meme kanserl hastalarda kem kl ğ m krometastazının flovs tometr

advertisement
T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
MEME KANSERLİ HASTALARDA KEMİK İLİĞİ
MİKROMETASTAZININ FLOVSİTOMETRİ
YÖNTEMİYLE BELİRLENMESİ VE DİĞER
PROGNOSTİK PARAMETRELERLE İLİŞKİSİ
Dr. Mustafa Salih AKIN
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. Berksoy ŞAHİN
ADANA - 2009
I
T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
MEME KANSERLİ HASTALARDA KEMİK İLİĞİ
MİKROMETASTAZININ FLOVSİTOMETRİ
YÖNTEMİYLE BELİRLENMESİ VE DİĞER
PROGNOSTİK PARAMETRELERLE İLİŞKİSİ
Dr. Mustafa Salih AKIN
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. Berksoy ŞAHİN
ADANA - 2009
II
TEŞEKKÜR
Tezimin hazırlanmasının her aşamasında bana yardımcı olan Hocam Prof. Dr.
Berksoy Şahin’e ve tüm Onkoloji Bilim Dalı çalışanlarına,
Flovsitometrik
değerlendirme
için
önemli
katkılarından
dolayı
Pediatri
İmmünoloji Bilim Dalı Öğretim Görevlisi Prof. Dr. Mustafa Yılmaz’a ve flovsitometri
laboratuarı çalışanları Hatice İrday ve Sibel Erkoç’a,
Önemli yardımlarını esirgemeyen Terapötik Aferez Ünitesinden Bio. Ferda
Tekinturhan’a,
Hastaların metastaz açısından değerlendirilmesinde yardımcı olan Nükleer Tıp
Arş. Gör. Evren Tümkaya’ya,
Patoloji Ana Bilim Dalından Doç. Dr. Melek Ergin ve patoloji çalışanlarına,
İstatistiksel değerlendirme konusunda yardımları için Doç. Dr. Gülşah Seydaoğlu
ve ekibine,
İç Hastalıkları Ana Bilim Dalındaki tüm hocalarıma ve çalışma arkadaşlarıma,
Sevgili Eşim ve Tüm Aileme, sabrı, desteği ve değerli katkılarından dolayı sonsuz
teşekkür ederim.
Dr. Mustafa Salih AKIN
Adana 2009
I
İÇİNDEKİLER
TEŞEKKÜR .................................................................................................................. I
İÇİNDEKİLER ............................................................................................................ II
TABLO LİSTESİ ..................................................................................................... IVV
ŞEKİL LİSTESİ ........................................................................................................ VV
KISALTMA LİSTESİ ................................................................................................ VI
ÖZET ................................................................................................................... VIVIII
ABSTRACT............................................................................................................. IXX
1. GİRİŞ VE AMAÇ .....................................................................................................1
2. GENEL BİLGİLER ...................................................................................................4
2.1. Tanım ve Epidemioloji .......................................................................................4
2.1.1. Etyoloji ve Risk Faktörleri ...........................................................................4
2.1.2. Meme Kanseri Patolojik Sınıflandırma .........................................................7
2.1.3. Meme Kanserinde Evreleme ........................................................................9
2.1.4. Meme Kanserinde Prognostik ve Prediktif Faktörler ..................................13
2.1.4.1. Aksiller Lenf Nodu Tutulumu .............................................................15
2.1.4.2. Tümör Boyutu .....................................................................................15
2.1.4.3. Tümörün Histolojik Tipi......................................................................16
2.1.4.4. Tümör Derecesi (Grade) .....................................................................17
2.1.4.5. Lenfovasküler İnvazyon ......................................................................17
2.1.4.6. Hormon Reseptörleri ...........................................................................17
2.1.4.7. Moleküler Prognostik Parametreler .....................................................18
2.1.4.7.1. Proliferatif Oran ...........................................................................18
2.1.4.7.2. Flovsitometri ................................................................................18
2.1.4.7.3. Kİ-67 ............................................................................................18
2.1.4.7.4. Timidin Bağlama İndeksi (TBI) ....................................................19
2.1.4.7.5. DNA İçeriği..................................................................................19
2.1.4.8. HER-2 (epidermal growth factor receptor-2, c-erb-B2) ........................19
2.1.4.9. Siklin E ve p27 ....................................................................................20
2.1.4.10. P53 Gen Analizi ................................................................................20
2.1.4.11. Anjiyogenez Markerleri ....................................................................21
2.1.4.12. Katepsin D ........................................................................................21
2.1.4.13. Ürokinaz Plazminojen Aktivatör Sistem ............................................21
2.1.4.14. Tümör Markerleri ..............................................................................22
2.1.4.15. Multiparametreli Gen Ekspresyon Analizi .........................................22
2.2. Meme Kanserinde Kemik İliği Mikrometastazının Prognostik Önemi ...............24
2.2.1. Kemik İliği Mikrometastazının Tanımı ve Erken Metastatik Hastalığın
Biyolojisi .............................................................................................................24
2.2.2. Mikrometastazın Prognostik ve Klinik Önemi ............................................31
2.2.3. Mikrometastazın Klinik ve Tedaviye Yanıtın İzlenmesindeki Yeri .............32
2.2.4. Mikrometastatik Kanser Hücrelerinin Moleküler ve Fonksiyonel
Tanımlaması ........................................................................................................35
2.2.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle İlgili Gen Ekspresyon Paternleri ve
Yolaklar...............................................................................................................36
2.2.6. Kemik İliği Mikrometastazının Belirlenmesi İçin Kullanılan Yöntemler ....38
2.2.6.1. İmmünositokimyasal Yöntemler ..........................................................40
II
2.2.6.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ....................................................42
2.2.6.3. Enzim-Bağlı İmmunospot (ELİSPOT) Teknolojisi ..............................44
2.2.6.4. Flovsitometrik Yöntem ........................................................................45
2.2.7. Çalışmamızda Kullandığımız Markerler.....................................................46
2.2.7.1. Sitokeratinler .......................................................................................46
2.2.7.1.1. Sitokeratin 4 .................................................................................47
2.2.7.1.2. Sitokeratin 6a ...............................................................................48
2.2.7.1.3. Sitokeratin 8 .................................................................................49
2.2.7.1.4. Sitokeratin 10 ...............................................................................49
2.2.7.1.5. Sitokeratin 18 ...............................................................................50
2.2.7.2. Epitelyal Hücre Adezyon Molekülü (EpCAM) ....................................51
2.2.7.3. CD24 ..................................................................................................52
2.2.7.4. CD44 ..................................................................................................53
2.2.7.5. CD45 ..................................................................................................53
2.2.8. Meme Kanseri Kök Hücresi Kavramı .........................................................53
2.2.9. Dolaşımdaki Tümör Hücreleri (CTC) .........................................................55
3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................................57
3.1. Hasta Seçimi ve Klinik Evreleme......................................................................57
3.2. Kemik İliği Hazırlanması ..................................................................................57
3.3. Flovsitometrik Değerlendirme ..........................................................................58
3.4. İstatistiksel Analiz ............................................................................................59
4. BULGULAR ...........................................................................................................60
4.1. Kemik İliği Mikrometastazı İle Cinsiyet İlişkisi ................................................60
4.2. Kemik İliği Mikrometastazı İle Yaş İlişkisi .......................................................61
4.3. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Boyutu İlişkisi ......................................62
4.4. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenf Nodu Metastazı Arasındaki İlişki .............63
4.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Alt Tipi Arasındaki İlişki ......................65
4.6. Kemik İliği Mikrometastazı İle Evre Arasındaki İlişki ......................................65
4.7. Kemik İliği Mikrometastazı İle Östrojen Reseptör Durumu Arasındaki İlişki ....66
4.8. Kemik İliği Mikrometastazı İle Progesteron Reseptör Durumu Arasındaki
İlişki ........................................................................................................................67
4.9. Kemik İliği Mikrometastazı İle c-erb-B2 Durumu Arasındaki İlişki ..................68
4.10. Kemik İliği Mikrometastazı İle Histolojik Grade Arasındaki İlişki .................69
4.11. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenfovasküler İnvazyon Arasındaki İlişki ......70
4.12. Kemik İliği Mikrometastazı İle Menopozal Durum Arasındaki İlişki ..............71
4.13. Kemik İliği Mikrometastazı İle DCİS Komponenti Arasındaki İlişki ...............71
4.14. Kemik İliği Mikrometastazı İle Kemik İliği Biyopsisinde İmmünohistokimyasal
Yöntemle Gösterilmiş Kemik İliği Metastazı Arasındaki İlişki ................................72
4.15. Kemik İliği Mikrometastazı İle Karaciğer Metastazı Arasındaki İlişki.............73
4.16. Kemik İliği Mikrometastazı İle Serebral Metastaz Arasındaki İlişki ................73
4.17. Kemik İliği Mikrometastazı İle Akciğer Metastazı Arasındaki İlişki ...............74
4.18. Kemik İliği Mikrometastazı İle Kemik Metastazı Arasındaki İlişki .................74
5. TARTIŞMA ............................................................................................................77
6. SONUÇ VE ÖNERİLER .........................................................................................95
7. KAYNAKLAR........................................................................................................97
ÖZGEÇMİŞ .............................................................................................................. 126
III
TABLO LİSTESİ
Tablo No
Sayfa No
Tablo 1. Meme kanseri evrelerinin gruplandırılması .......................................................................... 13
Tablo 2. Meme kanserinde evreye göre 5 yıllık sağkalım oranları ..................................................... 14
Tablo 3. Tümör çapı ile aksiller lenf nodu tutulumu arasındaki ilişki ............................................... 16
Tablo 4. Tümör boyutu ile meme kanseri prognozu arasındaki ilişki ............................................... 16
Tablo 5. Erken evre meme kanserli hastalarda immünositokimyasal yöntemle belirlenmiş kemik
iliği mikrometastazlarının prognozla ilişkisi ........................................................................................ 33
Tablo 6. Meme kanserli hastalarda kemik iliğinde, kanda ve lenf nodlarında minimal rezidüel
hastalık ile ilgili çalışmaların özeti ........................................................................................................ 39
Tablo 7. Hastaların genel özellikleri ...................................................................................................... 61
Tablo 8. Kemik iliği mikrometastazı ile cinsiyet ilişkisi ...................................................................... 62
Tablo 9. Kemik iliği mikrometastazı ile yaş ilişkisi .............................................................................. 62
Tablo 10. Kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu ilişkisi .......................................................... 64
Tablo 11. Kemik iliği mikrometastazı ile metastatik lenf nodu sayısı arasındaki ilişki .................... 64
Tablo 12. Lenf nodu veya uzak metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki ...65
Tablo 13. Kemik iliği mikrometastazı ile evre arasındaki ilişki.......................................................... 66
Tablo 14. Kemik iliği mikrometastazı ile östrojen reseptör durumu arasındaki ilişki ..................... 67
Tablo 15. Kemik iliği mikrometastazı ile progesteron reseptör durumu arasındaki ilişki............... 68
Tablo 16. Kemik iliği mikrometastazı ile c-erb-B2 durumu arasındaki ilişki ................................... 69
Tablo 17. Kemik iliği mikrometastazı ile histolojik Grade arasındaki ilişki ...................................... 70
Tablo 18. Kemik iliği mikrometastazı ile lenfovasküler invazyon arasındaki ilişki .......................... 70
Tablo 19. Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki .................................. 71
Tablo 20. Kemik iliği mikrometastazı ile DCİS komponenti arasındaki ilişki .................................. 72
Tablo 21. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik iliği biyopsisinde immünohistokimyasal yöntemle
gösterilmiş kemik iliği metastazı arasındaki ilişki ............................................................................... 72
Tablo 22. Kemik iliği mikrometastazı ile karaciğer metastazı arasındaki ilişki ............................... 73
Tablo 23. Kemik iliği mikrometastazı ile serebral metastaz arasındaki ilişki ................................... 74
Tablo 24. Kemik iliği mikrometastazı ile akciğer metastazı arasındaki ilişki ................................... 74
Tablo 25. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik metastazı arasındaki ilişki ..................................... 75
Tablo 26. Klinik değişkenlere göre kemik iliği mikrometastazı prevalansı ....................................... 75
IV
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No
Sayfa No
Şekil 1. A45B/B3 monoklonal antikoru ile immünositokimyasal olarak boyanmış tek ve grup
halinde bulunan mikrometastatik hücreler .......................................................................................... 26
Şekil 2. Apopitotik ve nonapopitotik mikrometastatik hücreler ....................................................... 27
Şekil 3. Flovsitometride pozitif bulunmuş mikrometastatik hücreler ................................................ 60
V
KISALTMA LİSTESİ
AgNOR
APAAP
AJCC
ASCO
ATM
BCSS
bFGF
βhCG
BRCA
BrdU
CDK
CEA
CGH
CK
CMF
CTC
COX
CXCR
DCİS
DDFS
DFS
DMSO
DNA
DTC
EDTA
EGF
EGFR
ELİSA
ELİSPOT
EMA
EpCAM
ER
FITC
FİSH
GEP
GF
H&E
HER2
HIF-1a
IGF-1
İDK
İHK
İLK
İMA
İSK
: Argyrophilic nucleolar organizer regions
: Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase
: American Joint Commitee on Cancer
: American Society of Clinical Oncology
: Ataxia telangiectasia mutated
: Meme kanseri spesifik sağkalım
: Basic fibroblast growth factor
: β-human koryonik gonadotropin
: Meme kanseri (Breast cancer)
: Bromodeoksiüridin
: Siklin bağımlı kinazlar
: Karsino embriyonik antijen
: Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon
: Sitokeratin
: Siklofosfamid-metotreksat-florourasil)
: Dolaşımdaki tümör hücreleri
: Siklo-oksijenaz
: Chemokine receptor
: İn situ duktal karsinom
: Uzak metastazsız hastalıksız sağkalım
: Hastalıksız sağkalım
: Dimetil sülfoksit
: Deoksiribonükleik asit
: Dissemine tümör hücreleri
: Etilen diamin tetra asetik asit
: Epidermal Growth Factor
: Epidermal Growth Factor Receptor
: Enzyme-linked immunosorbent assay
: Enzim-bağlı immunospot
: Epitelyal membran antijen
: Epitelyal hücre adezyon molekül
: Östrojen reseptörü
: Fluorescein isothiocyanate
: Fluorescence in situ hybridization
: Gen ekspresyon profili
: Büyüme faktörü
: Hematoksilen&Eozin
: Human Epidermal growth factor Receptor 2
: Hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 alfa
: Insulin-like growth factor 1
: İnvaziv duktal karsinom
: İmmünohistokimya
: İnvaziv lobüler karsinom
: İmmünomanyetik ayırma
: İmmünositokimya
VI
İTH
Kİ
LCIS
MAM
MHC-1
MORE
MP-FCM
MRD
MUC-1
NSAİİ
OTC
OS
PAI
PBS
PCNA
PEM
Pgp-1
Pİ
PR
PTEN
RT-PCR
TAG12
TBI
TIMP
TNM
uPA
VEGF
WHO
: İzole tümör hücreleri
: Kemik iliği
: İn situ lobüler karsinom
: Mammaglobin
: Major histocompatibility complex-1
: Multiple Outcomes of Raloksifen Evaluation
: Çok parametreli flovsitometri
: Minimal rezidüel hastalık
: Müsin-1
: Nonsteroid anti-inflamatuar ilaçlar
: Occult tumor cells (Gizli tümör hücreleri)
: Toplam sağkalım
: Plazminojen aktivatör inhibitör
: Phosphate buffered saline
: Proliferating Cell Nuclear Antigen
: Polimorfik epitelyal müsinlerin
: Fagositik glikoprotein-1
: Propidyum iyodit
: Progesteron reseptörü
: Phosphatase and Tensin homolog
: Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu
: Tümör-ilişkili glikoprotein
: Timidin bağlama indeksi
: Metaloproteinazların doku inhibitörleri
: Tümör boyutu-Lenf nodu -Metastaz
: Ürokinaz plazminojen aktivatör
: Vasküler endotelyal growth faktör
: Dünya Sağlık Örgütü
VII
ÖZET
Meme Kanserli Hastalarda Kemik İliği Mikrometastazlarının Flovsitometri
Yöntemiyle Belirlenmesi ve Diğer Prognostik Parametrelerle İlişkisi
Amaç: Meme kanserli hastalarda gizli metastatik hücrelerin araştırılması oldukça
önemlidir, çünkü tümör hücrelerinin erken yayılımı uzak organlarda relapsın ve
kanserden ölümün önemli nedenlerinden biridir. Meme kanserinde kemik iliği
mikrometastazlarının immünositokimyasal yöntemle bulunmasının, prognostik bir
marker olduğu rapor edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, kemik iliğindeki mikroskobik
depozitlerin belirlenmesi ve sayılması için, objektif bir metot olarak flovsitometrinin
potansiyel
avantajlarını
değerlendirmek
ve
meme
kanserli
hastalarda
mikrometastazların prevalansı ve niceliğini belirlemektir. Bu çalışmada meme kanserli
hastalarda kemik iliğindeki mikrometastazlar ile prognostik parametreler (yaş,
menopozal durum, tümör büyüklüğü ve lenf nodu tutulumu) ve immünohistokimyasal
belirleyiciler ve intraduktal komponent (DCİS) arasındaki ilişki araştırıldı.
Gereç ve Yöntem: Evre I-IV meme kanserli 52 ve epitelyal kanseri olmayan 16
hastadan üst iliak çıkıntıdan kemik iliği aspirasyonu yapıldı. Tüm hastalarda akciğer
grafisi, karın ultrasonografisi ve tüm vücut kemik taraması ile uzak organ metastaz
varlığı araştırıldı. Epitelyal hücreler, anti-sitokeratin monoklonal antikor ve hem
propidyum iyodit hem de CD45 ile çift boyanarak bulundu. Hücreler (105 hücre)
flovsitometri ile analiz edildi.
Bulgular: Onaltı kontrol hastasının ikisinde (yüzde 12,5), 52 meme kanserli
hastanın 11’inde (yüzde 21) kemik iliğinde sitokeratin-18 pozitif hücreler bulundu.
Kemik iliğinde gizli metastatik hücrelerin varlığı lenf nodu metastazı varlığı veya
yokluğu, tümör boyutu, evre, menopozal durum, hormon reseptör durumu, histolojik
grade, c-erb-B2 ekspresyonu, tümör alt-tipi, lenfovasküler invazyon, DCİS komponenti
ve cinsiyet ile ilgisizdi. Hastaların yaş ortalaması 49,1 (en az 27, en çok 82) idi. Kırkdört hastada histolojik olarak tanı konmuş invaziv duktal karsinom mevcuttu. Yirmisekiz hasta premenopozal ve 22 hasta postmenopozal idi. Yirmi-bir hastada tümör çapı
2 cm.den küçük iken, 24 hastada 2-5 cm aralığında ve 6 hastada da 5 cm.den büyüktü.
Yirmi-iki hastada koltuk altında lenf nodu metastazı saptanmazken, 9 hastada 1-4 arası,
12 hastada 4-9 arası ve 11 hastada 9’un üzerinde lenf nodu metastazı saptandı. ER 40
hastada ve PR 35 hastada pozitifti. C-erb-B2 ekspresyonu 38 hastada pozitifti. Dört
hastada grade 1, 22 hastada grade 2 ve geri kalan 26 hastada da grade 3 tümör saptandı.
DCİS 25 hastada bulundu. Pozitif CK-4 ekspresyonu bir hastada, EpCAM ekspresyonu
3 hastada görüldü. Kemik iliği mikrometastazları ile yaş, kemik, kemik iliği, akciğer ve
karaciğer metastazları arasında anlamlı ilişki vardı.
Sonuç: Sonuç olarak meme kanserli hastalarda kemik iliği mikrometastazları yaş
ve kemik, kemik iliği, akciğer ve karaciğer metastazları ile ilişkilidir.
Anahtar kelimeler: meme kanseri, kemik iliği, mikrometastaz, flovsitometri,
sitokeratin
VIII
ABSTRACT
Detection of Bone Marrow Micrometastases in Breast Cancer Patients with Flow
cytometry Method and Correlation with Other Prognostic Parameters
Purpose: The search for occult metastatic cells in patients with breast cancer is of
considerable importance, because early dissemination of tumor cells is one of the
leading causes of relapse at distant sites and of death from cancer. Immunocytochemical
detection of bone marrow micrometastases has been reported as a prognostic marker in
breast cancer. The aim of this study were to evaluate the potential advantage of flow
cytometry as an objective method of identifying and quantifying micrometastatic
deposits within bone marrow and to determine the prevalence and quantity of
micrometastases in patients with breast cancer. In this study was investigate the
correlation of bone marrow micrometastases with prognostic parameters (age,
menopausal status, tumor size, and lymph node involvement), immunohistochemical
markers and intraductal component (DCİS).
Matherial and Methods: We obtained bone marrow aspirates from upper iliac
crests of 52 patients with stage I-IV breast cancer and 16 patients without epithelial
cancer. All patients were evaluated for the presence of distant metastases with chest Xray, abdominal ultrasound, and whole body bone scan. Epithelial cells were detected by
dual staining with monoclonal anti-cytokeratin and both propidium iodide and CD45.
The cells were analyzed (105 events) using on flow cytometer.
Results: Cytokeratin-18 positive cells were detected in the bone marrow
specimens of 2 of the 16 control patients without epithelial cancer (12.5 percent) and 11
of the 52 patients with breast cancer (21 percent). The presence of occult metastatic
cells in bone marrow was unrelated to the presence or absence of lymph-node
metastasis, tumour size, stage, menopausal status, hormone receptor status, histologic
grade, expression of c-erb-B2, tumor subtype, lymphovascular invasion, intraductal
component (DCİS) and sex. Mean age of the study subjects was 46.6 (min 27 and max
82). Forty-four patients had invasive ductal carcinoma proven histologically. Twentyeight patients were premenopausal and 22 were postmenopausal. Tumor size was less
than 2 cm in 21, 2 to 5 cm in 24, and larger than 5 cm in 6 patients. In 22 subjects axilla
was free of lymphatic metastases, 1 to 4 nodal involvement was detected in 9, 4 to 9
nodal metastases was observed in 12, and more than 9 nodal metastases was detected in
11 women. ER was positive in 40, and PR was positive in 35 subjects. Expression of cerbB2 was positive in 38. Four cases had grade I tumor, 22 had grade II, and the
remaining 26 had grade III tumor. DCİS was detected in 25 cases. Positive CK-4
expression was detected in one patient and EpCAM exspression in 3 patients. Bone
marrow micrometastases significantly correlated with age and metastases in bone, bone
marrow, lung and liver.
Conclusion: It is concluded that bone marrow micrometastases correlates with the
age and metastases in bone, bone marrow, lung and liver in breast carcinoma patients.
Keywords: Breast cancer, bone marrow, micrometastases, flow cytometer, cytokeratin
IX
1. GİRİŞ VE AMAÇ
Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen kanserdir ve akciğer kanserinden sonra,
kansere bağlı ölümlerin ikinci en sık sebebidir. Yaşam boyu her dokuz kadından birisi,
invaziv meme kanseri gelişme riskine sahiptir.1 Dünya genelinde, her yıl yaklaşık 1
milyon yeni vaka bildirilmekte, her yıl 400.000 kadın hastalıktan kaybedilmektedir.2
Özellikle son iki dekatda meme kanserinin öncelikle tanısında ve bunu izleyerek
tedavisinde yaşanan bilgi değişiklikleri ve ilerlemeler; hastaların sağkalımlarına,
hastalıksız yaşama sürelerine önemli katkılarda bulunmuştur. Tedavi yöntemlerinin
artması, özellikle de meme kanserinin tanısından itibaren sistemik bir hastalık olarak
algılanmaya başlaması ile “neo-adjuvan” ve “adjuvan sistemik” tedaviler gündeme
girmiş ve bu tedavilerin hangi hastalara uygulanacağı sorusunu da beraberlerinde
getirmişlerdir. Böylece hastalar evrelendirilmeye başlanmış, sağkalımla ilgili prognostik
faktörler bulunmuş, bunların klinik gözlem ve tedavilere uygulanması sağlanmıştır.2
Operabl meme kanserli hastalarda uzak metastaz riski; primer tümörün boyutu,
aksiller lenf nodu tutulumu ve primer tümör markerleri gibi prognostik göstergelerle
korelasyon göstermektedir. Aksiller lenf nodu negatif hastalarda; tümör boyutu, HER2
pozitifliği, hormon reseptör durumu, lenfovasküler invazyon ve yüksek histolojik grade
gibi faktörler, sistemik tedavi ihtiyacını ve rekürrens riskini belirlemek için
kullanılmaktadır. Buna rağmen, lokalize hastalığı olan ve aksiller lenf nodu metastazı
olmayan meme kanserli hastaların yaklaşık % 25’inde sistemik relaps gelişmekte; buna
karşın aksiller lenf nodu metastazı olan hastaların en az % 30’unda primer tedaviyi takip
eden 5-10 yıl içinde relaps gelişmemektedir.2 Bu gözlemler, tümör yayılımının önemli
bir bölümünün, lenfojen yol ile birlikte ve bazı vakalarda lenfojen yoldan bağımsız
olarak hematojen yolla olabileceğini akla getirmiştir. Aksiller lenf nodu negatif meme
kanseri
hastalarının
%
20-40’ında
kemik
iliğinde
mikrometastatik
hücreler
saptanmaktadır. Günümüzde kullanılan prognostik faktörlerin, hastaların relaps riskini
yeterli doğrulukla belirleyememesi nedeniyle, yeni prognostik parametrelere ihtiyaç
vardır. Bu nedenle, metastaz gelişiminden önce kemik iliği mikrometastazlarının
değerlendirilmesi ile daha doğru risk sınıflaması yapılabilir ve bu hücrelerin ortadan
kaldırılması için ek konvansiyonel veya bu hücreleri hedefleyen yeni biyolojik tedaviler
kullanılabilir.
1
Solid epitelyal tümörlerde, kemik iliği mikrometastazı kavramı 30 yıl önce ortaya
atılmıştır. Metastatik kaskatın ilk basamağında lokal olarak tümör hücre invazyonu
meydana gelmekte, bunu takiben lokal lenf nodlarına veya kan dolaşımı yoluyla ikincil
organlara yayılım gerçekleşmektedir. Tümör hücreleri ikincil organlarda ya apopitozise
uğramakta ya da immün sistem tarafından ortadan kaldırılmaktadır. Hayatta kalanlar ise
metastatik lezyonlar için potansiyel prekürsörlerdir. Mikrometastaz, primer tümörden
uzak organlara yayılan tümör hücrelerinin, çapı 2 mm.den küçük mikroskobik
metastatik depozitleri olarak tanımlanmaktadır. Tümör gelişiminin olasılıkla erken
döneminde meydana gelen mikrometastatik yayılım; kan, lenf nodları veya kemik
iliğine olabilmekte; kemik iliği primer tümörden köken alan mikrometastatik hücrelerin
en sık yayıldığı organ olarak kabul edilmektedir. Günümüzde tümör evreleme
yöntemleri genellikle manifest uzak metastazları içermektedir, fakat uzak organlarda tek
tek mevcut olan tümör hücrelerini içermemektedir. Metastazın başlangıcında erken
dönemde tespit edilmesi, metastatik tümör yükünün daha küçük olması ve
kemoterapötik ajanlara solid metastazlardan daha duyarlı olmaları nedeniyle önemlidir.
Mikrometastatik hücreler G0 fazında dormant halde olmalarına rağmen, yeniden
prolifere olabilme, büyüme ve metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle
kanser rekürrensi için her zaman potansiyel bir tehdit oluştururlar. Erken evre
hastalarda, konvansiyonel yöntemlerle gösterilemeyen gizli metastatik hücreler, uzak
metastaz gelişimi ve kanser ilişkili ölümün en önemli nedenidir. Daha önceleri meme
kanserinin ilk olarak lenf nodlarına metastaz yaptığı düşünülürken, günümüzde lokalize
meme kanserli hastaların yaklaşık % 50’sinde hematojen yayılımın olduğu ileri
sürülmektedir. Bu nedenle, primer lokorejyonel tedaviden önce kemik iliği
mikrometastazının değerlendirilmesi, rekürrens riski yüksek hastaların belirlenmesi,
adjuvan-neoadjuvan tedavi kararı ve tedaviye cevabın izlenmesi açısından önemlidir.
Tek merkezli, önemli sayıda hastayı kapsayan ve yeterli izlem süresi olan
çalışmaların çoğunda, kemik iliği mikrometastazı ile prognoz arasındaki ilişki
gösterilmiştir. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan 4703 hastayı kapsayan bir
meta-analizde; evre I-II ve III operabl meme kanseri hastalarda, immünositokimyasal
yöntemlerle saptanan kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 olarak bildirilmiştir. Bu
hastalarda çok değişkenli analizde, kemik iliği mikrometastazları diğer prognostik
faktörlerden bağımsız olarak, azalmış genel ve meme kanseri spesifik sağkalım
2
oranlarıyla ilişkili bulunmuştur.3 Bununla beraber, prognozla ilişkisi gösterilemeyen
çalışmalar da vardır. Kemik iliği aspirasyon teknikleri, materyallerin hazırlanması,
kullanılan antikorlar, zenginleştirme yöntemlerinin kullanılıp kullanılmaması, analiz
edilen hücre sayıları, hastaların evreleri ve takip süreleri arasındaki farklılıklar
nedeniyle çelişkili sonuçlar ortaya çıkmaktadır. Kemik iliği mikrometastazının
prognostik önemine ek olarak, tümör hücrelerinin varlığının tedavi sonrası
değerlendirilmesi, gelecekte tedavinin etkinliğinin izlenmesi için bir araç olabilir.
Meme ve diğer solid tümörlerde kemik iliği mikrometastazlarını belirlemek için
birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Lenf nodları, kan ve kemik iliğinde çok az sayıda ve
tek tek bulunan bu hücreleri bulabilmek için sensitif immünositokimyasal,
flovsitometrik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Kullanılan yöntem, kanser
hücrelerini normal hematopoietik hücrelerden ve kemik iliği alınırken ciltten kontamine
olan epitelyal hücrelerden ayırt edebilmelidir. Ancak kullanılan çoğu yöntemin
duyarlılığı ve özgüllüğü düşüktür.
Flovsitometrik yöntem, kan ve kemik iliğindeki göreceli olarak çok az sayıdaki
kanser hücrelerini bulmak için geliştirilmiştir. Bu yöntem özellikle 106 hücre içinde tek
bir hücreyi belirleyebilecek duyarlılığa sahip olduğu rapor edilmiştir, ancak bu
duyarlılık tüm çalışmalarda gösterilememiştir. Flovsitometri immünositokimyasal
yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek duyarlılıkla tümör yükünü belirlemek için
kantitatif ölçümlerin yapıldığı, rezolüsyonu iyi, hızlı, tekrar edilebilir ve istatistiksel
olarak daha güvenilir bir yöntemdir. Günlük pratikte kullanılabilirliği, hızlı sonuç
alınabilmesi ve ilgili çalışmaların çok az sayıda olması nedeniyle flovsitometri
yöntemini kullandık. Çalışmamızda, evre I-IV meme kanserli 52 hastada kemik iliği
mikrometastazı prevalansı, sitokeratin pozitif hücrelerin meme kanseri kök hücresi ile
benzerliği
ve
bu
hücrelerde
çeşitli
sitokeratinlerin
ekspresyon
paternlerinin
değerlendirilmesi amaçlandı. Kemik iliğinde sitokeratin pozitif hücre varlığı ile
konvansiyonel prognostik parametreler (yaş, menopozal durum, tümör büyüklüğü ve
lenf nodu tutulumu) ve immünohistokimyasal belirleyiciler arasındaki ilişki araştırıldı.
Kontrol grubu olarak, epitelyal malignensisi olmayan, remisyonda lösemi ve lenfoma
tanısı olan 16 hastadan kemik iliği aspirasyonu alındı. Bu hastalarda yanlış pozitifliğin
değerlendirilmesi amaçlandı.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Tanım ve Epidemioloji
Meme kanseri, memenin duktus veya lobüllerini örten epitelyal hücrelerin malign
proliferasyonudur. Kadınlarda en sık görülen kanserdir ve akciğer kanserinden sonra,
kansere bağlı ölümlerin ikinci en sık sebebidir. Kadınlarda görülen kanserlerin üçte
birinden sorumludur. Erken tanı yöntemlerinin gelişmesi ve artan tedavi seçenekleri
nedeniyle meme kanseri mortalitesi azalmaktadır.¹ Ayrıca, ER/PR (östrojen/progesteron
reseptörü) pozitif meme kanseri sıklığı, erken evre meme kanseri, invaziv lobüler meme
kanseri ve intraduktal karsinom (invaziv olmayan) görülme sıklığı da artmıştır. Dünya
genelinde, her yıl yaklaşık 1 milyon yeni vaka bildirilmekte, her yıl 400.000 kadın
hastalıktan kaybedilmektedir. Genel olarak gelişmiş ülkelerde daha yüksek insidansa
sahiptir. 2007 yılında Amerika Birleşik Devletlerinde 180.000 kadın meme kanseri
tanısı almış ve yaklaşık 40.000 kadın hastalıktan kaybedilmiştir. Yaşam boyu her dokuz
kadından birisi, invaziv meme kanseri gelişme riskine sahiptir.²
2.1.1. Etyoloji ve Risk Faktörleri
Meme kanserinin nedenleri hala bilinmemektedir. Epidemiyolojik çalışmalarda
tanımlanmış birçok risk faktörü vardır. Meme kanseri hormon bağımlı bir hastalıktır.
Östrojenlerin, meme epitelindeki proliferatif etkisi, daha sonra DNA (deoksiribonükleik
asit)’nın hatalı replikasyonu olasılığını artırarak mutasyonlara yol açabilmektedir.
Bilinen birçok risk faktörü, endojen veya egzojen östrojen uyarısının süresi ve seviyesi
ile ilişkilidir. Premenopozal kadınlarda; erken menarş, düzenli ovülasyon ve geç
menopoz; postmenopozal kadınlarda ise obesite ve hormon replasman tedavileri
östrojen maruziyetini artıran faktörlerdir. Menarşta her 2 yıllık gecikme, risk oranında
% 10 azalmaya yol açmaktadır.4 45 yaşından önce menopoza girenlerin meme kanseri
riski, 55 yaşından sonra menopoza girenlerden % 50 oranında daha azdır. Menopozda
her 1 yıllık gecikme, meme kanseri riskini % 1,03 artırmaktadır. 40 yaş öncesi bilateral
ooferektomi, yaşam boyu meme kanseri gelişme riskini % 50 azaltmaktadır.
Premenopozal over kaynaklı olan östrojen, postmenopozal dönemde, periferik yağ
dokuda androjenlerden aromataz enzimi aracılığı ile oluşturulur.4 Yaşamın her
döneminde egzojen östrojenler özellikle postmenopozal dönemde riski arttırmaktadır.
4
Gebelik, meme dokusunun somatik mutasyonlara duyarlılığını azaltır; böylece ilk
gebeliğin erken yaşta olması, duyarlılık periyodunu kısaltmaktadır. Gebelik, özellikle
erken yaşta ve sayıca çok olanlarda, riski azaltırken, ilk gebeliğini 30 yaşından sonra
yapanlarda veya hiç doğum yapmayanlarda risk artmıştır.4
İnsanlarda ve hayvanlarda endojen ve egzojen östrojen kullanımının meme
kanserine yol açtığı gösterilmiştir. Anti-östrojenik tedaviler (tamoksifen, kastrasyon)
meme kanseri gelişimini azaltmaktadır, ancak meme kanseri riskindeki azalma ile
serum östradiol seviyeleri arasındaki korelasyon, hormon seviyelerinin değişkenlik
göstermesi nedeni ile tutarlı bulunamamıştır. Premenopozal hastalarda serum östrojen
düzeyleri gebelik ve adet dönemlerinde belirgin dalgalanmalar göstermektedir.
Postmenopozal kadınlarda, meme kanseri riski ile hormon seviyeleri arasındaki ilişki
daha tutarlıdır. Yapılan 9 prospektif çalışmada, östrojen düzeyleri ile meme kanseri
riskindeki artış açıkça gösterilmiştir. MORE (Multiple Outcomes of Raloksifen
Evaluation) çalışmasında serum östrojen düzeyi yüksek olanlarda (>12 pmol/L) düşük
olanlara göre meme kanseri riskinde 2 kat artış olduğu belirlenmiştir.11 Ayrıca, daha
yüksek östradiol seviyelerine sahip kadınlarda, düşük östradiol seviyesi olan kadınlara
göre daha fazla risk azalması sağlamaktadır.5
Büyüme promoterleri (transforme edici GF, epidermal GF, trombositten derive
GF, fibroblast GF) ve büyüme faktör inhibitörleri meme kanser hücreleri tarafından
salgılanır ve bunlar tümör progresyonunun otokrin mekanizmalarında görev alırlar. Bu
büyüme faktörlerinin oluşumu östrojene bağımlıdır ve dolaşan hormonlar, kanser
hücrelerince salgılanan hormon reseptörleri ve tümör hücreleri tarafından oluşturulan
otokrin büyüme faktörleri arasındaki etkileşimlerin meme kanser progresyonunda görev
aldığını düşündürmektedir.5,6
Yaş en önemli risk faktörlerinden birisidir. Yaş ilerledikçe, özellikle 45-50 yaş
sonrası meme kanseri insidansı artmaktadır. Meme kanseri, kadınlarda erkeklerden 100
kat daha sık görülmektedir. Daha iyi sosyoekonomik şartlara sahip Kuzey Amerika ve
Kuzey Avrupa toplumlarında meme kanseri görülme sıklığı 2 kat artmıştır. Etnik olarak
farklı toplulukları barındıran aynı popülasyonda da, meme kanseri görülme insidansı
farklılıklar göstermektedir. Beyaz ırk, siyah ırka göre daha yüksek riske sahiptir. Ancak
siyah ırkta, daha ileri evrede tanı almaları nedeniyle mortalite oranları daha yüksektir.2
5
Meme kanserlerinin yaklaşık % 5-10’u doğrudan genetik faktörlerle ilişkilidir.7
Aile hikâyesi, meme kanseri için önemli bir risk faktörüdür. Ailesinde, 1. dereceden
yakınında meme kanseri hikâyesi olanlarda risk 1,8 kat artmışken, 1. dereceden 2
yakınında meme kanseri hikâyesi olanlarda risk 2,93 kat artmıştır.7 Eğer bu vakalar 30
yaş ve altında ise risk 2,9 kat, 60 yaş üzerinde ise 1,5 kat artar. Yani aile bireyleri ve
yakınında görülen kanser ne kadar erken yaşta ortaya çıkarsa, diğer bireylerde görülme
riski o kadar artmaktadır. Ailesel vakalarda, birkaç mutat gen gösterilmiştir. LiFraumeni sendromu, p53-tümör supresör gen mutasyonuyla karakterizedir, meme
kanseri, osteosarkom ve diğer malignensilerin insidansı artmıştır. BRCA-1 ve BRCA-2
tümör supresör gen mutasyonları, herediter meme kanserlerinin % 30-40’ından
sorumludur.7 BRCA-1 geninin mutat allelini taşıyan kadınlarda yaşam boyu meme
kanseri gelişme riski % 60-80, over kanseri gelişme riski % 33’dür. Bu mutasyonu
taşıyan erkeklerde prostat ve meme kanseri gelişme riski artmıştır. BRCA-2
mutasyonunu taşıyan kadınlarda yaşam boyu meme kanseri gelişme riski % 25-30’dur.
BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları varlığında gelişen tümörler, sporadik meme
kanserlerine göre daha kötü diferansiye tümörlerdir ve prognozları daha kötüdür. Meme
kanserinde ayrıca, PTEN ve ATM gen mutasyonları rapor edilmiştir.7
Memedeki benign ve malign öncül lezyonların varlığı bir diğer risk faktörüdür.
Atipik benign proliferatif lezyonların malignleşme potansiyeli, atipisiz ve proliferatif
olmayanlara göre artmıştır. Ayrıca lobüler karsinoma insitu ve atipik lobüler hiperplazi
yıllık % 1 oranında invaziv karsinom geliştirme potansiyeli taşır.8 Memedeki benign
non-proliferatif lezyonlar (fibrokistik değişiklikler, soliter papillom, basit fibroadenom)
meme kanseri riskinde artışla ilişkili değildir.8 Non-invaziv veya invaziv meme
kanserlerinin önemli prekürsörleri, sitolojik atipi gösteren proliferatif lezyonlardır. Atipi
olmayan kompleks fibroadenomlar, orta derecede hiperplazi, sklerozan adenozis ve
intraduktal papillomlarda, risk 1,3-2 kat artmıştır. Atipi ile beraber proliferatif
lezyonlarda (atipik lobüler hiperplazi, atipik duktal hiperplazi), risk 4-6 kat artmıştır.8
Göğüs duvarına uygulanan iyonize radyasyon meme kanseri gelişme riskini
arttırmaktadır. Özellikle 10-14 yaş arasında Hodgkin Lenfoma nedeniyle radyoterapi
alan çocuklarda ileri yaşlarda meme kanseri gelişme riski artmıştır.8
Diyet ve vücut kitle indeksindeki değişiklikler meme kanseri riskini
etkilemektedir. Postmenopozal obesite, yağdan zengin diyet, sedanter yaşam, aşırı alkol
6
kullanımı meme kanseri riskini arttıran çevresel faktörlerdir. Vücut kitle indeksinde
artış, meme kanserinde artmış mortalite ile ilişkilidir.10 NSAİİ (nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar) kullanımının benign ve malign kolon tümörü gelişimini azalttığı
gösterilmiştir. Meme kanserinde de aspirin ve diğer NSAİİ’ın kullanımı meme kanseri
gelişimini azaltmakla birlikte, COX-2 enzim inhibitörlerinin, birincil önleme ve
tedavide kullanımına yönelik, umut verici sonuçlar bildiren çalışmalar vardır.8
15 yaştan sonra menarş, 1 yıldan uzun süre emzirme, monoansatüre yağdan
zengin diyet, fiziksel aktivite, premenopozal obesite, meme kanserine karşı koruyucu
role sahip olduğu belirlenen faktörlerdir.8
2.1.2. Meme Kanseri Patolojik Sınıflandırma
Meme kanserlerinin % 95’i meme epitelinden kaynaklanan karsinomlardır.
Skuamöz hücreli karsinom, phyllodes tümör, sarkom ve lenfoma gibi adenokarsinom
dışı diğer malign tümörler ise % 5’den az bir grubu oluşturmaktadır. Meme karsinomu,
mikroskobik görünüm ve biyolojik davranışlarına göre çeşitli grupları kapsamaktadır.
