APOPTOSİS

APOPTOZİS BİYOKİMYASI
Sağlık Slaytları
http://hastaneciyiz.blogspot.com
Jacobson et al., Cell 88:347 (1997)
Nekroz ve apoptozis
-Yol açan nedenler
•
•
•
•
•
Nekroz
İskemi
Hipertermi
Hipoksi
Litik viral enfeksiyon
Toksik maddelerin
yüksek
konsantrasyonları
• Şiddetli oksidatif stress
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Apoptozis
Büyüme faktörü eksikliği
Hücre yaşlanması
HIV
Kanser ilaçları
Radyasyon
Yüksek doz glukokortikoid
Fas veya TNFR-1 res. akt.
Sitotoksik T lenfositler
Çok şiddetli olmayan
oksidatif stress
Nekroz ve apoptozis
-Morfolojik özellikler
•
•
•
•
•
•
•
Nekroz
Hücre membranı
bütünlüğünün kaybı
Kromatin flokülasyonu
Hücre şişmesi
Organellerin
disintegrasyonu
Endoplazmik
retikulumun dilatasyonu
Büyük vakuollerin
oluşumu
Hücre lizisi
•
•
•
•
•
Apoptozis
İntakt hücre membranı fakat
membranda “bleb” oluşumu
Kromatinin nükleer membran
civarında toplanması ve
yoğunlaşması
Hücre küçülmesi
Organellerde disintegrasyon
yok
Hücrenin intakt mitokondri,
ribozom, nukleus parçaları ve
diğer organelleri içeren
membranla kaplı apoptotik
cisimciklere parçalanması
Nekroz ve apoptozis
-Biyokimyasal özellikler
•
•
•
•
•
Nekroz
Bozulmuş iyon hemostazisi
ATP gerekmez (pasif süreç)
+4 oC’de gerçekleşebilir
DNA rastgele parçalanır
(agaroz jel elektroforezinde
“smear” görüntüsü)
Postlitik DNA fragmentasyonu
(=ölümün geç safhasında)
•
•
•
•
•
Apoptozis
İyi kontrollu, bazı aktivasyonların
ve enzimatik basamakların
olması
ATP gereklidir (aktif süreç)
+4 oC’de gerçekleşmez.
DNA internukleozomal alanlarda
180 kb çiftinin katları olacak
şekilde kırılır mono ve
oligonukleozomlara ayrılır
(agaroz jel elektroforezinde
merdiven patterni=apoptozisin
en önemli belirteci)
Prelitik DNA fragmantasyonu
(=erken evrede gerçekleşir)
Nekroz ve apoptozis
-Diğer özellikler
•
•
•
•
Nekroz
Hücreler gruplar halinde ölür
Fizyolojik olmayan (patolojik)
etkiler sonucu gerçekleşir
Lizozomal enzimler salınır
İnflamasyona neden olur
•
•
•
•
Apoptozis
Hücreler tek tek veya birkaçı bir
arada ölür
Fizyolojik şartlarda da
gerçekleşebilir
Komşu hücreler veya makrofajlar
tarafından fagosite edilirler
İnflamasyon görülmez
İntiharla Ölüm
Hücreler intihar kararı ile şunlara neden olur:
• Küçülme olur
• Sitokrom c salınımı ile mitokondrileri yıkılır
• Yüzeylerinde kabarcık benzeri çıkıntılar gelişir
• Nükleusları yıkıldığında kromatin (DNA ve protein)
ortaya çıkar
• Küçük, membran katlantılı, fragmanlara yıkılır
• Normalde plazma membranına yerleşik olan fosfolipid
fosfatidilserin, yüzeye çıkar.
• Bu makrofaj gibi fagositik hücreler ve dendritik hücreler
üzerindeki reseptörlere bağlanmakta ve daha sonra hücre
fragmanlarını yutmaktadır.
• Fagositik hücreler inflamasyonu inhibe eden sitokinleri
salgılar.
• İntiharla ölümdeki sonuçların dizisi öyle düzenlidir ki bu
işleme programlanmış hücre ölümü (PHÖ) denilmektedir.
• Programlanmış hücre ölümünün hücresel mekanizması
mitozisin tersine çevrilmesi gibidir.
• Programlanmış hücre ölümü apoptozis olarak
adlandırılmaktadır.
Apoptozisin tanımı
• Zararlı hücrelerin kendilerini öldürdükleri bir yöntem
• “hücre intiharı”
• Kanser apoptozis aktivitesinin olmamasının sonucudur.
Tümörler kendilerini kurban etmekten sakınarak kansere
yol açar. Böylece zararlı hücrelerin yapısında apoptozis
ortaya çıkmaz.
