Tolga Aytan - Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

advertisement
1
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ
ECZACILIK FAKÜLTESİ
İNSÜLİNİN BİYOTEKNOLOJİK ÜRETİMİ
Hazırlayan
Tolga AYTAN
Danışman
Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK
Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı
Bitirme Ödevi
Mayıs 2011
KAYSERİ
i
“İnsülinin Biyoteknolojik Üretimi” adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü
Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik
Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir.
Tezi Hazırlayan
Tolga AYTAN
Danışman
Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK
Farmasötik Biyoteknoloji ABD Başkanı
Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK
ONAY:
Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı’nın ………....… tarih ve
…………..……
sayılı kararı ile onaylanmıştır.
………. /……../
………
Prof.Dr. Müberra KOŞAR
Dekan
ii
TEŞEKKÜRLER
Bitirme ödevim boyunca bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım değerli hocam Doç.Dr.
Gökçen YUVALI ÇELİK ‘e Bitirme ödevimi hazırlamamda bana destek olan değerli
hocam Berrak BAŞAK DUMLUPINAR ‘a Bitirme ödevimi hazırlamamda bana destek
olan değerli arkadaşım Muhammed DOĞAN ‘a Öğrencilik yaşamım boyunca hiçbir
emeklerini esirgemeden bana gösterdikleri sabır ve destek için aileme sonsuz teşekkür
ederim.
iii
İNSÜLİNİN BİYOTEKNOLOJİK ÜRETİMİ
ÖZET
Yirminci asrın harika ilacı ve hormonu olan insülinin keşfinin 84. yılındayız. İnsülin
sadece şeker hastalarında kan şekeri düzenleyicisi değildir. Bunun yanı sıra; gelişme,
büyüme ve yenilenme fonksiyonlarını da dolaylı yoldan etkileyici bir güce sahiptir.
Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken son 10 yıl içinde
yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş ve daha sonra genetik mühendisliği ile
bakteriler ve mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri
sağlanmıştır. Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi
ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır. Rekombinant DNA
teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın
içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan
çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır. Rekombinant insan insülini Escherichia coli veya
mayalarda proinsülin kodlayan genin klonlanması ile üretilmektedir. Proinsülin bu
bakteri veya maya hücrelerinde üretildikten sonra saflaştırılır ve enzimatik işlemlere
tabi tutularak insan insülini elde edilir.
Anahtar Kelimeler: İnsülin, Rekombinant DNA, Biyoteknoloji
iv
BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF INSULIN
ABSTRACT
We are in the 84th year of discovery of insulin which is the wonderful medicine and
hormone of 20th century. Insulin is not a hormone that only regulates the blood glucose
in diabetics. Besides this, it has a power of effecting the growth, development and
renewing functions by indirect ways. The first produced insulin preparation were
obtained from animal pancreas , but in the last decade, human insulin has been obtain
by using semi synthetic ways and then by injecting human insulin gene into bacteria and
yeast, it has been provided them to produce human insulin gene via genetic engineering.
Today biosynthetic human insulin is produced by using recombinant DNA technology,
and it is commonly used by diabetics. The recombinant DNA technology is the total of
the techniques of the studies that aim to insert a gene, which has been insulated from a
living thing by any way, into an appropriate host and then provide it to be reproduced
there and sometimes to be expressed there. The recombinant human insulin is produced
by cloning the gene that codes the Escherichia coli or proinsulin in yeast. After
proinsulin is produced in this bacteria or yeast cells, it is purified and then by subjecting
it into enzymatic processes, human insulin is obtained.
Key Words: Insulin, Recombinant DNA, Biotechnology
v
İÇİNDEKİLER
KABUL ONAY ................................................................................................................. i
TEŞEKKÜR ...................................................................................................................... ii
ÖZET ............................................................................................................................... iii
ABSTRACT .................................................................................................................... iv
İÇİNDEKİLER ................................................................................................................ v
KISALTMALAR ........................................................................................................................ vii
ŞEKİLLER VE TABLOLAR DİZİNİ .......................................................................... viii
1.GİRİŞ VE AMAÇ ........................................................................................................ 1
2.BİYOTEKNOLOJİ ...................................................................................................... 2
2.1.Biyoteknoloji nedir ..................................................................................................... 3
2.2.Biyoteknolojik tanımlamalar ....................................................................................... 3
2.2.1.Modern Biyoteknoloji ..................................................................................... 3
2.2.2.Moleküler Biyoloji .......................................................................................... 4
2.2.3.Bitkisel Biyoteknoloji ..................................................................................... 4
2.2.4.Biyogüvenlik ................................................................................................... 4
2.2.5.Gen Teknolojisi ............................................................................................... 4
2.2.6.Biyolojik Çeşitlilik .......................................................................................... 4
2.2.7.Rekombinant DNA (Deoksiribonükleik Asit) ............................................... 4
2.2.8.Rekombinant DNA Teknolojisi ...................................................................... 4
2.3. Farmasötik biyoteknolojinin tarihsel gelişimi............................................................ 5
2.4 Biyoteknolojik ilaç çeşitleri ........................................................................................ 7
3.REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ .................................................................. 8
vi
3.1. Gen izolasyonu ........................................................................................................................... 11
3.2. Uygun gen faşıma aracı (Vektör) .................................................................................. 11
3.3. Genin hücreye sokulması................................................................................................... 13
3.4. Geni içeren hücrenin seçimi .................................................................................................... 13
4.İNSÜLİN ..................................................................................................................... 14
4.1.İnsülin nedir .............................................................................................................. 14
4.2.İnsülinin tarihçesi ..................................................................................................... 15
4.3.İnsülinin yapısı kimyası ve biyokimyası .................................................................. 16
4.4.İnsülin sentezinin doğası ve amacı ............................................................................ 17
4.5.İnsülin üretimi ........................................................................................................... 19
4.6.İnsan insülini sentezinin basamakları........................................................................ 20
4.7.Rekombinant DNA teknolojisi ile insülin üretimi .................................................... 20
4.7.1.Vektör (Gram Negatif E. coli) .................................................................... 22
4.7.2.Genetik Mühendislerinin Araç Kutusu İçindekiler ...................................... 23
