anaerobiyozis -enzimler

ANAEROBİOZİS
• Oksijensiz ortamda üreyen bakterilere ANAEROBİK
BAKTERİ denir.
Anaerobik bakteriler
düşük oksidasyon-redüksiyon potansiyeline sahip
besiyerlerinde ürerler.
Oksijenle ilgili herhangi bir mekanizmaları da yoktur
Bu nedenle O2
(sitokrom oksidaz,katalaz gibi)
toksik etki yaratır
Serbest O2’in bulunduğu durumlarda
H2O2 oluşur.
H 2O 2
Aerobik bakteriler yapılarında
Bulunan KATALAZ enzimi
İle ayrıştırırlar.
Anaerobik bakterilerde
KATALAZ enzimi yok.
H2O2’yi ayrıştırmazlar ve toksik etki yapar
Anaerobik bakterileri üretmek için
çeşitli yöntemler vardır :
A-BESİYERİNDEKİ OKSİJENİN
GİDERİLMESİ ;
1-Isı ile O2 in çıkarılması:
Anaerobik koşullarda üretilmesi istenilen bir bakteri ya da inceleme örneği,sıvı
besiyerinde üretileceği zaman tüplerdeki sıvı besiyerleri 10-15 dakika
kaynatılarak ,içinde erimiş bulunan O2 dışarı çıkarılır,tüpler hemen soğuk
suya daldırılarak tüp içindeki havada bulunan O2 en az düzeye indirilir
hemen ekim yapılır
besiyerinin üstüne sıvı parafin dökülerek
kapatılır
inkubasyon bırakılır.
Katı besiyerlerinde anaerobik ortam sağlamak için,tüplere dökülmüş katı
besiyerleri ısıtılır
45°C’e ılıtılır
ekim yapılır ,inkubasyona
bırakılır.
Katı besiyerleri için uygulanan diğer yöntem
ROUX yöntemidir.
Isıtılıan ve 45 °C’e kadar ılıklaştırılan katı besiyerlerine ekim yapılır.
besiyerleri küçük dar tüplere çekilir
iki ucu alevle kapatılır
inkubasyona bırakılır
üreme varsa
tüpler steril koşullarda kırılarak
içindeki besiyeri dışarı alınır
içinde bulunan kolonilerden
istenilenler seçilerek ayrı bir
besiyerine ekilir.
Yarı-katı besiyerlerinde de aynı işlem uygulanır.
s
2-Reduksiyon Şiddetinin Artırılması
Besiyerlerine redüktan maddeler katılarak
ortamın redüksiyon şiddeti artırılır.
Sıvı besiyerlerine – beyin,böbrek,karaciğer,et
gibi taze doku parçacıkları ,
sistein(%0.05)
sodyum thioglikolat (%0.01-0.5)
gibi kimyasal maddeler katılır.
B-HAVADAKİ OKSİJENİN
GİDERİLMESİ
A-Kimyasal yöntemler
Havadaki oksijenin tüketilmesini sağlayan kimyasal
maddeler yoluyla anaerobik ortam sağlanır.
Oksijen tüketici olarak en çok
PİROGALLiK ASİT + NaOH
Tepkimesi sonucu oluşan PİROGALLOL ‘den
yararlanılarak uygulanan yöntemler kullanılır.
Buchner Yöntemi
Geniş bir tüpün dibine
pirogallik asid konulur
Üstüne %30 oranında NaOH eklenir.
Bu tüpün içine
Ekim yapılmış tüpler yerleştirilerek,ağzı iyice kapatılır ve
etüve kaldırılır.
Spray Yöntemi
Özel hazırlanmış,dibinde bölmeler bulunan aletler kullnılır.
Aletteki bölmelerden birine
pirogallik asit
diğerine
NaOH
konur.
Aletin kapağına ekim yapılmış tüp ya da petri kutusu
yerleştirildikten sonra,kapak sıkıca kapatılır,kapağın
kenarları parafinlenir.
Alet eğilerek NaOH’in pirogallik asid ile teması sağlanır ve
etüve kaldırılır.
