KANSERDE TRİPTOFAN KİNÜRENİN YOLAĞININ İNCELENMESİ
advertisement
KANSERDE TRİPTOFAN KİNÜRENİN YOLAĞININ İNCELENMESİ Mahmut Özhan ARSLAN DOKTORA TEZİ BİYOKİMYA(ECZ) ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEMMUZ 2014 MAHMUT ÖZHAN ARSLAN tarafından hazırlanan “KANSERDE TRİPTOFAN KİNÜRENİN YOLAĞININ İNCELENMESİ” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından OY BİRLİĞİ ile Gazi Üniversitesi BİYOKİMYA Anabilim Dalında DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: PROF.DR. YEŞİM ÖZKAN BİYOKİMYA ANABİLİM DALI, GAZİ ÜNİVERSİTESİ Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Doktora Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum ....………….… Başkan : PROF.DR.BOLKAN ŞİMŞEK BİYOKİMYA ANABİLİM DALI, GAZİ ÜNİVERSİTESİ Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Doktora Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum .…………….… Üye : PROF.DR. ÜÇLER KISA TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI, KIRIKKALE ÜNİVERSİTESİ Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Doktora Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum ...……….………. Üye : PROF.DR. MERAL TORUN BİYOKİMYA ANABİLİM DALI, GAZİ ÜNİVERSİTESİ Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Doktora Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum ...……………… Üye : PROF.DR. AYMELEK GÖNENÇ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI, GAZİ ÜNİVERSİTESİ Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Doktora Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum ...……………… Tez Savunma Tarihi: 04/07/2014 ......../….…/…… Jüri tarafından kabul edilen bu tezin Doktora Tezi olması için gerekli şartları yerine getirdiğini onaylıyorum. …………………….……. Prof. Dr. Mustafa KEREM Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürü iii ETİK BEYAN Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dökümanları akademik ve etik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, Tez çalışmasında yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak gösterdiğimi, Kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı, Bu tezde sunduğum çalışmanın özgün olduğunu, bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan ederim. Mahmut Özhan ARSLAN 04.07.2014 iv KANSERDE TRİPTOFAN KİNÜRENİN YOLAĞININ İNCELENMESİ (Doktora Tezi) Mahmut Özhan ARSLAN GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Temmuz 2014 ÖZET İmmün sistem ile malign hücreler arasındaki ilişki kanserin geriletilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. İndolamin 2,3-dioksijenaz (IDO), triptofan parçalanmasındaki kinürenin yolağında hız sınırlayıcı bir enzimdir. IDO çok çeşitli tümör hücrelerinden ve tümör mikro çevresinden eksprese edilmektedir. IDO ekspresyonuna ve aktivitesine bağlı olarak, azalmış triptofan konsantrasyonu ve üretilen immünomodülatör triptofan katabolitleri immün kaçışa ve immünsupresyona yol açabilir. Meme kanseri, kadınlar arasında ülkemizde en çok tespit edilen kanser çeşididir ve kanserden ölümlerin başlıca sebebini oluşturmaktadır. IDO enziminin lokal doku ekspresyonunun sistemik etkilerini değerlendirmek için non-metastatik ve metastatik meme kanserli hastalarda IDO protein seviyelerini, triptofan ve kinürenin konsantrasyonlarını ölçtük, sonuçları sağlıklı kontrol grubuyla karşılaştırdık. IDO enzim aktivitesi kinürenin/triptofan (Kyn/Trp) oranı ile hesaplanmıştır. Bunun yanında IFN-, neopterin ve 5-metil sitozin seviyeleri ölçülmüş ve bütün gruplarda karşılaştırılmıştır. Bu parametrelerdeki değişim ve korelasyonlar, metastatik ve histopatolojik durumuna göre sınıflandırılan hastalarda incelenmiştir. Meme kanserli hastalarda artmış IDO enzim aktivitesi ve global DNA hipometilasyonu gözlenmiştir. Bu artmış aktivite non-metastatik grup için spesifiktir. En düşük IDO protein seviyeleri triple pozitif (ER/PR+ HER2+) grupta gözlenmiştir. Bilim Kodu Anahtar Kelimeler Sayfa Adedi Danışman : 727.10 : Meme kanseri, IDO, triptofan, kinürenin, HPLC, DNA metilasyonu, neopterin, IFN-, ER, PR, HER2. : 103 : Prof. Dr. Yeşim ÖZKAN v SEARCHING OF TRYPTOPHAN KYNURENINE PATHWAY IN CANCER (Ph. D. Thesis) Mahmut Ozhan ARSLAN GAZI UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF HEALTH SCIENCE July 2014 ABSTRACT İnteraction between immune system and malignant cells plays an important role in cancer regression. Indolamine 2,3-dioxygenase (IDO) is a rate-limiting enzyme of kynurenine pathway of tryptophan degradation. IDO expressed in many different types of tumor cells and tumor microenvironment. Depending on IDO expression and its activity, reduced tryptophan concentration and produced immunomodulatory tryptophan catabolites may leads to immun escape and imunosupression. Breast cancer is the most diagnosed and the primary cause of deaths among women in our country. To evaluate systemic effects of local tissue expression of IDO enzyme, we measured IDO protein levels, tryptophan and kynurenine concentration in non-metastatic and metastatic breast cancer patients, compared results with that of healthy controls. IDO enzyme activity was estimated by ratio of kynurenine to tryptophan (Kyn/Trp). Besides, IFN-, neopterin and 5methyl cytosine levels were measured and compared in all groups. Changes and correlations of these parameters were analysed in patients according to metastatic situation and histopathological classification. Increased IDO enzyme activity and global DNA hypomethylation were observed in breast cancer patients. This increased activity is spesific for non-metastatic group. The lowest IDO protein levels were observed in triple positive (ER/PR+ HER2+) group. Science Code Key Words Page Number Supervisor : 727.10 :Breast cancer, IDO, tryptophan, kynurenine, HPLC, DNA methylation, neopterin, IFN-, ER, PR, HER2 : 103 : Prof.Dr. Yeşim ÖZKAN vi TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren, kıymetli tecrübelerinden faydalandığım danışman hocam Prof. Dr. Yeşim ÖZKAN’a, desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Anabilim Dalı başkanımız Prof.Dr. Bolkan ŞİMŞEK’e, ve Anabilim Dalımız öğretim üye ve yardımcılarına, çalışmamızın klinik kısmında çok büyük katkısı olan Abdurrahman Yurtarslan Onkoloji Hastanesinde görevli Doç.Dr. Ülkü YALÇINTAŞ ARSLAN’a, analizler sırasında katkıda bulunan Farmasötik Kimya Öğretim Üyesi Doç.Dr. Murat ŞÜKÜRÜOĞLU’na çalışmamdaki katkıları için çok teşekkür ederim. Ayrıca anneme, babama ve abim Özgür ARSLAN’a manevi destekleriyle beni yalnız bırakmadıkları için teşekkürü bir borç bilirim. Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 02/2010-42 proje numarası ile desteklenmiştir. vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ...................................................................................................................... iv ABSTRACT ............................................................................................................. v TEŞEKKÜR ............................................................................................................ vi İÇİNDEKİLER ........................................................................................................ vii ŞEKİLLERİN LİSTESİ ............................................................................................ ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ ........................................................................................ x KISALTMALAR LİSTESİ ........................................................................................ xi 1. GİRİŞ .................................................................................................................1 2. GENEL BİLGİLER............................................................................ 7 2.1.Meme Kanseri ...........................................................................................7 2.1.1. Epidemiyoloji .....................................................................................7 2.1.2. Mortalite ............................................................................................9 2.1.3. Meme kanseri etiyoloji ....................................................................10 2.1.4. Patoloji ............................................................................................17 2.1.5. Meme kanserinin evrelendirilmesi ...................................................19 2.2. Triptofan Metabolizması .........................................................................28 2.2.1. Triptofan metabolizması hidroksilasyon yolağı ...............................30 2.2.2. Triptofan metabolizması oksidasyon yolağı ....................................30 2.3. Neopterin Metabolizması .......................................................................39 2.4. DNA Metilasyonu ...................................................................................41 3. GEREÇ ve YÖNTEMLER ...........................................................................45 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ................................................................45 viii 3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler ...................................................................45 3.3. Çalışmaya Katılan Hasta ve Kontrol Gruplarının Özellikleri ...................46 3.3.1. Hasta grubu ....................................................................................46 3.3.2.Kontrol grubu ...................................................................................46 3.4. Kan Örneklerinin Toplanması ve Saklanması ........................................47 3.5. Kinürenin ve Triptofan Tayini .................................................................48 3.5.1. Kromatografik koşullar ....................................................................48 3.5.2. Standart örneklerinin hazırlanması .................................................48 3.5.3. Serum örneklerinin hazırlanması ....................................................51 3.6. Serum İndolamin 2,3-dioksijenaz (IDO) Miktar Tayini ............................52 3.7. Serum Neopterin Tayini .........................................................................53 3.9. Serum IFN- Tayini ................................................................................54 3.9. Serum Metillenmiş DNA Miktar Tayini ....................................................56 3.9.1. DNA izolasyonu ..............................................................................56 3.9.2. Metillenmiş DNA miktar tayini .........................................................56 3.10. Tümör Dokusunda HER2, ER, PR Tayini .............................................59 3.11. İstatistiksel Değerlendirme ...................................................................59 4. BULGULAR ....................................................................................................61 5. TARTIŞMA .....................................................................................................73 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ..............................................................................85 KAYNAKLAR .........................................................................................................87 ÖZGEÇMİŞ .........................................................................................................103 ix ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Şekil 2.1. Şekil 2.2. Şekil 2.3. Şekil 2.4. Şekil 2.5. Şekil 2.6. Şekil 2.7. Şekil 2.8. Şekil 2.9. Şekil 2.10. Şekil 2.11. Şekil 2.12. Sayfa Dünya genelinde kadınlar arasında kanser dağılımı ........................... 7 Türkiyede kadınlar arasında kanser dağılımı ....................................... 8 Dünya genelinde kadınlar arasında kanserden ölüm oranları ............. 9 Türkiyede kadınlar arasında kanserden ölüm oranları…………….…..10 Triptofan Metabolik Yolakları ............................................................. 29 IDO ve TDO enzimatik reaksiyonu ve substrat etkileşimi .................. 32 IDO aracılı immün süpresyonun mekanizması ................................. 35 IDO’nun LIP ve GCN 2 Aracılıklı Etki mekanizması............................36 Tümörlerde ve tümörü drene eden lenf nodlarında IDO’nun etkileri . 38 Neopterin sentezi............................................................................... 41 Sitozinin metillenmesi ........................................................................ 42 Tümör gelişimde artmış CpG adası ve azalmış global DNA metilasyonunun olası etkileri ............................................................ 44 Şekil 3.1. Kinürenin standart kalibrasyon grafiği................................................ 49 Şekil 3.2. Kinürenin standardına ait kromatogram............................................. 50 Şekil 3.3. Triptofan standart kalibrasyon grafiği................................................. 51 Şekil 3.4. Triptofan standardına ait kromatogram.............................................. 51 Şekil 3.5. Serum örneğine ait kinürenin kromatogramı...................................... 52 Şekil 3.6. Serum örneğine ait triptofan kromatogramı ....................................... 52 Şekil 3.7. Serum IDO standart kalibrasyon grafiği ............................................. 53 Şekil 3.8. Neopterin standart kalibrasyon grafiği ............................................... 54 Şekil 3.9. IFN- standart kalibrasyon grafiği ...................................................... 55 Şekil 3.10. DNA izolasyon şeması ...................................................................... 56 Şekil 3.11. Metillenmiş DNA ölçüm şeması ......................................................... 57 Şekil 3.12. Pozitif kontrol DNA kalibrasyon grafiği............................................... 58 Şekil 4.1. Total hasta grubu ve kontrol grubunda ortalama kinürenin, triptofan, Kyn/Trp oranı ve IDO enzim düzeylerinin karşılaştırılması . 63 Şekil 4.2. Total hasta grubu ve kontrol grubunda ortalama neopterin, IFN- ve DNA metilasyon düzeylerinin karşılaştırılması .................... 64 Şekil 4.3. Metastatik, non-metastatik hasta grupları ve kontrol grubunda ortalama kinürenin (a), triptofan (b), Kyn/Trp oranı (c) ve IDO enzim (d) düzeylerinin karşılaştırılması ............................................................. 68 Şekil 4.4. Metastatik, non-metastatik hasta grupları ve kontrol grubunda ortalama neopterin (a), IFN- (b) ve DNA metilasyon (c) düzeylerinin karşılaştırılması ................................................................................. 69 x ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Meme kanserinin patolojik sınıflandırılması ..................................... 19 Çizelge 2.2. AJCC Evreleme gruplandırması ...................................................... 22 Çizelge 2.3. Meme tümörlerinin reseptörlerine göre immünohistokimyasal sınıflandırılması ............................................................................... 23 Çizelge 3.1. Hasta ve Kontrol Grubunun Demogragik Özellikleri ........................ 47 Çizelge 3.2. Kinürenin standart konsantrasyonlarına karşılık gelen pik alanları .. 49 Çizelge 3.3. Triptofan standart konsantrasyonlarına karşılık gelen pik alanları ... 50 Çizelge 3.4. Serum IDO konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri .......................................................................................... 53 Çizelge 3.5. Neopterin standart konsantrasyonlarına karşılık gelen % bağlanma değerleri .......................................................................... 54 Çizelge 3.6. Serum IFN- konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri .......................................................................................... 55 Çizelge 3.7. Standart DNA konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri .......................................................................................... 58 Çizelge 4.1. Hasta ve kontrol gruplarında ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri ................................................................ 62 Çizelge 4.2. Metastatik ve non-metastatik hasta gruplarında ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri ......................... 67 Çizelge 4.3. İmmünohistokimyasal olarak sınıflandırılan grup I hasta (ER/PR+, HER2+; ER/PR+, HER2-) ve grup II (ER/PR-, HER2+; ER/PR-, HER2-) hastalarda ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri ................................................................ 71 Çizelge 4.4. İmmünohistokimyasal olarak sınıflandırılan hastalarda dört farklı alt grupta(ER/PR+, HER2+; ER/PR+,HER2-; ER/PR-, HER2+ ve ER/PR-, HER2-) ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri ................................................................ 72 xi KISALTMALAR LİSTESİ Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Kısaltmalar Açıklama AJCC American Joint Committee on Cancer ATM Ataksi Telejiektazi Mutand Geni ASH Antijen Sunan Hücre A-T Ataksi-Telenjiektazi BHMT Betain Homosistein Metil Transferaz BRCA1 Meme Kanseri Geni 1 BRCA2 Meme Kanseri Geni 2 CDK Siklin Bağımlı Kinaz CDKN2A Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörü 2A CIP Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitör Proteini CTLA4 Sitostatik T Lenfosit Antijen 4 CpG Sitozin Fosfoguanin c-erbB1 Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör Geni c-erbB2 c-Neu/HER2 geni DC Dendritik Hücre DCIS Duktal Karsinoma in situ DNMT DNA Metil Transferaz EDTA Etilen diamin tetra asetik asit EGFR Epidermal Büyüme Faktör Reseptörü eIF2 Başlatma Faktörü 2 Alfa ER Östrojen Reseptörü FGF Fibroblast Büyüme Faktörü GCN2 Stress-Responsive Kinase General Control Nonderepressible-2 GPR35 Ailesi Bilinmeyen G-protein Bağlı Reseptör HER2 İnsan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü 2 HRT Hormon Replasman Tedavisi HPLC Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi H4B Tetrahidrobiopterin xii IDO İndolamin 2, 3-dioksijenaz IDO 2 İndolamin 2,3-dioksijenaz 2 IHC İmmünohistokimya IL İnterlökin IFN İnterferon INDO IDO Geni INDOL 1 IDO 2 Geni KYN Kinürenin Kyn/Trp Kinürenin/Triptofan Oranı LCIS Lobüler karsinoma in situ MMP Matriks Metalloproteinaz NF-IL6 /CEBP-β İmmün Regülatuvar Transkripsiyon Faktörü NK Doğal Öldürücü Hücre NMDA N-metil D-aspartik asit NOS Not Otherwise Specified NOS Nitrik Oksit Sentaz NST No Special Type PR Progesteron Reseptörü pRB Retinoblastoma Proteini RB Retinoblastoma SAM S-Adenozil Metiyonin TDO Triptofan 2, 3-dioksijenaz TGF Tümör Büyüme Faktörü Th1 Yardımcı T hücre Tip 1 Th2 Yardımcı T hücre Tip 2 TNF Tümör Nekroz Faktör TP53 p53 Geni Treg Düzenleyici T lenfosit Tris Tri[hidroksi metil] amino metan TRP Triptofan uPA Ürokinaz Plazminojen Aktivatörü 1 1. GİRİŞ Dünya Sağlık Örgütü ve Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı’nın verilerine göre 2008 yılında dünya genelinde 12,7 milyon kişiye kanser teşhisi konulmuş ve 7,6 milyon insan kanserden hayatını kaybetmiştir. Bu rakamlar 2012 yılında 14,1 milyon yeni kanser vakası ve 8,2 milyon kansere bağlı ölüm sayısı olarak hesaplanmıştır. 2012’ nin rakamlarına göre son beş yılda 15 yaş üstü kanser teşhisi konulmuş kişi sayısı 32,6 milyondur. Global kanser bilgi sistemi (Globocan) 2012 rakamlarından hareketle 2025’e kadar her yıl tahminen 19,3 milyon yeni kanser vakasının ortaya çıkacağı tahmin edilmektedir. Kanserlerin %56,8’i ve kanserden ölümlerin %64,9’u dünyanın az gelişmiş bölgelerinde meydana gelmiş ve bu oranın 2025’e kadar daha da artması beklenmektedir. Dünya genelinde 2012 yılında en yaygın teşhis konulan kanserleri; 1,8 milyon ile akciğer kanseri (totalin %13,0’ü), 1,7 milyon ile meme kanseri (totalin %11,9’u), 1,4 milyon ile kolorektum kanseri (totalin %9,7’si) oluşturmaktadır [1]. Meme kanseri, kadınlar arasında kanserden ölüm nedenlerinin başında gelmekte ve dünya çapında 184 ülkenin 140’ında en sık teşhis edilen kanser türünü oluşturmaktadır. Yaklaşık olarak kadınlardaki her dört kanserden biri meme kanseridir. Son 5 yılda meme kanseri teşhisi konulanların toplamı 6,3 milyondur. 