4.7.3.Humulin Üretimi .......................................................................................... 24
4.8.Genetik Olarak İşlenen Rekombinant İnsan İnsülininin Biyolojik İçerikleri .......... 27
4.9.İnsülin üretimi için biyoteknolojik tesisler ............................................................... 27
4.9.1.Yeşil Alan Üzerinde Bağımsız Bir Tesis ................................................... 28
4.9.2.Zorlu Üretim Süreci ................................................................................... 30
4.9.3.Proses Görüntüleme ve Dökümantasyon .................................................. 31
5.TARTIŞMA VE SONUÇ........................................................................................... 35
6. KAYNAKLAR .......................................................................................................... 38
ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 41
vii
KISALTMALAR
EPA
: Plazminojen aktivatör
EPO
:Eritropoitein
HAT
: Hipoksantin, Aminopterin ve Timin
HVAC
: Isıtma- Havalandırma- Klima tesisatı
G-CSF
:Granulosit koloni stimule edici faktör
GMP
: İyi İmalat Uygulamaları
IGF1
:Growth factor 1
IGF2
:Growth factor 2
LIMS
:Labaratuvar bilgi işletim sistemi
LKCA
: Linde Tesisi İnşası
PCR
:Polimeraz zincir reaksiyonu
viii
TABLO VE ŞEKİL DİZİNİ
Tablo 1:Biyoteknolojik yöntemlerle üretilen ve Dünyada en çok satılan 12 terapötik
protein türü ilaç ...........................................................................................................7
Şekil 1:Rekombinant DNA’ların üretilmesi .................................................................. 10
Şekil 2:cDNA eldesi ....................................................................................................... 12
Şekil 3: İnsülin zinciri .................................................................................................... 16
Şekil 4: B insülin zinciri için gerekli özel nükleotid zinciri ile birlikte sarılmış DNA .. 16
Şekil 5: Diyabetik kişinin kan glikoz seviyesindeki yükselme ve alçalmalar
(dalgalanmalar) sağlıklı bireyler ile karşılaştırılması .......................................... 18
Şekil 6: Rekombinasyon (yeniden birleştirme) işlemine genel bir bakış ....................... 19
Şekil 7: İnsülinin B zincirinin kodlanması için gerekli olan ve açığa çıkan nükleotidler
ile birlikte DNA 11. kromozomunun çözülme ipliği .......................................... 20
Şekil 8: Açığa çıkan DNA iplikçiği ................................................................................ 21
Şekil 9: (m)RNA iplikçiği .............................................................................................. 21
Şekil 10: Ribozomdaki tercüme işlemi ........................................................................... 21
Şekil 11: Taşıyıcı RNA molekülleri kodonların bağlandığı özel amino asit .................. 22
Şekil 12: E. coli hücresi içine insülin tanıtılması ........................................................... 22
Şekil 13: Vektörlerin plazmidlerinin elektron mikroskobu ile görünüşü ....................... 23
Şekil 14: İnsülin üretimi ................................................................................................. 24
Şekil 15: İnsan insülini yapısı. amino grup asit RNA’dan DNA’ya dönüşüm ............... 24
Şekil 16: A ve B zincirlerinin E.coli plazmidleri içine yerleştirilmesi ........................... 25
Şekil 17: Mitosiz İşlemi .................................................................................................. 26
ix
Şekil 18: A veya B zinciri ile birleşen beta-galaktosidaz ............................................... 26
Şekil 19: İnsan İnsülini Molekülü .................................................................................. 27
Şekil 20: Lantus Aventis at the Höchst Industrial Park. ................................................ 28
Şekil 21: Propanol damıtma tesisi, fermentasyon binası ve tank deposunun görünümü 31
Şekil 22: Depolayıcı özelliğe sahip, genetiği değiştirilmiş insülin türevi üretimi için
gerekli olan tesisin 3 boyutlu dizayn modeli ve yapısal planı ......................... 33
Şekil 23: Ana ürünlerin teste tabi tutulduğu kısım. ........................................................ 33
Şekil 24: Höchst Industrial Park’ta bulunan Aventis Lantus tesisinin güney doğusuna
bir bakış ............................................................................................................ 34
1
1.GİRİŞ VE AMAÇ
İnsülin, insüline bağlı Diabetes Mellitus'un tedavisi için gereklidir. Daha önceki yıllarda
insülin sığır veya domuz pankreasından elde edilmekteydi. Fakat bu insülin insan
insülininden kimyasal olarak farklılıklar taşıyordu. Şeker hastalarında bu insülinle
tedavi sonrası antikorların oluşması, insülinin biyosentezinin rekombinant DNA
teknolojisiyle eldesinin önemini daha da arttırmıştır (1).
Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken (sığır, domuz ya da
sığır/domuz karışımı) son 10 yıl içinde yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş
(Hayvanlardan elde edilen insülin biyolojik ve kimyasal reaksiyonlarla insanın ürettiği
insülinle aynı hale getirilmiş) ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakteriler ve
mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri sağlanmıştır.
Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte
ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır (1,2).
1980’lere kadar, bütün insülinler inekler ve domuzlar gibi hayvanlardan elde ediliyordu.
Bu ilacın bu formu hala çok kullanışlı olmasına rağmen, şimdi insan insülinin aynısını
ekmek mayası gibi hücreleri kullanarak üretmek mümkün hale gelmiştir. Bunlar
“biyosentetik” insülinler olarak adlandırılır (1,2).
İnsülinler en basit biçimde kısa, orta ve uzun etki süreli olmak üzere etki sürelerine göre
sınıflandırılabilirse de unutulmaması gereken nokta enjekte edilen insülinin emilimi
aynı kişide %25 oranında, kişiler arasında ise %50'ye varan oranda değişkenlik
gösterebilir (3).
İdeal olan insülinine benzer insülinleri kullanmaktır. Elde edilme biçimine göre iki çeşit
insan insülini vardır. Domuz insülininin insan insülinine benzeyecek şekilde değişime
uğratılmasıyla elde edilen yarı sentetik insülinler ve insan vücudunun yaptığı insülinin
2
yapısı ile aynı olacak şekilde genetik mühendislik teknikleri ile üretilen rekombinant
(biyosentetik) insan insülini vücudumuzun ürettiği insülinine tamamıyla benzer olduğu
için kullanıldığında vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinine
göre çok daha azdır (1).
İnsan insülini insanlardan elde edilmez, insan vücudunun yaptığı insülin moleküler
yapısı ile aynı olacak şekilde üretilir. En modern insülin tipidir ve laboratuvar
koşullarında bazı kimyasal metodlar kullanılarak elde edilir. İnsan insülini
vücudumuzun ürettiği insülinin tamamiyle aynısı olduğu için vücudun bu insüline karşı
tepki gösterme olasılığı hayvan insülinlerine göre çok daha azdır (1,2).
3
2.BİYOTEKNOLOJİ
2.1.Biyoteknoloji nedir
Biyolojik süreçlerin insan yaşamında kullanımı insanlık tarihi kadar eski bir geçmişe
dayanır. Bu anlamda geleneksel biyoteknoloji, insan toplulukları tarafından içerisindeki
bilimsel mekanizma bilinmeden, yazılı tarihin başından bu yana ekmek yapımında,
alkollü içeceklerin mayalandırılmasında, tarım bitkilerinin ve evcil hayvanların
ıslahında yüzyıllardır uygulanmaktadır. Başlangıçta zanaatsal bir yaklaşımla kullanılan
bu süreçlerin temel biyolojik bilimlerde 18. yüzyılda ortaya çıkan gelişmelere koşut
olarak bilimsel ve teknolojik kontrolü devreye girmiştir. 1919 yılında Karl Ershy
tarafından biyoteknoloji “biyolojik sistemlerin yardımıyla ham maddelerin yan ürünlere
dönüştürüldüğü işlemlerdir” şeklinde tanımlamıştır. Moleküler biyoloji ve moleküler
genetik bilimlerinde 1950’li yıllardan itibaren ortaya çıkan gelişmeler, 1970’li yıllarda
biyoteknoloji alanında meyvesini vermeye başlamıştır. Buna bağlı olarak da moleküler
düzeyde yapılan genetik manipülasyonlarla verimliliğin ve üretkenliğin arttırıldığı, yeni
ürünlerin üretebildiği görülmüştür. Bu gelişmelere paralel olarak biyoteknolojinin
tanımı değişikliğe uğrayarak; “biyolojik sistem ve canlı organizmaları veya türevlerini
kullanarak, özel bir kullanıma yönelik olarak ürün veya işlemleri dönüşüme uğratmak
üzere geliştirilen teknolojik uygulamalar” şeklinde tanımlanmaya başlanmıştır (4).