İki ana gruba ayrılabilir. İn situ karsinomlarda, tümör hücreleri duktus veya lobüle
sınırlıdır. Işık mikroskobunda stromaya invazyon yoktur. İnvaziv (infiltratif)
karsinomlarda ise tümör hücreleri bazal membranı aşarak stromaya invazyon
göstermektedir. Bu nedenle invaziv karsinomlar, lenfatik ve kan damarlarını invaze
ederek bölgesel lenf düğümlerine ve uzak organlara metastaz yapabilme kapasitesine
sahiptir.2
En sık kullanılan tanısal sınıflandırma sistemi Dünya Sağlık Örgütü (WHO)
sınıflandırmasıdır.11 Bu sınıflamaya göre meme kanserleri:
1. İn situ karsinom
- İn situ duktal karsinom (DCİS)
- İn situ lobuler karsinom (LCIS)
2. İnvaziv karsinom
- İnvaziv duktal karsinom (% 70-80)
- İnvaziv lobuler karsinom (% 5-10)
- Tubuler karsinom (% 2)
- İnvaziv kribriform karsinom
- Medülller karsinom (% 1-5)
7
- Müsinöz (kolloid) karsinom (% 1-2)
- İnvaziv papiller karsinom (% 1)
- İnvaziv mikropapiller karsinom
- Apokrin karsinom
- Sekretuar (juvenil) karsinom
- Adenoid kistik karsinom
- Metaplastik karsinom
- Nöroendokrin karsinom
- İnflamatuar karsinom
Diğer önemli histopatolojik bulgular ise, lenf nodu metastazı, lenfo-vasküler
invazyon, tümör boyutu ve histolojik gradedir. Histolojik olarak tümörün derecesi
Bloom-Richardson sistemine göre 3 gruba ayrılır. Tübül formasyonu, nükleer
pleomorfizm ve mitotik aktivite değerlendirilir ve bu özelliklere göre 1-3 arasında
skorlanır.12-14
1. Tübüler grade; tübüler formasyonun derecesi temel alınarak belirlenir.
a. Tübüler yapılar tümörün % 75’den fazlasını oluşturuyorsa iyi diferansiye-1
puan
b. Tübüler yapılar tümörün % 10-75’ini oluşturuyorsa orta derecede diferansiye-2
puan
c. Tübüler yapılar tümörün % 10’dan azını oluşturuyorsa kötü diferansiye-3 puan
2. Nükleer grade; nükleus büyüklüğü, boyanma yoğunluğu ve şekil farklılıkları
temel alınarak belirlenir.
a. Küçük ve uniform boyanan nükleus varlığı, iyi prognoz-1 puan
b. Nükleus boyut ve şeklinde orta derecede farklılıklar, orta dereceli prognoz-2
puan
c. Koyu boyanma ve belirgin nükleer polimorfizm, kötü prognoz-3 puan
3. Siklüs fraksiyonunun belirlenmesi (mitotik indeks ve S-faz). S-fazın
belirlenmesi flovsitometrinin kullanımını gerektirirken; mitotik indeks, proliferasyonun
erken ve hızlı değerlendirilmesini sağlar. Mitotik indeks skorlaması aşağıdaki gibidir:
a. Düşük (0-3,3/mm2)-1 puan
b. Orta (3,3-7/mm2)-2 puan
c. Yüksek (>7/mm2)-3 puan
8
- Histolojik grade; tübüler, nükleer ve mitotik skorların toplamından elde edilen
birleşik indekstir. İnvaziv kanser aşağıdaki gibi derecelendirilir:
a. İyi diferansiye - grade 1: toplam puan 3-5
b. Orta diferansiye - grade 2: toplam puan 6-7
c. Kötü diferansiye - grade 3: toplam puan 8-9
Meme kanserinde son zamanlarda yeni sınıflamalar yapılmaktadır.15 Bu
sınıflamalar üzerinde görüş birliği sağlanamamıştır. Sınıflama sırasında dikkate alınan
parametreler, histopatolojik tümör tipi ve farklılaşma, tümörün yaygınlığı (boyut, lenf
nodu metastazı ve uzak metastaz), biyolojik belirteçler (ER, PR, c-erb-B2) ve tümör
genetiğidir.
Gen ekspresyon profiline göre, meme kanserleri 5 gruba ayrılmaktadır.
1. Luminal A
2. Luminal B
3. Normal meme benzeri
4. C-erb-B2 aşırı-eksprese eden
5. Bazal benzeri
Luminal tümörler genellikle ER(+) olup özellikle luminal A tipinde CK8 ve CK18
ile pozitif boyanma izlenir. Prognoz Luminal tip A’da en iyidir ve endokrin tedavi
yeterli bulunmaktadır. Luminal tip B’de prognoz biraz daha kötüdür ve tamoksifene
yanıt Luminal A tipine göre daha az, ancak kemoterapiye yanıt iyidir. Bazal benzeri
tümörlerde ER(-), c-erb-B2(-), Vimentin(+), EGFR(+), CK8/18(+), CK5/6(+) olup
konvansiyonel kemoterapiye iyi yanıt verirler.15
2.1.3. Meme Kanserinde Evreleme
Meme kanseri, 2002 yılında American Joint Commitee on Cancer (AJCC)
tarafından, (T) tümör boyutu, (N) lenf nodu durumu ve (M) uzak metastaz durumu
temel alınarak 4 evrede gruplandırılmıştır.16
Primer tümör (T)
TX - Primer tümör saptanamamaktadır
T0 - Primer tümör kanıtı yok
Tis - Karsinoma in situ,
Tis (DCİS) intraduktal karsinoma in situ
9
Tis (LCİS) Lobüler karsinoma in situ
Tis (Paget) Kitle olmadan meme başının Paget hastalığı (Not: Tümör olan Paget
hastalığı, primer tümörün boyutuna göre sınıflandırılır.)
T1 - Tümörün en büyük boyutu 2 cm veya daha az
T1mic - En büyük boyutu 0,1 cm veya daha az mikroinvazyon
T1a - En büyük boyutu 0,1 cm.den büyük, 0,5 cm.den küçük tümör
T1b - En büyük boyutu 0,5 cm.den büyük, 1 cm.den küçük tümör
T1c - En büyük boyutu 1 cm.den büyük, 2 cm.den küçük tümör
T2 - En büyük boyutu 2 cm.den büyük, 5 cm.den küçük tümör
T3 - En büyük boyutu 5 cm.den büyük tümör
T4 - Herhangi bir boyutta ancak (a) göğüs duvarına veya (b) cilde direkt yayılım,
fakat aşağıda belirtildiği gibi (Not: Göğüs duvarına; kostalar, interkostal kaslar ve
serratus anterior kası dahildir fakat pektoral kas hariç tutulmuştur)
T4a - Pektoral kasa ulaşmamış göğüs duvarı yayılımı
T4b - Meme cildinde ödem (peau d’orange dahil) veya ülserasyon, veya aynı
memede satellit deri nodülleri
T4c - Yukarıdakilerin her ikisi (T4a ve T4b)
T4d - İnflamatuar karsinoma (Not: İnflamatuar karsinoma , genellikle ele gelen
bir kitle olmadan, meme cildinin erizipeloid sınırlı endürasyonu ile karakterize
klinikopatolojik bir durumdur. Radyolojik olarak, bir kitle bulunabilir ve meme
üzerindeki deride karakteristik kalınlaşma görülebilir. Bu klinik durum, yüzeyel
kapillerlerin obstriksiyonu ve dermal lenfatiklerin tümör embolizasyonu nedeniyle
ortaya çıkmaktadır.)
Bölgesel lenf nodları (N)
NX - Bölgesel lenf nodları saptanamamaktadır (örn. daha önceden çıkartılmış)
N0 - Bölgesel lenf nodu metastazı yok
N1 - İpsilateral lenf nod(lar)ında metastaz (fikse değil)
N2 -Fikse veya gruplaşmış ipsilateral aksiller lenf nodlarında metastaz veya klinik
olarak belirgin* aksiller lenf nodu metastazı olmadığı durumlarda klinik olarak belirgin
ipsilateral internal mammarial nodlarında metastaz
N2a Birbirlerine veya çevre dokulara fikse ipsilateral aksiller lenf nodlarında
metastaz
10
N2b Sadece klinik olarak aksiller lenf nodu metastazı olmadığında klinik olarak
belirgin* ipsilateral internal mammarial nodlarda metastaz olduğunda
N3 - Aksiller lenf nodu tutulumu olsun ya da olmasın ipsilateral infraklaviküler
lenf nod(ları) metastazı veya klinik olarak belirgin* ipsilateral internal mammarial lenf
nod(ları) metastazı ile birlikte klinik olarak belirgin aksiller lenf nodu metastazı; veya
aksiller ya da internal mammarial lenf nodu metastazı olsun ya da olmasın ipsilateral
supraklaviküler lenf nod(ları) metastazı
N3a İpsilateral infraklaviküler lenf nod(lar)ında metastaz
N3b İpsilateral internal mammarial lenf nod(lar)ında veya aksiller lenf
nod(ları)nda metastaz
N3c İpsilateral supraklaviküler lenf nod(ları)nda metastaz
Görüntüleme metodları (lenfo-sintigrafi hariç) veya klinik muayene ile veya
patolojik olarak açıkça görülerek saptanması durumunda ‘klinik olarak belirgin’ terimi
kullanılır.
Patolojik sınıflama (pN)a
pNX - Bölgesel lenf nodları saptanamamakta (örneğin, patolojik inceleme için
daha önce çıkarılmış veya çıkarılmamış)
pN0 - Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı olmayan, izole tümör
hücreleri (İTH) için ek inceleme yok
Not: H&E boyası ile doğrulanabilen ancak sıklıkla sadece immünohistokimyasal
(İHK) veya moleküler metodlarla saptanan, 0,2 mm.den daha geniş olmayan tek tümör
hücreleri veya küçük hücre kümeleri ‘İzole tümör hücreleri (İTH)’ olarak tanımlanır.
İTH, proliferasyon veya stromal reaksiyon gibi malign aktivite kanıtlarını genellikle
göstermezler.
pN0(i-) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, negatif İHK
pN0(i+) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, pozitif İHK, 0,2
mm.den geniş İHK kümesi yok
pN0(mol-) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, negatif moleküler
bulgular (RT-PCR)b
pN0(mol+) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, pozitif moleküler
bulgular (RT-PCR)b
11
a. Sınıflama sentinel lenf nodu diseksiyonu uygulanan veya uygulanmayan
aksiller lenf nodu diseksiyonuna göre yapılır. Ardından aksiller lenf nodu diseksiyonu
uygulanmayan sentinel lenf nodu diseksiyonuna dayalı yapılan sınıflama, sentinel nod
için (sn) ile belirtilir, örn ; pN0(i+)(sn).
b. RT-PCR: ters transkriptaz/ polimeraz zincir reaksiyonu
pN1 - 1-3 arası aksiller lenf nodlarında, ve/veya internal mamarial nodlarda
sentinel lenf nodu diseksiyonu ile saptanan mikroskobik hastalıkla birlikte metastaz,
fakat klinik olarak belirgin değil**
pN1mic- Mikrometastaz ( 0,2 mm.den geniş, 2,0 mm.den geniş değil)
pN1a - 1-3 adet aksiller lenf nodunda metastaz
pN1b - Sentinel lenf nodu diseksiyonu ile internal mammarial nodlarda
mikroskobik hastalık olarak saptanan metastaz, fakat klinik olarak belirgin değil**
pN1c - 1-3 adet aksiller lenf nodunda ve internal mammarial nodlarda sentinel
lenf nodu diseksiyonu ile mikroskobik olarak saptanan metastaz, fakat klinik olarak
belirgin değil**. (3 aksiller lenf nodundan fazla pozitif nod varsa, artmış tümör yükünü
göstermek için internal mammarial lenf nodları pN3b olarak sınıflandırılır). (pN1a +
pN1b)
pN2 - 4-9 aksiller lenf nodunda metastaz veya aksiller lenf nodu metastazı
olmadığında internal mammarial lenf nodlarında klinik olarak belirgin* metastaz
pN2a 4-9 aksiller lenf nodunda metastaz (2,0 mm.den büyük en az bir tümör
odağı)
pN2b Aksiller lenf nodu metastazı yokken, internal mammarial lenf nodlarında
klinik olarak belirgin* metastaz
pN3 - 10 veya daha fazla aksiller lenf nodunda veya infraklaviküler lenf
nodlarında veya 1 ya da daha fazla aksiller lenf nodu pozitif olduğunda klinik olarak
belirgin* ipsilateral internal mammarial lenf nodlarında metastaz; veya internal
mammarial lenf nodlarında klinik olarak negatif mikroskobik metastazla birlikte 3’ten
daha fazla aksiller lenf nodunda metastaz; veya ipsilateral supraklaviküler lenf
nodlarında metastaz
pN3a 10 veya daha fazla aksiller lenf nodunda metastaz (2,0 mm.den büyük en az
bir tümör odağı), veya infraklaviküler lenf nodlarına metastaz
12
pN3b 1 veya daha fazla pozitif aksiller lenf nodu varlığında klinik olarak belirgin
ipsilateral internal mammarial lenf nodu metastazı; veya sentinel lenf nodu
diseksiyonuyla saptanan fakat klinik olarak belirgin olmayan mikroskobik hastalıkla
birlikte 3 veya daha fazla aksiller lenf nodunda veya internal mammarial lenf nodlarında
metastaz.
pN3c İpsilateral supraklaviküler lenf nodlarında metastaz
Uzak Metastaz (M)
MX - Uzak metastaz bulunamıyor
M0 - Uzak metastaz yok
M1 - Uzak metastaz var (Tümörün olduğu tarafta supraklaviküler lenf nodları ve
karşı memenin bölgesel lenf nodlarına metastazlar dahil)
Meme kanseri evrelerinin gruplandırılması Tablo 1’de gösterilmiştir.
2.1.4. Meme Kanserinde Prognostik ve Prediktif Faktörler
Adjuvan kemoterapinin yaygın olarak kullanılması, meme kanseri mortalitesini
azaltmıştır. Bununla beraber, bu tedaviyi alan çoğu hasta, tedavinin faydasından çok,
gereksiz toksisitesine maruz kalmaktadır. Bu nedenle, adjuvan sistemik tedaviden fayda
görecek hastaların seçimi ve gereksiz toksisite ve maliyetten kaçınmak için, güvenilir
prognostik faktörlerin kullanılması büyük önem taşımaktadır.2
Tablo 1. Meme kanseri evrelerinin gruplandırılması
EVRE 0
EVRE I
EVRE IIA
Tis, N0, M0
T1, N0, M0
T0, N1, M0
T1, N1, M0
T2, N0, M0
T2, N1, M0
T3, N0, M0
T0, N2, M0
T1, N2, M0
T2, N2, M0
T3, N1, M0
T3, N2, M0
T4, herhangi bir N, M0
Herhangi bir T, N3, M0
Herhangi bir T, herhangi bir N, M1
EVRE IIB
EVRE IIIA
EVRE IIIB
EVRE IIIC
EVRE IV
Prognostik faktörler, tedaviden bağımsız olarak, tanı anında, hastalığın klinik
sonuçları hakkında bilgi vermektedir. Bu gibi prognostik faktörler, büyüme, invazyon
13
ve metastatik potansiyelin göstergesidir. Prediktif faktörler ise, tümörün verilen
tedaviye yanıt verip vermeme olasılığı hakkında bilgi vermektedir. Bu gibi faktörler,
tedavinin hedefi veya bir modülatörü olabilir. Prognozun belirlenmesinde rutin patolojik
değerlendirme esastır.2 En önemli prognostik değişken, tümörün evresidir.1 Tümörün
boyutu ve aksiller lenf düğümlerinin durumu, tümör rekürrensi hakkında önemli bilgi
sağlamaktadır (5 yıllık sağkalım oranları tablo 2’de gösterilmiştir). Klasik prognostik
faktörler; evre, aksiller lenf nodu durumu, tümör boyutu, tümörün histolojik tipi,
histolojik
grade,
nükleer
grade,
lenfovasküler
invazyon,
karsinoma
insitu
komponentinin karakteri ve oranı, deri ve meme başı invazyonudur. Modern tedavide,
hormon reseptör durumu, onkogenler (HER/2-neu), tümör supresör genler (p53), tümör
anjiyogenezi, proteazlar, flovsitometrik incelemeler, proliferasyon belirleyicileri (Ki-67)
gibi pek çok parametre prognostik ve prediktif olarak kullanılmaktadır.12 Yaş ise
bağımsız prognostik parametredir. Genç hastalar yaşlılara göre kötü prognoza
sahiptirler. En kötü prognoz 30 yaş altı hastalarda gözlenmektedir. 45-50 yaşa göre risk
30 yaş altında iki kat artmıştır.17
Hastaların prognostik gruplara ayrılması için, DNA içeriği (ploidi), S faz veya
flovsitometri yöntemine dayanan meme dokusunun proliferasyon markerlerinin
kullanımı, verilerin yetersizliği nedeniyle rutin klinik kullanımda önerilmemektedir.
Ayrıca, immünohistokimyasal yöntemlere proliferasyon markerlerinin (örneğin Ki67,
siklin D, siklin E, p27, p21, timidin kinaz veya topoizomeraz II), prognostik marker
olarak kullanımını destekleyen yeterli kanıt yoktur. Ayrıca p53 ve katepsin D ölçümleri,
meme kanserinin yönetiminde yetersiz veri nedeniyle önerilmemektedir.20,21
Tablo 2. Meme Kanserinde Evreye Göre 5 Yıllık Sağkalım Oranları
EVRE
0
I
IIA
IIB
IIIA
IIIB
IV
5 Yıllık Sağkalım (%)
99
92
82
65
47
44
14
Tedavi kararı için kritik bilgi sağlayan ve her zaman kabul edilen prognostik
faktörler; TNM evresi, aksiller lenf nodu durumu, tümör boyutu, tümörün derecesi ve
hormon reseptör durumudur.
14
2.1.4.1. Aksiller Lenf Nodu Tutulumu
Aksiller lenf nodu tutulumu ve metastatik lenf nodu sayısı, invaziv meme kanseri
için halen en önemli prognostik faktör olarak kabul edilmektedir. Tümör boyutu 1
cm.den küçük ve aksiller lenf nodu tutulumu olmayan hastalarda, adjuvan kemoterapiye
nadiren ihtiyaç duyulur.1,17 Lenf nodu negatif fakat küçük damar (kapiller veya lenfatik)
tutulumu olan tümörler, lenf nodu pozitif olanlarla eşdeğer kabul edilebilir. Aksiller lenf
nodu metastazı olmayan hastalarda, 10 yıllık hastalıksız yaşam % 70-80, aksiller lenf
nodu metastazı varlığında yaklaşık % 30 saptanmıştır. Metastatik lenf nodu sayısı çok
önemlidir. Birçok klinik çalışmada tutulan lenf nodu sayısına göre hastalar, nod negatif,
1-3 nod pozitif, 4-9 nod pozitif, 9 veya daha fazla nod pozitif olarak gruplandırılmıştır.
Tutulan lenf nodu sayısı arttıkça sistemik metastaz riski daha fazla, prognoz daha
kötüdür. Metastatik lenf nodu sayısı kadar, metastatik lezyonun çapı (mikrometastaz),
lenf nodu çevresi yumuşak dokuya yayılım da prognozu olumsuz yönde etkileyen
faktörlerdir. Bazı görüşler mikrometastazların (2 mm.den küçük metastazlar) prognozu
olumsuz yönde etkilemediği biçimindedir. Buna karşı, Friedman ve arkadaşları lenf
nodlarında seri kesitlerle ortaya konan subkapsüler ve marjinal sinüs yerleşimli tümör
emboli varlığında, uzak metastaz riskinin lenfatik tutulumu olmayan olgulara göre 1,7
kez arttığını saptamışlardır.13,17,18
2.1.4.2. Tümör Boyutu
Tümör çapı, meme kanserinin rekürrens riski ve özellikle nod negatif hastalarda
adjuvan tedavi seçimi için önemli ve güvenilir bir prognostik faktördür.22 Tümör
boyutu; lenf nodu tutulumu ve hastalığın prognozuyla yakından ilişkilidir. (Tablo 3-4)
Tüm nodal tutulum kategorilerinde tümör çapı büyüdükçe yaşam süresi kısalmaktadır.
Tümör çapının 2 cm ya da daha küçük olduğu olgularda prognoz belirgin olarak daha
iyidir. Özellikle aksiller tutulumu olmayan hastalarda, tümörün meme içindeki
lokalizasyonu da prognostik önem taşımaktadır. Lateral yerleşimli tümörler, medial
tümörlere göre daha fazla 15aksiller metastaz yapabilme özelliğine sahiptir.18,23,24
15
Tablo 3. Tümör çapı ile aksiller lenf nodu tutulumu arasındaki ilişki
Tümör Çapı (cm)
0,5 cm.den küçük
0,5-0,9
1-1,9
2-2,9
3-3,9
4-4,9
5 cm.den büyük
Lenf tutulumu (%)
20
20
33
45
52
60
70
2.1.4.3. Tümörün Histolojik Tipi
Meme karsinomları iyi ve kötü prognozlu tipler olarak iki alt gruba ayrılabilir. İyi
prognozlu histolojik tipler aşağıda sıralanmıştır. Meme kanserinin özel tiplerini
belirleyen morfolojinin, bir tümörün % 90’ından fazlasını hatta % 100’e yakın
bölümünü oluşturması önemlidir.23,24
Tablo 4. Tümör boyutu ile meme kanseri prognozu arasındaki ilişki
5 Yıllık Sağkalım
Tümör boyutu
(cm)
Nod (-) %
Nod (+) %
1-3 (+) %
0,1-0,5
82-99
52
95
0,6-1,0
72-98
54
94
1,1-2,0
68-96
39
87
2,1-3,0
63-92
39
83
3,1-4,0
61-86
33
79
4,1-5,0
59-85
26
70
>5,0
57-82
21
73
İyi prognoza sahip meme karsinomları aşağıda sıralanmıştır:
1. Tubuler karsinom
2. Kribriform karsinom
3. Pür müsinöz (kolloid) karsinom
4. Adenoid kistik karsinom
5. Düşük dereceli adeno-skuamöz karsinom
6. Sekretuar karsinom
7. Tübülo-lobüler karsinom
8. Klasik lobüler karsinom
9. Medüller karsinom
10. İnvaziv papiller karsinom
16
4 < (+) %
59
54
67
63
57
53
46
2.1.4.4. Tümör Derecesi (Grade)
Günümüzde en çok kabul gören sistem, Elston tarafından modifiye edilmiş
Bloom-Richardson sistemidir. Bu sistemde tümörde tubul formasyonu, nükleer
özellikler ve mitoz sayısı ayrı ayrı değerlendirilerek skorlanır ve elde edilen sonuca göre
tümörün histolojik derecesi; grade I, II, III olarak değerlendirilir. Medüller karsinomlar
hariç tüm invaziv meme karsinomlarında derecelendirme yapılabilir. Kötü diferansiye
tümörler, iyi diferansiye tümörlere göre daha yüksek rekürrens sahiptir.18
2.1.4.5. Lenfovasküler İnvazyon
Kan ve lenfatik damarların tümör hücrelerince invazyonu prognoz açısından
önemlidir. Bu bulgu, lenf nodu metastazı varlığı ile kuvvetli birliktelik gösterir ve
ayrıca lenf nodu metastazı olmayan olgularda kötü prognoz belirtisi olarak kabul edilir.
Dermal lenfatiklerde tümör hücre embolisi varlığı, inflamatuar meme karsinomunun
patolojik göstergesidir.13,14,17 Tümörün büyümesi için, neovaskülarite oluşturmalıdır ve
tümörün vaskülaritesi arttıkça prognozu daha kötüdür. Bu nedenle, bevasizumab gibi
kan damarlarını hedefleyen tedaviler önemlidir.1
2.1.4.6. Hormon Reseptörleri
Günümüzde, meme karsinomlarında immünohistokimyasal yöntemle hormon
reseptörlerinin araştırılması, tedavinin belirlenebilmesi için yapılan rutin bir
uygulamadır. Endokrin tedavi için prediktif belirleyici olarak, adjuvant ve metastatik
meme kanserinde önemli bir yer tutar.2 ER ve PR pozitif tümörler daha iyi prognoza
sahiptirler.2 Primer meme kanserlerinin ortalama % 55-65’i; meme kanseri
metastazlarının yaklaşık % 45-55’i ER pozitiftir. Primer ve metastatik meme
kanserlerinin yaklaşık % 45-60’ı PR pozitiftir. ER ve PR pozitifliğine postmenopozal
dönemde, premenopozal döneme göre daha fazla rastlanmaktadır. ER pozitif
tümörlerde, hormonal tedaviye % 55-60, ER negatif tümörlerde ise % 8 yanıt
alınmaktadır. ER, evre 1 ve 2 meme kanserlerinde, toplam sağkalım ve hastalıksız
sağkalım ile ilişkili bulunmuş. PR ise sağkalım için, ER’ye oranla daha belirleyici role
sahiptir. İnsitu duktal karsinomlarda da nükleer derece arttıkça ER ve PR pozitifliğinin
azaldığı saptanmıştır. ER ve PR, meme kanserlerinde bağımsız prognostik
faktörlerdir.13,17
17
2.1.4.7. Moleküler Prognostik Parametreler
2.1.4.7.1. Proliferatif Oran
Artmış proliferatif oran, genellikle tedavi edilmeyen hastalarda, kötü prognozla
korelasyon göstermektedir. Meme tümörlerinde proliferatif oran; mitotik indeks, timidin
bağlama indeksi (TBI), bromodeoksiüridin (BrdU) işaretleme, flovsitometri ile S-faz
fraksiyonunun belirlenmesi, immünohistokimyasal yöntemlerle antijenlere karşı
monoklonal antikorlar kullanarak prolifere olan hücrelerin bulunması (Kİ-67 veya
proliferating cell nuclear antigen [PCNA/siklin]) ve argyrophilic nucleolar organizer
regions (AgNOR)’un değerlendirilmesi gibi çeşitli yöntemlerle belirlenebilir. En sık
kullanılan yöntemler, flovsitometri ile S-faz fraksiyonunun ve İHK ile Kİ-67’nin
belirlenmesidir.25,26
2.1.4.7.2. Flovsitometri
Bu yöntemle meme tümör örneklerinde, S fazındaki hücrelerin yanı sıra tümör
hücrelerinin DNA içeriği de belirlenebilir. Tek değişkenli analizlerde bağımsız bir
prognostik faktör olduğu gösterilmiştir.2 Nod (-) ve nod (+) meme kanserli hastalarda
mortalite ve rekürrens riskinde artma ile S faz fraksiyonu arasında korelasyon vardır.
Ancak rutin kulanım için standardizasyon ve kalite kontrolüne gereksinim vardır ve
pratikte önerilmemektedir. Ayrıca östrojen ve progesteron reseptör varlığının düşük S
faz fraksiyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir.27-30
2.1.4.7.3. Kİ-67
G0 hariç tüm hücre sikluslarında nükleusta mevcut olan bir nükleer antijene karşı
gelişen monoklonal antikordur. DNA içeriğine bakmaksızın herhangi bir siklus fazında
bulunan tüm hücreler G0 fazına girebildiği için, Ki-67 fraksiyon tayini, bir tümörün
prolifere olan hücre komponenti ile ilgili en anlamlı bilgileri vermektedir. Nod (-) meme
kanserlerinde Ki-67 büyüme fraksiyonu ortalaması % 13 iken, dörtten az nod (+)
tümörlerde bu fraksiyon % 20’dir. Ayrıca hormon reseptör varlığı ile ters orantılı ilişki
vardır.31-35
18
2.1.4.7.4. Timidin Bağlama İndeksi (TBI)
S fazındaki hücrelerin oranı belirlenir. Bu yöntemde saptanan S faz fraksiyonu
prognozla koraledir. Meme kanserlerinde ortalama TBI % 5’tir. Genellikle müsinöz,
adenoid kistik karsinom gibi düşük dereceli karsinomlar düşük TBI’ne sahiptir. TBI’nin
tümörün klinik evresi ile zayıf bir korelasyon gösterdiği, ER içeriği ile ters ilişkiye
sahip olduğu ve histolojik grade ile doğrudan ilişkili olduğu bilinmektedir.36
2.1.4.7.5. DNA İçeriği
Birçok çalışmada DNA analizinin, meme kanserinin prognozunu değerlendirmede
kullanılabileceği bildirilmiştir. Bazı çalışmalarda, azalmış hastalıksız ve toplam
sağkalımla bağımsız bir ilişki bulunurken, bazı çalışmalarda da hastalığın sonucunu
etkilemediği ileri sürülmüştür. Bu konuda henüz fikir birliği sağlanamamıştır. Genel
olarak DNA anöploidisi, yüksek histolojik grade ile korelasyon göstermektedir. Meme
karsinomlarının yaklaşık olarak % 50-60’ı anöploid popülasyona sahiptir. DNA ploidi
analizleri, flovsitometri veya statik sitofotometri ile yapılabilir, ancak flovsitometrinin
zaman ve hücre sayısı açısından üstünlüğü mevcuttur.37-39
2.1.4.8. HER-2 (epidermal growth factor receptor-2, c-erb-B2)
Meme kanserli hastaların yaklaşık % 20-35’inde aşırı eksprese edilmektedir.
Meme kanseri için prognostik ve prediktif özelliği vardır. HER2’nin yüksek seviyelerde
ekspresyonu (İHK ile +3 pozitif veya FİSH yöntemiyle pozitif) meme kanserli
hastalarda önemli bir prediktif faktördür, bu hastalar HER2’yi hedefleyen trastuzumab
gibi ajanlardan fayda görebilir. Ek olarak c-erb-B2, antrasiklin dışı kemoterapi
ajanlarına (örneğin CMF - siklofosfamid/metotreksat/florourasil) ve tamoksifene
dirençten sorumludur. C-erb-B2 pozitif hastaların antrasiklin ve taksan tabanlı adjuvan
kemoterapilere, spesifik hedefleyici tedavi olan trastuzumab ve Her-2/neu kinaz
inhibitörlerine yanıtı daha iyidir.40
C-erb-B2 pozitif tümörlerde prognozun daha kötü olduğu, az diferansiye ve
ER/PR negatif tümörler olduğu bilinmektedir. Erken evre meme kanserlerinde c-erbB2’nin prognostik değeri tartışmalı olmakla birlikte yapılan çalışmaların çoğunda tedavi
edilmeyen hastalarda kötü prognozla ilişkili bulunmuştur. Bazı çalışmalarda HER-2
aşırı ekspresyonu diğer kötü prognostik faktörlerle (tümör boyutu, grade, nodal durum)
19
ile ilişkili bulunmuştur. Lenf nodu pozitif hastalarda kötü prognozla bağımsız olarak
açıkça ilişkilidir.41-43
Serum ECD (ekstrasellüler domain) Seviyesi
Metastatik hastaların yaklaşık üçte birinde, HER-2’nin ekstrasellüler domaini,
ELİSA yöntemi kullanılarak serum veya plazmada yükselmiş bulunmaktadır. HER-2
ECD’nin varlığı genel olarak kötü prognozla ilişkilidir. HER-2 ECD seviyesi tümör
yüküyle doğrudan paraleldir. Ancak ASCO (American Society of Clinical Oncology)
tarafından, serum ECD seviyesi ölçümü tümör markeri olarak kabul edilmemiştir.44
2.1.4.9. Siklin E ve p27
Siklin E, hücre siklüsünün geç G1 fazında eksprese edilen 50 kD ağırlığında bir
proteindir. Siklin’ler, regülatör partnerleri siklin bağımlı kinazlar (CDK) ile birlikte,
hücre siklüsünün ilerleyişinde moleküler kontrol mekanizmalarını oluştururlar.
Siklin/CDK kompleksi, p21 ve p27 proteinleri ile inhibe edilirler.45,46
Siklin E’nin yüksek seviyelerinde, hücrelerin S fazına girişi stimüle edilmektedir.
Meme kanserlerinde hem siklin E geni amplifikasyonu, hem de siklin E ekspresyonu
artmıştır. P27, prolifere olmayan hücrelerde yüksek seviyededir ve seviyesi düştüğünde,
hücre mitojenik sinyallere prolifere olarak cevap vermektedir. Siklin E ve p27
seviyeleri, tümör progresyonunun değerlendirilmesinde önemlidir. Yüksek siklin E ve
düşük p27 seviyeleri, azalmış toplam ve hastalıksız sağkalım ile ilişkilidir. Klinik
pratikte kullanımı önerilmektedir.47-49
2.1.4.10. P53 Gen Analizi
P53 tümör supresör gen mutasyonları ve mutasyona uğramış genin ürettiği p53
proteininin artışı, meme kanserlerinin % 20-50’sinde rapor edilmiştir. Bu anormallik,
herediter meme kanserlerinde (Li-Fraumeni sendromu) daha sık görülmektedir. Birkaç
çalışmada, doku p53 protein seviyesi veya p53 genindeki mutasyon ve delesyonların,
hem nod (+) hem de nod (-) hastalarda, azalmış hastalıksız ve toplam sağkalım ile
ilişkili olduğu saptanmıştır. Ancak bu veriler yetersizdir ve prognostik faktör olarak
kullanımı sınırlıdır.50-55
20
2.1.4.11. Anjiyogenez Markerleri
Tümörün
büyümesi
ve
metastaz
yapabilmesi
anjiyogeneze
bağımlıdır.
Anjiyogenez, direk olarak yeni kan damarlarının değerlendirilmesi veya indirek olarak
anjiyojenik faktörlerin ve reseptörlerinin ölçümü ile yapılabilir. Erken bir raporda,
microvessel dansitesinin, hastalıksız ve toplam sağkalımla istatistiksel olarak anlamlı
ilişkisi gösterilmiştir. Ancak, microvessel dansite ölçümleri için kullanılan teknik
farklılıklar kullanımlarını kısıtlamaktadır. Bu konuda değerlendirilen diğer faktörler,
basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2) ve vascular endothelial growth factor
(VEGF)’dir. VEGF, meme kanserinde up-regüle edilmekte olup özellikle VEGF
ekspresyonu, hem nod (+) hem de nod (-) hastalarda relapssız ve toplam sağkalım ile
ilişkilidir. Anjiyojenik faktörler, bazı özel tümör örneklerinin değerlendirilmesinde
kullanılabilmektedir, ancak klinik kullanımları ve prognostik rollerinin tanımlanması
için geniş prospektif çalışmalara ihtiyaç vardır.56-60
2.1.4.12. Katepsin D
Adezyon, invazyon ve metastazın markerlerinin belirlenmesi, özellikle nod
negatif meme kanserli hastaların prognozu hakkında önemli bilgiler vermektedir.
Bunlardan en yoğun olarak çalışılan belirteç, lizozomal proteolitik bir enzim olan
katepsin D’dir. Protein katabolizması ve dokuların yeniden yapılandırılmasında önemli
rol oynamaktadır. Yüksek katepsin D seviyesine sahip hastaların prognozuyla ilgili
çelişkili sonuçlar olmakla birlikte, çalışmaların çoğunda kötü prognozla ilişkili
bulunmuştur.61-64
2.1.4.13. Ürokinaz Plazminojen Aktivatör Sistem
Ürokinaz plazminojen aktivatör (uPA), kanser invazyon ve metastazında önemli
rol oynayan serin proteazdır. Reseptörüne (uPAR) bağlandığında, plazminojeni
plazmine çevirmekte ve tümör invazyonu sırasında ekstrasellüler matriksin uygun hale
gelmesine aracılık etmektedir. UPA’nın spesifik inhibitörleri (plazminojen aktivatör
inhibitör [PAI] tip 1 ve 2) tanımlanmıştır. PAI-1 düzeyleri, tümör dokusu ve plazmada
yüksektir ve PAI-1, uPA’ya bağlandığı zaman inaktive etmektedir. PAI-2 ise, gebelik
ve myeloid lösemi gibi durumlar dışında genellikle düşük seviyede bulunmaktadır.65-67
21
Retrospektif bir çalışmada, meme kanserli hastalarda yüksek uPA, uPAR ve PAI1 seviyeleri, kısalmış sağkalım ile ilişkili iken, yüksek PAI-2 seviyesinin ise daha iyi
prognozla ilişkili olduğu belirlenmiştir. 8377 hasta içeren bir analizde, uPA ve PAI-1
seviyelerinin, lenf nodu durumundan sonra, tüm hastalar için hastalıksız ve toplam
sağkalımın güçlü bir prediktörü olarak gösterilmiştir. Özellikle lenf nodu negatif
hastalarda, her ikisinin birlikte ekspresyonu durumunda bu ilişki daha belirgindir.68
Sonuç olarak, en az 300 mg. taze veya donmuş dokuda ELİSA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) yöntemiyle uPA ve PAI-1 ölçümü, yeni tanı almış nod negatif
meme kanserli hastalarda prognozun belirlenmesi için kullanılabilir. Her ikisinin düşük
seviyesi, özellikle adjuvan hormonal tedavi alan ER/PR pozitif hastalarda düşük
rekürrens riski ile ilişkilidir ve ilave kemoterapinin yararı minimaldir. Yüksek uPA ve
PAI-1 seviyesi olan hastalarda, ilaçsız takip edilen hastalara göre CMF tabanlı
kemoterapinin önemli faydası vardır. İHK ve küçük örneklerde ELİSA’nın kullanılması
uygun değildir.69
İnvazyon ve metastaz potansiyelinin değerlendirilmesi için; nm23, E-cadherin,
kateninler, metaloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP), prostat spesifik antijen, doku
faktörü ve osteopontin gibi birçok faktör ileri sürülmüş ve üzerinde çalışılmıştır. Ayrıca,
allel kaybı, mikrosatellit instabilite veya tümör supresör genlerin metilasyonla
baskılanması da prognostik bilgi sağlamaktadır.70
2.1.4.14. Tümör Markerleri
CA 15-3 ve CA 27-29 periferik kandaki MUC-1 (müsin-1) antijenini bulmak için
tanımlanmıştır. Birkaç çalışmada erken evre meme kanserinde MUC-1’in prognostik
değeri belirtilmiştir ancak, tedavi kararının verilmesinde MUC-1’e dayanan tümör
markerlerinin faydası konusunda hiçbir veri yoktur. Sadece seçilmiş metastatik
hastaların izlenmesinde önerilmektedir.71-74
2.1.4.15. Multiparametreli Gen Ekspresyon Analizi
Genomik teknolojiler (proteomiks, gen ekspresyon profili [GEP]), meme
kanserinde prognostik şema düzenlemek için giderek artan bir şekilde uygulanmaktadır.
Moleküler subtipleme halen geliştirilmektedir ve prognostik olarak farklı alt grupları iyi
belirleyememektedir. Birçok genin eş zamanlı olarak ekspresyon analizinin yapılması,
22
kanser sınıflaması için yeni bir yaklaşımdır. Bu teknik sıklıkla gen array analizi olarak
adlandırılır.75,76
Multiparameter gen assay’in klinik pratikte kullanımı, prognostik sınıflama ve
tedavi seçiminde önemlidir. Bununla beraber, luminal (çoğu ER-pozitif), basal-like
(çoğu ER-negatif, HER-2 negatif, bazen triple negatif olarak adlandırılır) ve HER2+
(çoğu ER-negatif) arasında ayrım yapmak için klinik faydası henüz belirlenememiştir.
Daha önemlisi, birçok genin ekspresyon analizi, erken ever meme kanserli hastaların
klinik sonucunu tahmin etmek için kullanılabilmektedir ve klasik klinik ve patolojik
prognostik özelliklerle birlikte daha önemli bilgiler elde edilmektedir.77-80
İki genel yaklaşım, DNA microarray yöntemiyle taze-donmuş dokuda gen
ekspresyon profilinin belirlenmesi ve real-time reverse-transcriptase polymerase chain
reaction (RT-PCR) yöntemiyle fikse edilmiş parafine gömülü tümör dokusunda, seçilen
genin ekspresyonunun miktarının tespit edilmesidir (örneğin Oncotype DX assay).81,82
Gen ekspresyon profili için microarray’e dayanan testler, taze veya donmuş doku
gerektirir. Hollanda’da yapılan bir seride, 295 evre I ve II meme kanserli hasta (151 nod
negatif ve 144 nod pozitif), daha önceden belirlenen 70-gen profiline göre iyi (n=115)
ve kötü (n=180) prognozlu olarak sınıflandırılmış ve on yıllık takipte, toplam ve
hastalıksız sağkalım açısından, iyi prognozlu olarak sınıflanan grubun önemli derecede
iyi prognoza sahip olduğu belirlenmiştir (% 95’e karşı % 51). Çok değişkenli analizde,
tümörün gen ekspresyon profilinin, prognoz için klasik klinik ve histolojik kriterlerden
daha güçlü bir prediktör olduğu gösterilmiştir. Aynı yöntemle Avrupa ve Amerika’da
yapılan çalışmalarda, istatistiksel olarak anlamlı olmakla beraber daha az pozitif
sonuçlar elde edilmiştir. Bu sonuç hipotez olarak değerlendirilmiş ve rutin kullanım için
yetersiz bulunmuştur. Randomize klinik çalışmalar halen devam etmektedir.83-86
76 gen ifadesinin değerlendirildiği, adjuvant sistemik tedavi almayan nod negatif
400 hasta içeren bir çalışmanın çok değişkenli analizinde, gen profili 5 ve 10 yıllık uzak
metastaz gelişme riski ile korale bulunmuştur. Ancak klinik pratikte kullanım için
onaylanmamıştır.87
RT-PCR’a dayanan metotlar – Formalinle fikse edilmiş parafine gömülü
dokuların ve özellikle daha küçük tümörlerin değerlendirilmesini sağlayan pratik bir
yöntemdir.80
23
DNA microarray analizi ve gen ekspresyon profili, meme kanserinin moleküler
profilini belirlemek, prognozunu tahmin etmek ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde
kullanılabilir. Bu yöntemlerin geçerliliği için, daha büyük prospektif çalışmalara,
metotların standartlaştırılmasına ihtiyaç vardır.
Multiparameter gen ekspresyon analizi, yeni tanı almış, nod negatif, tamoksifen
tedavisi verilen ER-pozitif meme kanserli hastalarda rekürrens riskinin belirlenmesinde
kullanılabilir. Ayrıca düşük rekürrens oranı, tamoksifenden fayda görmesi beklenen ve
adjuvant kemoterapi gereken hastaların belirlenmesinde önemli bilgiler sağlamaktadır.
