enfeksiyonlarına daha açık olduğu öne sürülmüştür (4). Sigaranın aynı zamanda in ivo ve in vitro olarak Gram pozitif bakteri 74 üremesini baskıladığı dolayısıyla periduktal mastit etiyolojisinde rol alan Gram- negatif aerobik ve anaerobik bakterilerin aşırı üremesine neden olduğu öne sürülmüştür (99). Hastaların sosyodemografik özellikleri incelendiğinde non-laktasyonel mastitli hastalardan özellikle periduktal mastitlilerde sigara kullanımının belirgin şekilde yüksek olduğu (9/10,%90),granülomatöz mastitli hastalarımızda ise, periduktal mastitlilerde belirlenen oran kadar olmasa da %60,8’lere ulaştığı, laktasyonel mastitlilerde ise çok düşük olduğu (7/44, %16) belirlenmiştir. Ammari ve ark. 2002 yılında 29 periduktal mastitli hastayla gerçekleştirdikleri çalışmada, hastaların %26’sının sigara kullanmaka olduğunu belirtmişlerdir (99). Ülkemizde Ocal ve ark. 2009’da 16 granülomatöz mastitli hasta ile yaptıkları çalışmada 6 (%37,5) hastanın sigara kullanmakta olduğunu belirtmişerdir (101). Yine ülkemizden Parlakgümüş ve ark. 2012 yılında, 47 granülomatöz mastitli hasta ile gerçekleştridikleri çalışmada hastaların 9 (%19)’unun sigara kullanmakta olduğunu bildirmişlerdir (96). Oran ve ark 46 nonlaktasyonel mastitli hastanın 16 (%35)’sının sigara kullanmakta olduğunu bildirmişlerdir (102). Ramalingam ve ark 2014’te Hindistan’da, Batı literatürüne zıt olarak, 35 periduktal mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada hastaların hiçbirinin sigara kullanmamakta olduğunu bildirmişlerdir (103). Mediano ve ark. 2014’te İspanya’da gerçekleştirdikleri çalışmada 368 laktasyonel mastitli hastanın 72 (%20)’sinin sigara kullanmakta olduğunu bildirmişlerdir (89). Foxman ve ark Michigan ve Nebraska’da 946 laktasyonel mastit hastası ile gerçekleştirdikleri çalışmada 61(%6,5) hastanın sigara kullanmakta olduğunu belirtmişlerdir (97). Özellikle periduktal mastitli ve granülomatöz mastitili hastalarımızda saptadığımız yüksek sigara kullanım oranının kaynaklarda bildirilen oranların oldukça üzerinde olduğu belirlenmiştir. Non-laktasyonel mastitli hastalardan alınan örneklerde mikroorganizmaların üretilemediği birçok kaynakta belirtilmektedir (86, 87, 99, 101).. Buna karşın laktasyonel mastit tanısı almış hastalarda enfeksiyon etkeni bakterilerin genellikle üretildiği bildirilmektedir. Bizim araştırmamızda, laktasyonel mastit tanısı almış 44 hastamızdan alınan örneklerin 38 (%86,4)’inde kültürde bakteri ürediği, 5 (%11,3)’inde Gram ile hazırlanan preparasyonlarda bakteri görülmediği ve kültürde de bakteri üremediği, 1’inde ise Gram ile hazırlanan preparasyonlarda bakteri görüldüğü halde kültürde üretilemediği tespit edilmiştir. Araştırmamızda laktasyonel mastitli hastalardan aldığımız örnekler sonucunda yaptığımız kültürlerde en sık üreyen bakterinin Staphylococcus aureus (%43,1) olduğunu tespit ettik. Uluslararası kaynaklarda, Kvist 75 ve ark 2008 yılında 192 laktasyonel mastit tanısı almış hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada, hastaların 87(%45,3)’sinde S. aureus ürettiklerini bildirmişlerdir (27). Osterman ve ark. 2000 yılında İsveç’te 40 laktasyonel mastit hastası ile gerçekleştirdikleri çalışmada 13 hastaörneğinden (%32,5) S. aureus izole ettiklerini belirtmişlerdir (105). Delgado ve ark. 2008 yılında İspanya’da yaptıkları çalışmada 20 laktasyonel mastitli hastadan ürettikleri 149 kökeni PCR-DGGE ile tarayarak 14’ünün S. aureus olduğunu tespit etmişlerdir (28). Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda ülkemizde laktasyonel mastitli hasta örneklerini mikrobiyolojik yönden inceleyen yalnızca 1 yayına rastladık. Dener ve ark. 2003 yılında 26 laktasyonel mastit hastasından topladıkları cerahatlerde yaptıkları incelemelerde 10 hastada (%38) S. aureus izole etmişlerdir (91). Laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde, gerek uluslarası gerekse ulusal literatürde bildirilen S.aureus oranının bizim saptadığımız oranla uyum gösterdiği belirlenmiştir. Olgularda, en yüksek oranda saptanan bakterinin S.aureus olması, süt emen bebeğin ağız florasında yer alan bu bakterinin sıklıkla meme ucundaki çatlaklardan anneye geçerek enfeksiyona neden olması ile ilişkilendirilmiştir(1). Araştırmamızda, laktasyonel mastitli olgularda 2. sıklıkta üretilen bakterinin anaerop Gram pozitif diplokoklardan Peptostreptococcus spp. olduğu saptanmıştır. Çalışmamıza dahil edilen 44 laktasyonel mastit hastasının 5 (%11,3)’inden Peptostreptococcus spp. izole edilmiştir. Sandhu ve ark. 2014 yılında laktasyonel mastitli olgularla gerçekleştirdikleri çalışmada, örneklerin %12,5’inden Peptostreptococcus spp. ürettiklerini bildirmişlerdir (44). Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda ise ulusal literatürde laktasyonel mastitli olgularda Peptostreptococcus spp. varlığına değinen bir kaynak bulunamamıştır. Ancak Sandhu ve ark‘nın saptadığı oranla bizim oranımızı uyuşmuştur (44). Ulusal ve uluslararası kaynaklarda laktasyonel mastitli hasta örneklerinden sıklıkla izole edildiği belirtilen diger bir bakteri Staphylococcus epidermidis’tir. Araştırmamızda, laktasyonel mastitli hasta örneklerinden 2. sıklıkta ürettiğimiz Peptostreptococcus spp.’ye yakın oranlarda (%9) Staphylococcus epidermidis saptadık. Sandhu ve ark 2014 yılında gerçekleştirdikleri çalışmada laktasyonel mastitli hastaların %40’ında S. epidermidis ürettiklerini belirtmişlerdir (44). Osterman ve arke 2000 yılında 40 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada 23 hastadan 76 (%57,5) koagülaz negatif stafilokok izole ettiklerini belirtmişlerdir (105). Delgado ve ark 2008 yılında 20 laktasyonel mastit hastası ile gerçekleştirdikleri çalışmada 149 izolattan 72 (%48)’sinin S. epidermidis oldugunu belirlemişlerdir (28). S.epidermidis için bildirilen bu yüksek oranlara karşı, bizim araştırmamızda saptadıgımız %9’luk Staphylococcus epidermidis oranına benzer şekilde, Bharat ve ark 2009 yılında 12 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada %7 oranında S. epidermidis ürettiklerini belirtmişlerdir (106). Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda ülkemizde yapılan çalışmalarda ise laktasyonel mastitli olgularda etken mikroorganizmaların dağılımına yönelik araştırmalarda S. epidermidis oranına değinen bir kaynak bulunamamıştır. Ayrıca laktasyonel mastitli hasta grubumuzda 2 köken S. saprophyticus üretmemize rağmen ulusal ve uluslararası kaynaklarda bu verilerimizi destekleyen bir yayın da bulamadık. Staphylooccus spp. kasık, perine, koltuk altı deri florasını oluşturur. Daha çok nekroz ve cerahatlenmeye, apseleşmeye neden oldugu bilinmektedir. Başta koagülaz negatif stafilokoklar olmak üzere, birçok türünün biyofilm oluşturarak enfeksiyonlara neden oldugu gösterilmiştir (107). S. saprophyticus ise insanda özellikle idrar yolu epiteline tutunabilme özelligi ile bilinen bir bakteridir ve idrar yolu enfeksiyonlarına neden oldugu bildirilmiştir (107). S. Saprophyticus saptadığımız 2 hastamızın mastit sırasında üriner sistem enfeksiyonu geçiriyor olması bizim için oldukça ilginç ve bulgumuzu destekleyici bir veri olmuştur. Araştırmamızda, laktasyonel mastitli hastalarda numune alım sırasında deri dezenfeksiyonuna özen gösterildiği ve böylece flora bakterilerinin örnege kontaminasyonunun titizlikle önlendiğini bildiğimizden üreyen bakterilerin deriden kontamine olma olasılığı düşünülmemiştir. Laktasyonel mastitli hasta grubumuzda saptadığımız diğer bakteriler Escherichia coli (%6,8) ve Proteus mirabilis’dir. 2003 yılında Leborgne ve ark. yaptıkları çalışmada laktasyonel mastitli hastaların %5’inde Proteus mirabilis %3’ünde ise Escherichia coli izole ettiklerini bildirmişlerdir (108). Delgado ve ark. 2008 yılında laktasyonel mastitli hastalardan izole ettikleri 149 köken ile gerçekleştirdikleri çalışmada, 1 hasta örneğinden E. coli izole ettiklerini bildirmişlerdir (28). Bharat ve ark 2009 yılında 12 laktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada, hastaların %4,4’ünden Proteus spp. ürettiklerini bildirmişlerdir (106). Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda bu uluslararası 77 kaynaklar dışında laktasyonel mastitli hastaların örneklerinde E. coli ve Proteus spp. varlıgını belirten ulusal bir yayına rastlanmamıştır. Çalışmamıza dâhil ettiğimiz laktasyonel mastitli hasta örneklerinde ayrıca 2 Corynebacterium spp. kökeni izole edilmiştir. Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda ulusal literatürde bu verimizi destekleyecek bir yayına rastlamamış olsak da uluslararası yayınlarda saptadığımız Corynebacterium spp.’ye yönelik verilere ulaştık. Paviour ve ark, 2002 yılında, laktasyonel mastit hastalarından 3 Corynebacterium spp. kökeni izole ettiklerini bildirmişlerdir (104). Laktasyonel mastitli hastalarımızın örneklerinden izole edilen bir diğer Gram pozitif çomak anaerobik bir bakteri olan Propionibacterium acnes’tir. Bu bakteri laktasyonel mastitli hastalarımızın 3 (%6,8)’ünde üretilmiştir. Bunun dışında 1 hastanın Gram preparasyonunda Gram pozitif çomak gördügümüz halde kültürde ürememesi üzerine örnek PZR ile analize alınmış ve 1 Propionibacterium acnes DNA’sı saptanmıştır. Böylece laktasyonel mastitli olgularımızın 4 (%9)’ünde P.acnes varlığı gösterilmiştir. Bu verimizi destekleyecek yayınlar arasında uluslararası kaynaklarda bulduğumuz önemli bir çalışma, Kvist ve ark’nın 2008 yılında 192 laktasyonel mastit tanısı almış hasta ile gerçekleştirdikleri araştırmadır (27). Hasta örneklerinin %1‘inde Propionibacterium spp. saptadıklarını belirtmişlerdir. Paviour ve arkadaşları ise 2002 yılında yaptıkları araştırmada laktasyonel mastitli olgularda, %6 oranında P.acnes varlığı bildirmişlerdir (104). Uluslararası kaynaklarda bildirilen P. acnes oranlarının bizim bulgularımızla uyum gösterdiği belirlenmiştir. Laktasyonel mastitli olguların örneklerinde P.acnes varlığını belirten ulusal bir yayına ulaşılamamıştır. Non-laktasyonel mastit tanısı almış toplam 56 hastamızın 43’ünde Gram ile hazırlanan preparasyonlarda bakteri görülmüş ve bunların 24’ünde kültürde bakteri üretilebilmiştir. Uluslararası kaynaklarda non-laktasyonel mastitli (granülomatöz mastit) olgulardan alınan örneklerde Gram boyama sonuçlarının kültürdeki üremeyle uyumlu olmadığı belirtilmektedir. Taylor ve ark. 2003 yılında yaptıkları araştırmada, kültürde üreme saptadıkları 16 örneğin 10’unda Gram preparasyonlarında bakteri göremediklerini belirtmişlerdir (41). Renshaw ve ark. 2011 yılında 3 non-laktasyonel mastit (granülomatöz lobüler mastit) olgusuna ait örneklerden hazırlanan Gram preparasyonlarda bakteri gördükleri halde kültürde bakterileri üretememişlerdir (109). Fletcher ve ark. 1982 yılında yaptıkları araştırmada, 7 non-laktasyonel mastitli (granülomatöz mastit) hastadan aldıkları örneklerde histolojik inceleme raporlarında 78 mikroapseler ve granüloma belirtildiği halde kültürde üreme saptayamamışlardır (110). Ülkemizde granülomatöz mastitli hastalardan üretilen bakterilere ait bilgiler içeren sınırlı sayıda araştırma bulunmaktadır. Oran ve ark. 2013 yılında, 11 non-laktasyonel mastitli (granülomatöz mastit) hastanın apse örneğinde bakteri varlığını araştırmış ancak 8’inde bakteri üretebilmişlerdir (102). Son yıllarda, non-laktasyonel mastitli hastalarda, henüz etiyolojisi tam açıklanamamış, kronik enflamatuvar özellikteki hastalıkla beraber memede yoğun cerahat oluşmasına karşın bakteri üretilememesi nedeniyle, hastaların cerahatlerinden üretilen bakteri türlerine yönelik ilgi artmış ve bu konudaki araştırmalara ağırlık verilmiştir. Non-laktasyonel mastitli hastalarımızın örneklerinde en sık üretilen aerop bakterinin Corynebacterium türleri olduğu dikkati çekmektedir. Bunu Staphylococcus aureus ve Enterobacteriaceae ailesinden Proteus mirabilis ve Klebsiella pneumoniae takip etmektedir. Yine araştırma sonuçlarımıza göre nonlaktasyonel mastitli olgularda en sık üretilen anaerop bakterinin Peptostreptococcus spp. olduğu bunu Bacteroides fragilis’in izlediği belirlenmiştir. Ayrıca, Clostridium spp.’nin de etkenler arasında bulunduğu gösterilmiştir. Korinebakteriumların nonlaktasyonel mastitli olgulardaki varlığı birçok araştırmacının dikkatini çekmiş ancak üretimde başarı sağlanamadığı bildirilmiştir. 2012 yılında Flèche-Matéosve ark. nonlaktasyonel mastitli (granülomatöz mastit) bir olguda direkt Gram boyamada bakteri görülmediği halde Corynebacterium kropenstedii’nin ürediğini belirtmişlerdir (111). Yine Paviour ve ark. 2002 yılında, 15 mastitli hastadan üretilen 19 Corynebacterium türünü bildirmişler ve bunların 14’ünün Corynebacterium kropenstedii 2sinin C. tuberculostearicum ve 3 ünün C. amycolatum olduğunu belirtmişlerdir (104). Özellikle non-laktasyonel mastitli olgularda saptanan Corynebacterium türlerine ait oranların diğer türlere nazaran oldukça fazla olduğu belirtilmektedir (104). Araştırmamızda non-laktasyonel mastitli hastalar arasında özellikle 46 hastayı kapsayan granülomatöz mastitli hasta grubunda en sık üreyen bakterinin Corynebacterium spp. olduğu belirlenmiştir. PZR ile yapılan araştırmalarımız sonucunda ise yine granülomatöz mastitli hastalarda 5 Corynebacterium DNA’sı daha saptanmıştır. Böylece araştırmamızda granülomatöz mastitli hasta grubumuzda 17 (%36,9) korinebakterium saptanmıştır. Taylor ve ark, 2003 yılında Yeni Zelanda’da gen sekanslama yöntemi ile gerçekleştirdikleri çalışmada, 34 granülomatöz mastitli hasta örneğinin 24 (%70,6)’ünde lipofilik Corynebacterium spp. izole ettiklerini belirtmişlerdir (41). Granülomatöz mastitli hastalarımızda, saptanan Corynebacterium 79 türleri arasında C. pseudotuberculosis, C. kroppenstedtii ve C. urealyticum’un yer aldığı görülmektedir. Taylor ve ark. 2003 yılında granülomatöz mastitli hastalarda C. kropenstedii’nin %41 oranında saptandığını belirtmişlerdir (41). Ang ve ark., 2006 yılında İngiltere’de gerçekleştirikleri bir çalışmada C. accolens türünü bir granülomatöz mastitli hastadan izole ettiklerini bildirmişlerdir (42). Araştırmamızda gerek kültürle gerekse PZR ile saptayabildiğimiz Corynebacterium türleri arasında C. accolens türüne rastlanmamıştır. Ülkemizde ise granülomatöz mastitli olgulardan alınan cerahatlerde Corynebacterium varlığını gösteren iki araştırma bulunmaktadır. Parlakgümüş ve ark 2012 yılında 28 granülomatöz mastit tanısı almış hastadan alınan örneklerin 6’sında üreme olduğunu belirtmişler ve üretilen kökenlerden 1’inin bir difteroid basil olduğunu belirtmişlerdir ancak tür tanımına gidemememişlerdir (96). Özaydın ve ark ise, 2009 yılında granülomatöz mastitli 1 olguda Corynebacteriumamycolatum üretmişlerdir (112). Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda bu veri dışında non-laktasyonel mastitli olgularda Corynebacterium spp. oranını belirten ya da Corynebacterium spp. varlığına değinen ulusal bir yayına rastlayamadık. Corynebacterium türleri sıklıkla hayvanlarda mastit etkeni olarak bildirilmiştir (113). Bunun dışında, bu bakteriler insanda deri florası bakterileri olduğundan klinik örnekte üretilmeleri durumunda enfeksiyon etkeni mi oldukları, kolonize mi ya da kontaminant mı oldukları tartışılmaktadır. Özellikle granülomatöz mastitli hastalarda, granülomalardaki cerahatli akıntılardan hazırlanan Gram preparasyonlarda polimorf nüveli lökositlerle birlikte görülmeleri ve tek etken olarak üretilmeleri durumunda, enfeksiyon etkeni olarak kabul edilmeleri önerilmektedir (113). Bununla beraber, normal steril vücut bölgelerinde üretilmeleri halinde enfeksiyon etkeni oldukları kabul edilmektedir(113). Corynebacterium türlerinin mastitli olgularda nadir etkenler olarak bildirilmesinde Gram preparasyonlarda soluk boyanmalarına bağlı olarak kolay görülememelerinin ayrıca, bu bakterilerin lipofilik özelliğinden dolayı üreme için %1 Tween80 içeren besiyerlerine ihtiyaç