WİLSON ANAEROBİK PETRİ
KUTUSU
Spray yöntemine benzer
İki petri kutusu kapağı karşılıklı yerleştirilmiştir.Kapakların
arasında,ortasında 4 cm çapında delik olan metal levha
bulunur.
Kapakların birine besiyeri,
Diğerine pirogalik asid+NaOH karışımı konur.
Ekim yapıldıktan sonra,iki kapağın arası parafinle kapatılır.
Etüve kaldırılır.
Lochkart tüp yöntemi ;
Tüpteki besiyerine ekim yapılır
Ortasında küçük presipitasyon tüpü bulunan
pamuk içeri itilir.
İçinde 2 cc %40’lık NaOH
kapatılarak
2 cc %20’lik pirogallik asid vardır.
bırakılır.
tüpün ağzı
İnkubasyona
B-KAVANOZ YÖNTEMİ
Novyi yöntemi – musluklu bir kavanozun havası vakumla çekilir.
Kavanozun içine ekim yapılmış tüp ya da petri kutuları yerleştirilir ve
inkubasyona bırakılır.
Gaz paketleri
• Saydam plastikten yapılmış özel kavanozun içine ekim
yapılmış sıvı ve katı besiyerleri konur.
• Kavanozun bir tarafına
• SODYUM BOROHYDRİDE (hidrojen oluşturucu)
• SODYUM BİKARBONAT (karbondioksit oluşturucu)
• İçeren hazır paketler yerleştirilir.
• Paketin bir ucu yırtılarak içine bir miktar su eklenir.
BİYOLOJİK YÖNTEMLER
• Sınırlı bir atmosfer ortamında aerobik
bakterilerle anaerobik bakterilerin birarada
üretilmesi temeline dayanır.
• Aerobik bakteriler oksijeni tüketince,anaerobik
ortam oluşur ve anaerobik bakteriler ürer.
• Oksijen tüketici bakteriler olarak
Serratia marcescens
B.subtilis
kullanılabilir.
BAKTERİ ENZİMLERİ
•
•
•
•
•
•
•
ENZİM canlı hücreler tarafından oluşturulan ve hücre içindeki
biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran organik maddelerdir.
Çok az miktarlarda etkinlik gösterirler.
Tepkime sonunda aynı yapıda ve aynı miktarda ortamında kalırlar.
PROTEİN yapısında
Metabolizma sırasında reaksiyonlara katılırlar fakat harcanmazlar.
Her enzim özgül bir kimyasal tepkimeyi katalize eder ve yalnız bir madde
(substrat) üzerine etkili olarak onunla birleşir.
Örn : proteinlere etki ederler ,
Karbonhidrat ve lipidlere etki etmezler .
Etkileme şekli,enzim molekülü ile substrat molekülü arasındaki özel
kimyasal ilişkiye bağlı !!!
Bakteri metabolizmasında işlev
yapan enzimler iki türlüdür ;
EKZOENZİMLER : (EKSTRACELLULER ENZİMLER)
Dış ortama salgılanarak,üreme ortamındaki büyük moleküllü
maddelerin(protein,lipid,kh.)ayrışmasını ve hücre içine girebilmesini
sağlarlar.
ENDOENZİMLER (İNTRASELLULER ENZİMLER)
Hücre içinde kalarak,hücre içine alınan gıda maddelerini daha küçük
moleküllere (monosakkarit,aminoasit gibi) ayrıştırırlar.
Hücre içindeki metabolizma olaylarını katalize ederler.
Genellikle hücre zarı çevresinde ya da sitoplazma içinde etkinlik
gösterirler.
Enzimler 2 kısımdan oluşur
APOENZİM
Enzimlerin
protein (inaktif)
kısmı
KOENZİM
bazı enzimlerin işlevleri sırasında
gereksinim duydukları,enzimleri
aktive eden non-proteik kısım(inaktif)
Tek başlarına aktif değillerdir
Apoenzim+Koenzim
Haloenzim (aktif)
Bazı enzimler aktif hale gelebilmek için,koenzimlerin dışında
KOFAKTÖRLERE gereksinim duyarlar.