2008’den itibaren meme kanseri insidansı %20’den fazla, mortalite oranı ise %14 oranında artış göstermiştir [1]. Ülkemizde kanser haritası incelendiğinde her yıl yaklaşık 150 000 yeni kanser olgusu teşhis edilmektedir. Bölgelerimiz ve şehirlerimiz arasında kanser sıklığı açısından belirgin bir fark gözlenmezken, en sık rastlanan kanser tipini erkeklerde akciğer kanseri, kadınlarda ise meme kanseri oluşturmaktadır [2]. Kanser birçok genetik ve epigenetik faktörün etkisiyle ortaya çıkan çok aşamalı ve sporadik mutasyonların birikimiyle ortaya çıkan genetik bir hastalıktır. Ayrıca, sürdürülebilir proliferatif potansiyel, apopitoza direnç, anjiogenez indüksiyonu ve konakçı immün sisteminden kaçış gibi kazanılmış kendine özgü özellikleri olan tümör hücreleri ile konakçı hücrelerinin kompleks bir karışımı olan kanserde, İmmün kaçış kritik bir yoldur. Kanserin bu temel özelliğinin ortaya çıkması, kanser 2 supresyonunda hayati rol oynayan immün sistemi yenmesinin önemini göstermektedir. Gerçekte immün kaçış klinik belirtilerin ana belirleyicisi olabilir. Bunu, tümörün sessizliğine karşı ilerlemesini etkileyerek, invasyon ve metastaza yönlendirerek ve teröpatik cevabı etkileyerek yapmaktadır. Bu nedenle tümörün immün baskılanması ve immün kaçış ile ilgili mekanizmalar günümüzde önemli araştırma konularını oluşturmaktadır [3]. İmmün kaçış, tümör hücresinin yaşamı için merkezi rol oynamaktadır. Gelişen kanser kendi antijenlerine karşı immünolojik tepkisizlik (tolerans) yaratarak immüniteden kendisini korumakta, böylece tümör konağın immün sisteminden kaçmaktadır, ancak bunun mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Çoğu immün kaçış mekanizması, tümör hücresi, tümör mikroçevresindeki immün, vasküler ve tümör hücresinin etkisi altında olan stromal hücreler tarafından aktif bir immün supresyon ile ilişkilendirilmiştir. Kanserle ilişkilendirilmiş immün kaçış mekanizmalarından birisi de; triptofan yıkımını gerçekleştiren enzim olan, indolamin 2,3-dioksijenaz enziminin (IDO) artışıdır [4]. Triptofan; protein sentezinin yanısıra, seratonin biyosentez yolağı ve kinürenin katabolik yolağı olmak üzere üç farklı metabolik süreçte yer almaktadır. Vücutta esas triptofan metabolizması kinürenin yolağı üzerinden gerçekleşmektedir. Triptofan metabolizmasının %90’ından sorumlu olan kinürenin yolağının ilk ve hız sınırlayıcı basamağı; kinüreninin N-formil kinürenine dönüştürüldüğü oksidasyon basamağıdır. Bu basamak; substrat spesifitesi, doku ve hücre lokalizasyonları bakımından farklılık gösteren triptofan 2,3-dioksijenaz (TDO) ve indolamin 2,3dioksijenaz enzimleri tarafından katalizlenmektedir. TDO; karaciğerde eksprese edilmekte ve diyetle alınan triptofanın fazlasının yıkımını sağlayarak serum triptofan konsantrasyonlarının eşik seviyenin altında tutulmasını sağlamaktadır. IDO ise; ekstrahepatik dokulardaki triptofan metabolizmasının primer mekanizması olup, monositler, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC) gibi endojen ve ekzojen antijenlere karşı tölerans ve immüniteyi regüle eden antijen sunan hücrelerin yanısıra, doku stroma ve parankima hücrelerinde eksprese edilmektedir. IDO ekspresyonu kompleks regülasyona sahiptir ve bu regülasyondaki dominant bileşenler; hücre tipine, hücrenin olgunlaşma durumuna ve aktivasyon düzeyine bağlı olarak hücreler arasında farklılık gösterebilmektedir. Örneğin; IDO dinlenme 3 halindeki immün hücrelerde konstitütif olarak eksprese edilmezken, bazı stimülanlara bağlı olarak spesifik hücrelerde ekspresyonu artmaktadır. Dendritik hücrelerde, sitokinler ve büyüme faktörleri enzimin fonksiyonel aktivitesini değiştirerek veya edebilmektedir [5-7]. değiştirmeksizin IDO’nun IDO protein ekspresyonu, Tip düzeylerini II interferonlar up-regüle (IFN-), inflamatuvar sitokinler, lipopolisakkaritler ve tümör nekroz faktörler (TNF-α) gibi kompleks immünolojik sinyallerce düzenlenmektedir [8,9]. İmmün sistem aktive olduğunda T lenfositler IFN- salınımı yapmakta, IFN- ise makrofaj ve dendritik hücrelerde neopterin sentezini yapan GTP-siklohidrolaz enziminin sentezini uyarmaktadır. Bu yüzden neopterin hücresel immünitenin güçlü bir belirteci olarak kabul edilmektedir [10]. IDO dual role sahip bir enzimdir. IDO ve immün sistem arasındaki ilişkiyi ortaya koyan ilk bulgular, insanlarda hamilelikte doğal koruyucu mekanizma olmasından gelmektedir. Hamilelikte, transplantasyonda ve enfeksiyöz hastalıklarda artmış IDO ekspresyonu bu rolün pozitif yanını oluştururken, gelişen bu tölerans otoimmün hastalıklarda ve kanserde negatif yanını oluşturmaktadır. IDO, lokal triptofan konsantrasyonunu azaltarak T-hücre proliferasyonunu ve aktivasyonunu baskılayıp periferal tölerans ve immün supresyonu indüklemektedir. T hücreleri IDO aktivasyonuna duyarlı olup, T hücrelerinde triptofan açlığı geliştiğinde T hücreler bölünememektedir. Bunun sonucunda antijen sunan hücrelere karşı T hücre aktivasyonu meydana gelmemekte, hücre proliferasyonunun baskılanmasına bağlı olarak immünosupresif etkiler ortaya çıkmaktadır. Hem bölgesel triptofan konsantrasyonunun azalması, hem de bu yolakta oluşan diğer metabolitler, T hücrelerinin aynı zamanda kinüreninlere ve IDO katabolik yolunda meydana gelen ve IDO’nun immünosupresif etkilerine katkıda bulunan immünite düzenleyici diğer triptofan metabolitlerine duyarlı olması nedeniyle kinürenin yolağı, bu süreçte önemlidir. Bu metabolitler, T-hücre proliferasyonunu baskılamakta, T-hücre apopitozuna sebep olmakta [11,12] ve bu metabolitlerden bazıları doğal öldürücü (NK) hücrelerin hücre fonksiyonlarını etkilemektedir [13]. Triptofan metabolik yolağında kinüreninin oluşumunun, IDO enzimi ile sıkı bir şekilde regüle olması nedeniyle serum veya plazma kinürenin konsantrasyonunun 4 triptofan konsantrasyonuna oranı, IDO enzim aktivitesinin önemli bir göstergesi olabilmektedir. Gen ekspresyonunu ve genomik bütünlüğü etkileyen DNA metilasyonu kanser gelişiminin önemli bir bileşenidir. DNA metilasyonu, sitozinin 5. konumuna metil grubunun DNA metiltransferaz enzimlerinin katalizörlüğünde eklenmesiyle meydana gelmekte ve çoğunlukla genlerin promotör bölgelerinde lokalize sitozin fosfoguanin (CpG) adacıklarında meydana gelmektedir. Normal sağlıklı dokularda çoğunlukla metillenmiş olan bu adacıklar, kanserde değişen oranlarda metillenmektedir. Genlerin promotör bölgelerinin metilasyonu, gen transkriptini ortadan kaldırması nedeniyle gen susturulması ile ilişkilendirilmiştir. DNA metilasyonu, hipermetilasyon yoluyla genleri susturarak veya hipometilasyon yoluyla genleri aktive ederek hastalıkların gelişiminde önemli rol oynayabilmektedir [14]. Global DNA metilasyonu çoğu kanser genomunun karakteristik özelliğidir. Hipometilasyonun, onkogenleri aktive ederek, genomik instabiliteyi indükleyerek ve kromozom instabilitesine neden olarak maligniteye etki ettiği öne sürülmüştür. Bu alanda yapılan çalışmalar, genom düzeyinde hipometilasyon, ve gen-spesifik hipo- veya hiper-metilasyon ve histon modifikasyonu gibi epigenetik değişikliklerin otoimmün ve nörolojik hastalıkların yanısıra kanserde de rol oynadığını gösteren deliller ortaya koymuştur. Spesifik genlerin hipometilasyonu veya hipermetilasyonu yaygın olarak çalışılmakla birlikte, günümüze kadar metilasyon belirteci bulmak amacıyla yapılan metilasyon çalışmalarının çoğunda, tümör dokusu ile histolojik olarak normal olan dokular arasındaki metilasyon farklılıkları değerlendirilmiştir. Ancak elde edilen dokuların invazif özellikte olması ve doku heterojenitesinden dolayı epidemiyolojik çalışmaları sınırlamıştır. Günümüzde yapılan çalışmalarda; periferal kan global DNA metilasyonunun, sistemik hücrelerde tümör gelişimi yönünde genomik instabiliteye neden olmak suretiyle, kolorektal, mesane ve başboyun bölgesi kanserleri için bir risk faktörü olduğu bildirilmiştir [15-17]. Meme kanserlerinde östrojen reseptör (ER), progesteron reseptör (PR) ve insan epidermal büyüme faktörü 2 (HER2) ekspresyon profilleri hem prognostik hem de terapötik öneme sahiptir. Yapılan epigenetik analizlerde; meme kanserlerinin hormon reseptörleri ve HER2’ye göre değerlendirildiği alt gruplarında anormal 5 metilasyon paternlerinin olduğu gösterilmiştir, ancak global metilasyon değişiklikleriyle ilgili veriler sınırlıdır [18]. Bu tez kapsamında; günümüzde çeşitli immünoinflamatuvar hastalıklarda ve in vitro kanser araştırmalarında terapötik hedef olarak ele alınan IDO enziminin düzeylerinin ve aktivitesinin, ayrıca global DNA metilasyon değişikliklerinin, kadınlarda kanserden ölüm nedenlerinin başında gelen meme kanserli bireylerde belirlenmesi, enzimin düzeylerinde ve düzeylerine paralel olarak aktivitesinde meydana gelen değişikliklerin diğer immün belirteçler ile olan korelasyonlarının, metastaz ve immünohistokimyasal olarak yapılan değerlendirmede kötü prognoz ve sağkalım profili gösteren gruplarda bu parametrelerde meydana gelen değişikliklerin incelenmesi amaçlanmıştır. 6 7 2. GENEL BİLGİLER 2.1.Meme Kanseri 2.1.1. Epidemiyoloji Meme kanseri dünyada kadınlar arasında en sık görülen malign tümör olup kadınlarda görülen tüm kanserlerin yaklaşık %25’ini oluşturmaktadır. Avrupa’da yılda yaklaşık 232 bin, Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda 464 bin yeni olgu saptanmaktadır. Dünya genelinde 2012 yılında kadınlarda kanser insidansı 6 663 001 iken meme kanseri insidansı 1 676 633 olarak hesaplanmıştır [1] (Şekil 2.1). Şekil 2.1. Dünya genelinde kadınlar arasında kanser dağılımı [1] Meme kanseri sadece dünya genelinde değil, dünyanın pek çok bölgesinde de kadınlar arasında en yüksek orana sahip kanser türü olarak yerini korumaktadır. Dünya genelinde kadınlar arasında kanserlerin %25,2’si meme kanseri iken, bu oran Amerika Kıtası ve Avrupa’da %28,6, Asya’da %21.2, Afrika’da %27,6 Avustralya ve Yeni Zelanda’da %28,1 ve Ortadoğu ve Kuzey Afrika’da %31,1’dir. Çin’de bu oran %15,1 ile kanserler arasında ikinci sırada, Japonya’da ise %19,0 ile birinci sırada fakat dünya geneline göre düşük seyir göstermektedirler. Bu da bölgeler arasında önemli farklılıklar olduğunu göstermekle beraber hala tüm bölgelerde meme kanseri oranının yüksekliğine dikkati çekmektedir [1]. 8 Meme kanserinin erkeklerde görülme sıklığı kadınlardaki oranın %1’i kadardır [1]. Türkiyede ise meme kanseri insidansı 15 230 ile % 24,5’lik bir orana sahiptir. Bu oran ile kadınlarda ortaya çıkan kanser türlerinde ilk sıradaki yerini almaktadır[1] (Şekil 2.2). Şekil 2.2. Türkiyede kadınlar arasında kanser dağılımı [1] Meme kanseri sıklığı yaşa bağlı olarak artmaktadır. Onbeş yaşından sonra görülmeye başlanmakla beraber yaş ilerledikçe görülme sıklığı artmakta, 75 yaş üzerinde ise en fazla insidansa sahip olmaktadır. 75 yaşın üstündeki 100 000 kadından 170’i meme kanserine yakalanmaktadır. Kadınlarda kansere yakalanma oranı ile yaş grupları arasındaki ilişki araştırıldığında ise 15 yaş altında löseminin, 15-40, 40-49, 50-60, 60-75 arasında ve 75 yaş üstünde hep meme kanserinin, ilk sırada olduğu görülmektedir. En yüksek oran 75 yaş üstünde saptanmıştır [1]. Türkiyede yaşa göre ise, 15 yaş altında lösemi, 15-75 yaş arasında ve 75 yaş üstünde dünya ile paralel olarak meme kanseri yüksek oranda görülmektedir, fakat dünyadan farklı olarak bizde 55-60 yaş arasında görülme oranı en yüksek seviyededir [1]. 9 2.1.2. Mortalite Kadınlarda meme kanseri yalnızca en çok görülen kanser türü değil, aynı zamanda birçok ülkede kanserden ölümlerin başlıca nedenidir. 1950’lerden beri meme kanseri insidansı giderek artmaktadır. İnsidansındaki bu artışa paralel olarak mortalite de artmaktadır. Kadınlarda kansere bağlı ölümlerin %14,9’u meme kanseri nedeniyle oluşmakta ve meme kanserine bağlı ölümler, akciğer kanseri ve kolorektal kanserleri geçerek birinci sıraya yerleşmiş bulunmaktadır [1] (Şekil 3). Şekil 2.3. Dünya genelinde kadınlar arasında kanserden ölüm oranları [1] Meme kanseri görülme sıklığında olduğu gibi yıllık mortalite oranlarında da bir artış görülmekle birlikte, bu artış görülme sıklığında olduğu kadar belirgin değildir. Dünya genelinde kadınlar arasında kanserden ölümlerin %14,7’si meme kanseri sebebiyle meydana gelmekte ve bu oran ile meme kanseri kanserden ölümlerde birinci sıradaki yerini almaktadır (Şekil 2.3). Bu oran Amerika Kıtası’nda %14,9, Asya’da %12,8, Avustralya ve Yeni Zelanda’da %15,7 ile kanserden ölümlerde akciğer kanserinden sonra ikinci sırada gelmektedir. Avrupa’da %16,8, Afrika’da %20,2, Ortadoğu ve Kuzey Afrika’da %20,9 ile birinci sırada yer almaktadır. Çin’de %6,2, Japonya’da ise %8,9 ile son sıralarda olup düşük mortalite oranına sahiptirler. Bu da bölgeler arasında önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir [1]. Görülme sıklığında olduğu gibi, mortalite de yaşa bağlı olarak artış olmakta ve 75 yaşın üstündeki 100 000 kadından 90’ı meme kanserinden ölmektedir. Kadınlarda 10 kansere bağlı ölüm nedenleri ile yaş grupları arasındaki ilişki araştırıldığında ise 15 yaş altında löseminin, 15-40, 40-50, 50-60, 60-75 ve 75 yaş üstünde hep meme kanserinin birinci sırayı aldığı görülmektedir [1]. Türkiyede ise meme kanseri mortalitesi 5 199 kişi ile % 15,7’sini oluşturmakta ve kadınlarda kanserden ölümlerde ilk sırada yer almaktadır. Yaşa göre ise, 15 yaş altında lösemi, 15-40, 40-49, 50-60, 60-75 arasında ve 75 üstünde dünya ile paralel olarak meme kanseri yüksek oranda görülmektedir (Şekil 2.4) [1]. Şekil 2.4. Türkiyede kadınlar arasında kanserden ölüm oranları [1] 2.1.3. Meme kanseri etiyoloji İnsanlarda meme kanserinin nedeni kesin olarak bilinmemekle birlikte, genetik, çevresel, hormonal, sosyobiyolojik ve psikolojik etkenlerin oluşumda rol aldığı kabul edilmektedir. Ancak meme kanserli kadınların büyük bir kısmının, çoğu zaman bu risk faktörlerini taşımadığı gözlenmektedir. Bazı kimyasal maddeler, iyonize radyasyon ve virüslerin de kanser oluşumunda katkısı olmaktadır. Tüm bu ajanların mutasyonlara neden olabileceği ve kromozomal mutasyonların da insanda kanser ortaya çıkış ve gelişimi ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir [19]. 11 Genetik Faktörler Genetik olarak onkogenlerin aktifleşmesi, tümör supresör genlerin baskılanması veya değişimi kanser gelişimine sebep olabilmektedir. Genetik hasar, protoonkogenlerin aktivasyon ve aşırı salınımı veya tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu ile meydana gelebilmektedir. Onkogenler, kontrolünü kaybetmiş protein kodlayan genlerdir, proto-onkogenler ise mutasyonlar veya artmış gen ekspresyonu nedeniyle onkogene dönüşebilen, normal genlerdir. Hücre çoğalmasında itici rol oynayan proto-onkogenler hücre çoğalmasını normalde fizyolojik gereksinimlere göre ve kontrollü olarak yürütmektedirler. Onkogenler şu şekilde sınıflandırılabilirler [20]. Büyüme faktörleri; İnt2 geni meme karsinomalarında tanımlanmış bir proto-onkogendir. Fibroblast büyüme faktörü (FGF)-ilişkili büyüme faktörlerini kodlayarak kanser oluşumuna sebep olmaktadır. Büyüme faktörü reseptörleri; c-Mas geni; epidermoid meme karsinomalarında G-protein bağlı anjiyotensin reseptörlerini kodlamaktadır. mutasyonlar, ligand bağımsız Bazı DNA konstitütif düzenlenmeleri reseptör ve/veya nokta aktivasyonuna sebep olmaktadırlar. c-erbB1 geni; epidermal büyüme faktörü reseptör (EGFR) genleri normalde hücrelerde eksprese edilen genlerdir. Meme kanserlerinde aşırı eksprese edilmekte ve zayıf prognozla korelasyon göstermektedir. Meme kanseri dahil pek çok kanser türünde mevcut olup, kötü prognozla ilişkilidirler c-erbB2 (c-Neu/HER2) geni; meme karsinomalarında EGFR ailesinin proteinlerini kodlayan bir pro-onkogendir. Liganttan bağımsız aktif olabilmek için transmembran kısımda tek aminoasit değişimine yol açan nokta mutasyonu veya gen 12 amplifikasyonu ile onkogene dönüşmekte, böylece yapısal olarak ligand bağımsız bir reseptöre dönüşmektedir. Meme kanserlerinde görülmektedir. Nükleer DNA bağlayan/transkripsiyon faktörleri; c-myc onkogeni meme kanserlerinin %80’inde görülen bir proto-onkogendir. Hücreler mitojenik büyüme faktörleri ile uyarıldıklarında, c-myc ekspresyonu hücrede ilk olarak dramatik bir artış göstermektedir. Normal hücrelerde c-myc’nin anormal veya ektopik aşırı ekspresyonu hücrede gen amplifikasyonu, translokasyon ve hücre siklusunun tamamlanması için yolakların kontrolsüz devam etmesine yol açmaktadır. Hemen tüm kanser türlerinde olduğu gibi meme kanserinde de birçok onkogende değişiklikler bildirilmiştir. Ancak bunların sadece bir bölümü bugün için klinik ya da gelişme açısından önem taşımaktadır. Tümör supresör genler, hücre çoğalmasında negatif yönde rol oynayan genlerdir. Proliferasyonu doğrudan baskılayan tümör süpresör genlere “bekçi” tipi genler denilmektedir. Bekçi genler hücre siklusunu denetlemekte ve hücreyi apopitoza yönlendirmektedir. Tümör süpresör genlerde ortaya çıkan işlev kaybettirici mutasyonlar da hücreye çoğalma yönünde bir üstünlük sağlar. Hücre çoğalmasını doğrudan baskılayan bekçi tipi tümör süpresör genlerden başka, dolaylı etki gösteren genler de mevcuttur. Bunlara da “bakıcı” tip tümör süpresör genler denilmektedir. Bakıcılar genomun bütünlüğünden sorumlu DNA tamir genleridir ve mutasyon oluşumunu engellemektedirler. Bakıcı gen sınıfından, BRCA1 (meme kanseri geni 1) bir tümör supresör gendir ve eksprese edilen ürünü ise BRCA1 proteinidir [21]. Bu gen ürünü insanda DNA onarımından sorumludur [22]. BRCA1 mutasyonları meme kanserlerinin %2’sine neden olmaktadır ve meme kanseri olma olasılığını %35 ile %85’e kadar artırmaktadır. Erken gelişen meme kanseri ile ilişkilidir. BRCA1 tümörlerinin agresif patolojik özelliklere sahip olduğu kesindir. Bu tümörler tipik olarak ER, PR ve insan HER-2 negatiftir. 13 BRCA1 proteini RNA polimeraz II ve histon deasetilaz kompleksi ile ilişkilidir. Bu yüzden bu protein transkripsiyon, DNA çift sarmal kırığı [23] ve ubikitinlemede rol almaktadır [24]. BRCA2 (Meme Kanseri Geni 2) bir diğer tümör supresör gendir. Tıpkı BRCA1’deki gibi isimlendirilmektedir. BRCA2 geni, bakıcı tipte bir tümör supresör gen olarak sınıflandırılmaktadır [25]. BRCA2’ye atfedilen fonksiyonlar, DNA rekombinasyonu ve homolog tamiri, transkripsiyon, kromatinin yeniden şekillenmesi ve sentrozom duplikasyonunu içermektedir. BRCA1 ve BRCA2 fonkiyonel olarak ilişkilidirler. BRCA1 ve BRCA2 normalde meme ve diğer dokulardan eksprese edilmekte ve DNA hasarını onarmakta, onaramadıkları durumlarda hücreyi apopitoza götürmektedirler. BRCA1; homolog rekombinasyon, DNA hasarına yanıt, hücre siklusu kontrol noktasının kontrolü, ubikitinleme, transkripsiyonel düzenleme, kromatin modifikasyonu, sentrozom duplikasyonu ve kromozom inaktivasyonu gibi süreçlerde yer almaktadır [26]. Meme kanserinde etkili tümör supresör genlerden biri PTEN tümör supresör genidir. Gen mutasyonunda memede Cowden sendromu ortaya çıkmaktadır [27]. Bir diğer meme kanserinde etkin tümör supresör gen p53 (TP53) genidir. Bu gen hücre döngüsü ve apopitoz düzenleyici transkripsiyon faktörüdür. p53 proteini transkripsiyonel olarak hücre büyümesini durduran genleri düzenlemektedir. Genom gardiyanı olarak da anılmaktadır. Bu genlerden birinin ürünü olan, siklin bağımlı kinaz inhibitör proteini (CIP), diğer adıyla p21 proteini hücreyi G1 ve G2 fazlarında durdurmaktadır. Normalde p53 seviyeleri mdm2 onkogen ürününe bağlanarak düşük tutulmaktadır. Böylece hücreyi proteolitik yıkımdan ve apopitozdan kurtarmaktadır. p53’ün mdm2’den kurtulması için fosforillenmesi gerekmektedir. Ribonükleotid azalması, telomer kısalması, hipoksi ve radyasyon veya kemoterapi sonucu meydana gelen hasar sonucu DNA hasar kontrol noktalarını düzenleyen bazı kinazlarca p53 fosforillenmektedir. Fosforillenmiş p53 mdm2’den ayrılarak hücre döngüsünü durduran veya apopitoza götüren p21’in gen transkripsiyonunu artırmaktadır. p53 genindeki mutasyon Li-Fraumeni ailesel 14 kanser sendromuna neden olmaktadır. Pek çok tümörde kromozom 17p’deki bir p53 alel yok, diğer alel ise mutasyona uğramış olarak tespit edilmiştir. Retinoblastoma (RB) geni bir başka meme kanseri supresör genidir. Retinoblastoma proteini (pRB) hücre siklusunun ilerlemesini düzenlemekte ve hücre siklusunun G1 fazında siklin-siklin bağımlı kinaz (CDK) kompleksi tarafından hiperfosforilasyon ile aktif hale getirilmektedir. Mitojenik aktivite sonucu meydana gelen bu hiperfosforilasyon, E2F transkripsiyon ailesi faktörlerini açığa çıkarmaktadır. Fosforilasyon pRB’yi inaktive eder. Açığa çıkan E2F’ler S-faz siklin genlerini transkripsiyonel olarak aktif hale getirirler. Böylece hücre bölünmesi süreci kontrol noktasından geçmiş olmaktadır. Hücre bölünmesi durduğunda pRb hipofosforillenmektedir. Retinoblastomanın ailesel formunda kalıtsal germline mutant alele sahip hastalarda hastalığın gelişmesi için kalan normal alel geni de inaktif hale getirecek somatik bir mutasyona gereksinimi bulunmaktadır [26]. Bir diğer muhtemel meme kanseri tümör supresör geni ataksi telejiektazi mutand (ATM) genidir. düşünülmektedir. ATM’nin meme kanseri Ataksi-telenjiektazi (A-T); gelişiminde etkili olabileceği serebellar ataksi, okulokütanöz telenjiektazi, immün hasar, kansere yol açması ile karakterize otozomal çekinik bir hastalıktır. A-T’li bireylerin kansere yakalanma riskleri büyüktür. A-T hücreleri iyonize radyasyona karşı uygun miktarda p53 ekspresyonunu uyarmada başarısız olmakta, bu da DNA hasarının onarımının kaybolmasına yol açmaktadır [28-30]. Ailesel Faktörler Hastalık için aile meme kanseri geçmişi uzun zamandır bir risk faktörü olarak kabul edilmektedir. Meme kanseri teşhisi konmuş çoğu kadının ailelerinde meme kanseri olan bireyler bulunmamaktadır. Hastaların sadece %5 ile %10’unda gerçek ailesel meme kanserine yatkınlık bulunmaktadır. Pozitif ailesel meme kanseri hikayesi olan pek çok kadında meme kanseri gelişme riski artar [31]. Kaltsal yatkınlık açısından, genç yaşta birinci derece akrabalarda meme kanseri meydana geldiği zaman rölatif risk 2 veya daha fazla olmaktadır. Batı ülkelerinde meme kanseri vakalarının %10 kadarının genetik yatkınlıktan olduğu düşünülmektedir. LİFraumeni sendromu, TP53’ün kalıtsal mutasyonundan kaynaklanmaktadır ve ömür 15 boyu meme kanseri gelişme riski %50’dir. Ataksi-telenjiektazi (A-T), artmış mutasyon riskinden dolayı kansere daha yatkın homozigot kişilerde görülen nadir otozomal resesif bir hastalıktır. A-T heterozigotlar genel popülasyonun %0,5-1 kadarında görülmektedir ve muhtemelen meme kanser eğilimlidirler. Cowden sendromu PTEN genindeki mutasyondan kaynaklanan bir sendromdur. Otozomal dominant bir hastalıktır. Etkilenmiş bayanların yarısı memenin fibrokistik hastalığına ve üçte biri meme kanserine sahiptir [32]. Üreme İle İlgi Faktörler ve Hormonlar Kadınlarda meme kanseri gelişimi kadın üreme hormonları ile ilişkili görülmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar, tutarlı bir şekilde bazı meme kanseri risk faktörlerinin artmış endojen östrojen salınımı ile ilgili olduğunu ortaya koymuştur. Erken menarş yaşı, nulliparite veya geç yaşta hamilelik ve geç yaşta menopoz meme kanseri gelişimi riskini artırmaktadır. Erken menarşda (menarş 11 yaşından önce olursa) rölatif risk 3’tür. Geç menopozda (54 yaşından sonra menopoz meydana gelirse) rölatif risk 2 ve geç ilk doğum yaşı (ilk doğum yapma 40 yaşından sonra olursa) durumlarında rölatif risk 3’dür. Hiç doğum yapmamış olan kadın, çok doğum yapan ile karşılaştırıldığında rölatif risk 3’e denk gelmektedir. 35 yaşından önce bilateral ooferektomi geçiren kadınlar, doğal menopoza giren kadınlar ile karşılaştırıldığında risk azalmaktadır (rölatif risk=0,6) [33,34]. Postmenopozal kadınlarda, obezite ve postmenopozal hormon replasman tedavisi, artmış meme kanseri riski ile ilişkilidir. Meme kanserinin yaşa bağlı görülme sıklığı menopoza kadar yaş ile birlikte giderek artar. Menopozdan sonra her ne kadar insidans artmaya devam etse de, premenopozal periyoda göre artış oranı 1/6 oranında azalma gösterir. Yaşa bağlı bu dramatik azalış meme kanseri etiyolojisinde over aktivitesinin önemli bir rol oynadığına işaret etmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar; hormon replasman tedavisi almayan ooferektomi yaptırmış premenopozal kadınların hayatlarında meme kanserine yakalanma risklerinin belirgin derecede azaldığını göstermiştir [35]. BRCA1 ve BRCA2 mutasyonlu kadınlardan alınan bilgilere göre, erken ooferektomi bu populasyonda önemli derecede meme kanserinden koruyucu etki sağlamaktadır [36]. 16 Erken yaşta menarş artmış meme kanseri riski ile ilişkilidir. Menarşda geciken her bir yıl için %20 meme kanseri riskinde azalma görülmektedir. Üreme döneminde maruz kalınan hormon seviyelerinin erken menarşa giren kadınlarda geç girenlere göre daha yüksek olabileceği de unutulmamalıdır. Bu bilgilere göre menarş ve menopoz endojen östrojene maruz kalma süresini değiştirerek meme kanseri riskinde önemli bir faktör oluşturmaktadır. Kombine östrojen ve progestin hormon replasman tedavisi (HRT) meme kanseri riskini artırmaktadır. Kadın Sağlığı Girişimi grubunun (Womens’ Health IniniativeWHI), yaşları 59-70 arasında değişen 16 688 postmenopozal kadın üzerinde yaptığı çalışma HRT’nin meme kanseri gelişim oranını tehlikeli derecede artırdığını göstermiştir. HRT’nin etkileri nispeten kısa süre kullanımda ortaya çıkmıştır. Bir yıl HRT tedavisinden sonra anormal mamogramlar gözlenmiş, çalışma sürdürüldüğünde iki yıl sonunda artmış meme kanseri insidansı belirlenmiştir [37]. Diyet, Obezite ve Fiziksel Aktivite Fiziksel aktivite postmenopozal kadınlar arasında ve daha az oranda premenopozal kadınlar arasında meme kanseri risk faktörü olarak belirlenmiştir. Obezite ise premenopozal kadınlar arasında değil, postmenopozal kadınlar arasında meme kanseri risk faktörü olarak bulunmuştur [38]. Vaka kontrol ve kohort çaışmaları, fiziksel olarak aktif kadınlar arasında meme kanseri riskinin %15 ile %50 arasında azaldığını göstermiştir [39]. Ondokuz kohort ve 29 vaka kontrol çalışmasından oluşan bir meta analiz, fiziksel aktivite ile postmenopozal meme kanseri arasında ters ilişki olduğu ile ilgili kanıtlar sağlamıştır. Fakat premenopozal meme kanseri için kanıtlar zayıftır [40]. Obezite meme kanseri için bağımsız bir risk faktörü olarak düşünülmektedir. Premenopozal kadınlar arasında oldukça kilolu veya obez olanlar normal veya zayıf (BMI<25kg/m2) olan kadınlara göre daha düşük meme kanseri riskine sahiptir. Bunun aksine postmenopozal kadınlar arasında yetişkin obezitesi ve kilo alımı yüksek kanser riski ile ilişkili bulunmuştur. Obezite postmenopozal kadınlarda artmış meme kanseri gelişme riski ve artmış meme kanseri mortalitesi ile ilişkilidir. Post menopozal kadınlarda bu en büyük risk olarak görülmektedir [38]. 