duymaları, Tween80 eksikliğinde üretilememelerinin, rol oynadığı kanaatindeyiz. Bu bilgiler yanı sıra son yıllarda özellikle uluslararası kaynaklarda mastitli olgulardan alınan cerahatlerde Corynebacterium türlerinin varlığına değinen, tür düzeyinde tanısına inen ve hatta oranını belirten yayınlar yer almaktadır (41, 42, 104, 111, 112). Bu yayınlarda özellikle bakterinin Gram boyamada soluk boyanması ve kültürde zor üremesi nedeniyle gözden 80 kaştığı vurgulanmaktadır. Biz bu araştırmada hastalarımızın 19’unda kültür ve/veya PZR ile Corynebacterium türleri saptadık. Bu türler uluslarası kaynaklarda nonlaktasyonel mastitli hastalarda bildirilmiştir ancak ülkemizde elde edilen ilk verilerdir. (41, 104, 111). Araştırmamızda, non-laktasyonel mastitli olgularda 2. sıklıkta üretilen bakterinin Staphylococcus aureus olduğu belirtilmiştir. Sandhu ve ark 2014 yılında yaptıkları bir araştırmada non-laktasyonel mastitli olguların apse cerahatlerinde en sık üretilen bakterinin S. aureus (%33) olduğunu belirtmişlerdir (44). Leborgne ve ark ise 2003 yılında yaptıkları çalışmada apse örneklerinde %42 oranında S. aureus varlığı belirtmişlerdir (108). Kasım 2015-Haziran 2015 tarihleri arasında MEDLINE veri tabanında yaptığımız araştırmalar sonucunda gerek ülkemizde gerekse uluslararası yayınlarda non-laktasyonel mastitli olgularda S.aureus varlığını belirten yeterli sayıda yayın bulunamamıştır. Bu durum verilerimizin diğer verilerle kıyaslanmasında zorluklara neden olmuştur. Ülkemizde yalnızca Oran ve ark non-laktasyonel mastitli olgularda S. aureus varlığından ve oranından bahsetmişlerdir (102). Bu araştırmacılar 11 non-laktasyonel mastitli hastadan aldıkları cerahat örneklerinin 5 (%45)’inde S. aureus’u izole ettiklerini belirtmişlerdir (102). Araştırmamız sonucunda nonlaktasyonel mastitli olguların 43 (%76,8)’ünde bakteri varlığı saptanmıştır. Bunların 8 (%18,6)’inde S. aureus varlığı tespit edilmiştir. Araştırmamız sonucunda saptadığımız %18’lik oran, Oran ve ark’nın belirttiği %45’lik orandan ve uluslararası kaynaklarda belirtilen %33-%42’lik oranlardan oldukça düşüktür. Ancak bunun nedenini saptayabilmek için sonuçlarımızı kıyaslayabileceğimiz daha fazla araştırmaya gerek duyulduğu kanaatindeyiz. S. aureus dışında ulusal ve uluslararası kaynaklarda nonlaktasyonel mastitli olgularda az sayıda da olsa S. epidermidis varlığından sözedilmektedirb(44, 96). Biz araştırmamızda non-laktasyonel mastitli olgularımızda kültürle S. epidermidis saptamamamıza karşın PZR yöntemiyle 3 örnekte S. epidermidis varlığını belirledik. Bu oran S. aureus oranımızdaki gibi Sandhu ve ark’nın belirttiği %25’li S. epidermidis oranından ve ülkemizde Parlakgümüş ve ark’nın belirttiği %14,3’lük orandan düşüktür. Bu verimizi sağlıklı bir şekilde tartışabilmek için daha fazla ulusal ve uluslararası yayına ihtiyaç olduğunu düşünmekteyiz. Non-laktasyonel mastitli hasta grubumuzda 1 S. saprophyticus kökeni üretilmiş ve 1 S. capitis DNA’sı PZR ile saptanmıştır. Kaynaklarda, bu bakterilerin özellikle ineklerde gelişen mastitlerden alınan örneklerden izole edilmiş olduğu, insanlarda bu konuda yapılmış 81 sınırlı sayıda araştırma incelendiğinde bu verilerimizi destekleyen ulusal ve uluslararsı literatürde bir yayın bulunmadığı belirlenmiştir. Non-laktasyonel mastitli olgularda streptokok türlerinin varlığına değinen ve oranların oldukça düşük olduğunu gösteren birkaç sınırlı sayıda ulusal ve uluslararası yayına ulaşılabilmiştir. Bu yayınlarda belirlenen köken sayısı düşük olduğundan oran bilgisinden kaçınılmıştır. Sandhu ve ark 50 non-laktasyonel mastitli hastada 2 Streptococcus pyogenes kökeni, Oran ve ark ise ülkemizde 2013 yılında 11 granülomatöz mastit hastasının 3’ünde Streptococcus spp varlığını saptamıştır (44, 102). Biz araştırmamızda kültürle 1 S. pyogenes kökeni yine aynı hasta grubumuzda PZR ile 1 S. mitis DNA’sı ve türü kesin olarak tanımlanamayan bir Streptococcus spp. DNA’sı saptadık. Non-laktasyonel mastitli hasta grubumuzda saptadığımız diğer bakteriler Enterobacteriaceae ailesinde yer alan Klebsiella ve Proteus’tur. Bu hasta grubunda 2 Proteus mirabilis ve 1 Klebsiella pneumoniae kökeni üretilmiştir ancak üretilen bakteri sayısı az olduğundan oran bildiriminden kaçınılmıştır. Uluslarası kaynaklarda, Ramalingam ve ark 2014 yılında, 35 periduktal mastitli hasta örneğinin 2’sinde Klebsiella pneumoniae izole etmişlerdir (103). Nair ve ark ise 2015 yılında 38 idiyopatik granülomatöz mastitli hastanın 2’sinde ve 12 periduktal mastitli hastanın 1’inde Klebsiella spp. izole etmişlerdir (88). Klebsiella spp. yanı sıra Proteus spp.varlığına da değinen Sandhu 2014 yılında yaptığı araştırmada non-laktasyonel mastitli olguların 1’inde Proteus spp. saptamıştır (44). Bharat ve ark ise 2009 yılında 77 non-laktasyonel mastitli hastada 3 Proteus spp. saptamıştır (106). Ulusal kaynaklarda non-laktasyonel mastitli olgularda Proteus spp. varlığına değinen bir yayın bulunamamıştır. 100 mastit hastası ile gerçekleştirdiğimiz araştırmamızda aerop kültürlerin yanı sıra anaerop kültürler de yapılmıştır. Laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hasta örnekleri ile gerçekleştirdiğimiz anaerop kültürler sonucunda, anaerop Gram pozitif diplokoklardan Peptostreptococcus spp., anaerop Gram negatif çomaklardan Bacteroides fragilis ve anaerop Gram pozitif çomaklardan Propionibacterium acnes ve Clostridium spp. izole edilmiştir. Araştırmamıza dahil ettiğimiz 44 laktasyonel mastit hastasından alınan örneklerde en sık rastlanılan anaerobik etken yukarıda da belirtildiği gibi Peptostreptococcus spp. (%11,3) olmuştur. Laktasyonel mastitli hastalarımızın örneklerinden izole edilen bir diğer anaerobik bakteri ise %6,8 oranında izole ettiğimiz Propionibacterium acnes’tir. 82 Non-laktasyonel mastitli hastalarımızda ise anaerop kültür ile en sık üretebildiğimiz bakteri Peptostreptococcus spp.’dir (%7,1), (periduktal mastitli 1 olguda ve granülomatoz mastitli 3 olguda). Sandhu ve ark. 2014 yılında gerçekleştirdikleri bir çalışmada, non-laktasyonel mastitli hastalarda %60 oranında Peptostreptococcus spp. izole ettiklerini bildirmişlerdir (44). Paviour ve ark. 2002 yılında, Yeni Zelanda’da gerçekleştirdikleri bir çalışmada hastaların yalnıza 1’inin anaerobik kültürlerinden Peptostreptococcus spp. izole ettiklerini bildirmişlerdir (104). Ülkemizde ise nonlaktasyonel mastitli hastalarla gerçekleştirilmiş hiçbir çalışmada anaerop kültür yapılmadığı için Peptostreptococcus spp.’den söz edilmemiştir. Çalışmamıza dahil ettiğimiz 56 non-laktasyonel mastitli hastadan 2. sıklıkta ürettiğimiz anaerobik bakteri %4,3 oranında saptadığımız Bacteroides fragilis’tir (granülomatöz mastitli 2 olguda). Ammari ve ark. 2002 yılında gerçekleştirdikleri çalışmada, 29 non-laktasyonel mastitli hastanın 22’sinden alınan örneklerde Bacteroides spp. (%41) izole ettiklerini belirtmişlerdir(99). Sandhu ve ark. 2014 yılında gerçekleştirdikleri bir çalışmada, nonlaktasyonel mastitli hasta kültürlerinden %40 oranında Bacteroides spp. izole ettiklerini bildirmişlerdir (44). Ülkemizde ise non-laktasyonel mastit hastalarıyla gerçekleştirilmiş hiçbir çalışmada anaerop üremesinedeğinilmemiştir. 