Örn: tripsinojen barsaktaenterokinaz
tripsin
pepsinojen midedeHCl
pepsin
Bazı enzimler de aktivasyonları için ORGANİK OLMAYAN kofaktörlere
gereksinim duyarlar. Kofaktörler:Fe,Mn,Zn,Co,Mo,Cu
ENZİMLERİN
İSİMLENDİRİLMESİ
• Substrat isimlerinin sonuna “az” takısı eklenir.
Örn:proteinleri ayrıştıran enzim – proteinaz
• Bazıları katalize ettikleri reaksiyonu gösteren
sözcüğün sonuna “az” takısı getirilerek
isimlendirilir.
Örn : oksidasyon olayını katalize eden enzimler oksidaz
Enzimler sentezlenmelerindeki
süreklilik yönünden 2 türlüdür ;
1-Yapısal enzimler : Bakterinin kimyasal yapısı ve metabolizmasının
bir kısmını oluştururlar.
Her zaman kullanıldıkları için SÜREKLİ SENTEZLENİRLER.
Endo ve ekzoenzimlerin büyük kısmı bu özelliktedir.
2-İndüklenebilen enzimler : Sürekli sentezlenemezler !!!
Ortamda indükleyebilici maddeler bulunmalıdır.
Örn : E.coli ‘nin – ß-galaktasidaz ve permeaz enzimleri (ortamda
Laktoz enzimi bulunduğu sürece sentezlenirler)
ß-galaktasidaz - laktozu ayrıştırır.
Permeaz - laktozun hücre içine girmesini sağlar
Bu enzimler laktozu ayrıştırdıktan sonra sentezleri durur.
Enzim aktivitesini etkileyen
faktörler ;
1-Kimyasal mad. ; Ağır metaller,asidler,alkaliler,deterjanlar,boyalar
Enzimlerin yapısını bozarak etkinliklerini durdururlar.
Bazı kimyasal maddelerin yapısı ise substratların yapısına benzerdir.Bu durumda
biyokimyasal reaksiyonlarda esas substratın yerini alarak ezimlerle birleşirler.Esas
substrat ezimle birleşemediği için reaksiyon bozulur.
2-Isı ; Her enzimin aktif olduğu optimal ısı vardır.Optimal ısıdan uzaklaştkça enzim
aktivitesi yavaşlar,durur.
Yüksek ısı protein yapısındaki enzimleri koagule eder.
Düşük ısı enzim aktivitesini azaltır ve durdurur.
3-pH ; Optimal pH’dan uzaklaştıkça enzim aktivitesi durur.
4-Substrat yoğunluğu ; Fazlalığı enzim aktivitesini yavaşlatır.
5-Enzim yoğunluğu ; azlığı reaksiyonların bozulmasına yol açar.
6- Tuz yoğunluğu ;ortamda fazla tuz bulunması aktiviteyi olumsuz etkiler.
BAKTERİ
METABOLİZMASI
Bakteriler beslenmeleri için gerekli gıda maddelerini bulundukları
ortamdan alırlar.Ortamdaki gıda maddeleri BÜYÜK MOLEKÜLLÜ
Bu nedenle hücre zarından geçişleri zor.
Bakteri EKZOENZİMLERİ aracılığıyla büyük moleküllü maddeleri
parçalar ve hücre zarından geçebilecek büyüklüğe ayrıştırır!!!
Gıda maddeleri hücre zarından geçer ve sitoplazmaya ulaşır.
Sitoplazmaya ulaşan gıda maddeleri burada ENDOENZİMLER aracılığıyla
ayrıştırılır,daha küçük moleküller haline getirilir.
Bu olaya DİSSİMİLASYON (KATABOLİZMA)denir.
Bakteriler daha sonra bu küçük moleküllü gıda maddelerinden yeniden
büyük molekülleri sentezlerler) ASSİMİLASYON (ANABOLİZMA)
Hücrenin yapıları özel mekanizma ile oluşturulur.