2.2.Biyoteknolojik tanımlamalar
2.2.1.Modern Biyoteknoloji: Geleneksel olmayan ve modern bilgi ve tekniklerin
uygulanmasıdır. Bu tanımlama zaman zaman sadece genetik mühendisliğine dayanan
tekniklerle gerçekleştirilen biyoteknolojiyi tanımlamakta da kullanılmaktadır (5).
4
2.2.2.Moleküler Biyoloji: Biyolojinin bir alt alanını kapsayan bu tanım, canlıların ve
biyolojik olguların moleküler düzeyde (çoğu kez DNA, RNA ve protein düzeyinde)
tanımlanmasına yönelik bilgi ve teknikleri kapsamaktadır (5).
2.2.3.Bitkisel Biyoteknoloji: Tarımsal ürünlerin hali hazırda, üretim sürecinde maruz
kaldıkları çeşitli hastalık, zararlı ve yabancı ot problemlerinin verim üzerine bilinen
olumsuz etkilerinin ortadan kaldırılması ile kalitelerinin yükseltilmesinde kullanılan,
modern biyoteknoloji yöntemleri ile geliştirilmiş tohumların elde edilmesi ile uğraşan
bilim dalıdır (5).
2.2.4.Biyogüvenlik: Modern biyoteknoloji tekniklerinin, uygulamalarının ve modern
biyoteknoloji ürünlerinin insan sağlığı ve biyolojik çeşitlilik üzerinde oluşturabileceği
olumsuz etkilerin belirlenmesi sürecini ve belirlenen risklerin meydana gelme
olasılığının ortadan kaldırılması ya da meydana gelme durumunda oluşacak zararların
kontrol altında tutulması için alınan tedbirleri kapsayan bir kavramdır (5).
2.2.5.Gen Teknolojisi: Bir canlı türüne başka bir canlı türünden gen aktarılması veya
mevcut
genetik
yapıya
müdahale
edilmesi
yoluyla
yeni
genetik
özellikler
kazandırılmasını sağlayan modern biyoteknoloji teknikleridir (5).
2.2.6.Biyolojik Çeşitlilik: Ekosistemlerin insanlığın gönenci için elzem olan yaşam
destek sürecini sürdürebilme yeteneğinin ve sağlıklı çevrenin göstergesidir (5).
2.2.7.Rekombinant DNA (Deoksiribonükleik Asit): Yabancı DNA parçalarının
eklenmesi, bazı DNA parçalarının çıkartılması ve benzeri yöntemlerle doğal diziliş
sırası değiştirilmiş olan DNA’dır (5).
2.2.8.Rekombinant DNA Teknolojisi: Rekombinant DNA teknolojisi, çeşitli
materyallerden genlerin izole edilmesi, genler üzerinde değişik manipülasyonların
uygulanması, genlerin klonlanması ve daha sonra da araştırmalarda kullanılması gibi
moleküler uygulamalar şeklinde tanımlanmaktadır. Bu teknolojinin kullanıldığı
alanlardan bazıları; zararlılara karşı direnç sağlayan genlerin bitkilere transferi; bitkilere
tuzluluk ve herbisitlere dayanıklılığı sağlayan genlerin transferi; bakterilere toksik
atıkları temizleme özelliği kazandıran genlerin ilavesi; ürünlerin kalite ve veriminin
artırılmasıdır (5).
5
2.3. Farmasötik biyoteknolojinin tarihsel gelişimi
Bu tanıma göre biyoteknolojinin tarihini, insanoğlunun yerleşik düzene geçtiği on bin yıl
öncesine kadar götürmek mümkündür. Yabani bitki ve hayvanların evcilleştirilmesi,
bunların melezlerinin oluşturulması ile insanın gereksinimlerin uygun yeni türlerin
geliştirilmesi, bugünkü genetik olarak değiştirilmiş bitki ve hayvanların geliştirilmesine
örnek olan uygulamalardır. Diğer taraftan, bitkisel ve hayvansal ürünlerin (üzüm, süt, et
gibi) fermantasyon gibi tekniklerle şarap, yoğurt, peynir veya pastırmaya dönüştürülmesi
de biyoteknolojinin ilk örnekleridir. Ürün geliştirmede biyolojinin kullanımını, 1866'da
başlayan Mendel'in bezelye deneylerine kadar götürmek mümkündür. Mendel'in bu
gözlemleri, modern genetiğin temellerini oluşturmuştur. Modern biyoteknoloji ile ilgili
belgelerde, bu teknolojinin başlama tarihi olarak 1979 kabul edilse de, rekombinant
protein üretiminde bugün kullanılmakta olan fermantasyon teknolojisi ilk kez 1. Dünya
Savaşında, mısır şekeri fermantasyonunda ve patlayıcı amaçlı aseton üretmek için
kullanılmıştır. Aynı fermantasyon teknolojisi daha sonra, 2. Dünya savaşında, antibiyotik
üretiminde kullanıldı ve böylece yüz binlerce insanın ölümü engellenebildi. 1869'da
Friederich Miescher'in DNA'yı izole etmesi, 1928'de Alexander Flemming'in penisilini
bulması, 1953'de James Watson, Francis Crick ve Rosalinda Franklin'in DNA'nın yapısını
tanımlamaları, 1961 'de Marshall Nirenberg ve Gobind Khorana'nın genetik kodu
çözmeleri, modern biyoteknoloji endüstrisine geçişte önemli kilometre taşlarını
oluşturmuştur. 1970'ler de hücre bölünmesi ve protein yapısının anlaşılması, DNA kesici
enzimleri ve polimerazları da içeren DNA replikasyon enzimlerin izolasyonuyla başlayan
Walter Gilbert'in ilk rekombinant DNA deneyleri, 1975'de ilk hibridomanın
yapılması, 1976'da ilk biyotek firması olan Genentech'in kuruluşu, 1982'de tanı amaçlı
ilk monoklonal antikorun üretimi, yine aynı yılda insülinin ilk insan terapötik proteini
olarak üretilmesi, bu yoldaki en önemli gelişmeler olmuştur (6).