56 kültür yapılmamış non-laktasyonel mastit ve Bacteroides hastasının dahil fragilis olduğu çalışmamızda, granülomatöz mastitli olgularımızın birinde 1 Clostridium spp. kökeni izole edilmiştir ancak ulusal ve uluslararası kaynaklarda non-laktasyonel mastitli olgularda bu bakterinin varlığına değinen bir kaynak bulunamamıştır. Buna karşın hayvanlardan özellikle sığır ve ineklerde gelişen mastitlerde Clostridium spp’nin enfeksiyon etkeni olduğunu belirten kaynaklar bulunmaktadır (114, 115). Araştırmamızda gerçekleştirdiğimiz aerop ve anaerop kültürlerin sonucunda yalnızca bir bakteri türü üreyen örnekler yanı sıra birden fazla bakteri türünün ürediğini gözlediğimiz örneklere de rastladık. Laktasyonel mastitli hasta grubumuzda 4 hastadan aldığımız örneklerin 2’sinde aerop ve anaerop bakterilerin oluşturduğu 2 bakteri türü birlikteliği 1’inde ise üç tip bakteri türü birlikteliği saptadık. Nonlaktasyonel mastitli hasta grubumuzdan periduktal mastitli hasta grubunda tüm hasta örneklerinin kültürlerinde tek tip üreme gözlenirken granülomatöz mastitli grupta 4 hastada 2 türün, 2 hastada ise üç bakteri türünün birlikteliğini gözledik. En sık rastladığımız bakteri birlikteliği ise, nonlaktasyonel mastitli grubumuzdan granülomatöz mastitli hasta örneklerinin üçünde saptadığımız Corynebacterium spp. ve Peptostreptococcus spp. 83 birlikteliğidir. Sandhu ve ark 50 mastitli hasta ile yaptıkları çalışmada, yalnızca nonlaktasyonel mastitli grupta 7 hasta örneğinde karışık kültür gözlediklerini belirtmişlerdir (44). Ammari ve ark 2002’de 22 nonlaktasyonel mastitli hasta ile gerçekleştirdikleri çalışmada 4 hasta örneğinde Enterococci ve Bacteroides birlikteliğini saptamışlardır (99). Paviour ve ark. 24 mastitli hasta örneğinin 5’inde 2 tür bakteri birlikteliği gözlediklerini bildirmişlerdir (104). Araştırmamızda örneklerde saptadığımız bu bakteri birlikteliklerinin tedavide uygulanacak antibiyotiklerin düzenlenmesi için önemli bir veri olacağı kanaatindeyiz. Mastit tedavisinde kesin çözüme ulaşmak ya da nükslerin önüne geçebilmek için dikkat edilecek önemli noktalardan biri etkene yönelik antibiyotik kullanımını tercih etmektir. Dirençli suşların ortaya çıkmasında uygulanan antibiyotik politikalarının rolünün büyük olduğu düşünüldüğünde etkenlerin saptanması ve antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesi aşırı ve kontrolsüz antibiyotik kullanımının önlenmesi açısından önem taşımaktadır. Mastitin tedavisinde öncelikle beta-laktamaz dirençli penisilinler önerilmektedir. Ayrıca, alkali olan eritromisin anne sütünde iyi konsantre olarak aktif kalabildiğinden, Stapyhylococcus spp. ‘nin bazı türlerinin eritromisine dirençli olduğu bilindiği halde bu antibiyotik, enfeksiyonun primer olarak süt bezlerini tuttuğu laktasyonel mastit tedavisinde en iyi ilaç seçeneklerinden biri olarak gösterilmiştir (116). Ayrıca, yeni doğanların ertiromisin almasında bir sakınca görülmemesi ve bu antibiyotiğin antibiyotik direnç reaksiyonlarını daha az tetiklemesi de bu antibiyotiğin tercih nedenlerinden olmuştur. Mastit tedavisinde, geniş spektrumlu antibiyotiklerin yaygın kullanımının, enfeksiyona neden olan etkenlerde antibiyotik direnç oranlarının artışına neden olduğu ve MRSA artışından kaçınmak için amoksisilin/klavulonik asit gibi kombine antibiyotik kullanımlarından olabildiğince kaçınılması gerektiği önerilmiştir (27, 29, 116). Araştırmamızda laktasyonel ve non-laktasyonel mastitli hasta örneklerinden ürettiğimiz aerop bakterilerin amoksisilin/klavulonik asit, penisilin, imipenem, ampisilin, meropenem, seftriakson, seftazidim, klindamisin, eritromisin, trimetoprim/sulfametoksazol, gentamisin, siprofloksasin, vankomisin ve linezolide duyarlılık ve direnç durumları disk difüzyon yöntemi ile saptanmıştır. Metisilin-dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) kökenlerinde, penisilin, seftriakson ve amoksisilin/klavulonik asit direnci 9 kökende, eritromisin direnci 4 84 kökende, klindamisin direnci 3 kökende ve siprofloksasin direnci 1 kökende saptanmıştır. Buna karşın, trimetoprim/sülfametoksazol, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci hiçbir kökende tespit edilmemiştir. Metisilin duyarlı Staphylococcus aureus (MSSA) kökenlerinde ise eritromisin direnci 2 kökende, klindamisin ve linezolid direnci 1’er kökende saptanmıştır. Ramalingam ve ark 35 mastitli hasta ile gerçekleştridikleri çalışmada, hasta örneklerinden ürettikleri 4 S. aureus kökeninin 3’ünde trimetoprim/sülfametoksazol, 2’sinde penisilin, eritromisin ve siprofloksasin direncine rastladıklarını buna karşın, kökenlerin linezolid, rifampisin, sefoksitin, amikasin ve vankomisine direnç geliştirmediklerini belirtmişlerdir (103). İzole ettiğimiz, Staphylococcus epidermidis kökenlerinde eritromisin ve siprofloksasin direncine 1’er kökende rastlanırken, penisilin, seftriakson, amoksisilin/klavulonik asit, klindamisin trimetoprim/sülfametoksazol, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci hiçbir kökende saptanmamıştır. Ramalingam ve ark, mastitli hastalardan izole ettikleri 3 S. epidermidis kökeninden hepsinin penisiline, 2’sinin eritromisine, trimetoprim/sülfametoksazol ve siprofloksasin’e, 1’inin sefoksitin ve amikasin’e dirençli olduğunu buna karşın rifampisin, linezolid ve vankomisin dirençlerini hiçbir kökende saptamadıklarını bildirmişlerdir (103). Yılmaz ve ark. 2013’te yaptıkları araştırmada, kan kültürlerinden izole ettikleri metisilin dirençlikoagülaz-negatif stafilokok türlerinin %98,4’ünde penisilin, % 81,8’inde eritromisin, %81,8’inde siprofloksasin ve %50,3’ünde klindamisin direnci tespit ettiklerini belirtmişlerdir. Bu çalışma ile kıyasladığımızda çalışmamızda izole ettiğimiz koagülaz negatif stafilokok türlerinin direnç oranlarının uyuştuğu belirlenmiştir (117). Staphylococcus saprophyticus kökenlerinde ise klindamisin ve eritromisin direnci 1 kökende belirlenmiştir. İzole edilen 1 non-hemolitik streptokok kökeni penisiline, amoksisilin/klavulonik aside, klindamisine, eritromisine vetrimetoprim/sülfametoksazole dirençli olarak tespit edilmiştir. Diğer bir streptokok türü olan Streptococcus pyogenes kökenlerinin birinde eritromisin direnci saptanmıştır. Bu bulgumuzun aksine Ramalingam ve ark, mastitli hastalardan izole ettikleri tek bir S. pyogenes kökeninde penisilin ve trimetoprim/sülfametoksazol direncine rastladıklarını belirtmişlerdir (103). Gram negatif çomaklardan Escherichia coli kökenlerinde ampisilin direnci 1 kökende, seftriakson direnci 1 kökende, trimetoprim/sülfametoksazol direnci 1 kökende ve siprofloksasin direnci yine 1 kökende saptanmıştır. İzole edilen Proteus mirabilis 85 kökenlerinde yine ampisilin direnci 1 kökende, seftriakson direnci 1 kökende, meropenem direnci 1 kökende, trimetoprim/sülfametoksazol direnci 1 kökende görülürken, Proteus mirabilis’te seftazidim, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, gentamisin ve siprofloksasin direnci gözlenmemiştir. İzole edilen 1 Klebsiella spp. kökeni ise trimetoprim/sülfametoksazol ve siprofloksasine dirençli olarak bulunmuştur. Ramalingam ve ark ürettikleri bir tek Klebsiella pneumoniae kökeninin penisilin, rifampisin, amoksisilin/sulbaktam, sefoksitin, trimetoprim/sülfametoksazol, siprofloksasine dirençli buna karşın, linezolid, eritromisin, amikasin, netilmisine duyarlı olarak tespit etmişlerdir (103).Çıkman ve ark. 2014’te yaptıkları araştırmada, idrar kültürlerinden izole ettikleri tüm Enterobacteriacea ailesi üyelerini ertapenem ve meropeneme karşı duyarlı bulunmuştur. Bu antibiyotikler dışında Enterobacteriacea türlerine en etkili diğer antibiyotikler; amikasin, piperasilin-tazobaktam ve sefoksitin olarak bildirmişlerdir (118). Granülomatöz mastitli hastaların örneklerinden ürettiğimiz Corynebacterium spp. kökenlerinde siprofloksasin direncine 5 kökende, klindamisin direncine 3 kökende rastlanmış, buna karşın penisilin, gentamisin, vankomisin ve linezolid direnci hiçbir kökende saptanmamıştır. Ang ve ark İngiltere’de gerçekleştirdikleri bir olgu bildirisinde, granülomatöz mastitli bir hasta örneğinden ürettikleri Corynebacterium accolens‘in trimetoprim/sülfametoksazole dirençli, eritromisin, klindamisin, aminoglikozidlere tetrasiklin ve penisilin, sefalosporinler, duyarlı olduğunu bildirmişlerdir (42). Fransa’da gerçekleştirilen bir başka olgu bildirisinde FlècheMatéosve ark. 2012’de granülomatöz mastitli hastadan ürettikleri Corynebacterium kroppenstedtii’nin trimetoprim/sülfametoksazole ve fosfomisine dirençli buna karşın, penisilin, amoksisilin, sefotaksim, minosiklin, kanamisin, gentamisin, ertromisin, klindamisin, vankomisin, rifampisin, linezolid, moksifloksasine duyarlı olduğunu saptamışlardır (111). Ülkemizde Öztürkeri ve ark. idrar kültürlerinden izole ettiklei Corynebacterium spp.’de izolatların %95’ini penisiline dirençli bulurken tümünü vankomisine duyarlı olarak bulmuşlardır. Aynı zamanda C. urealyticum izolatlarının %27’sini klindamisine duyarlı bulmalarına rağmen C.jeikeium izolatlarının hepsini direçli olarak tespit etmişlerdir. Araştırmalarında, penisilnin bakterilere etkisiz olduğunu ve vankomisinin son seçenek olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir (119). Corynebacterium türlerimizde saptadığımız direnç oranların özellikle uluslararası kaynaklarda belirtilen direnç oranları ile uyumlu olduğu belirlenmiştir. 