17 Hormonlar, fiziksel aktivite ve obezite ile meme kanseri riski arasındaki biyolojik mekanizmanın güncel tartışmalarında merkezde yer almaktadır. Fiziksel aktivite gençlikte vücut yağ oranını düşürür. Düşük vücut yağ oranı ilk menstruasyon yaşını geciktirir. Geç menarş düşük meme kanseri ile ilişkili bulunmuştur. Fiziksel aktivite ayrıca genç kadınların yaşamlarında ovulasyon siklus sayısını azaltır. Ovülasyon siklusunun azalması memenin endojen overyan hormonlara daha az maruz kalmasına sebep olur [41]. Menopoz yumurtalık hormon üretiminin durması olarak tanımlanabilir. Bu durumda adipoz doku androstendion ve östronun aromatizasyonu vasıtasıyla endojen hormonların birinci kaynağı haline gelir [42]. Böylece kilolu postmenopozal kadınlar daha az adipoz dokusu olan kadınlara göre daha fazla sirküle olan östrojene maruz kalırlar. Premenopozal obez kadınların düşük risk taşımaları ise obez kadınların yumurtlama olmayan siklus, ikincil amenore gibi menstrual siklus rahatsızlıkları yüzünden östradiol ve progesterona kümülatif olarak maruziyetlerinin azalmasıyla açıklanmaktadır [43]. Meme kanseri insidansı ülkeden ülkeye uluslararası farklılıklar göstermektedir. Yüksek yağlı diyetle beslenen ülkelerde meme kanseri insidansının düşük yağlı diyetle beslenen ülkelere oranla yüksek olması, yüksek yağlı diyetle beslenmenin meme kanseri riski ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Ancak yedi prospektif epidemiyolojik çalışmanın toplanan analiz sonuçları; gelişmiş ülkelerde yetişkin kadınlarda yağ alımı ile meme kanseri riski arasında bir ilişki tanımlayamamıştır [44]. Yüksek meyve tüketiminin makul bir koruyucu etkisi olabilir fakat meyve, lifli gıdalar ve et tüketimi ile ilgili ikna edici sonuçlar yoktur. Aksine alkol ile meme kanseri arasında tüketilen alkol oranıyla doğrusal artan pozitif bir ilişki görülmektedir [45]. 2.1.4. Patoloji Epitel hücreden köken alan malign tümörler karsinom, mezenkimal dokudan köken alan malign tümörler ise sarkom olarak isimlendirilmektedir. Meme kanserinde tümörler genellikle epitel dokudan köken almakta ve karsinom olarak adlandırılmaktadırlar. İnvazyon; kanserin köken aldığı doku dışındaki dokulara 18 yayılması ve çevredeki sağlıklı dokularda büyümesidir. Kanserler bu özelliklerine göre invazif ve non-invazif olarak iki gruba ayrılmaktadır. Pek çok meme kanseri, duktus veya lobülllerdeki epitel dokudan farklılaştığı için bu kanserler duktal veya lobüler karsinom olarak sınıflandırılmıştır. Karsinoma in situ, düşük grade kanserojen veya prekanserojen hücrelerin, meme duktusu gibi belirli doku kompartımanında çevre dokulara invasyon yapmadan büyümesi anlamına gelmektedir. Bunun aksine invazif karsinom ise kendisini köken aldığı dokuya hapsetmemektedir [46]. Non-invazif meme kanserleri bazal membrana invazyonu olmayan, memenin duktal veya lobüler sistemi ile sınırlı malign epitel hücrelerin proliferasyonu ile karakterize meme kanserleridir. İn situ lobüler ve duktal kanserlerin klinik seyirleri ve tedavi yaklaşımları birbirinden farklıdır. Lobüler karsinoma in sitular, meme kanseri oluşumunda risk faktörü olarak görülürken, duktal karsinoma in situ cerrahi tedavi gerektiren bir kanser olarak değerlendirilmektedir [47]. İnfiltratif veya invazif duktal karsinom en yaygın histolojik meme kanseri türüdür ve meme kanserlerinin %70 ile %80’ini oluştururken özel tür kanserler invazif kanserlerin yaklaşık %20 ile %30’unu oluşturmaktadır. İnvazif duktal karsinom, invazif meme karsinomunun diğer hiçbir özel kategorisinde sınıflandırılamayan bir türdür. Bu noktayı vurgulamak için pek çok sınıflandırma sistemi ‘infiltrating ductal carcinoma, not otherwise specified (NOS) veya no special type (NST)’ adlarını vermiştir. Pratikte invazif duktal karsinoma, infiltratif duktal karsinom ve infiltratif veya invazif özel olmayan tür NOS karsinom birbirinin yerine kullanılmaktadır [48]. İnvazif meme kanserleri klinik durumlarına, radyografik karakterlerine, patolojik özelliklerine ve biyolojik davranışlarına göre değişen heterojen lezyon grupları oluştururlar. Tarihsel olarak, invazif meme kanseri sınıflandırması ışın mikroskobu ile görülen kanserin morfolojik görüntüsüne, invazif tümör hücresinin büyüme kalıbına, sitolojik özelliklerine dayanır [49]. Çoğu meme kanserleri histolojik türünden bağımsız olarak terminal duktal ve/veya lobüler birimde meydana gelir. Meme kanseri histolojik sınıflandırması bu bilgiler ışığında American Joint 19 Committee on Cancer (AJCC)’e göre patolojik sınıflandırma Çizelge 2.1’de verilmiştir [50]. Çizelge 2.1. Meme kanserinin patolojik sınıflandırılması Duktal karsinoma in situ (DCIS) Komedo karsinoma (yüksek dereceli DCIS) İnvazif duktal karsinom, NOS Predominant intraduktal komponenet invazif duktal karsinom Duktal İnflamatuvar karsinom Lenfositik infiltre medüller karsinom Müsinöz (kolloidal) karsinom Papillar karsinom Skiröz karsinom Tübüler karsinom Diğer Lobüler karsinoma in situ (LCIS) Lobüler Predominant in situ bileşenli invazif lobüler karsinom İnvazif lobüler karsinom Paget hastalığı, NOS Meme başı İntraduktal karsinom ile paget hastalığı İnvazif duktal karsinom ile paget hastalığı Diğer Farklılaşmamış karsinoma 2.1.5. Meme kanserinin evrelendirilmesi TNM evreleme sistemine göre sınıflandırma Primer tümörü (T) sınıflandırmak için yapılan tanımlamalar klinik ve patolojik sınıflama için de aynıdır. Eğer ölçüm fiziksel muayene ile yapılmışsa muayene yapan kişi T1, T2, T3 genel başlıklarını kullanır. Mamografi ve patolojik ölçümler gibi diğer ölçüm yöntemleri kullanılmışsa T1’in alt başlıkları kullanılabilir. AJCC TNM evreleme sistemi aşağıda verilmiştir. T tümör çapı ile, N tutulan lenf nodları ile ve M metastaz ile ilişkilidir. 20 Primer tümör (T) TX : Primer tümör ölçülemez T0 : Primer tümör varlığına dair bir delil yoktur Tis : (DCIS): Ductal karsinoma in situ (LCIS): Lobüler karsinoma in situ (Paget’s): Tümörsüz memenin paget hastalığı T1: En geniş çapı 2 cm den fazla olmayan tümörler T1mic: en geniş çapı 0,1 cm den büyük olmayan mikroinvasyon T1a: en geniş çapı 0,1 cm den büyük, 0,5 cm den küçük tümörler T1b: en geniş çapı 0,5 cm den büyük, 1,0 cm den küçük tümörler T1c: en geniş çapı 1,0 cm den büyük, 2,0 cm den küçük tümörler T2: En geniş çapı 2,0 cm den büyük, 5,0 cm den küçük tümörler T3: En geniş çapı 5,0 cm den büyük tümörler T4: Doğrudan göğüs duvarına veya deriye uzantısı olan herhangi boyuttaki tümörler T4a: Pektoral kasa dokunmadan göğüs duvarına uzantılı tümör T4b: Ödem (portakal kabuğu deri dahil) veya meme derisinin ülseri durumu T4c: T4a ve T4b durumu bir arada ise T4d: İnflamatuvar karsinom 21 Bölgesel Lenf Nodları(N) NX: Bölgesel lenf nodları ölçülemiyor (ör: daha önceden alınmışsa) N0: Bölgesel lenf nodlarına metastaz yok N1: Aynı taraftaki fiske olmayan aksiler lenf noduna veya nodlarına metastaz N2:Koltuk altında fikse lenf nodu veya aksiller lenf nodu olmaksızın internal mamari lenf nodu metastazı N2a: Koltuk altında fikse lenf nodu metastazı N2b: Sadece aksiller lenf nodu olmaksızın internal mamari lenf nodu metastazı N3: Aksiller lenf nodu ile birlikte veya tek başına aynı taraftaki (ipsilateral) infraklavikular lenf nodu metastazı, veya ipsilateral internal meme lenf nodu ve aksiler lenf nodu metastazı, veya Aksiller lenf nodu ile birlikte veya tek başına aynı taraftaki (ipsilateral) supklavikular lenf nodu metastazı N3a: ipsilateral infraklavikular lenf nodu metastazı N3b: ipsilateral internal meme lenf nodu ve aksiler lenf nodu metastazı N3c: ipsilateral supklavikular lenf nodu metastazı Uzak Metastazlar (M) MX: Ölçülemeyen uzak metastazların varlığı M0: Uzak metastaz olmaması M1: Uzak metastaz varlığı 22 Çizelge 2.2. AJCC Evreleme gruplandırması Evre T N M Evre 0 Tis N0 M0 Evre I T1 N0 M0 Evre II A T0 N1 M0 T1 N1 M0 T2 N0 M0 T2 N1 M0 T3 N0 M0 T0 N2 M0 T1 N2 M0 T2 N2 M0 T3 N1 M0 T3 N2 M0 T4 N0 M0 T4 N1 M0 T4 N2 M0 Evre IIIC Herhangi bir T N3 M0 Evre IV Herhangi bir T Herhangi bir N M1 Evre IIB Evre IIIA Evre IIIB Meme Kanserinin İmmünohistokimyasal Sınıflandırılması İmmünohistokimya (IHC); biyolojik dokulara ait hücrelerdeki protein gibi antijen özelliğe sahip maddelerin antikor bağlanması ile tespit edilmesi esasına dayanan bir prosestir [51]. Meme kanserinde ER, PR ve HER2 reseptör proteinlerinin immünohistokimyasal tespiti ve immünohistokimyasal sınıflandırılması hem terapötik hem de prognostik öneme sahiptir. Meme kanseri ER/PR ve HER2 ekspresyon profiline göre dört grupta sınıflandırılabilir [52]. İmmünohistokimyasal sınıflandırma intrinsik gen ekspresyonu mikroarray kategorizasyonu ile de korelasyon göstermektedir. Bu sınıflandırma hormon reseptör düzeyinin varlığına göre iki ana gruba ayrılmaktadır. Birinci grup; ER pozitif tümörler, luminal A ve luminal B türleridir. İkinci grup ise; ER negatif tümörler, basal-like ve HER2’ce zengin olanlar olarak ayrılmaktadır [53] (Çizelge 2.3). 23 Luminal tümörler; memenin luminal epiteline benzer ekspresyon yaparak sitokeratin 8 ve 18 salgıladıkları için bu ismi almışlardır. Bunlar genellikle ER pozitif kanserlerin çoğunluğunu oluştururlar ve ER, PR ve diğer ER aktivasyonu ile ilgili genleri eksprese etmeleri ile karakterize edilmektedirler. Çizelge 2.3. Meme tümörlerinin reseptörlerine göre immünohistokimyasal sınıflandırılması ER+/PR + HER2 + ER-/PR+ HER2 + göstermektedir) ER+/PR- HER2 + ER/PR +, HER2 – ER+/PR+ HER2 - ER-/PR+ HER2 - ER+/PR- HER2 - ER-/PR- HER2 + ER-/PR- HER2 - ER/PR+, HER2 + (Luminal B ile Grup I 1 korelasyon (Luminal A ile 2 korelasyon göstermektedir) ER/PR -, HER2 + (HER2 zengin tümörler ile 3 korelasyon Grup II göstermektedir) ER/PR -, HER2 – Triple negatif/bazal 4 benzeri tümörler ile korelasyon göstermektedir Luminal A tümörler (ER/PR+, HER2-) meme kanserinin yaklaşık %40’ını oluştururlar. Genellikle yüksek derecede ER ilişkili genleri eksprese ederken, HER2 ile ilişkili genleri ve proliferasyonla bağlantılı genleri çok düşük miktarda eksprese ederler. Luminal A tümörler bütün meme kanseri türleri içinde en iyi prognoza sahip tümörlerdir [53]. 24 Luminal B tümörler (ER/PR+, HER2+), meme kanserinin yaklaşık %20’sini oluşturmaktadır. Bu tümörlerde, ER bağıl gen ekspresyonu relatif olarak biraz daha düşük, HER2 ile ilişkili genler değişken karakterde eksprese edilmektedir. Proliferasyonla bağlantılı genler ise yüksek seviyede eksprese edilmektedir. Luminal B tümörler, Luminal A tümörlere oranla daha kötü prognoza sahiptirler [53]. HER2’ce zengin tümörler( HER2+, ER-): meme kanserinin yaklaşık %10-15’ini oluştururlar ve yüksek HER2 ekspresyonu ve proliferasyon gen ekspresyonu ile karakterize edilirler. Düşük luminal özelliktedirler. Bu yüzden bu tümörler ER/PR negatif ve HER2 pozitif tümörlerdir. Bu tür, HER2 pozitif meme kanserlerinin yarısını oluşturmaktadır. HER2’yi hedef alan tedavi yaklaşımlarından önce bu tür meme kanserleri zayıf prognoza sahipken, yeni hedeflenmiş tedaviler bu durumu düzeltmiştir [53]. Bazal-benzeri tümörler (ER/PR-, HER2-): Bazal epitel hücrelerdeki ekspresyona benzer ekspresyon karakterine sahip oldukları için bu ismi almışlardır. Meme kanserlerinin %15-20’sini oluşturmaktadırlar. Düşük luminal ve HER2 ekspresyon karakteristiğine sahiptirler. Bu yüzden bu tümörler tipik olarak ER, PR ve HER2 negatiftirler ve triple negatif olarak adlandırılmaktadırlar. Bu tür kanserler, en kötü sağkalım ve en kötü prognoza sahip kanserlerdir [54,55]. Meme Tümörlerinin Histolojik Sınıflandırılması Meme kanserleri histolojik olarak; tübül oluşumu, nükleer pleomorfizm ve mitotik aktivite gelişimine göre sınıflandırılmaktadır. Tübüler oluşum (%75’den fazla, %10 ile %75 arası, %10’dan az), nükleer pleomorfizm (küçük ve tek tip, boyut ve şekilde makul varyasyon, belirgin nükleer pleomorfizm), mitotik aktivite (alan başına mitotik aktivite) 1 ile 3 arasında skorlanır. Bu üç parametrenin skorlarının toplamı toplam skoru verir. Toplam skoru 3 ile 5 arası olanlar grade 1 (iyi farklılaşmış), 6 ile 7 olanlar grade 2 (makul derecede farklılaşmış) ve 8 ile 9 olanlar grade 3 (zayıf farklılaşmış) olarak sınıflandırılır. Düşük grade tümörler daha iyi huylu, daha az agresif tedavi yöntemleri ile tedavi edilebilir özellikte ve daha iyi 25 sağkalım oranına sahiptirler. Yüksek grade tömürler daha agresif tedavi yöntemleri ile tedavi edilebilir ve daha kötü sağkalım oranına sahiptirler [56]. 2.1.6. Meme kanseri tedavisi Meme kanseri tedavisine başlanmadan önce kanserin histolojik sınıflandırması yapılmakta, daha sonra ise TNM evrelendirme sistemine göre evresi belirlenmektedir. Bu durumun istisnai örneğini ise in situ tümörler oluşturmaktadır. Buna göre tedavi beş gruba ayrılarak yapılmaktadır [57]. Bu gruplar; Duktal karsinoma in situ (DCIS) tedavisi Lobüler karsinoma in situ (LCIS) tedavisi Evre I, II, IIIA ve opere edilebilir IIIC hastaların tedavisi Evre IIIB, opere edilemeyen IIIC Evre IV, rekürren (tekrarlayan) ve metastatik hastaların tedavisi şeklindedir. Duktal karsinoma in situ tedavisi; DCIS, non-invazif bir tümördür fakat invazif kansere dönüşebilmektedir. Son zamanlara kadar DCIS tedavi geleneği mastektomiden oluşmakta iken artık üç farklı tedavi yöntemi bulunmaktadır. Bunlar; meme koruyucu cerrahi ve tamoksifenli veya tamoksifensiz radyasyon tedavisi, tamoksifen ile veya tamoksifensiz total mastektomi, radyasyon tedavisiz meme koruyucu cerrahiden oluşmaktadır. Lobüler karsinoma in situ tedavisi; LCIS’lu pek çok kadının hastalığı biyopsiden sonra ilave lokal terapi gerekmeden yapılmaktadır. Biyopsi sonrası eksizyon yapılması ile ilgili yeterli kanıt bulunmamaktadır. Tamoksifen kullanımı meme kanseri gelişme riskini azaltmaktadır. Buna göre tedavi yaklaşımı; tanısal biyopsiden sonra gözlem, daha sonra meme kanseri gelişim insidansını düşürmek 26 için tamoksifen kullanımı, aksillar lenf nodları çıkarılmadan, bilateral proflaktik total mastektomi şeklinde olabilmektedir. Evre I, II, IIIA ve opere edilebilir IIIC hastaların tedavisi; evre I, II, IIIA ve opere edilebilir IIIC meme kanserleri genellikle tedavi için çok yönlü yaklaşım gerektirmektedir. Seçilen nihai prosedür her ne olursa olsun tanısal biyopsi ve primer tedavi olan cerrahi iki ayrı prosedür olarak değerlendirilmektedir. Primer tümör için; ER ve PR protein durumu ve HER2 durumu araştırılmalıdır. Grade ve proliferatif aktivite içeren ilave patolojik karakterler de bu konuda yardımcı olabilmektedir. Adjuvan sistemik tedaviyi ve kullanılacak yöntemi evre ve moleküler özellikler belirlemektedir. ER ve PR pozitif hastalar hormon tedavisi almaktadırlar. HER2 aşırı ekspresyonu, kemoterapi ile kombine adjuvan trastuzumab kullanımı için belirleyici olmaktadır. Hormon tedavisinde tek başına tamoksifen, tamoksifen ve kemoterapi birlikte, over ablasyonu, tamoksifen ve kemoterapi bir arada ve tek başına aromataz inhibitörleri kullanılabilmektedir. Aromataz inhibitörleri post menopozal kadınlarda ilk adjuvan tedavi seçeneğini oluşturmaktadır. Hem aşırı HER2 ekspresyonu hem de hormon reseptör varlığı olmadığında (triple negatif tümörler) adjuvan tedavi kemoterapötik rejimlere dayanmaktadır. Opere edilebilir meme kanserinin adjuvant tedavisi için çeşitli standart kemoterapi rejimleri mevcuttur. Bu rejimlerin birbirlerine üstünlükleri ile ilgili delil bulunmamaktadır. Birkaç faz III klinik çalışma, aşırı HER2 eksprese eden kanserli hastalar için adjuvan terapi olarak anti-HER2 antikoru trastuzumabın rolüne işaret etmektedir. Bu yüzden güncel olarak bu tedavi seçeneği de kullanılmakta ve başarı sağlamaktadır [58]. Evre IIIB, opere edilemeyen IIIC hastaların tedavisi; cerrahi yaklaşım genellikle ER, PR ve HER2’nin aşırı ekspresyonunun tespitini sağlamak için yapılan biyopsi 27 ile sınırlıdır. Başlıca tedavi olarak antrasiklin merkezli kemoterapi ve/veya taksan merkezli terapi kullanılmaktadır. Evre IV, rekürren ve metastatik meme kanseri tedavisi; rekürren meme kanseri genellikle terapiye duyarlı olmasına rağmen tedavi hastalığın bu evresinde nadiren iyileşmeye sebep olmaktadır. Rekürren veya metastatik kanserlerde tedaviye başlamadan önce hastalığın boyutlarını değerlendirmek için yeniden evrelendirmek gerekmektedir. Tekrarlama durumunda tedavi seçilirken, ER seviyeleri ve PR seviyeleri, HER2 pozitifliği ve eğer biliniyorsa önceden uygulanan tedavi dikkate alınması gerekmektedir. ER durumu tekrarlama durumunda değişiklik gösterebilmektedir. Daha önce ER pozitif olan kanser türü tekrarladığında ER negatif olabilmektedir. Eğer ER ve PR durumu bilinmiyorsa, tekrarlayan bölgeler, hastalıksız ara dönem, önceki tedaviye cevap ve menopozal durum kemoterapi veya hormon tedavisi seçiminde yararlı olmaktadır. Evre IV ve metastatik hastalıkların tedavisinde tedavi palyatif amaçlı yapılmaktadır. Tedavinin hedefi hayat kalitesini yükseltmek ve yaşam süresini uzatmaktır. Her ne kadar ortalama sağ kalım süresi 18-24 ay olarak rapor edilmiş olsa da bazı hastalar daha uzun yaşam süresine sahip olabilmektedir. Metastatik meme kanserinin tedavisi genellikle trastuzumab ile veya trastuzumabsız hormon tedavisi ve/veya kemoterapiyi içermektedir. Radyasyon tedavisi ve/veya cerrahi sınırlı metastazlı hastalar için endike olabilmektedir. Sistemik tedavide kemik metastazlı hastaların iskelet rahatsızlıklarını azaltmak için bifosfonatlar kullanılmaktadır. Yeni metastatik hastalık tanısı konmuş postmenopozal hastalarda eğer hasta tümörü ER +, PR + veya ER/PR bilinmiyor ise ilk tedavi hormon tedavisi olmaktadır. Bu tedavide tamoksifen uzun yıllardır kullanılmaktadır. Bazı klinik çalışmalar ise aromataz inhibitörlerinin tamoksifene eşdeğer veya daha iyi sonuç verdiğine işaret etmektedir [59]. 28 Premenopozal kadınlara ooferektomi (cerrahi, radyasyon tedavisi ile veya luteinleştirici hormon salgılatıcı hormon agonistleri ile) yapılmalıdır. Bu alanda luteinleştirici hormon salgılatıcı hormon agonistleri de tamoksifen ile kombine kullanılmıştır. Daha önce sitotoksik kemoterapi ile tedavi edilmiş tümörleri aşırı HER2 eksprese eden hastalarda tek ajan olarak trastuzumab uygulaması %21 oranında cevap vermektedir. Randomize bir çalışmada trastuzumab, paklitaxel ve karboplatin ile tedavi edilen metastatik meme kanserli hastaların bu kombinasyonu iyi tolere ettiği ve trastuzumab ve paklitaksel ile tek tek tedavisine oranla kanserin progresyonunun daha uzun zaman aldığı gözlenmiştir [60]. Hormon tedavisi altında tümörleri progresyona uğrayan hastalar sitotoksik kemoterapiye geçmektedir. Ayrıca hormon reseptör negatif tümörlü hastalar ile iç organlara metastazı olan hastalar da sitotoksik ajanlarla tedavi edilmektedir. 2.2. Triptofan Metabolizması Triptofan ilk olarak kazein proteininden Hopkins ve Cole tarafından 1900’lü yılların başlarında izole edilerek keşfedilmiş, bundan kısa bir süre sonra Ellinger ve Flammed tarafından moleküler yapısı aydınlatılmıştır. IUPAC sistemine göre 2amino-3-(1H-indol-3-il) propiyonik asit olarak adlandırılan triptofan, apolar yan zincire sahip esansiyel bir amino asittir [61]. İnsan vücudunda triptofan, protein sentezine katılmanın yanısıra kinürenin bileşiklerinin veya seratoninin sentezlendiği iki önemli yolağın öncül bileşiği olarak görev yapmaktadır (Şekil 2.5). Triptofan absorbe edildikten sonra % 90 oranında albümine bağlı olarak veya serbest formda periferal dolaşımda yer almaktadır. Kompetitif non-spesifik L-amino asit taşıyıcılarıyla serbest formda kan-beyin bariyerini geçmektedir. Hem periferal hem de santral sinir sisteminde triptofan metabolizmasının majör yolağı kinürenin yolağıdır [62]. 29 Şekil 2.5. Triptofan Metabolik Yolakları 30 2.2.1. Triptofan metabolizması hidroksilasyon yolağı Diyetsel triptofanın yaklaşık %3’ü vücutta seratonin sentezi için kullanılmakta, beyinde ise diyetsel triptofanın %1’i seratoninin sentezlendiği hidroksilasyon yolağına katılmaktadır [61]. Triptofan, triptofan 5-hidroksilaz (EC.1.14.16.4) enzimi aracılığı ile 5-OH triptofan’a hidroksillenmekte, L-amino asit dekarboksilaz (EC.4.1.1.28) enzimiyle dekarboksilasyona uğrayarak seratonin’e dönüşmektedir (Şekil 2.5) [61,63]. Seratonin sentez hızı, bu iki enzimin aktivitesine ve triptofanın kullanılabilirliğine bağlıdır. Diyetle triptofan alımı doku seratonin içeriğini artırmakta, seratonin oluşumu gastrointestinal sistem, trombositler ve beyinde meydana gelmektedir. Seratonin, kısmen düşük konsantrasyonlarda olmakla birlikte, fizyolojik ve psikiyatrik süreçlerde önemli bir nörotransmitter ve nöromodülatör olarak rol oynamaktadır [61-64]. Triptofan seratonin yolağı melatonin sentezine de aracılık etmesi nedeniyle de önem taşımaktadır [65]. Triptofanın oksidasyon yolağında etkili olan indolamin 2,3-dioksijenaz enzimi aracılığıyla meydana gelen triptofan azlığının özellikle kanser hastalarında da gözlenen depresyona aracılık ettiği bildirilmektedir [66,67]. 2.2.2. Triptofan metabolizması oksidasyon yolağı Kinürenin yolağı olarak da adlandırılan triptofanın oksidasyon yolağı, triptofan metabolizmasının %90’ından sorumludur. Kinürenin yolağına giren triptofan, doku ve hücre lokalizasyonları, substrat spesifiteleri bakımından farklılık gösteren triptofan 2,3-dioksijenaz (EC.1.13.11.11) ve indolamin 2,3-dioksijenaz (EC.1.13.11.17) olarak adlandırılan enzimler tarafından N-formil kinürenine dönüştürülmektedir (Şekil 2.5). Kinürenin yolağının bu basamağı, yolağın ilk ve hız sınırlayıcı basamağıdır. Bu basamağı takiben, bu katabolik yolda yer alan diğer enzimler aracılığı ile biyolojik olarak aktif, hücresel fonksiyonlar üzerinde fizyolojik ve patofizyolojik etkileri olan 3-hidroksiantranilik asit, kinürenik asit ve kinolinik asit gibi diğer metabolitler meydana gelmektedir [62]. 31 Kinürenik asit; beyinde nanomolar konsantrasyonda bulunan endojen nöroprotektif bir bileşiktir. Düşük konsantrasyonlarda N-metil D-aspartik asit (NMDA) reseptörünün glisin modülatör bölgesine, yüksek konsantrasyonlarda ise NMDA reseptörünün konsantrasyon glutamat artışının bölgesine sedatif bağlanmaktadır. ve antikonvülzan Beyinde kinürenik asit etkilere aracılık ettiği gösterilmiştir [68]. Kinürenin yolağında 3-hidroksikinüreninin hidroliz veya antranilik asitin oksidasyonundan oluşabilen 3-hidroksiantranilik asit immünoregülasyondaki rolünün yanı sıra nörotoksik bir metabolittir. Kinürenin yolağında oluşan diğer bir metabolit olan pikolinik asit, endojen nöroprotektan ve doğal demir ve çinko şelatörü olup, hücresel büyümeyi kontrol etmekte, antitümöral, antifungal ve antiviral aktivite göstermektedir. Kinolinik asit ise; nöronal NMDA glutamat reseptörlerini aktive ederek agonist olarak davranmaktadır. Beyinde kinolinik asit konsantrasyonu, triptofanın seratonin yolağına yönelmesinden dolayı, kan ve sistemik dokularla kıyaslandığında daha düşüktür [62]. İndolamin 2,3-dioksijenaz (IDO) 1967 yılında tavşan barsağında, D-triptofanın N-formil-D-künirenine dönüşümünü katalizleyen enzimin varlığı gösterilmiş, ilk olarak 1978 yılında tavşan barsağından saflaştırılan bu enzim TDO’ya benzer şekilde "hem" taşıyan dioksijenaz olarak tanımlanmıştır. Geniş bir substrat spesifitesi gösterdiğinden bu enzim IDO olarak adlandırılmıştır [69]. 