KATABOLİZMA + ANABOLİZMA
METABOLİZMA
Katabolizma sırasına GIDA MADDELERİNİN AYRIŞMASI
sonucu önemli oranda ENERJİ açığa çıkar.
saklanması ve gerektiğinde
yenidenkullanılabilmesi için ATP’YE GEREKSİNİM VAR.
enerjiye depolama ve aktarabilme özelliğinde
Metabolizma sırasında ADP ve ATP özel enzimler aracılığıyla
birbirine çevrilir.
ENERJİ VERİCİ reaksiyonlarda
ADP
ATP’e
çevrilir,yüksek enerjili fosfat bağı oluşur ,enerji burada
depolanır.
HÜCRE İÇİNDE ENERJİNİN gerektiği sentezler sırasında
ATP
ADP’e çevrilir,yüksek enerjili fosfat bağı
çözülür.Açığa çıkan enerji sentez için kullanılır.
KARBONHİDRAT
METABOLİZMASI
A-KARBONHİDRAT PARÇALANMASI
1-Polisakkaritlerin ayrışması
Hidrolizasyon ve fosforilasyon ile monosakkaritlere kadar ayrıştırır.
Karbohidraz
Polisakkarit-fosforilaz
Enzimleri aracılığıyla olur
2-Monosakkaritlerin ayrışması
Monosakkaritler arasında GLUKOZ önemli
Glukoz birçok mikroorganizma tarafından karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılır.
GLUKOZ
Aerobik bakteriler
Anaerobik bakteriler
Değişik şekillerde ayrıştırırlar
ara ürün
Pürivik asit
Aerobik ayrışma
(Krebs ya da sitrik
Anaerobik ayrışma
(fermentasyon yoluyla)
Asid siklusu ile)
son ürün
son ürün
CO2 ve H2O
organik madeler
Enerji açığa çıkar
enerji bunlara bağlı kalır açığa çıkan enerji miktarı az.
B-KARBONHİDRATLARIN
SENTEZİ
Monosakkaritler arasında glikozid bağları kurularak
polisakkaritler sentezlenir.
Glikozid bağları
Fosforilasyon ve transglikolizasyon ile oluşur.
Monosakkaritler
Fosforilaz enzimleriyle
Bağlanır
disakkaritlerdeki
glikozid bağları birinden
diğerine aktarılarak yeni
bağlar oluşur ve polisakkaritler
sentezlenir.
LİPİD METABOLİZMASI
A-LİPİDLERİN AYRIŞMASI
Lipaz enzimlerinin etkisiyle yağ
asitler,gliserin ayrışır.
B-LİPİDLERİN SENTEZİ
Yağ asitlerinin sentezine yönelik olarak
başlatılır.Bir dizi kimyasal reaksiyonlar
sonucu palmitik asit sentezlenir.
PROTEİN METABOLİZMASI
A-PROTEİNLERİN AYRIŞMASI
Protein
proteinaz
Polipeptid
peptidaz
Aminoasit
Ya sitoplazmada tutulurlar ya da ayrışmaya devam ederler
Aminoasitlerin ayrışması 3 şekilde olur ;
1-deaminasyon : Oksidatif ya da redüktif deaminasyon ile amin (NH2)
grubunun çıkması sonucu AMONYAK oluşur.
2-dekarboksilasyon : Karboksilaz enzimlerinin etkisiyle karboksil (CO-OH)
grubunun çıkması sonucu CO2 ve AMİN oluşur.
3-transaminasyon : Transaminaz enzimlerinin etkisiyle ayrışma olur.
B-PROTEİNLERİN SENTEZİ
A-DEAMİNASYON : Amonyak NH2’e çevrilerek
organik asidin hidrojenine bağlanır ve
aminoasitler oluşur.
B-TRANSAMİNASYON : Aminoasitlerdeki amino
grupları organik asitlere aktarılarak yeni
aminoasitler oluşur.
C-BASAMAKLI SENTEZ : Aminoasitler küçük
moleküllerden aşamalı olarak sentezlenir.