Yüksek rekürrens oranına sahip kemoterapi alan hastalar (özellikle CMF rejimi),
tamoksifen alan hastalara göre göreceli olarak daha fazla yarar görmektedir.87-93
2.2. Meme Kanserinde Kemik İliği Mikrometastazının Prognostik Önemi
2.2.1. Kemik İliği Mikrometastazının Tanımı ve Erken Metastatik Hastalığın
Biyolojisi
Solid epitelyal tümörlerde, kemik iliğine dissemine tümör hücreleri (DTC)
kavramı 30 yıl önce ortaya atılmıştır.94-96 Minimal rezidüel hastalık (MRD), kemik
iliğinden izole edilen tümör hücreleri (İTH) veya gizli metastatik hücreler, DTC ile eş
anlamlı olarak kullanılmaktadır. Mikrometastaz, primer tümörden uzak organlara
yayılan tümör hücrelerinin, çapı 2 mm.mden küçük mikroskobik metastatik depozitleri
olarak tanımlanmaktadır.94,97,98 Kemik iliğindeki sıklıkla tek tek veya gruplar halinde
bulunan bu tümör hücreleri, kemik iliği mikrometastazları olarak tanımlanmaktadır.
(Şekil 1’de A45B/B3 monoklonal antikoru ile immünositokimyasal olarak boyanmış tek
ve grup halinde bulunan mikrometastatik hücreler)99 Bu hücreler klasik görüntüleme
yöntemleri ile tespit edilememektedir. Tümör gelişiminin olasılıkla erken döneminde
meydana gelen mikrometastatik yayılım, kan, lenf nodları veya kemik iliğine
olabilmekte, kemik iliği, primer tümörden köken alan mikrometastatik hücrelerin en sık
yayıldığı organ olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler yıllarca iskelet metastazı veya
tekrar dolaşıma geçerek karaciğer veya akciğer metastazı geliştirmeden dormant halde
kalmaktadır.100
Gelişmiş ülkelerde solid tümörlerin çoğunluğunu epitelyal kaynaklı meme,
akciğer, gastrointestinal sistem ve prostat karsinomları oluşturmaktadır. Metastatik
kaskadın ilk basamağında lokal olarak tümör hücre invazyonu meydana gelmekte, bunu
24
takiben lokal lenf nodlarına veya kan dolaşımı yoluyla ikincil organlara yayılım
gerçekleşmektedir. Tümör hücreleri ikincil organlarda ya apopitozise uğramakta ya da
immün sistem tarafından ortadan kaldırılmaktadır. (Şekil 2: Apopitotik ve nonapopitotik hücreler gösterilmiştir)101 Hayatta kalanlar ise metastatik lezyonlar için
potansiyel prekürsörlerdir. Günümüzde tümör evreleme yöntemleri genellikle manifest
uzak metastazları içermekte fakat uzak organlardaki bu tek tümör hücrelerini
içermemektedir. Metastazın başlangıcında erken dönemde tespit edilmesi, metastatik
tümör yükünün daha küçük olması ve kemoterapötik ajanlara solid metastazlardan daha
duyarlı olmaları nedeniyle önemlidir.100
Lenf nodu tutulumu (evre N0) veya uzak metastazın klinik ve histopatolojik
bulgusu olmayan (evre M0) epitelyal tümörlerde (meme, prostat, kolon ve akciğer
karsinomları gibi) kemik iliği mikrometastazı oranı % 20-40 bulunmuştur. Bu konuda
en fazla araştırma meme kanserinde yapılmıştır. Cerrahi sırasında kemik iliğindeki bu
erken metastatik hücrelerin bulunması, gelecekte kemik veya diğer organlarda meydana
gelebilecek relaps için bir prediktördür.100
25
Şekil 1. A45B/B3 monoklonal antikoru ile immünositokimyasal olarak boyanmış tek ve grup
halinde bulunan mikrometastatik hücreler99
26
Şekil 2. Apopitotik ve nonapopitotik mikrometastatik hücreler (a) Nonapopitotik mikrometastatik
hücreler (APAAP kit metodu) (b) Apopitotik mikrometastatik hücrede membran
düzensizliği ve nükleer daralma (APAAP kit metodu) (c) FİSH yöntemiyle Apopitotik
mikrometastatik hücrede membran düzensizliği ve nükleer daralma (d) Apopitotik
mikrometastatik hücrede kromatin yokluğu
İn vivo videomikroskobinin kullanıldığı hayvan deneylerinde, metastazın hem
yeterlilik
hem
de
yetersizlik
adımlarından
oluşan
bir
süreç
olduğu
gösterilmiştir.100,102,103 Metastatik hastalığın başlangıç aşamasında (dolaşımda hayatta
kalma, mikrosirkülasyonda tutunma ve ekstravazasyon) etkin bir şekilde gerçekleştirilir.
Ancak hücrelerin malign potansiyelinden bağımsız olarak, mikrometastatik depozitlerin
daha sonraki büyüme ve klinik olarak metastaz geliştirmelerinde yetersizlik söz
konusudur. Tümör hücrelerinin bu büyümeyi başlatma yeteneğine ve daha az derecede
hedef organın fiziksel özelliklerine bağlı olarak metastaz ortaya çıkmaktadır.102,104,105
Yeni deneysel bir çalışmada, flovsitometri yöntemiyle kemik iliği ve diğer dokularda
27
tümör hücrelerinin gösterilmesine rağmen, deney hayvanlarının % 13’ünden daha
azında uzak metastaz gelişmiştir.106 Bu bulgulara dayanarak, metastatik hastalık, insan
vücudunun çeşitli bölgelerinde bulunan tüm malign hücrelerin relatif olarak küçük bir
bölümünden oluşan tek hücrelerin bir subpopülasyonu olarak tanımlanabilir.103,107
Metastaz kapasitesi olan bu tek hücreleri diğer tümör hücrelerinden ayıran ve metastatik
büyümeyi başlatabilmelerini sağlayan özellikleri vardır.108
Tümör uykusu (dormant tümör hücreleri); kemik iliği gibi bir rezervuarda gizli
durumda çoğalmadan yaşayan tümör hücrelerinin yayılmasının sonucu olarak, gros
hastalığın tamamen eradikasyonundan yıllar sonra kanserin rekürrensini açıklayabilen
klinik olarak kabul edilen bir durumdur.109,110 DTC’nin bu uyku halinde kaldığına
inanılır ve bilinmeyen bir zamanda, iskelet metastazı gelişmeden, kemik iliğinden uzak
organlara yayılmaktadır.94 Klinik ve deneysel verilerin bu teoriyi güçlü bir şekilde
desteklemesine rağmen, bu fenomenin mekanizması tam olarak bilinmemektedir.
Mikrometastatik hücre popülasyonu, henüz belirlenemeyen faktör ve durumların etkisi
altında, çoğalmadan ve başka yerlere yayılmadan yaşayabilen tümör hücrelerinden
oluşmaktadır. Tümör anjiyogenezisi, hücre proliferasyonu, hücre siklüsünün durması,
immün regülasyon ve kanser hücrelerinin mikroçevre ile etkileşiminin bu duruma
katkıda bulunduğu ileri sürülen olası sebeplerdir.109,111-114
M0 evre epitelyal kanserli hastaların kemik iliğinden elde edilen tümör
hücrelerinin kullanıldığı hücre kültürlerinde, bu hücrelerin zaman-sınırlı proliferatif
aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu da, prolifere olan hücreleri hedefleyen
kemoterapötik ajanlara dirençli olmalarını açıklamaktadır.94,115 Bazı araştırmacılar,
mikrometastazın, benzer proliferasyon ve apopitozis dereceleri olan, metabolik olarak
aktif fakat fonksiyonel olarak dormant haldeki hücrelerden kaynaklandığını; bazı
araştırmacılar da, metastaz yeteneğine bakmadan, ne çoğalan ne de apopitozise uğrayan,
yaşayan fakat inaktif soliter dormant haldeki hücrelerden kaynaklandığını ileri
sürmüşlerdir.109,116-119DTC,
gerektirmeyen,
kritik
nutrisyon
boyutun
desteği
çok
için
altında,
anjiyogenezi
preanjiogenik
başlatmayı
evrede
bulunmaktadır.109,116,117,120 Bu evrenin, primer tümörün kendisi tarafından da uyarılmış
olabileceğine ilişkin kanıtlar vardır.116 Daha önceki çalışmalarda, bazı primer
tümörlerin, anjiostatin veya endostatin gibi antianjiyogenetik medyatörler salarak,
metastazların büyümesini inhibe ettiğini göstermiştir.118,121,122 Guba ve arkadaşları,
28
deneysel verilere dayanarak, primer tümörün, soliter dormant haldeki tümör
hücrelerinin büyümesini suprese edebileceğini ileri sürmüştür. Bu gözlemlerini, uyku
halinin başlamasını, primer tümörün anjiyogenezisi inhibe etmesi ya da henüz
bilinmeyen moleküllerin sekresyonu yoluyla, yayılan tümör hücrelerini suprese
etmesinin bir sonucu olduğu şeklinde açıklamışlardır.109
Kanserin büyümesinin kontrolünde konak immün sisteminin rolü açıkça ortaya
koyulmuştur. Bununla beraber, tümör uykusu fenomenine katkısı bilinmemektedir.
Mürin
lenfoma
modelinde
immünizasyon
yoluyla
deneysel
tümör
uykusu
gerçekleştirilmiştir. İnterferon gama gibi sitokinler dahil bir çok faktörün, uyku halinin
oluşturulmasında ve sürdürülmesindeki etkisi gösterilmiştir.123-127 Çalışmalar immün
sistemin, mikrometastatik hücreleri en azından başlangıçta, çoğalmadan ve diğer
organlara yayılmadan tuttuğunu göstermiştir. Solid tümörlerde ise, bu modellerin kanser
büyümesinde
uygulanıp
uygulanamayacağı
henüz
açıklığa
kavuşmamıştır.128
Mikrometastatik hücrelerin MHC-1 (major histocompatibility complex) genlerini
eksprese etmemesi nedeniyle, bu hücrelerin lenfositlerce tanınmasından ve sitotoksik T
hücreleri tarafından lizise uğratılmasından korunduğu düşünülmektedir.129-132 Bu
nedenle, hematolojik malignensilerin aksine solid tümörler, immün sisteme karşı
tamamen korumasız değildir.133
Bu faktör ve durumlara ek olarak, kemik iliği mikroçevresi, mikrometastatik
hücrelerin hayatta kalması ve çoğalmasını etkilemektedir. Birçok büyüme faktörü ve
hücresel integrinlerin ligandları, kemik iliğindeki normal hematopoietik hücrelerin yanı
sıra tümör hücrelerine de modülatör etkilere sahiptir.134 Malign hücrelerle lokal çevre
arasındaki bu etkileşim, gerçek erken metastatik hastalık ile kemik iliğine implante
olmadan geçici tümör yayılımı arasında kritik rol oynamaktadır.129,135,136 Tümör
hücrelerinin çoğu, kemik iliği stromasına uygun bir şekilde bağlanamamakta ve
ölmektedir, hayatta kalanlar ise iyi diferansiye evrede kalmaktadır.134 Korah ve
arkadaşları, uyku hali ve kemik iliğindeki meme kanseri hücrelerinin ölüme direncini
açıklamak için bir in vitro model öne sürmüştür. Buna göre integrin alfa5-beta1fibronektin etkileşimi, fibroblast büyüme faktörü (FGF-2)’ ne duyarlı meme kanseri
hücrelerinde kısmen fosfatidil-inositol 3-kinaz/Akt yolağının aktivasyonu, dormant
tümör hücrelerinin hayatta kalmasını sağlamaktadır.134
29
Mikrometastatik hücreler G0 fazında dormant halde olmalarına rağmen, yeniden
prolifere olabilme, büyüme ve metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle
kanser rekürrensi için her zaman potansiyel bir tehdit oluştururlar. Bu olasılıkla, malign
bir fenotipin oluşmasına ve kemik iliği mikroçevresinin spesifik selektif baskısının
sonucudur.94,137,138 Bu görüş, yeni verilerle desteklenmektedir. DTC’nin proliferatif
potansiyeli klinik sonucu belirler ve azalmış toplam sağkalımla ilişkilidir.108,115 Önceki
bilgilere göre, karsinoma hücrelerinin invaziv özellik kazanmaları, başlıca epitelyalmezenkimal dönüşüm ve bazı integrin subünitleri ve laminin reseptörleri gibi bazı
adezyon
moleküllerinin
ekspresyonunda
değişikliklerle
sağlanmaktadır.102,138,139
Metastatik meme tümörlerinde com1 olarak adlandırılan bir faktörün eksprese edildiği
bulunmuştur. Bu molekül, büyümeye cevap olarak intrasellüler sinyal iletimine aracılık
etmekte ve mikrometastatik hücrelerin implantasyonu ve uzak metastaz geliştirmelerini
sağlamaktadır.135 Hematojen metastazın bir başka düzenleyicisi, transkripsiyon faktörü
HIF-1a (hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 alfa)’dır. Bu faktör kemik iliğinin
mikrometastatik tutulumu ile ilişkili görünmektedir.94 Kemik iliği mikroçevresi ile bu
etkileşimlerin yanısıra yeni kan damarı oluşumu, DTC’nin daha primitif hale
farklılaşmasını ve uzak metastaz gelişimini büyük ölçüde etkilemektedir.140-143 Bu
farklılaşma sırasında, çeşitli transkripsiyon supresörleri (örneğin poliklonal grup protein
EZH-2) aşırı eksprese edilirken, KİSS-1 ve NM23 gibi metastaz-supresör genlerin down
regülasyonu söz konusudur.94,144,145
Mikrometastazın, primer tümörün progresyonu sırasında hangi evrede meydana
geldiği de tartışma konusudur.146,147 Tümör hücresi yayılımının, gros olarak büyük bir
primer tümörün gelişiminden önce, karsinogenezin erken dönemlerinde gerçekleştiği
konusunda giderek artan kanıtlar vardır.127,148,148 Mikrometastatik hücreler, yüksek
genetik heterojenite ve heterojen proliferatif potansiyele sahiptir. Primer tümörden
erken evrede ayrılmaları ve kalan tümör dokusundan bağımsız gelişim göstermeleri
nedeniyle, primer tümörlerine fazla benzerlik göstermezler.115,150 Bu genetik
heterojenite karşılaştırmalı genomik hibridizasyon yöntemiyle ortaya koyulmuştur ve
metastaz gelişimini azalttığı gösterilmiştir.137,151 Gangnus ve arkadaşları, DTC’de kopya
sayısının büyük ölçüde değiştiğini ileri sürmüşlerdir. İleri evre kanserlerde kromozomal
sapmaların stabilize olduğu düşünüldüğünde, mikrometastazların erken evrede
gerçekleştiği daha olası görünmektedir.108,152
30
2.2.2. Mikrometastazın Prognostik ve Klinik Önemi
Meme kanseri erken tanı ve tedavisindeki gelişmelere rağmen, halen yüksek
morbidite ve mortalite oranına sahiptir. Erken evre hastalarda, konvansiyonel
yöntemlerle gösterilemeyen gizli metastatik hücreler, uzak metastaz gelişimi ve kanser
ilişkili ölümün en önemli nedenidir. Daha önceleri meme kanserinin ilk olarak lenf
nodlarına metastaz yaptığı düşünülürken, günümüzde lokalize meme kanserli hastaların
yaklaşık % 50’sinde hematojen yayılımın olduğu ileri sürülmektedir. Bu nedenle,
primer lokorejyonel tedaviden önce kemik iliği mikrometastazının değerlendirilmesi,
rekürrens riski yüksek hastaların belirlenmesi, adjuvan-neoadjuvan tedavi kararı ve
tedaviye cevabın izlenmesi açısından önemlidir. Örneğin kemik iliği bulguları olmayan
lenf nodu negatif erken evre hastalarda, tek başına cerrahi tedavi yeterli olmakta ve
ilave adjuvan kemoterapiye nadiren gerek duyulmaktadır.
Operabl meme kanserli hastalarda uzak metastaz riski; primer tümörün boyutu,
aksiller lenf nodu tutulumu ve primer tümör markerleri gibi prognostik göstergelerle
korelasyon göstermektedir. aksiller lenf nodu negatif hastalarda; tümör boyutu, HER2
pozitifliği, hormon reseptör durumu, lenfovasküler invazyon ve yüksek histolojik grade
gibi faktörler, sistemik tedavi ihtiyacını ve rekürrens riskini belirlemek için
kullanılmaktadır. Buna rağmen, lokalize hastalığı olan ve aksiller lenf nodu metastazı
olmayan meme kanserli hastaların yaklaşık % 25’inde sistemik relaps gelişmekte; buna
karşın aksiller lenf nodu metastazı olan hastaların en az % 30’unda primer tedaviyi takip
eden 5-10 yıl içinde relaps gelişmemektedir.153-156 Bu gözlemler, tümör yayılımının
önemli bir bölümünün, lenfojen yol ile birlikte ve bazı vakalarda lenfojen yoldan
bağımsız olarak hematojen yolla olabileceğini akla getirmiştir. aksiller lenf nodu negatif
meme kanseri hastalarının % 20-40’ında kemik iliğinde DTC saptanabilir.157
Günümüzde kullanılan prognostik faktörlerin, hastaların relaps riskini yeterli doğrulukla
belirleyememesi nedeniyle, yeni prognostik parametrelere ihtiyaç vardır. Bu nedenle,
metastaz gelişiminden önce kemik iliğinde MRD’in değerlendirilmesi ile daha doğru
risk sınıflaması yapılabilir, bu hücrelerin ortadan kaldırılması için ek konvansiyonel
veya bu hücreleri hedefleyen yeni biyolojik tedaviler kullanılabilir.
Tek merkezli, önemli sayıda hastayı kapsayan ve yeterli izlem süresi olan
çalışmaların çoğunda, kemik iliği mikrometastazı ile prognoz arasındaki ilişki
gösterilmiştir. Mansi ve arkadaşları, anti-EMA antikoru kullanarak, ortalama 12,5 yıllık
31
takip süresi sonrası, ilk tanı anındaki kemik iliği durumu ile uzak metastaz gelişimi ve
toplam sağkalım arasında önemli bir prognostik ilgi bulmuştur.136 Diel ve Arkadaşları
727 hastayı kapsayan bir grupta, 36 ay takipten sonra, kemik iliği mikrometastazı ile
hastalıksız ve toplam sağkalım arasındaki ilişkiyi göstermiştir. İTH’nin prognostik
değeri; lenf nodu tutulumu, tümör boyutu ve grade’dan daha üstün bulunmuştur.158 Son
dört prospektif çalışma toplam 2316 hastayı kapsamış ve klasik prognostik faktörlerden
bağımsız olarak kötü prognoz ile ilişkisi gösterilmiştir.99,159-161
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan 4703 hastayı kapsayan bir metaanalizde; evre I-II ve III operabl meme kanseri hastalarda, immünositokimyasal
yöntemlerle saptanan kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 olarak bildirilmiştir. Bu
çalışmaya alınan hastaların % 90’ı T1 ve T2 tümöre sahipti ve hastalarda uzak metastaz
saptanmadı. % 58’i nod negatif ve % 70’i adjuvan kemoterapi almıştı. Kemik iliği
mikrometastazı özellikle büyük tümör boyutu, yüksek tümör grade, lenf nodu metastazı
varlığı ve hormon reseptör negatifliği ile ilişkili bulunmuştur. Bu hastalarda çok
değişkenli analizde, kemik iliği mikrometastazları diğer prognostik faktörlerden
bağımsız olarak, azalmış genel ve meme kanseri spesifik sağkalım oranlarıyla ilişkili
bulunmuştur.158 Bugüne kadar başlıca immünositokimyasal yöntemlerin kullanıldığı
çalışmalarda, kemik iliğinde DTC’nin bulunmasının toplam ve hastalıksız sağkalımın
bağımsız bir göstergesi ve kötü prognostik faktör olduğu ortaya koyulmuştur.3,99,159,162168
Bununla beraber, prognozla ilişkisi gösterilemeyen çalışmalar da vardır.169-170 Kemik
iliği
aspirasyon
teknikleri,
materyallerin
hazırlanması,
kullanılan
antikorlar,
zenginleştirme yöntemlerinin kullanılıp kullanılmaması, analiz edilen hücre sayıları,
hastaların evreleri ve takip süreleri arasındaki farklılıklar nedeniyle çelişkili sonuçlar
ortaya
çıkmaktadır.
Tablo
5’de
erken
evre
meme
kanserli
hastalarda
immünositokimyasal yöntemle belirlenmiş kemik iliği mikrometastazlarının prognozla
ilişkisini gösteren başlıca çalışmaların listesi gösterilmiştir.
2.2.3. Mikrometastazın Klinik ve Tedaviye Yanıtın İzlenmesindeki Yeri
Kemik iliği mikrometastazının prognostik önemine ek olarak, tümör hücrelerinin
fenotiplerinin belirlenmesi sayesinde tedavinin etkinliğinin izlenmesi için bir araç
olarak kullanılabileceği ileri sürülmüştür. Meme kanserli hastaların evrelendirilmesi ve
tedavi seçimi üzerine etkisi tartışılmaktadır. Ayrıca primer tedaviden sonra kemik iliği
32
mikrometastazlarının eradike edilememesi, adjuvan tedavinin uzatılması veya farklı
tedavi yöntemleri için bir endikasyon olarak değerlendirilmektedir.
Tablo 5. Erken evre meme kanserli hastalarda immünositokimyasal yöntemle belirlenmiş
kemik iliği mikrometastazlarının prognozla ilişkisi
Prognostik değeri
Çalışma (yıl) [referans]
Mikrometastaz oranı (%)
(hasta sayısı)
Schlimok ve Ark. (1987) [171]
18
DDFS (155)
Cote ve Ark. (1991) [172]
37
DFS, OS (49)
Harbeck ve Ark. [173]
38
DFS, OSa (100)
Diel ve Ark. (1996) [158]
31
DFSa, OSa (727)
Molino ve Ark. (1997) [174]
31
İlişki bulunamadı (109)
Mansi ve Ark. (1999) [156]
25
DFS, OS (350)
Braun ve Ark. (2000) [99]
36
DFSa, OSa (552)
Gebauer ve Ark. (2001) [159]
42
DFSa, OSa (393)
Gerber ve Ark. (2001) [160]
31
DFSa, OSa (484)
Wiedswang ve Ark. (2003) [161]
13
DDFSa, BCSSa (817)
Braun ve Ark. meta-analiz (2005)
31
DDFSa, OSa (4,703)
[3]
a: Çok değişkenli analiz ile doğrulanmış. BCSS: Meme kanseri spesifik sağkalım DDFS: Uzak
metastazsız hastalıksız sağkalım DFS: Hastalıksız sağkalım OS: Toplam sağkalım
Üçten fazla metastatik lenf nodu ve kutanöz lenf damarlarına yaygın invazyonu
olan yüksek riskli meme kanserli hastaları kapsayan bir çalışmada, hastalar taksan veya
antrasiklin içeren kemoterapileri almadan önce ve kemoterapi sonrası kemik iliği
mikrometastazı açısından değerlendirilmişlerdir. Hastaların kemoterapi öncesi ve
sonrası kemik iliği bulgularının değişmediği saptanmıştır.175 Ayrıca kemik iliğinde
tümör hücrelerinin varlığı özellikle kötü prognoz ve tedaviye heterojen cevabın bir
göstergesiydi. İki pilot çalışmada, yüksek doz kemoterapi [ifosfamid, karboplatin,
epirubicin (n=18) veya vinblastin, ifosfamid, karboplatin (n=10)] sonrası otolog kök
hücre nakli yapılan hastalar değerlendirilmiştir. Bu iki hasta grubunda tedavi
tamamlandıktan ve hastaların çoğunda tam klinik remisyon elde edildikten sonra
yapılan kemik iliği analizlerinde, sırasıyla ilk grupta 15 hastada (% 83) ve ikinci grupta
3 hastada (% 30) mikrometastaz saptanmıştır.95 Bu bulgular, klinik ile kemik iliği
mikrometastazı tarafından belirlenen relaps riski arasındaki çelişkiyi göstermektedir. Bu
gözlem, yüksek doz kemoterapinin tedavideki yetersizliğini açıklamaktadır. Agresif
sistemik tedavi sonrası mikrometastaz varlığının devam etmesi, etkinliği kanıtlanmış
tamamlayıcı stratejilerin ve hücre siklüsünden bağımsız olarak tümör hücrelerine
seçiciliği olan tedavilere ihtiyacı ortaya koymaktadır.
33
Daha sonra yapılan çalışmalarda da, uzak metastaz bulgusu olmayan erken evre
meme
kanserli
incelenmiştir.
176-178
hastalarda
kemik
iliği
mikrometastazı
ve
prognoz
ilişkisi
İlk çalışmada, T1-T2, N0-N3 M0 evre 228 hastadan kemik iliği
alınmış. Ortalama 21,3 ay takipten sonra tek değişkenli ve çok değişkenli analizde
mikrometastaz varlığı ile artmış relaps ve kanser ilişkili ölüm riski arasındaki ilişki
gösterilmiştir. Kemoterapi sonrası mikrometastaz saptanmayan hastalar anlamlı
derecede uzun yaşama sahipti.(162,1 aya karşı 98,7 ay) Çok değişkenli cox-regresyon
analizinde kalıcı mikrometastaz varlığı, azalmış hastalıksız sağkalımla ilişkili
bulunmuştur.
İkinci çalışmada, Wiedswang ve arkadaşları, primer tanıdan 3 yıl sonra kemik
iliğinde sitokeratin pozitif tümör hücrelerinin bulunmasının prognozla ilişkisini ortaya
koymuştur.(n=356)207 Hastaların % 15’indemikrometastaz saptanmış ve ortalama 66 ay
takipten sonra, hem hastalıksız sağkalım hem de toplam sağkalım için bağımsız güçlü
bir prognostik gösterge olduğu belirlenmiştir. Çok değişkenli analizde; başlangıç kemik
iliği durumu, aksiller LN durumu, tümör boyutu, Her2/neu aşırı-ekspresyonu, vasküler
invazyon ve takip kemik iliği durumu, meme kanseri spesifik ölüm oranı ile ilişkili
bulunmuştur.
Bu hücrelerin non-proliferatif durumda olması nedeniyle standart tedaviye
dirençli olmaları, hücre siklüsünden bağımsız, monoklonal antikorlara dayanan tedavi
rejimlerinin geliştirilmesi için bir seçenek oluşturmaktadır.179,180 Sitokeratin pozitif
meme kanser hücrelerinde Ki-67 proliferasyon markeri negatif bulunmuştur.179 Braun
ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir pilot çalışmada, ileri evre 10 hastada, tek doz
500 mg. edrecolomab tedavisi uygulamıştır. Edrecolomab, meme tümörlerinde yaygın
olarak eksprese edilen epcam’a (epitelyal hücre adezyon molekülü) karşı kullanılan
monoklonal antikordur. Çalışmada, edrecolomab tedavisinden 5-7 gün sonra yapılan
kontrol kemik iliğinde, tedavi öncesine göre tümör yükünde belirgin azalma saptanmış
ve 4 hastada CK+/epcam+ metastatik hücrelerin tamamen eradike edildiği gözlenmiştir.
Ancak bu tedavi hastaların klinik sonucunda herhangi bir değişikliğe neden olmamıştır.
Bu sonuç, antikorun tümör kitlesindeki fizyolojik bariyerlerden yeterince penetre
olamamasına bağlanmıştır.
Bununla beraber edrocolomab tedavisinin adjuvan kemoterapi rejimlerinde daha
etkin olduğu gösterilmiştir. Dukes C kolorektal kanserlerin adjuvan tedavisinde
34
plaseboya karşı edrecolomabın klinik yararı kanıtlanmıştır.181 Epcam kolorektal
kanserlerde homojen olarak eksprese edilmektedir. Hastalara toplam 5 doz edrecolomab
tedavisi uygulanmış ve hastalar 7 yıllık takipten sonra değerlendirildiğinde edrecolomab
alan grubun kontrol grubuna göre % 30 daha az mortalite ve uzak metastaz oranına
sahip olduğu gözlenmiştir. Sonraki faz III çalışmada ise, 2761 evre III kolon kanserli
hastada, adjuvan kemoterapiye edrecolomab ilavesinin hayatta kalım üzerine bir etkisi
olmadığı rapor edilmiştir. Edrecolomab monoterapisi alan hastalar, kombine kemoterapi
alan hastalara göre daha kısa toplam ve hastalıksız sağkalım oranlarına sahipti.182 Primer
kolon ve pankreas tümörlerinde epcam sık eksprese edilmesine karşın, erken evre meme
kanserli hastaların kemik iliğindeki epcam (+) mikrometastatik tümör hücreleri sıklığı
% 7 bulunmuştur. Ancak ileri evre meme kanserlerinde bu oran % 68’e çıkmaktadır.183
Bu nedenle, edrecolomabın bazı çalışmalarda etkinliğinin düşük saptanması, uygun
hastaların seçilememesine ve afinitesi daha fazla olan yeni ajanların ek fayda
sunmalarına bağlanabilir.
Seçilen
hasta
popülasyonuna
uygun
tedavi
seçenekleri
göz
önünde
bulundurulmalıdır. Örneğin mikrometastatik hücrelerin fenotipinin belirlenmesi
gelecekte ümit verici tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
İmmünofloresan çift boyama veya floresan in situ hibridizasyon (FİSH) gibi farklı
teknikler,
mikrometastatik
hücrelerin
antijenik
profilini
göstermek
amacıyla
kullanılabilir. Trastuzumab (herceptin) gibi antikorlara dayanan tedavi yöntemleri daha
efektif olabilir.184 Primer tümörlerinde hormon reseptörleri negatif olsa da,
mikrometastatik hücrelerde hormon reseptörleri pozitif olabileceği için, adjuvan
endokrin tedavi kararı için bu hücrelerin hormon reseptör analizinin yapılması uygun bir
yaklaşımdır.185 Zolendronik asit gibi bifosfonatların da bu hücrelerin elimine
edilmesindeki etkinliği gösterilmiştir.186-188
2.2.4. Mikrometastatik Kanser Hücrelerinin Moleküler ve Fonksiyonel
Tanımlaması
DTC’nin genetik özelliklerinin tanımlanması, kemik iliği gibi uzak bir organda
onlara erken dönemde yayılışını, kemik iliğine seçiciliğini ve burada hayatta kalmalarını
sağlayan biyolojik özelliklerinin belirlenmesini sağlar. Kemik iliğindeki DTC’ler,
oldukça geniş bir fenotipik heterojenite gösterir; özel antijenler, HER2/neu gibi proto-
35
onkogenler bu hücrelerde sıklıkla eksprese edilmektedir. HER2/neu, DTC’nin çok
agresif bir alt tipini tanımlamakta ve meme kanserinin sistemik tedavisinde biyolojik
hedef olarak önem kazanmaktadır.189,190
Klein ve arkadaşları, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) yöntemini
kullanarak, klinik olarak uzak metastaz bulguları olmayan meme kanserli hastaların
kemik iliğinde, genetik olarak heterojen özellikleri olan sitokeratin-pozitif hücreleri
göstermiştir.191 Şaşırtıcı olarak, çalışmada bu hücrelerin kendi primer tümörlerine çok
az benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Bu bulgular, yayılan kanser hücrelerinin, onların
primer tümörlerinden erken bir evrede ayrılmış olabileceği şeklinde yorumlanabilir. Bu
hipotez, M0 hastalardaki çok az sayıdaki tek metastatik hücrelerin TP53 mutasyonlarını
içermesiyle de desteklenmektedir.191,192 Sonuç olarak, bu hücrelerin bir kısmı primer
tümör hücrelerinden bağımsız olarak yayılabilir ve bu mikro-evrim, kemik iliği
mikroçevresinin spesifik selektif baskısı altında sürdürülebilir.193 Açık metastazların
prekürsörü olan bu hücrelerin tanınması, mikrometastaz araştırmalarının gelecekteki
büyük tartışmalarından biri olacaktır. Şimdiye kadar, M0 evre hastalarda erken
metastatik hücrelerdeki hangi genomik sapmaların daha sonraki uzak metastazlarla
ilişkili olduğu açık değildir.194 Deneysel veriye göre, tek hücre evresinden solid
metastazlara ilerleyen hücre sayısı muhtemelen çok azdır.195
2.2.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle İlgili Gen Ekspresyon Paternleri ve
Yolaklar
Meme tümörlerinde hematojen yayılımı belirleyen genler araştırılmaktadır.
Ancak, tümör hücre yayılmasının ilk evresini, özel genlerin aracılığıyla mı rasgele bir
olay mı olduğu tartışmalıdır. Son olarak geliştirilen cDNA-array tekniği, her tümör
örneğinde eşzamanlı olarak binlerce genin ekspresyonunu belirleyen, bu konuyu
araştırmak için değerli bir araç olduğu görünmektedir. Microarray yöntemiyle gen
ekspresyon profilinin belirlenmesi, meme kanserlerinin moleküler portrelerinin ve
subgruplarının tanımlanmasını (örneğin bazal-benzeri grup, normal meme-benzeri grup
ve luminal grup), meme karsinomlarının sınıflandırılmasını ve klinik sonucu hakkında
prognostik bilgi elde edilmesini sağlamaktadır.196-198
Son olarak 2003 yılında Woelfle ve arkadaşları, metastatik kaskatın daha erken
basamaklarında, kemik iliğinde DTC’nin varlığı veya yokluğuyla ilişkili bilgi elde
36
etmek için primer meme tümörlerinin gen ekspresyon analizini yapmıştır.199 Küme
analizi ile eksprese edilen genlerin görüntülenmesi, tümörlerin kemik iliği durumunu
tam olarak yansıtan iki ayrı gen ekspresyon profiline sahip olduğunu göstermiştir. Bu
analizin dikkat çekici bir sonucu da, kemik iliği tutulumu olan tümörlerin çoğunda, gen
ekspresyonunun baskılanmış olmasıdır. Sonuç olarak, birçok genin baskılanması, tümör
progresyonu
için
önemli
bir
mekanizma
olabileceği
yeni
görüşlerle
de
desteklenmektedir.200 Tümör hücrelerinin farklılaşması sürecinde, transkripsiyon
baskılayıcılar (örneğin son olarak tanımlanan polycomb grup proteini EZH2) aşırı
eksprese edilebilmektedir, bunun sonucu olarak metastaz-supresör genler dahil birçok
gen baskılanmaktadır.201 Ayrıca KİSS-1 ve NM23 gibi iki metastaz supresör gen
tanımlanmış ve bunların kemik iliği pozitif tümörlerde, kemik iliği negatif tümörlere
göre daha az eksprese edildiği gösterilmiştir.199
Kemik
iliği
pozitif
tümörlerde,
sitokeratinlerin
down-regüle
edildiği
gösterilmiştir. Bu da, bu yapısal proteinlerin metastaz supresör olarak rol
oynayabileceğini akla getirmiştir. Örneğin meme kanserinde yükselmiş sitokeratin 18
düzeyleri, azalmış metastatik relaps oranları ile ilişkilidir.202 Solid tümörlerde mevcut
verilere ve ekspresyon profili çalışmalarına dayanarak, meme tümör hücrelerinin hücre
iskeleti kompozisyondaki değişimler, epitelyal tümör hücrelerinin mobil hale
gelmesiyle sonuçlanabilir.197,203,204
Kemik iliği mikrometastazı ile ilişkili olduğu belirlenen yolaklardan biri,
metastatik yayılım için potansiyel gücü olduğu bilinen hipoksi ile indüklenen faktör 1alfa (HIF-1 alfa) yolağıdır. En önde gelen faktör, hipoksi ile ilgili çeşitli süreçlerin
(örneğin, proliferasyon, anjiyogenez ve hücre ölümü) transkripsiyon faktörü HIF-1
alfa’dır ve kemik iliği pozitif tümörlerde up-regüle edildiği bilinmektedir. Kemik iliği
pozitif tümörlerde, HIF 1-alfa’nın baskılanmasından sorumlu genlerin downregülasyonu (örneğin VHL ve cullin2) tümör hücrelerinde HIF 1-alfa’nın birikmesine
neden olabilir. HIF 1-alfa protein düzeyleri, meme kanserlerinin erken evrelerinde
yüksektir, bu nedenle meme tümör hücrelerinin erken metastatik yayılımına katkıda
bulunabilmektedir.205 Staller ve arkadaşları HIF 1-alfa’nın, CXCR4’ü aktif hale
getirdiğini göstermiştir.206 CXCR4 ligand CXCL12’yi eksprese eden ve hücrelerin uzak
organlara (kemik iliği, lenf nodu, akciğer ve karaciğer gibi) göçünü uyaran ve
kemotaksisinde rol oynayan G-proteinine bağlı bir kemokin reseptörüdür. Bu veriler,
37
HIF 1-alfa yolağı tümör hücrelerinin hematojen yolla organ-spesifik yayılımına katkı
sağladığını göstermektedir.207
Kemik
iliği
mikroçevresinin
DTC’yi
farklılaşmamış
durumda
tuttuğu
düşünülmektedir. Bu hücrelerin hayatta kalması ve/veya daha sonra uzak organlara
metastaz yapabilmesinin mikroçevre koşulları tarafından belirlendiği düşünülmektedir.
Bu hipotez metastatik meme kanseri için kabul edilirken kolon kanseri için henüz
gösterilememiştir. Tümör hücreleri daha sonra yayıldığı karaciğer ve akciğer gibi
organlarda daha kolay büyüme gösterebilir. Bu görüş Paget’in seed ve soil (tohum ve
toprak) hipoteziyle uyumludur.208,209
C-DNA-array yöntemiyle primer tümörler metastatik kapasitelerinin olup
olmamasına göre iki gruba ayrılmaktadır ve primer tümördeki metastatik klonların
relatif olarak daha fazla sayıda olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, metastatik genotip
ve fenotipin tümör gelişiminin geç evresinde kazanıldığını ve bu metastatik
subklonların primer tümörün çok küçük bir subpopülasyonunu oluşturduğunu savunan
klasik görüşlerle tezat oluşturmaktadır.197,201 Alternatif görüşe göre, tümör hücreleri
metastatik
kapasitelerini
sağlayan
genetik
değişimleri
karsinogenezisin
erken
safhalarında kazanmaktadır ve metastatik potansiyeli olan bu hücreler primer tümörün
göreceli olarak büyük bir kısmını temsil etmektedir.209,210 Bu durum ayrıca erken evre
meme kanserli hastaların kemik iliğinde gizli metastatik hücrelerin varlığını da
açıklayabilir.
2.2.6. Kemik İliği Mikrometastazının Belirlenmesi İçin Kullanılan Yöntemler
Erken tümör yayılımı genellikle klasik histopatolojik analizler (kemik iliği
biyopsisi) veya yüksek rezolüsyonlu görüntüleme yöntemleriyle tespit edilememektedir.
Kemik iliği biyopsi serilerinde mikrometastaz bulunma oranı % 4’den azdır. Meme ve
diğer solid tümörlerde kemik iliği mikrometastazlarını belirlemek için birçok farklı
yöntem kullanılmıştır. Lenf nodları, kan ve kemik iliğinde çok az sayıda ve tek tek
bulunan bu hücreleri bulabilmek için sensitif immünositokimyasal, flovsitometrik ve
moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Kullanılan yöntem, kanser hücrelerini normal
hematopoietik hücrelerden ve kemik iliği alınırken ciltten kontamine olan epitelyal
hücrelerden ayırt edebilmelidir. Kemik iliği, kan ve lenf nodlarında mikrometastatik
38
hücrelerin belirlenmesi için yapılan çalışmalar, kullanılan yöntemler ve mikrometastaz
bulunma yüzdeleri aşağıdaki tablo 6’da özetlenmiştir.
Tablo 6. Meme kanserli hastalarda kemik iliğinde, kanda ve lenf nodlarında minimal
rezidüel hastalık ile ilgili çalışmaların özeti.
Marker
Çalışma (yıl) [Referans]
Doku
Teknik
Hasta sayısı
Mikrometastaz
oranı (%)
Datta ve ark. 1994 (211)
Kİ
CK19
RT-PCR
34
26
Fields ve ark. 1996 (212)
Kİ
CK19
RT-PCR
83
71
Vannucchi ve ark. 1998
(213)
Slade ve ark. 1999 (214)
Kİ
CK19
RT-PCR
33
48
Kan
61
Kİ
RT-PCR
İSK
İSK
23
Braun ve ark. 2000 (99)
CK19/
CK
CK
552
36
Gerber ve ark. 2001 (160)
Landys ve ark. 1998 (215)
Funke ve ark. 1996 (216)
Mathieu ve ark. 1990
(217)
Singletary ve ark.1991
(218)
Cote ve ark. 1991 (219)
Kİ
Kİ
Kİ
Kİ
İSK
İSK
İSK
İSK
484
128
234
93
31
19
38
1
İSK
71
38
İSK
49
37
Harbeck ve ark. 1994
(173)
Diel ve ark. 1996 (190)
Mansi ve ark. 1999 (154)
Porro ve ark. 1988 (220)
Salvadori ve ark. 1990
(221)
Redding ve ark. 1983
(222)
Berger ve ark. 1988 (223)
de Mascarel ve ark. 1992
(224)
Cote ve ark. 1999 (172)
de Mascarel ve ark. 1992
(224)
Cote ve ark. 1999 (172)
Gerber ve ark. 2001 (160)
Bussolati ve ark. 1986
(225)
Noguchi ve ark. 1994
(226)
Schoenfeld ve ark. 1994
(227)
Zhong ve ark. 2000 (228)
Kİ
İSK
100
38
Kİ
Kİ
Kİ
Kİ
CK
CK
CK18
MUC/
CK
MUC/
CK
MUC/
CK
MUC/
CK
MUC
MUC
MUC
MUC
İSK
İSK
İSK
İSK
727
350
159
121
43
25
16
17
Kİ
MUC
İSK
110
31
Kİ
LN
MUC
-
İSK
H&E
285
1.680
27
7
LN
LN
CK
İHK
İHK
736
129
20
10
LN
LN
LN
İHK
İHK
İHK
736
484
50
20
11
23
LN
CK
CK
MUC/
CK
MUC-1
RT-PCR
15
30
LN
CK19
RT-PCR
75
31
Kİ
CK19
26
87/81
Berois ve ark. 2000 (229)
Kİ
42
48/29
Berois ve ark. 2000 (229)
Kan
CK19/
CEA
CK19/
CEA
RT-PCR
İSK
RT-PCR
RT-PCR
37
35/3
Kİ
Kİ
39
Tablo 6’ın devamı
de Cremoux ve ark. 2000
(230)
Kahn ve ark. 2000 (231)
Fabisiewicz ve ark. 2004
(232)
Kan
MUC-1
Kan
Kan
CK19
MAM/
βhCG ve
CK19
CK19/
MAM ve
CK19
MAM
A/B
CK19
Benoy et al. 2006
(233)
Kİ
Janku ve ark. 2004 (234)
Kİ
Stathopoulou ve ark. 2003
(235)
Han ve ark. 2003 (236)
Silva ve ark. 2001 (237)
Zach ve ark.2002(238)
Lin ve ark. 2003 (239)
Lin ve ark. 2003 (239)
Kan
LN
Kan
Kan
Kan
Kan
Ooka ve ark 2001 (240)
Aihara ve ark. 2000 (241)
Silva ve ark. 2001 (237)
Kİ
LN
Kan
İMS ve
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
MAM A
MAM
MAM
MAM
MAM/
CEA
MAM A
MAM B
CK19/
MAM A
MAM A
94
37
109
55
44
38/38/38
İSK/RTPCR
25
62/40/80
RT-PCR
34
12/0
RT-PCR
124
35
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
70
78
59
111
33
84
24
34
37
54/51
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
111
111
45
28
23
49/60
Cerveira ve ark. 2004
Kan
RT-PCR
54
41
(242)
Marchetti ve ark. 2001
LN
MAM A
RT-PCR
248
53/41
(243)
CEA
βhCG, β-human koryonik gonadotropin; Kİ, kemik iliği; CEA, karsino embriyonik antijen; CK,
sitokeratin; H&E, hematoksilen-eozin; MAM, mammaglobin; İSK, immünositokimya; İHK,
immünohistokimya; İMA, immünomanyetik ayırma; LN, lenf nodu; MUC, müsin; RT-PCR, reverse
transcription–polymerase chain reaction.