Modern biyoteknolojinin tedavi alanında uygulanabilirliği 1980'lerde kesinlik kazanınca,
bundan 20 yıl kadar önce, başlangıcında çoğu ABD'de olmak üzere, "start-up"
biofarmasötik şirketleri kurulmaya başladı. E.coli’de ilk gen nakli 1973 yılında Boyer ve
Cohen tarafından gerçekleştirildi. Böylece modern biyoteknoloji bu iki yönteme dayalı
olarak günümüzdeki gelişmiş düzeyine ulaşmıştır; zira, DNA zincirinin parçalara
ayrılabilmesi ve çoğaltılarak mikroorganizmalara yerleştirilmesi olanaklı hale gelmiştir
(7).
6
Bugün sayıları bir kaç yüzle ifade edilen bu şirketlerin çoğu girişimci moleküler
biyologlar tarafından kuruldu. Dolayısı ile, bu küçük firmalar, biyoteknoloji arenasında
kendilerine avantaj sağlayacak akademik ve teknik deneyime sahip olmalarına rağmen,
ilaç üretim tecrübelerinin olmaması gibi önemli bir handikap taşımaktaydılar. Diğer
taraftan, önde gelen farmasötik şirketleri ise, bu hızla büyüyen çok önemli teknolojinin
yüksek potansiyelini önceleri fark edemeyerek modern biyoteknoloji alanına girmekte
yavaş davrandılar. Zamanla, bu ikili sorun, küçük biyoteknoloji firmalarının büyük ilaç
firmaları ile kurduğu ittifaklar yoluyla aşıldı. Örneğin, Genentech biyoteknoloji firması
rekombinant insan insülinini geliştirdi. Eli Lilly bu ilacı Humulin® marka adı ile piyasaya
sürdü. Son zamanlarda ise başarılı küçük biyoteknoloji firmaları, büyük ilaç firmaları tarafından, çok yüksek fiyatlarla satın alınmaktadır (6).
1980’li yıllarda, laboratuvar koşullarında DNA parçalarının kopyalarının üretilmesini
sağlayan PCR yöntemi geliştirilmiştir. Günümüzde ilaç olarak kullanılan terapötik
proteinlerin neredeyse tamamı, ya memeli hayvan hücresinde, ya E.coli'’de ya da
Saccharomyces cerevisiae maya türünde üretilmektedir. Ancak, başka sistemler de terapötik
protein üretimi için denenmektedir. Modern biyoteknoloji firmalarının başlattığı bu yeni
akım, 20 yıl gibi kısa bir sürede 50'den fazla farklı terapötik proteinin hastaların
kullanımına sunulmasını sağlamıştır. 1982'de insan insülininin E.coli'de üretilmesinden
sonra, sayıları her yıl hızla artan bu ilaçlardan Protropin (1985), Intron A (1986-1992),
Alferon N (1989), Activase (1990), Recoınbinate (1992), Epogen (1993), Procrit (1993),
Orthoclon (1993), Betasemn (1993), Kogenate (1993), Cerezyme (1994), Nutropin
(1994), Neupogen (1994) örnek olarak verilebilir. Toplam ilaç türlerinin binlere ulaştığı
bir ilaç endüstrisinde, 50 yeni molekülün anlamının sınırlı olabileceği gibi bir kanıya
kapılmadan önce, bu 50 kadar ilacın, kısa bir süre içinde yılda 30 milyar dolarlık bir paya
sahip olduklarını hatırlamak gerekir. Tablo 1'de terapötik proteinler içinde satış rakamları
açısından en önde yer alanların bir listesi sunulmaktadır (6,8).
7
Tablo 1:Biyoteknolojik yöntemlerle üretilen ve Dünyada en çok satılan 12 terapötik
protein türü ilaç
2.4 Biyoteknolojik ilaç çeşitleri
Biyoteknoloji, geliştirme veya ürüne dönüştürme aşamasında canlı organizmaların
kullanıldığı bir teknoloji alanını ifade ettiği için, bugün geleneksel ilaçlar haline gelmiş
olan hayvan kaynaklı (androjenler, östrojenler, kortikosteroidler vb.), bitkisel kaynaklı
(atropin, morfin, kardiyak glikosidler, aspirin vb.) ve mikrobiyolojik kaynaklı ilaçlar
(antibiyotikler vb.) biyoteknolojik ilaçlar kapsamında tanımlanmaktadır. Ancak,
günümüzün biyoteknolojisi, yani modern biyoteknoloji, geleneksel biyoteknolojiden
farklı
bir
konumdadır. Modern biyoteknolojiye dayanan
yeni
ilaçlar kısaca
"biyofarmasötikler" olarak tanımlanabilir. Biyofarmasötikler ise iki ana sınıfta
incelenebilir: küçük moleküllerden oluşan "kimyasal ilaçlar" ve daha büyük
moleküllerden oluşan "terapötik proteinler" dir (6).
8
3.REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ
Moleküler genetik araştırma tekniklerinin gelişmesi araştırıcılara farklı kaynaklardan
yani organizmalardan gelen DNA moleküllerinin in vitro'da birleştirilebilme olanağı
sağlamıştır. Farklı kaynaklardan gelen moleküllerin birleştirilmesi ile oluşan DNA
moleküllerine rekombinant DNA denir ve kısaca rDNA olarak yazılır. Doğada
kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde
edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislik teknolojisiyle kesilmesine ve elde
edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir.
Rekombinant
DNA
üzerinde
restriksiyon
endonükleaz
analizleri,
DNA
dizileme ve yönlendirilmiş mutasyon gibi genetik analiz ve manipulasyonlar
gerçekleştirilebilir. Bütün bu işlemleri yapmak için kullanılan tekniklerin tamamına
rekombinant DNA teknolojisi denir. Bu teknik genetik mühendisliği olarak da
adlandırılır. Bu alanda yapılan işlemler, kısaca genlerin herhangi bir organizmadan
alınarak üretilmesi ve üretilen genlerin gerek temel, gerekse uygulamalı araştırmalar için
kullanılması olarak özetlenebilir. Bu teknoloji bugün temel bilimler, tıp, endüstri,
hayvancılık, ziraat, çevre mühendisliği gibi alanlarda yaygın bir biçimde kullanılmaya
başlamıştır (9).
Bu teknolojinin bilimsel temeli olan çeşitlenme (rekombinasyon) genetik bir olaydır ve
doğada canlılar arasında görülen çeşitliliğin önemli nedenlerinden birini oluşturur.
Rekombinasyon; farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler söz konusu olduğunda,
anne babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya
gelmesine yol açan olaylar dizisidir. Bu olay moleküler düzeyde, farklı nükleotid
dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça
alışverişi sonucunda meydana gelen yeni gruplamalardır. Bunun için DNA molekülleri
arasında kırılmalar meydana gelir ve kırılma bölgelerinde DNA molekülleri
arasında parça alışverişi oluşur. Sonuçta orijinal durumdaki DNA moleküllerine tam
9
olarak benzemeyen ve onlara ait nükleotid dizilerini kısmen taşıyan rekombinant DNA
molekülleri oluşur (9,10).