1988 yılında insan IDO enzimi plasentadan saflaştırılmış, enzimin tavşan IDO enzimine benzer substrat spesifitesi gösterdiği, ancak insanlarda mevcut IDO enziminin seratonine karşı inaktif olduğu belirlenmiştir [70]. Her ne kadar TDO ve IDO, "hem" yapısı taşıyan protein olsalar ve aynı reaksiyonu kataliz etseler de (Şekil 2.6), bu enzimler bazı farklılıklar göstermektedir. TDO, memelilerin yanısıra insektlerde, bakteri, maya ve deniztarağı gibi canlılarda bulunurken, IDO sadece memelilerde ve maya’da bulunmaktadır [71]. TDO homotetramer olarak aktiftir ve subsrat spesifitesi L-Triptofan ile sınırlıdır. TDO öncelikli olarak karaciğerde yer alır, triptofan, tirozin, histidin, glukokortikoid ve kinürenin tarafından indüklenmektedir. IDO monomerik enzim olarak etki eder ve L-triptofana ilaveten seratonin, triptamin gibi diğer indol içeren bileşikleri de bağlamaktadır [7,8,72,73]. IDO, intrasellüler olarak konstitütif indüklenebilir formda 32 plasenta, akciğer, ince ve kalın barsak, kolon, dalak, mide ve beyin gibi pek çok dokuda eksprese edilmekte ve bu dokularda dentritik hücreler, monosit ve makrofajlar, eozinofiller, fibroblastlar, epitelyal hücreler, endotelyal hücreler ve bazı tümör hücreleri gibi spesifik hücrelerden tip II interferonlar (IFN-) inflamatuvar sitokinler, lipopolisakkaritler ve tümör nekroz faktör tarafından stimülasyonuna bağlı olarak ve az substrat özgüllüğü ile aktivite göstermektedir [79, 74]. Şekil 2.6. IDO ve TDO enzimatik reaksiyonu ve substrat etkileşimi [72] Normal şartlarda hepatik kinürenin yolağı aktiftir ve sağlıklı dokularda IDO ekspresyonu oldukça düşüktür, ancak immün aktivasyona, enfeksiyona ve inflamasyona bağlı olarak IDO ekspresyonu up-regüle olarak ekstrahepatik kinürenin yolağının baskın hale gelmesine ve triptofan parçalanma ürünlerinin birikmesine neden olmaktadır. IDO immün cevabın regülasyonunda aktif rol oynarken, TDO’nun bu süreçte rolü ile ilgili deliller sınırlıdır [7,75-77]. IDO enzimi, 8. Kromozomun kısa kolunda (8p12-p11) lokalize INDO geni tarafından kodlanmaktadır. INDO transkripsiyonunun regülasyonu kompleks ve hücre tipine spesifik olup mekanizması tam olarak aydınlatılmamıştır. IDO aktivitesi hem transkripsiyonel hem de posttranslasyonel düzeyde regüle 33 olmaktadır [78]. Transkripsiyon, spesifik inflamatuvar medyatörlere cevap veren sıkı bir immünolojik kontrol altındadır [9]. Sitokinler, hormonlar ve bazı ilaçların IFN-γ bağımlı mekanizmalar aracılığı ile doğrudan veya dolaylı olarak INDO gen ekspresyonunu indüklemekte veya inhibe etmektedir. 2009 yılında indolamin 2,3dioksijenaz 2 (IDO 2) olarak adlandırılan, IDO’ya yapısal ve enzimatik aktivite bakımından benzerlik göstermesine karşın etkinliği daha düşük olan bir yeni enzim tanımlanmıştır. IDO 2, INDO genine yakın 8p12 kromozomu üzerinde yer alan INDOL 1 geni tarafından kodlanmaktadır. Bu enzimin keşfi triptofan metabolizmasının kinürenin yolağının biyolojik süreçlerde düşünülenden daha fazla rol oynadığına işaret etmektedir. Günümüze kadar yapılan çalışmalar bütün memelilerdeki IDO genlerinin promotör bölgelerinde bir veya daha fazla IFN yanıt elemanı taşıdığını ve lokal bölgede üretilen IFN’lerin birçok hücre tipinde güçlü bir IDO indükleyicisi olduğunu göstermektedir [79-81]. IDO enziminin immün sistem üzerindeki etkileri IDO, immün cevabın regülasyonunda kritik bir biyolojik rol oynamaktadır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar, konakçı kemik iliğinden köken alan, endojen ve yabancı antijenlere karşı oluşan tölerans ve immünitenin regülasyonunu sağlayan birçok antijen sunan hücrede IDO’nun eksprese edildiğini göstermektedir. Doğal immün effektör mekanizmayı temsil eden IDO’nun konstitütif olarak eksprese edildiği ve mukoz membranlarda hızla indüklenerek intrasellüler ve ekstrasellüler organizmaların büyümesini inhibe ettiği in vitro olarak gösterilmiştir [7]. Önceleri, inflamatuvar hücrelerin IDO aracılığıyla hücre içi havuzda veya mikroçevrede triptofanı tüketmesi ve enfekte hücrelerin ölmesi nedeniyle, IDO’nun majör rolünün antimikrobiyal savunma mekanizmasına aracılık etmek olduğu düşünülmekteydi [82]. IDO salgılayan hücrelerin, allojenik hücre ve dokuları immünolojik açıdan koruması, IDO ekspresyonunun doğal bir immünosupresif mekanizma olduğunu göstermektedir. İn vitro olarak insan makrofajlarının T-hücre çoğalmasını triptofan katabolizması yoluyla inhibe etiğinin gösterildiği çalışmalardan elde edilen veriler 34 [83,84], IDO salgılayan hücreler için genel bir immün baskılayıcı role işaret etmiştir. Bu deneylere dayanarak, IDO salgılayan hücrelerin T-hücre cevabını lokal doku çevresinde triptofana erişimi kısıtlayarak baskıladığı ileri sürülmüştür. Dendritik hücreler; antijeni alıp, işleyip, T hücrelerine sunarak adaptif immün cevabı indüklemek veya baskılamak üzere özelleşmiş hücrelerdir. Yani dendritik hücreler, normal, kanserli, enfekte hücrelerden, transplante dokular ve hamilelik sırasında fetal dokulardan aldığı antijenleri T hücre cevabını ortaya çıkarmak için sunan hücrelerdir. T hücre cevabı; enfekte ve sağlıklı hücreleri yıkmak (immünite), veya korumak (tölerans) şeklinde ortaya çıkabilmektedir [82]. Triptofan metabolizmasının tölerans indüksiyonu ile ilgili olarak iki mekanizma ileri sürülmüştür: Birincisi; triptofan yıkımına bağlı olarak lokal doku çevresinde triptofanın azalması nedeniyle T hücre proliferasyonunun azalması, ikincisi; bu yolakta IDO sonrası basamaklarda oluşan ürünlerin yani genel ifadeyle kinüreninlerin effektör T hücre veya diğer hücrelerle doğrudan etkileşerek immün reaktiviteyi baskılaması. İnsan dendritik hücrelerinin, IDO eksprese ettiği ve in vitro olarak belirli kültür şartlarında T-hücre çoğalmasını baskıladığı gösterilmiştir [85]. IDO ve kinürenin yolağının devamındaki enzimler bir seri immünosüpresif triptofan metabolitleri üretmektedir. Bu metabolitlerin bazıları in vitro T hücre proliferasyonunu baskılamakta, T hücre apopitozuna neden olmakta ve doğal öldürücü hücrelerin fonksiyonunu etkileyebilmektedir [11,86,87] (Şekil 2.7). 35 Şekil 2.7. IDO aracılı immün süpresyonun mekanizması [78] Aktif T hücreleri, T hücre reseptör sinyalizasyonunu takip eden T-hücre siklusu sürecinde serbest triptofan miktarına aşırı duyarlıdır. Aktif T hücrelerinin proliferasyonu, serbest triptofana erişimleri sınırlandırılınca hücre siklusunun G1 fazında durdurulur [84]. Bu bilgiler doku mikroçevresinde triptofan ulaşılabilirliğinin, antijen sunan hücreler (ASH)’e karşı oluşacak cevapta T hücrelerinin aktive ve prolifiye olup olmayacağını belirleyen kritik bir faktör olduğunu göstermektedir. Bu ilk olarak, IDO’nun T hücreleri üzerinde bazı etkilerinin in vitro olarak fazla triptofan ilavesi ile tersine çevrilmesinin gözlenmesi sonucu ileri sürülmüştür. Yakın zamanda, T hücrelerinin IDO tarafından yaratılan stres durumunu algılamasında ve cevap verebilmesinde sinyal molekül olarak tanımlanan "stress-responsive kinase general control nonderepressible-2" (GCN2) olarak adlandırılan sinyal molekülü tanımlanmıştır [88]. GCN2’nin kinaz aktivitesi hücredeki boş t-RNA miktarındaki artış ile tetiklenir. Bu yüzden IDO’nun triptofanı azaltmasında olduğu gibi herhangi bir amino asitteki yetersizlik, GCN2 kinaz aktivitesini aktive eder ve sinyal yolağını başlatır (Şekil 2.8). Bu, çoğu proteinin translasyonunun baskılanması ile sonuçlanır fakat GCN2 tarafından verilen sinyale duyarlı genlerin küçük alt gruplarının selektif artışına sebep olur. Bu GCN2 duyarlı genler her hücre çeşidinde farklıdır ve bu sinyal geçiş yolunun tam olarak nasıl immün cevabı düzenlediği hala araştırılmaktadır [3]. 36 Şekil 2.8. IDO’nun LIP ve GCN 2 Aracılıklı Etki mekanizması, a; Boş t-RNA’lar üzerinden etki mekanziması, b; LIP aktivasyonu [3] T hücrelerde, triptofan açlığı GCN2 bağımlı stres yolakları aktive etmek suretiyle hücre büyümesinin durmasına neden olur. Triptofan açlığı; GCN2 aracılığı ile başlatma faktörü 2 alfa (eIF2α) fosforilasyonuna ve sonucunda translasyonun durmasına neden olur. Ayrıca triptofan açlığına bağlı olarak, immün regülatuvar transkripsiyon faktörü olarak bilinen NF-IL6 (CEBP-β olarak da bilinmektedir)’nın ekspresyonu LAP izoformlarından LIP izoformu yönüne kayar. LIP, dimerizasyona ve DNA bağlanmasına aracılık eden bZIP bölgesini kodlar fakat transaktivasyon bölgesini içermez. NF-IL6/CEBP-β’nin doğal baskın inhibitörü olarak görev alır. GCN2-eIF2α yolağı aktivasyonu sonucu gen düzenlenmesine karışarak oluşan LIP indüksyonu, düzenleyici T lenfosit (Treg) fonksiyonunu ve immünosupresyonu ilerletebilir [3] (Bkz. Şekil 2.8). IDO ve bu yolaktaki diğer enzimler bir seri immünosupresif triptofan metaboliti üretir. IDO kendi başına bulunmasa bile, kinürenin triptofan parçalanması 37 yolundaki IDO’dan sonraki enzimler kinürenin sağlanırsa immünosupresif metabolitleri bazı oluşturabilir. Sıçanlarda yapılan çalışmada triptofan metabolitlerinin immünosupresif olduğu gösterilmiştir. Bu bileşiklerin, immünolojik etkilerini hangi moleküler mekanizmayla ortaya çıkardıkları bilinmemektedir, ancak yapılan bir çalışmada kinürenik asiti bağlayabilen bir reseptör tanımlamıştır. Bu ailesi bilinmeyen G-protein bağlı reseptörün (GPR35) biyolojik fonksiyonu bilinmemektedir, fakat ekspresyonu, IDO’nun salgılandığı bölgeler olarak bilinen immün sistem ve sindirim sistemi hücrelerinde en yüksek seviyededir. Diğer triptofan metabolitleri için böyle başka reseptörler olup olmadığı ve böyle reseptörlerin biyolojik etkilerinin in vivo olarak ne olabileceği sorusu hala cevaplanmamıştır [89]. Tümöre Karşı Gelişen Töleransda IDO’nun Rolü Hem GCN2 yolağı hem metabolit yolağı fonksiyonunun sinerjik olarak IDO’nun tam biyolojik etkisini yaratması muhtemel görünmektedir. GCN2-LIP yolağı tümör hücrelerinde indüklenmiştir fakat patofizyolojik ilişkisi hala araştırılmaktadır. Çoklu mekanizmalar tümör uyarımlı toleransa katkıda bulunmaktadır. Bunlar tümörün kendi içinde veya tümörün aktığı lenf nodu gibi immün sistemin tümör antijenini karşıladığı anahtar bölgelerde olabilir. Kombinasyon halinde, bu tolerojenik mekanizmalar tümör antijenine cevabın başlamasını bloke eder, aktive T hücrelerinin tümör hücrelerini öldürme yeteneğini inhibe eder ve Treg’lerin baskılayıcı aktivitesini artırır. Elde edilen veriler, hem tümörde hem de tümörün aktığı lenf nodunda IDO’nun bu proseslerin her birine katkıda bulunma potansiyeli olduğunu göstermektedir [74,78] (Şekil 2.9). Lenf Nodlarında İmmün Sistem Supresyonu Birçok çalışma, doğrudan tümör hücreleri tarafından peptit sunulmasıyla değil, tümörden türemiş peptitlerin konak ASH’leri tarafından sunulmasıyla naif, dinlenme halindeki T hücrelerinin ilk olarak tümör antijenlerinin farkında olduğunu göstermektedir [75,90]. Klasik olarak, dinlenme halindeki T hücrelerine antijen sunumu, akımın olduğu lenf nodlarında olur [91]. Bu çalışmalar, lenf nodlarının 38 tolerans ve immünite arasındaki seçeneği belirlediğini vurgulamaktadır. Pek çok tümör antijeninin tümörün aktığı lenf nodunda sunulmasıyla bu nodlar esas olarak tümöre karşı immün cevabı etkileyecek şekilde konumlanır [92]. Tümörün aktığı insan ve fare lenf nodlarında IDO ekspresyonu olur. İnsanlarda, IDO eksprese eden spesifik hücre tipi kesin olarak karakterize edilememiştir, fakat çoğunlukla konak hücreleri olduğu nettir ve plazmasitoid morfolojiye sahiptirler [93]. Bir araya getirildiğinde bu çalışmalar, tümör akan lenf nodlarında bulunan IDO eksprese eden konak dendritik hücrelerinin, tümörden türemiş antijenlere karşı immün cevabın başlamasını baskıladığını ve bu yolla da, tümör kaynaklı antijenlere sistemik tolerans oluşturulmasına katkıda bulunduğunu göstermektedir. Şekil 2.9. Tümörlerde ve tümörü drene eden lenf nodlarında IDO’nun etkileri [78] Tümör Mikro Çevresinde İmmün Sistem Supresyonu IDO aktivitesinin olduğu ikinci bir potansiyel bölge tümörün kendi mikro çevresidir. Uyttenhove ve arkadaşları çeşitli insan tümörlerinin IDO eksprese ettiğini immünohistokimyasal olarak göstermiştir [94]. IDO, temel olarak tümör hücrelerinden malignant değişimi içeren genetik değişikliklerin parçası olarak 39 konstitütif olarak eksprese edilebilir. Tümör hücreleri tarafından IDO ekspresyonu immünospresif mikro çevre oluşturabilir. Alternatif olarak, IDO’nun pek çok tümör hücre kültüründe IFN- ve diğer inflamatuvar medyatörlerce uyarılabileceği bilinmektedir. Bu yüzden, IDO’nun, tümör hücrelerinden veya konak stroma hücrelerinden, tümöre karşı konağın ilk cevabı olan inflamatuvar sitokinlere karşı ikincil olarak salınmış olabileceği de düşünülmektedir [95]. Treg hücreler, tümöre kazanılmış toleransta anahtar bileşen olarak rol oynamaktadır. Artmış Treg aktivitesi tümör büyümesini kolaylaştırırken, Treg azalması, etkili antitümör immün cevaba sebep olmaktadır [78]. IDO, Treg hücrelerin muhtemel immünosupresif etki mekanizmasını oluşturmaktadır. Grohmann ve arkadaşları, Treg’lerin in vitro olarak fare DC’lerinde yüksek seviyede fonksiyonel IDO ekspresyonunu başlattıklarını göstermiştir [96]. Bunun, Treg hücreler üzerindeki sitostatik T lenfosit antijen 4 (CTLA4+) ’ün, dendritik hücrelerdeki B7-1 ve B7-2’lere (sırasıyla CD80 ve CD86 olarak bilinen ve antijen sunan hücreler üzerinde bulunan kostimülatör proteinler) bağlanması ile olduğu öne sürülmüştür [78]. Bu da DC’lerde IDO ekspresyonunu ve fonksyonel enzimatik aktiviteyi artıran bir sinyal oluşturur. CTLA4-B7-1 ve/veya B7-2 arası etkileşiminin IDO’yu indüklediği insan monosit kaynaklı DC’lerde de gösterilmiştir [97]. Bu nedenle, IDO, CTLA4+-Treg aracılı immünosupresyonda olası bir mekanizmadır (Bkz. Şekil 2.9). 2.3. Neopterin Metabolizması Neopterin (6-D-eritrotrihidroksipropil-pterin) düşük molekül uğramış kendi ağırlıklı pteridin yapısında bir moleküldür. T lenfositler yabancı veya değişikliğe öz hücrelerimizle karşılaştığında interferon- gibi lenfokin denilen farklı medyatörler üretmeye başlarlar. Bir sonraki aşamada oluşan interferon insan monositlerini/makrofajlarını neopterin üretmesi için uyarır [98]. Neopterin; guanozin trifosfattan, pteridin biyosentezindeki anahtar enzim olan GTP Siklohidrolaz I (E.C.3.5.4.16) tarafından sentezlenir. Böylece GTP Siklohidrolaz I, guanozin trifosfatı parçalar ve bir ara ürün olarak 7,8-dihidroneopterin trifosfatı oluşturur (Şekil 2.10). Birçok hücrede 40 aktif olan GTP Siklohidrolaz I enzimi H4B (Tetrahidrobiopterin) sentezine yönelirken, 6-Pürivoil tetrahidropterin sentaz enziminin monosit, makrofaj ve dendritik hücrelerde yetersiz olması nedeniyle, bu hücrelerde neopterin sentezine yönelmektedir. dihidroneopterin GTP-Siklohidrolaz trifosfat, I fosfatazlarla enzim aktivitesi dihidroneopterine sonucu ve oluşan oksidasyonla neopterine dönüşmektedir [99]. Hücresel immün cevap sırasında aktif T lenfositin Th1 (Yardımcı T hücre Tip 1) alt tipi IFN- salınımı yapar. Bu da insan makrofaj ve dendritik hücrelerinde GTPsiklohidrolaz enzimini neopterin üretmek üzere uyarır [100]. Tümör nekroz faktör neopterin yapımını doğrudan uyaramaz. Ancak IFN-’yı uyarımı sonucu eş zamanlı olarak neopterin salınımını uyarır [101]. Neopterin düzeyi, IFN- tarafından aktif hale getirilen monosit ve makrofajların aktivasyon derecesinin göstergesi olarak kabul edilmektedir. IFN- başlıca aktif T lenfositlerden salınmaktadır ve neopterin yapımını uyarır. Bu yüzden T lenfositlerin aktivasyon derecesi (özellikle Th1:interferon ve interlökin-2 üretiminden sorumludur) neopterin üretimi için çok büyük bir öneme sahiptir [102]. Serum ve idrar gibi vücut sıvılarında artmış neopterin konsantrasyonu hücresel immün reaksiyon ile ilişkili hastalıklarla bağlantılıdır [103]. Örneğin HIV enfeksiyonunu içeren viral enfeksiyonlar, parazitler, otoimmün hastalıklar, romatizmal hastalıklar, organ transplantasyonu sonucu tepkimeleri ve malignant hastalıklar bu kapsamda sayılabilir. oluşan reddetme 41 Şekil 2.10. Neopterin sentezi 2.4. DNA Metilasyonu Nükleotid sıralamasında değişiklik olmamasına rağmen aktarılabilir olan DNA ve kromatindeki potansiyel tersinir düzenlemelere epigenetik değişiklikler adı verilmektedir. Epigenetik değişikliklerin en önemli özelliği, DNA dizinini değiştirmemesidir. Buna rağmen genlerin promotor bölgelerinde neden olduğu düzenleme ile, ilgili genin transkripsiyonunda nicel değişikliklere neden olmaktadır. Bu, ilişkili genin transkripsiyonunu baskılayabilir veya serbestleştirebilir [104]. Epigenetik düzenlemeler, sekansın değişime uğramamış olması nedeni ile dinamiktir. Diğer bir deyişle sekansa ait mutasyonlar gibi kalıcı değildir. Hücrenin ihtiyacına göre, artmış olan transkripsiyon yeri geldiğinde susturulabilir. Bu sayede genetik kontrolün anlık ihtiyaçları da sağlanabilmektedir [105]. Epigenetik 42 düzenlemenin bir başka önemli özelliği, oluşan değişikliklerin aktarılabilir olmasıdır [106]. Epigenetik düzenlenmenin, DNA CpG adacıklarının metilasyonu, histon modifikasyonu ve nükleozomal düzenlenme olmak üzere, üç mutasyonel etkileşim olayını içerdiği bilinmektedir [107]. DNA metilasyonu memeli hücrelerindeki gen ifadesinin kontrolünde önemli rol oynayan epigenetik bir modifikasyondur. Metilasyon; DNA metiltransferaz enzimlerinin aracılığı ile sitozinin 5 numaralı karbonundaki hidrojen iyonunun yerine metil grubu geçmesi ile meydana gelen, metil vericisi olarak S-adenozilmetiyoninin kullanıldığı bir reaksiyondur [14]. Metil transferazlar, S-adenosil-metiyonin (SAM)’ den bir metil gubunun sitozin rezidülerine transferini katalizlemekte ve böylelikle sitozin, 5-metilsitozin haline gelmektedir (Şekil 2.11) Şekil 2.11. Sitozinin metillenmesi Memeli hücrelerinde bu metilasyon; CpG dinükleotitini oluşturan ve guanin (G) rezidüsü ile bağ yapmış sitozin (C) rezidüleri ile sınırlı bulunmaktadır. Memeli hücrelerinde, CpG adacıkları olarak bilinen bu CpG dinükleotitleri, kısa genomik sekanslarda bağıl olarak çok daha yüksek oranda bulunabilmektedir. CpG adacıkları 0.5 ile 5 kb ölçülerinde ve en az %55 G:C içeriğine sahip bölümlerdir. CpG adacıkları memeli genlerinin yaklaşık olarak yarısı ile ilişkilidir ve çoğunlukla genlerin promotor veya ilk ekzon bölgelerinde bulunmaktadırlar [108]. CpG adacıkları genellikle normal yetişkin sağlıklı dokularda metillenmemiş iken, kanserde değişen oranlarda metillenebilmektedir [109]. Gen promotor bölgelerindeki CpG adacıklarının metilasyonu genellikle gen transkripsiyonunu durduran gen susturulması ile ilişkili bir olaydır [110]. Tümörogenezin erken 43 safhasında metilasyona uğrayan genler, bireylerin artmış malignite gelişme riskini ölçmeye veya erken malignite teşhisine yarayan potansiyel belirteçler olarak değerlendirilebilmektedirler muhtemel rolü uzun [111]. Onkogenezdeki yıllardan DNA metilasyonunun beri tartışılmaktadır. Son yıllarda yapılan birçok çalışmada DNA metilasyonunun kanser oluşumunda önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir. Epigenetik kalıtım bir hücre neslinden diğerine gen etkinliği hallerinin kararlı olarak çoğalmasını sağlayan temel mekanizmalar olan DNA metillenmesini, histon modifikasyonlarını ve RNA ortamlı susturmayı kapsar. Farklı genlerde tümör spesifik metilasyon değişimleri tanımlanmıştır [112]. DNA metilasyonu, aynı zamanda hücresel fonksiyonlarda embriyonik gelişim, gen regülasyonu, ekspresyonunun modifikasyonunda hipometilasyon; aktivasyonuna görev kromozom neden X alır. kromozomu inaktivasyonu Epigenetik modifikasyonlardan instabilitesi, mobil olurken, hipermetilasyon, DNA tümör ve ve supresör kromatin global onkogen genlerin promotör bölgelerinin transkripsiyonunu baskılar [113]. Özellikle son 10 yılda birçok multifaktöryel-multijenik hastalığın etiyolojisinde epigenetik regülasyon bozukluğunun rol oynadığının konu edildiği birçok derleme ve hipotez yayınlanmıştır. Güvenilir ve tekrarlanabilir kanıtları halen eksik olmakla birlikte günümüze kadar edinilen veriler bunun olabileceğini kuvvetle destekler niteliktedir. Kanserde, transkripsiyon başlangıç bölgesindeki normal olmayan metilasyon, tümör supresör genlerin ifadesini baskılayabilir, DNA onarıcı genleri baskılayabilir, kromozom kararsızlığına sebep olabilir ya da onkogenlerin aktivasyonunu sağlayabilir [114]. (Şekil 2.12). 44 Şekil 2.12. Tümör gelişimde artmış CpG adası ve azalmış global DNA metilasyonunun olası etkileri [114] Bu anormal metillenmiş genleri içeren serbest DNA’lar veya hücreler luminal sıvıya ve kana salınmakta böylece kanserin erken teşhis edilmesine veya kanser gelişme riski yüksek bireylerin tanımlanabilmesine olanak sağlamaktadır [106]. Hem belirli özel bölgelerdeki hem de genel genomik düzeydeki DNA metilasyon kalıbındaki değişiklikler pek çok farklı kanser çeşidi ile ilişkili bulunmuştur [115]. Bu farklılıklar tümör supresör genlerin hipermetilasyonunu, onkogenlerin hipometilasyonunu ve doku düzeyinde düşük genel metilasyon oranlarını içermektedir. Son yıllarda DNA metilasyon değişiklikleri, sirküle eden tümör DNA’sının göstergesi olarak plazmada da gözlenmeye başlanmıştır [116]. 45 3. GEREÇ ve YÖNTEMLER 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler L-Kinürenin ................................................................................................... (Sigma) L-Triptofan ........................................................................................ (Sigma-Aldrich) Asetik Asit..................................................................................................... (Merck) Perklorik Asit ................................................................................................ (Merck) Metanol (HPLC grade).................................................................................. (Merck) Asetonitril (HPLC grade)............................................................................... (Merck) Sodyum Hidroksit ............................................................................. (Sigma-Aldrich) Perklorik Asit ................................................................................................ (Merck) Tri[hidroksi metil] amino metan (Tris) ............................................................ (Fluka) Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) ........................................................... (Sigma) Neopterin ELISA kit (Lot No: MNPK 1305) ..................................................... (DRG) DNA izolasyon kiti (FitAmpTM Plasma/Serum DNA Isolation Kit, Lot No:206543) …………………… ......................................................... (Epigentek) Serum IDO ELISA Kiti (Human Indolamine 2,3-Dioxygenase ELISA Kit Lot No: S11060485) …………………… ................................................................. (Cusabio) Serum IFN- ELISA Kiti (Lot No: 951016207) …………………… .(Boster Biological) DNA metilasyon kiti (MethyFlashTM methylated DNA Quantification Kit, Lot No:208216) ………… ....................................................................... (Epigentek) Tris EDTA Tampon ..…………………………….…………………………….....(Sigma) Ultra Saf Su………..……………………………………...…………….……….(Milipore) 3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ...................................Hewlett Packard UV Dedektör ....................................................................................Hewlett Packard Analitik Kolon ........................................................................... Develosil ODS-MG-5 Guard Kolon ............................................................................ Develosil ODS-MG-5 Hassas Terazi ..................................................................................... AND GR-200 Vorteks ...........................................................................................................Firlabo pH metre.............................................................................................. WTW-İnoLab 46 Magnetik Karıştırıcı....................................................................................... MK 318 Ultrasonik Banyo .......................................................................... Bandelin Sonorex Yüksek Devirli Soğutmalı Santrifüj................................................... Jouan MR 1822 Derin Dondurucu ............................................................................................. Jouan Otomatik Pipetler ...................................................................................... Eppendorf 0.45 μm Membran Filtre .............................................................................. Millipore Vial ................................................................................................................ Waters İnsert ............................................................................................................. Waters Çalkalayıcılı Su Banyosu ........................................................................... GFL 1083 Elisa Okuyucu ............................................................................................ Versimax Nanodrop Spektrofotometre ....................................................................... ND 1000 Ultra saf Su Cihazı...................................................................................... Millipore 3.3. Çalışmaya Katılan Hasta ve Kontrol Gruplarının Özellikleri 3.3.1. Hasta grubu Dr. Abdurrahman Yurtaslan Onkoloji Eğitim ve Araştırma Hastanesi Medikal Onkoloji ve Genel Cerrahi Anabilim dallarında meme kanseri tanısı almış, hiçbir ilaç kullanmamış 51 kadın hastadan oluşturulmuştur (Çizelge 3.1). 3.3.2.Kontrol grubu Dr. Abdurrahman Yurtaslan Onkoloji Eğitim ve Araştırma Hastanesi Medikal Onkoloji servisinden yaş bakımından uygunluk gösteren 28 sağlıklı kadın gönüllüden oluşturulmuştur (Çizelge 3.1). Çalışma için Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır (Karar No:148). 47 3.4. Kan Örneklerinin Toplanması ve Saklanması Hasta ve kontrol grubunu oluşturan bireylerden 12 saat açlık sonrası sabah alınan kan örnekleri serum elde edilmek üzere 1000ₓg’de 20 dk. santrifüj edildi. Ayrılan serumlar -800C’de analiz süresince saklandı. Çizelge 3.1. Hasta ve Kontrol Grubunun Demogragik Özellikleri (Sayısal değerler ortalama±standart sapma ve gruplardaki kişi sayısı olarak verilmiştir) HASTA GRUBU KONTROL GRUBU Total Non-metastatik Metastatik Kontrol (n=51) (n=24) (n=27) (n=28) Yaş (Yıl) 55,25±11,74 57,25±10,84 53,48±12,43 54,39±14,17 Aile Öyküsü 28 15 13 Sigara Kullanan 16 9 7 ER Pozitif 36 15 21 - PR Pozitif 29 12 17 - HER-2R Pozitif 21 9 12 - 0 - - - - I 3 3 - - II 17 17 - - III 4 4 - - IV 27 - 27 - 1 6 3 3 - 2 24 9 15 - 3 21 12 9 - Tümör Evresi Tümör Derecesi 48 3.5. Kinürenin ve Triptofan Tayini Serum kinürenin ve triptofan düzeylerinin tayini Zhang ve arkadaşları tarafından geliştirilen metoda göre UV dedektörlü-yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile yapılmıştır [117]. 3.5.1. Kromatografik koşullar Kolon : ODS kolon, 5 µm, 150x4.6 ID Mobil Faz : Asetat Tamponu (15mmol/l; pH:4,0): Asetonitril (95:5) Akış Hızı : 0,8 mL/dk Elüsyon : İzokratik Enjeksiyon Hacmi : 20 μL Dedektör UV λ : 360 nm (Kinürenin için) 278 nm (Triptofan için) Alıkonma süresi(Rt) : 5,14 dk. (Kinürenin için) 8,45 dk. (Triptofan için) 3.5.2. Standart örneklerinin hazırlanması Mobil fazda 0,5-20 μmol/L konsantrasyon aralığında kinürenin ve 0,5-60 μmol/L konsantrasyon aralığında triptofan standart çözeltileri hazırlandı. Bu standart çözeltilerden 100 μL alınarak üzerine 13 μL %40’lık perklorik asit çözeltisi ilave edildi. 15 000xg’de 10 dak. santrifüjlendikten sonra süpernatan HPLC sistemine enjekte edildi. Kinürenin standart konsantrasyonlarına karşılık gelen pik alanlarından (Çizelge 3.2) hareketle kinürenin standart kalibrasyon grafiği çizildi (Şekil 3.1). Kinürenin standartına ait kromatogram örneği Şekil 3.2’de verilmiştir. 49 Triptofan standart konsantrasyonlarına karşılık gelen pik alanlarından (Çizelge 3.3) hareketle triptofan standart kalibrasyon grafiği çizildi (Şekil 3.3). Triptofan standartına ait kromatogram örneği Şekil 3.4’de verilmiştir. Çizelge 3.2. Kinürenin standart konsantrasyonlarına karşılık gelen pik alanları Standart Kinürenin Konsantrasyonu (μM) Pik alanı 0,5 11048,5 1 21803 4 72409,5 6 110422 8 145681 10 184112 20 371953 400000 350000 Pik Alanı 300000 250000 200000 y = 18478x + 395,37 R² = 0,9997 150000 100000 50000 0 0 5 10 15 20 Kinürenin Konsantrasyonu (µM) Şekil 3.1. Kinürenin standart kalibrasyon grafiği 25 50 Şekil 3.2. Kinürenin standardına ait kromatogram Çizelge 3.3. Triptofan standart konsantrasyonlarına karşılık gelen pik alanları Standart Triptofan Konsantrasyonu (μM) Pik alanı 2,5 72216,5 5 141637 20 590475 30 867582 40 1119513 50 1429449 60 1735764 51 2100000 1800000 Pik Alanı 1500000 1200000 900000 y = 28661x + 1365,5 R² = 0,9994 600000 300000 0 0 20 40 60 Triptofan Konsantrasyonu (µM) 80 Şekil 3.3. Triptofan standart kalibrasyon grafiği Şekil 3.4. Triptofan standardına ait kromatogram 3.5.3. Serum örneklerinin hazırlanması 100 μL serum üzerine proteinleri çöktürmek amacıyla 13 μL %40’lık perklorik asit çözeltisi ilave edilerek vortekslendi. 15 000ₓg’de 10 dak. santrifüjlendikten sonra ayrılan süpernatan HPLC sistemine enjekte edildi. Serum kromatogram örnekleri Şekil 3.5 ve Şekil 3.6’da verilmiştir. 52 Şekil 3.5. Serum örneğine ait kinürenin kromatogramı Şekil 3.6. Serum örneğine ait triptofan kromatogramı 3.6. Serum İndolamin 2,3-dioksijenaz (IDO) Miktar Tayini Serum indolamin 2,3-dioksijenaz, CUSABIO Human indolamin 2,3-dioksijenaz ELISA Kiti (Lot No: S11060485) kullanılarak tayin edilmiştir. IDO standart konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri Çizelge 3.4‘de, kalibrasyon grafiği Şekil 3.7’de verilmiştir. Serum IDO konsantrasyonları, 4-parametreli regresyon analizi ile elde edilen kalibrasyon grafiğinden hareketle hesaplanmıştır. 53 Çizelge 3.4. Serum IDO konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri Standart IDO konsantrasyonu(ng/ml) Absorbans 0,78 0,058 1,56 0,185 3,12 0,257 6,25 0,581 12,5 1,046 25 1,259 Şekil 3.7. Serum IDO standart kalibrasyon grafiği 3.7. Serum Neopterin Tayini Serum neopterin düzeyleri DRG Neopterin ELISA kiti ( EIA-Lot No: MNPK1305) kullanılarak tayin edildi. Neopterin standart konsantrasyonlarına karşı gelen % bağlanma değerleri Çizelge 3.5.’de, kalibrasyon grafiği Şekil 3.8’de verilmiştir. Serum neopterin konsantrasyonları, kalibrasyon grafiğinden elde edilen denklem kullanılarak hesaplanmıştır. 54 Çizelge 3.5. Neopterin standart konsantrasyonlarına karşılık gelen % bağlanma değerleri Standart Neopterin Konsantrasyonu (ng/mL) % Bağlanma 0,5 72,76 1,5 52,98 3 42,62 6 30,38 12 25,09 24 25,09 100 15,20 80 70 % Bağlanma 60 50 40 y = -10,66ln(x) + 57,33 R² = 0,9072 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Neopterin Konsantrasyonu (ng/mL) 120 Şekil 3.8. Neopterin standart kalibrasyon grafiği 3.9. Serum IFN- Tayini Serum IFN- düzeyleri, Boster Biological IFN- ELISA kiti ( EIA-Lot No: 951016207) kullanılarak tayin edildi. IFN- standart konsantrasyonlarına karşı gelen absorbans değerleri Çizelge 3.6.’da, kalibrasyon grafiği Şekil 3.9’da verilmiştir. Serum IFN- konsantrasyonları, kalibrasyon grafiğinden elde edilen denklem kullanılarak hesaplanmıştır. 55 Çizelge 3.6. Serum IFN- konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri Standart IFN- Konsantrasyonu (pg/mL) Absorbans 15,6 0,039 31,2 0,022 62,5 0,124 125 0,173 250 0,389 500 0,789 1000 1,414 1,6 1,4 1,2 Absorbans 1 0,8 0,6 y = 0,0014x + 0,0168 R² = 0,9956 0,4 0,2 0 0 200 400 600 IFN- Konsantrasyonu (pg/mL) Şekil 3.9. IFN- standart kalibrasyon grafiği 800 1000 56 3.9. Serum Metillenmiş DNA Miktar Tayini 3.9.1. DNA izolasyonu Hasta Serumlarından DNA izolasyonu FitAmpTM Plasma/Serum DNA izolasyon çözeltileri (Epigentek) kullanılarak yapılmıştır. DNA izolasyon prosedürü Şekil 3.10’da verilmiştir. Eppendorflara alınan serum örneği üzerine 500 µL DNA izolasyon tamponu ve 20 µL sindirim çözeltisi ilave edilip vortekslendikten sonra 65 ºC’de 10 dk. İnkübe edildi. 500µl’lik porsiyonlar halinde 2 mL’lik toplama tüplerine yerleştirilen spin kolonlara aktarılarak 12 000 rpm’de 30 sn. santrifüj edildi. Toplama tüpündeki kısım atılarak spin kolondaki örnek üzerine 300 µL %70’lik etanol ilave edilip 12 000 rpm’de 20 sn. santrifüj edildi. Süzüntü atıldıktan sonra spin kolondaki örnek iki defa 200 µL % 90 etanol ileve edilerek 12 000 rpm’de ilkinde 20 sn. ikincisinde 40 sn. santrifüj edildi. Spin kolon yeni bir viale alınarak 18 µL DNA elüsyon çözeltisi ilave edilip 12 000 rpm’de 20 sn. santrifüj edilerek DNA elüsyonu sağlandı. Elde edilen DNA örneklerinde nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA miktar tayini yapıldı. Şekil 3.10. DNA izolasyon şeması 3.9.2. Metillenmiş DNA miktar tayini Global DNA metilasyon düzeyi MethylFlashTM Methylated DNA tayin kiti (Epigentek) kullanılarak yapılmıştır. DNA metilasyon tayin prosedürü Şekil 3.11’de 57 verilmiştir. Yöntem, DNA metilasyon düzeylerinin 5-metil sitozin (5-mC) düzeylerinin belirlenmesi esasına dayanmaktadır. Şekil 3.11. Metillenmiş DNA ölçüm şeması Pozitif kontrol olarak alınan 10 ng/µL’lik DNA, Tris EDTA tamponu ( pH:8.0) ile Çizelge 3.7’de verilen konsantrasyonlarda olacak şekilde seyreltildi. Elde edilen pozitif kontrol örnekleri, negatif kontrol örneği ve izole edilen DNA örnekleri Şekil 3.11’de verilen prosedüre uygun olarak işleme tabii tutularak 450 nm’de absorbans değerleri ölçüldü. Pozitif kontrol konsantrasyonları için elde edilen absorbans değerleri ile çizilen kalibrasyon grafiği (Şekil 3.12) eğimi kullanılarak, izole edilen DNA örneklerindeki 5-mC yüzdesi Eşitlik 1 ve Eşitlik 2’de verilen formüller ile hesaplandı. 58 Çizelge 3.7. Standart DNA konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbans değerleri Konsantrasyon (ng/mL) Absorbans 0,5 0,4735 2 0,6155 5 0,841 10 1,1145 1,2 1 Absorbans 0,8 0,6 y = 0,0664x + 0,4707 R² = 0,9875 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 DNA Konsantrasyonu (ng/mL) Şekil 3.12. Pozitif kontrol DNA kalibrasyon grafiği 10 12 59 3.10. Tümör Dokusunda HER2, ER, PR Tayini Dr. Abdurrahman Yurtarslan Onkoloji Eğitim Araştırma Hastanesi’nde ameliyat sonrası alınan formalin fiske parafin takipli tümör dokularında HER2, ER, PR’leri yine aynı hastanede immünohistokimyasal olarak tayin edilmiştir. Her üç reseptör de tam otomatik immünohistokimya cihazı Ventana Benchmark XT ile Ultraview dab detection kiti kullanılarak SISH (Silver in situ hibridizasyon) yöntemi ile tayin edilmiştir. Görüntüleme Ventana görüntü analiz sistemi (VIAS) ile yapılmıştır [118]. 3.11. İstatistiksel Değerlendirme Çalışma sonucu elde edilen veriler; ortalaması±standart sapma (ortalama±SS), medyan değerleri ile 25. ve 75. yüzdelik değer aralıkları (inter quartile range, IQR) olarak ifade edilmiştir. Verilere, Kolmogorov-Smirnov testi uygulanarak ölçülen parametreler bakımından normal dağılım gösterip göstermediği değerlendirilmiştir. Normal dağılım gösteren gruplarda iki parametrenin karşılaştırılmasında Student t testi, normal dağılım göstermeyen gruplarda iki parametrenin karşılaştırılmasında Mann-Whitney U testi uygulanmıştır. Parametreler arasındaki korelasyon Pearson ve Spearman Rho Korelasyon analiziyle değerlendirilmiştir. Sonuçlar %95 güven aralığında, anlamlılık p<0,05 düzeyinde değerlendirilmiştir. değerlendirme, SPSS 15.0 istatistik paket programı ile yapılmıştır. İstatistiksel 60 61 4. BULGULAR Tez kapsamında çalışma grubu; Dr. Abdurrahman Yurtaslan Onkoloji Eğitim ve Araştırma Hastanesi Medikal Onkoloji ve Genel Cerrahi Anabilim dallarında meme kanseri tanısı almış, tedaviye başlanmamış yaş ortalaması 55,2±11,7 olan 51 kadın hasta (Hasta grubu) ve yaş ortalaması 54,4±14,2 olan 28 sağlıklı bireyden (kontrol grubu) oluşturulmuştur. Hastanın, yaşı, menapoz durumu, tümör evresi ve derecesi, hormon reseptör (ER, PR) ve HER-2 özellikleri kaydedilmiştir. Hastaların 16’sı (%31) sigara kullanırken, 28’inde (%54) ailede meme kanseri öyküsü mevcuttu. Tanı anında, hastaların 27’si (% 53) Evre IV metastatik meme kanseri tanısı alırken, immünohistokimyasal değerlendirmede; hastaların 36’sı (%70) östrojen reseptör pozitif, 29’u (%57) progesteron reseptör pozitif ve 21’i (%41) HER-2 pozitif olarak belirlendi (Bkz. Çizelge 3.1). Hasta ve kontrol grubunda, serum IDO enzim düzeyi ölçüldü ve enzim aktivitesini belirlemek amacıyla serum triptofan, kinürenin düzeyleri tayin edilip, enzim aktivitesinin göstergesi olarak kinürenin/triptofan (Kyn/Trp) oranları hesaplandı. Ayrıca, hasta ve kontrol grubunda neopterin, IFN- ve DNA metilasyon düzeyleri tayin edildi. Hasta ve kontrol grubu arasında yapılan değerlendirmede; hasta grubunda triptofan ve kinürenin konsantrasyonları kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (sırasıyla p=0,0001; p=0.05), IDO enzim düzeyleri hasta grubunda kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde düşük bulunurken (p= 0,001), IDO enzim aktivitesinin göstergesi olarak Kyn/Trp oranı hasta grubunda kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur (p= 0.027). Neopterin ve IFN- düzeyleri bakımından hasta ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmezken (p>0,05), global DNA metilasyon düzeyleri anlamlı düzeyde düşük bulunmuştur (p=0,002) (Çizelge 4.1) (Şekil 4.1, Şekil 4.2). 62 Çizelge 4.1. Hasta ve kontrol gruplarında ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri Hasta grubu (n=51) Kontrol Grubu (n=28) Parametreler Ortalama±SS Medyan IQR Ortalama±SS Medyan IQR P Kinürenin (µmol/L) 2,55±1,01 2,26 (1,95-2,86) 1,84±0,33 1,87 (1,65-2,03) 0,0001 Triptofan (µmol/L) 38,30±8,15 37,97 (32,43-44,44) 34,00±9,42 34,34 (26,84-39,33) 0,05 Kyn/Trpx103 69,3±27,8 63,7 (50,3-85,7) 58,5±22,1 52,3 (45,4-61,9) 0,027 IDO (ng/mL) 3,78±2,66 3,18 (2,00-4,58) 5,97±4,26 4,79 (4,09-6,48) 0,001 Neopterin (ng/mL) 2,29±1,54 2,18 (1,33-3,03) 2,11±1,72 1,56 (1,04-2,59) 0,219 IFN- (pg/mL) 704,93±534,95 522,50 (377,00-834,25) 618,76±320,96 512,00 (364,50-881,50) 0,755 DNA Metilasyon (% 5-mC) 1,26±0,64 1,14 (0,67-1,58) 3,56±2,99 3,25 (0,51-6,24) 0,002 63 p = 0 ,0 5 T r ip t o f a n ( µ m o l/ l ) 4 3 2 1 0 K o n tr o ru 20 10 0 u H a s ta G ru ID O ( n g /m l ) 3 n l G b u p = 0 ,0 0 1 50 10 5 K o n o u b b ru ru G G G u l l b o tr ru ta G u s ta b a a s ru u 0 0 H K y n /T r p x 1 0 o o tr ru p = 0 ,0 2 7 100 H u K 15 150 b tr s l G b 30 n a ru u 40 o H ta G b 50 K K in ü r e n in (µ m o l/l) p = 0 ,0 0 0 1 Şekil 4.1. Total hasta grubu ve kontrol grubunda ortalama kinürenin, triptofan, Kyn/Trp oranı ve IDO enzim düzeylerinin karşılaştırılması N e o p t e r in ( n g /m l) 64 5 4 3 2 1 0 a s G b u K o n t ro l G ru b u p = 0 ,0 0 2 8 6 4 2 ru ru b b u u 0 n o K H a s tr o ta l G G D N A M e t ila s y o n u ( % 5 - m C ) H ta ru Şekil 4.2. Total hasta grubu ve kontrol grubunda ortalama neopterin, IFN- ve DNA metilasyon düzeylerinin karşılaştırılması 65 Hasta grubu, metastaz durumuna göre metastazı olan hastalar (metastatik hasta grubu) ve metastazı olmayan hastalar (non-metastatik hasta grubu) olarak iki grubu ayrılıp ölçülen parametreler yönünden değerlendirildiğinde; Metastazı olmayan hasta grubunda metastazı olan hasta grubuna kıyasla triptofan düzeyleri bakımından anlamlı bir farklılık gözlenmezken (p=0,206), kinürenin düzeyleri istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek (p=0,007), IDO enzim düzeyi anlamlı bir farklılık göstermezken (p=0,072), enzim aktivitesinin göstergesi olan Kyn/Trp oranı anlamlı derecede yüksek (p=0.017) bulunmuştur. Metastazı olan ve metastazı olmayan hasta grupları arasında neopterin (p=0,103), ve DNA metilasyon düzeyleri (p=0,719)bakımından anlamlı bir farklılık gözlenmezken, IFN düzeyleri metastazı olan hastalarda metastazı olmayan hastalara kıyasla anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (p=0,005) (Çizelge 4.2) (Şekil 4.3, Şekil 4.4). Metastatik ve non-metastatik hasta grupları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında; metastazı olan hastalarda kinürenin (2,24±0,82 µmol/L) ve triptofan (39,37±9,56 µmol/l) düzeyleri kontrol grubu kinürenin (1,84±0,33 µmol/L) ve triptofan (34,00±9,42 µmol/L) düzeylerine kıyasla anlamlı derecede yüksek (sırasıyla p=0,047, p=0,037) bulunmuştur. Metastatik hasta grubunda Kyn/trp oranı (60,8±24,7) kontrole kıyasla (58,5±22,1) anlamlı bir farklılık göstermezken (p=0,724), IDO enzim düzeyleri daha düşük bulunmuştur (metastatik hasta için 2,66±1,24; kontrol grubu için 5,97±4,26) (p=0,0001). Metastatik hasta grubunda neopterin (1,88±1,07 ng/mL) ve IFN- düzeyleri (903,17±602,18 pg/mL) bakımından kontrol grubuna kıyasla (sırasıyla 2,11±1,72 ng/mL; 618,76±320,96 pg/mL) anlamlı bir farklılık gözlenmezken, DNA metilasyon düzeyleri metastatik hasta grubunda (1,31±0,69 %5-mC) kontrol grubuna kıyasla (3,56±2,99 %5-mC) anlamlı derecede düşük bulunmuştur (p=0,0001). Metastazı olmayan hasta grubunda kontrole kıyasla tritofan düzeyleri bakımından anlamlı bir farklılık gözlenmezken (p=0,219), kinürenin düzeyleri metastatik olmayan hasta grubunda (2,89±1,09 µmol/L) kontrol grubuna kıyasla (1,84±0,33 µmol/L) anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (p=0,0001). Non-metastatik hasta Kyn/Trp oranı (78,8±28,5) kontrol grubuna kıyasla (58,5±22,1) anlamlı derecede yüksek gözlenirken, IDO enzim düzeylerinde (p=0,079) ve IFN- düzeylerinde (p=0,251) anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Non-metastatik hasta grubu neopterin düzeyleri (2,77±1,86 66 ng/mL) kontrole kıyasla (2,11±1,72 ng/mL) anlamlı derecede yüksek (p=0,047), DNA metilasyon düzeyleri ise (sırasıyla 1,20±0,59; 3,56±2,99 %5-mC) anlamlı derecede düşük bulunmuştur (p=0,0001) (Şekil 4.3, Şekil 4.4). Hasta ve kontrol gruplarında ölçülen parametreler arasındaki korelasyonlar incelendiğinde; Total hasta grubunda kinürenin (r=0,451, p=0,001), Kyn/Trp oranı (r=0,516, p=0,0001) ve DNA metilasyon düzeyleri (r=0,344, p=0,016) ile neopterin arasında anlamlı pozitif korelasyonlar gözlenmiştir. Kontrol grubunda ise Kyn/Trp oranı ile IDO enzim düzeyi (r=0,537, p=0,006), neopterin (r=0,534, p=0,003) ve IFN- (r=0,427, p=0,033) düzeyleri arasında anlamlı pozitif korelasyonlar gözlenmiştir. Ayrıca kontrol grubunda IFN- düzeyleri ile triptofan düzeyleri arasında negatif (p=0,454, p=0,023) korelasyonlar gözlenmiştir. Ölçülen parametreler arasındaki korelasyonlar hastalar metastatik ve nonmetastatik oluşuna göre ayrılıp değerlendirildiğinde; IDO enzim aktivitesinin göstergesi olan Kyn/Trp oranı ile neopterin arasında, metastazı olan hastalarda (r=0,386, p=0,047) ve metastazı olmayan hastalarda (r=0,497, p=0,013) anlamlı pozitif korelasyonlar gözlenmiştir. IDO enzim düzeyleri ile Kyn/Trp oranı arasında metastatik ve non-metastatik hasta gruplarında anlamlı bir korelasyon gözlenmemiştir. Metastazı olmayan hastalarda, neopterin düzeyleri kinürenin düzeyleri ile (r=0,483, p=0,017) ve DNA metilasyon düzeyleri ile (r=0,497, p=0,013) pozitif korelasyon göstermiştir. 67 Çizelge 4.2.Metastatik ve non-metastatik hasta gruplarında ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri Metastatik Hasta Grubu (n=27) Non-Metastatik Hasta Grubu (n=24) Parametreler Ortalama±SS Medyan IQR Ortalama±SS Medyan IQR p Kinürenin (µmol/L) 2,24±0,82 2,08 (1,68-2,55) 2,89±1,09 2,41 (2,19-3,49) 0,007 Triptofan (µmol/L) 39,37±9,56 40,26 (33,97-45,01) 37,10±6,17 37,39 (32,25-42,81) 0,206 Kyn/Trpx103 60,8±24,7 57,3 (40,9-81,5) 78,8±28,5 67,6 (58,9-90,1) 0,017 IDO (ng/mL) 2,66±1,24 2,73 (1,85-3,51) 4,63±3,14 3,85 (2,20-5,88) 0,072 Neopterin (ng/mL) 1,88±1,07 1,75 (1,08-2,93) 2,77±1,86 2,26 (1,53-3,21) 0,103 IFN- (pg/mL) 903,17±602,18 698,00 (510,00-1069,00) 487,80±348,86 490,00 (281,50-582,50) 0,005 DNA Metilasyon (% 5-mC) 1,31±0,69 1,15 (0,74-1,71) 1,20±0,59 1,11 (0,66-1,58) 0,719 68 (a ) p = 0 ,0 4 7 (b ) p = 0 ,0 3 7 p = 0 ,0 0 7 p = 0 ,0 0 0 1 60 T r ip t o f a n ( µ m o l/l) K in ü r e n in ( µ m o l/l) 5 4 3 2 1 40 20 0 0 M e ta s ta ti G k N ru n o p e -m s ta ta ti k G ru p K o n o tr l G ru b u M e ta s ta ID O ( n g /m l) 3 K y n /T r p x 1 0 -m ta s ti k ru p K o n o tr l G ru b u p = 0 ,0 0 0 1 50 10 5 0 0 M e ta G p = 0 ,0 0 0 1 100 e n p 15 p = 0 ,0 1 7 s o ru (d ) 150 ta k N (c ) ta ti G ti k N G o n ru p -m e ta s ta ti k G ru p K o n t ro l G ru b u M e ta s ta ti k N G o n ru p -m e ta s ta ti k G ru p K o n o tr l G ru b u Şekil 4.3. Metastatik, non-metastatik hasta grupları ve kontrol grubunda ortalama kinürenin (a), triptofan (b), Kyn/Trp oranı (c) ve IDO enzim (d) düzeylerinin karşılaştırılması 69 (a ) (b ) N e o p t e r in ( n g /m l) p = 0 ,0 4 7 M ta e s 5 2000 p = 0 ,0 0 5 4 1500 IF N - 3 2 1000 1 500 0 ta N ti o G k n ru -m e p ta s ta ti k G ru K p o n tr o l G ru b 0 u M e ta s ta ti k N G o n ru p -m e ta s ta ti k G ru p K o n tr o l G ru b u (c ) D N A M e t ila s y o n u ( % 5 - m C ) p = 0 ,0 0 0 1 p = 0 ,0 0 0 1 8 6 4 2 0 G M e ta s ta ti ru p k N o n -M e ta s ta ti k G ru p K o n o tr l G ru b u Şekil 4.4. Metastatik, non-metastatik hasta grupları ve kontrol grubunda ortalama neopterin (a), karşılaştırılması IFN- (b) ve DNA metilasyon (c) düzeylerinin 70 İmmünohistokimyasal olarak hasta grubu östrojen ve progesteron reseptörleri pozitifliğine göre; ER/PR pozitif (Grup I) ve ER/PR negatif (Grup II) olarak sınıflandırılıp ölçülen parametreler bakımından değerlendirildiğinde; Grup II’de IDO enzim düzeyleri Grup I’e göre anlamlı derecede yüksek bulunurken (p=0,025), DNA metilasyonu Grup II’de Grup I’e kıyasla anlamlı derecede düşük bulunmuştur (p=0,007). Diğer parametreler bakımından anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. (Çizelge 4.3). Hastalarda immünohistokimyasal sınıflandırmaya göre korelasyonlar incelendiğinde; sadece ER/PR pozitif olan Grup I’de, Kyn/Trp oranı ile neopterin arasında (r=0,613, p=0,001) ve neopterin ile kinürenin arasında (r=0,534, p=0,0001) anlamlı pozitif korelasyon gözlenmiştir. ER/PR pozitifliğine ek olarak HER2 pozitifliğine göre hastalar; Grup 1 (ER/PR+, HER2+), Grup 2 (ER/PR+, HER2-), Grup 3 (ER/PR-, HER2+) ve Grup 4 (ER/PR-, HER2-) olarak sınıflandırıldığında; En düşük kinürenin, Kyn/Trp ve IDO düzeyleri triple pozitif olan Grup 1’de gözlenmiş, ancak istatistiksel olarak sadece kinürenin (p=0,023) ve IDO düzeyleri (p=0,011) Grup 3’deki düzeylerle istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermiştir. En düşük DNA metilasyon düzeyleri Grup 3 ve Grup 4’de gözlenmiş, en yüksek DNA metilasyon düzeyleri ise Grup 2’de gözlenmiştir. DNA metilasyon düzeyi Grup 2’de, Grup 3 (p=0,003) ve Grup 4 (p=0,05)’e kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermiştir. En düşük IFN- düzeyleri Grup 2’de gözlenmiş ve sadece Grup 4 düzeyleri ile istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermiştir (p=0,007) (Çizelge 4.4). Bakılan parametreler ile tümör grade dereceleri arasında herhangi bir anlamlı ilişki bulunamamıştır. 71 Çizelge 4.3.