2.2.6.1. İmmünositokimyasal Yöntemler
Mikrometastatik hücrelerin epitelyal veya tümör ilişkili antijenlerini belirleyen
monoklonal antikorlarla boyanarak tespit edildiği, bugüne kadar en sık kullanılan
yöntemdir.159,215,216,244 Sitokeratinler, lenf nodu, kan veya kemik iliği gibi mezenkimal
dokularda epitelyal tümör hücrelerini tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan
markerlerdir.3 Bununla beraber farklı boyama teknikleri, değerlendirilen hücre sayısı,
kullanılan antikor ve zenginleştirme metodları, yöntemin özgüllüğünü önemli ölçüde
etkilemektedir. Yapılan çalışmalarda immünositokimyasal yöntemlerle kemik iliği
mikrometastazı bulunma oranının, kullanılan antikora bağlı olarak % 4-48 arasında
değiştiği
bildirilmiştir.245,246
Bu
nedenle
uluslararası
organizasyonlar,
immünositokimyasal yöntemlerin prospektif çalışmalarla değerlendirilerek standart hale
getirilmesini önermektedir.247-249
40
İmmünositokimyasal
analizler
genellikle,
dansite
gradient
santrifüjü,
immünomanyetik işlemler veya hücre filtrasyon metodları gibi zenginleştirme
yöntemleriyle birlikte kullanılmaktadır.250-253 Son zamanlarda daha iyi zenginleştirme
elde edebilmek için geliştirilmiş dansite gradient ve antikor-bağlı manyetik partiküller
kullanılmıştır.254-257 Mononükleer hücre fraksiyonunu izole etmek için kullanılan yeni
zenginleştirme
tekniklerinin
standart
dansite
gradient
yöntemine
üstünlüğü
gösterilememiştir.
İmmünositokimyasal yöntemle boyanmış lamların mikroskopda taranması,
manuel olarak ışık mikroskobuyla veya imaj-analiz tarama sistemleri ile yapılabilir.
Yeni otomatik sistemlerin kullanımı sonuçların daha hızlı elde edilmesini ve verimliliği
sağlamaktadır.255,258-262 CellSearch™ system, otomatik immünomanyetik zenginleştirme
ile kan örneklerinde sitokeratin pozitif hücreleri saymak için giderek daha fazla
kullanılan bir yöntemdir.
Kemik iliğine dissemine olmuş tümör hücrelerini bulmak için farklı monoklonal
ve poliklonal antikorlar veya antikor karışımları kullanılmıştır. Kullanılan antikorlar;
EMA (epitelyal hücre yüzey antijeni)3, TAG12 (tümör-ilişkili glikoprotein)215 ve
sitokeratinlere (epitelyal hücre iskeletinin başlıca yapısal proteinleri)160,216,244 karşı
olabilir. Bununla beraber, hem immünositokimyasal hem de moleküler yöntemlerin
klinikle ilgisi, metodolojik farklılıklar nedeniyle tartışmalı yorumlara sebep olmuştur.
Ayrıca, sitokeratin 19 (CK19), epitelyal membran antijen (EMA) ve müsin-1 gibi bazı
antijenlerin, eritroblastlar gibi hematopoietik prekürsör hücrelerle çapraz reaksiyon
vermeleri nedeniyle, marker ve antikor seçilirken yanlış pozitiflik sorunu göz önünde
bulundurulmalıdır. Normal mononükleer hücrelerde polimorfik epitelyal müsinlerin
(PEM) yanlış pozitiflik oranı % 2-10’dur. Sitokinlere yönelik antikorlar oldukça
spesifiktir, ancak normal bir kemik iliğinde çok nadiren plazmasitoid hücrelerde yanlış
pozitiflik görülebilir. Yanlış pozitifliğin dışlandığı durumlarda ise, henüz tanı
koyulmamış başka bir epitelyal tümörün varlığı araştırılmalıdır. Farklı sitokeratin
antijenlerine
karşı
bazı
antikorların
kombinasyonları
veya
farklı
sitokeratin
proteinlerinin ortak epitopunu tespit edebilen antikorlar (örneğin sitokeratin 8, 18 ve
19’u tanıyan A45B/B3), tek sitokeratin proteinini hedefleyen monospesifik antikorlara
(örneğin sitokeratin 18’i tanıyan sitokeratin 2) göre daha üstün görünmektedir.3,246,247
Çünkü solid tümör hücreleri, önemli derecede antijenik heterojeniteye sahiptir. Kemik
41
iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için en sık A45B/B399,115,246,263-265 ve
AE1/AE3161,177,266 kullanılmıştır ve her ikisininde de yanlış pozitiflik oranları düşüktür.
A45B/B3’ün kullanıldığı çalışmalarda özgüllüğü ve duyarlılığı ispatlanmıştır (Yanlış
pozitiflik oranları % 5’den azdır). AE1/AE3 ve CAM 5.2 gibi pansitokeratin antikorları,
immünohistokimyasal yöntemlerle lenf nodlarında mikrometastazın belirlenmesi için
kullanılmıştır.
Bu yöntemin doğruluğu için en az 2x106 mononükleer hücrenin değerlendirilmesi
gereklidir. Bu yaklaşımla, milyonlarca hematopoetik hücre içinde tek bir tümör hücresi
bulunabilir ve halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Bu yaklaşımın bir avantajı
da, tümör hücrelerinin moleküler düzeyde daha iyi tanımlanması ve morfolojik
analizinin yapılabilmesidir. Ayrıca bu yöntem hücrelerde c-erb-B2 gibi önemli biyolojik
markerlerin ekspresyonunun belirlenmesine yardımcı olmaktadır (c-erb-B2 gen
amplifikasyonu FİSH yöntemiyle kombine edilerek belirlenmektedir). Bununla beraber
sitokeratinler gibi hücre içinde bulunan hedeflerin boyanması için, antikorun hücreye
permeabilizasyonu gereklidir. Bu işlem hücrelerin canlılığını yitirmesiyle sonuçlanabilir
ve bu yöntemle hücrelerin ölü veya canlı olduğunu tespit etmek imkânsızdır. Ayrıca
hematopoetik hücreler direk olarak alkalen fosfataza karşı reaktif olabilir veya endojen
peroksidaz üretebilir. Kronik inflamasyon gibi durumlarda veya anormal plazma
hücrelerinin varlığında, yüzeylerindeki kappa ve lambda hafif zincirler alkalen fosfataz
ile reaksiyona girerek, nonspesifik boyanmalarına neden olabilir. Eğer bu enzimler tam
olarak bloke edilmezse, alkalen fosfataz veya peroksidaza dayalı metotlarda yanlış (+)
sonuçlar elde edilebilir.246,267,268
İmmünositokimyasal yöntem, rutin uygulama açısından zaman alıcı, pahalı ve
yorumlayan kişiye bağlı olarak sonuçları değişkenlik gösterebilen bir yöntemdir.
Kalitatif flovsitometri ise immünositokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek
duyarlılıkla tümör yükünü belirlemek için kantitatif ölçümlerin yapıldığı, rezolüsyonu
iyi, hızlı, tekrar edilebilir ve istatistiksel olarak daha güvenilir bir yöntemdir.269
2.2.6.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Kemik iliğinde mikrometastatik tümör hücrelerini bulmak için, moleküler
yöntemler yaygın olarak kullanılmıştır. PCR kalitatif ve kantitatif olarak, tümör
hücrelerinin genetik (allel-spesifik ekspresyon, mikro-satellit instabilite, heterozigosite
42
kaybı) ve epigenetik sapmalarının (metilasyon durumu) belirlenmesi ve özelliklerinin
ortaya konması için üzerinde çalışılan bir yöntemdir. Bu araştırmalara onkogen veya
tümör supresör genlerdeki tümör-ilişkili nokta mutasyonları da dahildir. Ayrıca
tümörler arasındaki genetik varyasyonlar bu yöntemle karşılaştırılabilir. Örneğin, TP53
geni, P53 proteinini kodlamaktadır. Meme tümörlerinin % 25’inde mutasyona
uğramıştır, ancak bu gende 1400’den fazla mutasyon bildirilmiştir.268 PCR yöntemiyle
plazmadaki serbest DNA bulunabilir. Meme kanserinde spesifik genlerin (ESR1, APC,
HSD17B4, HIC1, RASSF1A) DNA’sındaki metilasyon analizininin prognostik değeri
gösterilmiştir. Örneğin RASSF1A metilasyonunun ölçümü, adjuvan tamoksifen
tedavisinin etkinliğini izlemek için önemlidir. Ancak PCR’ın burada kullanımı, düşük
özgüllüğü nedeniyle sınırlıdır.269
Kemik iliğinden PCR ile nükleik asit amplifiye edilebilir, böylece heterojen bir
hücre popülasyonu içinde yüksek bir duyarlılıkla çok az sayıdaki tümör hücreleri
bulunabilir. Bununla beraber, tümör hücrelerinin DNA ve mRNA ekspresyon paternleri,
çevrelerindeki hematopoetik hücrelerden ayırt edilmeleri için farklı olmalıdır. Meme
karsinomları DNA seviyeleri genetik olarak tamamen heterojendir, genel olarak
uygulanabilir bir DNA markeri yoktur. Bu nedenle, meme karsinomlarında moleküler
tanısal yöntemler geliştirmek için araştırmacılar genellikle RNA markerlerini
kullanmıştır. Dissemine olan tümör hücreleri bulabilme duyarlılığını artırmak açısından,
tümör-spesifik mRNA markerlerinin kullanıldığı çok markerli yaklaşımlar, tek markerli
yöntemlere göre daha üstündür. Çünkü mikrometastatik hücrelerde mRNA ekspresyonu
önemli farklılıklar göstermektedir. Bu yaklaşımla yanlış pozitiflik oranları azaltılırken,
yöntemin duyarlılığı artırılır.270,271 Sitokeratin 18, sitokeratin 19, sitokeratin 20, müsin-1
ve karsino-embriyojenik antijen gibi birçok transkript; tümör spesifik markerler olarak
değerlendirilmiştir.272,273 Ancak, bu transkriptlerin çoğu, RT-PCR ile normal kemik
iliği, kan ve lenf nodlarında da saptanabilir. Ayrıca bu yöntemle canlı-ölü hücrelerin
ayrımı ve hücrelerin morfolojik analizi yapılamamaktadır. Önemli bir nokta da,
mikrometastatik tümör yükü hakkında net bilgi elde edilememesidir.274-276 Analiz öncesi
örneklere karışan normal hücre fraksiyonunun azaltılması (örneğin, granülositler
sitokeratin 20 eksprese etmektedir) veya cut-off değeri iyi belirlenmiş kantitatif RTPCR yönteminin kullanılması, bu problemin çözülmesine yardımcı olabilir. Ayrıca,
43
mRNA markeri ekspresyonu down-regüle edilebilir, bu durumda çok parametreli RTPCR kullanılması daha uygun bir yöntemdir.277,278
Bununla beraber birkaç çalışmada, RT-PCR yönteminin, 107 normal hücre içinde
tek bir tümör hücresini bulacak hassasiyette olduğu ve immünositokimyasal yönteme
üstün olduğu ileri sürülmüştür.211,279-281 Bu çalışmalarda kullanılan markerler
immüsitokimyasal metodlarla benzerdir ve genellikle sitokeratin 19 kullanılmıştır.
Smith ve arkadaşları, periferik kanda immünositokimyasal ve PCR yöntemini birlikte
değerlendirmiştir. PCR yöntemiyle hastaların % 50’sinde, immünositokimyasal
yöntemle ise hastaların % 42’sinde pozitiflik saptamışlar ve bu nedenle PCR
yönteminin daha hassas bir yöntem olduğunu ileri sürmüşlerdir.282
2.2.6.3. Enzim-Bağlı İmmunospot (ELİSPOT) Teknolojisi
Hem immünositokimya hem de RT PCR yönteminin canlı ve apopitotik hücreler
arasında ayrım yapamaması nedeniyle, son zamanlarda mikrometastatik hücrelerin
analizi için bu önemli farkı ayırt etmeye olanak tanıyan yeni bir teknik geliştirilmiştir.283
ELİSPOT tekniği spesifik marker proteinlerin sekresyon veya aktif salınımını kullanan
enzim-bağlı immünospot teknolojisinin adapte edilmiş şeklidir. ELİSPOT sadece canlı
tümör hücrelerinin bulunmasını sağlayabilir ve protein sekresyonu tek bir hücre
düzeyinde belirlenebilir.284 Primer tümörden köken alan dolaşımdaki ve kemik
iliğindeki mikrometastatik hücrelerin bulunması için, MUC1 ve CK19 marker
proteinleri olarak kullanılmaktadır.285 MUC1-sekrete eden dolaşımdaki tümör hücreleri,
analiz edilen bütün metastatik meme kanserli hastalarda bulunmuştur, ancak bu
hücreler, sağlıklı kontrol grubunda gözlenmemiştir. Bu yöntemle MUC1 ve CK19
sekrete eden hücrelerin sayılması yoluyla, uzak metastazı olan meme kanserli hastaların
% 90’ında, uzak metastazı olmayan hastaların ise % 54’ünde kemik iliğinde
mikrometastatik hücreler tespit edilmiştir.285
Bu veriler yeni EPİSPOT teknolojisinin, yüksek duyarlılık ve özgüllüğünü
göstermiştir, bu nedenle erken metastatik yayılımın biyolojisinin anlaşılması için umut
vadeden bir yöntem gibi gözükmektedir.
44
2.2.6.4. Flovsitometrik Yöntem
Flovsitometrik yöntem, kan ve kemik iliğindeki göreceli olarak çok az sayıdaki
kanser hücrelerini bulmak için geliştirilmiştir.286-288 Bu yöntem özellikle 106 hücre
içinde tek bir hücreyi belirleyebilecek duyarlılığa sahip olduğu rapor edilmiştir, ancak
bu duyarlılık tüm çalışmalarda gösterilememiştir.289 Clevenger ve arkadaşları CD45 ve
sitokeratin18
monoklonal
antikorları
kullanılarak
tümör
hücrelerinin
normal
hematopoietik hücrelerden yüksek duyarlılıkla ayırt edilebileceğini bildirmiştir.287 Leers
ve arkadaşları, anti-sitokeratin antikorların kullanıldığı çok parametreli flovsitometri
(MP-FCM) yöntemiyle, meme kanserli hastaların lenf nodlarında mikrometastatik
tümör
hücrelerini
immünohistokimyasal
bulmayı
amaçlamışlardır.
yöntemlerle
lenf
nodu
Hematoksilen
metastazı
eozin
saptanan
(HE)
38
ve
hasta,
flovsitometrik yöntemle değerlendirilmiş ve % 1 hatayla hastaların 37’sinde lenf
nodlarında tümör hücreleri bulunmuştur. MP-FCM’nin yüksek duyarlılık ve özgüllüğe
sahip olduğunu, bu yöntemle tüm lenf nodunun değerlendirilebileceği, ploidi hakkında
bilgi edinilerek moleküler çalışmalara yardımcı olabileceğini ileri sürmüşlerdir.290
Flovsitometrik yöntemin en büyük dezavantajı, pozitif sonuçların morfolojik
özelliklerinin ortaya koyulamamasıdır. Ayrıca hem RT-PCR hem de flovsitometrik
yöntemde normal kontrol hastalarında yanlış pozitiflik bildirilmiştir.230,291,292 Bununla
beraber geliştirilmiş hücre-sınıflandırma teknolojileri kullanılarak, seçilen hücre
popülasyonunun morfolojik değerlendirmesi yapılabilir.
İmmünositokimyasal ve flovsitometrik yöntemlerin karşılaştırıldığı çalışmalarda,
farklı sonuçlar elde edilmiştir.286,293-295 Molino,
Vredenburgh
ve
arkadaşları
immünohistokimyanın daha üstün bir yöntem olduğunu öne sürmüşlerdir.293,295 Bunun
aksine, Gross ve arkadaşları yüksek duyarlılığa sahip bir flovsitometrik yöntem
geliştirmiştir ve bu yöntemle kemik iliği mikrometastazı bulma oranı % 10-40 olarak
bildirilmiştir. Ancak bu duyarlılığa ulaşmak için, örneğin 40 saat analiz edilmesi
gerekmektedir ve çok sayıdaki örneğin analizi için oldukça zaman alıcı bir yöntemdir.
Buna rağmen flovsitometri lenfoma ve lösemi hastalarında rezidüel hastalığın
belirlenmesi için önemli bir yöntemdir.296,297 Epitelyal tümörlerde kemik iliği
mikrometastazını belirlemek için, flovsitometrinin immünositokimyasal yönteme
üstünlüğünü gösteren herhangi bir çalışma yoktur. Mikrometastazın belirlenmesi için
kullanılan bazı örnek hücre dizilerinin özellikleri tartışmalara neden olmaktadır.298
45
Örneğin, eğer sitokeratin antikorları kullanılırsa, sitokeratin ekspresyon kaybı bu
hücrelerin bulunmasını engellemektedir. Meme kanser hücreleri çok parametreli DNA
flovsitometri ile araştırıldığında, sitokeratin kaybının, mevcut hücresel faktörlerin ve
kullanılan hazırlık prosedürünün bir sonucu olduğu gösterilmiştir.294 Bu nedenle, in vivo
kanser hücrelerinin seçilmiş in vitro hücrelere göre farklı özellikler gösterebilmesi
nedeniyle, DNA içeriğinin değerlendirilmediği çalışmalarda bu metodun klinikle ilişkisi
tartışmalıdır.
Çabioğlu ve arkadaşları tarafından yapılan ve immünomanyetik zenginleştirme
sonrası flovsitometrinin kullanıldığı bir çalışmada
meme kanserli hastaların
% 33,3’ünde kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır.299 Bu çalışmada sitokeratin 7 ve
8’e yönelik CAM5-2 monoklonal antikoru ve flovsitometrik değerlendirme için spesifik
MCF-7 meme kanseri hücre dizisi kullanılarak non-spesifik boyanma nedeniyle oluşan
yanlış pozitiflik dışlanmıştır. Ayrıca, flovsitometriye ilave olarak morfolojik analiz için
başka bir tekniğin kullanılmadığı durumlarda, tekniğin güvenirliğini artırmak için
negatif ve pozitif kontrollerin değerlendirilmesi önerilmiştir. Braun ve arkadaşları,
özellikle erken meme kanserli hastaların kemik iliğinde mikrometastatik hücre sayısının
çok az olması nedeniyle, uygun zenginleştirme yönteminin kullanılmadığı çalışmalarda
yöntemin başarısız olacağını ileri sürmüşlerdir.158
2.2.7. Çalışmamızda Kullandığımız Markerler
Çalışmamızda, flovsitometrik yöntemle evre I-IV meme kanserli 52 hastada
kemik iliği mikrometastazı prevalansı, sitokeratin pozitif hücrelerin meme kanseri kök
hücresi ile benzerliği ve bu hücrelerde çeşitli sitokeratinlerin ekspresyon paternlerinin
değerlendirilmesi amaçlandı. Günümüze kadar kemik iliği mikrometastazlarının
belirlenmesi için en yaygın olarak sitokeratinleri tanıyan monoklonal antikorlar
kullanılmıştır.
2.2.7.1. Sitokeratinler
Sitokeratinler, epitelyal dokuda intrasitoplazmik hücre iskeletini oluşturan ara
filamanlardır. Biyokimyasal özellikleri birbirinden farklı 20 polipeptit tanımlanmıştır.
Moleküler ağırlıkları 40-68 kDa, izoelektrik pH’ları 4.9-7.8 arasında değişmektedir.
Düşük moleküler ağırlıklı asidik tip I ve yüksek moleküler ağırlıklı bazik veya nötral tip
46
II sitokeratinler olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Sitokeratinler genellikle biri tip I ve
diğeri tip II sitokeratinden oluşan çiftler halinde heterotetramerleri oluştururlar. Yüksek
moleküler ağırlıklı bazik veya nötral tip II sitokeratinler; CK1, CK2, CK3, CK4, CK5,
CK6, CK7, CK8 ve CK9 alt tiplerini kapsamaktadır. Düşük moleküler ağırlıklı asidik
tip I sitokeratinler ise CK10, CK12, CK 13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 ve
CK20’dir. Sitokeratinlerin ekspresyonu çoğunlukla organ ve dokuya spesifiktir.
Örneğin CK7 genellikle genitoüriner sistem epitelinde, CK20 ise gastrointestinal sistem
epitelinde eksprese edilmektedir. Histopatolojide çeşitli tümörlerin orjinini bulmak için
bu farklılıklardan yararlanılmaktadır.
Epitelyal hücrelerde eksprese edilen sitokeratinlerin alttipleri, başlıca epitelin tipi,
matürasyon ve farklılaşma derecesiyle ilişkilidir. Bu nedenle, epitelyal dokular
sitokeratin ekspresyon profillerine göre sınıflandırılmaktadır. Epitelden köken alan
karsinomlarda sitokeratin profili değişmemektedir. Tümörlerin ayırıcı tanısı ve cerrahi
patolojide; immünositokimya, sitopatoloji ve flovsiyometri yöntemleriyle sitokeratin
profilinin belirlenmesi yaygın olarak kullanılmaktadır.
Sitokeratinler 30 geni kapsayan bir gen ailesi tarafından kodlanmaktadır.
Sitoplazmada keratin filamentleri kompleks bir yapı oluşturarak hücre membran
yüzeyinden nükleusa uzanmaktadır. Plazma membranı ve nükleer yüzey arasındaki bu
etkileşim, sitoplazma ve hücresel iletişim mekanizmaları (mitoz, post-mitotik periyot,
hücre hareketi ve farklılaşma) için çok önemlidir. Sitokeratinler desmozom ve
hemidesmozomlarla etkileşmektedir. Bu sayede hücre-hücre adezyonu ve bazal
hücrelerin konnektif dokuyla bağlantısı sağlanmaktadır.300,301
Epitel hücrelerinde başlıca CK8, CK18, CK19 ve CK20 eksprese edilmektedir.
Bunlar arasında meme kanserinde kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için en
fazla kullanılan CK19’dur. Ancak diğer tümörler için özgüllük ve duyarlılığı düşüktür.
CK6 ve CK16 baş-boyun tümörlerinde, CK7 küçük hücreli dışı akciğer kanserinde,
CK17 oral ve orofarinks skuamoz hücreli karsinomlarda, CK20 ise peritoneal, gastrik,
kolorektal ve hepatik tümörlerde mikrometastazları belirlemek amacıyla kullanılmıştır.
2.2.7.1.1. Sitokeratin 4
Sitokeratin 4, kornea ve transizyonel epitel (mesane) dahil non-kornifiye skuamoz
epitelde (dil, larinks, farinks, epiglottis, özofagus, ekzoserviks, vajina) bulunmaktadır.
47
Silialı psödostratifiye epitel (bronş) ve çeşitli egzokrin glandlardaki duktal epitelde
zayıf pozitiftir. Normalde sitokeratin 4 epidermisde bulunur, fakat derinin glandüler
dokularında da (ter bezleri) fokal pozitif bulunabilir. Deri epidermisi başlıca bazal
tabakada sitokeratin 14 ve 19, kornifiye tabaka ise sitokeratin 1 ve 10 içermektedir.
Sitokeratin 4, kornifiye skuamoz epitelden köken alan skuamoz hücreli karsinomlarda
eksprese edilmektedir. Monoklonal anti-sitokeratinler epitelyal tümörlerin tanımlanması
ve sınıflandırılması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Monoklonal anti-sitokeratin 4
zincir spesifik antikordur ve normal, metaplazik veya neoplazik hücreleri tanımlamak
için kullanılmaktadır.
Meme kanserlerinin büyük kısmı lüminal hücrelerden köken almaktadır. Meme
kanserinde grade ve sitokeratin profili arasında korelasyon vardır. grade 1 ve 2
tümörlerde genellikle basit (luminal) epitele özgü sitokeratinleri, yüksek grade tümörler
ise stratifiye epitelyal keratinler (yüksek molekül ağırlıklı CK4, CK14 ve/veya CK17)
eksprese etmektedir.300 Bu sitokeratin fenotipi, özellikle lenf nodu pozitif hastalarda
azalmış toplam ve hastalıksız sağkalım, ER negatifliği ile ilişkilidir. Ayrıca bu alt
grubun diğer bir özelliği de HER2(-) olmasıdır. Normal meme bazal hücreleri dışında,
meme kanserinde % 2-18 ve grade 3 benign meme lezyonlarında % 25 oranında bu
yüksek molekül ağırlıklı sitokinler saptanmaktadır. Bu nedenle bu meme kanseri grubu
bazal/miyoepitelyal fenotip gösteren grup olarak adlandırılır. Ayrıca bazal-benzeri,
bazaloid grup da sinonim olarak kullanılmaktadır. Meme kanserlerinin hemen hemen
tamamında basit (luminal) epitelyal sitokeratinler eksprese edilmektedir (CK7, CK8,
CK18 ve CK19). grade 3 karsinomların yaklaşık % 60’ı bimodal ekspresyon paternine
sahiptir ve stratifiye epitelyal keratinlerden en az biri ko-eksprese edilmektedir. (CK4
% 36, CK5 % 18, CK14 % 20 ve CK17 % 38)302,303,304
2.2.7.1.2. Sitokeratin 6a
Sitokeratin 6, epitelyal dokularda normal şartlarda heterojen olarak eksprese
edilmektedir, ancak stratifiye epitelin indüklendiği hücre proliferasyonu veya anormal
farklılaşma durumlarında ekspresyonu artmaktadır. Bu nedenle hiperproliferasyon ile
ilişkili keratin olarak adlandırılmaktadır. CK6a, CK6 izoformları arasında deride ve
hücre kültürlerinde üretilen epitelyal hücre dizilerinde baskın olarak eksprese edilen
sitokeratindir. (% 77) Sitokeratin6, kıl folliküllerinde, baş-boyun skuamöz hücreli
48
karsinomlarında, çeşitli internal çok katlı epitelin suprabazal hücrelerinde, hem normal
hem de hiperproliferatif durumlarında eksprese edilmektedir. Normal meme dokusunda
eksprese edilmemektedir. Moll ve arkadaşları tarafından western-blott yöntemi
kullanılarak, meme duktuslarının bazal ve progenitör hücrelerinde sitokeratin5 ve 6’nın
baskın olarak eksprese edildiği gösterilmiştir.305,306 Meme kanserlerinde sitokeratin6
ekspresyonu, ER negatifliği, c-erb-B2 pozitifliği yüksek nükleer grade ve tek odaklı
DCİS varlığı ile ilişkili bulunmuştur. Sitokeratin6 pozitif tümörlerin, negatif tümörlere
göre daha primitif hücrelerden köken aldığı düşünülmektedir.307
2.2.7.1.3. Sitokeratin 8
Tip II yüksek moleküler ağırlıklı keratinlerdendir ve hücrelerde sitokeratin 18 ile
birleşmiş halde bulunmaktadır. Sitokeratin 8, başlıca normal non-skuamöz epitel
(endokrin ve ekzokrin glandüler epitel), sindirim (karaciğer, pankreas ve ince ve kalın
bağırsak), solunum ve genitoüriner sistem epiteli ile beraber adenokarsinom ve duktal
karsinomların hemen tamamında pozitiftir. Skuamöz hücreli karsinomlar da ise
negatiftir. Hepatosellüler karsinomlarda sitokeratin 8 ve 18’e bağlanan antikorların
pozitifliği ile tanı koyulmaktadır.
Sitokeratin 8, 18 ve 19, mikrometastatik hücrelerde pozitif olduğu için, kemik iliği
mikrometastazının belirlenmesi için özellikle immünositokimyasal yöntemlerde yaygın
olarak kullanılmıştır. Sitokeratin 8 ve 18’in ekspresyon profili sitokeratin 19 ile
benzerdir. Sitokeratin 8, meme epitelinde bazal benzeri hücrelerden ziyade luminal
benzeri hücrelerde eksprese edilmektedir. Dolayısıyla bazal benzeri tümörlerden köken
alan mikrometastatik hücreleri bulmak göreceli olarak daha zordur.269
2.2.7.1.4. Sitokeratin 10
Sitokeratin 10, iki tip I ve iki tip II sitokeratinden oluşan heterotetramer yapıda bir
sitokeratindir. Genel olarak sitokeratin 1 ile birlikte bulunmaktadır. Stratum korneum
dahil tüm suprabazal hücre tabakalarında bulunmaktadır. Çalışmamızda kullandığımız
monoklonal antikor, keratinize çok katlı yassı epitel ve iyi diferansiye skuamöz
karsinomlarda pozitiftir ve mikrometastatik hücreleri, cilt epitelinden kontamine olmuş
hücrelerden ayırt etmek için kullanılmıştır.
49
2.2.7.1.5. Sitokeratin 18
Sitokeratin
18,
non-skuamöz
epitelde
ve
adenokarsinomlar
ve
duktal
karsinomların çoğunda pozitif olan asidik keratindir. Skuamöz hücreli karsinomlarda
negatiftir. Sitokeratin 8 ile kombinasyon halinde bulunmaktadır. Çalışmada kullanılan
monoklonal antikor çeşitli basit epitelde pozitifken stratifiye skuamöz epitelde
negatiftir. Meme, gastrointestinal kanal, akciğer, pankreas, over ve tiroid gibi epitelyal
kanserlerde kullanılmaktadır.
Meme kanserinde ise CK18 ekspresyonu CK8 ile birlikte özellikle luminal
hücrelerden köken alan tümörlerde görülmektedir.269 CK18, epitelyal tümörlerde kemik
iliğindeki mikrometastazların belirlenmesi için en sık kullanılan markerlerden biridir.
Ancak bazal hücrelerden köken alan mikrometastatik hücreleri belirlemek için uygun
bir marker değildir. Mikrometastatik hücrelerde ortak bir sitokeratin epitopunu
belirleyen
A45B/B3;
CK8,
CK18
ve
CK19’u
tanımaktadır.
Bu
antikor
immünositokimyasal yöntemlerde yaygın olarak kullanılmıştır. Meme, prostat,
gastrointestinal sistem tümörlerinde de flovsitometrik yöntemlerle yapılan çalışmalarda
en sık kullanılan markerdir. Bizim çalışmamızda bu sitokeratini tanıyan monoklonal
antikoru kullanılmıştır.
Normal hücrelerin kanser hücrelerine dönüşümü sırasında hücre iskeletinde
meydana gelen değişiklikler açıkça ortaya koyulmuştur. Primer meme tümörlerinde
CK18 ekspresyonu ile metastatik potansiyeli arasında ilişki bulunmuştur. Yüksek
oranda CK18 ekspresyonuna sahip tümörlerin metastatik potansiyeli düşüktür. CK18
ekspresyon kaybı, tümör hücrelerinin daha mobil olmasına neden olmakta ve meme
tümörlerinde prognostik önemi olduğu düşünülmektedir.269,308 Metastatik tümörlerde ise
CK18 ekspresyonu down-regüle edilmektedir.202 Ayrıca, farelerde yapılan bir
çalışmada, meme kanser hücrelerine keratin 18 geninin transfeksiyonu sağlanarak,
adezyon molekül ekspresyonunun indüklendiği ve in vivo veya in vitro olarak
metastazların gerilediği gösterilmiştir.309
CK18
ayrıca
meme
kanserinde
bazı
kemoterapi
ajanlarına
yanıtın
değerlendirilmesi için kullanılmıştır. ELİSA yöntemiyle CK18 yıkım ürünleri ve
parçalanmamış CK18 düzeyleri ölçülmüş; dosataksel alan hastalarda apopitozisin
indüklenmesi nedeniyle CK18 yıkım ürünleri, florourasil, epirubisin ve siklofosfamid
50
(FEC) alan hastalarda ise hücre yıkımı nedeniyle parçalanmamış CK18 düzeylerinin
yükseldiği gösterilmiştir.310
2.2.7.2. Epitelyal Hücre Adezyon Molekülü (EpCAM)
Epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM), 40 kDa ağırlığında bir hücre yüzey
antijenidir. Bu antijen farklı gruplar tarafından farklı isimlendirilmiştir. (CD326, ESA,
HEA125 ve TACSTD1 gibi) Epitelyal karsinomlarda tümör spesifik molekül olan
EpCAM’a karşı birçok monoklonal antikor geliştirilmiştir. EpCAM tip I transmembran
glikoproteindir. Erişkin skuamöz epiteli, hepatosit ve gastrik epitel gibi bazı spesifik
epitelyal hücreler dışında, epitelyal dokuların çoğunda bazolateral membranda eksprese
edilmektedir. EpCAM’ın, tümör hücrelerinde ekspresyonunun artması nedeniyle erken
malignensinin olası bir markeri olabileceği rapor edilmiştir. Metastatik meme kanser
hücrelerinin % 60’dan fazlasında EpCAM eksprese edilmektedir. Ayrıca displastik
skuamöz epitelde de novo ekspresyonu görülebilir.269,311,312
Meme kanserinde EpCAM’a yönelik monoklonal antikorlar, mikrometastatik
hücrelerin immünomanyetik olarak ayrılması ve RT-PCR analizi için zenginleştirme
yöntemlerinde kullanılmıştır.268 Bu antijeni tanımlayan monoklonal antikorlar tanısal
yöntemler yanında tedavi seçeneği olarak da kullanılmıştır. Meme kanseri dahil
epitelyal malignensiler için yüksek duyarlılığı olmasına rağmen, dolaşan tümör
hücrelerini bulmak için kullanıldığında normal periferik kan hücrelerinde düşük sayıda
eksprese edildiği gösterilmiştir.313
Meme
ve
kolorektal
kanserlerde
antikora
dayalı
immünoterapi
için
mikrometastatik hücreler uygun bir hedeftir. (örneğin EpCAM için edrekolomab gibi)
Ancak hedef antijenler bu hücrelerde heterojen olarak eksprese edilmektedir ki
monospesifik antikor tedavisinin etkinliğini sınırlamaktadır. Tek doz 500 mg.
edrekolomab ile tedavi edilen, kemik iliği mikrometastazı tespit edilmiş, metastatik ve
lokal nüks olan 10 meme kanseri hastası tedaviden 5-7 gün sonra değerlendirildiğinde,
mikrometastatik hücre sayısının önemli ölçüde azaldığı ve 4 hastada tamamen elimine
edildiği gözlenmiştir.314
Primer meme tümörlerinde EpCAM aşırı eksprese edilmektedir. Hastalıksız
sağkalım ile ilişkilidir. Meme kanseri gelişmesinde direk olarak katkısı bulunmaktadır.
İn vitro çalışmalarda EpCAM ekspresyonunun baskılanarak meme kanseri fenotipinin
51
dramatik
olarak
değiştiği,
proliferasyon
ve
invaziv
potansiyelin
azaldığı
gösterilmiştir.315,316
2.2.7.3. CD24
CD24 (ısıya dayanıklı antijen olarak bilinir) 30 aminoasitten oluşan kor polipeptiti
ve yüksek karbonhidrat içeriği olan fosfatidil-inositol ile bağlı bir hücre yüzey
glikoproteinidir. Fare lenfoma hücrelerinden molekül ağırlığı 40-60 ve 23-30 kDa
arasında değişen iki formu izole edilmiştir. CD24 B hücrelerinin gelişiminin tüm
evrelerinde ve timüsten gelişen çoğu T hücre prekürsörlerinde (timosit) eksprese
edilmektedir. T hücrelerinin matürasyonu ile CD24 ekspresyonu kaybolurken CD4 veya
CD8 eksprese edilmeye başlanmaktadır. CD24 ayrıca granülosit, monosit, Langerhans
hücreleri ve eritrositlerde pozitiftir. P selektin için alternatif bir ligantdır. Endotelyal
hücrelerde ve trombositlerde adezyon moleküllerinin ekspresyonunu artırmaktadır.
CD24 B hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynamaktadır.
CD24 ayrıca pankreas kanseri için pozitif bir markerdir. Tümör hücrelerinde CD24
ekspresyonu metastaz potansiyelini artırmaktadır ve karsinomlar dahil birçok kanserde
aşırı eksprese edilmektedir. Bu nedenle potansiyel olarak erken tümör markeri gibi
düşünülebilir.317-320
Meme
kanserinde
immünositokimyasal
ekspresyonunun kötü prognozla ilişkili olduğu bulunmuştur.
321
yöntemle
CD
24
Son veriler meme
tümörlerinde karsinogenez sırasında CD24 ekspresyonunun azaldığı veya kaybolduğu
gösterilmiştir. Bu da kanser kök hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir.322,323 CD24
stromal hücrelerden salınan faktör-1 ile ilişkili olarak migrasyon ve sinyal iletimini
sağlamaktadır. Bu nedenle mikrometastatik hücrelerde CD24 ekspresyon kaybı, bu
hücrelerin metastatik potansiyelini baskılamaktadır.
Meme
kanserinde
kemik
iliğinde
bulunan
mikrometastatik
hücrelerin,
mezenkimal kök hücre ile benzer özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler
meme kanseri kök hücresi olarak değerlendirilmiştir. Mezenkimal kök hücresi gibi bu
hücrelerde de CD44+/CD24zayıf+/- olarak tespit edilmiştir. Biz de çalışmamızda bu
nedenle mikrometastatik hücrelerde CD24 ve CD44 ekspresyonunun değerlendirilmesi
amaçlanmıştır.
52
2.2.7.4. CD44
CD44, fagositik glikoprotein-1 (pgp-1) veya HCAM olarak bilinen tip 1
transmembran glikoproteinidir. CD44, hyaluronik asit için reseptördür ve birçok
izoformu vardır. Başlıca izoformu olan tip 1 glikolize transmembran proteini, lenfosit,
myeloid hücreler ve eritrositlerde eksprese edilmektedir. Diğer izoformları glikozaminoglikan içermektedir ve hematopoietik veya hematopoietik olmayan hücrelerde
eksprese edilmektedir. CD44 lökositlerin endotelyal hücrelere, stromal hücrelere ve
ekstrasellüler matrikse adezyonu ile ilişkilidir.324,325
CD44’ün v6 epitopu meme kanserlerinde yaygın olarak eksprese edilmekle
beraber prognostik önemine dair tartışmalı bilgiler vardır. Meme tümörleri ve meme
glandındaki fonksiyonu henüz bilinmemektedir. Normal meme dokusundaki kök
hücreler ile ilişkilidir ve CD44 ekspresyonu, meme epitelinin büyüme ve farklılaşmasını
sağlamaktadır. CD44 ekspresyonu kısmen hormonlar, IGF-1 ve EGF gibi büyüme
faktörleri tarafından düzenlenmektedir. Meme karsinomlarında CD44 ekspresyonu,
tümörün kök hücre ilişkili olduğunu göstermektedir. Biz çalışmamızda CD44, CD24 ile
birlikte
mikrometastatik
hücrelerin
CD44+/CD24zayıf+/-
ekspresyon
paternini
değerlendirmek için kullanılmıştır.321
2.2.7.5. CD45
CD45, tek zincirli transmembranöz bir glikoproteindir. Dört ayrı izoformu vardır.
(220, 205, 190, 180 kDa) Ekstrasellüler alanı ileri derecede glikolizedir. CD45, matür
eritrositler dışında insan hematopoietik hücrelerinde (hematopoietik kök hücreler dahil)
eksprese edilmektedir. Diğer dokuların farklılaşmış hücrelerinde ise eksprese
edilmemektedir. CD45, sinyal iletiminde, immünolojik olayların inhibisyon veya upregülasyonunda önemli rol oynamaktadır. Genellikle izoformların hepsinde ortak olan
bir epitopu tanıyan antikorlar kullanılmaktadır. Biz çalışmamızda CD45, sitokeratin
pozitif hücreleri normal hematopoietik hücrelerden ayırt etmek için kullanılmıştır.
Mikrometastatik hücrelerde CD45 eksprese edilmemektedir.326,327
2.2.8. Meme Kanseri Kök Hücresi Kavramı
Meme kanseri kök hücresi varlığı ile ilgili giderek artan delillerin ortaya
koyulması, normal meme dokusundaki yetişkin meme epitelyal kök hücreleri üzerine
53
yapılan çalışmalara hız vermiştir. Bu hücreler rutin doku yenilenmesinden ve gebelik
sırasında meme dokusundaki masif genişlemeden sorumludur. Ayrıca tamamı olmasa
bile çoğu meme tümörlerinin kaynağı olarak meme kanseri kök hücreleri
gösterilmektedir.
Birçok teorik öneri ve incelemede, metastazın oluşmasında kanser kök
hücrelerinin rolü olduğu ileri sürülmüştür, ancak bu konu halen tartışmalıdır.328-331
Deneysel olarak, CD44+/CD24zayıf+/- kanser hücreleri, kök hücre paterniyle benzer bir
fenotipe sahiptir ve metastaz için gerekli olan invaziv özellikleri vardır.331,332 50 hastayı
kapsayan bir seride, kemik iliğindeki mikrometastatik kanser hücrelerinin çoğunun, kök
hücre benzeri bir immünohistokimyasal fenotip sergilediği gösterilmiştir.321
Meme kanserleri fenotipik olarak farklı hücre gruplarından meydana gelmektedir.