Homolog çeşitlenme (rekombinasyon), eşeyli üremeyle genelde mayoz bölünmedeki
kromozomal parça değişimi sonucunda meydana gelir. Bakterilerde çeşitlenme farklı
işleyişlerle, transformasyon konjugasyon ve trandüksiyon olaylarıyla görülür. Bu
olayların
hepsinin
temeli
DNA
molekülleri
arasında
homoloji
olmasına
dayanmaktadır. Bu yüzden doğada çeşitlenme, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok
yakın türler arasında kısıtlıdır. Farklı türler arasında var olan çeşitli düzeydeki eşleşme
engelleri farklı türlere ait bireyler arasında genetik bilgi aktarımına, dolayısıyla da
rekombinasyona olanak sağlamamaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinin tanımı ve
kapsamı çeşitli toplumlara ya da bilim insanlarına göre farklılıklar göstermektedir.
Bununla birlikte, bu değişik tanımlar arasında hepsindeki ortak yönleri birleştiren
oldukça geniş ve günümüzün modern ölçütlerine uygun bir tanım şu şekilde yapılabilir:
Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin
uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade
edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır (11).
Belirli bir amaç için doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan bu teknolojiyle, in
vitro şartlarda genetik materyalde planlı değişiklikler yapılabilmekte, istenilen genlerin
istenilen canlıya sokularak, doğal biçimde bulunmadığı bu konakta çoğaltılması ve
istenilen ürünü vermesi için nakledilen genin ifadesi sağlanabilmektedir. Bu teknolojiyle,
prokaryotik ve ökaryotik gruplara ait türlerin kendi aralarında olduğu kadar, gruplar
arasında da gen aktarımları yapmak ve çeşitlilikler meydana getirmek mümkün
olmaktadır. Transgenik hayvanlar kendi genomunda başka bir organizmaya ait
rekombinant bir geni taşıyan hayvanlar olarak tanımlanmaktadır (10,11).
10
Şekil 1: Rekombinant DNA’ların üretilmesi
Rekombinant DNA teknolojisindeki süratli gelişme gen aktiviteleri ile ilgili çalışmalar
yapmak için yeni fırsatlar ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte moleküler biyoloji ve
genetik mühendisliği alanında yapılan çalışmalarda, gen aktarım teknolojilerinin önemi
gün geçtikçe artmaktadır. Çiftlik hayvanlarına gen transferi; elde edilen yavru sayısı, süt
miktarı, yapağı miktar ve kalitesi, yemden yararlanma kabiliyeti ve hastalıklara
direncin yükseltilmesi amacı ile yapılmaktadır. Önemli bir diğer hedef ise transgenik
hayvanların organ
vericisi haline getirilmesidir. Rekombinant DNA tekniği
geliştirildiğinde, sadece genlerin organizasyonu, düzenlenmesi ve mutasyonlar gibi,
temeli akademik çalışmalara dayanan araştırmalar için kullanılırdı. Bilim adamları,
bu teknolojiden yararlanarak endüstriyel uygulamasını da bulmuşlar ve bugün
biyoteknoloji adı altında tıp, kozmetik ve tarım gibi farklı alanla da ekonomiye
milyarlarca liralık katkısı ile önemli bir endüstri doğmuştur (9).
11
Rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak bir genin klonlanması 4 aşamada
gerçekleştirilebilir. Gen klonlanması ise şöyle tanımlanabilir: Önemli bir ürünün yani
hedef DNA bölgesinin bir vektör ile birleştirilerek özel konak hücreler içinde çok
sayıda kopyasını elde etme işlemidir (11,12).
3.1. Gen izolasyonu
a) mRNA'sından komplementer DNA (cDNA)’ nın sentezlenmesi,
b) Gen kütüphanelerinin kullanılması: Aranan genin etiketli kopyası ya da
etiketli mRNA'sı elde mevcutsa tüm genomu parça parça içeren klonlar arasından aranan
geni içeren klon tespit edilip, bol miktarda gen izolasyonunda kullanılabilir (9,10).
3.2. Uygun gen taşıma aracı (Vektör)
a) Plazmidler: Konak E.coli hücresi içerisinde çoklu kopyaları bulunan 2kb200kb ebatlı küçük kromozomdan ayrı olarak bulunan dairesel moleküllerdir. En çok
kullanılan pBR322 plazmiti Ampisilin ve Tetrasiklin antibiyotiklerine direnç bölgeleri
içerir. Pek çok restriksiyon enzimi için tek bir kesme yerine sahip olup, 6000 bp'e
kadar yabancı DNA parçaları taşıyabilir.
b) Virüsler:
1978’de yapılan Asimolar konferasınsında en az tehlikeli ve en
çok incelenmiş virüs olarak ƛ-faji kullanılmaya karar verilmiştir.ƛDNA'sı 49 kb
boyunda çift iplikli bir moleküldür. Her iki ucunda birbirlerine komplementer 12
nükleotitlik tek iplikli zincirlere sahiptir. Bu uçlara "cos" (cohesive = yapışkan)
uçlar denir. Infekte olmuş hücrede DNA'ları cos bölgelerinden birbirine bağlı peşpeşe
DNA zincirleri halinde sentezlenir ve sonra faj halinde paketlenirler.
12
Şekil 2: cDNA eldesi
c) Kozmidler:
Plazmit ve fajların kullanışlı özelliklerini bünyesinde toplayan
melez bir vektördür. 35000 - 45 000 bp'ye kadar DNA parçalarını klonlamada
kullanılabilir. ƛ fajını paketleyen enzimlerin
"cos" bölgelerini tanımasından
yararlanılır. ƛ fajının "cos" bölgeleri örneğin pBR322'nin tet geni içine klonlanır.
Amp1 geni sağlam kalır. Yabancı DNA nispeten büyük parçalara kesilip her biri
(biraz şans ile) "cos" bölgeli plazmit ile birleştirilir.
Bakteriler ekilerek ampisiline
dirençli, tetrasikline duyarlı olanlar seçilir.
d) Ekspresyon vektörleri:
Yabancı genin ekleneceği bölgenin önünde
tercihli bir promoter bölge içeren yapay plazmitlerdir. Klone edilecek genin ürünü olan
proteinin sentezlenmesi arzu ediliyorsa ekspresyon vektörleri kullanılır (9,10).
13
3.3. Genin hücreye sokulması
a) Plasmid ya da virüslerle,
b) Kimyasal yöntemle:
Ca3(PO4)2 kullanılarak DNA'yı tuzakladıktan sonra seçici
bir ortamda ( ±tk geni ile seçerek),
c) Fiziksel yöntem: Hücre çekirdeğine sokulacak cam (ya da plastik) mikro
pipetlerle (uçları 0,1 - 0,5 mikron olmalı) DNA injeksiyonudur. Bu yöntemle
herhangi bir DNA parçası herhangi bir hücreye direkt olarak sokulabilir.
d) Füzyon ile: Lipozomlar ya da eritrosit hayaletler (içlerindeki hemoglobin ve
diğer proteinler boşaltılmış, bütünlüğü korunmuş eritrosit membranları)
kullanılarak içerdikleri DNA'nın hücre erimesi yöntemiyle diğer bir hücre ile
birleştirilmesi yöntemidir (9,10).