İmmünohistokimyasal olarak sınıflandırılan grup I hasta (ER/PR+, HER2+; ER/PR+, HER2-) ve grup II (ER/PR-, HER2+; ER/PR-, HER2) hastalarda ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri Grup I (n=39) Grup II (n=12) Parametreler Ortalama±SS Medyan IQR Ortalama±SS Medyan IQR P Kinürenin (µmol/L) 2,43±0,86 2,17 (1,89-2,83) 2,93±1,35 2,33 (2,24-3,77) 0,183 Triptofan (µmol/L) 37,95±8,27 37,69 (31,95-44,44) 39,45±7,96 42,34 (35,59-44,55) 0,374 75,3±30,8 64,6 (52,6-99,5) 0,505 3 67,4±27,02 63,7 (48,8-84,8) IDO (ng/mL) 3,29±2,47 2,78 (1,96-3,85) 5,36±2,82 4,55 (3,32-6,35) 0,025 Neopterin (ng/mL) 2,37±1,66 2,09 (1,33-3,08) 2,05±1,08 2,32 (1,08-2,94) 0,876 IFN- (pg/mL) 647,32±513,72 511,00 (378,25-721,00) 900,80±586,91 768,00 (357,50-1296,75) 0,206 DNA Metilasyon (% 5-mC) 1,38±0,65 1,33 (0,92-1,64) 0,86±0,41 0,81 (0,58-1,05) 0,007 Kyn/Trpx10 72 Çizelge 4.4. İmmünohistokimyasal olarak sınıflandırılan hastalarda dört farklı alt grupta(ER/PR+, HER2+; ER/PR+,HER2-; ER/PR-, HER2+ ve ER/PR-, HER2-) ölçülen parametrelerin ortalama, medyan ve IQR değerleri (*; p<0,05, **p<0.01) Grup I (n=39) Grup II (n=12) ER/PR + HER2 + (n=15) ER/PR + HER2 (n=24) ER/PR HER2 + (n=6) ER/PR HER2 (n=6) Ortalama±SS Medyan IQR Ortalama±SS Medyan IQR Ortalama±SS Medyan IQR Ortalama±SS Medyan IQR Kinürenin (µmol/L) 2,22±0,56* 2,04 (1,95-2,55) 2,56±0,99 2,37 (1,73-2,94) 3,05±1,03 2,66 (2,23-4,19) 2,80±1,71 2,28 (2,04-3,32) Triptofan (µmol/L) 38,17±7,76 40,26 (31,19-44,64) 37,81±8,73 36,31 (32,25-44,19) 39,59±10,85 42,89 (33,40-46,27) 39,32±4,65 39,12 (34,99-43,80) Kyn/Trpx103 61,7±21,9 53,7 (46,1-86,8) 71,0±29,7 65,9 (53,7-84,6) 80,5±25,4 81,4 (58,5-103,4) 70,0±37,0 58,9 (48,7-85,7) IDO (ng/mL) 2,40±1,23* 2,04 (1,70-3,45) 4,12±3,05 3,01 (2,07-5,16) 6,87±3,76 5,04 (4,37-11,20) 4,23±1,59 3,93 (2,87-5,90) Neopterin (ng/mL) 1,94±0,94 2,03 (1,08-2,93) 2,64±1,96 2,14 (1,44-3,22) 2,17±0,97 2,13 (1,28-3,11) 1,94±1,27 2,32 (0,64-2,87) IFN- (pg/mL) DNA Metilasyon (% 5-mC) 742,36±566,76 580,80±476,73** 668,00 509,00 (326,25-1063,00) (403,25-653,00) 1,21±0,66 1,08 (0,65-1,57) 1,49±0,64 1,46 (1,03-1,83) 761,40±769,24 1040,20±367,06 372,00 1251,00 (281,50-1436,00) (649,50-1325,50) 0,76±0,30** 0,71 (0,49-1,05) 0,96±0,50* 0,81 (0,59-1,28) 73 5. TARTIŞMA Çoklu mekanizmalar tümör uyarımlı toleransa katkıda bulunmaktadır. Bunlar tümörün kendinde veya tümörün aktığı lenf nodu gibi immün sistemin tümör antijenini karşıladığı anahtar bölgelerde olabilmektedir. Tümör hücrelerinin immün sistemi çökerterek veya immün sistemi kendi yararına yeniden programlayarak immün redden kaçındıkları bilinmekle birlikte, bu kaçışın moleküler mekanizmaları tam olarak aydınlatılmamıştır. Bu tolerojenik mekanizmalar; tümör antijenine cevabın başlamasını bloke ederek, aktive T hücrelerinin tümör hücrelerini öldürme yeteneğini inhibe ederek ve Treg’lerin baskılayıcı aktivitesini artırarak immün kaçışa katkı sağlamaktadır. Triptofan, protein sentezi için esansiyel bir amino asittir ve başlıca kinürenin yolağı ile metabolize edilmektedir. Kinürenin yolağına giren triptofan, doku ve hücre lokalizasyonları, substrat spesifiteleri bakımından farklılık gösteren karaciğer kaynaklı TDO ve ekstrahepatik dokularda bulunan IDO tarafından yıkılmaktadır [62]. IDO, TDO’nun aksine konstitütif indüklenebilir formda bir enzim olup, dentritik hücreler, monosit ve makrofajlar, eozinofiller, fibroblastlar, epitelyal hücreler, endotelyal hücreler ve bazı tümör hücreleri gibi spesifik hücrelerde IFN-, inflamatuvar sitokinler, lipopolisakkaritler ve TNF tarafından stimülasyona bağlı olarak aktivite göstermektedir 8,9]. Hamilelikte, transplantasyonda ve enfeksiyöz hastalıklarda artmış IDO ekspresyonu, IDO’nun doğal koruyucu rolünü oluştururken, otoimmün hastalıklarda IDO’ya bağlı tölerans gelişimi IDO’nun istenmeyen etkilerini oluşturmaktadır. IDO enzim aktivitesine bağlı olarak triptofan konsantrasyonunun azalması T-hücre proliferasyonunu azaltmakta, aktivasyonunu baskılayıp periferal tölerans gelişimine ve immün supresyona neden olabilmektedir. Triptofan metabolizmasına bağlı tölerans indüksiyonunda, triptofan açlığının T hücreler üzerinde yarattığı etkilerin yanı sıra kinürenin yolağında, IDO enzimatik reaksiyonundan sonraki basamakta meydana gelen kinürenin metabolitlerinin efektör T hücreler veya diğer hücrelerle doğrudan etkileşimi, immün aktivite baskılanmasında rol oynayan iki mekanizma olarak karşımıza çıkmaktadır 11,12. 74 İmmünosupresif moleküllerin ekspresyonunun; kanserin prognozunu, metastaz oluşumunu ve sitostatik bileşiklerle tedaviyi etkilediği bilinmektedir. IDO ekspresyonunun tümör ve tümör mikroçevresinde artışı, immünotoleransı indüklemekte ve aynı zamanda uygulanan tedaviyi de etkilemektedir. Normalde IDO düşük düzeyde eksprese edilmektedir. IDO aktivitesi hem transkripsiyonel hem de posttranslasyonel düzeyde regüle olmakta ve transkripsiyon, spesifik inflamatuvar medyatörlere cevap veren sıkı bir immünolojik kontrol altındadır. Sitokinler, hormonlar ve bazı ilaçlar IFN- bağımlı mekanizmalar aracılığı ile doğrudan veya dolaylı olarak INDO gen ekspresyonunu indüklemekte veya inhibe edebilmektedir. Yapılan araştırmalar IDO promotör bölgelerinin IFN yanıt elemanı taşıdığı ve lokal bölgede üretilen IFN’lerin birçok hücre hattında IDO ekspresyonunu güçlü bir şekilde indüklediğini göstermektedir [9,78]. İlk defa 2003 yılında Uyttenhove ve arkadaşları, melanoma, pankreatik karsinoma, küçük hücreli akciğer kanseri hücre hatlarını kullanarak, immünohistokimyasal olarak birçok insan meme kanseri hücresinin IDO eksprese ettiğini göstermişlerdir. Fare model sistemi kullanarak yüksek düzeyde IDO eksprese eden hücrelerin lokal triptofanı yıkarak immün sistemden kaçtığını, yine bu çalışmada IDO’yu çok az eksprese eden veya hiç etmeyen dokuların konakçı hayvanın immün sistemi tarafından kolaylıkla tanındığını ve reddedildiğini göstermişlerdir [94]. Takip eden yıllarda mide, akciğer, pankreas ve kolerektal kanser gibi çeşitli kanserlerde IDO ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir [119-123]. Mide kanserlerinde immünohistokimyasal olarak IDO ekspresyonlarının değerlendirildiği çalışmada, IDO ekspresyonundaki artış derin invazyon ve daha yüksek oranda lenf nod metastazı ile ilişkili bulunmuştur [123]. Ancak metastaz artışına bağlı olarak IDO expresyonunda artış gözlendiği bulgusunu desteklemeyen veriler bir başka çalışmada ortaya konulmuştur. Bu çalışmada; kolon kanserli kişilerden alınan dokularda, tümörü drene eden metastazlı ve metastazsız lenf nodları ile sağlıklı dokular karşılaştırıldığında, metastatik olmayan lenf nodlarında IDO+ hücre yoğunluğunun daha yüksek olduğu, ve bu hastalarda 5 yıllık sağkalım oranının daha düşük olduğu gösterilmiştir [124]. 75 Jacquemier ve arkadaşlarının 2011 yılında yapmış oldukları meme kanserinde immünohistokimyasal olarak IDO ekspresyonunu ve IDO’yu kodlayan INDO geni mRNA ekspresyonlarını değerlendirdikleri çalışmada, INDO mRNA ekspresyonunun, bazal-like meme kanserinde lüminal A tümörlere kıyasla daha yüksek olduğunu, medullar meme kanserlerinde de bazal-benzeri non-medüllar tümörlere kıyasla INDO mRNA ekspresyonunun daha yüksek olduğunu göstermişlerdir. Çalışma sonucunda IDO ekspresyonunun morfolojik olarak medullar özelliklerle ilişkili olduğunu, bazal-like meme kanserlerinde prognostik değer taşıdığını, survival göstergesi olabileceğini bildirmişlerdir [125]. Soliman ve arkadaşlarının 2013 yılında yapmış oldukları, meme kanserinde immünohistokimyasal olarak IDO ekspresyonu ve ER, PR ve HER2 ilişkisini araştırdıkları çalışmada; ilerlemiş evrede olan meme kanserli kişilerden elde edilen dokulara kıyasla, lenf nod-negatif meme kanserleri dokularda IDO ekspresyonunun daha yüksek olduğunu, ayrıca ER+ tümörlerde ER- tümörlere göre IDO ekspresyonunun daha yüksek olduğunu ve bu kişilerde sağkalımın da daha fazla olduğunu göstermişlerdir. IDO’yu düşük eksprese eden hücrelerin ise daha yüksek neovaskülerizasyona sahip ER- hücreler olduğunu göstermişlerdir [126]. Meme kanserli hastalarda CD4+, CD25+ Treg hücrelerindeki artışın meme kanserinde histolojik evre ve tümör büyüklüğü ile güçlü bir korelasyon gösterdiği bildirilmiştir. IDO’nun regülatuvar T hücrelerin farklılaşmasını indükleyerek T hücre immünitesini inhibe ettiği bilinmekle birlikte, Treg hücrelerdeki artışın in situ tümör hücrelerinde IDO ekspresyonu ile up-regülasyonu ve mekanizması ile ilgili önemli bir çalışma Jinpu ve arkadaşları tarafından 2011 yılında yapılmıştır. Bu çalışmada, meme kanserli hastaların tümör dokularında, hem RNA hem de protein düzeyinde IDO ekspresyonunun ve Treg amplifikasyonunun iyi huylu meme tümörlerinden daha yüksek olduğunu, tümör bölgesindeki artmış infiltre düzenleyici T hücre sayısı ve lenf nodu metastazı ile korelasyonunu tespit etmişlerdir. IDO’nun Treg hücreler ile etkileşiminin Foxp3+ ekspresyonunu artırmak suretiyle Treg hücrelerin farklılaşma, aktivasyon ve matürasyonunu etkilediğini bildirmişlerdir. [127]. 76 Triptofan metabolik yolağında kinüreninin oluşumunun, IDO enzimi ile sıkı bir şekilde regüle olması nedeniyle serum veya plazma kinürenin konsantrasyonunun triptofan konsantrasyonuna oranı, IDO enzim aktivitesinin önemli bir göstergesi olabilmektedir. IDO aktivitesindeki artışa bağlı olarak Kyn/Trp oranının arttığı hipotezini destekleyen bulgular çeşitli immünoinflamatuvar hastalıklarda [128] ve son yıllarda bazı kanserlerde yapılan çalışmalardan gelmektedir [129-131]. Preoperatif endometrial, vulvar ve over kanserli hastalardan elde edilen serumlarda Kyn/Trp oranları değerlendirildiğinde kanserli hastalarda kontrollere kıyasla daha yüksek Kyn/Trp oranı tespit edilmiştir. Bu çalışmada Kyn ve Kyn/Trp oranının erken veya ileri evre endometrial ve vulvar kanserlerde değişmediği, over kanserinde ise ileri evrede anlamlı düzeyde yüksek Kyn/Trp oranı olduğu gözlenmiştir [130]. Jinekolojik kanserlerde yapılan çalışmada ise hastalarda yüksek Kyn/Trp oranı olmakla birlikte istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı bildirilmiştir [131]. Kyn/Trp oranlarının meme kanserli hastalarda değerlendirildiği çalışma sınırlı sayıda olup [132,133], bu çalışmalardan biri Lyon ve arkadaşları tarafından 2011 yılında yayınlanmıştır. Pilot çalışma meme kanseri şüphesiyle gelen hastalardan alınan biyopsi örneklerinin sonuçlarına göre oluşturulan meme kanserli grup ve benign meme hastalığı olan grupta yapılmış, kemoterapi öncesi ve sonrası kan örneklerinde triptofan, kinürenin, tirozin düzeylerine bakılarak IDO’nun kanser ile ve IDO’ya bağlı olarak kanserlerde gelişen nöropsikiyatrik semptomların ilişkisi incelenmiştir. Elde edilen bulgular Kyn/Trp oranının meme kanserli hastalarda yüksek olduğunu, bu yüksekliğin tedavi sonrasında da devam ettiğini göstermektedir [132]. Diğer bir meme kanserli hasta ve sağlıklı kontrol grubundan oluşan çalışmada; yüksek IDO serum düzeyleri ve IDO ekspresyonu gözlenmiştir. Serum düzeyleri ve IDO ekspresyonunu histolojik sınıflandırma, tümör çapı, lenfatik ve venöz invazyon veya lenf nodu metastazı ile korelasyon göstermezken, sistemik immünodepresyon biyobelirteci olan immünsüpresör asidik protein ile korelasyon göstermiştir. Yine bu çalışmada çok sayıda kemik metastazı olan hastalarda bu oranın düşük, tek metastaz lezyonu olan hastalarda ise yüksek olduğunu bildirmişlerdir [133]. Lokal doku ekspresyonunun sistemik etkilerini değerlendirmek amacıyla IDO enzim düzeylerinin yanısıra IDO enzim aktivitesininin göstergesi olan Kyn/Trp oranlarını değerlendirdiğimiz çalışmamızda; kanser hastalarında hem enzim 77 düzeyinde hemde enzim aktivitesi düzeyinde sağlıklı kontrollere kıyasla farklı değerler gözledik. IDO enzim düzeyi kontrol grubunda anlamlı derecede yüksek iken, kinürenin ve Kyn/Trp oranındaki yükseklik meme kanserinde IDO enzim aktivitesinin arttığını göstermiştir. Bulgularımız bu anlamda Lyon ve arkadaşlarının verilerini destekler nitelikte olup, Sakurai ve arkadaşlarının yayınlamış olduğu çalışmanın tüm verileri, yayının Japonca olması nedeniyle bulgularımızla kıyaslanamamıştır. Yapılan değerlendirmede sağlıklı kişilerde, IDO IFN-, neopterin ve IDO enzim düzeylerindeki artışa bağlı olarak IDO enzim aktivitesinde artış gözlenirken, kanserli hastalarda sadece Kyn/Trp oranı neopterin artışına paralel olarak artmış, IDO enzim düzeyleri ile aktivitesi arasında bir korelasyon gözlenmemiştir. Elde edilen bu veriler kanserde IDO ekspresyonu ve aktivitesinin sağlıklı doku ve kanserli dokuda farklı sinyal yolaklarıyla regüle olabileceğini düşündürmektedir. IDO enzim düzeyleri bakımından metastazlı hastalar ve metastazı olmayan hastalar arasında bir fark gözlenmezken, hem Kyn hem de Kyn/Trp oranı, IDO enziminin primer indükleyicisi olan IFN- düzeylerinin yüksek olmasına rağmen metastatik grupta metastazı olmayan gruba kıyasla anlamlı derecede düşük bulunmuştur. Metastatik hastalarda gözlenen aktivitedeki düşüklük bu hasta grubundaki IDO gen polimorfizminden de kaynaklanıyor olabilir. Metastazlı grupta sağlıklı kontrollere kıyasla da anlamlı bir fark gözlenmemesi, IDO enzim aktivitesinin metastatik meme kanserinde daha düşük olduğunu göstermektedir. Meme kanseri metastazında IDO enzim aktivitesinin bir etkisinin olup olmadığı düşünüldüğünde, IDO enzim aktivitesinin meme kanseri metastazında herhangi bir artırıcı etkisi olabileceği fikrini ile örtüşmemektedir. Her ne kadar immünohistokimyasal çalışmalar metastazda IDO enzim ekspresyonunda artış olduğunu gösterse de, bulgularımızı destekler nitelikte veriler Gao ve arkadaşları tarafında yapılan kolon kanserli hastalarda gözlenen verilerle ve Sakurai ve arkadaşlarını meme kanserinde yapmış olduğu çalışmadan elde ettikleri verilerle uyumludur [124]. Bulgularımız kanserde triptofan yıkımının ve IDO enzim aktivitesinin önemine dikkat çekmektedir. Meme kanser türlerinden ve köken aldıkları hücrelerden kaynaklı farklılıklar, bulgularımızdaki farklılıklara yol açmış olabilir. 78 ER- olan MDA-MB-231 ve ER+ MCF-7 meme kanseri hücre hatlarında yapılan çalışmada; IFN- ile uyarı yapılıp IDO indüksiyonunu değerlendirmek üzere ortama triptofan ilave edilip kinürenin düzeyleri ölçülmüş, MDA-MB-231 ER- olan hücre hattında kinürenin düzeylerinin arttığı buna karşın MCF-7 ER+ hücre hattında ise kinürenin konsantrasyonunun bazal düzeyde kaldığı gözlenmiştir [134]. Çalışmamızda meme kanserli hastalar ER- ve ER+ meme kanserli gruplara ayrılıp yapılan değerlendirmede hücre kültüründe yapılan çalışmayı destekler nitelikte yüksek IFN- düzeylerine sahip ER- hastalarda IDO enzim düzeylerinin ER+ hastalara kıyasla anlamlı derecede yüksek olduğu gözlenmiştir. Ayrıca en düşük enzim düzeyi ve aktivitesi de triple negatif grupta gözlenmiştir. Efektör T hücreleri ekstrasellüler bölgedeki düşük triptofan düzeylerine oldukça duyarlı olup, anerji ve apoptoza uğrarlar. Bazı normal hücre tiplerinde IDO ekspresyonunun hem Tip I (α) hem de tip II () IFN’ler tarafından indüklendiği bilinmektedir. IDO ekspresyonu aynı zamanda Th1/Th2 sitokinlerle modüle olmaktadır. Meme ve böbrek hücre hatlarında aktif T hücrelerinin fonksiyonel IDO ekspresyonunu indüklediği ve bu indüksiyonun tamamen IFN-’ya atfedilemeyeceği, IL-3 ve Th2 (yardımcı T hücre tip 2) sitokinlerin IDO ekspresyonu üzerine negatif modülatör etkileri olduğu gösterilmiştir. [135]. Tümör hücrelerinde IDO ekspresyonu olmakla birlikte tümör mikro çevresi ve burada mevcut olan hücre popülasyonlarında da IDO eksprese edilmektedir. Tümör mikroçevresindeki mevcut hücre farlılıkları da bunda etkili olabilmektedir. IDO ekspresyonu, hücre tipine, hücrenin olgunlaşma durumu ve aktivasyon derecesine bağlı olarak hücreler arasında farklılık göstermektedir. Dendritik hücrelerde sitokinler ve büyüme faktörleri enzimin fonksiyonel aktivitesini değiştirmeksizin IDO protein düzeylerini up-regüle edebilir, bulgularımızda gözlenen farklılıkların kısmen nedeni olabilir. Yapılan çalışmalarda meme kanserli bireylerde sentinel lenf nodlarında immünohistokimyasal olarak belirlenen IDO enzim ekspresyonunun kontrol grubuna oranla anlamlı derecede yüksek olduğu gösterilmiştir. [136,137]. 79 Bir aromatik pteridin olan neopterin, aktif T hücrelerinden salınan IFN- uyarımı sonucu monosit ve makrofajlarca salgılanmakta [138], üretimindeki artış monosit ve makrofaj aktivitesini yansıtmakta, hücresel immünitenin anlık durumu ile ilgili bilgi sağladığı için immün sistem aktivasyonunun bir belirteci olarak kabul edilmektedir [139]. IDO’nun aksine neopterin oluşumu IFN- ile aktive olan makrofaj ve dendritik hücrelere spesifiktir ve tümör hücrelerinde genellikle yoktur. Yüksek neopterin konsantrasyonu ve artmış triptofan yıkımı çeşitli tümörlerde daha kısa yaşam süresi için bir risk faktörü olarak ileri sürülmüştür [131,140-142]. Doğal immün sisteminin aktivite göstergesi olarak baktığımız neopterin miktarları hasta grubunda kontrol grubuna oranla yüksek çıkmakla birlikte anlamlı bir fark gözlenmezken, sadece metastazı olmayan hasta grubunda kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir farklılık gözlenmiştir. Bu durumun, hasta sayısının çok olmaması sebebiyle ortaya çıkmış bir durum da olabileceğini düşündürmekle beraber Murr ve arkadaşlarının yaptığı, meme kanserinde neopterinin diğer kanser türlerine oranla çok daha az miktarda artış gösterdiğini, bu çalışmaya katılan hastaların sadece %20’sinde neopterin seviyesinin normalin üzerinde olduğu tespit ettikleri çalışmalarıyla uyumludur [143]. Bu da bulgularımızın bu kapsamda değerlendirildiğinde bulunan artışın neden anlamlılık için yeterli olamadığına bir açıklama getirebilecektir. Meme kanserindeki metastatik ve non-metastatik hastalar arasında neopterin konsantrasyonu açısından anlamlı bir fark olmaması ise doğal immünite açısından değil, edinsel immünite açısından fark olabileceği fikrini akla getirebilir. Bununla ilgili IFN- miktarına baktığımızda metastatik hastalarda bu oranın non-metastatik hastalara oranla yüksek olduğu görülmektedir. Neopterinden farklı olarak IFN- hem doğal hem de edinsel immünütede rol almaktadır ve neopterin gibi bağışıklık sisteminin aktivasyonunun bir göstergesi olarak kabul edilebilinir. Fakat neopterin artmazken IFN- artışı bize artmış bir edinsel immüniteyi düşündürebilir. Klasik genetiğin popülasyondaki çeşitliliği, monozigot ikizleri, hatta klonlanmış hayvanları tek başına açıklayamaması, epigenetiğin ortaya çıkması ile sonuçlanmış ve ilk defa 1939’da Waddington tarafından ortaya atılan epigenetik terimi; DNA sekansında değişiklik olmadan gen ekspresyonunda kalıtsal değişiklik 80 olarak kabul edilmiştir [144]. Gerek spesifik bölgede gerekse tüm genomik düzeyde DNA metilasyon kalıbında meydana gelen değişiklikler çeşitli kanserlerle ilişkilendirilmiş, global DNA metilasyon düzeyi düşük olanlarda, daha yüksek metilasyon düzeylerine sahip olanlara kıyasla daha yüksek kanser riski taşıdıkları bildirilmiştir [145]. Meme kanserindeki onkogenik mekanizmanın genetik değişikliklerin yanı sıra epigenetik değişikliklerle korelasyon gösterdiği fark edilmiş ve epigenomik bilgilerdeki son gelişmelerin, meme kanserinin başlangıç mekanizmasının anlaşılmasında derin etkileri olmuştur. Sonuç olarak meme kanserinin teşhis ve tedavisinde yeni stratejilerin gelişmesini tetiklemiştir. En iyi bilinen epigenetik değişiklik DNA metilasyonudur. DNA metilasyonu gen aktivitesinin ve hücre çekirdeğinin yapısının kontrol edilmesinde önemli bir role sahiptir. [146,147]. CpG bölgeleri genomda rastgele dağılmamışlardır bunun yerine CpG adacıkları denilen CpG’ce zengin bölgeler bulunmaktadır. Bu bölgeler pekçok genin 5’ ucundaki düzenleyici bölgelerde yer almaktadır. Promotor bölgelerin CpG adacıklarının anormal DNA metilasyonunun karsinogenezde büyük rol oynadığı bildirilmiştir [148]. İnsan tümörlerinde ilk olarak global DNA hipometilasyonu bulguları saptanmış, [149], izleyen yıllarda daha çok tümör supresör genlerin hipermetilasyonu izlenmiştir [150]. Tümörlerdeki DNA metilasyonu, karşılık gelen normal dokudaki DNA metilasyonu ile karşılaştırıldığında daha düşük bulunmuş ve insan kanserlerinde bulunan ilk epigenetik değişiklik olmuştur [149]. Tümör gelişimi sırasında genomik DNA’nın hipometilasyon derecesi, hücrelerin benign proliferasyondan invazif kansere doğru ilerlemesini artırmaktadır [151]. Günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğunda, spesifik genlerin hipometilasyonu veya hipermetilasyonu yaygın olarak çalışılmış, metilasyon belirteci bulmak amacıyla yapılan metilasyon çalışmalarının çoğunda, tümör dokusu ile histolojik olarak normal olan dokular arasındaki metilasyon farklılıkları değerlendirilmiştir. Günümüzde yapılan çalışmalarda; periferal kan global DNA metilasyonunun, sistemik hücrelerde tümör gelişimi yönünde genomik instabiliteye neden olmak suretiyle, kolerektal, mesane ve baş-boyun bölgesi kanserleri için bir risk faktörü olduğu bildirilmiştir [15-17]. 81 Yaptığımız çalışmada global DNA metilasyonu hastalarda kontrol grubuna oranla anlamlı düzeyde düşük bulunmuştur. Metastatik ve non-metastatik gruplar biribirleriyle kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmezken, her iki grup da kontrole kıyasla düşük metilasyon paterni sergilemiştir. DNA demetilasyonu pro-metastatik genlerin ekspresyon gen bölgelerini açarak önemli bir rol üstlenmektedir. Örneğin prostat kanserindeki MMP geni (matriks metalloproteinaz-2’yi kodlar) [152] veya meme kanserindeki uPA geni (urokinaz plazminojen aktivatörünü kodlar) [153] demetilasyona uğramış genlerdendir. Ayrıca non-metastatik meme kanser hücre kültürlerinin demetilasyon ajanları ile tedavi denemesi tümörün invasifliğini artırmıştır [154,155]. İnvazif meme kanseri ve karaciğer hücre kültürlerinin ters-demetilasyon ajanları ile kür uygulaması bu kanserlerin invazif ve metastatik özelliklerini inhibe etmiştir [156,157]. Kanser oluşumunda bir diğer metilasyon mekanizması da tümör supresör genlerin promotor bölgelerindeki CpG adacıklarının hipermetilasyonudur. Tümör supresör genlerinin hipermetilasyonu birer örnek teşkil etmektedir. Supresör genlerin promotor bölgelerinin metilasyonu klinikte değişik meme kanserleri ile korelasyon göstermektedir [158]. p16 tümör supresör geninin metilasyonu meme kanserinin erken belirteçlerinden biri olarak kabul edilmektedir [159]. DNA metilasyon özellikleri, bazı genlerde çoklu koordineli değişiklikleri içermektedir. Bu DNA metilasyonundaki spesifik kalıpların meme kanseri alt türlerine farklılaşmasını sağladığı ve böylece büyük doğrulukla prognozunu belirlediği bildirilmektedir. Meme kanserlerinde ER, PR ve HER2 ekspresyon profilleri hem prognostik hem de terapötik öneme sahiptir. Yapılan epigenetik analizlerde; meme kanserlerinin hormon reseptörleri ve HER2’ye göre değerlendirildiği alt gruplarında anormal metilasyon paternlerinin olduğu gösterilmiştir, ancak global metilasyon değişiklikleriyle ilgili veriler sınırlıdır [160,161]. Çalışmamızda Grup II ER- hastalarda global DNA metilasyon düzeylerinin Grup I ER+ hastalara kıyasla anlamlı derecede düşük olduğu görülmüştür. Bulgularımız prognoz açısından agresif tümörleri oluşturan ER- tümörlü hastalarda DNA metilasyonunun da azaldığını göstermektedir. 