86 Araştırmamızda gerek laktasyonel gerek non-laktasyonel mastitli hastalarda ürettiğimiz anaerop bakterilerin antibiyotiklere direnç durumu antibiyotiklerin MİK değerleri ile belirlenmiştir. Anaerop bakteriler için penisilin, amoksisilin/klavulonik asit, imipnem, klindamisin, metronidazol, sefoksitin olmak üzere 6 antibiyotiğin MİK değerleri saptanmıştır. Örneklerimizden ürettiğimiz 9 Peptostreptococcus spp. kökenlerimizden 3’ü penisiline, bunlardan 2’si aynı zamanda sefoksitine ayrıca 1’i klindamisin ve metronidazole dirençli bulunmuştur. Dirençli kökenlerimizde en yüksek MİK değeri penisilin için 2 mg/L, sefoksitin için 128 mg/L, klindamisin için 6 mg/L ve metronidazol için 8 mg/L olarak saptanmıştır. Anaerop bakterilerde antimikrobiyal direncin hızla arttığı pek çok kaynakta belirtilmektedir. Özellikle penisilin direncindeki artışın penisilinaz ve beta-laktamaz oluşturan anaeroplarda korkutucu düzeyde arttığı öne sürülmektedir (120). Peptostreptococcus spp.’de penisilin MİK değerlerinin 8 mg/L’ye ulaştığını belirten kaynaklar bulunmaktadır (120). Bu durum bir beta-laktam antibiyotik olan sefoksitini de kapsamaktadır. Peptostreptococcus spp.’de uluslararası kaynaklarda klindamisin direncinin %10’a kadar ulaştığı bildirilmektedir (120). Ülkemizde ise Peptostreptokokların antimikrobiyal direncine değinen güncel bir araştırma bulunmamaktadır. Ülkemizde korneal apselerden izole edilen Peptostreptococcus anaerobius kökenlerinde %13,3 oranında klindamisin direnci saptandığını belirten yayınla bizim araştırmamızda saptadığımız %11,1’lik direnç uyuşmaktadır. Bacteroides fragilis grubu bakterileri beta-laktamaz yapan ve klinik kullanımdaki antibiyotiklere yüksek oranda direnç geliştiren bakteriler olarak bilinmektedir. Araştırmamızda ürettiğimiz 2 B. fragilis kökeninin penisilin ve sefoksitine dirençli olduğu belirlenmiştir. En yüksek MİK değerleri sırasıyla, 4 mg/L ve 128 mg/L olarak belirlenmiştir. Brook ve ark. araştırmalarında sefoksitin dirençli Bacteroides fragilis kökenlerinde MİK değerinin 64 mg/L’nin üzerinde olduğuna işaret etmişlerdir ve %4 ile %25 arasında değişen bir sefoksitin direncine işaret etmişlerdir. Ülkemizde Bacteroides fragilis kökenlerinin güncel sefoksitin direncine değinen bir araştırma bulunmamaktadır. Ancak penisilin dirençli B. fragilis’lerde MİK değerinin 256 mg/L’ye kadar ulaştığı belirtilmektedir (121). Propionibacterium acnes genellikle antibiyotiklere duyarlı bir anaerop bakteri olarak bilinmektedir. Penisilin, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem ve sefoksitine direnç henüz bildirilmemiştir (120). Ancak P. acnes’in klindamisin direncindeki artışın bugün %20’lere kadar ulaştığı 87 bilinmektedir (120). Ülkemizde P. acnes’in güncel klindamisin direncinin %34 olduğu ve dirençli kökenlerde klindamisin MİK değerinin 64 mg/L’ye kadar ulaştığı bildirilmiştir. Bizim araştırmamızda saptadığımız 3 P. acnes kökeni klindamisine duyarlı bulunmuştur. Clostridium spp. genelde antibiyotiklere duyarlı türler olarak bilinmektedir. Uluslararası literatürde belirtildiği şekilde bizim araştırmamızda da saptadığımız 1 Clostridium kökeni antibiyotiklere duyarlı olarak bulunmuştur. Araştırmamız süresince laktasyonel mastitli bir hastanın ve non-laktasyonel mastitli 19 hastanın örneğinde Gram preparasyonlarda bakteriler görüldüğü halde kültürde üreme olmadığı saptanmıştır. Özellikle non-laktasyonel mastitli olgulardan granülomatöz mastitli olanlarda, kültürde üremelerin olmadığı birçok kaynakta belirtilmiştir (41). Bu nedenle son yıllarda, moleküler yöntemleri kullanan araştırmalar dikkati çekmektedir. Taylor ve ark, 16S rRNA gen analizi ile granülomatöz mastitli olguların 14’ünde Corynebacterium kroppenstedtii saptamıştır (41). Paviour ve ark ise kültürde ürettikleri 19 Korinebakterium izolatının tür tanımını 16S rRNA gen analizi ile gerçekleştirmişler ve 14’ünün Corynebacterium kroppenstedtii, 2’sinin Corynebacterium tuberculostearicum, ve 3’ünün Corynebacterium amycolatum olduğunu belirlemişlerdir (104). Bu araştırmamızda direkt Gram boyamada Gram pozitif çomak saptadığımız ancak kültürde bakteri üretemediğimiz 5 örneğin 3’ünde Corynebacterium kroppenstedtii, 1’inde Corynebacterium uralyticum ve diğer 1’inde Corynebacterium pseudotuberculosis’i 16S rRNA gen analizi ile saptadık. Ayrıca araştırmamızda 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu sonucunda elde edilen bakteri DNA’larının fasta dizilerine göre 1 örnekte Lactococcus lactis izole edilmiştir. Uluslararası literatürde insandan izole edildiğini belirten bir kaynağa rastlanmamıştır. Hayvan mastitlerinde ise gittikçe önemi artan yaygın patojen olarakbildirilmiştir (122, 123). Ülkemizde nonlaktasyonel mastitli olgularda PZR ile bakteri saptayan bir araştırmaya rastlayamadık. Ayrıca mastitli olgularda Bifidobacterium brevi varlığını gösteren ulusal ya da uluslar arası hiçbir makaleye de rastlayamadık. Sonuç olarak, doldurduğumuz hasta formlarındaki bilgilere göre laktasyonel mastitli hastalarımızın yaş ortalamasının 29 olduğu ve bunların %75’inin mastitle beraber seyreden bir üriner sistem enfeksiyonu da geçirdikleri buna karşın nonlaktasyonel mastitli hastalarımızdan özellikle granülomatöz mastitli grupta yaş 88 ortalamasının 34,5 olduğu, bunların %60’ının sezaryenle doğum yaptığı, önceden geçirilmiş bir mastit öykülerinin bulunduğu ve sigara kullandıkları saptanmıştır. Yapılan aerop kültürlerde laktasyonel mastitli hasta örneklerinde en yüksek oranda üretilen bakterilerin Gram pozitif diplokoklardan S. aureus (%43,1) olduğu belirlenmiştir. Bunun dışında bu gruptaki hastalarda saptanan diğer stafilokok ve streptokok türleri (aerop/anaerop) de göz önünde bulundurulduğunda laktasyonel mastit ile Gram pozitif diplokokların varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunduğu (p<0.05) ve bu ilişkide en fazla S.aureus’un rolü olduğu kanaatindeyiz. Non-laktasyonel mastitli hastalardan özellikle granülomatöz mastitli olanların örneklerinde, kültür ya da 16S rRNA'nın PZR amplifikasyonu sonucunda elde edilen bakteri DNA’larının dizi analizi ile Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium amycolatum ve Corynebacterium pseudotuberculosis’in varlığı ülkemizde ilk defa bu çalışma ile belirlenmiştir. Granülomatöz mastitli hastalarda saptanan tüm Gram pozitif çomaklar (aerop/anaerop kültür ve PCR ile) göz önünde bulundurulduğunda, granülomatöz mastit ile Gram pozitif çomakların varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Bu ilişkide en fazla Corynebacterium türlerinin rolü olduğu düşünülmektedir. Ayrıca aynı gruptaki hasta örneklerinde yine aynı yöntemle şimdiye kadar yalnızca hayvan mastitlerinde gösterilmiş olan S. saprophyticus,S. capitis, Lactococcus lactis veBifidobacterium breve’de ilk defa insanlarda saptanmıştır. Bunun yanı sıra, düşük oranda da olsa mastitlerde peptostreptokokların en baskın üreyen anaerop bakteri olduğu belirlenmiştir. Laktasyonel mastitlerin etiyolojisinde rolü olan bakterilerin bilinmesine ve tedavide çoğunlukla başarı sağlanmasına karşın non-laktasyonel mastitlerin önemli bir bölümünü teşkil eden granülomatöz