Hücre intiharı nedenleri
İki farklı neden vardır:
1. Programlanmış hücre ölümü mitozisdeki gibi normal
gelişme için gereklidir.
2. Programlanmış hücre ölümü organizmanın bütünlüğüne
karşı bir tehdit oluşturan hücreleri yıkmak için gereklidir.
Normal gelişmede PHÖ
•
•
•
•
Örnekler:
İribaşın bir kurbağaya metamorfozu sırasında
kuyruğunun rezorpsiyonu apoptozis ile oluşur.
Fetusun parmak ve ayak parmaklarının
biçimlenmesi aralarındaki dokunun apoptozis ile
ayrılmasını gerektirir.
Uterusun iç katının (endometrium) menstruasyonun
başlangıcında dökülmesi apoptozis ile oluşur.
Beyinde nöronlar arasında uygun bağlantıların
(sinapslar) biçimlenmesi artakalan hücrelerin
apoptozis ile eliminasyonunu gerektirir.
Tehdit oluşan PHÖ
Örnekler:
• Virüslerle enfekte hücreler: sitotoksik T-lenfositler
aracılığıyla virus ile enfekte hücrelerin ortadan kaldırılması
apoptozis ile uyarılır.
• İmmun sistem hücreleri:
• DNA hasarlı hücreler: p53 güçlü bir apoptozis uyarıcısıdır.
• Kanser hücreleri: Radyasyon ve kemoterapi tedavisi
apoptozisi uyarır.
Hücrenin intihara karar vermesi
Yaşam ömrünün sürdürülmesi için gerekli
• pozitif sinyallerin azalması,
• negatif sinyallerin alınması,
arasındaki dengenin bozulması.
Pozitif sinyallerin azalması
Çok sayıda hücrenin sürdürülen yaşam ömrü, diğer
hücrelerden sürekli uyarımlar almasını gerektirir.
Bazı pozitif sinyal örnekleri:
• Nöronlar için growth (büyüme) faktörleri
• Lenfositlerin mitozu için esansiyel faktör olan Interleukin2 (IL-2).
Negatif sinyallerin alınması
• Hücre içinde artmış oksidanların düzeyi,
• Bu oksidanlar ve diğer ajanların DNA’ya verdikleri hasar,
Bunlar:
-
-
Ultraviyole ışık
x-ray ışını
Kemoterapötik ilaçlar
Moleküller hücre yüzeyindeki spesifik reseptörleri bağlar ve
apoptozis programını başlatmak için hücreye sinyal verir.
Bu ölüm aktivatörleri:
• Tümör nekrozis faktör - alfa ("TNF") TNF reseptörüne
bağlanır.
• Lenfotoksin (tümör nekrozis faktör – beta olarak ta bilinir)
de TNF reseptörüne bağlanır.
• Fas ligand (FasL), Fas adlı bir hücre-yüzey reseptörüne
bağlanan bir moleküldür. (CD95 olarak ta bilinir)
Apoptozis Mekanizması
Bir hücrenin apoptozisle intihar kararı vermesi için iki
mekanizma vardır.
• Biri hücre içinden gelen sinyallerle meydana gelme.
• Diğeri hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanan ölüm
aktivatörleriyle başlatılma.
• TNF
• Lenfotoksin
• Fas ligand (FasL)
Apoptozisin modülatör (mediatör) leri
•
•
•
•
•
Bazı iyonlar (kalsiyum),
Moleküller (seramid),
Genler (c-myc),
Proteinler (p53)
Organeller (mitokondri)
Apoptozis nasıl çalışır?
• Apoptozis kimyasal sinyallere karşı yanıtta yer alır.
Hücreler parçalara ayrılır ve bu parçalar paketlenir.
Makrofajlar paketleri yutar ve onları yıkar.
• Aşağıdaki proteinler apoptoziste yer almaktadır:
• ICE-benzeri proteinler
• FAS
• FAS ligand
• BCL-2
• p53
ICE-benzer proteinler
• ICE = Interleukin-Converting Enzyme (İnterlökinDönüştürücü Enzim) apoptozis mediatörü
• BCL-2 aşırı üretimi ICE-benzer proteaz aktivasyonunu
inhibe eder.
• İntrasellüler asidifikasyon direk ya da indirek yolla ICEbenzer proteazları aktive ederek apoptozisi başlatır.
• Tüm apoptotik yollar p53-aracılı transkripsiyon akışı ve
ICE-benzer proteazların aktivasyonu ile ilişkilidir.
FAS ve FAS ligand
• FAS ve FAS ligand tümör nekrozis ailesinin transmembran
proteinleridir.
• FAS ligand FAS’a bağlandığında hedef hücrenin ölüm
olgusunu başlatır.
• FAS/FAS ligand sistemi immün yanıtın sonlandırılmasında
da önemli bir rol oynar.