82 Östrojen reseptörünün yapısal ve foksiyonel patolojik değişiklikleri kadınlarda östrojen duyarsızlığına ve muhtemel meme kanseri oluşumuna işaret etmektedir. Pek çok deneysel ve klinik çalışmalar ER durumunun meme kanserinin gelişimi ve progresyonunda önemli bir yer tuttuğuna dair kanıtlar sağlamıştır ve bu, meme kanseri tedavisinde ER durumunu en önemli hormonal biyobelirteçlerden biri haline getirmiştir. Anti-östrojen tedavinin etkisinin, ER pozitif meme kanseri hücrelerinin büyümesini inhibe etmek ve önlemek olduğu bilinmektedir [162,163]. ER+ ve ER- tümörler arasında görülen gen ekspresyonu ve genomik mutasyonlar gibi ER ekspresyonundaki farklılıkların asıl rolü halen tam olarak bilinmemektedir. Östrojenler ve reseptörlerinin muhtemelen meme kanseri hücrelerinde kompleks etkileri vardır. Hem östrojen hem de progesteron reseptör durumu, meme kanseri tedavi rotası ve prognozunun belirlenmesi için önemli bir belirteçtir. Reseptör durumundaki farklılığa istinaden, pozitif ve negatif reseptör ekspresyonu olan meme kanserli hastalar arasında terapötik etkide anlamlı bir fark olduğu kanıtlanmıştır. Hatta meme kanseri tümörlerinde, tümör gelişimi sırasında hormon reseptör ekspresyonunun değişebileceği anlaşılmıştır. Damarlarda sirküle eden tümör hücrelerinin ER durumlarındaki değişim, aylar içerisindeki tümör progresyonu sırasında meydana gelen dinamik değişikliklere birer örnektir. Hortobagyi tarafından yapılan bir çalışma başlangıçta ER pozitif olan meme kanserlerinin bir kısmının tümör progresyonu sırasında ER’lerini kaybettiğini ve bunun meme kanserlerinin önemli bir özelliği olduğunu söylemektedir [164]. Yang ve arkadaşları ise, ER ekspresyonunun kaybolmasının artık östrojen kontrolü altında olmadan tümörün büyümesine sebep olduğunu, bunun da daha fazla otonomiye, kanserin agresifliğine ve buna bağlı olarak endokrin tedavinin başarısızlığına yol açtığını ileri sürmektedir. ER promotor bölgesinin metilasyonu hücre büyümesinin düzenlenmesini değiştirebilmektedir. Bu çalışmalar meme kanserlerinin önemli bir kısmında ER’in yokluğu CpG adacıklarının anormal metilasyonunun bir sonucu olduğu kanısını güçlendirmektedir [165-167]. PR geninin promotor bölgesindeki CpG adacıklarının metilasyonu pek çok kanser doku çeşidinde keşfedilmiş ve transkripsiyonu doğrudan durdurduğu veya kromatini, transkripsiyonu engelleyecek konformasyonda stabilize ettiği gösterilmiştir [168,169]. PR negatif tümör vakalarında, PR geninin CpG adacıklarındaki metilasyona duyarlı kısıtlı bölgelerden hipermetilasyona uğradığı, 83 bunun da; meme kanserinde anormal DNA metilasyonuna ve PR geninin susturulmasına sebep olduğu gösterilmiştir [170]. Hücresel düzeyde HER reseptör ligandları; hücre siklusunun devamını, proliferasyonunu, hücre ölümünü, protein sentezini, metabolizma ve farklılaşmayı içeren bir dizi işlemi kontrol etmektedir. Fizyolojik olarak bu yara iyileşmesi, neonatal büyüme ve gelişme ile sonuçlanır. HER reseptör sinyalindeki değişiklik, artmış proliferasyon ve azalmış hücre ölümüne bağlı olarak onkogenez ile sonuçlanabilmektedir. Adezyon, migrasyon, invasyon ve neo-anjiogenez gibi hücre metastazında gerekli proseslerin artmasının sonucudur. HER reseptörlerinin ekspresyon ve sinyalizasyonlarının bozulması; meme, over, beyin, prostat, barsak, akciğer ile baş ve boyun tümörlerini içeren birkaç değişik kanser türünde görülmüştür [171]. Bir HER türü olan HER2 onkogeni veya HER2 reseptör proteini meme kanserlerinin yaklaşık %25-30’unda eksprese edilmektedir [172,173]. Aşırı HER2 ekspresyonunun, hem nod negatif hem nod pozitif invazif meme kanseri tümörlerinde düşük hastalıksız süre ve düşük sağkalıma yol açtığı gözlenmiştir [173]. İleri derece duktal ve inflamatuvar meme kanserinde HER2 geni amplifikasyona uğramış ve aşırı derecede eksprese edildiği bildirilmiştir. Bunun aksine iyi huylu lezyonlarında ise HER2 düşük seviyede eksprese edilmektedir [174]. Ayrıca HER2’nin hücrelerin metastatik potansiyellerini artırdığına dair kanıtların olması, HER2 amplifikasyonunun ve aşırı ekspresyonunun meme kanseri ilerlemesini kuvvetlendirdiğine işaret etmektedir [174]. Battaglia ve arkadaşları ER ekspresyon durumu ile HER2 veya HER1 aşırı ekspresyonu arasında anlamlı bir ters ilişki olduğuna dair kanıtlar sunmuşlardır [175]. ER negatif tümörler, daha çok HER1 ve/veya HER2 eksprese etmektedirler ve daha agresif bir fenotipe sahiptirler [176]. Meme kanserinde endokrin tedavide ER-pozitifliğinin olumlu etkisi olduğuna işaret ederken klinik ve preklinik çalışmalar HER2 aşırı ekspresyonunun hormonal tedaviye intrinsik direnç oluşturduğunu göstermektedir [177,178]. ER/PR pozitifliğine ek olarak HER2 pozitifliğine göre hastalar; Grup 1 (ER/PR+, HER2+), Grup 2 (ER/PR+, HER2-), Grup 3 (ER/PR-, HER2+) ve Grup 4 (ER/PR-, HER2-) olarak sınıflandırıldığında, en düşük kinürenin, IDO enzim düzeyi ve 84 aktivitesi triple pozitif olan Grup 1’de gözlenmiştir. Grup1’i, ER/PR varlığının ortadan kalkmış olduğu Grup 3 ile kıyasladığımızda, ER/PR hormon reseptörlerinin ortadan kalkmasıyla Kyn/Trp oranı da artmaktadır. Grup 3’ün, triple negatif tümörden sonra en kötü sağkalıma sahip olması, IDO enzim aktivitesinin hastalığın prognozuna kötü etki ettiği fikrini doğrulayabilir. Bu IDO enzim indüksiyonundaki artış her ne kadar istatistiksel olarak anlamlı çıkmamış olsa da hastalığın immün kaçış yolunu kuvvetlendirerek prognozunu kötüleştirdiği fikrini de olası bir hipotez olarak düşündürmektedir. Meme kanserli alt gruplarda gönüllü hasta sayısının düşük olması istatistiksel olarak anlamlı düzeylere ulaşmayı kısıtlasa da istatistiksel olarak kinürenin ve IDO enzim düzeylerinin Grup 3’deki düzeylerle istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermesi ise, bu düşünceyi kuvvetlendiren bir diğer kanıt olarak görülebilir. ER/PR negatif tümörler ise aynı zamanda DNA metilasyonunun da en düşük olduğu hastaları oluşturmaktadır. 85 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Kanserde immün aktivite oldukça kompleks mekanizmalarla kontrol edilmektedir ve bu mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır. Çalışmamızda Kyn/Trp oranı kanserli hastalarda IDO enzim aktivitesinin arttığını göstermekle birlikte, kanserler histolojik ve immünohistokimyasal sınıflandırılmalarına, grade ve evresine bağlı olarak değişik profiller sergileyebilmektedir. Bu nedenle daha büyük alt gruplarda yapılan çalışmalar IDO enzim aktivitesi açısından daha aydınlatıcı veriler sunacaktır. Düşük global DNA metilasyon paterninin; metastatik meme kanserlerinde ve düşük sağkalım, agresif ve kötü prognoz sergileyen ER- tümörler için olası bir patern olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızda yapmayı hedeflemekle birlikte etik ve mali nedenlerle gerçekleştiremediğimiz doku IDO protein ekspresyonlarının belirlenmesinin de gelecek çalışmalar için aydınlatıcı olacağı düşüncesindeyiz. 86 87 KAYNAKLAR 1. The International Agency for Research on Cancer (IARC), the specialized cancer agency of the World Health Organization, 12 December 2013, Lyon/Geneva. http://globocan.iarc.fr/Default.aspx 2. İnternet: Sağlık Bakanlığı. Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kanser Daire Başkanlığı. URL: http://www.kanser.gov.tr. http://www.webcitation.org/query?url=http%3A%2F%2Fkanser.gov.tr%2Fdaire -faaliyetleri%2Fkanser-istatistikleri.html+&date=2014-07-21. Son Erişim Tarihi: 21-07-2014. 3. Prendergast, G.C. (2008). Immune escape as a fundamental trait of cancer: focus on IDO. Oncogene, 27, 3889-3900. 4. Platten, M., Wick, W., Van den Eynde B.J. (2012) Tryptophan catabolism in cancer: beyond IDO and tryptophan depletion. Cancer Research, 72, 54355450 5. MacKenzie, C.R., Heseler K., Muller, A., Daubener, W. (2007). Role of indoleamine 2,3-dioxygenase in antimicrobial defence and immuno-regulation: tryptophan depletion versus production of toxic kynurenines. Current Drug Metabolism, 8(3), 237–244. 6. Higuchi, K., Kuno, S., Hayaishi, O. (1967). Enzymatic formation of Dkynurenin. Federation Proceedings, 120(2):397-403. 7. Taylor, M.W., Feng, G.S. (1991). Relationship between interferon gamma, indoleamine 2,3-dioxygenase, and tryptophan catabolism. Faseb Journal, 5,2516–2522 8. Grohmann, U., Fallarino, F., Puccetti, P. (2004). Tolerance, DCs and tryptophan: much ado about IDO. Trends in Immunology, 24,242–248 9. Mellor, A.L., Munn, D.H. (2004). IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nature Reviews Immunology, 4,762–774 10. Werner, E.R., Werner-Felmayer, G., Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Yim, J.J., Pfleiderer, W. and Wachter H. (1990). Tetrahydrobiopterin biosynthetic activities in human macrophages, fibroblasts, THP-1 and T 24 cells. GTP-cyclohydrolase I is stimulated by interferongamma, 6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase and sepiapterin reductase are constitutively present. Journal of Biological Chemistry, 265, 3189-3192 11. Fallarino, F.,Grohmann, U., Vacca, C., Bianchi, R., Orabona, C., Spreca, A., Fioretti, M.C., Puccetti, P. (2002). T cell apoptosis by tryptophan catabolism. Cell Death and Differentiation, 9,1069–1077 12. Weber W.P., Feder-Mengus, C., Chiarugi, A., Rosenthal, R., Reschner, A., Schumacher, R., Zajac, P., Misteli, H., Frey, DM., Oertli, D., Heberer, M., Spagnoli, G.C. (2006). Differential effects of the tryptophan metabolite 3- 88 hydroxyanthranilic acid on the proliferation of human CD8+ T cells induced by TCR triggering or homeostatic cytokines. European Journal of Immunology, 36,296–304 13. Chiesa, M.D., Carlomagno, S., Frumento, G., Balsamo, M., Cantoni, C., Conte, R., Moretta, L., Moretta, A., Vitale, M. (2006). The tryptophan catabolite Lkynurenine inhibits the surface expression of NKp46- and NKG2D-activating receptors and regulates NK-cell function. Blood, 108,4118–4125. 14. Esteller, M. (2008). Epigenetics in cancer. New England Journal of Medicine,358,1148-1159. 15. Lim, U., Flood, A., Choi, S.W., Albanes, D., Cross, A.J., Schatzkin, A., Sinha, R., Katki, H.A., Cash, B., Schoenfeld, P., Stolzenberg-Solomon, R. (2008). Genomic methylation of leukocyte DNA in relation to colerectal adenoma among asymptomatic women. Gastroenterology, 134, 47-55 16. Moore, L.E., Pfeiffer, R.M., Poscablo, C., Real, F.X., Kogevinas, M., Silverman, D., García-Closas R., Chanock, S., Tardón, A., Serra, C., Carrato, A., Dosemeci, M., García-Closas, M., Esteller, M., Fraga, M., Rothman, N., Malats, N. (2008) Genomic DNA hypomethylation as a biomarker for bladder cancer susceptibility in the Spanish Bladder Cancer Study: a case-control study, Lancet Oncology, 9(4), 359-366 17. Hsiung, D.T., Marsit, C.J., Houseman, E.A., Eddy, K., Furniss, C.S., McClean, M.D., Kelsey, K.T. (2007). Global DNA methylation level in whole blood as a biomarker in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention,16(1),108-114. 18. Sørlie, T., Perou, C.M., Tibshirani, R., Aas, T., Geisler, S., Johnsen, H., Hastie, T., Eisen, M.B., Van de Rijn, M., Jeffrey, S.S., Thorsen, T., Quist, H. Matese, J.C., Brown, P.O., Botstein, D., Lønning, P.E., Børresen-Dale, A.L. (2001). Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(19),10869-10874. 19. Pizzo, P.A., Poplack, D.G. The basic science of Oncology. (1992) Tannock, I.F., Hill, R.P. (Eds) 2nd ed. New York, Mc Graw- Hill. 20. Lurlaro, R., León-Annicchiarico, C.L., Muñoz-Pinedo, C. (2014). Chapter Three - Regulation of Cancer Metabolism by Oncogenes and Tumor Suppressors, Methods in Enzymology, 542, 59–80. 21. Yoshida, K., Miki, Y. (2004). Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer science, 95 (11), 866–871. 22. Fasching, P.A., Ekici, A. B., Wachter, D. L., Hein, A., Bayer, C. M., Häberle, L., Loehberg, C. R., Schneider, M., Jud, S. M., Heusinger, K., Rübner, M., Rauh, C., Bani, M. R., Lux, M. P., Schulz-Wendtland, R., Hartmann, A. Beckmann, M. W. (2013). Breast Cancer Risk – From Genetics to Molecular 89 Understanding of Pathogenesis. Geburtshilfe und Frauenheilkunde, 73(12), 1228–1235. 23. Friedenson, B. (2007). The BRCA1/2 pathway prevents hematologic cancers in addition to breast and ovarian cancers. BMC Cancer, 7, 152. 24. Starita, L.M., Parvin, J.D. (2003). The multiple nuclear functions of BRCA1: transcription, ubiquitination and DNA repair. Current Opinion in Cell Biology, 15 (3), 345–350. 25. Wooster, R., Neuhausen, S.L., Mangion, J., Quirk, Y., Ford, D., Collins, N., Nguyen, K., Seal, S., Tran, T., Averill, D. (1994). Localization of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13q12-13. Science, 265 (5181), 2088–2090. 26. Oesterreich, S. and Fuqua, S.A.W. (1999). Tumor suppressor genes in breast cancer. Endocrine-Related Cancer, 6, 410-411. 27. Kumar, V., Abbas, A.K . Fausto, N., Aster, J.C. (2009). Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease Professional Edition,(8), Saunders, 818. 28. Shiloh, Y. (1995). Ataxia-telangiectasia: closer to unraveling the mystery. European Journal of Human Genetics, 3, 116-138. 29. Swift, M., Morrell, D., Massey, R.B. Chase, C.L. (1991). Incidence of cancer in 161 families affected by ataxia-telangiectasia. New England Journal of Medicine, 325, 1831- 1836. 30. Oesterreich, S. and Fuqua, S.A.W. (1999). Tumor suppressor genes in breast cancer. Endocrine-Related Cancer, 6, 405-419 31. DeVita, V.T., Theodore, S., Lawrance, T.S., Rosenberg, S.A. (2008). Cancer Principles&Practice of Oncology. (8) Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins, 1595-1599. 32. Hanna, L., Crosby, T., Macbeth, F. (2012). Pratik Klinik Onkoloji. (Çev. Özdemir, F.). İstanbul: İstanbul Tıp Kitabevi (1). 33. Bernstein, L., Ross, RK. (1993). Endogenous hormones and breast cancer risk. Epidemiologic Reviews,15(1),48-65. 34. Roner, B., Colditz, G.A., Willet, W.C. (1994). Reproductive risk factors in a prospective study of breast cancer: the Nurses’ Health Study. American Journal of Epidemiology, 139(8),819-835. 35. Trichopoulus, D., MacMahon, B., Cole, P. (1972). Menapouse and breast cancer risk. Journal of the National Cancer Institute, 48(3),605-613. 36. Kauff, N.D., Satagopan, J.M., Robson, M.E. (2002). Risk-reducing salpingooophorectomy in women with BRCA1 or BRCA2 mutation. The New England Journal of Medicine,346(21),1609-1615. 90 37. Chlebowski, R.T., Hendrix. S.L., Langer, R.D., Stefanick, M.L., Gass, M., Lane, D., Rodabough, R.J., Gilligan, M.A., Michele G.C., Thomson, C.A. Khandekar, J., Petrovitch, H., McTiernan, A. (2003). Influence of estrogen plus progestin on breast cancer and mammography in healthy postmenopausal women: the Women’s Health Initiative Randomized Trial. JAMA, 289 (24), 3243-3253. 38. Vainio, H., Kaaks, R., Bianchini, F. (2002). Weight control and physical activity in cancer prevention: international evaluation of the evidence. European Journal of Cancer Prevention, 11(2), 94-100. 39. Lahmann, P., Friedenreich, C., Schuit, A., Salvini, S., Allen N.E., Key T.J.,Khaw K., Bingham, S., Peeters, P.H.M., Monninkhof, E., Bueno-deMesquita, H.B., Wirfält, E.W. , Manjer J.,Gonzales, C.A., Ardanaz, E., Pilar Amiano, P., Quirós, J.R., Navarro, C., Carmen Martinez, C., Berrino, F., Palli, D., Tumino, R., Panico, S., Vineis, P., Trichopoulou, A., Bamia, C., Trichopoulos, D., Boeing, H, Schulz, M., Linseisen, J., Chang-Claude, J., Chapelon, F.C., Fournier, A., Boutron-Ruault, M., Tjønneland, A., Johnson, N.F., Overvad, K., Kaaks, R. and Riboli, E. (2007). Physical activity and breast cancer risk: the european prospective investigation into cancer and nutrition. Cancer Epidemiology Biomarkers and Preventions,16,36-42. 40. Monninkhof, E.M., Elias, S.G., Vlems, F.A., Ingeborg, V.D.T., Jantine, S.A., Dorien V.W., Flora, E. (2007). Physical activity and breast cancer: a systematic review. Epidemiology, 18, 137-157. 41. Bernstein, L., Ross, R.K., Lobo, R.A., Harnisch, R., Krailo, M.D., Henderson, B.E. (1987). The effect of moderate physical activity on menstrual cycle patterns in adolescence: implications for breast cancer preventation. British Journal of Cancer, 55(6),681-685. 42. MacDonald, P.C., Edman, C.D., Hemsell, D.L., Porter, J.C., Siiteri, P.K. (1978). Effect of obesity on conversation of plasma androstenedione to estrone in post menopausal women with and without endometrial cancer. American journal of Obstetrics and Gynecology, 130(4),448-455. 43. Bernstein, L. (2002). Epidemiology of endocrine-related risk factors for breast cancer. Journal of Mammary Gland Biologyand Neoplasia, 7(1), 3-15. 44. Hunter, D.J., Spiegelman, D., Adami, H.O., et al. Beeson, L., van den Brandt, P.A., Folsom, A.R., Fraser, G.E., Goldbohm, R.A., Graham, S., Howe, G.R., Kushi, L.H., Marshall, J.R., McDermott, A., Miller, A.B., Speizer, F.E., Wolk, A., Yaun, S.S. and Willett, W. (1996). Cohort studies of fat intake and the risk of breast cancer-a pooled analysis. The New England Journal of Medicine, 334(6), 356-361. 45. Singletary, K.W., Gapstur, S.M. (2003). Alcohol and breast cancer: review of epidemiologic and experimental evidence and potential mechanisms. JAMA, 286(17), 2143-2151. 46. Porter, R.S., Kaplan, J.L. (Editörler).(2010). Merck and The Merck Manual. New Jersey. Merck Sharp&Co.INC. 91 47. Özen, V., Cantürk, Z., Çelik, V., Güler, N., Kapkaç, M., Koyuncu, A., Müslümanoğlu, M., Utkan, Z.( 2012). Meme Hastalıkları Kitabı. İstanbul: Güneş Tıp Kitabevleri, 187-194. 48. O'Brien, P.G., Kennedy, W.Z., Ballard, K.A. (2012). Psychiatric Mental Health Nursing. (Second edition). Burlington: Jones Barlett Learning, 501. 49. Schnitt, S.J., Guidi, A.J. (2004). Pathology of invasive breast cancer. Harris JR, Lippman ME, Morrow M, Osborne CK (Eds.), Disease of the breast, 3rd ed. Philedelphia: Lippincot William&Wilkins, 541. 50. Edge, S.B., Byrd, D.R., Compton, C.C., Fritz, A.G., Greene, F.L., Trotti, A., (Eds). (2010). AJCC Cancer Staging Manual, 7th ed. New York: Springer, 347-376. 51. Ramos-Vara, J.A.; Miller, M.A. (2014). When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology, 51 (1), 42–87. 52. Onitilo, A.A., Engel, J.M. Greenlee, R.T., Mukesh, B.N. (2009). Breast cancer subtypes based on ER/PR and Her2 expression: comparison of clinicopathologic features and survival. Clinical Medicine and Research. 7,413. 53. Itoh, M., Iwamoto, T., Matsuoka, J., Nogami, T., Motoki, T., Shien, T., Taira, N., Niikura, N., Hayashi, N., Ohtani, S., Higaki, K., Fujiwara, T., Doihara, H., Symmans, W.F., Pusztai, L. (2014). Estrogen receptor (ER) mRNA expression and molecular subtype distribution in ER-negative/progesterone receptorpositive breast cancers. Breast Cancer Research and Treatment, 143(2),403409. 54. Falck, A.K., Fernö, M., Bendahl, P.O., Ryden, L. (2013). St Gallen molecular subtypes in primary breast cancer and matched lymph node metastases aspects on distribution and prognosis for patients with luminal A tumours: results from a prospective randomised trial. BMC Cancer, 13:558. 55. Hu, X., Stern, H.M., Ge, L., O'Brien, C., Haydu, L., Honchell, C.D., Haverty, P.M., Peters, B.A., Wu, T.D., Amler, L.C., Chant, J., Stokoe, D., Lackner, M.R., Cavet, G. (2009). Genetic Alterations and Oncogenic Pathways Associated with Breast Cancer Subtypes. Molecular Cancer Research, 7(4), 511-522. 56. Rakha, E.A., Reis-Filho, J.S., Baehner, F., Dabbs, D.J., Decker, T., Eusebi, V., Fox, SB., Ichihara, S., Jacquemier, J., Lakhani, S.R., Palacios, J., Richardson, A.L., Schnitt, S.J., Schmitt, F.C., Tan, P.H., Tse, G.M., Badve, S., Ellis, I.O. (2010). Breast cancer prognostic classification in the molecular era: the role of histological grade. Breast Cancer Research, 12(4),207. 57. İnternet: AUTHORNAME. TITLE. . 2014-07-21. URL: http://www.webcitation.org/query?url=http%3A%2F%2Fwww.cancer.gov%2Fc ancertopics%2Fpdq%2Ftreatment%2Fbreast%2Fhealthprofessional&date=20. Son Erişim Tarihi: 21-07-2014. 92 58. Smith, I., Procter, M., Gelber, R.D., Guillaume, S., Feyereislova, A., Dowsett, M., Goldhirsch, A., Untch, M., Mariani, G., Baselga, J., Kaufmann, M., Cameron, D., Bell, R., Bergh, J., Coleman, R., Wardley, A., Harbeck, N., Lopez, R.I., Mallmann, P., Gelmon, K., Wilcken, N., Wist, E., Sánchez, Rovira, P., Piccart-Gebhart, M.J. (2007). 2-year follow-up of trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer: a randomised controlled trial. Lancet, 369 (9555), 29-36. 59. Bonneterre, J., Thürlimann, B., Robertson, J.F., Krzakowski, M., Mauriac, L., Koralewski, P., Vergote, I., Webster, A., Steinberg, M., von Euler, M. (2000). Anastrozole versus tamoxifen as first-line therapy for advanced breast cancer in 668 postmenopausal women: results of the tamoxifen or arimidex randomized group efficacy and tolerability study. Journal of Clinical Oncology, 18 (22): 3748-3757. 60. Robert, N., Leyland-Jones, B., Asmar, L., Belt, R., Ilegbodu, D., Loesch, D., Raju, R., Valentine, E., Sayre, R., Cobleigh, M., Albain, K., McCullough, C., Fuchs, L., Slamon, D. (2006). Randomized phase III study of trastuzumab, paclitaxel, and carboplatin compared with trastuzumab and paclitaxel in women with HER-2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology, 24 (18), 2786-2792. 61. Richard, D.M., Dawes, M.A., Mathias, C.W., Acheson, A., Hill-Kapturczak, N., Dougherty, D.M. (2009). L-Tryptophan: Basic Metabolic Functions, Behavioral Research and Therapeutic Indications. International Journal of Tryptophan Research, 2,45-60. 62. Chen, Y. and Gıillemin G.J. (2009). Kynurenine pathway in humans: disease and health states. International Journal of Tryptophan Research, 2, 1-19. 63. Kema, I.P., Vries, E.G.E., Mıskiet, F.A.J. (2000). Clinical chemistry of serotoin and metabolites. Journal of Chromatography, 747, 33-48. 64. Sandyk, R. (1992). L-tryptophan in neuropsychiatric disorders: a review. International Journal of Neuroscience, 67 (1-4), 127-144. 65. Szczepanik M. (2007). Melatonin and its influence on immune system. Journal of Physiology and Pharmacology, (58), 6, 115-124. 66. Christmas, D.M., Potokar, J., Davies, S.J. (2011). A biological pathway linking inflammation and depression: activation of indoleamine 2,3-dioxygenase. Neuropsychiatric Disease and Treatment, 7, 431–439. 67. Kurz, K., Schroecksnadel, S., Weiss, G., Fuchs, D. (2011). Association between increased tryptophan degradation and depression in cancer patients. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 1 (14), 49-56. 68. Carpenedo R1, Chiarugi A, Russi P, Lombardi G, Carlà V, Pellicciari R, Mattoli L, Moroni F. (1994). Inhibitors of kynurenine hydroxylase and kynureninase increase cerebral formation of kynurenate and have sedative and anticonvulsant activities. Neuroscience, 61(2), 237-243. 93 69. Takikawa, O. (2005). Biochemical and medicinal aspects of the indolamine 2,3-dioxygenase-initiated L-tryptophan metabolism. Biochemical and Biophysical Research Communication, 338, 12-19. 70. Takikawa, O., Kuroiwa. T., Yamazaki, F., Kido, R. (1988). Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indolamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its intracellular activity. Journal of Biological Chemistry, 263,2014-2048. 71. Yuasa, H.J., Takubo, M., Takahashi, A., Hasegawa, T., Noma, H., Suzuk,i T. (2007). Evolution of vertebrate indolamine 2,3-dioxygenase. Journal of Molecular Evolution, 65,705-714. 72. Efimov, I., Basran, J., Thackral, S.J., Handa, S., Mowat, C.G., Raven, E.L. (2011). Structure and reaction mechanism in the heme dioxygenases. Biochemistry, 52, 2717-2724. 73. Capece, L., Arrar, M., Roitberg, A.E., Yeh, S.R., Marti, M.A., Estrin, D.A. (2010). Substrate Stereo-specificity in Tryptophan dioxygenase and Indoleamine 2,3- dioxygenase. Proteins, 78(14), 2961–2972. 