mastitlerin patogenezi ve etiyolojisi bugün kesin olarak bilinmemektedir; tedavi yanıtında yaşanan güçlükler ve sıkça karşılaşılan nüksler nedeni ile bu hasta grubunda elde edilen her verinin üstünde durulmaya değer olduğu belirtilmektedir. Bakterilerin granülomatöz mastit etiyolojisinde birincil rolü olduğunu söyleyen kaynaklar yanı sıra, bu bakterilerin sekonder olarak klinik tabloya eklendiğini belirten kaynakların da bulunması, ürettiğimiz bakterilerle mastit arasındaki ilişkinin incelikleri hakkında yorum yapmamızı zorlaştırmaktadır. İnsanda granuloma oluşumuna neden olan birçok klinik neden yanı sıra özellikle M.tuberculosis, Brucella spp. ve bazı mantarların bizzat bu oluşumdan sorumlu olduğu göz önünde bulundurulduğunda, 89 lipofilik olan Corynebacterium türleri ile granuloma oluşumu arasında da benzer bir ilişki olabileceği ve ileride bunun gösterilebileceği düşünülebilir. Ürettiğimiz bakterilerin antimikrobial duyarlılık testleri sonuçlarına göre, trimetoprim/sülfametoksazol, gentamisin, siprofloksasin, vankomisin ve linezolidin aerop Gram pozitif diplokoklara, seftazidim, amoksisilin/klavulonik asit, imipenem ve gentamisinin aerop Gram negatif çomaklara, penisilin, gentamisin, vankomisin ve linezolidin Gram pozitif difteroid çomaklara, ayrıca amoksisilin/klavulonik asit, imipenem, klindamisin ve metrondazolün de izole ettiğimiz anaerop bakterilere en etkin antibiyotikler olduğu saptanmıştır. Gerek laktasyonel gerekse non-laktasyonel mastitlerde enfeksiyona neden olan bakterilerde direnç gelişimine neden olabilecek geniş spektrumlu antibiyotikleri içeren ampirik tedavi protokollerinin uygulanmasından ziyade aerop/anaerop etkenlerin belirlenerek etkene spesifik tedavi uygulanmasının anlamlı olacağı özellikle etkenlerin üretilmesinde güçlükler yaşanan granülomatöz mastitli olgularda iseGram pozitif çomaklara (Corynebacterium türlerine) etkili penisilin, gentamisin, vankomisin ve linezolid gibi yağ dokuya penetrasyonu güçlü olan antibiyotiklerin tedaviye mutlaka eklenmesinde yarar olacağı kanısındayız. 90 KAYNAKLAR 1. Oran SE, Gurdal SO, Soybir GR. Mastitler. J Breast Health 2013; 9 (1): 1-4. 2. Kvist LJ. Toward a clarification of the concept of mastitis as used in empirical studies of breast inflammation during lactation. J Hum Lact2010;26:53-59. (PMID:19910519) 3. Thomsen AC, Espersen T, Maigaard S. Course and treatment of milkstasis, noninfectious inflammation of the breast, and infectiousmastitis in nursing women. American Journal of Obstetrics andGynecology 1984;149:492-495. (PMID:6742017) 4. Dixon JM, Khan LR. Treatment of breast infection. BMJ 2011;11: 342396.(PMID:21317199) 5. Arroyo R, Martín V, Maldonado A, Jiménez E, Fernández L, RodríguezJM. Treatment of infectious mastitis during lactation: antibioticsversus oral administration of Lactobacilli isolated from breast milk.Clin Infect Dis, 2010;50:1551-1558. (PMID:20455694) 6. Mızraklı T. 2012. Granülomatöz Mastit Tanılı Hastalarda Tanı ve Tedavi Yaklaşımı. Uzmanlık Tezi. İstanbul. 7. Unal M. Meme hastalıkları giriş ve tarihce. Editor Kalaycı G. Genel Cerrahi Cilt 1.Nobel, İstanbul 2002; 533-36. 8. Sikorak K, et al. Genes, dreams and cancer. BMJ, 1994; 308: 1217-21. 9. Carol M. Rumack, Stephanie R. Wilson, J. William Charboneau, Jo-Ann M. Johnson.Diagnostic Ultrasound third edition, Mosby Inc, 2005; 797-798. 10. Romrel LJ, Bland KI. Anatomy of the breast, axilla, chest wall and related metastaticsites. In: Bland KI, Copeland EM, editors. The breast Comprehensive management of benignand malignant disease, Philadelphia: W.B. Saunders Company, 17-35, 1991. 91 11. Beller F: Development and anatomy of the breast. In: Mitchell Jr. GW, Basset LW,editors. The female breast and its disorders. Baltimore: Williams and Wilkins, 1990; 1-12. 12. Gray H.Anatomy of the Human Body. Philadelphia: Lea & Febiger, 1918. 13. Daniel B. Kopans. Breast Imaging, Third Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA,2007; 7. 14. Keith L. Moore. Clinically Oriented Anatomy, Third eddition, Williams and WilkinsBaltimore, USA 1992; 45-46. 15. Mc Carty Jr KS, Tucker JA: Breast. In: Sternberg SS, ed. Histology for Pathologists. NewYork: Raven Pres, 1992;893-902. 16. EE Üstün, Mamografi Atlası, İzmir Güven ve Nobel Tıp Kitabevleri, 2000; 3. 17. Tavassoli F. A. : Pathology of the Breast. Appleton and Lange. Norwalk, Connecticut,1992. 18. Page DL, Anderson TJ: Diagnostic histopathology of the breast. Edinburg: Churchill Livingstone, 1987;4-10. 19. Ceylan İ, Uysal S, Törüner A, Alıç B. Meme Hastalıkları. Türkiye Klinikleri Yayınevi, Ankara, 1996; 52-65. 20. Kamal RM, Hamed ST, Dorria S. Classification of inflammatory reast disorders and step by step diagnosis. Breast J, 2009; 15: 367–380. 21. Altıntoprak F, Baytekin HF, Altınay AE, Eren T. Meme kanserini taklit eden idiyopatik granülomatöz mastit. Meme Sağlığı Dergisi 2009; 5 (1); 40-43. 22. Haagensen CD. Anatomy of the mammary glands. In: Diseases of the Breast. Haagensen CD. Ed Saunders Company 1986; 1-48. 23. Inch S, Von Xylander S. Mastitis: Causes and Manegement. Geneva: WHO, Department of Child and Adolescent Health and Development, 2000;13;56-61. 24. Novy MJ. Disorders of lactation. In: Benson RC, ed. Obstetric andgynecologic diagnosis and treatment Los Altos, Lange MedicalPublications 1984;864-867. 92 25. Inch S, Fisher C. Mastitis: infection or inflammation? Practitioner, 1995;239:472-476. (PMID:7659673) 26. Schoenfeld EM, McKay MP. Mastitis and methicillin-resistantStaphylococcus aureus (MRSA): the calm before the storm? J EmergMed 2010;38:31-34. (PMID:19232875) 27. Kvist LJ, Larsson BW, Hall-Lord ML, Steen A, Schalén C. The role ofbacteria in lactational mastitis and some considerations of the use ofantibiotic treatment. Int Breastfeed J, 2008;7:3-6. (PMID:18394188) 28. Delgado S, Arroyo R, Martín R, Rodríguez JM. PCR-DGGE assessmentof the bacterial diversity of breast milk in women with lactationalinfectious mastitis. BMC Infect Dis, 2008; 18;8:51. (PMID:18423017) 29. Infectious and Inflammatory Diseases of the Breast. In Sabel MS. ed.Essentials of the Breast Disease. 5th ed. Philadelphia: Mosby Elsevier;2009:83-90. 30. Rosa M. “Inflammatory” changes in breast: how to provide a bettercare to our patients. Arch Gynecol Obstet 2010;281:901-905.(PMID:19789887) 31. Rizzo M et al. Management of breast abscesses in nonlactating women. Am Surg. 2010; 76(3): 292-5. 32. Ingman WV, Glynn DJ, Hutchinson MR. Inflammatory mediators in mastitis and lactation insufficiency. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2014; 19:161167. 33. Devereux WP. Acute puerperal mastitis. Evaluation of its management. Am J Obstet Gynecol, 1970; 108:78-81. (PMID: 5454586) 34. Eryilmaz R, Sahin M, Hakan Tekelioglu M, Daldal E. Management of lactational breast abscesses. Breast 2005; 14:375-379. (PMID: 16216739) 35. Şimşek G, Gündeş E, Tekin S, Tavlı A. Laktasyonda olmayan kadında E. Coli’ye bağlı bilateral meme apsesi: nadir bir olgu. J Breast Health 2014; 10: 174-176. 93 36. Kadanalı A, Karagöz G. Puerperal İnfeksiyonlar. Ümraniye Tıp Dergisi. 2012;5: 22-28. 37. Buğra D. Hastane Dışı Cilt ve Yumuşak Doku İnfeksiyonlarında Antimikrobik Tedavi.ANKEM Derg 5 (3): 1991; 275-281. 38. Yau FM, Macadam SA, Kuusk U, Nimmo M, Van Laeken N. The surgical management of granulomatous mastitis. Annals of Plastic Surgery 2010;64:9– 16. 39. Memis A, Bilgen I, Ustun EE, Ozdemir N, Erhan Y, Kapkac M. Granulomatous mastitis: imaging findings with histopathologic correlation. Clin Radiol 2002; 57:1001–1006. 40. Mudgil AV, Macias ES, Karsif K. Idiopathic Granulomatous Lobular Mastitis. Int J Dermatol 2012 ;51(2):142-151. 41. Taylor GB, Paviour SD, Musaad S, Jones WO, Holland DJ. A clinicopathological review of 34 cases of inflammatory breast disease showingan association between corynebacteria infection and granulomatous mastitis. Pathology 2003;35:109–19. 