• Tümör hücreleri FAS ekspresyonunun azaltılmasıyla ile
FAS-aracılı apoptozise direnç kazanabilir
• Onkogenler ve p53 gibi tümör supresör genlerdeki
mutasyonlar FAS sinyal işlemiyle de interfere olur.
• FAS-aracılı apoptozis ICE ailesinde yer alan bir sistein
proteaz sınıfının aktivasyonunu gerektirir.
Bcl-2 ailesi
• Bir kısmının apoptozisi indüklediği (Bax, Bad, Bid, BclXs),
• Bir kısmının ise inhibe ettiği (Bcl-2, Bcl-Xl) geniş bir
ailedir.
• Bu ailenin üyeleri kendi aralarında homo veya heterodimerler oluştururlar.
• Hücrenin yaşayabilirlik durumu (“survival”ı) bu ailenin
pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyelerinin rölatif oranına
bağlıdır.
• Bu heterodimerlerden biri olan Bcl-2/Bax’ın (ikisinin
oranının) bazı hematolojik malignensilerde prognostik
değer taşıdığı gösterilmiştir.
An Evil Twin: BAX
BAX Activation Death
p53
• p53 kromozom 17 üzerinde haritalanmış olan bir tümör
supresör genidir, aktivitesi tümör oluşumunu durdurur.
• Bir bireyin kansere eğiliminin olması için ebeveynlerinden
bir fonksiyonel gen kopyası kalıtımına ihtiyacı vardır.
• p53’teki mutasyonlar çoğu tümör tipinde bulunmaktadır.
• Hücrede, p53 proteini DNA’yı bağlar.
 başka bir gen ürünü olan p21 proteinini stimule eder
 p21 hücre bölünmesini uyaran protein, cdk2 ile etkileşir
 p21, cdk2 ile kompleks oluşturduğunda hücre,
hücre bölünmesinin yeni basamağına geçemez.
• Mutasyona uğramış p53 DNA’ya etkin bir yolla daha uzun
süre bağlanamaz.
 böylece, p21protein hücre bölünmesi için stop sinyali
olarak etki yapamaz
 hücreler daha sonra kontrolsüz olarak bölünür ve
tümörler oluşur.
Apoptozisin internal sinyallerle başlatılması
• Sağlıklı hücrede mitokondri dış zarları yüzeylerinde Bcl-2
proteini eksprese olur.
• Bcl-2 Apaf-1proteinin bir molekülüne bağlanır.
• Hücredeki internal hasarla Bcl-2,
• Apaf-1 serbestleşmesi,
• Mitokondriden dışarı sitokrom c’nin daha uzun süre
sızmamasına,
• neden olur.
• Serbestleşen sitokrom c ve Apaf-1 caspase 9 moleküllerine
bağlanır.
Apoptosom
• Sonuçlanan kompleks;
•
•
•
•
sitokrom c
Apaf-1
kaspaz 9
(ve ATP)
• Apoptosom olarak
adlandırılır.
• Bunlar sitozolde agrege
olur.
Kaspazlar
• Kaspazlar (“Caspases”), sistein proteazlardır ve aspartik
asitten sonraki peptid bağını kırarlar.
• Hücrede inaktif (zimojen) olarak bulunurlar ve proteolitik
olarak birbirlerini aktifleştirirler.
• Böylece bir kaskad şeklinde işlerler.
• Apoptozisde hücreyi parçalayan yani apoptotik morfolojinin
oluşumunu sağlayan etkenler olarak bilinirler.
Kaspaz
• Kaspaz 9 bir düzineden çok kaspaz ailesinin bir üyesidir.
Bunlar proteazdırlar. Adlarını proteinleri Asp rezidülerinden
kesmeleri nedeniyle alırlar.
• Kaspaz 9 diğer kaspaz’ları aktive eder.
• Bir kaspaz’ın diğerini aktive etmesi proteolitik aktivitenin
geniş bir kaskadını yaratır (kan pıhtılaşması ve kompleman
aktivasyonu gibi). Bu durum;
• Sitoplazmada yapısal proteinlerin sindirimi,
• Kromozomal DNA’nın yıkılımı, ve
• Hücrenin fagositozunu
başlatır.
Apoptozisin eksternal sinyallerle başlatılması
• Fas ve TNF reseptörü hücre yüzeyinde gösterilen reseptör
domainleri ile integral membran proteinleridir.
• Komplementer ölüm aktivatörlerinin (sırasıyla FasL ve TNF)
bağlanması sitoplazmaya sinyal geçirir.
• Kaspaz 8 aktivasyonunu başlatır.
• Kaspaz 8 (kaspaz 9 gibi) bir kaspaz aktivasyon kaskadını
başlatır.
• Bu da hücrenin fagositozuna yol açar.