74. Johnson, T.S., Munn, D.H. (2012). contribution to systemic acquired investigations, 41,765-797. Host indolamine 2,3-Dioxygenase: tumor tolerance. Immunological 75. Hargadon, K.M., Brinkman, C.C., Sheasley-O'neill, S.L., Nichols, L.A., Bullock, T.N., Engelhard, V.H. (2006). Incomplete differentiation of antigen-specific CD8 T cells in tumor draining lymph nodes. Journal of Immunology, 177,6081– 6090. 76. Badawy, A.A.-B., Morga, C.J., Turner, J.A., Dougherty, D.M., Marshd, D.M., Mathias, C.W., Addicottd, M.A., Jagare, A.A. (2007). Assessment of the kynurenine pathway in humans: I. Normal plasma values, ethnic differences and their clinical implications. International Congress Series, 1304, 335-343. 77. Schröcksnadel, K., Wirleitner, B., Winkler, C., Fuchs, D. (2006). Monitoring tryptophan metabolism in chronic immune activation. Clinica Chimica Acta, 364, 82-90. 78. Munn, D., Mellor, A.L. (2007). Indolamine 2,3-dioxygenase and tumor-induced tolerance. Journal of Clinical Investigation. 117, 1147-1154. 79. Ball, H.J., Sanchez-Perez, A., Weiser, S., Austin, C.J., Astelbauer, F., Miu, J., McQuillan, J.A., Stocker, R., Jermiin, L.S., Hunt, N.H. (2007). Characterization of an indoleamine 2,3-dioxygenase-like protein found in humans and mice. Gene, 396, 203–213. 80. Ball, H.J., Yuasa, H.J., Austin, C.J.D., Weiser, S., Hunt, N.H. (2009). Indolamine 2,3-dioxygenase-2; a new enzyme in the kynurenine pathway. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 41,467-471. 94 81. King, N.J.C., Thomas, S.R. (2007). Molecules in focus: Indolamine 2,3dioxygenase. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 39, 2167-2172. 82. Mellor, A. (2005). Indolamine 2,3-dioxygenase and regulation of T cell immunity. Biochemical and Biophysical Research Communications, 338,20-24. 83. Munn, D.H., Zhou, M., Attwood, J.T., Bondaref, I., Conway, S.J., Marshall, B., Brown, C.,Mellor, A.L. (1998). Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism. Science, 28 (5380), 1191-1193. 84. Munn, D.H., Shafizadeh, E., Attwood, J.T., Bondarev, I., Pashine, A., Mellor, A.L. (1999). Inhibition of T cell proliferation by macrophage tryptophan catabolism. Journal of Experimental Medicine, 189,1363–1372. 85. Mellor, A.L., Munn, D.H. (1999). Tryptophan catabolism and T-cell tolerance: immunosuppression by starvation. Immunology Today, 20, 469–473. 86. Frumento, G., Rotondo, R., Tonetti, M., Damonte, G., Benatti, U., Ferrara, G.B. (2002). Tryptophan-derived Catabolites are Responsible for Inhibition of T and Natural Killer Cell Proliferation Induced by Indoleamine 2,3-Dioxygenase. Journal of Experimental Medicine, 196, 459-468. 87. Chiesa, M.D., Carlomagno, S., Frumento, G., Balsamo, M., Cantoni, C., Conte, R., Moretta, L., Moretta, A., Vitale, M. (2006). The tryptophan catabolite Lkynurenine inhibits the surface expression of NKp46- and NKG2D-activating receptors and regulates NK-cell function. Blood, 108,4118–4125. 88. Dong, J., Qiu, H., Garcia-Barrio, M., Anderson, J., and Hinnebusch, A.G. (2000). Uncharged tRNA activates GCN2 by displacing the protein kinase moiety from a bipartite tRNA-binding domain. Molecular Cell, 6,269–279. 89. Wang, J., Simonavicius, N., Wu, X., Swaminath, G., Reagan, J., Tian, H., Ling, L. (2006). Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. Journal of Biological Chemistry, 281,22021–22028. 90. Huang, A.Y., Golumbek, P., Ahmadzadeh, M., Jaffee, E., Pardoll, D., Levitsky, H. (1994). Role of bone marrow derived cells in presenting MHC class Irestricted tumor antigens. Science, 264,961–965. 91. Itano, A.A. and Jenkins, M.K. (2003). Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology, 4,733–739. 92. Munn, D.H., and Mellor, A.L. (2006). The tumor draining lymph node as an immune-privileged site. Immunological Reviews, 213,146–158. 93. Lee, J.R., Dalton, R.R., Messina, J.L., Sharma, M.D., Smith, D.M., Burgess, R.E., Mazzella, F., Antonia, S.J., Mellor, A.L., Munn, D.H. (2003). Pattern of recruitment of immunoregulatory antigen presenting cells in malignant melanoma. Laboratory Investigattion, 83,1457–1466. 95 94. Uyttenhove, C., Pilotte, L., Théate, I., Stroobant, V., Colau, D., Parmentier, N., Boon, T., Van den Eynde, B.J. (2003). Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3dioxygenase. Nature Medicine, 10,1269–1274. 95. Dunn, G.P., Koebel, C.M., and Schreiber, R.D. (2006). Interferons, immunity and cancer immunoediting. Nature Reviews Immunology, 6,836–848. 96. Fallarino, F., Grohmann, U., Hwang, K.W., Orabona, C., Vacca, C., Bianchi, R., Belladonna, M.L., Fioretti, M.C., Alegre, M.L., Puccetti, P. (2003). Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nature Immunology, 4,1206–1212. 97. Munn, D.H., Sharma, M.D., and Mellor, A.L. (2004). Ligation of B7-1/B7-2 by human CD4+ T cells triggers indoleamine 2,3-dioxygenase activity in dendritic cells. Journal of Immunology. 172,4100–4110. 98. Huber, C., Batchelor, J.R., Fuchs, D., Hausen, A., Lang, A., Niederwieser, D., Reibnegger, G., Swetly, P., Troppmair, J., Wachter, H. (1984). Immune response-associated production of neopterin. Release from macrophages primarily under control of interferon-gamma. Journal of Experimental Medicine, 160, 310-316. 99. Hamerlinck, E.F.V. (1999). Neopterin: a review. Experimental Dermatology, 8,167-176. 100. Werner-Felmayer, G., Werner, E.R., Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Wachter, H. (1990). Neopterin formation and tryptophan degradation by a human myelomonocytic cell line (THP-1). Cancer Research, 50,2863-2867. 101. Werner-Felmayer, G., Werner, E.R., Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Wachter, H. (1989). Tumour necrosis factor alpha and lipopolysaccharide enhance interferon-induced tryptophan degradation and pteridine synthesis in human cells. Biological Chemistry Hoppe-Seyler, 370,1063-1069. 102. Maggi, E., Parronchi, P., Manetti, R., Simonelli, C., Piccinni, M.P., Rugiu, F.S., De Carli, M., Ricci, M., Romagnani, S. (1992). Reciprocal regulatory effects of IFN-γ and IL-4 on the in vitro development of human Th1 and Th2 clones. Journal of Immunology,148 ,2142-2148. 103. Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Werner, E.R., Dierich, M.P., Wachter, H. (1998). Neopterin as a marker for activated cell-mediated immunity: Application in HIV infection. Immunology Today, 9,150-155 104. Holliday, R. (1994). Epigenetics: an overview. Developmental Genetics, 15(6),453-457. 105. Liu, L., Wylie, R.C., Andrews, L.G. and Tollefsbol, T.O. (2003). Aging, cancer and nutrition: the DNA methylation connection. Mechanisms of Ageing Development, 124, 989–998. 96 106. Brena, R.M., Huang, T.H.M., Plass, C. (2006). Toward a human epigenome. Nature Genetics, 38,1359-1360. 107. Baylin, S.B., Ohm, J.E. (2007). Epigenetic gene silencing in cancer – a mechanism for early oncogenic pathway addiction?. Nature Reviews Cancer, 6,107-116. 108. Laird, P.W. (2003). The power and the promise of DNA methylation markers. Nature Reviews Cancer, 3,253–266. 109. Widschwendter, M., Jones, P.A. (2002). DNA methylation and breast carcinogenesis. Oncogene, 21,5462–5482. 110. Jones, P.A., Baylin, S.B. (2007). The epigenomics of cancer. Cell, 128,683– 692. 111. Duffy, M.J., Napieralski, R., Martens, J.W.M., Span, P.N., Spyratos, F., Sweep, F.C.G.J., Brunner, N., Foekens, J.A. , Schmitt, M. (2009). Methylated genes as new cancer biomarkers. European Journal of Cancer, 45(3),335-346. 112. Das, P.M., Signal, R. (2004). DNA methylation and cancer. Journal of Clinical Oncology, 22, 4632-4642. 113. Cavallaro, U, Christofori, G. (2001). Cell adhesion in tumor invasion and metastasis: loss of the glue is not enough. Biochimica et Biophysica Acta, 1552, 39–45. 114. Strathdee, G. and Brown, R. (2002). Aberrant DNA methylation in cancer: potential clinical interventions. Expert Reviews in Molecular Medicine, 4,1-17. 115. Taby, R., Issa, J.P.J. (2010). Cancer epigenetics. CA Cancer Journal for Clinitians, 60,376-392. 116. Zhang, Y.J., Wu, H.C., Shen, J., Ahsan, H., Tsai, W.Y., Yang, H.I., Wang, L.Y., Chen, S.Y., Chen, C.J., Santella, R.M. (2007). Predicting hepatocellular carcinoma by detection of aberrant promoter methylation in serum DNA. Clinical Cancer Research, 13(8),2378-2384. 117. Zhang, X., He, Y., Ding, M. (2009). Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in plasma samples of children patients with Kawasaki disease by high-performance liquid chromatography with programmed wavelength ultraviolet detection. Journal of Chromatography B, 877, 1678–1682. 118. Özdemir, D., Pak, I. (2010). Evaluation of immunohistochemistry and silverenhanced in situ hybridization results for Her2/neu manually and with image analysis system in human breast cancer. Turkish Journal of Pathology, 26 (3),216-221. 119. Zhang, R., Li, H., Yu, J., Zhao, J., Wang, X., Wang, G., Yao, Z., Wei, F., Xue, Q., Ren, X. (2011). Immunoactivative role of indoleamine 2,3dioxygenase in gastric cancer cells in vitro. Molecular Medicine Reports, 4,169–173. 97 120. Astigiano, S., Morandi, B., Costa, R., Mastracci, L., D'Agostino, A., Ratto, G.B., Melioli, G., Frumento, G. (2005). Eosinophil granulocytes account for indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated immune escape in human non-small cell lung cancer. Neoplasia,7,390–396. 121. Feder-Mengus, C., Wyler, S., Hudolin, T., Ruszat, R., Bubendorf, L., Chiarugi, A., Pittelli, M., Weber, W.P., Bachmann, A., Gasser, T.C., Sulser, T., Heberer, M., Spagnoli, G.C., Provenzano, M. (2008). High expression of indoleamine 2,3-dioxygenase gene in prostate cancer. European Journal of Cancer, 44(15),2266-2275. 122. Brandacher, G., Perathoner, A., Ladurner, R., Schneeberger, S., Obrist, P., Winkler, C., Werner, E.R., Werner-Felmayer, G., Weiss, H.G., Göbel, G., Margreiter, R., Königsrainer, A., Fuchs, D., Amberger, A. (2006). Prognostic value of indoleamine 2,3-dioxygenase expression in colorectal cancer: effect on tumor-infiltrating T cells. Clinical Cancer Research,12,1144–1151. 123. Zhang, R., Liu, H., Li, F., Li, H., Yu, J., Ren, X. (2013). The correlation between the subsets of tumor infiltrating memory T cells and the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in gastric cancer. Digestive Diseases and Sciences, 58(12),3494-3502. 124. Gao, Y.F., Peng, R.Q., Li, J., Ding, Y. Zhang, X., Wu, X.J., Pan, Z.Z., Wan, D.S., Zeng, Y.X., and Zhang, X.S. (2009). The paradoxical patterns of expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in colon cancer. Journal of Translational Medicine, 7,71. 125. Jacquemier, J., Bertucci, F., Finetti, P., Esterni, B., Charafe-Jauffret, E., Thibult, M.L., Houvenaeghel, G., Van den Eynde, B., Birnbaum, D., Olive, D., Xerri, L. (2011). High expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in the tumour is associated with medullary features and favourable outcome in basal-like breast carcinoma. International Journal of Cancer, 130(1),96-104. 126. Soliman, H., Rawal, B., Fulp, J., Lee, J.H., Lopez, A., Bui, M.M., Khalil, F., Antonia, S., Yfantis, H.G., Lee, D.H., Dorsey, T.H., Ambs, S. (2013). Analysis of indoleamine 2-3 dioxygenase (IDO1) expression in breast cancer tissue by immunohistochemistry. Cancer Immunology, Immunotherapy, 62(5),829-837. 127. Yu, J., Du, W., Yan, F., Wang, Y., Li, H., Cao, S., Yu, W., Shen, C., Liu, J., Ren, X. (2013). Myeloid-Derived Suppressor Cells Suppress Antitumor Immune Responses through IDO Expression and Correlate with Lymph Node Metastasis in Patients with Breast Cancer. Journal of Immunology, 190,37833797. 128. Ozkan Y, Mete G, Sepici-Dincel A, Sepici V, Simsek B (2012). Tryptophan degradation and neopterin levels in treated rheumatoid arthritis patients . Clinical Rheumatology, 31,29-34. 129. Weinlich, G., Murr, C., Richardsen, L., Winkler, C., Fuchs, D. (2007). Decreased serum tryptophan concentration predicts poor prognosis in malignant melanoma patients. Dermatology, 214(1),8-14. 98 130. de Jong, R.A., Nijman, H.W., Boezen, H.M., Volmer, M., Ten Hoor, K.A., Krijnen, J., van der Zee, A.G., Hollema, H., Kema, I.P. (2011). Serum tryptophan and kynurenine concentrations as parameters for indoleamine 2,3dioxygenase activity in patients with endometrial, ovarian, and vulvar cancer. International Journal of Gynecological Cancer, 21(7),1320-1327. 131. Schroecksnadel, K., Winkler, C., Fuith, L.C., Fuchs, D. (2005). Tryptophan degradation in patients with gynecological cancer correlates with immune activation. Cancer Letters, 223(2),323-329. 132. Lyon, D.E., Walter, J.M., Starkweather, A.R., Schubert, C.M. and McCain, N.L. (2011). Tryptophan degradation in women with breast cancer: a pilot study. BMC Research Notes, 4,156-163. 133. Sakurai, K., Fujisaki, S., Nagashima, S., Maeda, T., Tomita, R., Suzuki, S., Hara, Y., Enomoto, K., Amano, S. (2013). Indoleamine 2, 3-dioxygenase activity for breast cancer patients with recurrence 5 or more years after surgery. Gan To Kagaku Ryoho. 40(12),1590-1592. 134. Travers, M.T., Gow, I.F., Barber, M.C., Thomson, J., Shennan, D.B . (2004). Indoleamine 2,3-dioxygenase activity and L-tryptophan transport in human breast cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta, 1661(1),106–112. 135. Godin-Ethier, J., Pelletier, S., Hanafi, L.A., Gannon, P.O., Forget, M.A., Routy, J.P., Boulassel, M.R., Krzemien, U., Tanguay, S., Lattouf, J.B., Arbour, N., Lapointe, R. (2009). Human Activated T Lymphocytes Modulate IDO Expression in Tumors through Th1/Th2 Balance. The Journal of Immunology, 183, 7752–7760. 136. Mansfield, A.S., Heikkila, P.S., Vaara, A.T., von Smitten, K.A., Vakkila, J.M., Leidenius, M.H. (2009) Simultaneous Foxp3 and IDO expression is associated with sentinel lymph node metastases in breast cancer. BMC Cancer, 9,231. 137. Munn, D.H., Sharma, M.D., Hou, D., Baban, B., Lee, J.R., Antonia, S.J., Messina, J.L., Chandler, P., Koni, P.A., Mellor, A.L. (2004). Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase by plasmacytoid dendritic cells in tumor-draining lymph nodes. Journal of Clinical Investigation, 114(2),280-290. 138. Berdowska, A., Zwirska-Korczala, K. (2001). Neopterin measurement in clinical diagnosis. Journal of clinical pharmacy and therapeutics, 26(5),319–329. 139. Fuchs, D., Baier-Bitterlich, G., Wede, I., Wachter, H. (1997). Reactive oxygen radicals and apoptosis. In: Scandolis J, editor. Oxidative stress and molecular biology of antioxidant defences. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, (34),139–167. 140. Murr, C., Bergant, A., Widschwendter, M., Heim, K., Schröcksnadel, H., Fuchs, D.(1999). Neopterin is an independent prognostic variable in females with breast cancer. Clinical Chemistry, 45(11),1998-2004. 141. Reibnegger, G.J., Bichler, A.H., Dapunt, O., Fuchs, D.N., Fuith, L.C., Hausen, A., Hetzel, H.M., Lutz, H., Werner, E.R., Wachter, H. (1986). Neopterin as a 99 prognostic indicator in patients with carcinoma of the uterine cervix. Cancer Research, 46(2),950-955. 142. Reibnegger, G., Hetzel, H., Fuchs, D., Fuith, L.C., Hausen, A., Werner, E.R., Wachter, H. (1987). Clinical significance of neopterin for prognosis and followup in ovarian cancer. Cancer Research, 47(18),4977-4981. 143. Murr C, Fuith LC, Widner B, Wirleitner B, Baier-Bitterlich G, Fuchs D. (1999). Increased neopterin concentrations in patients with cancer: indicator of oxidative stress? Anticancer Research,19,1721–1728. 144. Holliday R. (1987). The inheritance of epigenetic defects. Science, 238,163170. 145. Terry, M.B., Delgado-Cruzata, L., Vin-Raviv, N., Wu, H.C., Santella, R.M. (2011). DNA methylation in white blood cells: association with risk factors in epidemiologic studies. Epigenetics, 6(7),828-837. 146. Herman, J.G., Baylin, S.B. (2003). Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. The New England Journal of Medicine, 349, 20422054. 147. Weber, M., Hellmann, I., Stadler, M.B., Ramos, L., Pääbo, S., Rebhan, M., Schübeler, D. (2007). Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nature Genetics ,39,457466. 148. Jones, P.A., Baylin, S.B. (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nature Review Genetics, 3, 415-428. 149. Feinberg, A.P., Vogelstein, B. (1983). Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature, 301:89-92. 150. Greger, V., Passarge, E., Hopping, W., Messmer, E., Horsthemke, B. (1989). Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression of retinoblastoma. Human Genetics, 83,155-158. 151. Fraga, M.F., Herranz, M., Espada, J., Ballestar, E., Paz, M.F., Ropero, S., Erkek, E., Bozdogan, O., Peinado, H., Niveleau, A., Mao, J.H., Balmain, A., Cano, A., Esteller, M. (2004). A mouse skin multistage carcinogenesis model reflects the aberrant DNA methylation patterns of human tumors. Cancer Research, 64,5527-5534. 152. Shukeir, N., Pakneshan, P., Chen, G., Szyf, M., Rabbani, S.A. (2006). Alteration of the methylation status of tumor-promoting genes decreases prostate cancer cell invasiveness and tumorigenesis in vitro and in vivo. Cancer Research, 66,9202-9210. 153. Pakneshan, P., Szyf, M., Farias-Eisner, R., Rabbani, S.A. (2004). Reversal of the hypomethylation status of urokinase (uPA) promoter blocks breast cancer growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry, 279,31735-31744. 100 154. Ateeq, B., Unterberger, A., Szyf, M., Rabbani, S.A. (2008). Pharmacological inhibition of DNA methylation induces proinvasive and prometastatic genes in vitro and in vivo. Neoplasia , 10,266-278. 155. Chik, F., Szyf, M. (2011). Effects of specific DNMT gene depletion on cancer cell transformation and breast cancer cell invasion; toward selective DNMT inhibitors. Carcinogenesis , 32,224-232. 156. Pakneshan, P., Szyf, M., Farias-Eisner, R., Rabbani, S.A. (2004). Reversal of the hypomethylation status of urokinase (uPA) promoter blocks breast cancer growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry, 279,31735-31744. 157. Stefanska, B., Huang, J., Bhattacharyya, B., Suderman, M., Hallett, M., Han, Z.G., Szyf, M. (2011). Definition of the landscape of promoter DNA hypomethylation in liver cancer. Cancer Research , 71,5891-5903. 158. Dickinson, R.E., Dallol, A., Bieche, I., Krex, D., Morton, D., Maher, E.R., Latif, F. (2004). Epigenetic inactivation of SLIT3 and SLIT1 genes in human cancers. British Journal of Cancer , 91,2071-2078. 159. Berman, H., Zhang, J., Crawford, Y.G., Gauthier, M.L., Fordyce, C.A., McDermott, K.M., Sigaroudinia, M., Kozakiewicz, K., Tlsty, T.D. (2005). Genetic and epigenetic changes in mammary epithelial cells identify a subpopulation of cells involved in early carcinogenesis. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , 70,317-327. 160. Szyf, M. (2012). DNA methylation signatures for breast cancer classification and prognosis. Genome Medicine, 4(3),26. 161. Choi, J.Y., James, S.R., Link, P.A., McCann, S.E. Hong, C.C., Davis, W., Nesline, M.K. Ambrosone, C.B. and Karpf, A.R. (2009). Association between global DNA hypomethylation in leukocytes and risk of breast cancer. Carcinogenesis, 30(11),1889-1897. 162. Shiau, A.K., Barstad, D., Loria, P.M., Cheng, L., Kushner, P.J., Agard, D.A., Greene, G.L. (1998). The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell, 95, 927937. 163. Robinson, S.P., Parker, C.J., Jordan, V.C. (1990). Preclinical studies with toremifene as an antitumor agent. Breast Cancer Research and Treatment, 16,9-17. 164. Hortobagyi, G.N. (1998). Treatment of breast cancer. The New England journal of medicine, 339,974-984. 165. Yang, X., Philips, D.L., Ferguson, A.T., Nelson, W.G., Herman, J.G., Davidson, N.E. (2001). Synergic activaion of functional estrogen receptor (ER)-alpha by DNA methyltransferase and histone deacetylase inhibition in human ER-alphanegative breast cancer cells. Cancer Research, 61, 7025-7070. 101 166. Lapidus, R.G., Nass, S.J., Butash, K.A., Parl, F.F., Weitzman, S.A., Graff, J.G., Hermann, J.G., Davidson, N.E. (1998). Mapping of ER gene CpG island methylation-specific polymerase chain reaction. Cancer Research, 58, 25152519. 167. Bird, A.P. (1986). CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature, 321, 209-213. 168. Sasaki, M., Dharia, A., Oh, B.R., Tanaka, Y., Fujimoto, S., Dahiya, R. (2001). Progesterone receptor B gene inactivation and CpG hypermethylation in human uterine endometrial cancer. Cancer Research, 61, 97-102. 169. Sasaki, M., Tanaka, Y., Perinchery, G., Dharia, A., Kotcherguina, I., Fujimoto, S., Dahiya, R. (2002). Metylation and inactivation of estrogen, progesterone, and androgen receptors in prostate cancer. Journal of the National Cancer Institute, 94,384-390. 170. Mc Cormack, O., Chung, W.Y., Fitzpatrick, P., Cooke, F., Flynn, B., Harisson, M., Fox, E., Gallager, E., McGoldrick, A., Dervan, P.A., Mc Cann, A., Kerin, M.J. (2008). Progesterone receptor B (PRB) promoter hypermethylation in sporadic breast cancer: progesterone receptor B hypermethylation in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, 111,45-53. 171. Burden, S., Yarden, Y. (1997). Neuregulins and their receptors: a versatile signaling module in organogenesis and oncogenesis. Neuron, 18(6),847-855. 172. Slamon, D.J. (1987). Proto-oncogenes and human cancers. The New England journal of medicine, 317,955-957. 173. van de Vijver, M.J., Mooi, W.J., Peterse, J.L., Nusse, R. (1988). Amplification and over-expression of the neu oncogene in human breast carcinomas. European Journal of Surgical Oncology,14,111-114. 174. Freudenberg, J.A., Wang, Q., Katsumata, M. Drebin, J., Nagatomo, I., Greene, M.I. (2009). The role of HER2 in early breast cancer metastasis and the origins of resistance to HER2-targeted therapies. Experimental and Molecular Pathology, 87(1), 1-11. 175. Battaglia, F., Polizzi, G., Scambia, G., Rossi, S., Panici, P.B., Iacobelli, S., Crucitti, F., Mancuso, S. (1988). Receptors for epidermal growth factor and steroid hormones in human breast cancer. Oncology, 45,424-427. 176. Weigelt, B., Hu, Z., He, X., Livasy, C., Carey, L.A., Ewend, M.G., Glas, A.M., Perou, C.M., Van’t Veer, L.J. (2005). Molecular portrait and 70-gene prognosis signature are preserved throughout the metastatic process of breast cancer. Cancer Research ,65,9155-9158. 177. Benz, C.C., Scott, G.K., Sarup, J.C., Johnson, R.M., Tripathy, D., Coronado, E., Shepard, H.M., Osborne, C.K. (1992). Estrogen-dependent, tamoxifenresistant tumorigenic growth of mcf-7 cells transfected with her2/neu. Breast Cancer Research and Treatment, 24,85-95. 102 178. Shou, J., Massarweh, S., Osborne, C.K., Wakeling, A.E., Ali, S., Weiss, H., Schiff, R. (2004). Mechanisms of tamoxifen resistance: Increased estrogen receptor-her2/neu cross-talk in er/her2-positive breast cancer. Journal of National Cancer Institute, 96,926-935. 103 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : ARSLAN Mahmut Özhan Uyruğu : T.C. Doğum tarihi ve yeri : 04/03/1978 Merzifon Medeni hali : Bekâr Telefon : 0 (364) 6114420 Faks : 0 (364) 6115010 e-posta : ozhanarslan2@hotmail.com Eğitim Derecesi Okul/Program Yüksek lisans Gazi Üniversitesi /Eczacılık Fakültesi 2005 Lisans Gazi Üniversitesi/ Eczacılık Fakültesi 2000 Lise Samsun Anadolu Lisesi 1996 İş Deneyimi, Yıl Çalıştığı Yer Görev 2000- devam ediyor Güneş Eczanesi Eczacı MezuniyetMezuniyet yılı yılı Yabancı Dili İngilizce Yayınlar 1. Arslan M.Ö., Şimşek B., (2005). Hiperlipidemik Hastaların Serbest Eczacılık Yönünden İncelenmesi. Hobiler Gitar, Okçuluk, Kitap okuma, Masa tenisi