Bu hücre tipleri, tam olarak anlaşılamamış olmakla beraber tümör gelişimine katkıda
bulunmaktadır. Myeloid lösemilerde tümör oluşumunu başlatabilen ve spesifik hücre
yüzey markerleri ile ayırt edilebilen farklı hücre alt grupları gösterilmiştir. Bu konuda
iki önemli hipotez öne sürülmüştür. Birinci hipotez, hücre popülasyonundaki her
hücrenin mutasyona uğrayarak tümör geliştirme kapasitesine sahip olabileceğini; ikinci
hipotez ise, bu yeteneğin sadece seçkin bir gruba özgü olduğunu savunmaktadır.207Son
olarak Al-Hajj ve arkadaşları tarafından, tümör geliştirme yeteneği olmayan hücrelerden
farklılaşan, tümör başlatıcı veya tümörijenik meme hücrelerini belirlemek için bir
yöntem ileri sürülmüştür. Bu çalışma kanser kök hücresi üzerine solid tümörlerde
yapılmış ilk çalışmadır. Flovsitometri yöntemiyle 1000 meme tümör hücresi içinde 100
hücrenin CD44+/CD24zayıf+/-Lineage- fenotipe sahip olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler
obez olmayan diyabetik/ciddi kombine immün yetmezliği olan farelerin yağ dokusu
içine enjekte edildiğinde, 12 hafta içinde tümör geliştiği gözlenmiştir. Ayrıca bu
hücrelerin EpCAM+ alt grubu da tanımlanmıştır.
(CD44+/CD24zayıf+/-Lineage-
EpCAM+)333 Tümörijenik meme kanser hücreleri, normal kök hücrelerle benzer olarak
kendilerini yenileyebilme, proliferasyon ve farklılaşma özelliklerine sahiptir. Bu
fenomen, meme kanserli hastalarda klinik olarak metastatik hastalığın gelişmesine
neden
olan
kemik
iliği
mikrometastazını
açıklamaya
yardımcı
olabilir.
Mikrometastazlar tümörijenik veya tümörijenik olmayan meme kanser hücreleri ile
meydana gelse de sadece tümörijenik hücreler klinik olarak önemli progresyona neden
olmaktadır. Güncel medikal tedaviler tümörde regresyona neden olabilir, ancak yeni
54
çalışmalar kanser-başlatıcı hücreler hedef alınmadıkça tümörün tamamen yok
edilemeyeceğini göstermiştir. Bu bulgular gelecekteki araştırmalar ve yeni tedavi
stratejileri için bir başlangıç oluşturmuştur.334
2.2.9. Dolaşımdaki Tümör Hücreleri (CTC)
Metastatik malignensiler kanser ilişkili ölümün en önemli sebebidir. Tümör
progresyonu sırasında, dolaşan tümör hücreleri (CTC) primer tümörden ayrılarak uzak
organlara kolinize olmaktadır. CTC metastaz oluşturulması için gereklidir, bununla
beraber bu proses için yeterli değildir ve dolaşımdaki çoğu tümör hücresi hedef
organlarda metastaz geliştirme konusunda başarısız olmaktadır. Az sayıda CTC
migrasyon sırasında ölürken diğerleri yıllarca dormant halde kalmakta ve çok azı
makrometastaz geliştirebilmektedir. CTC kanser hastalarında gösterilmiş olmasına
rağmen, klinikle ilişkisi halen tartışmalıdır ve bu hücrelerin biyolojisi tam olarak
anlaşılamamıştır. Şu anda CTC için kullanılan markerler yetersizdir ve bu hücrelerin alt
grupları arasında ayrım yapılamamaktadır. Güncel metotların CTC’nin bulunması ve
özelliklerinin ortaya koyulması için duyarlılığı ve özgüllüğü düşüktür.
Metastatik meme, kolorektal ve prostat kanserli hastalarda CTC varlığı, azalmış
progresyonsun ve toplam sağkalım ile ilişkili bulunmuştur, ancak erken evre
kanserlerde böyle bir ilişki gösterilememiştir.335-344 CTC’nin bulunması ve sayısının
belirlenmesi için CellSearch sistem tasarlanmıştır. Bu yöntemde immünomanyetik
zenginleştirme sonrası flovsitometri kullanılarak CD45 (-) ve sitokeratin8, 18, 19,
EpCAM (+) hücreler, epitelyal tümör hücreleri olarak değerlendirilmektedir. Kemik
iliğinde mikrometastatik hücreleri bulmak için kullanılan zenginleştirme yöntemleri
CTC’ye yönelik işlemler içinde önerilmektedir. (örneğin dansite Gradient, filtrasyon,
immünomanyetik
ayrıştırma
gibi)
CTC’yi
bulmak
immünositokimyasal yöntemler ve RT-PCR kullanılmıştır.
için
345
aynı
zamanda
Anti-epitelyal hücre
antikorlarının daha uygun olması nedeniyle, meme kanserinde CTC’nin bulunması için
birçok çalışmada, sitometrik metotlar kullanılmıştır. Metastatik meme kanserli
hastalarda CTC’in varlığı, yeni bir tedavi basamağına başlamağına başlanılan hasta
gruplarda, progresyonsuz ve toplam sağkalım ile ilişkili bulunmuştur. Prognostik
değeri, tedavinin basamağından bağımsızdır (örneğin, birinci veya ikinci basamak).
Ayrıca çok değişkenli analizde, metastazın yeri, tedavi şekli ve primer cerrahiden sonra
55
rekürrense kadar geçen zamanın uzunluğundan bağımsız olarak, CTC’nin prognostik
değeri daha üstün bulunmuştur.346 Bu bilgiler, CTC’in varlığı nedeniyle, ileri evre
hastalık için evreleme sisteminin yeniden gözden geçirilmesi gereğini ortaya
koymaktadır. Meme kanseri ve kolorektal kanserler, melanoma ve prostat kanseri dahil
diğer tümörlerde, sitometrik veya PCR’a dayanan yöntemlerin geçerliliği ortaya
konmuştur.347-356 Lösemi hastalarında minimal rezidüel hastalığın belirlenmesi için
yapılan çalışmalar, daha uygun tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine olanak sağlamıştır.
Metastatik meme kanserinde, standart veya anti HER2’ye yönelik ajanlarla tedaviden
sonra periferik kanda CTC sayısındaki değişim yanıtın değerlendirmesi için
önemlidir.212
56
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Hasta Seçimi ve Klinik Evreleme
Çalışmamızda, flovsitometrik yöntemle evre I-IV meme kanserli 52 hastada
kemik iliği mikrometastazı prevalansı, sitokeratin pozitif hücrelerin meme kanseri kök
hücresi ile benzerliği ve mikrometastatik hücrelerde çeşitli sitokeratinlerin ekspresyon
paternlerinin değerlendirilmesi amaçlandı. Kontrol grubu olarak, epitelyal malignensisi
olmayan, remisyonda lösemi ve lenfoma tanısı olan 16 hastadan kemik iliği aspirasyonu
alındı.
2007 yılında prospektif olarak çalışmaya başlandı. Kemik iliği mikrometastatik
hastalığı prevalansını değerlendirmek için, opere olmuş, adjuvan kemoterapi almak
üzere Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi İç hastalıkları Onkoloji Bilim Dalına
başvuran 40 evre I-III ve daha önce kemoterapi almış relaps hastalığa sahip veya yeni
tanı metastatik hastalığa sahip 12 evre IV meme kanserli hasta çalışmaya alındı.
Çalışmaya, aksiller lenf nodu metastazı (-) 20 hasta, aksiller lenf nodu metastazı (+) 20
hasta ve kemik, kemik iliği, karaciğer, akciğer veya serebral metastazı olan 12 hasta
olmak üzere toplam 52 hasta dahil edildi. Opere olmuş hastalara, adjuvan kemoterapi
başlanmadan operasyon sonrası en geç 3 hafta içinde kemik iliği aspirasyonu yapıldı.
Tüm hastalar uzak metastaz açısından akciğer grafisi, batın ultrasonografisi ve kemik
sintigrafisi ile değerlendirildi. Modifiye radikal mastektomi ve aksiller lenf nodu
diseksiyonu yapılmış aksiller lenf nodu metastazı (+) veya (-) hastalarda uzak metastaz
saptanmadı. Hastalara yapılacak işlem anlatıldı, aydınlatılmış onam formu onayları
alındı. Hastalar 2002 yılında American Joint Commitee on Cancer (AJCC) tarafından
yayınlanan, (T) tümör boyutu, (N) lenf nodu durumu ve (M) uzak metastaz durumu
temel alınarak evrelendi. Hastaların, yaşı, cinsiyeti, tümör boyutu, metastatik aksiller
lenf nodu sayısı, evresi, tümör alt tipi, histolojik grade, lenfovasküler invazyon ve
karsinoma in situ varlığı, östrojen ve progesteron reseptör durumu, c-erb-B2
ekspresyonu, menopozal durumu ve metastatik hastalarda metastaz yerleri not edildi.
3.2. Kemik İliği Hazırlanması
Tüm hastalardan posterior iliak çıkıntıdan, lokal anestezi altında aseptik teknikle
kemik iliği aspirasyonu yapıldı. Aspirasyon öncesi cilt epitelinden kontaminasyonu
57
önlemek için bisturi ile insizyon yapıldı ve aspire edilen ilk 0.5 cc. kemik iliği atıldı.
Tüm hastalardan ortalama 9 cc. kemik iliği alınarak EDTA (etilen diamin tetra asetik
asit) içeren iki ayrı mor tüpe koyuldu. Kemik iliğinin hazırlanması için yapılan işlemler
önceki yayınlarda açıklanmıştır.99,156,158,175,186,246 Mononükleer hücrelerin ayrıştırılması
için, kemik iliği 15’er cc’lik falkon tüplere aktarıldı. Üzerine, her 1 cc. kemik iliği için 1
cc. PBS (phosphate buffered saline) ilave edildi. Daha sonra ayrı bir falkon tüpe 5 cc
ficoll-hypack solüsyonu koyularak üzerine kemik iliği-PBS karışımı damla damla
yayıldı. Örnekler 900 devirde 30 dakika santrifüj edildi. Mononükleer hücreleri içeren
bufy coat tabakası pipetle toplanarak ayrı bir falkon tüpe koyuldu. Üzerine 15 cc’ye
kadar PBS eklenerek 150 devirde 5 dakika santrifüj edildi. Oluşan süpernatant atıldı.
Üzerine 15 cc’ye kadar PBS eklenerek 150 devirde 5 dakika santrifüj edildi. Oluşan
süpernatant atıldı. Aynı işlem bir kez daha tekrarlanarak hücreler için toksik olan ficollhypack solüsyonu uzaklaştırıldı. Materyal DMSO (dimetil sülfoksit) ile dondurularak 80 0C’de saklandı. DMSO hücre zarlarından kolayca geçerek nükleusun etkilenmeden
saklanmasını sağlayan ve hematopoietik kök hücrelerin saklanması yaygın olarak
kullanılan bir kriyoprotektandır.
Materyal kullanılacağı zaman avuç içinde eritilerek üzerine fetal bovin serum
içeren % 10’luk PBS eklendi. 400 devirde 10 dakika santrifüj edildi. Üzerindeki
süpernatant atıldı. Fetal bovin serum içeren % 10’luk PBS ile tekrar 400 G’de 10 dakika
yıkama yapıldı. Aynı işlem üç kez tekrarlanarak DMSO uzaklaştırıldı.
3.3. Flovsitometrik Değerlendirme
DMSO uzaklaştırma işlemi sonrası, kemik iliği materyallerinin bir kısmı damla
damla % 70’lik alkol eklenerek +4ºC’de FITC ile konjuge sitokeratin 18 monoklonal
antikoru ile boyandı. (Abcam, Cambridge, ABD) Antikor, PBS ile 1/20 seyreltildi ve
100 µl örnek için 10 µl antikor eklendi. PBS ile tekrar yıkama sonrası DNA içeriği
RNAaz içeren propidyum iyodit (Pİ) ile boyandı.357 Kemik iliğinin diğer bir kısmı ise
alkol ile fikse edilmeden, CD45 ile yüzey ve CK18 ile intrasellüler olarak boyanarak
flovsitometride incelendi.293 Sitokeratin 4, 6, 8, 10 için intrasellüler; CD24, CD44,
CD45 ve EpCAM için yüzey boyama yapıldı. Tüm hastalarda en az 105 hücre analiz
edildi.
BD
FACSCaliburTM
flovsitometri
(Becton
Dickinson)
ile
örnekler
değerlendirildi. Pİ negatif-sitokeratin18 pozitif ve diğer grupta CD45 negatif-
58
sitokeratin18 pozitif hücreler mikrometastatik tümör hücreleri olarak değerlendirildi.
Non-spesifik boyanmalar veya sahte boyanan debrisler negatif kabul edildi.
Remisyonda lösemi ve lenfomalı 16 hastadan elde edilen normal kemik ilikleri, kontrol
grubu olarak çalışmaya dahil edildi. Kemik iliğinde sitokeratin18 pozitifliği saptanan
hastalarda, CD44, CD24, sitokeratin4, sitokeratin6, sitokeratin8, sitokeratin10 ve
EpCAM
monoklonal
antikorları
(Abcam,
Cambridge,
ABD)
kullanılarak
flovsitometride değerlendirildi.
3.4. İstatistiksel Analiz
Elde edilen tüm veriler SPSS (Statistical Package for Social Sciences) Windows
12,0 programına kaydedildi. Mikrometastaz saptanan veya saptanmayan tüm hastalarda,
stepwise multivariate Cox regresyon analizi ile diğer prognostik faktörler arasındaki
ilişki değerlendirildi. Mikrometastaz varlığının ayrı ayrı her değişkenle ilişkisinin
belirlenmesi için Ki-Kare testi kullanıldı. P değeri 0.05’in altında olan değerler
istatistiksel açıdan anlamlı kabul edildi.
59
4. BULGULAR
Çalışmaya 12’si evre I (% 23), 20’si evre II (% 38,5), 8’i evre III (% 15,5) ve
12’si evre IV (% 23) hasta olmak üzere 52 hasta dahil edildi. Hastaların ortanca yaşı 45
(27-82), ortalama yaşı 47,92 bulundu. Hastaların demografik, klinik ve tümör özellikleri
tablo 7’de gösterilmiştir. Flovsitometride pozitif kabul edilen alan şekil 3’de
gösterilmiştir.
CD 45 negatif
CK18 pozitif
bölüm
mikrometastatik
hücreler olarak
değerlendirildi
CK18 FITC
Şekil 3. Flovsitometride pozitif bulunmuş mikrometastatik hücreler
4.1. Kemik İliği Mikrometastazı İle Cinsiyet İlişkisi
Hastaların 50’si kadın, 2’si erkek cinsiyete sahipti. Erkek hastalarda kemik
iliğinde mikrometastatik hücreye rastlanmadı (% 0). 50 kadın hastanın 11’inde kemik
iliği mikrometastazı saptandı (% 22). Cinsiyet ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki
ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,455). Hastalar lenf nodu veya uzak
metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara
ayrıldığında, alt grup analizinde kemik iliği mikrometastazı ile cinsiyet arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,732). Kemik iliği mikrometastazı cinsiyet
arasındaki ilişki tablo 8’de gösterilmiştir.
60
Tablo 7. Hastaların genel özellikleri
Yaş grupları
Menopozal durum
Cinsiyet
Tümör boyutu
Lenf nodu metastazı
Metastatik lenf nodu sayısı
Evre
Tümör histopatolojisi
Östrojen Reseptörü (ER)
Progesteron Reseptörü (PR)
c-erb-B2
Grade
Lenfovasküler İnvazyon
DCİS komponenti
Mikrometastaz oranı
Parametreler
<50
>50
Pre
Post
Erkek
Kadın
T1
T2
T3
T4
Yok
Var
N0
N1
N2
N3
I
II
III
IV
İDK
İLK
Müsinöz
Diğer
Negatif
Pozitif
Negatif
Pozitif
0
1+
2+
3+
1
2
3
Negatif
Pozitif
Yok
Var
LN (-) grup
LN(+) grup
Metastatik grup
Sayı (%)
32 (61,5)
20 (38,5)
23 (44)
27 (56)
2 (4)
50 (96)
21 (40,5)
24 (46)
6 (11.5)
1 (2)
22 (42,5)
30 (57,5)
22 (42,5)
9 (17)
11 (21)
10 (19,5)
12 (23)
20 (38,5)
8 (15,5)
12 (23)
43 (82,5)
4 (7,5)
1 (2)
4 (8)
12 (23)
40 (77)
18 (34,5)
34 (65,5)
16 (31)
6 (11,5)
12 (23)
18 (34,5)
4 (8)
22 (42,5)
26 (49,5)
20 (38,5)
32 (61,5)
27 (52)
25 (48)
% 25
%5
% 41,7
4.2. Kemik İliği Mikrometastazı İle Yaş İlişkisi
Kemik iliğinde mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca yaş 45 (27-82),
ortalama yaş 46,22 bulunurken, mikrometastaz saptanan grupta ortanca yaş 53 (32-76),
ortalama yaş 54,27 bulundu. Yaş arttıkça mikrometastaz sıklığının arttığı belirlendi.
Çok değişkenli analizde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlı bulundu (p=0,036). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna
61
göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup
analizinde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlılığa ulaşmadı (p=0,759) Kemik iliği mikrometastazı ile yaş arasındaki ilişki
tablo 9’da gösterilmiştir.
Tablo 8. Kemik iliği mikrometastazı cinsiyet arasındaki ilişki
Kadın
Cinsiyet
Erkek
Toplam
N
Cinsiyet içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Cinsiyet içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Cinsiyet içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Kemik iliği
mikrometastazı
Yok
Var
39
11
% 78
% 22
% 95,1
% 100
2
0
% 100
%0
% 4,9
%0
41
11
% 78,8
% 21,2
% 100
% 100
Toplam
P değeri
50
% 100
% 96,2
2
% 100
% 3,8
52
% 100
% 100
0, 455
Tablo 9. Kemik iliği mikrometastazı yaş ilişkisi
Kemik iliği mikrometastazı
Yok
Var
Toplam
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
62
Yaş
P değeri
46,22
10,919
45,00
27
82
41
54,27
12,313
53,00
32
76
11
47,92
11,587
45,00
27
82
52
0,036
4.3. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Boyutu İlişkisi
Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca tümör boyutu 4 cm. (0,7-10),
ortalama tümör boyutu 3,882 cm. bulunurken, mikrometastaz saptanmayan grupta
ortanca tümör boyutu 2,5 cm. (0,5-10), ortalama tümör boyutu 3 cm. bulundu. Tümör
boyutu arttıkça mikrometastaz oranının arttığı tespit edildi. Çok değişkenli analizde
tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlılığa ulaşmadı (p=0,092). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre;
lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup
analizinde, tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu ilişkisi
tablo 10’da gösterilmiştir.
4.4. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenf Nodu Metastazı Arasındaki İlişki
Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca metastatik lenf nodu sayısı 1
(0-34), ortalama lenf nodu sayısı 6,64 bulunurken, mikrometastaz saptanmayan grupta
ortanca metastatik lenf nodu sayısı 2 (0-16), ortalama metastatik lenf nodu sayısı 3,9
bulundu. Ancak lenf nodu metastazı pozitif olan grupta sadece bir hastada
mikrometastaz saptandı. Mikrometastaz pozitif grupta ortanca ve ortalama lenf nodu
sayısı yüksekliği metastatik gruba bağlandı. Çok değişkenli analizde metastatik lenf
nodu sayısı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlılığa ulaşmadı (p=0,843). Lenf nodu negatif 20 hastanın 5’inde (% 20), lenf nodu
pozitif 20 hastanın 1’inde (% 5) ve uzak metastaz saptanan 12 hastanın 5’inde (% 41,6)
kemik iliğinde mikrometastatik tümör hücreleri tespit edildi. Hastalar lenf nodu
metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, lenf nodu
metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile metastatik lenf nodu sayısı
arasındaki ilişki tablo 11’de; lenf nodu veya uzak metastaz varlığı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki tablo 12’de gösterilmiştir.
63
Tablo 10. Kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu ilişkisi
Kemik iliği mikrometastazı
Yok
Var
Toplam
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Tümör boyutu
3,000
1,8889
2,500
0,5
10,0
41
3,882
2,3714
4,000
0,7
10,0
11
3,187
2,0083
2,850
0,5
10,0
52
P değeri
0,092
Tablo 11. Kemik iliği mikrometastazı ile metastatik lenf nodu sayısı arasındaki ilişki
Kemik iliği mikrometastazı
Yok
Var
Toplam
Metastatik Lenf Nodu Sayısı
3,90
4,969
2,00
0
16
41
6.64
10,481
1,00
0
34
11
4,48
6,494
2,00
0
34
52
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
64
P değeri
0,843
Tablo 12. Lenf nodu veya uzak metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki
ilişki
Lenf nodu
(+)
GRUP
Lenf nodu
(-)
Metastatik
Toplam
N
Grup içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Grup içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Grup içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Grup içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Kemik iliği
mikrometastazı
Yok
Var
19
1
% 95
%5
% 46,3
% 9,1
15
5
% 75
% 25
% 36,6
% 45,5
7
5
% 58,3
% 41,7
% 17,1
% 45,5
41
11
% 78,8
% 21,2
% 100
% 100
Toplam
P değeri
20
% 100
% 38,5
20
% 100
% 38,5
12
% 100
% 23,1
52
% 100
% 100
0,001
4.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Alt Tipi Arasındaki İlişki
Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta 11 hastadan 10’unda (% 90) primer
tümör invaziv duktal karsinom, 1’inde (% 1) invaziv lobüler karsinom alt tipine sahipti.
Kemik iliği mikrometastazı saptanmayan grupta ise 33 hasta (% 80) invaziv duktal
karsinom, 3 hasta (% 7,3) invaziv lobüler karsinom, 1 hasta (% 2,4) müsinöz karsinom
ve 4 hasta (% 10) diğer tümör alt tiplerine sahipti. Çok değişkenli analizde tümör alt tipi
ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı.
(p=0,377) Hastalar lenf nodu metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt
gruplara ayrıldığında, tümör alt tipi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,680).
4.6. Kemik İliği Mikrometastazı İle Evre Arasındaki İlişki
Kemik iliği mikrometastazı saptanan hastalardan 1 hasta evre I (% 9), 4 hasta evre
II (% 36), 1 hasta evre III (% 9) ve 5 hasta evre IV (% 46) grubunda idi. Evre I 12
hastanın 1’inde (% 8,3), evre II 20 hastanın 4’ünde (%20), evre III 8 hastanın 1’inde
(% 12,5) ve evre IV 12 hastanın 5’inde (% 41,6) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı.
Çok değişkenli analizde tümörün evresi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,227). Hastalar lenf nodu veya uzak
metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara
ayrıldığında, alt grup analizinde, tümörün evresi ile kemik iliği mikrometastazı
65
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği
mikrometastazı ile tümörün evresi arasındaki ilişki tablo 13’de gösterilmiştir.
Tablo 13. Kemik iliği mikrometastazı ile tümörün evresi arasındaki ilişki
GRUP
EVRE
Ortalama
3,00
Standart sapma
1,298
Ortanca
4,00
Lenf nodu (+)
Minimum
2
Maksimum
6
N
20
Ortalama
1,40
Standart sapma
0,503
Ortanca
1,00
Lenf nodu (-)
Minimum
1
Maksimum
2
N
20
Ortalama
4,00
Standart sapma
0
Ortanca
4,00
Metastatik
Minimum
4
Maksimum
4
N
12
Ortalama
3,00
Standart sapma
2,00
Ortanca
3,00
Toplam
Minimum
1
Maksimum
4
N
52
P değeri
0,277
4.7. Kemik İliği Mikrometastazı İle Östrojen Reseptör Durumu Arasındaki
İlişki
Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca östrojen reseptörü pozitifliği
% 30 (0-100), ortalama östrojen reseptörü pozitifliği % 36,36 bulunurken,
mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca östrojen reseptörü pozitifliği % 80 (0-100),
ortalama östrojen reseptörü pozitifliği % 59,15 bulundu. Çok değişkenli analizde
östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,1). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna
göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup
analizinde, östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
66
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,901). Kemik iliği mikrometastazı ile
östrojen reseptör durumu arasındaki ilişki tablo 14’de gösterilmiştir.
Tablo 14. Kemik iliği mikrometastazı ile östrojen reseptör durumu arasındaki ilişki
Kemik iliği mikrometastazı
Yok
Var
Toplam
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Östrojen Reseptörü (%)
59,15
38,437
80,00
0
100
41
36,36
40,749
30,00
0
100
11
54,33
39,656
60,00
0
100
52
P değeri
0,1
4.8. Kemik İliği Mikrometastazı İle Progesteron Reseptör Durumu
Arasındaki İlişki
Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca progesteron reseptörü
pozitifliği % 0 (0-95), ortalama progesteron reseptörü pozitifliği % 26,36 bulunurken,
mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca progesteron reseptörü pozitifliği % 30 (0100), ortalama progesteron reseptörü pozitifliği % 39,34 bulundu. Çok değişkenli
analizde progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,155). Hastalar lenf nodu veya uzak
metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara
ayrıldığında, alt grup analizinde, progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,733).
Kemik iliği mikrometastazı ile progesteron reseptör durumu arasındaki ilişki tablo
15’de gösterilmiştir.
67
Tablo 15. Kemik iliği mikrometastazı ile progesteron reseptör durumu arasındaki ilişki
Kemik iliği
mikrometastazı
Yok
Var
Toplam
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Ortalama
Standart sapma
Ortanca
Minimum
Maksimum
N
Progesteron Reseptörü (%)
P değeri
39,34
36,775
30,00
0
100
41
26,36
40,006
0.00
0
95
11
36,60
37,459
30,00
0
100
52
0,155
4.9. Kemik İliği Mikrometastazı İle c-erb-B2 Durumu Arasındaki İlişki
C-erb-B2 negatif 16 hastanın 2’sinde, 1 pozitif 6 hastanın 3’ünde, 2 pozitif 12
hastanın 1’inde, 3 pozitif 18 hastanın 5’inde kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Cerb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa
ulaşmadı. (p=0,147) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu
(+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde,
c-erb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa
ulaşmadı (p=0,222). Kemik iliği mikrometastazı ile c-erb-B2 durumu arasındaki ilişki
tablo 16’da gösterilmiştir.
68
Tablo 16. Kemik iliği mikrometastazı ile c-erb-B2 arasındaki ilişki
Kemik iliği
mikrometastazı
0
1
c-erb-B2
2
3
Toplam
Toplam
Yok
Var
N
c-erb-B2 içindeki %
14
% 87,5
2
% 12,5
16
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 34,1
% 18,2
% 30,8
N
c-erb-B2 içindeki %
3
% 50
3
% 50
6
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 7,3
% 27,3
% 11,5
N
c-erb-B2 içindeki %
11
% 91,7
1
% 8,3
12
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 26,8
% 9,1
% 23,1
N
c-erb-B2 içindeki %
13
% 72,2
5
% 27,8
18
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 31,7
% 45,5
% 34,6
N
c-erb-B2 içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
41
% 78,8
% 100
11
% 21,2
% 100
52
% 100
% 100
P değeri
0,147
4.10. Kemik İliği Mikrometastazı İle Histolojik Grade Arasındaki İlişki
Histolojik grade 1 olan 4 hastanın 2’sinde (% 50), histolojik grade 2 olan 22
hastanın 3’ünde (% 13,6), histolojik grade 3 olan 26 hastanın 6’sında (% 23,1) kemik
iliğinde mikrometastaz saptandı. Histolojik grade ile kemik iliği mikrometastazı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,247). Hastalar lenf nodu
veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt
gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, histolojik grade ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,435).
Kemik iliği mikrometastazı ile histolojik grade arasındaki ilişki tablo 17’de
gösterilmiştir.
69
Tablo 17. Kemik iliği mikrometastazı ile histolojik grade arasındaki ilişki
Kemik iliği
mikrometastazı
1
Histolojik
Grade
2
3
Toplam
Toplam
Yok
Var
N
Histolojik Grade içindeki %
2
% 50
2
% 50
4
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 4,9
% 18,2
% 7,7
N
Histolojik Grade içindeki %
19
% 86,4
3
% 13,6
22
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 46,3
% 27,3
% 42,3
N
Histolojik Grade içindeki %
20
% 76,9
6
% 23,1
26
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 48,8
%54,5
% 50
N
Histolojik Grade içindeki %
41
% 78,8
11
% 21,2
52
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 100
% 100
% 100
P değeri
0,247
4.11. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenfovasküler İnvazyon Arasındaki
İlişki: Lenfovasküler invazyonu olan 32 hastanın 6’sında (% 18,8), lenfovasküler
invazyonu olmayan 20 hastanın 5’inde (% 25) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı.
Lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,591). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz
durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında,
alt grup analizinde, lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki
ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile
lenfovasküler invazyon arasındaki ilişki tablo 18’de gösterilmiştir.
Tablo 18. Kemik iliği mikrometastazı ile lenfovasküler invazyon arasındaki ilişki:
Kemik iliği
mikrometastazı
Toplam
Yok
Var
N
15
5
20
Lenfovasküler invazyon içindeki %
% 75
% 25
% 100
Yok
Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 36,6 % 45,5
% 38,5
Lenfovasküler
N
26
6
32
İnvazyon
Lenfovasküler invazyon içindeki %
% 81,3 % 18,8
% 100
Var
Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 63,4 % 54,5
% 61,5
N
41
11
52
Lenfovasküler invazyon içindeki %
% 78,8 % 21,2
% 100
Toplam
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 100
% 100
% 100
70
P
değeri
0,591
4.12. Kemik İliği Mikrometastazı İle Menopozal Durum Arasındaki İlişki
Premenopozal 28 hastanın 4’ünde (% 14,3), postmenopozal 22 hastanın 7’sinde
(% 31,9) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Menopozal durum ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,144)
Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak
metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, menopozal durum ile
kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı.
(p=0,435) Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki tablo 19’da
gösterilmiştir.
Tablo 19. Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki:
Kemik iliği
mikrometastazı
Toplam
Yok
Var
N
24
4
28
Menopozal durum içindeki % % 85,7 % 14,3
% 100
Pre menopozal
Kemik iliği mikrometastazı
% 61,5 % 36,3
% 56
içindeki %
Pre/Post
Menopozal
N
15
7
22
Menopozal durum içindeki % % 68,1 % 31,9
% 100
Post menopozal
Kemik iliği mikrometastazı
% 38,5 % 63,7
% 44
içindeki %
N
39
11
50
Menopozal durum içindeki %
% 78
% 22
% 100
Toplam
Kemik iliği mikrometastazı
% 100
% 100
% 100
içindeki %
P
değeri
0,144
4.13. Kemik İliği Mikrometastazı İle DCİS Komponenti Arasındaki İlişki
Primer tümörde DCİS komponenti içeren 25 hastanın 5’inde (% 20), DCİS
komponenti içermeyen 27 hastanın 6’sında (% 22,2) kemik iliğinde mikrometastaz
saptandı. DCİS komponenti varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,845). Hastalar lenf nodu veya uzak
metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara
ayrıldığında, alt grup analizinde, DCİS komponenti varlığı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,88).
Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki tablo 20’de
gösterilmiştir.
71
Tablo 20. Kemik iliği mikrometastazı ile DCİS komponenti arasındaki ilişki
Yok
DCİS
komponenti
Var
Toplam
4.14.
N
DCİS komponenti içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
DCİS komponenti içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
DCİS komponenti içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Kemik
İliği
Mikrometastazı
Kemik iliği
mikrometastazı
Yok
Var
21
6
% 77,8 % 22,2
% 51,2 % 54,5
20
5
% 80
% 20
% 48,8 % 45,5
41
11
% 78,8 % 21,2
% 100
% 100
İle
Kemik
Toplam
P değeri
27
% 100
% 51,9
25
% 100
% 48,1
52
% 100
% 100
0,591
İliği
Biyopsisinde
İmmünohistokimyasal Yöntemle Gösterilmiş Kemik İliği Metastazı Arasındaki
İlişki
Kemik iliği biyopsisinde immünohistokimyasal yöntemle kemik iliği metastazı
saptanan 2 hastanın 2’sinde de flovsitometrik yöntemle mikrometastatik hücreler
gösterildi. (% 100). Kemik iliği metastazı olmayan 50 hastanın 9’unda (% 18) kemik
iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik iliği metastazı ile kemik iliği mikrometastazı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya
uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt
gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik iliği metastazı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,031). Kemik
iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki tablo 21’de gösterilmiştir.
Tablo 21. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik iliği biyopsisinde immünohistokimyasal
yöntemle gösterilmiş kemik iliği metastazı arasındaki ilişki
Kemik iliği
mikrometastazı
Toplam
P değeri
yok
var
N
41
9
50
Kemik iliği metastazı içindeki %
% 82
% 18,2
% 100
Yok
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 100
% 81
% 96,2
Kemik iliği
metastazı
N
0
2
2
0,005
Kemik iliği metastazı içindeki %
%0
% 100
% 100
Var
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
%0
% 18,2
% 3,8
N
41
11
52
Toplam
Kemik iliği metastazı içindeki %
% 78,8 % 21,2
% 100
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
% 100
% 100
% 100
72
4.15. Kemik İliği Mikrometastazı İle Karaciğer Metastazı Arasındaki İlişki
Karaciğer metastazı saptanan 5 hastanın 3’ünde (% 60), karaciğer metastazı
olmayan 47 hastanın 8’inde (% 17) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Karaciğer
metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0,025). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu
(+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde,
karaciğer metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile karaciğer metastazı
arasındaki ilişki tablo 22’de gösterilmiştir.
Tablo 22. Kemik iliği mikrometastazı ile karaciğer metastazı arasındaki ilişki
Kemik iliği
mikrometastazı
Toplam
Yok
Karaciğer
metastazı
Var
Toplam
N
Karaciğer metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Karaciğer metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Karaciğer metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Yok
Var
39
% 83
% 95,1
2
% 40
% 4,9
41
% 78,8
% 100
8
% 17
% 72,7
3
% 60
% 27,3
11
% 21,2
% 100
47
% 100
% 90,4
5
% 100
% 9,6
52
% 100
% 100
P
değeri
0,025
4.16. Kemik İliği Mikrometastazı İle Serebral Metastaz Arasındaki İlişki
Serebral metastaz saptanan 3 hastanın 1’inde (% 33,3), serebral metastazı
olmayan 49 hastanın 10’unda (% 20,4) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Serebral
metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa
ulaşmadı (p=0,595). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu
(+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde,
serebral metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlı bulundu (p<0,005). Kemik iliği mikrometastazı ile serebral metastaz arasındaki
ilişki tablo 23’de gösterilmiştir.
73
Tablo 23. Kemik iliği mikrometastazı ile serebral metastazı arasındaki ilişki:
Yok
Serebral
metastaz
Var
Toplam
N
Serebral metastaz içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Serebral metastaz içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Serebral metastaz içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Kemik iliği
mikrometastazı
Yok
Var
39
10
% 79,6 % 20,4
% 95,1 % 90,9
2
1
% 66,7 % 33,3
% 4,9
% 9,1
41
11
% 78,8 % 21,2
% 100
% 100
Toplam
P
değeri
49
% 100
% 94,2
3
% 100
% 5,8
52
% 100
% 100
0,595
4.17. Kemik İliği Mikrometastazı İle Akciğer Metastazı Arasındaki İlişki
Akciğer metastazı saptanan 2 hastanın 2’sinde (% 100), akciğer metastazı
olmayan 50 hastanın 9’unda (% 18) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Serebral
metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu
(+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, akciğer
metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0,031). Kemik iliği mikrometastazı ile akciğer metastazı arasındaki ilişki
tablo 24’de gösterilmiştir.
Tablo 24. Kemik iliği mikrometastazı ile akciğer metastazı arasındaki ilişki
Kemik iliği
mikrometastazı
Toplam
Yok
Akciğer
Metastazı
Var
Toplam
N
Akciğer metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Akciğer metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Akciğer metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Yok
Var
41
% 82
% 100
0
%0
%0
41
% 78,8
% 100
9
% 18
% 81,8
2
% 100
% 18,2
11
% 21,2
% 100
50
% 100
% 96,2
2
% 100
% 3,8
52
% 100
% 100
P değeri
0,013
4.18. Kemik İliği Mikrometastazı İle Kemik Metastazı Arasındaki İlişki
Kemik metastazı saptanan 10 hastanın 5’inde (% 50), kemik metastazı olmayan
42 hastanın 6’sında (% 14,3) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik metastazı
ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu.
74
(p=0,013) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya
uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik metastazı ile
kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu
(p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile kemik metastazı arasındaki ilişki tablo 25’de
gösterilmiştir.
Tablo 25. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik metastazı arasındaki ilişki (p=0,013)
Kemik iliği
mikrometastazı
Toplam
Yok
Kemik
Metastazı
Var
Toplam
N
Kemik metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Kemik metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
N
Kemik metastazı içindeki %
Kemik iliği mikrometastazı içindeki %
Yok
Var
36
% 85,7
% 87,8
5
% 50
% 12.2
41
% 78.8
% 100
6
% 14,3
% 54,5
5
% 50
% 45.5
11
% 21.2
% 100
42
% 100
% 80,8
10
% 100
% 19.2
52
% 100
% 100
Tablo 26. Klinik değişkenlere göre kemik iliği mikrometastazı prevalansı
Klinik Değişken
Yaş - %
20-35 yaş
36-50 yaş
51-65 yaş
>65 yaş
Tümör boyutu
T1
T2
T3
T4
Lenf nodu Metastazı
N0
N1
N2
N3
Menopozal durum
Premenopozal
Postmenopozal
Histolojik Grade
1
2
3
Östrojen reseptörü
Pozitif
Negatif
Toplam
hasta
Kemik iliği
mikrometastazlı
hastalar
Kemik iliği
mikrometastazı
olmayan hastalar
7
26
15
4
1
2
6
3
6
24
9
1
21
24
6
1
2
8
0
1
19
18
6
0
22
9
12
11
5
1
2
3
17
8
10
8
28
22
4
7
24
15
4
22
26
2
3
3
2
19
23
40
12
6
5
34
7
75
P değeri
0,036*
0,092
0,843
0,144
0,247
0,1
Tablo 26’nın devamı
Progesteron
reseptörü
Pozitif
Negatif
C-erb-b2
0
+1
+2
+3
Tümör alt tipi
İDK
İLK
Müsinöz
Mikst
Evre
I
II
III
IV
Lenfovasküler
invazyon
Pozitif
Negatif
DCİS komponenti
Pozitif
Negatif
Cinsiyet
Erkek
Kadın
Kemik iliği
metastazı
Pozitif
Negatif
Kemik
metastazı
Pozitif
Negatif
Karaciğer metastazı
Pozitif
Negatif
Akciğer metastazı
Pozitif
Negatif
Serebral metastaz
Pozitif
Negatif
* istatistiksel olarak anlamlı
0,155
35
17
4
7
31
10
14
6
11
18
2
3
1
5
12
3
10
13
43
4
1
3
10
1
0
0
33
3
1
0
12
20
8
12
1
4
1
5
11
16
7
7
32
20
6
5
26
15
25
27
5
6
20
21
0,591
2
50
0
11
2
39
0,455
2
50
2
11
0
39
10
42
5
6
5
36
5
47
3
8
2
39
0,025*
2
50
2
9
0
41
0,005*
3
49
1
10
2
39
0,595
76
0,147
0,377
0,227
0,591
0,005*
0,013*
5. TARTIŞMA
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve akciğer kanserinden sonra,
kansere bağlı ölümlerin ikinci en sık sebebidir. Kadınlarda görülen kanserlerin üçte
birinden sorumludur.1,2 Meme kanseri erken tanı ve tedavisinde ilerlemelere rağmen,
halen yüksek morbidite ve mortalite oranına sahiptir. Hastalar genellikle uzak
metastazlar nedeniyle kaybedilmektedir. Adjuvan kemoterapinin yaygın olarak
kullanılması, meme kanseri mortalitesini azaltmıştır. Bununla beraber, bu tedaviyi alan
bazı hastalar, tedavinin faydasından çok, gereksiz toksisitesine maruz kalmaktadır.
Klinik pratikte, meme kanseri ile ilgili en önemli prognostik ve prediktif bilgi; patolojik
evrelendirme (tümör boyutu, aksiller lenf nodu tutulumu, lenfatik ve vasküler invazyon
varlığı, tümörün grade ve östrojen/progesteron reseptör durumu) ile elde edilmektedir.
Lenf nodu metastazı halen en önemli prognostik faktör olarak kabul edilmektedir.
Metastatik lenf nodu sayısı arttıkça sistemik metastaz riski daha fazla, prognoz daha
kötüdür. Bununla beraber, olumlu prognostik faktölere sahip (lokalize hastalığı olan ve
lenf nodu metastazı olmayan) meme kanserli hastaların yaklaşık % 25’inde sistemik
relaps gelişmekte; buna karşın kötü prognostik faktörlere sahip (lenf nodu metastazı
olan) hastaların en az % 30’unda primer tedaviyi takip eden 5-10 yıl içinde relaps
gelişmemektedir.153-156 Bu nedenle, adjuvan sistemik tedaviden fayda görecek hastaların
seçimi ve gereksiz toksisite ve maliyetten kaçınmak için; yeni, daha doğru ve güvenilir
prognostik faktörlere ihtiyaç vardır.
Solid epitelyal tümörlerde, dissemine tümör hücreleri (DTC) kavramı 30 yıl önce
ortaya atılmıştır.94-96 Kemik iliği mikrometastazı için en geniş çalışmalar meme
kanserinde yapılmıştır. DTC (dissemine tümör hücreleri) terimi en doğru tanımlamadır;
ayrıca minimal rezidüel hastalık (MRD), kemik iliğinden izole edilen tümör hücreleri
(İTH), gizli metastatik hücreler veya kemik iliği mikrometastazı gibi terimlerde
kullanılmaktadır. Mikrometastaz, primer tümörden uzak organlara yayılmış tümör
hücrelerinin, mikroskobik metastatik depozitleri olarak tanımlanabilir.95,97,98 Kemik
iliğinde sıklıkla tek tek veya gruplar halinde bulunan tümör hücreleri, kemik iliği
mikrometastazları olarak tanımlanmaktadır. Bu hücreler klasik görüntüleme yöntemleri
ile tespit edilememektedir. Tümör gelişiminin olasılıkla erken döneminde meydana
gelen mikrometastatik yayılım; kan, lenf nodları veya kemik iliğine olabilmekte; kemik
77
iliği primer tümörden köken alan mikrometastatik hücrelerin en sık yayıldığı organ
olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler yıllarca iskelet metastazı veya tekrar dolaşıma
geçerek uzak metastaz geliştirmeden G0 fazında kalmaktadır.99
Lenf nodu tutulumu (evre N0) veya uzak metastazın klinik ve histopatolojik
bulgusu olmayan (evre M0) epitelyal tümörlerde (meme, prostat, kolon ve akciğer
karsinomları gibi) kemik iliği mikrometastazı oranı % 20-40 arasında değişmektedir.