3.4. Geni içeren hücrenin seçimi
a) Antibiyotiklere dirençlilik,
b) Seçici ortamlar
(örneğin HAT: Hipoksantin, Aminopterin ve Timin) ortamında
tk- hücreler üreyemez. Çünkü Aminopterin, dCTP ->dTDP yolunu bloke eder (9,10).
Yabancı geni içeren hücre seçildikten sonra uygun koşullarda saklanabilir ya da arzu
edildiğinde adı geçen geni üreten bir fabrika gibi kullanılabilir. Günümüzde değerli
proteinlerin genleri (insülin, büyüme hormonu vb.) ekspresyon vektörlerine klone
edilmiş olarak mevcuttur. Hatta çeşitli firmalardan ücreti ödenerek temin edilebilir
(9,10).
Rekombinant DNA teknolojisi uygulamaları özellikle genetik mühendisliği ve
biyoteknolojide kullanılmaktadır. Dünya nüfusunun %3-5'nin genellikle tedavi olanağı
bulmayan kalıtsal hastalıklardan etkilendiği bilinmektedir. Bu alandaki en büyük
ümit ve beklenti genetik bozuklukların gen aktarımı yöntemleriyle düzeltilmesi ya da
etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesidir. Kısa zamanda çok geniş bir uygulama
alanı bulan bu yöntemin gerçek değeri önümüzdeki yıllarda çok daha iyi anlaşılacaktır
(12).
14
4.İNSÜLİN
4.1.İnsülin nedir
İnsülin pankreastaki langerhans adacıklarının beta-hücreleri tarafından üretilen
polipeptit yapıda 6000 dalton molekül ağırlığında bir hormondur. Molekülü 2 aminoasit
zincirinden oluşmaktadır. Zincirler birbirlerine iki disülfür köprüsüyle ile bağlanmıştır.
Bu hücreler pankreas kütlesinin yaklaşık %1’ini oluştururlar. İnsülin, dokular tarafından
yakıtların kullanımını düzenleyen en önemli hormonlardan biridir. Metobolik etkileri
anaboliktir, ör: glikojen, triaçilgliserol ve protein sentezini desteklemektedir (13).
Bunların dışında membran enzimlerini aktive ve inaktive edebilirler, birçok protein ve
mRNA’nın sentez veya yıkım hızını değiştirebilir, hücre büyüme ve farklılaşmasını
etkileyebilirler (14).
İnsülinin karbonhidrat özüştürmesinin birincil dengeleyicisi olmasının yanında,
karbonhidrat metabolizması ile ilişki içinde bulunan yağ ve protein metabolizmaları
üzerinde de önemi vardır ve kandaki insülin derişimi değişikliklerinin tüm bedende
yaygın etkileri bulunmaktadır. Bu hormonun tam yokluğu, şeker hastalığının 1. tipine ;
görece azlığı ya da insüline karşı direnç ya da her ikisinin birlikte olması ise 2. tip şeker
hastalığına yol açar. Bu doğrultuda, endüstriyel olarak üretilmiş olan insülin, 1. tip şeker
hastalığında ve başka ilaçların yetersiz kaldığı 2. tip şeker hastalığı vakalarında ilaç
olarak da kullanılır. İnsülinin yapısı hayvanlar arasında görece küçük farklara bağlı bir
çeşitlilik gösterir ve insan insülinine en benzer yapıdaki insülin, arada tek bir aminoasit
biriminin farklı oluşuyla, domuz insülinidir. İnsülinin karbonhidrat metabolizması
üzerindeki
düzenleyici
gösterebilmektedir (15).
işlevinin
etkinliği
de
insandan
insana
değişkenlik
15
4.2.İnsülinin tarihçesi
1869 yılında Langerhans pankreas adacıklarını islet Cell diye isimlendiriliyordu. 1889
da Minkowsky ve V. Mering total pankreatektomi yaptıkları köpeğin diyabet olduğunu
göstermeleriyle şeker hastalığının merkezi organını tanımlamış oldular. 1909’da Jean de
Mayer, pankreasın bu adacıklarının salgıladığı endojen salgıya İnsülin adını teklif
ettiler. 1916’da Nicoulau Paulesco pankreasın bu ekstresine pencrein adını vererek,
diyabetik hastalarda bunun kan şekerini düşürdüğünü yayınladılar (1,16).
1920’ler heyecan verici yıllardı. Gelişimin heyecan verici sürecinde ilk adım olarak
dünyanın ilk insülini elde edildi. İnsülin tedavisi Danimarka’da başladı, Novo terapötik
laboratuvarları ve Nordisk insülin laboratuvarları kuruldu.30 Ekim 1920 de Banting dış
kanalı bağlı pankreasta adacıkları izole edildi. 1921’de Best, Banting, Mac Leod ve J.
Collip pankreas ekstresiyle diyabetik köpeğin kan şekerini düşürüp, hipoglisemi ve şoka
sokuldu ve böylelikle insülin keşfedilmiş oldu. 1922 yılı mayıs ayında Lilly ilaç
firmasıyla Best Collip insülin üretim kontratı imzaladı ve insülin tedavi sahasına
sokuldu (1).
Biyofarmasötik endüstrisi 1971 yılında Berkeley’deki Cetus’un kurulması ile başladı.
1975’de ilk monoklonal antikor üretildi.1976’da Genentech in kurulması ile DNA
dizileme, replikasyon ve maya DNA’sının ekspresyonunun sunumu yapıldı. Bir sonraki
yıl, insan geni bakteride ifade edildi ve tavşan insülin geni klonlandı. 1978 yılında
Biogen kuruldu ve aynı yıl rekombinant insan insülini ve insan büyüme hormonu
üretildi. Bakteriyal DNA başarılı bir şekilde maya kromozomuna sokuldu. 1979’da
maya protoplastı bir hibrit E. coli/maya plazmidi ile transforme edildi. 1980’de Amgen
kuruldu ve canlı organizmaların patentlenebileceği US yüksek mahkemesi ile
kurallandırıldı. 1981’de ilk rekombinant diagnostik kit FDA tarafından onaylandı ve 3
şirket daha oluşturuldu: Genetics Institute, Chiron ve Genzyme. Rekombinant insan
insülini 1982 yılında onaylandı (1,16).
16
4.3.İnsülinin yapısı kimyası ve biyokimyası
Kimyasal olarak insülin küçük basit bir proteindir. 30 tanesinin bir polipeptit zincirini
ve 21 tanesinin de ikinci bir zinciri oluşturduğu 51 amino asitten oluşur. Bu iki zincir
bir disülfit bağı ile bağlanır (şekil 3 ) (2).
Şekil 3: İnsülin zinciri
İnsüline ait genetik kod DNA içindeki on birinci kromozomun kısa kolunun üzerinde
bulunmuştur. Bu, 153 azot kökü içerir (63 ü A zincirinde ve 90 tanesi de B zincirinde).
İki uzun birbirine sarılı helisel içeren kromozomu oluşturan DNA, her biri bir şeker
deoksiribozu bir fosfat ve azot kökünden oluşan bir nükleotidler zincirinden inşa edilir.
Dört farklı azot kökü vardır; bunlar adenin, timin, sitozin ve guanindir. İnsülin gibi özel
bir proteinin sentezi bu köklerin tekrar edildikleri bir zincir ile tespit edilir (Şekil 4 )
(17,18).