Örnek: Sitotoksik T hücreleri ne zaman hedeflerini tanır
(bağlar)?
• Yüzeylerinde çok miktarda FasL üretilir.
• Bu hücrenin apoptozis ile ölümüne yol açan hedef
hücrenin yüzeyinde yer alan Fas ile bağlanır.
• Apoptozisin erken basamakları en azından C. elegans
örneğinde gösterilmiştir ki, reversibldir. Bazı olgularda,
hücrenin nihai parçalanması bir fagositin hücre içerisine
alınması ile garanti edilmektedir.
BCL-2 Inhibitor Restores Death
by Displacing “BH3-Only” to Activate BAK
BCL-2
Occupied
BCL-2
Small
Molecule
Inhibitor
“BH3 Only”
Activation
BAK
BCL-2
DEATH
tBID
“Active”
BAK
Extrinsic pathway
CD14
LPS
TNF
TLR-4
TNFR-1
?
Bax
bad
bid
Mitochondria
Caspase 8 ?
Bcl-2
Bcl-x
TRADD
Cytochrome c
FADD
APAF-1
Caspase8
Caspase-9
Caspase-3
Caspase-6
Caspase-7
Cleavage of death substrates
Potential mechanisms of LPS-mediated apoptosis
Apoptoziste hücrelerde görülen morfolojik
değişiklikleri
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Hücre küçülmesi
Hücre şeklinde değişim
Sitoplazmanın yoğunlaşması
Nükleer zarf değişiklikleri
Nükleer fragmantasyon
Hücre yüzey yapılarının kaybı
Apoptotik cisimcikler
Hücrenin parçalanması
Kalıntıların fagositozu
Biyokimyasal değişikilikler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Serbest kalsiyum iyon artışı
bcl2/BAX etkileşimi
Hücrenin su kaybı (dehidrasyonu)
Mitokondriyal membran potansiyeli kaybı
Proteoliz
Phosphatidylserinin dışarı çıkması
Lamin B proteolizi
DNA denaturasyonu
50-300 kb yarılma
Intranükleozomal yarılma
Protein cross-linking
Apoptozisin özet olarak belli başlı aşamaları
•
•
•
•
•
•
•
Apoptozisin indüksiyonu
Hücre yüzey ölüm reseptörlerinin uyarılması
Sitokrom c’nin salıverilmesi
Apoptozom oluşumu (sitokrom c+Apaf-1 +kaspaz-9)
Mitokondriyal transmembran potansiyelin değişmesi
Kaspazların aktivasyonu
Fosfatidilserinin hücre membranının iç yüzünden dış yüze
transloke olması
• DNaz’ın aktivasyonu sonucu DNA’nın fragmentasyonu
(internukleozomal DNA fragmentasyonu)
• Yapısal proteinlerin yıkılmasına bağlı olarak apoptozise özgü
morfolojik değişikliklerin meydana gelmesi
APOPTOZİSİN SAPTANMASINDA KULLANILAN
YÖNTEMLER
1.
2.
3.
4.
5.
Morfolojik görüntüleme yöntemleri
İmmunohistokimyasal yöntemler
Biyokimyasal yöntemler
İmmunolojik yöntemler
Moleküler Biyoloji yöntemleri
Morfolojik görüntüleme yöntemleri
1. Işık Mikroskobu
a. Hematoksilen Boyama
b. Giemsa Boyama
2. Floresan Mikroskobu
/ Lazerli Konfokal Mikroskop
a. Propidium İyodür (PI)
b. Hoechst Dye
3. Elektron Mikroskobu*
4. Faz Kontrast Mikroskobu
Histokimyasal yöntemler
1.
2.
3.
4.
Anneksin V Yöntemi
TUNEL Yöntemi
M30 Yöntemi*
Kaspaz-3 Yöntemi*
Biyokimyasal Yöntemler
1. Agaroz Jel Elektroforezi DNA fragmentasyonu
2. “Western Blotting”
- Substrat kırılmaları
- Aktif kaspaz belirlenmesi
- Sitokrom c salıverilmesi
3. “Flow” Sitometri
- DNA azalması
- Annexin V
İmmunolojik Yöntemler:
1. ELISA
- DNA Fragmentasyonu
- M30 Düzeyi
2. Fluorimetrik YÖNTEM
- Kaspaz Aktivasyonu (Hücre
kültürü
Moleküler Biyoloji Yöntemleri:
“DNA Microarrays”
Gen ekspresyon dereceleri (mRNA)
- Hücre ölüm reseptörleri
- Kaspazlar
DNA merdivenleşmesi ile apoptozisin
gösterilmesi
5 kb
2 kb
1 kb
0.5kb
Sağlık Slaytları
http://hastaneciyiz.blogspot.com