Tek merkezli, önemli sayıda hastayı kapsayan ve yeterli izlem süresi olan çalışmaların
çoğunda, kemik iliği mikrometastazı varlığı ile kötü prognoz arasındaki ilişki
gösterilmiştir. Mansi ve arkadaşları, anti-EMA antikoru kullanarak, ortalama 12,5 yıllık
takip süresi sonrası, ilk tanı anındaki kemik iliği durumu ile uzak metastaz gelişimi ve
toplam sağkalım arasında önemli bir prognostik ilişki bulmuştur.136 Diel ve Arkadaşları
727 hastayı kapsayan bir grupta, 36 ay takipten sonra, kemik iliği mikrometastazı ile
hastalıksız ve toplam sağkalım arasındaki ilişkiyi göstermiştir. Bu çalışmada kemik iliği
mikrometastazının prognostik değeri; lenf nodu tutulumu, tümör boyutu ve tümörün
histolojik grade’inden daha üstün bulunmuştur.158 Son dört prospektif çalışma toplam
2316 hastayı kapsamış ve kemik iliği mikrometastazı varlığının klasik prognostik
faktörlerden bağımsız olarak kötü prognoz ile ilişkisi gösterilmiştir.99,159-161
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan, evre I-III operabl meme kanserli 4703
hastayı içeren bir meta-analizde, kemik iliğinde immünositokimyasal yöntemle
gösterilen DTC varlığının, kötü prognozla ilişkisi gösterilmiştir.3 Bu hastalarda kemik
iliği mikrometastazı oranı % 30,6 bulunmuştur. Bu çalışmaya % 90’ı T1 ve T2 tümöre
sahip, uzak metastazı olmayan, % 58’i nod negatif ve % 70’i adjuvan kemoterapi almış
hastalar dahil edilmiştir. Kemik iliği mikrometastazı varlığı özellikle büyük tümör
boyutu, yüksek tümör grade, lenf nodu metastazı varlığı ve hormon reseptör negatifliği
ile ilişkili bulunmuştur. Çok değişkenli analizde, kemik iliği mikrometastazları diğer
prognostik faktörlerden bağımsız olarak, azalmış genel ve meme kanseri spesifik
sağkalım oranlarıyla ilişkili bulunmuştur.3 Bugüne kadar başlıca immünositokimyasal
yöntemlerin kullanıldığı çalışmalarda, kemik iliğinde DTC’nin bulunmasının toplam ve
hastalıksız sağkalımın bağımsız bir göstergesi ve kötü prognostik faktör olduğu ortaya
koyulmuştur.3,99,159,162-168 Bununla beraber, prognozla ilişkisi gösterilemeyen çalışmalar
da vardır.169,170 Kemik iliği aspirasyon teknikleri, materyallerin hazırlanışı, kullanılan
antikorlar, zenginleştirme yöntemlerinin kullanılıp kullanılmaması, analiz edilen hücre
78
sayıları, hastaların evreleri ve takip süreleri arasındaki farklılıklar nedeniyle çelişkili
sonuçlar ortaya çıkmaktadır. Metastatik hastalarda ise kemik iliğinde mikrometastaz
varlığından çok dolaşımda tümör hücreleri varlığı prognozla ilişkili olduğu
gösterilmiştir.358 Kemik iliği mikrometastazının meme kanserinde prognostik faktör
olarak kullanımı, veri yetersizliği ve standart yöntemin henüz ortaya koyulamaması
nedeniyle ASCO tarafından onaylanmamıştır.
Meme ve diğer solid tümörlerde kemik iliği mikrometastazlarını belirlemek için
birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Lenf nodları, kan ve kemik iliğinde çok az sayıda ve
tek tek bulunan bu hücreleri bulabilmek için immünositokimyasal, flovsitometrik ve
moleküler yöntemler geliştirilmiştir. İmmünositokimyasal yöntemler, mikrometastatik
hücrelerin epitelyal veya tümör ilişkili antijenlerini belirleyen monoklonal antikorlarla
boyanarak tespit edildiği, bugüne kadar en sık kullanılan yöntemdir.159,215,216,244 Bu
yöntem kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için halen altın standart olarak
kabul edilmektedir. Yapılan çalışmalarda evre I-III meme kanserli hastalarda
immünositokimyasal yöntemlerle kemik iliği mikrometastazı bulunma oranının,
kullanılan antikora bağlı olarak % 4-48 arasında değiştiği bildirilmiştir.245,246
İmmünositokimyasal yöntemin diğer yöntemlere üstünlüğü, sitokeratin (+) hücrelerin
görerek değerlendirilmesi ve yanlış pozitifliğin dışlanabilmesidir. Dezavantajları ise,
gözlemcinin yorumuna bağımlı subjektif bir yöntem olması ve oldukça zaman alıcı bir
yöntem olmasıdır. Sadece bir hastanın bu yöntemle değerlendirilmesi ortalama 4 gün
sürmektedir. RT-PCR yönteminin kullanıldığı çalışmalarda, 107 normal kemik iliği
hücresi içinde tek bir tümör hücresini bulabilecek hassasiyette olduğu ve
immünositokimyasal yönteme daha üstün olduğu ileri sürülmüştür.211,279-281 Bugüne
kadar RT-PCR yönteminin kullanıldığı çalışmalarda kemik iliği mikrometastazı
bulunma oranı kullanılan primerlere bağlı olarak % 0-71 arasında değişmektedir. Bu
kadar değişken sonuçların ortaya koyulması yanlış pozitif sonuçlara bağlanmıştır.
Kullanılan primerler normal kemik iliği hücreleri ile çapraz reaksiyon vermektedir.
Hem immünositokimya hem de RT PCR yönteminin canlı ve apopitotik hücreler
arasında ayrım yapamaması nedeniyle, son zamanlarda mikrometastatik hücrelerin
analizi için bu önemli farkı ayırt etmeye olanak tanıyan yeni bir teknik geliştirilmiştir.283
ELİSPOT tekniği spesifik marker proteinlerin sekresyon veya aktif salınımını kullanan
enzim-bağlı immünospot teknolojisinin adapte edilmiş şeklidir. Bu yöntemle MUC1 ve
79
CK19 sekrete eden hücrelerin sayılması yoluyla, uzak metastazı olan meme kanserli
hastaların % 90’ında, uzak metastazı olmayan hastaların ise % 54’ünde kemik iliğinde
mikrometastatik hücreler tespit edilmiştir.285 Flovsitometrik yöntem, hematolojik
malignensilerde kan ve kemik iliğindeki göreceli olarak çok az sayıdaki kanser
hücrelerini bulmak için geliştirilmiştir.286-288 Bu yöntemin özellikle 106 hücre içinde tek
bir hücreyi belirleyebilecek duyarlılığa sahip olduğu rapor edilmiştir, ancak bu
duyarlılık tüm çalışmalarda gösterilememiştir.289 Clevenger ve arkadaşları, meme
kanserli hastalarda CD45 ve sitokeratin18 monoklonal antikorları kullanılarak tümör
hücrelerinin normal hematopoietik hücrelerden yüksek duyarlılıkla ayırt edilebileceğini
bildirmiştir.287 Flovsitometrik yöntemin immünositokimyasal ve diğer ışık mikroskobik
yöntemlere üstünlüğü, ploidi durumunun belirlenebilmesi, apopitotik ve ölü hücreleri
ayırt edebilmesi, objektif bir yöntem olması ve çok sayıdaki hücrenin kısa sürede
sayılabilmesidir. Biz de çalışmamızda, günlük pratikte kullanılabilirliği, hızlı sonuç
alınabilmesi ve ilgili çalışmaların çok az sayıda olması nedeniyle flovsitometri
yöntemini kullandık.
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde, T1 tümör boyutuna
sahip hastaların % 25,2’sinde, T2 tümör boyutuna sahip hastaların % 33,3’ünde, T3
tümör boyutuna sahip hastaların % 38’inde, T4 tümör boyutuna sahip hasta % 60,4’ünde
kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (p<0,001 anlamlı).3 Çalışmamızda, lenf nodu
metastazı negatif 20 hastadan, T1 tümör boyutuna sahip 13 hastanın 1’inde (% 7,6), T2
tümör boyutuna sahip 7 hastanın 4’ünde (% 57) kemik iliği mikrometastazı saptandı.
Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, T1 tümör boyutuna sahip 5 hastada, T2 tümör
boyutuna sahip 10 hastada ve T3 tümör boyutuna sahip 4 hastada kemik iliği
mikrometastazı saptanmadı. Bu grupta T4 tümör boyutuna sahip 1 hastada kemik iliği
mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan, T1 tümör boyutuna
sahip 3 hastanın 1’inde (% 33,3), T2 tümör boyutuna sahip 7 hastanın 4’ünde (% 57)
kemik iliği mikrometastazı saptanırken, T3 tümöre sahip 2 hastada kemik iliği
mikrometastazı negatif bulundu. Tüm hastalar birlikte değerlendirildiğinde T1 tümör
boyutuna sahip 21 hastanın 2’sinde (% 9,5), T2 tümör boyutuna sahip 24 hastanın 8’inde
(% 33,3), T3 tümör boyutuna sahip 6 hastanın 0’ında (% 0), T4 tümör boyutuna sahip 1
hastada (% 100) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Bizim çalışmamızda çok
değişkenli analizde tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
80
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,092) Hastalar lenf nodu ve uzak metastaz
durumuna göre; lenf nodu (+), (-) ve uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt
grup analizinde, tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlı bulundu. (p<0,001) T3 tümör boyutuna sahip hastalar
dışlandığında, tümör boyutu arttıkça kemik iliği mikrometastazı oranının arttığı
bulundu. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde ise tek değişkenli
analizde kemik iliği mikrometastazı ile ilişkili bulunurken, çok değişkenli analizde ilişki
gösterilememiştir. Bizim çalışmamızda ise alt grup analizinde ilişkili bulundu ancak
tüm hastalar birlikte ele alındığında ilişki gösterilemedi.3 Bizim çalışmamızda bu
bulgularla uyumlu bulgular elde edildi.
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde, N0 lenf nodu
metastazına sahip hastaların % 26,4’ünde, N1 lenf nodu metastazına sahip hastaların %
30’unda, N2 lenf nodu metastazına sahip hastaların % 39,4’ünde ve N3 lenf nodu
metastazına sahip hastaların % 50’sinde kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır
(p=0,001).3 Bizim çalışmamızda lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, N1 lenf nodu
metastazına sahip 9 hastanın 1’inde (% 11,1) kemik iliği mikrometastazı saptanırken, N2
lenf nodu metastazına sahip 6 hastada ve N3 lenf nodu metastazına sahip 5 hastada
kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Lenf nodu metastazı negatif (N0) 20 hastanın
5’inde (% 25) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV)
hastadan, N0 lenf nodu metastazına sahip 2 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif
bulundu. (% 0) Oniki metastatik hastadan; N1 lenf nodu metastazına sahip hasta yoktu,
N2 lenf nodu metastazına sahip 6 hastanın ikisinde (% 33,3) ve N3 lenf nodu metastazına
sahip 6 hastanın üçünde (% 50) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Tüm hastalar
birlikte değerlendirildiğinde N0 lenf nodu metastazına sahip 22 hastanın 5’inde (%
22,7), N1 lenf nodu metastazına sahip 9 hastanın 1’inde (% 11,1), N2 lenf nodu
metastazına sahip 12 hastanın 2’sinde (% 16,6) ve N3 lenf nodu metastazına sahip 11
hastanın 3’ünde (% 27,2) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Bizim çalışmamızda çok
değişkenli analizde metastatik lenf nodu sayısı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki
ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,843) Hastalar lenf nodu metastazı
(+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, lenf nodu metastazı
ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu
81
(p<0,001). Bizim çalışmamızda, Braun ve arkadaşlarının yaptığı meta-analizle
karşılaştırıldığında lenf nodu pozitif grup dışında uyumlu bulgular elde edildi.
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde yaşa göre kemik iliği
mikrometastaz oranı, 20-35 yaş arasındaki hastalarda (% 34,8), 36-50 yaş arasındaki
hastalarda (% 33,3), 51-65 yaş arasındaki hastalarda (% 29,5), 65 yaş üstü hastalarda (%
27,8) bulunmuştur (p=0,001 anlamlı).3 Çalışmamızda hastaların yaşı ile kemik iliği
mikrometastazı varlığı arasındaki ilişki değerlendirildiğinde, lenf nodu negatif 20
hastadan 20-35 yaş arasındaki 3 hastanın 1’inde (% 33,3), 36-50 yaş arasındaki 9
hastanın 2’sinde (% 22,2), 51-65 yaş arasındaki 7 hastanın 2’sinde (% 28,5) kemik iliği
mikrometastazı saptanırken, 65 yaş üstü 1 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif
bulundu (% 0). Lenf nodu pozitif 20 hastadan 20-35 yaş arasındaki 2 hastada, 36-50 yaş
arasındaki 13 hastada, 51-65 yaş arasındaki 3 hastada kemik iliği mikrometastazı
negatif bulunurken, 65 yaş üstü 2 hastanın 1’inde (% 50) kemik iliği mikrometastazı
pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan 20-35 yaş arasındaki 2 hastada ve
36-50 yaş arasındaki 4 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulunurken, 51-65
yaş arasındaki 5 hastanın 4’ünde (% 80), 65 yaş üstü 1 hastada kemik iliği
mikrometastazı pozitif bulundu (% 100). Tüm hastalar beraber ele alındığında 20-35 yaş
arasındaki 7 hastanın 1’inde (% 14,2), 36-50 yaş arasındaki 26 hastanın 2’sinde (% 7,6),
51-65 yaş arasındaki 15 hastanın 6’sında (% 40), 65 yaş üstü 4 hastanın 3’ünde (% 75)
kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Bizim çalışmamızda, çok değişkenli
analizde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0,036). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu
(+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, yaş ile
kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı.
(p=0,759)
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; premenopozal
hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 32,7), postmenopozal hastalarda (%
29,5) bulunmuştur (p=0,02).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan,
premenopozal 9 hastanın 3’ünde (% 33,3), postmenopozal 11 hastanın 2’sinde (% 18,1)
kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan,
premenopozal 13 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı, postmenopozal 7
hastanın 1’inde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 14,2) Oniki metastatik
82
(evre IV) hastadan premenopozal 7 hastanın 1’inde (% 14,2), postmenopozal 5 hastanın
4’ünde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 80). Tüm hastalar beraber ele
alındığında, premenopozal 28 hastanın 4’ünde (% 14,3), postmenopozal 22 hastanın
7’sinde (% 31,9) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Menopozal durum ile
kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı.
(p=0,144) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya
uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, menopozal durum
ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı.
(p=0,435)
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; reseptör negatif
hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 34,5), herhangi bir reseptörü (östrojen
ve/veya progesteron) pozitif hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 29,4)
bulunmuştur (p=0,003).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan,
östrojen reseptörü negatif 6 hastanın 3’ünde (% 50), östrojen reseptörü pozitif 14
hastanın 2’sinde (% 14,2) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı
pozitif 20 hastadan, östrojen reseptörü negatif 3 hastanın 1’inde (% 33,3) kemik iliği
mikrometastazı pozitif bulunurken, östrojen reseptörü pozitif 17 hastada kemik iliği
mikrometastazı saptanmadı. Oniki metastatik (evre IV) hastadan östrojen reseptörü
negatif 3 hastanın 1’inde (% 33,3), östrojen reseptörü pozitif 9 hastanın 4’ünde (% 44,4)
kemik iliği mikrometastazı saptandı. Tüm hastalar beraber ele alındığında, östrojen
reseptörü negatif 12 hastanın 5’inde (% 41,6), östrojen reseptörü pozitif 40 hastanın
6’sında (% 15) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Çok değişkenli analizde
östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,1) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna
göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup
analizinde, östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,901)
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; reseptör negatif
hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 34,5), herhangi bir reseptörü (östrojen
ve/veya progesteron) pozitif hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 29,4)
bulunmuştur (p=0,003).3
Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan,
progesteron reseptörü negatif 7 hastanın 4’ünde (% 57,1), progesteron reseptörü pozitif
83
13 hastanın 1’inde (% 7,6) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı
pozitif 20 hastadan, östrojen reseptörü negatif 6 hastanın 1’inde (% 16,6) kemik iliği
mikrometastazı pozitif bulunurken, progesteron reseptörü pozitif 14 hastada kemik iliği
mikrometastazı saptanmadı. Oniki metastatik (evre IV) hastadan progesteron reseptörü
negatif 4 hastanın 2’sinde (% 50), progesteron reseptörü pozitif 8 hastanın 3’ünde (%
37,5) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Tüm hastalar beraber ele alındığında,
progesteron reseptörü negatif 17 hastanın 7’sinde (% 41,1), progesteron reseptörü
pozitif 35 hastanın 4’ünde (% 11,4) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Çok
değişkenli analizde progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,155) Hastalar lenf nodu
veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt
gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,733)
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; çalışmaların yapıldığı
dönemde c-erb-B2 rutin olarak değerlendirilmediği için bu çalışmada klinik parametre
olarak kullanılmamıştır.3 C-erb-B2 ekspresyonu azalmış sağkalım ile ilişkilidir ve
meme kanserli hastaların % 20-35’inde aşırı-eksprese edilmektedir. Aynı zamanda
kemik iliğindeki mikrometastatik hücrelerde c-erb-B2 aşırı-ekspresyonu kötü prognoz
için bir prediktördür.220 Bu nedenle, mikrometastatik hücrelerde c-erb-B2’nin hem
mRNA
(RT-PCR)
değerlendirilmesi,
hem
de
immünoterapi
DNA
(FİSH)
(trastuzumab)
yöntemleriyle
için
ekspresyonunun
giderek
daha
sık
kullanılmaktadır.368 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, c-erb-B2
negatif 8 hastanın 2’inde (%25), c-erb-B2 1(+) 4 hastanın 2’sinde (%50), c-erb-B2 2(+)
2 hastanın 0’ında (% 0), c-erb-B2 3(+) 6 hastanın 1’inde (% 16,6) kemik iliği
mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, c-erb-B2 negatif 5
hastada, c-erb-B2 1(+) 1 hastada ve c-erb-B2 2(+) 8 hastada kemik iliği mikrometastazı
negatif bulundu; c-erb-B2 3(+) 6 hastanın 1’inde (% 16,6) kemik iliği mikrometastazı
pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan c-erb-B2 negatif 2 hastada kemik
iliği mikrometastazı negatif bulunurken, c-erb-B2 1(+) 1 hastada (% 100), c-erb-B2 2(+)
1 hastada (% 100), c-erb-B2 3(+) 6 hastanın 3’ünde (% 50) kemik iliği mikrometastazı
pozitif bulundu. Tüm hastalar beraber ele alındığında, c-erb-B2 negatif 14 hastanın
2’sinde (% 14,2), c-erb-B2 1(+) 6 hastanın 3’ünde (% 50), c-erb-B2 2(+) 11 hastanın
84
1’inde (% 9), c-erb-B2 3(+) 18 hastanın 5’inde (% 27,7) kemik iliği mikrometastazı
pozitif bulundu. c-erb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,147). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz
durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında,
alt grup analizinde, c-erb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel
olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,222).
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; mikrometastaz oranları
invaziv duktal karsinom alt tipine sahip hastalarda (% 30,7), invaziv lobüler karsinom
alt tipine sahip hastalarda (% 31,4), mikst alt tipe sahip hastalarda (% 28,4), inflamatuar
alt tipe sahip hastalarda (% 47,8) bulunmuştur (p=0,08).3 Çalışmamızda, lenf nodu
metastazı negatif 20 hastadan, invaziv duktal karsinom alt tipine sahip 16 hastanın
4’ünde (% 25), invaziv lobüler karsinom alt tipine sahip 2 hastanın 1’inde (% 50) kemik
iliği mikrometastazı saptandı. Bu grupta müsinöz karsinomu olan 1 hastada kemik iliği
mikrometastazı negatif bulundu. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, invaziv
duktal karsinom alt tipine sahip 16 hastanın 1’inde (% 6,25) kemik iliği mikrometastazı
pozitif bulundu, invaziv lobüler karsinom alt tipine sahip 2 hastada ve mikst tip alt tipe
sahip 2 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Oniki metastatik (evre IV)
hastadan invaziv duktal karsinom alt tipine sahip 11 hastanın 5’inde (% 45,4) kemik
iliği mikrometastazı saptandı. Bu grupta mikst alt tipe sahip 1 hastada kemik iliği
mikrometastazı saptanmadı. Tüm hastalar beraber ele alındığında, invaziv duktal
karsinom alt tipine sahip 43 hastanın 10’unda (% 23,2), invaziv lobüler karsinom alt
tipine sahip 4 hastanın 1’inde (% 25) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu, mikst
alt tipe sahip 3 hastada ve müsinöz karsinomu olan 1 hastada kemik iliği mikrometastazı
saptanmadı. Çok değişkenli analizde tümör alt tipi ile kemik iliği mikrometastazı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,377). Hastalar lenf nodu
metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, tümör alt
tipi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa
ulaşmadı (p=0,680).
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; evre I-III hastalar
değerlendirilmiş ve evre arttıkça mikrometastaz oranının arttığı belirtilmiştir.3 Bidard ve
arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, uzak metastazlı 138 hastanın kemik iliği
mikrometastazı açısından immünositokimyasal yöntemle değerlendirilmiş ve hastaların
85
% 59’unda kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır. Ancak azalmış toplam sağkalım ile
ilişkisi gösterilememiştir.358 Çalışmamızda kemik iliği mikrometastazı saptanan 11
hastadan; 1 hasta evre I (%9), 4 hasta evre II (% 36), 1 hasta evre III (% 9) ve 5 hasta
evre IV (% 46) grubunda idi. Evre I 12 hastanın 1’inde (% 8,3), evre II 20 hastanın
4’ünde (% 20), evre III 8 hastanın 1’inde (% 12,5) ve evre IV 12 hastanın 5’inde (%
41,6) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Çok değişkenli analizde tümörün evresi
ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı
(p=0,227). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-)
veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, tümörün
evresi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p<0,001).
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; histolojik grade 1
tümöre sahip hastalarda (% 22,5), histolojik grade 2 tümöre sahip hastalarda (% 29,9),
histolojik grade 3 tümöre sahip hastalarda (% 34,5) oranında kemik iliği mikrometastazı
pozitif bulunmuştur (p<0,001). Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan,
histolojik grade 1 tümöre sahip 3 hastanın birinde (% 33,3), histolojik grade 2 tümöre
sahip 9 hastanın 2’sinde (% 22), histolojik grade 3 tümöre sahip 8 hastanın 2’sinde (%
25) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan,
histolojik grade 1 tümöre sahip hasta yoktu, histolojik grade 2 tümöre sahip hastada
kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu, histolojik grade 3 tümöre sahip 12 hastanın
1’inde (% 8,3) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV)
hastadan histolojik Grade 1 tümöre sahip 1 hastada (% 100), histolojik grade 2 tümöre
sahip 5 hastanın 1’inde (% 20), histolojik grade 3 tümöre sahip 6 hastanın 3’ünde (%
50) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Tüm hastalar beraber ele alındığında,
grade 1 tümöre sahip 4 hastanın 2’sinde (% 50), histolojik grade 2 tümöre sahip 22
hastanın 2’sinde (% 9), histolojik grade 3 tümöre sahip 26 hastanın 6’sında (% 23)
kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Histolojik grade ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,247).
Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak
metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, histolojik grade ile
kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı
(p=0,435).
86
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; lenfovasküler invazyon
varlığı klinik parametre olarak değerlendirilmemiştir. Naume ve arkadaşları tarafından
yapılan ve 920 hastayı kapsayan bir çalışmada, immünositokimyasal yöntem
kullanılarak, kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu, aksiller lenf nodu tutulumu,
lenfovasküler invazyon varlığı, c-erb-B2 ekspresyonu ve ER/PR durumu arasında
pozitif korelasyon bulmuşlardır.357 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20
hastadan, lenfovasküler invazyon pozitif 3 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif
bulundu, lenfovasküler invazyon negatif 17 hastanın 5’inde (% 29,4) kemik iliği
mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, lenfovasküler
invazyon pozitif 19 hastanın 1’inde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 5,2),
lenfovasküler invazyon negatif 1 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu.
Oniki metastatik (evre IV) hastadan lenfovasküler invazyon negatif 2 hastada kemik
iliği mikrometastazı negatif bulundu, lenfovasküler invazyon pozitif 10 hastanın 5’inde
kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 50). Tüm hastalar beraber ele
alındığında, lenfovasküler invazyon negatif 20 hastanın 5’inde (% 25), lenfovasküler
invazyon pozitif 32 hastanın 6’sında (% 18,75) kemik iliği mikrometastazı pozitif
bulundu (% 50). Lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,591). Hastalar lenf nodu veya uzak
metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara
ayrıldığında, alt grup analizinde, lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001).
Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; DCİS komponenti
varlığı klinik parametre olarak değerlendirilmemiştir. Yonksik Jonk ve arkadaşları
tarafından yapılan ve RT-PCR yönteminin kullanıldığı bir çalışmada DCİS tanısı olan 4
hastanın birisinde kemik iliği mikrometastazı saptanmış ve klinik takiplerinde 4
hastanın hiç birisinde rekürrens gözlenmemiştir.166 Bizim çalışmamıza DCİS (Tis)
tümöre sahip hastalar dahil edilmedi. Primer tümörlerde DCİS varlığı c-erb-B2 ve p53
pozitifliği ile güçlü bir şekilde ilişkilidir.359,360 Kutun ve arkadaşları tarafından yapılan
bir çalışmada 49 meme kanserli hastanın 21’inde DCİS komponenti pozitif bulunmuş,
DCİS pozitif hastaların 9’unda (%42,8) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunmuştur.
(p=0,002) DCİS lezyonları genellikle heterojendir ve çeşitli histolojik subtipler relaps
ve uzak metastaz olasılığında önemli farklara neden olmaktadır. Bu nedenle DCİS’in
87
histolojik subtipleri ile kemik iliği mikrometastazı arasında bir korelasyon olabileceği
düşünülmektedir.361,362 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, primer
tümörde DCİS komponenti pozitif 10 hastanın 1’inde (% 10), negatif 10 hastanın
4’ünde (% 40) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Lenf nodu metastazı pozitif
20 hastadan, primer tümörde DCİS komponenti pozitif 10 hastanın 1’inde (% 10) kemik
iliği mikrometastazı pozitif bulundu, DCİS komponenti negatif 10 hastada ise kemik
iliği mikrometastazı negatif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan DCİS
komponenti pozitif 5 hastanın 3’ünde (% 60), negatif 7 hastanın 2’sinde (% 28,5) kemik
iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Tüm hastalar beraber ele alındığında, DCİS
komponenti pozitif 25 hastanın 5’inde (% 20), negatif 27 hastanın 6’sında (% 22,2)
kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Lenfovasküler invazyon ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,591)
Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak
metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, lenfovasküler invazyon
ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu
(p<0,001).
Daha önceki çalışmalarda cinsiyet ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki
araştırılmamıştır. Çalışmamızda, 50’si kadın, 2’si erkek toplam 52 hasta dahil edildi.
Çalışmaya dahil edilen iki erkek hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu.
Çok değişkenli ve alt grup analizlerinde cinsiyet ile kemik iliği mikrometastazı arasında
istatistiksel anlamlılığa ulaşan ilişki bulunamadı.
Çalışmamıza 12 metastatik (evre IV) hasta dahil edildi. Hastaların 5’inde 1, 5
hastada 2 ve 2 hastada 3 metastaz odağı saptandı. Şimdiye kadar patolojik olarak
gösterilmiş kemik iliği metastazı olan hastalarda CK pozitifliğinin flovsitometri
yöntemiyle değerlendirildiği herhangi bir çalışma yoktur. Çalışmamızda biyopside
immünohistokimyasal olarak kemik iliği metastazı saptanan 2 hastada flovsitometrik
yöntemle CK pozitif hücreler gösterildi (% 100). Kemik iliği metastazı olmayan 50
hastanın 9’unda (% 18) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik iliği metastazı
varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu
(+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik
88
iliği metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak
anlamlılığa ulaşmadı (p=0,031).
Bidard ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, 138 metastatik hastadan, kemik
metastazı olan 74 hastanın 57’sinde (% 77), kemik metastazı olmayan 64 hastanın
24’ünde (% 37) kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (gruplar arasındaki fark
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadığı görülmüştür).358 Çalışmamızda kemik
metastazı saptanan 10 hastanın 5’inde (% 50), kemik metastazı olmayan 42 hastanın
6’sında (% 14,3) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik metastazı varlığı ile
kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu
(p=0,013). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-)
veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik
metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa
ulaşmadı (p<0,001).
Bidard ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, 138 metastatik hastadan, karaciğer
metastazı olan 62 hastanın 41’inde (% 66), karaciğer metastazı olmayan 76 hastanın
53’ünde (% 53) kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (gruplar arasındaki fark
istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmamıştır).358 Çalışmamızda karaciğer metastazı
bulunan 5 hastanın 3’ünde (% 60), karaciğer metastazı olmayan 47 hastanın 8’inde (%
17) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Karaciğer metastazı varlığı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,025). Hastalar
lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik
olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, karaciğer metastazı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001).
Magire ve arkadaşları, serebral metastaz pozitif olan 10 gastrointestinal
(özofagogastrik, rektum, kolon) ve 2 meme kanserli hastada flovsitometrik yöntemle
kemik ilikleri değerlendirilmiş ve tüm hastalarda kemik iliği mikrometastazı varlığı
gösterilmiştir (% 100). Bu nedenle serebral metastazı bulunan ve küratif cerrahi yapılan
hastalarda kemik iliği mikrometastazlarının değerlendirilmesi ve tedavinin buna göre
seçilmesi önerilmiştir.364 Çalışmamızda serebral metastazı olan 3 hastanın 1’inde (%
33,3), serebral metastazı olmayan 49 hastanın 10’unda (% 20,4) kemik iliğinde
mikrometastaz saptandı. Serebral metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı
arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,595). Hastalar lenf nodu
89
veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt
gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, serebral metastaz ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,005).
Şimdiye kadar akciğer metastazı varlığı ile kemik iliği mikrometastazı ilişkisinin
değerlendirildiği herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Çalışmamızda akciğer metastazı
bulunan 2 hastanın 2’sinde (% 100), akciğer metastazı olmayan 50 hastanın 9’unda (%
18) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Akciğer metastazı varlığı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,005). Hastalar
lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik
olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, akciğer metastazı ile kemik iliği
mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,031).
Çalışmamızda,
tüm
hastalar
birlikte
değerlendirildiğinde,
kemik
iliği
mikrometastaz oranı % 21,1 bulundu. Alt grup analizinde kemik iliği mikrometastazı
oranı, lenf nodu negatif grupta % 25; lenf nodu pozitif grupta % 5 ve uzak metastazlı
hastalarda ise % 41,6 bulundu. Tüm hastalar birlikte değerlendirildiğinde, çok
değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu, metastatik lenf nodu
sayısı, evre, kemik iliği, kemik, karaciğer ve akciğer metastazları arasında anlamlı ilişki
saptandı. Lenf nodu metastazı ve uzak metastaz varlığına göre alt grup analizinde ise;
kemik iliği mikrometastazı ile yaş, lenfovasküler invazyon, değerlendirmeye alınan tüm
uzak metastazlar (kemik iliği, kemik, beyin, karaciğer, akciğer) arasında istatistiksel
olarak anlamlı ilişki bulundu. Braun ve arkadaşları tarafından evre I-III 4703 hastayı
kapsayan meta-analizde ise kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 bulunmuştur. Bu
çalışmada tek değişkenli analizde yaş, tümör boyutu, lenf nodu metastazı varlığı ve
sayısı ile ilişki saptanırken, çok değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazının tüm
klinik değişkenlerden bağımsız bir prognostik faktör olduğu gösterilmiştir. Bu
çalışmaya göre, kemik iliği mikrometastazı olmayan hastalarla karşılaştırıldığında,
mikrometastaz saptanan hastaların primer tümörlerinin daha büyük boyutta ve daha
yüksek histolojik grade’e sahip olduğu, bu hastalarda lenf nodu metastazının ve hormon
reseptörleri negatifliğinin daha sık olduğu belirlenmiştir. Kemik iliği mikrometastazı
pozitif hastaların toplam ve meme kanseri spesifik hayatta kalımı önemli derecede kısa
bulunmuştur (tek değişkenli mortalite oranı sırasıyla 2,15 ve 2,44; her ikisi için P değeri
<0,001)3 Uzak metastazlı hastaların değerlendirildiği Bidard ve arkadaşlarının yaptığı
90
çalışmada, kemik iliği mikrometastazı oranı % 59 bulunmuş ancak prognozla ilişkisi
gösterilememiştir.
Yöntemin özgüllüğünü belirlemek için çalışmaya, epitelyal tümörü olmayan
remisyonda lösemi ve lenfomalı 16 hasta dahil edildi. Bu hastaların ikisinde 100.000
hücre içinde 2 sitokeratin pozitif hücre saptandı. Bu sonuçların eritroid prekürsörlerde
yanlış pozitif boyanmaya veya kemik iliği alırken cilt epitelinden kontaminasyona bağlı
olabileceği düşünüldü. RT-PCR veya flovsitometri gibi yöntemlerde pozitif sonuçların
immünositokimyasal yöntemle doğrulanması, yanlış pozitifliğin dışlanması açısından
önemlidir. İmmünositokimyasal yöntemin diğer yöntemlerden bir diğer üstünlüğü bu
noktadadır.
Çalışmamızda mikrometastatik hücre tespit edilen 12 hastada çeşitli CK’lerin ve
EpCAM’ın ekspresyonu değerlendirildi. CK4 pozitifliği lenf nodu metastazı olmayan,
östrojen ve progesteron reseptörü negatif ve c-erb-B2 negatif olan bir hastada saptandı.
CK4 pozitifliği bazal benzeri meme kanserlerinde eksprese edilmektedir ve bu tümörler
özellikle lenf nodu pozitif hastalarda luminal benzeri tümörlere göre daha kötü
prognoza sahiptir. Meme kanserlerinin % 2-18’i CK4 eksprese etmektedir.302-304
Mikrometastatik hücrelerde CK6 ve CK10 pozitifliği saptanmadı. Meme
kanserlerinde sitokeratin6 ekspresyonu, ER negatifliği, c-erb-B2 pozitifliği yüksek
nükleer grade ve tek odaklı DCİS varlığı ile ilişkili bulunmuştur. Sitokeratin6 pozitif
tümörlerin,
negatif
tümörlere
göre
daha
primitif
hücrelerden
köken
aldığı
düşünülmektedir.307 Kemik iliği mikrometastazlarının erken dönemde gerçekleştiği
düşünüldüğünde, bu hücrelerin CK6 eksprese etmeleri olasıdır. Ancak mikrometastatik
hücrelerde CK6 ekspresyonu ile ilgili araştırma yapılmamıştır. Çalışmamızda CK10,
mikrometastatik hücreleri cilt epitelinden kontamine olmuş hücrelerden ayırt etmek için
kullanılmıştır. Hastaların tamamında ciltten kontaminasyon olmadığı veya yöntemin
duyarlılığının düşük olması nedeniyle negatif bulunmuş olabileceği düşünüldü.
Çalışmamızda kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunan lenf nodu negatif 1
hastada ve uzak metastazlı 2 hastada EpCAM pozitifliği mevcuttu. EpCAM hücrelerin
metastaz yapabilmesi için gereken bir yüzey antijenidir. Metastatik meme kanser
hücrelerinin %60’dan fazlasında EpCAM eksprese edilmektedir. EpCAM meme kanseri
hücrelerinde heterojen olarak eksprese edilmektedir. Meme kanserinde EpCAM’a
yönelik monoklonal antikorlar, mikrometastatik hücrelerin immünomanyetik olarak
91
ayrılması ve RT-PCR analizi için zenginleştirme yöntemlerinde kullanılmıştır.268 Bu
antijeni tanımlayan monoklonal antikorlar tanısal yöntemler yanında tedavi seçeneği
olarak da kullanılmıştır. Ancak bizim çalışmamızda EpCAM eksprese eden
mikrometastatik hücre sayısı yöntemin düşük duyarlılığı nedeniyle az sayıdadır.
Meme
kanserinde
kemik
iliğinde
bulunan
mikrometastatik
hücrelerin
çoğunluğunun mezenkimal kök hücre ile benzer özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir.
Bu hücreler meme kanseri kök hücresi olarak değerlendirilmiştir. Mezenkimal kök
hücresi gibi bu hücrelerde de CD44+/CD24zayıf+/- olarak tespit edilmiştir. Ancak bizim
çalışmamızda, flovsitometrik yöntemle, kemik iliğinde 105-106 hücrede 1 tane gibi çok
az sayıda bulunan mikrometastatik hücrelerde bu ekspresyon profili gösterilemedi.
Güncel medikal tedavilerle kanser kök hücrelerinin tamamen yok edilememesi
nedeniyle hedef tedavilerin önemi artmaktadır.
Çalışmamızda flovsitometrik yöntemin duyarlılığı % 21, özgüllüğü % 87,5, yanlış
pozitiflik oranı % 15, pozitif prediktif değeri % 84, negatif prediktif değeri % 25
bulundu. Literatürde şu ana kadar yapılan çalışmalarda genel olarak kontrol grubu
alınmadan immünositokimyasal yöntemler kullanılmıştır. Bu tekniğin kullanılan
antikora ve farklı boyama tekniklerine bağlı olarak özgüllüğü ve duyarlılığında
farklılıklar bildirilmiştir. Farklı sitokeratin antijenlerine karşı bazı antikorların
kombinasyonları veya farklı sitokeratin proteinlerinin ortak epitopunu tespit edebilen
antikorlar (örneğin sitokeratin 8, 18 ve 19’u tanıyan A45B/B3), tek sitokeratin
proteinini hedefleyen monospesifik antikorlara (örneğin sitokeratin 18’i tanıyan
sitokeratin 2) göre daha üstün görünmektedir.3,246,247 Çünkü solid tümör hücreleri,
önemli derecede antijenik heterojeniteye sahiptir. Kemik iliği mikrometastazlarının
belirlenmesinde immünositokimyasal yöntem için en sık A45B/B399,115,246,263-265 ve
AE1/AE3161,177,266 kullanılmıştır ve her ikisininde de yanlış pozitiflik oranları düşük
bulunmuştur.
A45B/B3’ün
kullanıldığı
çalışmalarda
özgüllüğü
ve
duyarlılığı
ispatlanmıştır (Yanlış pozitiflik oranları % 5’den az bulunmuştur). Flovsitometrik
yöntem kemik iliği mikrometastazının belirlenmesi için prostat, mesane ve
gastrointestinal sistem tümörlerinde kullanılmıştır. Meme kanserinde ise kan ve lenf
nodlarında mikrometastatik hücrelerin belirlenmesi için kullanılmakla beraber kemik
iliğinde bu amaçla kullanıldığı çalışma sayısı çok azdır. Yöntemin doğruluğunun
belirlenmesi için, diğer yöntemlerle karşılaştırıldığı, yeterli hasta sayısı içeren ve
92
hastaların yeterli süre prognoz açısından takip edildiği çalışmalara ihtiyaç vardır. Ayrıca
yanlış pozitifliğin azaltılması için meme kanseri hücre dizileri (örneğin MCF7 cell line)
ve duyarlılığının artırılması için daha gelişmiş zenginleştirme yöntemleri (örneğin
immünomanyetik zenginleştirme) kullanılabilir.
Çalışmamızda lenf nodu metastazı pozitif grupta mevcut literatürle uyumlu
olmayan bulgular elde edildi. Bunun nedenleri, çalışmamızın daha önceki çalışmalara
göre heterojen bir hasta grubunu kapsaması, hasta sayımızın azlığı ve özellikle lenf
nodu metastazı pozitif grupta mikrometastaz oranının düşüklüğüne bağlı olabilir.
Mevcut çalışmalarda genellikle erken evre meme kanserli hastalar değerlendirilmiştir.
Lenf nodu metastazı olan hastaların kemik ilikleri daha uzun süre dondurulmuş halde
kaldı. Lenf nodu metastazı olmayan ve metastatik hasta gruplarında dondurulma işlemi
uygulanan hasta sayısı daha azdı. Dondurulmadan direk olarak flovsitometride çalışılan
hastalarda mikrometastaz oranı daha yüksek bulundu. Kemik iliğinin mononükleer
hücre fraksiyonunun ayrıştırılması için kullanılan ficoll-hypack solüsyonu ve dondurma
işlemi için kullanılan DMSO (dimetil sülfoksit) hücreler için toksik etkilere sahiptir. Bu
nedenle, her ne kadar ikisi için de uzaklaştırma işlemi uygulansa da bu iki ajana maruz
kalan hücrelerin sayılarında ciddi düşüşler olduğu gözlendi. Bazı hastalarda % 60’lara
varan hücre kaybı tespit edildi. DMSO, hücre zarlarından kolayca geçerek nükleusun
etkilenmeden saklanmasını sağlayan ve hematopoietik kök hücrelerin saklanması
yaygın olarak kullanılan bir kriyoprotektandır. DMSO ile hücre dondurma işlemlerinin
yapıldığı çalışmalarda hücre kaybının en fazla % 30-40 olabileceği bildirilmiştir. Ancak
DMSO için ex-vivo çalışmalarda antitümöral etkisi olduğu bildiren çalışmalar vardır. Bu
nedenle mikrometastatik tümör hücrelerinin DMSO’dan etkilenmesi olasıdır.365-367
Braun ve arkadaşları tarafından yapılan meta-analizde metastatik lenf nodu
sayısının arttıkça mikrometastaz oranının arttığı bulunmuştur. Woelfle ve arkadaşları
tarafından yapılan bir çalışmada kemik iliği pozitif ve negatif tümörlerin gen
ekspresyon profillerinin birbirinden farklı olduğu gösterilmiştir. Farklı eksprese edilen
genlerin; ekstrasellüler matriks remodeling, adezyon, hücre iskeleti plastisitesi ve sinyal
iletimi [özellikle RAS ve HIF-1a (hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 alfa)] olduğu
gösterilmiştir.