Şekil 4: B insülin zinciri için gerekli özel nükleotid zinciri ile birlikte sarılmış DNA
17
İnsülin molekülünün yapısı bakımından, türler arasında farklılıklar bulunmaktadır. Bu
farklılığın klinik önemi vardır. Örneğin domuz, sığır, at ve memeli deniz hayvanlarının
insülinlerindeki kimyasal olarak en büyük farklılık 8. 9. ve 10. amino asitteki
değişikliktir. İnsan insülinine en yakın olan domuz insülinidir. Domuz insülinindeki
tek fark B zincirinde karboksi terminalinde alanin treonin (threonine) olmasıdır.
Başlangıç maddesi olarak domuz İnsülinin kullanılması yan sentetik olarak insan
insülinin elde edilmesini nispeten kolaylaştırmıştır. 1983 yılında Frank ve Chance, E.coli
DNA' sının klonlanması ile insan insülini elde etmişlerdir. Bu heyecan verici yeni
teknolojik gelişme ile insan insülini üretilmiş, diyabet hastalarının daha etkin ve
memnuniyet verici bir şekilde tedavi edilmesi sağlanmıştır. İnsan insülininin
bulunması diyabet hastalarının tedavisinde önemli bir yolun aşıldığı anlamını
taşımaktadır. 1995 yılında rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi ile bir başka ilk
gerçekleştirilmiştir. İlk kez insan insülini analogu elde edilmiştir. B zincirinin C
terminalindeki prolin (B28) ile lizinin (B29); yer değiştirmesi sağlanarak insan
insülin analogu elde edilmiştir. Bu gelişmelerden, açıkça izleneceği gibi diyabet
hastalığının tedavisinde kullanılan insülinin, tedavi etkinliğini arttırmak amacı ile
yapılan çalışmalar, keşfinden günümüze kadar aralıksız olarak devam etmiştir.
Tedavide en iyi sonucun alınması ve sorunsuz olarak kullanılması ile ilgili olarak
insülin molekülünün geliştirilmesi ile ilgili çalışmalarda sınır tanınmamıştır. Diyabet
tedavisi ve insülin molekülünün geliştirilmesi ile ilgili olarak gelecekte erişilecek
düzeyin bir gün hayal gücümüzü bile aşacağını düşünmek uzak bir tahmin
olmayacaktır (19).
4.4.İnsülin sentezinin doğası ve amacı
Banting ve Best in 1921’de keşfettikleri hormon olan insülinden bu yana; bozulan
insülin hormonuna bağlı olarak artan şeker düzeyleri olan diyabet hastaları (Şekil 5);
mezbaha hayvanlarının pankreas bezelerinden (salgı bezi) türetilen insülin ile tedavi
edilmektedir. Langerhans’ın pankreas adacıklarının beta hücrelerinden üretilen ve
salgılanan bu hormon, yiyeceğin; özellikle karbonhidratların
depolanmasını düzenler (20,21).
kullanımını ve
18
Şekil 5 Diyabetik kişinin kan glikoz seviyesindeki yükselme ve alçalmalar
(dalgalanmalar) sağlıklı bireyler ile karşılaştırıldı.
Sığır ve domuz insülini insan insülinine benzer olmasına rağmen bunların yapısı az da
olsa farklıdır. Sonuç olarak bir seri hastanın bağışıklık sistemi buna karşı bunun
faaliyetlerini nötrleştiren antikor üretir ve bu da enjeksiyon alanlarında iltihaplı
tepkilerle sonuçlanır. Sığır ve domuz insülininin bu ters etkilerine ek olarak, yabancı
bir
maddenin
düzenli
olarak
enjeksiyonundan
sonra
gelen
uzun
süreli
komplikasyonlardan korkulmaktadır ve bu da hayvandan üretilen insülinin üretiminde
azalma olarak yansımıştır (22). Bu faktörler; araştırmacıları, uygun bir vektör E. coli
bakteriyel hücresi içine insülin geni yerleştirerek doğal olarak üretilen eşiyle kimyasal
olarak
aynı
olan,
insülin
üretmek
için,
humulin
sentezlemeyi
düşünmeye
yönlendirmiştir. Bu da rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak başarılmıştır. Bu
metot mezbahadan yan ürününü çıkartmak ve bunu arıtmaktan çok daha güvenilir ve
devamlı bir metottur (Şekil 6 ) (2).
19
Şekil.6: Rekombinasyon (yeniden birleştirme) işlemine genel bir bakış.
4.5.İnsülin üretimi
İnsülin genel olarak;
 Sığır (Beef İnsülin) Sığırların pankreaslarından ekstraksiyon yöntemi ile elde
edilir. 3 amino asidi insan insülininden faklıdır.
 Domuz (Pork İnsülin) Domuzların pankreaslarından ekstraksiyon yöntemi ile
sağlanır. İnsan insülininden bir amino asidi farklıdır.
 Bakteriler/Mayalar(Biosentetik) Bakteri ve maya (mantar)'ların DNA yapıları
değiştirilerek (rekombinasyon) insan insülini üretilir. (Rekombinant DNA
teknolojisi) (23).
20
4.6.İnsan insülini sentezinin basamakları
1. Nükleusta insulin kodlayan genlerden mRNA transkripsiyonu olur.
2. mRNA stoplazmaya gelir ve kaba endoplazmik retikuluma bağlı polizom ile
translasyona uğrar.
3. Polipeptit sentezi, N-Terminal sinyal polipeptidi oluşumuyla başlatılır ve kaba
endoplazmik retikulum membranı içine penetre olur.
4. Polipeptit zinciri, kaba endoplazmik retikulum lumeni içine doğru uzar, sonuçta
preproinsülin oluşur.
5. Sinyal peptidi ayrılır ve sisternada proinsülin oluşur.
6. Proinsülin kaba endoplazmik retikulumdan golgi kompleksine taşınır, orada
proteazların etkisiyle c-peptit segmentini kaybederek insüline dönüşür.
Dönüşüm golgi aparatından kopma sonucu oluşan insülin depo veziküllerinde
devam eder.
7. İnsülin parsiyel ekzositozla salgılanırken onunla birlikte ekimolar miktarda
Cpeptitide salgılanır (13).
4.7.Rekombinant DNA teknolojisi ile insülin üretimi
DNA’nın on birinci kromozomunun çift ipliği insülin üretiminde özel olan eşleşmemiş
azot köklerini açığa çıkararak ikiye bölünür (şekil 7 ) (21).
Şekil 7: İnsülinin B zincirinin kodlanması için gerekli olan ve açığa çıkan nükleotidler
ile birlikte DNA 11. kromozomunun çözülme ipliği
21
Açığa çıkan DNA iplikçilerini şablon olarak kullanarak (Şekil 8 ) transkripsiyon
(kopyalama) işlemindeki mesajcı RNA oluşur (şekil 9 ) (24).
Şekil 8:Açığa çıkan DNA iplikçiği.
Şekil 9 (m)RNA iplikçiği.