42. Ang LM, Brown H. Corynebacterium accolens isolated from breast abscess: possible association with granulomatous mastitis. Journal of Clinical Microbiology 2007;45:1666–8. 43. Breast Abscess. İçinde: Borgen PI, Hill AK. eds. Breast Diseases, 3. Baskı. Texas:Landes Bioscience 2000:56-58. 44. Sandhu GS, Gill HS, Sandhu GK, Gill GP, Gill AK. Bacteriology in Breast Abscesses. Sch. J. App. Med. Sci. 2014; 2(4E) : 1469-1472. 45. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. 3.Baskı. İzmir, Barış yayınları, 2002; 495-532. 46. Madigan TM ve Martinko JM. Brock Mikroorganizmaların Biyolojisi. İçinde Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria. Ankara: Palme Yayıncılık, 2010; 331-416. 94 47. Kiraz N. Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ders Kitabı. Cilt 1. İçinde Kaygusuz A, Samastı M, Aygün G (Ed.), Bulaşıcı Hastalıklarla Mücadele. İstanbul: İstanbul Üniversitesi Basım ve Yayınevi Müdürlüğü, 2011; 613-659. 48. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schereckenberger BC, Winn WC. Color Atlas and Text Book of Diagnostic Microbiology6th ed. JH. Philadelphia: Lippincott, 2006. 49. Kiraz N. Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ders Kitabı. Cilt 2. İçinde Torun MM (Ed.), Anaerop Gram Negatif Çomaklar.İstanbul: İstanbul Üniversitesi Basım ve Yayınevi Müdürlüğü,2011; 1047-1056. 50. Unat EK. Tıp Bakteriyolojisi ve Virolojisi. İçinde Endospor Yapan Bakteriler. İstanbul: Dergah Tıp Yayınları, 1986; 240-291. 51. Monzon M, Oteiza C, Leiva J, Amorena B. Synergy of different antibiotic combinations in biofilms of Staphylococcusepidermidis. J Antimicrob Chemother. 2001;48:151. 52. Lindsay D, Von Holy A. Bacterial biofilms within the clinical setting: what healthcare professionals should know? J Hosp Infect. 2006;64:313-25. 53. Fux CA, Costerton JW, Stewart PS, Stoodley P. Survival strategies of infectious biofilms. Trens Microbiol. 2005;13:34-40. 54. Russel AD. Bacterial adaption and resistance to antiseptics, disinfectants and preservatives is not a new phenomenon. J Hosp Infect. 2004;57:97-104. 55. Uludağ Altun H, Şener B. Biyofilm infeksiyonları ve antibiyotik direnci. Hacettepe Tıp Dergisi. 2008; 39:82-88. 56. Kiraz N. Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ders Kitabı. Cilt 1. İçinde Bahar H (Ed.), Mikrobiyolojide Mikroskopla İnceleme Yöntemleri. İstanbul: İstanbul Üniversitesi Basım ve Yayınevi Müdürlüğü, 2011; 125-135. 57. Kiraz N. Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ders Kitabı. Cilt 1. İçinde Aygün G (Ed.), Klinik Mikrobiyolojik Tanı II. İstanbul: İstanbul Üniversitesi Basım ve Yayınevi Müdürlüğü; 2011; 717-755. 95 58. Kiraz N. Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ders Kitabı. Cilt 1. İçinde Bahar H (Ed.), Klinik Mikrobiyolojide Antijen-Antikor Reaksiyonları. İstanbul: İstanbul Üniversitesi Basım ve Yayınevi Müdürlüğü, 2011; 399-415. 59. Kloos WE, Wolfshohl JF. Identification of Staphylococcus species with the API STAPH-IDENT system.J Clin Microbiol. 1982;16(3):509-16. 60. Aras Z. Mikrobiyolojide Hızlı Tanı Yöntemleri. Erişim 11.05.2015, Turk Hij Den Biyol Derg, 2011; 68(2): 97-104: http://www.journalagent.com/turkhijyen/pdfs/THDBD_68_2_97_104.pdf 61. Altaş K, Midilli K. Enfeksiyon hastalıklarında moleküler tanı yöntemleri. Kalıtsal hastalıklara moleküler tıp açısından bakış sempozyumu. 2003; 59-71. 62. Brown-Elliot, B.A., Brown, J.M., Conville, P.S., Wallace, R.J. Clinical and Laboratory features of the Nocardia spp. Based on current molecular taksonomy. Clin. Microbiol. Rev., 2006; 19, 259-282. 63. Zhi, X.Y., Li, W.J., Stackebrandt, E. An update of the structure and 16S rRNA gene sequence-based definition of higher ranks of the class Actinobacteria, with the proposal of two new suborders and four new families and emended descriptions of the existing higher taxa. Int. J. Syst. Evol.Microbiol., 2009; 59, 589-608. 64. Tindall, J., Rosselló-Móra, R., Busse, H.J., Ludwing, W., Kampfer, P., Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,2010; (60): 249-266. 65. Coenye, T., Gevers, D., Van de Peer, Y., Vandamme, P., Swings, J., Towards a prokaryotic genomic taxonomy. FEMS Microbiol. Rev., 2005; 29, 147–167. 66. Stackebrandt, E. Molecular identification, systematics, and population structure of prokaryotes. (Stackebtandt, E., Ed.)Springer. Berlin, 2006; 320. 67. Goodfellow, M., Fiedler, H.P., A guide to successful bioprospecting: informed by actinobacterial systematics. Antonie van Leeuwenhoek, 2010; 119–142. 96 68. Kirby, B.M., Everest, G.J., Meyers, P.R.,. Phylogenetic analysis of the genus Kribbella based on the gyrB gene: proposal of a gyrB-sequence threshold for species delineation in the genus Kribbella. Antonie van Leeuwenhoek, 2010; 131–142. 69. Everest, G.J., Meyers, P.R.,. The use of gyrB sequence analysis in the phylogeny of the genus Amycolatopsis. Antonie van Leeuwenhoek, , 2009;(95) 1-11. 70. Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards. Microbiol Today, 2006; (33) 152–155. 71. Şenocak MŞ. Biyoistatistik ve Araştırma Yöntem Bilimi. İstanbul: İstanbul Tıp Kitabevi. 2014. 72. Unat EK. Tıp Bakteriyolojisi Ve Virolojisi. 2nd. ed. İstanbul:Dergah Yayınları;1986. 73. Ederer GM, Clark M. Motility-indole-ornithine medium. Appl Microbiol. 1970; 20: 849-850. 74. Jousimies-Somer H, Summanen P, Citron DM, Baron EJ, Wexler,HM, Finegold SM. Wadsworth-KTL Anaerobic bacteriology. Manual, 6th ed, California: Star Publishing, 2002: 43-54. 75. Onderdonk A.B: Methods fort the isolation and identification of obligate anaerobes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1992; 11 1039-1043. 76. Summanen P, Baron E.J., Citron D.M., Strong C.A., Wexler H.M., Finegold S.M. Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual. 5. Baskı Star Publ. Co. Belmont 1993. 77. Woods G.L., Ayers L.W., Washington J.A., Medical Microbiology. Henry J.B eds. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 6. baskı W B Saunders Company Philadelphia 1996; 1166-1170. 78. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.2001. 97 79. Lane, D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic acid techniques in bacterial systematics, (Edited by Stackebrandt, E and Goodfellow, M. John Wieley and Sons), New York 1991; s: 115-175. 80. Kumar, S., Nei, M., Dudley, J., Tamura K. MEGA: A biologist-centric software fr evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefing in Bioinformatics, 2008; 9 (4): 299-306. 81. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.2015.Setting breakpoints for existing antimicrobial agents. EUCAST SOP 2.0.European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Växjö,Sweden. 82. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2015. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria. Approved standard,8th ed.CLSI document M11-A8. Clinical and Laboratory StandardsInstitute, Wayne, PA. 83. National Center for Biotechnology Information (US); 2010. Erişim: 20.07.2015 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/27466918?report=fasta 84. National Center for Biotechnology Information (US); 2010. Erişim: 20.07.2015 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/237784637?report=fasta 85. Amir H, Lumley J. Women’s experience of lactational mastitis- ‘I have never felt worse’. Aust Fam Physician. 2006; 35(9):745-7 86. Asoğlu O, Ozmen V, Karanlık H, et al. Feasibility of surgical management in patients with granülomatous mastitis. Breast J. 2005; 11: 108-14 87. Jahanfar S1, Ng CJ, Teng CL.Antibiotics for mastitis in breastfeeding women.Cochrane Database Syst Rev.2013; 2. 88. Nair CG, Hiran, Jacob P, Menon RR, Misha. Inflammatory diseases of the nonlactating female breast. Int J Surg. 2015; 13:8-11 89. Mediano P, Fernández L, Rodríguez JM, Marín M. Case-control study of risk factors for infectious mastitis in Spanish breastfeeding women. BMC Pregnancy Childbirth. 