Kemik
iliği
mikrometastazı
olan
tümörlerde
başlıca
özellik
transkripsiyonun baskılanmasıdır ve lenfatik metastaz yapan tümörlerden farklı
bulunmuştur.144
93
Erken evre epitelyal kanserli hastalarda, kemik iliğinde mikrometastatik
hücrelerin değerlendirilmesi, ilave prognostik parametre olarak giderek daha fazla
kullanılmaktadır. Özellikle erken evre meme kanserli hastalarda, doğru risk sınıflaması
açısından mikrometastazların araştırılması önemlidir. Bu yolla hastaların kemoterapinin
gereksiz toksisitesine maruz kalması önlenebilir veya adjuvan kemoterapi planlanmayan
hastaların prognozunu olumsuz etkileyecek olan kemik iliği mikrometastazları için
uygun tedavi seçenekleri uygulanarak, relaps riski azaltılabilir veya ortadan
kaldırılabilir.
Mikrometastazların
bulunmasının,
daha
etkili
antikanser
stratejilerinin
geliştirilmesine yardım edebileceğine yönelik kanıtlar vardır. Ancak, bu markerin
bağımsız prognostik değeri ve klinikle ilişkisi, klinik pratikte rutin kullanıma girmeden
önce tam olarak belirlenememiştir. Minimal rezidüel hastalığın prognostik ilişkisini
destekleyen deneysel ve klinik kanıtların çokluğuna rağmen, yayımlanan verilerin
büyük kısmının, erken metastatik hastalığının biyolojisinin tam olarak anlaşılamaması
nedeniyle, yorumlanmalarının zorluğu yanı sıra, zayıf temellere dayanmaktadır. Ayrıca,
mikrometastazın bulunması için kullanılan tekniklerin çoğunun, özgüllüğü ve
duyarlılığı yetersizdir.
Geniş prospektif çalışmalarda, prognoz ve hasta yönetimindeki etkisini göstermek
ve mikrometastazın gerçek değerine ilişkin kesin sonuçlar elde etmek için, güvenilir ve
tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış teknikler kullanılmalıdır. Manifest metastazın
gelişiminden önce, erken metastatik hastalığın oluşumunun belirlenmesi, dormansi
fenomenine
karışan
mekanizmaların
aydınlatılması,
moleküler
olayların
ve
etkileşimlerin tanımlanması, medikal onkoloji alanında daha doğru ve klinik yönden
faydalı bilgiler sağlayacaktır. Minimal rezidüel hastalığın eradike edilmesi veya
büyümesinin kontrol edilmesini sağlayan yeni ilaçların geliştirilmesi, hücre siklüsünden
bağımsız olarak, standart kemoterapi ile kombinasyon halinde antikorlara dayanan
tedavilerin kullanılması umut verici terapötik yaklaşımlardır. Son olarak, deneysel ve
klinik çalışmalarla mikrometastatik hücrelerin gen ekspresyon profilinin belirlenmesi
gibi yeni teknolojilerle birleştirilmesi, bu ilerlemeleri hızlandırmaktadır.
94
6. SONUÇ VE ÖNERİLER
1. Operabl meme kanserli hastalarda kemik iliği mikrometastazları prognostik
açıdan önemlidir.
2. Mikrometastatik hücrelerin büyük kısmı mezenkimal kök hücre fenotipine
sahiptir ve G0 fazında olmaları, klasik kemoterapi rejimleri ile eradike edilmelerini
zorlaştırmaktadır.
3. Mikrometastatik hücreler, kemik iliğindeki geniş hücre popülasyonu içinde çok
nadir bir hücre grubudur. Bu hücrelerin bulunabilmesi için duyarlı ve özgül yöntemlere
ihtiyaç vardır.
4. Çalışmamızda flovsitometrik yöntemle 52 evre I-IV meme kanserli hastada
kemik
iliği
mikrometastazı
oranı
araştırıldı.
Tüm
hasta
grupları
birlikte
değerlendirildiğinde, kemik iliği mikrometastaz oranı % 21,1 bulundu. Alt grup
analizinde ise lenf nodu negatif grupta % 25; lenf nodu pozitif grupta % 5 ve uzak
metastazlı hastalarda % 41,6 bulundu. Bulgularımız lenf nodu pozitif grup dışında
literatür ile uyumluydu.
5. Çalışmamızda çok değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazı ile tümör
boyutu, metastatik lenf nodu sayısı, evre, kemik iliği, kemik, karaciğer ve akciğer
metastazları arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı. Lenf nodu metastazı ve
uzak metastaz durumuna göre alt grup analizi yapıldığında; kemik iliği mikrometastazı
ile yaş, lenfovasküler invazyon, değerlendirmeye alınan tüm uzak metastazlar (kemik
iliği, kemik, beyin, karaciğer, akciğer) arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki
bulundu. Bu bulguya benzer sonuçlar literatürde bulunmakla birlikte, hasta sayımızın az
olması önemli bir dezavantajdır.
6. Kemik iliğinde mikrometastatik hücre pozitif bulunan 11 hastada, çeşitli
CK’lerin ve EpCAM’ın ekspresyonu değerlendirildi. CK4 pozitifliği, lenf nodu
metastazı olmayan, östrojen-progesteron reseptörü negatif ve c-erb-B2 negatif olan bir
hastada saptandı. Bu 11 hastanın tamamında mikrometastatik hücrelerde CK6 ve CK10
negatif bulundu. Kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunan lenf nodu negatif 1 hastada
ve uzak metastazlı 2 hastada EpCAM pozitifliği bulundu. Flovsitometrik yöntemle,
kemik iliğinde 105-106 hücrede 1 tane gibi çok az sayıda bulunan mikrometastatik
95
hücrelerde CD44+/CD24zayıf+/- ekspresyon profili gösterilemedi. Bulgularımız literatürle
uyumlu değildi.
7. Mikrometastatik hücrelerin belirlenmesi için flovsitometri uygun bir yöntem
olmakla birlikte, bu hücrelerin ekspresyon profillerinin belirlenmesi için duyarlılığı
düşüktür.
8. Kemik iliği materyallerinin saklanması için DMSO kullanılması önemli hücre
kaybına yol açtığı ve mikrometastatik hücreler için toksik etkilere neden olabildiği için,
ficoll-hypack santrifüjü sonrası örneklerin hemen değerlendirilmesi daha doğru bir
yaklaşımdır.
9. Flovsitometrik yöntemde CKpozitif/CD45negatif hücrelerin mikrometastatik hücre
olarak kabul edilmesi daha uygundur. CKpozitif/Pİnegatif hücreler değerlendirildiğinde,
pozitif kabul edilen mikrometastatik hücre sayısının daha az olduğu gözlenmiştir.
10. Flovsitometrik yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğünün daha doğru belirlenmesi,
prognoz ve hasta yönetimindeki etkisinin gösterilmesi ve mikrometastazın gerçek
değerine ilişkin kesin sonuçların elde edilmesi için, geniş prospektif çalışmalarla,
güvenilir, tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış yöntemlere ihtiyaç vardır.
96
7. KAYNAKLAR
1. Anthony S. Fauci, Eugene Braunwald, Dennis L. Kasper Breast Cancer Harrison’s Principles of
İnternal Mehdicine 17th Ed. New York: The McGraw-Hill Companies, Inc. 2008.
2. Rosen, Paul P. Rosen's Breast Pathology. Third Edition Lippincott Williams & Wilkins (LWW) 2008.
3. Braun S, Vogl FD, Naume B, Janni W, Osborne MP, Coombes RC. A pooled analysis of bone
marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med 2005;353(8):793-802.
4. Ewertz M, Duffy SW, Adamı HO. Ege at first birth, parity and risk of breast cancer: a meta-analysis
of 8 studies from the Nordic countries. Int J Cancer 1990;46:597.
5. Cancer Research UK. Epidemiology unit, University of Oxford UK. Endogenous sex hormon and
breast cancer in postmenopausal women: Reanalaysis of nine prospective studies. J Natl. Cancer Inst.
2002. Apr. 17;94 (8): 606-16.
6. Evans JS, Wennberg JE, McNeil BJ. The influence of diagnostic radiography on the incidence of
breast cancer and leukemia. N Engl J Med 1986;315:810.
7. Dickson RB, Lippman ME: Moleculer basis of breast cancer, in Molecular Basis of Cancer.
Mendelson J, Howley PM, Israel MA, Liotta LA (eds) Philadelphia, Saunders 2001, pp.313.
8. Data on SEER (Surveillance, Epidemiology and End Results) cancer statistics available online at
http://seer.cancer.gov/csr/1975_2003/results_merged/sect_04_breast.pdf (accessed October 11,2008).
9. American Cancer Society Breast Cancer Facts and Figures 2008 available online at
www.cancer.org/docroot/STT/STT_0.asp (accessed April 15, 2008).
10. Howe, HL, Wu, X, Ries, LA. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2003,
featuring cancer among U.S. Hispanic/Latino populations. Cancer 2006; 107:1711.
11. Dupont WD, Page DL, Rogers LW. Risk factors for breast cancer in women with proliferative
breast disease. N Engl J Med 1985 Jan 17;312(3):146-51.
12. Tavasoli F, DevilleP. WHO classification of tumours, Tumours of the Breast and Female Genital
Tract, ed.Tavasoli F, Deville P, IARC Pres, 2003.
13. Davis BW, Gelber R, Goldhirsch A. Prognostik significance of peritumoral lymphatic invasion in
clinical trials of adjuvant therapy for breast cancer with axillary lymph node metastasis. Hum Pathol
1985; 16: 1212-1218.
14. Güler G Ulusal Meme Hastalıkları Kongresi (5-9 Eylül 2007) Ankara.
97
15. Hunter DJ, Spiegelman D, Adami HO. Cohort studies of fat intake and the risk of breast cancer a
pooled analysis. N Engl J Med 1996;334:356-61
16. Schnitt, SJ, Guidi, AJ. Pathology of invasive breast cancer. In: Diseases of the Breast, Harris, JR,
Lippman, ME, Morrow, M, Osborne, CK, (Eds), 3rd ed, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia
2004. p.393.
17. Cianfrocca M, Goldstein J L. Prognostic and predictive marker of early stage breast cancer. The
Oncologist. 2004;9:606-616.
18. Elston CW, Ellis JO. Pathological prognostic factory in breast cancer: Experience from a long study
with long-term follow up. Histopathology 1991; 19: 403-410.
19. Singletary SE, Allred C, Ashley P, Bassett LW, Berry D, Bland KI, Borgen PI, Clark G, Edge
SB, Hayes DF, Hughes LL, Hutter RV, Morrow M, Page DL, Recht A, Theriault RL, Thor A,
Weaver DL, Wieand HS, Greene FL. Revision of the American Joint Committee on Cancer staging
system for breast cancer. J Clin Oncol 2002 Sep 1;20(17):3628-36.
20. Page, DL. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favorable prognostic types. Am J
Surg Pathol 1991; 15:334.
21. Simpson, JF, Page, DL. Status of breast cancer prognostication based on histopathologic data
[published erratum appears in Am J Clin Pathol 1995 Jan;103(1):115]. Am J Clin Pathol 1994; 102:S3.
22. Rosen, PP, Groshen, S, Kinne, DW, Norton, L. Factors influencing prognosis in node-negative
breast carcinoma: Analysis of 767 T1N0M0/T2N0M0 patients with long-term follow-up. J Clin Oncol
1993; 11:2090.
23. Fitzgibbons, PL, Page, DL, Weaver, D. Prognostic factors in breast cancer. College of American
Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966.
24. Cianfrocca M, Goldstein J L. Prognostic and predictive marker of early stage breast cancer. The
Oncologist. 2004;9:606-616.
25. Colozza, M, Azambuja, E, Cardoso, F. Proliferative markers as prognostic and predictive tools in
early breast cancer: where are we now?. Ann Oncol 2005; 16:1723.
26. Lackowska, B, Niezabitowski, A, Rys, J. S-phase fraction and menopausal status as the most
important prognostic factors of disease-free survival for node negative patients with breast cancer. A
prospective study. Pol J Pathol 2003; 54:101.
27. Merkel, DE, Winchester, DJ, Goldschmidt, RA. DNA flow cytometry and pathologic Gradeing as
prognostic guides in axillary lymph node-negative breast cancer. Cancer 1993; 72:1926.
98
28. Silvestrini, R, Daidone, MG, Luisi, A. Biologic andclinicopathologic factors as indicators of specific
relapse types in node-negative breast cancer. J Clin Oncol 1995; 13:697.
29. Jones, S, Clark, G, Koleszar, S. Low proliferative rate of invasive node-negative breast cancer
predicts for a favorable outcome: a prospective evaluation of 669 patients. Clin Breast Cancer 2001;
1:310.
30. Malmstrom, P, Bendahl, PO, Boiessen, P. S-phase fraction and urokinase plasminogen activator are
better markers for distant recurrences than Nottingham Prognostic Index and histologic Grade in a
prospective study of premenopausal lymph node-negative breast cancer. J Clin Oncol 2001; 19:2010.
31. Urruticoechea, A, Smith, IE, Dowsett, M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J Clin
Oncol 2005; 23:7212.
32.Mauri, FA, Girlando, S, Palma, PD. Ki-67 antibodies (Ki-S5, MIB-1, and Ki-67) in breast
carcinomas. A brief quantitative comparison. Appl Immunohistochem 1994; 2:171.
33. Weidner, N, Moore, DH, Vartanian, R. Correlation of Ki-67 antigen expression with mitotic figure
index and tumor Grade in breast carcinomas using the novel "paraffin"-reactive MIB1 antibody. Hum
Pathol 1994; 25:337.
34. Pinder, SE, Wencyk, P, Sibbering, DM. Assessment of the new proliferation marker MIB1 in breast
carcinoma using image analysis: Associations with other prognostic factors and survival. Br J Cancer
1995; 71:146.
35. Trihia, H, Murray, S, Price, K. Ki-67 expression in breast carcinoma. Cancer 2003; 97:1321.
36. Keshgegian, AA, Cnaan, A. Proliferation markers in breast carcinoma. Mitotic figure count, S-phase
fraction, proliferating cell nuclear antigen, Ki-67 and MIB-1. Am J Clin Pathol 1995; 104:42.
37. Chassevent, A, Jourdan, ML, Romain, S. S-phase fraction and DNA ploidy in 633 T1T2 breast
cancers: a standardized flow cytometric study. Clin Cancer Res 2001; 7:909.
38. Mandard, AM, Denoux, Y, Herlin, P. Prognostic value of DNA cytometry in 281 premenopausal
patients with lymph node negative breast carcinoma randomized in a control trial: multivariate analysis
with Ki-67 index, mitotic count, and microvessel density. Cancer 2000; 89:1748.
39. Baak, JP, van Diest, PJ, Voorhorst, FJ. Prospective multicenter validation of the independent
prognostic value of the mitotic activity index in lymph node-negative breast cancer patients younger than
55 years. J Clin Oncol 2005; 23:5993.
40. Fehm, T, Maimonis, P, Weitz, S. Influence of circulating c-erbB-2 serum protein on response to
adjuvant chemotherapy in node-positive breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 1997; 43:87.
99
41. Kandl, H, Seymour, L, Bezwoda, WR. Soluble c-erbB-2 fragment in serum correlates with disease
stage and predicts for shortened survival in patients with early-stage and advanced breast cancer. Br J
Cancer 1994; 70:739.
42. Mehta, RR, McDermott, JH, Hieken, TJ. Plasma c-erbB-2 levels in breast cancer patients:
prognostic significance in predicting response to chemotherapy. J Clin Oncol 1998; 16:2409.
43. Leitzel, K, Teramoto, Y, Sampson, E. Elevated soluble c-erbB-2 antigen levels in the serum and
effusions of a proportion of breast cancer patients. J Clin Oncol 1992; 10:1436.
44. Yamauchi, H, O'Neill, A, Gelman, R. Prediction of response to antiestrogen therapy in advanced
breast cancer patients by pretreatment circulating levels of extracellular domain of the HER-2/c-neu
protein. J Clin Oncol 1997; 15:2518.
45. Ohtsubo, M, Theodoras, AM, Schumacher, J. Human cyclin E, a nuclear protein essential for the
G1-to-S phase transition. Mol Cell Biol 1995; 15:2612.
46. Dulic, V, Lees, E, Reed, SI. Association of human cyclin E with a periodic G1-S phase protein
kinase. Science 1992; 257:1958.
47. Keyomarsi, K, Conte, D Jr, Toyofuku, W, Fox, MP. Deregulation of cyclin E in breast cancer.
Oncogene 1995; 11:941.
48. Buckley, MF, Sweeney, KJ, Hamilton, JA. Expression and amplification of cyclin genes in human
breast cancer. Oncogene 1993; 8:2127.
49. Porter, DC, Zhang, N, Danes, C. Tumor-specific proteolytic processing of cyclin E generates
hyperactive lower-molecular-weight forms. Mol Cell Biol 2001; 21:6254.
50. Patocs, A, Zhang, L, Xu, Y. Breast-cancer stromal cells with TP53 mutations and nodal metastases.
N Engl J Med 2007; 357:2543.
51.Thor, AD, Moore, DH, Edgerton, SM. Accumulation of p53 tumor suppressor gene protein: An
independent marker of prognosis in breast cancers. J Natl Cancer Inst 1992; 84:845.
52. Allred, DC, Clark, GM, Elledge, R. Association of p53 protein expression with tumor cell
proliferation rate and clinical outcome in node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 1993; 85:200.
53. Barnes, DM, Dublin, EA, Fisher, CJ. Immunohistochemical detection of p53 protein in mammary
carcinoma: An important new independent indicator of prognosis? Hum Pathol 1993; 24:469.
54. Isola, K, Visakorpi, T, Holli, K, Kallioniemi, OP. Association of overexpression of tumor
suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer
patients. J Natl Cancer Inst 1992; 84:1109.
100
55. Olivier, M, Langerod, A, Carrieri, P. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794
patients with breast cancer. Clin Cancer Res 2006; 12:1157.
56. Weidner, N, Folkman, J, Pozza, F. Tumor angiogenesis: A new significant and independent
prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1992; 84:1875.
57. Horak, ER, Leek, R, Klenk, N. Angiogenesis assessed by platelet/endothelial cell adhesion molecule
antibodies as indicator of node metastases and survival in breast cancer. Lancet 1992; 340:1120.
58. Gasparini, G, Toi, M, Gion, M. Prognostic significance of vascular endothelial growth factor protein
in node-negative breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1997; 89:139.
59. Heimann, R, Ferguson, D, Powers, C. Angiogenesis as a predictor of long-term survival for patients
with node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 1996; 88:1764.
60. Guidi, AJ, Berry, DA, Broadwater, G. Association of angiogenesis in lymph node metastases with
outcome of breast cancer. J Natl Cancer Inst 2000; 92:486.
61. Westley, BR, May, FE. Cathepsin D and breast cancer. Eur J Cancer 1996; 32A:15.
62. Tandon, AK, Clark, GM, Chamness, GC. Cathepsin D and prognosis in breast cancer. N Engl J
Med 1990; 322:297.
63. Siitonen, SM, Kononen, JT, Helin, HJ. Reduced E-cadherin expression is associated with
invasiveness and unfavorable prognosis in breast cancer. Am J Clin Pathol 1996; 105:394.
64. Ferrandina, G, Scambia, G, Bardelli, F. Relationship between cathepsin-D content and disease-free
survival in node-negative breast cancer patients: a meta-analysis. Br J Cancer 1997; 76:661.
65. Stephens, RW, Brunner, N, Janicke, F, Schmitt, M. The urokinase plasminogen activator system
as a target for prognostic studies in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1998; 52:99.
66. Foekens, JA, Peters, HA, Look, MP. The urokinase system of plasminogen activation and prognosis
in 2780 breast cancer patients. Cancer Res 2000; 60:636.
67. Chappuis, PO, Dieterich, B, Sciretta, V. Functional evaluation of plasmin formation in primary
breast cancer. J Clin Oncol 2001; 19:2731.
68. Look, MP, van Putten, WL, Duffy, MJ. Pooled Analysis of Prognostic Impact of Urokinase-Type
Plasminogen Activator and Its Inhibitor PAI-1 in 8377 Breast Cancer Patients. J Natl Cancer Inst 2002;
94:116.
69. Harbeck, N, Kates, RE, Schmitt, M. Clinical relevance of invasion factors urokinase-type
plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1 for individualized therapy decisions in
primary breast cancer is greatest when used in combination. J Clin Oncol 2002; 20:1000.
101
70. Janicke, F, Prechtl, A, Thomssen, C. Randomized adjuvant chemotherapy trial in high-risk, lymph
node-negative breast cancer patients identified by urokinase-type plasminogen activator and plasminogen
activator inhibitor type 1. J Natl Cancer Inst 2001; 93:913.
71. Ebeling, FG, Stieber, P, Untch, M. Serum CEA and CA 15-3 as prognostic factors in primary breast
cancer. Br J Cancer 2002; 86:1217.
72. Gion, M, Boracchi, P, Dittadi, R. Prognostic role of serum CA15.3 in 362 node-negative breast
cancers. An old player for a new game. Eur J Cancer 2002; 38:1181.
73. Kumpulainen, EJ, Keskikuru, RJ, Johansson, RT. Serum tumor marker CA 15.3 and stage are the
two most powerful predictors of survival in primary breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2002; 76:95.
74. Martin, A, Corte, MD, Alvarez, AM. Prognostic value of pre-operative serum CA 15.3 levels in
breast cancer. Anticancer Res 2006; 26:3965.
75. Sorlie, T, Tibshirani, R, Parker, J. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent
gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100:8418.
76. Sorlie, T. Molecular portraits of breast cancer: tumour subtypes as distinct disease entities. Eur J
Cancer 2004; 40:2667.
77. Perou, CM, Sorlie, T, Eisen, MB. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000;
406:747.
78. Brenton, JD, Carey, LA, Ahmed, AA, Caldas, C. Molecular classification and molecular
forecasting of breast cancer: ready for clinical application?. J Clin Oncol 2005; 23:7350.
79. Ahr, A, Karn, T, Solbach, C. Identification of high risk breast-cancer patients by gene expression
profiling. Lancet 2002; 359:131.
80. Espinosa, E, Vara, JA, Redondo, A. Breast cancer prognosis determined by gene expression
profiling: a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction study. J Clin Oncol 2005;
23:7278.
81. van't, Veer LJ, Dai, H, van de, Vijver MJ. Gene expression profiling predicts clinical outcome of
breast cancer. Nature 2002; 415:530.
82. van de, Vijver MJ, He, YD, van't Veer, LJ. A gene-expression signature as a predictor of survival
in breast cancer. N Engl J Med 2002; 347:1999.
83. Huang, E, Cheng, SH, Dressman, H. Gene expression predictors of breast cancer outcomes. Lancet
2003; 361:1590.
102
84. Sotiriou, C, Neo, SY, McShane, LM. Breast cancer classification and prognosis based on gene
expression profiles from a population-based study. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100:10393.
85. Wang, Y, Klijn, JG, Zhang, Y. Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymphnode-negative primary breast cancer. Lancet 2005; 365:671.
86. Foekens, JA, Atkins, D, Zhang, Y. Multicenter Validation of a Gene Expression-Based Prognostic
Signature in Lymph Node-Negative Primary Breast Cancer. J Clin Oncol 2006; 24:1665.
87. Buyse, M, Loi, S, van't Veer, L. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for
women with node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 2006; 98:1183.
88. Liu, R, Wang, X, Chen, GY. The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast-cancer
cells. N Engl J Med 2007; 356:217.
89. Acharya, CR, Hsu, DS, Anders, CK. Gene expression signatures, clinicopathological features, and
individualized therapy in breast cancer. JAMA 2008; 299:1574.
90. Paik, S, Shak, S, Tang, G. A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, nodenegative breast cancer. N Engl J Med 2004; 351:2817.
91. Desmedt, C, Piette, F, Loi, S. Strong time dependence of the 76-gene prognostic signature for nodenegative breast cancer patients in the TRANSBIG multicenter independent validation series. Clin Cancer
Res 2007; 13:3207.
92. Fisher, B, Dignam, J, Bryant, J, Wolmark, N. Five versus more than five years of tamoxifen for
lymph node-negative breast cancer: Updated findings from the National Surgical Adjuvant Breast and
Bowel Project B-14 randomized trial. J Natl Cancer Inst 2001; 93:684.
93. Ma, XJ, Hilsenbeck, SG, Wang, W. The HOXB13:IL17BR expression index is a prognostic factor
in early-stage breast cancer. J Clin Oncol 2006; 24:4611.
94. Pantel, K., & Woelfle, U. Cancer micrometastasis: Detection, clinical relevance, and molecular
description. In American Society of Clinical Oncology (ASCO) (Ed.), ASCO 2004 educational book (pp.
701–708). USA: Lisa Graves Publisher.
95. Zhu, L., Lam, C. K., & Chow, L. W. C. Sentinel lymph node biopsy or detection of micrometastasis
in bone marrow: Which might be an alternative to axillary lymph node dissection in breast cancer
patients? Asian Journal of Surgery, 2004, 27, 279–283.
96. Dearnaley, D. P., Sloane, J. P., Ormerod, M. G., Steele, K., Coombes, R. C., Clink, H. M.
Increased detection of mammary carcinoma cells in marrow smears using antisera to epithelial membrane
antigen. British Journal of Cancer, (1981) 44, 85–90.
103
97. Timar, J., Csuka, O., Orosz, Z., Jeney, A., & Kopper, L. Molecular pathology of tumor metastasis:
II. Molecular staging and differential diagnosis. Pathology Oncology Research, (2002) 8, 204–219.
98. Guinebretiere, J. M., & Contesso, G. “Micrometastases”: The pathologist’s point of view. Bulletin
du Cancer, 88, (2001) 549–550, 555–560.
99. Braun S, Pantel K, Muller P. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients
with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med 2000;342:525–533.
100. MacDonald, I. C., Groom, A. C., & Chambers, A. F. (2002). Cancer spread and micometastasis
development: Quantitative approaches for in vivo models. Bioessays, 24, 885–893.
101. Tanja Fehm , Sven Becker Presence of apoptotic and nonapoptotic disseminated tumor cells
reflects the response to neoadjuvant systemic therapy in breast cancer Breast Cancer Research 2006,
8:R60.
102. Chambers, A. F. (2004). Biology of the metastatic process. In American Society of Clinical
Oncology (ASCO) (Ed.), ASCO 2004 educational book (pp. 696–700). USA: Lisa Graves Publisher.
103. Chambers, A., F, MacDonald, I. C., Schmidt, E. E., Morris, V. L., & Groom, A. C. 1999). Preclinical assessment of anticancer therapeutic strategies using in vivo videomicroscopy. Cancer Metastasis
Reviews, 17, 263–269.
104. Fidler, I. J. (1975). Biological behavior of malignant melanoma cells correlated to their survival in
vivo. Cancer Research, 35, 218–224.
105. Cameron, M. D., Schmidt, E. E., Kerkvliet, N., Nadkarni, K. V., Morris, V. L., Groom, A. C.
(2000). Temporal progression of metastasis in lung: Cell survival, dormancy and location dependence of
metastatic inefficiency. Cancer Research, 60, 2541–2546.
106. Murphy, B. O., Joshi, S., Kessinger, A., Reed, E., & Sharp, J. G. (2002). A murine model of
bone marrow micrometastasis in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis, 19, 561–569.
107. Tarin, D., Price, J. E., Kettlewell, M. G., Souter, R. G., Vass, A. C., & Crossley, B. (1984).
Mechanisms of human tumor metastasis studies in patients with peritoneovenous shunts. Cancer
Research, 44, 3584–3592.
108. Gangnus, R., Langer, S., Breit, E., Pantel, K., & Spercher, M. R. (2004). Genomic profiling of
viable and proliferative micrometastatic cells from early-stage breast cancer patients. Clinical Cancer
Research, 10, 3457–3464.
109. Naumov, G. N., MacDonald, I. C., Weinmeister, P. M., Kerkvliet, N., Nadkarni, K. V., Wilson,
S. M. (2002). Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: A possible contributor
to dormancy. Cancer Research, 62, 2162–2168.
104
110. Demicheli, R., Abbattista, A., Miceli, R., Valagussa, P., & Bonnadonna, G. (1996). Time
distribution of the recurrence risk for breast cancer patients undergoing mastectomy: Further support
about the concept of tumor dormancy. Breast Cancer Research and Treatment, 41, 177–185.
111. Gimbrone,M. A., Jr., Leapman, S. B., Cotran, R. S., & Folkman, J. (1972). Tumor dormancy in
vivo by prevention of neovascularization. Journal of Experimental Medicine, 136, 261–276.
112. Michelson, S., & Leith, J. T. (1994). Dormancy, regression and recurrence: Towards a unifying
theory of growth control. Journal of Theoretical Biology, 169, 327–338.
113. Stewart, T. H. (1996). Immune mechanisms and tumor dormancy. Medicina (Buenos Aires), 56,
74–82.
114. Yu, W., Kim, J., & Ossowski, L. (1997). Reduction in surface urokinase receptor forces malignant
cells in a protracted state of dormancy. Journal of Cell Biology, 137, 767–777.
115. Solakoglu, O., Maierhofer, C., Lahr, G., Breit, E., Scheunemann, P., Heumos, I. (2002).
Heterogeneous proliferative potential of occult metastatic cells in bone marrow of patients with solid
epithelial tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99,
2246–2251.
116. Guba, M., Cernaianu, G., Koehl, G., Geissler, E. K., Jauch, K.- W., Anthuber, W. F. (2001). A
primary tumor promotes dormancy of solitary tumor cells before inhibiting angiogenesis. Cancer
Research, 61, 5575–5579.
117. Holmgren, L., O’Reilly, M. S., & Folkman, J. (1995). Dormancy of micrometastases: Balanced
proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nature Medicine, 1, 149–153.
118. O’Reilly, M. S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R. A., Moses, M. (1994).
Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung
carcinoma. Cell, 79, 315–328.
119. Luzzi, K. J., MacDonald, I. C., Schmidt, E. E., Kerkvliet, N., Morris, V. L., Chambers, A. F.
(1998). Multistep nature of metastatic inefficiency: Dormancy of solitary cells after successful
extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology, 153, 865–
873.
120. Murray, C. (1995). Tumor dormancy: Not so sleepy after all. Nature Medicine, 1, 117–118.
121. O’Reilly, M. S., Boehm, T., Shing, Y., Fukai, N., Vasios, G., Lane, W. S. (1997). Endostatin: An
endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 88, 277–285.
122. O’Reilly, M. S., Pirie-Shepherd, S., Lane, W. S., & Folkman, J. (1999). Antiangiogenic activity
of the cleaved conformation of the serpin antithrombin. Science, 285, 1926–1928.
105
123. Farrar, J. D., Katz, K. H., Windsor, J., Thrush, G., Scheuermann, R. H., Uhr, J. W. (1999).
Cancer dormancy VII. A regulatory role for CD8+ T cells and IFN-γ in establishing and maintaining the
tumor dormant state. Journal of Immunology, 162, 2842–2849.
124. Stevenson, F. K., George, A. J., & Glennie, M. J. (1990). Antiidiotypic therapy of leukemias and
lymphomas. Chemical Immunology, 48, 126–166.
125. Schirrmacher, V. (2001). T-cell immunity in the induction and maintenance of a tumor dormant
state. Seminars in Cancer Biology, 11, 285–295.
126. Dyke, R. J., McBride, H., George, A. J., Hamblin, T. J, & Stevenson, F. K. (1991). Idiotypic
vaccination against B-cell lymphoma leads to dormant tumor. Cellular Immunology, 132, 70–83.
127. Uhr, J. W., Tucker, T., May, R. D., Siu, H., & Vitetta, E. S. (1991). Cancer dormancy: Studies of
the murine BCL1 lymphoma. Cancer Research, 51, 50455–50535.
128. Meng, S., Tripathy, D., Frenkel, E. P., Shete, S., Naftalis, E. Z., Huth, J. F. (2004). Circulating
tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research, 10, 8152–8162.
129. Pantel, K., Cote, R. J., & Fodstad, O. (1991). Detection and clinical importance of micrometastatic
disease. Journal of the National Cancer Institute, 91, 1113–1124.
130. Andratschke, M., Pauli, C., Stein, M., Chaubal, S., &Wollenberg, B. (2003). MHC-class I
antigen expression on micrometastases in bone marrow of patients with head and neck squamous cell
cancer. Anticancer Research, 23, 1467–1471.
131. Schlimok, G., Kutter, D., Schaller, G., Geuz, T., Wiebecke, B., Backmann, R. (1991). Frequent
down-regulation of major histocompatibility class I antigen expression on individual micrometastatic
carcinoma cells. Cancer Research, 51, 4712–4715.
132. Schlimok, G., Funke, I., Bock, B., Schweiberer, B., Witte, J., & Riethmuller, G. (1990).
Epithelial tumor cells in bone marrow of patients with colorectal cancer: immunocytochemical detection,
phenotypic characterization and prognostic significance. Journal of Clinical Oncology, 8, 831–837.
133. Reynolds, T. (1998). Researchers slowly unveil where cancer cells hide. Journal of the National
Cancer Institute, 90, 1690–1691.
134. Korah, R., Boots, M., & Wieder, R. (2004). Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested
breast cancer cells: An in vivo paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Research,
64, 4514–4522.
135. Ree, A. H., Tvermyr, M., Engebraaten, O., Rooman, M., Rosok, O., Hovig, E. (1999).
Expression of a novel factor in human breast cancer cells with metastatic potential. Cancer Research, 59,
4675–4680.
106
136. Mansi, J. L., Berger, U., McDonnell, T., Pople, A., Rayter, Z., Gazet, J. C. (1989). The fate of
bone marrow micrometastases in patients with primary breast cancer. Journal of Clinical Oncology, 7,
445–449.
137. Pantel, K. (2005). Symposium 34-2. Bone marrow: Homing organ for dormant micrometastatic
cancer cells. Proceedings of the American Association for Cancer Research, 46, 1477–1478.
138. Putz, E.,Witter, K., Offner, S., Stosiek, P., Zippelius, A., Johnson, J. (1999). Phenotypic
characteristics of cell lines derived Cancer Metastasis Rev (2006) 25:507–519 515 from disseminated
cancer cells in bone marrow of patients with solid epithelial tumors: Establishment of working models for
human micrometastases. Cancer Research, 59, 241–248.
139. Willipinski-Stapelfeldt, B., Riethdorf, S., Assmann, V., Woelfle, U., Rau, T., Sauter, G. (2005).
Changes in cytoskeletal proteins composition indicative of an epithelial–mesenchymal transition in
human micrometastatic and primary breast carcinoma cells. Clinical Cancer Research, 11, 8006–8014.
140. Fodstad, O., & Kjonniksen, I. (1994). Microenvironment revisited: Time for reappraisal of some
prevailing concepts of cancer metastasis. Journal of Cellular biochemistry, 56, 23–28.
141. Fidler, I. J. (1995). Modulation of the organ microenvironment for treatment of cancer metastasis.
Journal of the National Cancer Institute, 87, 1588–1592.
142. Uhr, J. W., Scheuermann, R. H., Street, N. E., & Vitetta, E. S. (1997). Cancer dormancy:
Opportunities for new therapeutic approaches. Nature Medicine, 3, 505–509.
143. Folkman, J. (1995). Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases. Nature
Medicine, 1, 27–31.
144. Woelfle, U., Cloos, J., Sauter, G., Riethdorf, L., Janicke, F., van Diest, P. (2003). Molecular
signature associated with bone marrow micrometastasis in human breast cancer. Cancer Research, 63,
5679–5684.
145. Varambally, S., Dhanasekaran, S. M., Zhou, M., Kumar-Sinha, C., Sanda, M. G., Ghosh, D.
(2002). The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature, 419,
624–629.
146. Benoy, I. H., Salgado, R., Elst, H., Van Dam, P., Weyler, J., Van Marck, E. (2005). Relative
microvessel area of the primary tumor, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow
micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically
non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Research, 7, R210–R219.
147. Z’graggen, K., Centeno, B. A., Fernandez-del Castillo, C., Jimenez, R. E., Werner, J., &
Warshaw, A. L. (2001). Biological implications of tumor cells in blood and bone marrow of pancreatic
cancer patients. Surgery, 129, 537–546.
107
148. Zippelius, A., & Pantel, K. (2000). RT-PCR based detection of occult disseminated tumor cells in
peripheral blood and bone marrow of patients with solid tumors. An overview. Annals of the New York
Academy of Sciences, 906, 110–123.
149. Vona, G., Sabile, A., Louha, M., Sitruk, V., Romana, S., Schutze, K. (2000). Isolation by size of
epithelial tumor cells: A new method for the immunomorphological and molecular characterization of
circulating tumor cells. American Journal of Pathology, 156, 57–63.
150. Mehes, G., Luegmayr, A., Amros, I. M., Ladenstein, R., & Ambros, P. F. (2001). Combined
automatic immunological and molecular cytogenetic analysis allows exact identification and
quantification of tumor cells in the bone marrow. Clinical Cancer Research, 7, 1969–1975.
151. Klein, C. A., Blakenstein, T. J., Schmidt-Kittler, O., Petronio, M., Polzer, B., Stoecklein, N. H.
(2002). Genetic heterogeneity of single disseminated tumor cells in minimal residual disease. Lancet,
360, 683–689.
152. Albertson, D. G., Collins, C., McCormick, F., & Gray, J. W. (2003). Chromosome aberrations in
solid tumors. Nature Genetics, 34, 369–376.
153. Bernard Fisher, M.D., Stewart Anderson, Ph.D., John Bryant Twenty-Year Follow-up of a
Randomized Trial Comparing Total Mastectomy, Lumpectomy, and Lumpectomy plus Irradiation for the
Treatment of Invasive Breast Cancer Volume 347:1233-1241 October 17, 2002 Number 16.
154. Attiqa N. Mirza, MD, Nadeem Q. Mirza, MD, Georges Vlastos Prognostic Factors in NodeNegative Breast Cancer A Review of Studies With Sample Size More Than 200 and Follow-Up More
Than 5 Years Ann Surg. 2002 January; 235(1): 10–26.
155. Pantel K, Brakenhoff RH Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer 4, 448-456
(June 2004) | doi:10.1038/nrc1370.
156. Mansi JL, Gogas H, Bliss JM. Outcome of primary-breast-cancer patients with micrometastases: a
long-term follow-up study. Lancet 354(9174), 197–202 (1999).
157. Pantel K, Woefle U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors J Biol Regul Homeost
Agents 2004 Apr-Jun;18(2):120-5.
158. Diel IJ, Kaufmann M, Costa SD. Micrometastatic breast cancer cells in bone marrow at primary
surgery: prognostic value in comparison with nodal status. J Natl Cancer Inst 1996;88:1652–1658.
159. Braun S, Pantel K, Muller P. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of
patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med 2000;342:525–533.
160. Gebauer G, Fehm T, Merkle E. Epithelial cells in bone marrow of breast cancer patients at time of
primary surgery: clinical outcome during long-term follow-up. J Clin Oncol 2001;19:3669–3674.
108
160. Gerber B, Krause A, Muller H. Simultaneous immunohistochemical detection of tumor cells in
lymph nodes and bone marrow aspirates in breast cancer and its correlation with other prognostic factors.
J Clin Oncol 2001;19:960–971.
161. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R. Detection of isolated tumor cells in bone marrow is an
independent prognostic factor in breast cancer. J Clin Oncol 2003;21:3469–3478.
162. Harbeck N. (1994) Tumour cell detection in the bone marrow of breast cancer patients at primary
therapy: results of a 3-year median follow-up. Br J Cancer 1991 69: 566–571.
163. Solomayer EF, Becker S, Pergola-Becker G, Bachmann R, Kramer B, Vogel U, Neubauer H,
Wallwiener D, Huober J & Fehm TN Comparison of HER2 status between primary tumor and
disseminated tumor cells in primary breast cancer patients. Breast Cancer Research and Treatment 2006
98 179–184.
164. WiedswangG,BorgenE,Karesen R,Kvalheim G,Nesland JM, Qvist H, Schlichting E, Sauer T,
Janbu J, Harbitz T. Detection of isolated tumor cells in bonemarrow is an independent prognostic factor
in breast cancer. Journal of Clinical Oncology 2003 21 3469–3478.
165. Nogi H, Takeyama H. Detection of MUC1 and Keratin 19 mRNAs in the Bone Marrow by
Quantitative RT-PCR Predicts the Risk of Distant Metastasis in Breast Cancer Patients. Breast
Cancer vol: 10 issue: 1 page: 74-81 year: 2003
166. Yong-Sik Jung1, Kug-Jong Lee Clinical Significance of Bone Marrow Micrometastasis Detected
by Nested RT-PCR for Keratin-19 in Breast Cancer Patients Jpn J Clin Oncol 2003;33(4)167–172.
167. Freire T, Berois N, Sonora C, Varangot M, Barrios E & Osinaga E UDP-N-acetyl-Dgalactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 6 (ppGalNAc-T6) mRNA as a potential
new marker for detection of bone marrow-disseminated breast cancer cells. International Journal of
Cancer 2006 119 1383–1388.
168. Benoy IH, Elst H, Philips M. Prognostic significance of disseminated tumor cells as detected by
quantitative real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction in patients with breast cancer.
Clinical breast cancer ISSN 1526-8209 2006, vol. 7, no2, pp. 146-152.
169. Masuda TA, Kataoka A, Ohno S, Murakami S, Mimori K, Utsunomiya T, Inoue H, Tsutsui H,
Kinoshita J, Masuda N. Detection of occult cancer cells in peripheral blood and bone marrow by
quantitative RT-PCR assay for cytokeratin-7 in breast cancer patients. International Journal of Oncology
2005 26 721–730.
170. Gebauer G, Fehm T. Micrometastases in axillary lymph nodes and bone marrow of lymph nodenegative breast cancer patients: Prognostic relevance after 10 years. Anticancer research ISSN 02507005 2003, vol. 23, no5B, pp. 4319-4324.
109
171. Schlimok G, Funke I, Holzmann B, Gottlinger G, Schmidt G, Hauser H, Swierkot S, Warnecke
HH, Schneider B, Koprowski H: Micrometastatic cancer cells in bone marrow: in vitro detection with
anti-cytokeratin and in vivo labeling with anti-17-1A monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA
1987, 84: 8672-8676.
172. Cote RJ, Peterson HF, Chaiwun B, Gelber RD, Goldhirsch A, Castiglione-Gertsch M. Role of
immunohistochemical detection of lymph-node metastases in management of breast cancer. International
Breast Cancer Study Group. Lancet 1999;354(9182):896-900.
173. Harbeck N Untch M, Pache L, Eiermann W. (1994) Tumour cell detection in the bone marrow of
breast cancer patients at primary therapy: results of a 3-year median follow-up. Br J Cancer 1991 69:
566–571.
174. Molino A, Pelosi G, Turazza M, Sperotto L, Bonetti A, Nortilli R, Fattovich G, Alaimo C,
Piubello Q, Pavanel F, Micciolo R, Cetto GL: Bone marrow micrometastases in 109 breast cancer
patients: correlations with clinical and pathological features and prognosis. Breast Cancer Res Treat
1997, 42:23-30.
175. Braun S, Kentenich C, Janni W. Lack of effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of
single dormant tumor cells in bone marrow of high-risk breast cancer patients. J Clin Oncol 2000;18:80–
86.
176. Janni W, Hepp F, Rjosk D. The fate and prognostic value of occult metastatic cells in the bone
marrow of patients with breast carcinoma between primary treatment and recurrence. Cancer
2001;92:46–53.
177. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R. Isolated tumor cells in bone marrow three years after
diagnosis in disease-free breast cancer patients predict unfavorable clinical outcome. Clin Cancer Res
2004;10:5342–5348.
178. Janni W, Rack B, Schindlbeck C. The persistence of isolated tumor cells in bone marrow from
patients with breast carcinoma predicts an increased risk for recurrence. Cancer 2005;103:884–891.
179. Pantel K, Schlimok G, Braun S. Differential expression of proliferation-associated molecules in
individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst 1993;85:1419–1424.
180. Pantel K, Izbicki JR, Angstwurm M. Immunocytological detection of bone marrow
micrometastasis in operable non-small cell lung cancer. Cancer Res 1993;53:1027–1031
181. Riethmuller G, Schneider-Gadicke E, Schlimok G. Randomised trial of monoclonal antibody for
adjuvant therapy of resected Dukes’ C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17-1A Study Group.
Lancet 1994;343:1177–1183.
182. Punt CJ, Nagy A, Douillard JY. Edrecolomab alone or in combination with fluorouracil and folinic
acid in the adjuvant treatment of stage III colon cancer: a randomised study. Lancet 2002;360:671–677.
110
183. Thurm H, Ebel S, Kentenich C. Rare expression of epithelial cell adhesion molecule on residual
micrometastatic breast cancer cells after adjuvant chemotherapy. Clin Cancer Res 2003;9:2598–2604.
184. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against
HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;344:783–792.
185. Goss PE, Ingle JN, Martino S. A randomized trial of letrozole in postmenopausal women after five
years of tamoxifen therapy for early-stage breast cancer. N Engl J Med 2003;349:1793–1802.
186. Diel IJ, Solomayer EF, Costa SD. Reduction in new metastases in breast cancer with adjuvant
clodronate treatment. N Engl J Med 1998;339:357–363.
187. Rack B, Janni W, Schindlbeck C. Effect of zoledronate on persisting isolated tumor cells (ITC) in
the bone marrow (BM) of patients without recurrence of early breast cancer. Proc Am Soc Clin Oncol
2004;22:9515.
188. R. Aft, M. Watson, L. Ylagan. Effect of zolendronik acid on bone marrow micrometastases in
women undergoing neoadjuvant chemotherapy for breast cancer J Clin Oncol 26:2008 (May 20 suppl;
abstr 1021)
189. Braun S, Schlimok G, Heumos I. ErbB2 overexpression on occult metastatic cells in bone marrow
predicts poor clinical outcome of stage I-III breast cancer patients. Cancer Res 2001; 61: 1890-5.
190. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against
HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001; 344: 783-92.
191. Klein CA, Blankenstein TJF, Schmidt-Kittler O. Genetic heterogeneity of single disseminated
tumour cells in minimal residual cancer. Lancet 2002; 360: 683-9.
192. Offner S, Schmaus W, Witter K. p53 gene mutations are not required for early dissemination of
cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 6942-6.
193. Gray JW. Evidence emerges for early metastasis and parallel evolution of primary and metastatic
tumors. Cancer Cell 2003; 4: 4-6.
194. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P. Molecular classification of cancer: class discovery and class
prediction by gene expression monitoring. Science 1999; 286: 531-7.
195. Chambers AF, Groom AC, MacDonald IC. Dissemination and growth of cancer cells in
metastatic sites. Nat Rev Cancer 2002; 2: 563-72.
196. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB. Molecular portraits of human breast tumours. Nature, 2000; 406:
747-52.
111
197. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish
tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 10869-74.
198. van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ. Gene expression profiling predicts clinical outcome of
breast cancer. Nature 2002; 415: 530-6.
199. Woelfle U, Cloos J, Sauter G. Molecular signature associated with bone marrow micrometastasis in
human breast cancer. Cancer Res 2003; 63: 5679-84.
200 Zetter BR, Banyard J. Cancer. The silence of the genes. Nature 2002; 419: 572-3.
201. Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M. The polycomb group protein EZH2 is involved in
progression of prostate cancer. Nature 2002; 419: 624-9.
202. Woelfle U, Sauter G, Santjer S, Brakenhoff R, Pantel K. Down-regulated expression of
cytokeratin 18 promotes progression of human breast cancer. Clin Cancer Res 2004; 10: 2670-4.
203. Lonning PE, Sorlie T, Perou CM, Brown PO, Botstein D, Borresen-Dale AL. Microarrays in
primary breast cancer-lessons from chemotherapy studies. Endocr Relat Cancer 2001; 8: 259-63.
204. MacDonald TJ, Brown KM, LaFleur B. Expression profiling of medulloblastoma: PDGFRA and
the RAS/MAPK pathway as therapeutic targets for metastatic disease. Nat Genet 2001; 29: 143-52.
205. Bos R, Zhong H, Hanrahan CF. Levels of hypoxiainducible factor-1 alpha during breast
carcinogenesis. J Natl Cancer Inst, 2001; 93: 309-14.
206. Staller P, Sulitkova J, Lisztwan J, Moch H, Oakeley EJ. Chemokine receptor CXCR4
downregulated by von Hippel-Lindau tumour suppressor pVHL. Nature 2003; 425: 307-11.
207. Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature
2001; 414: 105-11.
208. Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the “seed and soil” hypothesis revisited. Nat Rev
Cancer 2003; 3: 453-8.
209. Bernards R, Weinberg RA. A progression puzzle. Nature 2002; 418: 823.
210. Ramaswamy S, Ross KN, Lander ES, Golub TR. A molecular signature of metastasis in primary
solid tumors. Nat Genet 2003; 33: 1-6.
211. Datta YH, Adams PT, Drobyski WR. Sensitive detection of occult breast cancer by the reversetranscriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol 1994; 12:475–482.
112
212. Fields KK, Elfenbein GJ, Trudeau WL. Clinical significance of bone marrow metastases as
detected using the polymerase chain reaction in patients with breast cancer undergoing high-dose
chemotherapy and bone marrow transplantation. J Clin Oncol 1996; 14: 1868–1876.
213. Vannucchi A, Bosi MA, Glinz S. Evaluation of breast tumour contamination in the bone marrow
and leukapheresis collections by RT-PCR for cytokeratin-19 mRNA. Br. J. Haematol. 1998; 103: 610–
17.
214. Slade MJ, Smith BM. Sinnet HD. (1999) Quantitative polymerase chain reaction for the detection
of micrometastases in patients with breast cancer. J Clin Oncol 17: 870–879.
215. Landys K, Persson S, Kovarik J, Hultborn R, Holmberg E: Prognostic value of bone marrow
biopsy in operable breast cancer patients at the time of initial diagnosis: results of a 20-year median
follow-up. Breast Cancer Res Treat 1998, 49:27-33.
216. Funke I, Fries S, Rolle M. (1996) Comparative analyses of bone marrow micrometastases in breast
and gastric cancer. Int J Cancer 65: 755–761.
217. Mathieu MC, Friedman S, Bosq J, Caillou B. (1990) Immunohistochemical staining of bone
marrow biopsies for detection of occult metastasis in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 15: 21–26.
218. Singletary SE, Lillie Larry, MS, Susan L. Tucker. (1991) Detection of micrometastatic tumor
cells in bone marrow of breast carcinoma patients. J Surg Oncol 47: 32–36.
219. Cote RJ, Rosen PP, Lesser ML, Old LJ, Osborne MP. (1991) Prediction of early relapse in
patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases. J Clin Oncol 9:
1749–1756.
220. Porro G, Sylvie Ménard, PhD, Elda Tagliabue. (1988) Monoclonal antibody detection of
carcinoma cells in bone marrow biopsy specimens from breast cancer patients. Cancer 61: 2407–2411.
221. Salvadori B, Squiccarni P, and Rovini D. (1990) Use of monoclonal antibody MBr1 to detect
micrometastases in bone marrow specimens of breast cancer patients. Eur J Cancer 26: 865–867.
222. Redding WH, J C Gazet, A McKinna, T J Powles, and R C Coombes (1983) Detection of
micrometastases in patients with primary breast cancer. Lancet 2: 1271–1274
223. Berger U, Bettelheim R, Mansi JL. (1988) The relationship between micrometastases in the bone
marrow, histopathologic features of the primary tumor in breast cancer and prognosis. Am J Clin Pathol
90: 1–6.
224. de Mascarel I, Bonichon F. (1992) Prognostic significance of breast cancer axillary lymph node
micrometastases assessed by two special techniques: reevaluation with longer follow-up. Br J Cancer 66:
523–527.
113
225. Bussolati G, Gugliotta P, Morra I. (1986) The immunohistochemical detection of lymph node
metastases from infiltrating lobular carcinoma of the breast. Br J Cancer 54: 631–636.
226. Noguchi S, Tomohiko Aihara, Shoji Nakamori. (1994) The detection of breast carcinoma
micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction.
Cancer 74: 1595–1600.
227. Schoenfeld A, Luqmani İ, D. Smith, S. (1994) Detection of breast cancer micrometastases in
axillary lymph nodes by using polymerase chain reaction. Cancer Res 54: 2986–2990.
228. Zhong XY, Kaul S, Lin YS, Eichler A. (2000) Sensitive detection of micrometastases in bone
marrow from patients with breast cancer using immunomagnetic isolation of tumor cells in combination
with reverse transcriptase/polymerase chain reaction for cytokeratin-19. J Cancer Res Clin Oncol 126:
212–218.
229. Berois N, M. Varangot, B. Aizen. (2000) Molecular detection of cancer cells in bone marrow and
peripheral blood of patients with operable breast cancer: comparison of CK19, MUC1 and CEA using
RT-PCR. Eur J Cancer 36: 717–723.
230. De Cremoux, P., Extra, J. M., Denis, M. G., Pierga, J. Y., Bourstyn, E., Nos, C., Clough, K. B.,
Boudou, E., Martin, E. C., Muller, A., Pouillart, P., and Magdelenat, H. Detection of MUC1expressing mammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast cancer patients by real-time
polymerase chain reaction. Clin. Cancer Res., 6: 3117–3122, 2000.
231. Kahn HJ, Yang LY, Blondal J. (2000) RT-PCR amplification of CK19 mRNA in the blood of
breast cancer patients: correlation with established prognostic parameters. Breast Cancer Res Treat 60:
143–151.
232. Fabisiewicz A, Kulik J, Kober P. (2004) Detection of circulating breast cancer cells in peripheral
blood by a twomarker reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Acta Biochim Pol 51: 747–
755.
233. Benoy IH, Elst H, Philips M, Wuyts H. (2006) Real-time RT-PCR detection of disseminated
tumour cells in bone marrow has superior prognostic significance in comparison with circulating tumour
cells in patients with breast cancer. Br J Cancer 94: 672–680.
234. Janku F, Kleibl Z, Novotny J. (2004) Mammaglobin A, a novel marker of minimal residual disease
in early stages breast cancer. Neoplasma 51: 204–208.
235. Stathopoulou A, Anna Gizi, Maria Perraki. (2003) Real-time quantification of CK-19 mRNApositive cells in peripheral blood of breast cancer patients using the lightcycler system. Clin Cancer Res
9: 5145–5151.
236. Han JH, Kang Y, Shin HC. (2003) Mammaglobin expression in lymph nodes is an important
marker of metastatic breast carcinoma. Arch Pathol Lab Med 127: 1330–1334.
114
237. Silva JM, Gemma Dominguez, Javier Silva. (2001) Detection of epithelial messenger RNA in the
plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics. Clin Cancer Res
7: 2821–2825.
238. Zach O, Kasparu H, Wagner H. (2002) Prognostic value of tumour cell detection in peripheral
blood of breast cancer patients. Acta Med Austriaca 29 (Suppl 59): S32–S34.
239. Lin YC, Chen SC, Hsueh S. (2003) Lack of correlation between expression of human
mammaglobin mRNA in peripheral blood and known prognostic factors for breast cancer patients.
Cancer Sci 94: 99–102.
240. Ooka M, Yasuhiro Tamaki, Isao Sakita. (2001) Bone marrow micrometastases detected by RTPCR for mammaglobin can be an alternative prognostic factor of breast cancer. Breast Cancer Res Treat
67: 169–175.
241. Aihara T, Fujiwara, Y. Miyake. (2000) Mammaglobin B gene as a novel marker for lymph node
micrometastasis in patients with abdominal cancers. Cancer Lett 150: 79–84.
242. Cerveira N Y, Lurdes Torres, Patrícia Rocha. (2004) Highly sensitive detection of the MGB1
transcript (mammaglobin) in the peripheral blood of breast cancer patients. Int J Cancer 108: 592–595.
243. Marchetti A. Buttitta F. Bertacca G. (2001) mRNA markers of breast cancer nodal metastases:
comparison between mammaglobin and carcinoembryonic antigen in 248 patients. J Pathol 195: 186–
190.
244. Pierga JY, Bonneton C, Magdelenat H, Vincent-Salomon A, Nos C, Boudou E, Pouillart P,
Thiery JP, de Cremoux P: Real-time quantitative PCR determination of urokinase-type plasminogen
activator receptor (uPAR) expression of isolated micrometastatic cells from bone marrow of breast cancer
patients. Int J Cancer 2005, 114:291-298.
245. Braun S, Vogl FD, Naume B, Janni W, Osborne M, Coombes RC, Schlimok G, Diel I, Gerber
B, Gebauer G, Pierga J-Y, Marth C, Oruzio D, Wiedswang G, Solomayer E-F, Kundt G, Strobl B,
Fehm T, Wong GYC, Bliss J, Vincent-Salomon A, Pantel K: International pooled analysis of
prognostic significance of bone marrow micrometastasis in patients with stage I, II, or III breast cancer. N
Engl J Med 2005, 353:793-802.
246. Pantel K, Schlimok G, Angstwurm M, Weckermann D, Schmaus W, Gath H, Passlick B,
Izbicki JR, Riethmuller G: Methodological analysis of immunocytochemical screening for disseminated
epithelial tumor cells in bone marrow. J Hematother 1994, 3: 165-173.
247. Borgen E, Naume B, Nesland JM, Kvalheim G, Beiske K, Fodstad O, Diel I, Solomayer E,
Theocharous P, Coombes RC, Smith B, Wunder E, Marolleau J-P, Garcia J, Pantel K:
Standardization of the immunocytochemical detection of cancer cells in BM and blood: I. establishment
of objecive criteria for the evaluation of immunostained cells. Cytometry 1999, 1:377-388.
115
248. Fehm T, Braun S, Müller V, Janni W, Marth C, Pantel K, Schindlbeck C, Solomayer E: A
concept for the standardized detection of disseminated tumor cells in bone marrow of patients with
primary breast cancer and its clinical implementation. Cancer 2006, 107:885-892.
249. Dismal Project [http://www.dismal-project.eu/]
250. Zach O, Lutz D: Tumor cell detection in peripheral blood and bone marrow. Curr Opin Oncol 2006,
18:48-56.
251. Paterlini-Brechot P, Benali NL: Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and
future directions. Cancer Lett 2007, 18:180-204.
252. Pinzani P, Salvadori B, Simi L, Bianchi S, Distante V, Cataliotti L, Pazzagli M, Orlando C:
Isolation by size of epithelial tumor cells in peripheral blood of patients with breast cancer: correlation
with real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction results and feasibility of molecular analysis
by laser microdissection. Hum Pathol 2006, 37:711-718.
253. Wong NS, Kahn HJ, Zhang L, Oldfield S, Yang LY, Marks A, Trudeau ME: Prognostic
significance of circulating tumour cells enumerated after filtration enrichment in early and metastatic
breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2006, 99:63-69.
254. Rosenberg R, Gertler R, Friederichs J, Fuehrer K, Dahm M, Phelps R, Thorban S, Nekarda
H, Siewert JR: Comparison of two density Gradient centrifugation systems for the enrichment of
disseminated tumor cells in blood. Cytometry 2002, 49:150-158.
255. Witzig TE, Bossy B, Kimlinger T, Roche PC, Ingle JN, Grant C, Donohue J, Suman VJ,
Harrington D, Torre-Bueno J, Bauer KD: Detection of circulating cytokeratin-positive cells in the
blood of breast cancer patients using immunomagnetic enrichment and digital microscopy. Clin Cancer
Res 2002, 8:1085-1091.
256. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R, Kvalheim G, Nesland JM, Qvist H, Schlichting E, Sauer
T, Janbu J, Harbitz T, Naume B: Detection of isolated tumor cells in bone marrow is an independent
prognostic factor in breast cancer. J Clin Oncol 2003, 21:3469-3478.
257. Woelfle U, Breit E, Zafrakas K, Otte M, Schubert F, Muller V, Izbicki JR, Loning T, Pantel K:
Bi-specific immunomagnetic enrichment of micrometastatic tumour cell clusters from bone marrow of
cancer patients. J Immunol Methods 2005, 300:136-145.
258. Kraeft SK, Ladanyi A, Galiger K, Herlitz A, Sher AC, Bergsrud DE, Even G, Brunelle S,
Harris L, Salgia R, Dahl T, Kesterson J, Chen LB: Reliable and sensitive identification of occult
tumor cells using the improved rare event imaging system. Clin Cancer Res 2004, 10:3020-3028.
259. Borgen E, Naume B, Nesland JM, Nowels KW, Pavlak N, Ravkin I, Goldbard S: Use of
automated microscopy for the detection of disseminated tumor cells in bone marrow samples. Cytometry
2001, 46:215-221.
116
260. Kraeft SK, Sutherland R, Gravelin L, Hu GH, Ferland LH, Richardson P, Elias A, Chen LB:
Detection and analysis of cancer cells in blood and bone marrow using a rare event imaging system. Clin
Cancer Res 2000, 6:434-442.
261. Bauer KD, de la Torre-Bueno J, Diel IJ, Hawes D, Decker WJ, Priddy C, Bossy B, Ludmann S,
Yamamoto K, Masih AS, Espinoza FP, Harrington DS: Reliable and sensitive analysis of occult bone
marrow metastases using automated cellular imaging. Clin Cancer Res 2000, 6:3552-3559.
262. Mehes G, Luegmayr A, Ambros IM, Ladenstein R, Ambros PF: Combined automatic
immunological and molecular cytogenetic analysis allows exact identification and quantification of tumor
cells in the bone marrow. Clin Cancer Res 2001, 7: 1969-1975.
263. M. Cristofanilli MD. Slade MJ, Singh A, Smith BM. (2005) Persistence of bone marrow
micrometastases in patients receiving adjuvant therapy for breast cancer: results at 4 years. Int J Cancer
114: 94–100.
264. Stephan Braun, B. Semeni Cevatli, Cyamak Assemi. (2001) Comparative analysis of
micrometastasis to the bone marrow and lymph nodes of node-negative breast cancer patients receiving
no adjuvant therapy. J Clin Oncol 19: 1468–1475.
265. Braun S and Pantel K (2001) Clinical significance of occult metastatic cells in bone marrow of
breast cancer patients. Oncologist 6: 125–132.
266. Naume Bjørn, Gro Wiedswang, Elin Borgen. (2004) The prognostic value of isolated tumor cells
in bone marrow in breast cancer patients: evaluation of morphological categories and the number of
clinically significant cells. Clin Cancer Res 10: 3091–3097.
267. Borgen E, Naume B, Nesland JM. Standardization of the immunocytochemical detection of cancer
cells in BM and blood: I. establishment of objecive criteria for the evaluation of immunostained cells.
Cytometry 1999; 1:377–388.
268. Zieglschmid V, Hollmann C & Bo¨cher O 2005 Detection of disseminated tumor cells in
peripheral blood. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 42 155–196.
269. Marc Lacroix Significance, detection and markers of disseminated breast cancer cells. EndocrineRelated Cancer 13 (4) 1033 -1067 2006 DOI: 10.1677/ERC-06-0001.
270. Symmans WF, Liu J, Knowles DM, Inghirami G: Breast cancer heterogeneity: evaluation of
clonality in primary and metastatic lesions. Hum Pathol 1995, 26:210-216.
271. Braun S, Hepp F, Sommer HL, Pantel K: Tumor-antigen heterogeneity of disseminated breast
cancer cells: implications for immunotherapy of minimal residual disease. Int J Cancer 1999, 84:1-5.
272. Stathopoulou A, Ntoulia M, Perraki M. A highly specific real-time RTPCR method for the
quantitative determination of CK-19 mRNA positive cells in peripheral blood of patients with operable
breast cancer. Int J Cancer 2006.
117
273. Xenidis N, Perraki M, Kafousi M. Predictive and prognostic value of peripheral blood cytokeratin19 mRNA-positive cells detected by real-time polymerase chain reaction in node-negative breast cancer
patients. J Clin Oncol 2006; 24:3756–3762.
274. Zippelius A, Kufer P, Honold G, Kollermann MW, Oberneder R, Schlimok G, Riethmuller G,
Pantel K: Limitations of reversetranscriptase polymerase chain reaction analyses for detection of
micrometastatic epithelial cancer cells in bone marrow. J Clin Oncol 1997, 15:2701-2708.
275. Bostick PJ, Chatterjee S, Chi DD, Huynh KT, Giuliano AE, Cote R, Hoon DS: Limitations of
specific reverse-transcriptase polymerase chain reaction markers in the detection of metastases in the
lymph nodes and blood of breast cancer patients. J Clin Oncol 1998, 16:2632-2640.
276. Jung R, Kruger W, Hosch S, Holweg M, Kroger N, Gutensohn K, Wagener C, Neumaier M,
Zander AR: Specificity of reverse transcriptase polymerase chain reaction assays designed for the
detection of circulating cancer cells is influenced by cytokines in vivo and in vitro. Br J Cancer 1998,
78:1194-1198.
277. Lankiewicz S, Rivero BG, Bocher O: Quantitative real-time RTPCR of disseminated tumor cells in
combination with immunomagnetic cell enrichment. Mol Biotechnol 2006, 34: 15-27.
278. Sidransky D Nucleic acid-based methods for the detection of cancer. Science 7 November 1997:
Vol. 278. no. 5340, pp. 1054 – 1058.
279. Cross NC, Feng L, Chase A, Bungey J. (1993) Competitive polymerase chain reaction to estimate
the number of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients after bone marrow
transplantation. Blood 82: 1929–1936.
280. Ghossein RA and Rosai J (1996) Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases
and circulating tumor cells. Cancer 78: 10–16.
281. Schoenfeld A, Luqmani, H.O. Sinnett. (1996) Keratin 19 mRNA measurement to detect
micrometastases in lymph nodes in breast cancer patients. Br J Cancer 74: 1639–1642.
282. Smith BM, Martin J. Slade, Jacqueline English. (2000) Response of circulating tumor cells to
systemic therapy in patients with metastatic breast cancer: comparison of quantitative polymerase chain
reaction and immunocytochemical techniques. J Clin Oncol 18: 1432–1439.
283. Pantel K, Alix-Panabieres C: The clinical significance of circulating tumor cells. Nat Clin Pract
Oncol 2007, 4:62-63.
284. Czerkinsky C, Moldoveanu Z, Mestecky J, Nilsson L, Ouchterlony O: A novel two colour
ELISPOT assay. I. Simultaneous detection of distinct types of antibody-secreting cells. J Immunol
Methods 1988, 115:31-37.
118
285. Alix-Panabières C, Vendrell J-P, Pellé O, Riethdorf S, Müller V, Fabbro M, Pantel K:
Detection and characterization of putative metastatic precursor cells in cancer patients. Clin Chem 2007,
53:537-539.
286. Gross HJ, Verwer B, Houck D, Hoffman RA, Recketenwald D. Model study detecting breast
cancer cells in peripheral blood mononuclear cells at frequencies as low as 10-7. Proc Natl Acad Sci USA
1995;92:537–541.
287. Clevenger, C. V., Khandewal, M., Stadtmauer, E., and Jardines, L. Detection of bone marrow
breast carcinoma metastasis using multiparameter flow cytometry. Ann. NY Acad. Sci., 677: 400–401,
1993.
288. Ryan, D., Mitchell, S. J., Hennessey, L. A., Bauer, K. D., Horan, P. K., and Cohen, H. J.
Improved detection of rare CALLA-positive cells in peripheral blood using multiparameter flow
cytometry. J. Immunol. Methods, 74: 115–128, 1984.
289. Leslie DS, Johnston WW, Daly L, et al. Detection of breast carcinoma cells in human bone
marrow using fluorescent-activated cell sorting and conventional cytology. Am J Clin Pathol 1990;94:8–
13.
290. Leers MPG, Schoffelen RHMG, Hoop JGM, et al. Multiparameter flow cytometry as a tool for
the detection of micrometastatic tumour cells in the sentinel lymph node procedure of patients with breast
cancer. J Clin Pathol 2002;55:359–366.
291. De Luca, A., Pignata, S., Casamassimi, A., D’Antonio, A., Gridelli, C., Rossi, A., Cremona, F.,
Parisi, V., De Matteis, A., and Normanno, N. Detection of circulating tumor cells in carcinoma patients
by a novel epidermal growth factor receptor reverse transcription-PCR assay. Clin. Cancer Res., 6: 1439–
1444, 2000.
292. Racila, E., Euhus, D., Weiss, A. J., Rao, C., McConnell, J., Terstappen, L. W., and Uhr, J. W.
Detection and characterization of carcinoma cells in the blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4589–
4594, 1998.
293. Molino A, Colombatti M, Bonetti F, Zardini M, Pasini F, Perini A, et al. A comparative analysis
of three different techniques for the detection of breast cancer cells in bone marrow. Cancer
1991;67:1033–6.
294. Wingren S, Guerrieri C, Franlund B, Stal O. Loss of cytokeratins in breast cancer cells using
multiparameter DNA flow cytometry is related to both cellular factors and preparation procedure. Anal
Cell Pathol 1995;9: 229–33.
295. Vredenburgh JJ, Silva O, Tyer C, DeSombre K, Abou-Ghalia A, Cook M, et al. A comparison
of immunohistochemistry, two-color immunofluorescence, and flow cytometry with cell sorting for the
detection of micrometastatic breast cancer in the bone marrow. J Hematother 1996;5:57–62.
296. Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of
hematologic malignancy. Blood 1997;90:2863–92.
119
297. Ciudad J, San Miguel JF, Lopez-Berges MC, Vidriales B, Valverde B, Ocqueteau M, et al.
Prognostic value of immunophenotypic detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic
leukemia. J Clin Oncol 1998;16:3774–81.
298. Simpson SJ, Vachula M, Kennedy MJ, Kaizer H, Coon JS, Ghalie R, et al. Detection of tumor
cells in the bone marrow, peripheral blood, and apheresis products of breast cancer patients using flow
cytometry. Exp Hematol 1995;23:1062–8.
299. Neslihan Cabioglu, Aysegul Sahin, Michele Doucet, Ekrem Yavuz, Abdullah Igci, Engin O.
Yildirim, Esin Aktas, Sema Bilgic, Bayram Kiran, Gunnur Deniz & Janet E. Price Chemokine
receptor CXCR4 expression in breast cancer as a potential predictive marker of isolated tumor cells in
bone marrow. Clinical & Experimental Metastasis (2005) 22: 39–46.
300. Bajpai Manisha, Jianying Lıu, Xın Geng. Repeated exposure to acid and bile selectively induces
colonic phenotype expression in a heterogeneous Barrett's epithelial cell line. Lab Invest 88:64351(2008).WB;Human.
301. van Muijen GN, DJ Ruiter, WW Franke. Cell type heterogeneity of cytokeratin expression in
complex epithelia and carcinomas as demonstrated by monoclonal antibodies specific for cytokeratins
nos. 4 and 13. Exp Cell Res 162:97-113 (1986).
302. Malzahn K, Mitze M, Thoenes M, Moll R: Biological and prognostic significance of stratified
epithelial cytokeratins in infiltrating ductal breast carcinomas. Virchows Arch 1998, 433: 119-129.
303. Abd El-Rehim DM, Pinder SE, Paish CE, Bell J, Blamey RW, Robertson JFR, Nicholson RI,
Ellis IO: Expression of luminal and basal cytokeratins in human breast carcinoma. J Pathol 2004,
203:661-671.
304. Nagle RB, Bocker W, Davis JR, Heid HW, Kaufmann M, Lucas DO, Jarasch ED:
Characterization of breast carcinomas by two monoclonal antibodies distinguishing myoepithelial from
luminal epithelial cells. J Histochem Cytochem 1986, 34:869-881.
305. Boecker W, Moll R, Poremba C, et al. Common adult stem cells in the human breast give rise to
glandular and myoepithelial cell lineages: a new cell biological concept. Lab Invest 2002;82:737–745.
306. Moll R. Cytokeratins as markers of differentiation in the diagnosis of epithelial tumors. Subcell
Biochem 1998;31:205–262.
307. Jo BH, Kim HJ, Kim YJ, Park Y, Lee IK, Kim DI, Lee WH, Yoon SO. Expression of the
Markers for the Mammary Stem Cells and the Cellular Lineages of the Mammary Gland on Ductal
Carcinoma In Situ. J Breast Cancer. 2006 Sep;9(3):184-192. Korean.
308. Gerhard Schaller, Ilka Fuchs. Elevated keratin 18 protein expression indicates a favorable
prognosis in patients with breast cancer. Clinical Cancer Research 1996 Nov; vol 2, 1879-1885.
120
309. Helmut Bühler Gerhard Schaller Transfection of Keratin 18 Gene in Human Breast Cancer Cells
Causes Induction of Adhesion Proteins and Dramatic Regression of Malignancy In vitro and In vivo (Mol
Cancer Res 2005;3(7):365–71).
310. Maria Hagg Olofsson,Takayuki Ueno Cytokeratin-18 Is a Useful Serum Biomarker for Early
Determination of Response of Breast Carcinomas to Chemotherapy. Clin Cancer Res 2007;13(11) June 1,
2007.
311. Tsubura A, Senzaki H, Sasaki M. Immunohistochemical demonstration of breast-derived and/or
carcinoma-associated glycoproteins in normal skin appendages and their tumors. J Cutan Pathol 19:73-9
(1992).
312. Villadsen R, Fridriksdottir AJ, Ronnov-Jessen L. Evidence for a stem cell hierarchy in the adult
human breast. J Cell Biol 177:87-101 (2007).
313. de Graaf H, Maelandsmo GM, Ruud P, Forus A, Oyjord T, Fodstad O & Hovig E Ectopic
expression of target genes may represent an inherent limitation of RT-PCR assays used for
micrometastasis detection: studies on the epithelial glycoprotein gene EGP-2. International Journal of
Cancer 1997 - 72 191–196.
314. Braun S, Hepp F, Kentenich CR. Monoclonal antibody therapy with edrecolomab in breast cancer
patients: monitoring of elimination of disseminated cytokeratin-positive tumor cells in bone marrow. Clin
Cancer Res 1999;5:3999–4004.
315. Zhong XY, Kaul S, Eichler A & Bastert G Evaluating GA733-2 mRNA as a marker for the
detection of micrometastatic breast cancer in peripheral blood and bone marrow. Archives of Gynecology
and Obstetrics 1999 - 263 2–6.
316. Walid A. Osta, Yian Chen EpCAM Is Overexpressed in Breast Cancer and Is a Potential target for
Breast Cancer Gene Therapy. Cancer Research 64, 5818–5824, August 15, 2004.
317. Pirruccello SJ, LeBien TW. The human B-cell associated antigen CD24 is a single chain
sialoglycoprotein. J Immunol 1986; 136:3779-3784.
318. Fischer GF, Majdic O, Gadd S, Knapp W. Signal transduction in lymphocytic and myeloid cells
via CD24 a new member of phosphoinositol-anchored membrane molecules. J Immunol 1990;144:638641.
319. Akashi T, Shirasawa T, Hirokawa K. Gene expression of CD24 core polypeptide molecule in
normal rat tissues and human tumor cell lines. Virchows Arch 1994; 425:399-406.
320. Goldsby RA, KindtTJ, Osborne BA. CDantigens. In: Kuby Immunology. 4th ed. NewYork:W.H.
Freeman and Company; 2000. p. 593^607.
121
321. Marija Balic, Henry Lin. Most Early Disseminated Cancer Cells Detected in Bone Marrow of
Breast Cancer Patients Have a Putative Breast Cancer Stem Cell Phenotype Clin Cancer Res 2006;5615
12(19) October 1, 2006.
322. Jackson D,Waibel R,Weber E, Bell J, Stahel RA. CD24, a signal-transducing molecule expressed
on human B cells, is a major surface antigen on small cell lung carcinomas. Cancer Res
1992;52:5264^70.
323. Kristiansen G, Schluns K, Yongwei Y, Denkert C, Dietel M, Petersen I. CD24 is an independent
prognostic marker of survival in nonsmall cell lung cancer patients. BrJCancer 2003;88:231^6.
324. Goodison S, Urquidi V,Tarin D. CD44 cell adhesion molecules. Mol Pathol 1999;52:189^96.
325. Lionel Hebbard, Anja Steffen. CD44 expression and regulation during mammary gland
development and function. Journal of Cell Science 113, 2619-2630 (2000)
326. Kirchberger S, O. Majdic, S. Bluml, C. Schrauf, J. Leitner. The cytoplasmic tail of CD45 is
released from activated phagocytes and can act as an inhibitory messenger for T cells. Blood : (2008).
327. Bazil V, Ivan Hilgert, Hana Kristofova. Sialic acid-dependent epitopes of CD45 molecules of
restricted cellular expression. Immunogenetics 29:202-5 (1989).
328. Wicha MS. Cancer stem cells and metastasis: lethal seeds. Clin Cancer Res 2006;12:5606–7.
329. Vaidya JS. An alternative model of cancer cell growth and metastasis. Int J Surg 2007;5:73–5.
330. Brabletz T, Jung A, Spaderna S. Opinion: migrating cancer stem cells—an integrated concept of
malignant tumour progression. Nat Rev Cancer 2005;5:744–9.
331. Hill A, McFarlane S, Mulligan K. Cortactin underpins CD44-promoted invasion and adhesion of
breast cancer cells to bone marrow endothelial cells. Oncogene 2006;25:6079–91.
332. Sheridan C, Kishimoto H, Fuchs RK. CD44+/CD242 breast cancer cells exhibit enhanced invasive
properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Res 2006;8:R59.F.
333. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF: Prospective
identification of tumourigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100:3983-3988.
334. Matthew Smalley and Alan Ashworth. Stem cells and breast cancer: a fıeld ın transıt november
2003 | volume 3 www.nature.com/reviews/cancer.
335. Ellis M, Hayes DF, Lippman ME. Treatment of metastatic disease. In: Harris J, Lippman M,
Morrow M, et al., eds. Diseases of the breast. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven, 2004:1101-59.
122
336. Ashworth TR. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood
after death. Australian Med J 1869;14:146.
337. Carey RW, Taft PD, Bennett JM, Kaufman S. Carcinocythemia (carcinoma cell leukemia): an
acute leukemia-like picture due to metastatic carcinoma cells. Am J Med 1976;60:273-8.
338. Engell HC. Cancer cells in the circulating blood: a clinical study on the occurrence of cancer cells in
the peripheral blood and in venous blood draining the tumour area at operation. Acta Chir Scand Suppl
1955;201: 1-70.
339. Myerowitz RL, Edwards PA, Sartiano GP. Carcinocythemia (carcinoma cell leukemia) due to
metastatic carcinoma of the breast: report of a case. Cancer 1977;40:3107-11.
340. Gallivan MV, Lokich JJ. Carcinocythemia (carcinoma cell leukemia): report of two cases with
English literature review. Cancer 1984;53:1100-2.
341. Sile CC, Perry DJ, Nam L. Small cell carcinocythemia. Arch Pathol Lab Med 1999; 123:426-8.
342. Rodriguez-Salas N, Jimenez-Gordo AM, Gonzalez E. Circulating cancer cells in peripheral blood:
a case report. Acta Cytol 2000;44:237-41.
343. Seronie-Vivien S, Mery E, Delord JP. Carcinocythemia as the single extension of breast cancer:
report of a case and review of the literature. Ann Oncol 2001;12:1019-22.
344. Yam LT, Janckila AJ. Immunocytodiagnosis of carcinocythemia in disseminated breast cancer.
Acta Cytol 1987;31:68-72.
345. Karine Jacob; Caroline Sollier; Nada Jabado. Circulating Tumor Cells: Detection, Molecular
Profiling and Future Prospects. Expert Rev Proteomics. 2007;4(6):741-756. © 2007 Future Drugs Ltd.
346. Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in
metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351(8), 781–791 (2004).
347. Kang Y, Massague J. Epithelial–mesenchymal transitions: twist in development and metastasis.
Cell 118(3), 277–279 (2004).
348. Mansi JL, Gogas H, Bliss JM. Outcome of primary-breast-cancer patients with micrometastases: a
long-term follow-up study. Lancet 354(9174), 197–202 (1999).
349. Iakovlev VV, Goswami RS, Vecchiarelli J, Arneson NC, Done SJ. Quantitative detection of
circulating epithelial cells by Q-RT-PCR. Breast Cancer Res. Treat. 107(1), 145–154 (2007).
123
350. Schmidt-Kittler O, Ragg T, Daskalakis A. From latent disseminated cells to overt metastasis:
genetic analysis of systemic breast cancer progression. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100(13), 7737–7742
(2003).
351. Hayes DF, Cristofanilli M, Budd GT. Circulating tumor cells at each follow-up time point during
therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer
Res. 12(14 Pt 1), 4218–4224 (2006).
352. Wulfing P, Borchard J, Buerger H. HER2-positive circulating tumor cells indicate poor clinical
outcome in stage I to III breast cancer patients. Clin. Cancer Res. 12(6), 1715–1720 (2006).
353. Ulmer A, Schmidt-Kittler O, Fischer J. Immunomagnetic enrichment, genomic characterization,
and prognostic impact of circulating melanoma cells. Clin. Cancer Res. 10(2), 531–537 (2004).
354. Moreno JG, Miller MC, Gross S. Circulating tumor cells predict survival in patients with
metastatic prostate cancer. Urology 65(4), 713–718 (2005).
355. Bozionellou V, Mavroudis D, Perraki M. Trastuzumab administration can effectively target
chemotherapy-resistant cytokeratin-19 messenger RNA-positive tumor cells in the peripheral blood and
bone marrow of patients with breast cancer. Clin. Cancer Res. 10(24), 8185–8194 (2004).
356. Oscar B. Goodman, Jr., Louis M. Fink, James T. Symanowski. Circulating Tumor Cells in
Patients with Castration-Resistant Prostate Cancer Baseline Values and Correlation with Prognostic
Factors. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 18, 1904, June 1, 2009.
357. Gerald C. O’Sullivan, J. Kevin Collns. Micrometastases in bone marrow of patients undergoing
curative surgery for gastrointestinal cancer. Gastroenterology 1995;109: 1535-1540.
358. Bidard, F., Vincent-Salomon, A., Sigal-Zafrani, B., et al. Prognosis of women with Stage IV
breast cancer depends on detection of circulating tumor cells rather than disseminated tumor cells. Annals
of Oncology. 2008. 19(3): 496-500.
359. Naume B, Borgen E, Kvalheim G, et al. Detection of isolated tumor cells in bone marrow in earlystage breast carcinoma patients: comparison with preoperative clinical parameters and primary tumor
characteristics. Clin Cancer Res 2001;7:4122–29.
360. William L. Donegan, MD Tumor-Related Prognostic Factors for Breast Cancer CA Cancer J Clin
1997;47:28-51.
361. N. Özdemir, Y.Erhan, O.Zekioğlu. Duktal Hiperplazi, Karsinoma İn Situ ve İnvaziv Meme
Kanserlerinde ER, PR, Kİ-67, P53 ve HER-2/NEU’nin önemi. Türkiye Ekopatoloji Dergisi 2000;6(34):131-141.
362. Bijker N, Peterse JL, Duchateau L, et al. Risk factors for recurrence and metastasis after breastconserving therapy for ductal carcinomain-situ: analysis of European Organization for Research and
Treatment of Cancer Trial 10853. J Clin Oncol 2001;19:2263–71.
124
363. Jeanne J. Yu, MD,* Meghan Brennan, RN, ONP. Bone Marrow Micrometastases and Adjuvant
Treatment of Breast Cancer The Breast Journal, Volume 10, Number 3, 2004 181–185.
364. D.Magire, G.C. O’Sullivan, B. McNamara. Bone marrow micrometastases in patient with brain
metastases from epithelial cell tumours. Q J Med 2000; 93:611-615.
365. Laroche, Vincent; McKenna, David H.; Moroff, Gary; Schierman, Therese; Kadidlo, Diane;
McCullough, Jeffrey Cell loss and recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of
postthaw and postwash samples. Transfusion. 45(12):1909-1916, December 2005.
366. Elgio K, Clausen OP. Mouse epidermal cell proliferation after a single application of dimethyl
sulphoxide (DMSO). Cell Tissue Kinet. 1983 Jul;16(4):343-9.
367. Karl G. Blume, Stephen J. Forman, Frederick R. Appelbaum Thomas' hematopoietic cell
transplantation. 4th edition.
368. Emens LA, Reilly RT & Jaffee EM Breast Cancer vaccines: maximizing cancer treatment by
tapping into host immunity. Endocrine-Related Cancer 2005 12 1–17.
369. Suat Kutun, Alper Çelik, Olga Koçkar, Abdullah Çetin Outcomes of bone marrow
micrometastases in breast carcinoma Cumhuriyet Tıp Derg 2009; 31: 52-59.
125
ÖZGEÇMİŞ
Adı-Soyadı
: Mustafa Salih AKIN
Doğum Tarihi ve Yeri
: 02 / 05 / 1976 – Turhal/TOKAT
Medeni Durumu
: Evli
Adres
: Kurttepe Mahallesi Arıkök Apt. Kat 8 Daire 16
Çukurova/ADANA
Telefon
: 0-505-7185221
e-mail
: salihakinmd@gmail.com
Mezuniyet
: Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mezuniyet Yılı
:1999
Yabancı Diller
: İngilizce
126
Download