2014 Jun 6;14:195 90. Amir LH, Forster DA, Lumley J, McLachlan H. A descriptive study of mastitis in Australian breastfeeding women: incidence and determinants. BMC Public Health. 2007 Apr 25;7:62 91. Dener C, Inan A. Breast abscesses in lactating women. World J Surg. 2003 Feb;27(2):130-3 98 92. Kurt S, Erler A, Demir N. Puerperal mastitlerin klinik izlemi. Türk Ekopatoloji Derg 1996; 2 (1-2):22-24. 93. Kok KY, Telisinghe PU. Granulomatous mastitis: presentation, treatment and outcome in 43 patients. Surgeon. 2010; 8(4):197-201. 94. Hovanessian Larsen LJ, Peyvandi B, Klipfel N, Grant E, Iyengar G. Granulomatous lobular mastitis: imaging, diagnosis, and treatment. AJR Am J Roentgenol. 2009 Aug;193(2):574-81. 95. Akbulut S, Arikanoglu Z, Senol A, Sogutcu N, Basbug M, Yeniaras E, Yagmur Y. Is methotrexate an acceptable treatment in the management of idiopathic granulomatous mastitis? Arch Gynecol Obstet. 2011 Nov;284(5):1189-95. 96. Parlakgümüş A, Yıldırım S, Bolat F, Purbager A, Çolakoğlu T, Belli S, Tarım A. Comparison of conservative therapy with steroids and surgical treatment for idiopathic granulomatous mastitis: Our clinical experience. Turkish Journal of Surgery 2012;(28):134-8. 97. Foxman B, D'Arcy H, Gillespie B, Bobo JK, Schwartz K.Lactation mastitis: occurrence and medical management among 946 breastfeeding women in the United States.Am J Epidemiol. 2002 Jan 15;155(2):103-14. 98. Scott JA, Robertson M, Fitzpatrick J, Knight C, Mulholland S.Occurrence of lactational mastitis and medical management: a prospective cohort study in Glasgow.Int Breastfeed J. 2008 Aug 25;3:21. 99. Ammari FF, Yaghan RJ, Omari AK.Periductal mastitis. Clinical characteristics and outcome.Saudi Med J. 2002 Jul;23(7):819-22. 100. Şimşek G, Gündeş E, Tekin Ş, Tavlı Ş. Laktasyonda Olmayan Kadında E.Coli’ye Bağlı Bilateral Meme Apsesi: Nadir Bir Olgu. J Breast Health 2014; 10: 174-176. 101. Ocal K, Dag A, Turkmenoglu O, Kara T, Seyit H, Konca K.Granulomatous mastitis: clinical, pathological features, and management.Breast J. 2010 MarApr;16(2):176-82. 102. Oran EŞ, Gürdal SÖ, Yankol Y, Öznur M, Calay Z, Tunacı M, Soybir GR. Management of idiopathic granulomatous mastitis diagnosed by core biopsy: a retrospective multicenter study. Breast J. 2013 Jul-Aug;19(4):411-8. 103. Ramalingam K, Srivastaa A, Vuthaluru S, Dhar A, Chaudhry R. Duct ectasia and periductal mastitis in Indian women. Indian J Surg 2014. 99 104. Paviour S, Musaad S, Roberts S, Taylor G, Taylor S, Shore K, Lang S, Holland D. Corynebacterium species isolated from patients with mastitis. Clin Infect Dis. 2002 Dec 1;35(11):1434-40. 105. Osterman KL, Rahm VA. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk, symptoms, treatment, and outcome. J Hum Lact. 2000 Nov;16(4):297-302. 106. Bharat A, Gao F, Aft RL, Gillanders WE, Eberlein TJ, Margenthaler JA. Predictors of primary breast abscesses and recurrence. Word J Surg, 2009; 33(12) 2582-2586 107. Huebner J, Goldmann DA.Coagulase-negative staphylococci: role as pathogens.Annu Rev Med. 1999;50:223-36. 108. Leborgne F. Treatment of breast abscesses with sonographically guided aspiration, irrigation, and instillation of antibiotics. AJR Am J Roentgenol. 2003 Oct;181(4):1089-91. 109. Renshaw AA, Derhagopian RP, Gould EW. Cystic neutrophilic granulomatous mastitis: an underappreciated pattern strongly associated with gram-positive bacilli. Am J Clin Pathol. 2011 Sep;136(3):424-7. 110. Fletcher A, Magrath IM, Riddell RH, Talbot IC. Granulomatous mastitis: a report of seven cases. J Clin Pathol. 1982 Sep;35(9):941-5. 111. Le Flèche-Matéos A, Berthet N, Lomprez F, Arnoux Y, Le Guern AS, Leclercq I, Burguière AM, Manuguerra JC. Recurrent Breast Abscesses due to Corynebacterium kroppenstedtii, a Human Pathogen Uncommon in Caucasian Women. Case Rep Infect Dis. 2012;120968. 112. Özaydın İ, Yıldırım M, Şahin İ, Doğan S. Recurrent breast abscess caused by Corynebacterium amycolatum: a cae report. Turk J Med Sci 2009;39(1):147-149. 113. Funke, G., A. von Graevenitz, J. E. Clarridge III, K. A. Bernard. Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 1997;(10):125-159. 114. Osman KM, El-Enbaawy MI, Ezzeldeen NA, Hussein HM. Mastitis in dairy buffalo and cattle in Egypt due to Clostridium perfringens: prevalence, incidence, risk factors and costs.Rev Sci Tech. 2009 Dec;28(3):975-86. 115. Schoonderwoerd M, Lewis IM, Scholten JA.Acute gangrenous mastitis due to Clostridium perfringens type A and Escherichia coli in a cow.Can Vet J. 1990 Jul;31(7):523-4. 100 116. Kataria K, Srivastava A, Dhar A. Management of lactational mastitis and breast abscesses: review of current knowledge and practice. Indian J Surg. 2013 Dec;75(6):430-5. doi: 10.1007/s12262-012-0776-1. 117. Yılmaz S, Gümral R, Güney M, Bedir O, Güçlü AÜ, Duyan S, Basustaoglu AC. Iki yıllık dönemde kan kültürlerinden izole edilen mikroorganizmalar ve antibiyotik duyarlılıkların degerlendirilmesi. Gülhane Tıp Derg 2013; 55: 247252) 118. Çıkman A, Gündem NS, Gülhan B, Aydın M, Parlak M, Bayram Y. İdrar kültürlerinden soyutlanan Enterobacteriaceae türlerinin GSBL üretimi ile ertapenem ve diğer antibiyotiklere direncinin belirlenmesi. Dicle Med J. 2014; 41 (3): 474-478. 119. Öztürkeri H, Düztaş O, Kocabeyoğlu Ö, Erdemoğlu A, Emekdaş G. Üriner enfeksiyon etkeni Corynebacterium urealyticum ve Corynebacterium jeikeum’un idrar kültürlerinden izolasyon sıklığı ve antibiyotiklere duyarlılıkları. ANKEM Derg 1999; 13 (4): 474-478. 120. Brook I, Wexler HM, Goldstein EJ.Antianaerobic antimicrobials: spectrum and susceptibility testing.Clin Microbiol Rev. 2013 Jul;26(3):526-46. 121. Bahar H, Altındaş M, Sarıbaş S, Altınkum S, Torun MM. Anaerobic microbiology of diabetic patients foot ulcers: a retrospective study of 180 cases. Cerrahpasa Med Rev. 2007; 15 (1):19-22. 122. Wyder AB1, Boss R, Naskova J, Kaufmann T, Steiner A, Graber HU. Streptococcus spp. and related bacteria: their identification and their pathogenic potential for chronic mastitis - a molecular approach. Res Vet Sci. 2011 Dec;91(3):349-57. 123. Barrett M. Identification, Characterization, and Management of an Emerging Mastitis Pathogen, Lactococcus lactis, subspecies lactis 2013 Final Report. Erişim 12.07.2015: http://mysare.sare.org/mySARE/ProjectReport.aspx?do=viewRept&pn=ONE11133&y=2013&t=1) 101 FORMLAR 102 ETİK KURUL KARARI 103 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Adı Zeynep Soyadı Taner Doğ.Yeri İstanbul Doğ.Tar. 22/07/1989 Uyruğu Email T.C. zynptaner@hotmail.com TC Kim No 20699173670 05333076799 Tel Eğitim Düzeyi Mezun Olduğu Kurumun Adı İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Marmara Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü Yük.Lis. Lisans Beşiktaş Atatürk Anadolu Lisesi Lise Yabancı Dilleri Mez. Yılı Okuduğunu Anlama* İngilizce Çok iyi Fransızca Orta 2015 2011 2007 Konuşma* Yazma* Çok iyi Orta Çok iyi Orta YDS Puanı IELTS Puanı 78.75 7.0 *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin ALES Puanı Sayısal Eşit Ağırlık Sözel 74,25 75,26 67 Bilgisayar Bilgisi Program Microsoft Word Microsoft Powerpoint Microsoft Excel Kullanma becerisi İyi İyi İyi Yayınları/Tebligleri Sertifikaları/Ödülleri Kocazeybek B, Demirci M, Taner Z, Algingil RC, Karakullukcu A, Can K, Yuksel P, Tokman HB. ‘The role of anaerobic bacteria in bite wound abscesses: Results of 53 young adult patients’. Int J Infect Dis 2014; Volume 21. 21S1: Abstract number: 58.048. H. Bahar Tokman , R. Çalışkan , G. Iskeleli , M. Demirci , S. Saribaş , P. Yuksel , K. Can , Z. Taner , S. Sirekbasan , E. Gurel , M. Sevgi , F. Koksal , B. Kocazeybek , M. Mamal Torun. ‘Propionibacterium acnes in biomaterials-associated infection: frequency and antimicrobial resistance’. FEMS, 6th Congress of European Microbiologists 2015; 461: Abstract number: 2210