Urasil tarafından değiştirilen azot köklü timin üzerindeki mRNA iplikçiğinin rolü
genetik bilgiyi taşımaktır. Mesela insüline ait olan bilgiyi çekirdekten sitoplazmaya,
ribozoma bağlandığı yere, taşıması gibi (Şekil 10 ) (21,24).
Şekil 10: Ribozomdaki tercüme işlemi.
mRNA’nın azot kökleri kodonlar adı verilen ağaçlarda gruplanırlar. Taşıyıcı RNA
(tRNA) molekülleri, üç eşlenmemiş azot kökü, toplu olarak mRNA üzerinde
22
tamamlayıcı kökler olan kodonlar ile birlikte toplu olarak bir anti kodon çifti olarak
bilinen özel bir amino aside bağlanırlar (Şekil 11) (21,24).
Şekil 11:Taşıyıcı RNA molekülleri kodonların bağlandığı özel amino asit
Ribozomda mRNA’nın tRNA tarafından okunması tercüme (yazma) olarak bilinir.
tRNA tarafından oluşturulan özel bir amino asit zinciri mRNA tarafından tespit edilen
kodu takip eder. mRNA’nın kök zinciri, insülin gibi özel proteinleri oluşturmak için
bununla birlikte bağlanan amino asit zinciri içine yazılır (21,24).
4.7.1.Vektör (Gram Negatif E.coli)
E.coli adlı yaygın bakterinin zayıflamış iplikçiği insan sindirim sisteminin bir sakinidir
ve bu; genetik insülin mühendisliği fabrikasıdır (Şekil 12) (2).
Şekil 12: E. coli hücresi içine insülin tanıtılması
23
Bakteri ürediğinde DNA’ nın sirküler bir kısmı olan plazmid ile birlikte insülin de
kopyalanır (Şekil 13). E. coli insülin gibi yabancı maddeleri hızla azaltan enzimleri
üretir. Bu enzimlerden yoksun mutant iplikçikleri kullanarak problemden kaçınılır (2).
Şekil 13: Vektörlerin plazmidlerinin elektron mikroskobu ile görünüşü
4.7.2.Genetik Mühendislerinin Araç Kutusu İçindekiler
Doğal olarak bakteri tarafından üretilen sınırlandırıcı enzimler, biyolojik cerrah
bıçakları olarak rol oynarlar ve insülin kodları gibi sadece özel nükleotidlerin
uzantılarını tanırlar. Bu belli azot kökü çiftlerini ayırmayı mümkün kılar ve
organizmaya ait kromozomdan DNA’yı kodlayan insülin kısmını ayırır böylece insülini
üretebilir (Şekil 14) (22,25). DNA ligaz açığa çıkan nükleotidleri yapışkan uçlarından
birbirine kaynaklayan genetik bir yapışkan, olarak hizmet eden bir enzimdir (2).
24
Şekil 14: İnsülin üretimi
4.7.3.Humulin Üretimi
Birinci basamak insülinin A ve B polipeptit zincirlerini karakterize eden özel nükleotid
zincirlerini taşıyan DNA zincirlerini kimyasal olarak sentezlemektir. (Şekil 15) (2).
Şekil 15: İnsan insülini yapısı. amino grup asit RNA’dan DNA’ya dönüşüm.
25
Gerekli DNA zinciri tespit edilebilir çünkü her iki zincirin amino asit içeriklerinin
şifresi çözülmüştür. A zincirini sentezlemek için altmış üç nükleotid ve B zinciri içinde
doksan nükleotid gereklidir. Bu zincirlerin her birinin ucuna protein sentezinin
bitirildiğini işaret eden artı bir kolon eklenir. Daha sonra bakteri hücresinin amino
asidinden insülin proteininin ayrılmasına izin vermek için amino asit ile işbirliği yapan
bir anti-kodon da, methionin, her bir zincirin başına yerleştirilir. Bundan sonra vektörün
plazmidi içine taşınan B-galaktosidaz, bakteri enzimi için, sentetik A ve B zinciri
“genler” gen içine ayrıca yerleştirilir. Bu safhada, sentetik genlerin kodonlarının Bgalaktosidazınkilerle uyumlu olması hayati önem taşır (Şekil 16) (2).
Şekil 16: A ve B zincirlerinin E.coli plazmidleri içine yerleştirilmesi.
Rekombinant plazmidler daha sonra E. coli hücrelerine tanıtılırlar. Rekombinant DNA
teknolojisinin insan insülini sentezindeki uygulamasında insülin verebilmek için insülin
geni ile birleşecek plazmidleri olan milyonlarca bakteri kopyası gerektirir. İnsülin geni
hücre içinde mitosize maruz kalan B-galaktosidaz ile birlikte kopyalandığında
tanımlanır (şekil 17) (2).
26
Şekil 17: Mitosiz İşlemi
Oluşan protein insülinin A veya B zinciri ile birleşen B-galaktosidazın bir kısmını içerir.
Daha sonra B-galaktosidaz parçacığından A ve B zincirleri tanımlanır ve arıtılır
(Şekil18) (2).
Şekil 18: A veya B zinciri ile birleşen beta-galaktosidaz
Bu iki zincir karıştırılır ve disülfit geçiş köprülerini oluşturan bir reaksiyonda yeniden
bağlanırlar ki bu da saf Humulin sentetik insan insülini ile sonuçlanır (Şekil 19) (2).
27
Şekil 19: İnsan İnsülini Molekülü
4.8.Genetik Olarak İşlenen Rekombinant İnsan İnsülininin Biyolojik İçerikleri
İnsan insülini bu şekilde bakteriler içinde yapılan tek hayvan proteinidir ki yapısı doğal
molekülünki ile tamamen aynıdır (26,27). Bu, antikor üretimi ile sonuçlanan
komplikasyon ihtimalini azaltmaktadır. Kimyasal ve farmakolojik çalışmalarda ticari
olarak elde edilebilen rekombinant DNA insan insülininin pankreas tarafından üretilen
insan insülininden ayırt edilemediği kanıtlanmıştır. Burada yüz yüze gelinen ana sorun
ev sahibi hücreler ile son ürünün kirletilmesiydi ki bu da fermantasyon suyunda
kirlenme riskini arttırmaktaydı. Bu tehlike arıtma işleminin işleme konulması ile
kökünden halledildi. Son insülin ürünü bir seri testlere maruz bırakıldığında, ki buna en
ince radyo imüno ayar teknikleri de dâhildir, hiçbir kirlilik tespit edilemez. Şimdi tüm
prosedür büyüme aracı olarak maya hücreleri kullanılarak yapıldı, çünkü bunlar
mükemmel üç boyutlu yapıda neredeyse tamamen insan insülini molekülü salgılarlar.
Bu da karışık ve maliyetli arıtma işlemlerine ihtiyacı en aza indirir (26).
4.9.İnsülin üretimi için biyoteknolojik tesisler
Sadece Almanya’da her gün 800,000 insan kan şekeri düzeyini korumak için insülin
kullanmak zorundadır. Genetik teknolojisinin son 30 yıldaki hızlı gelişimi, genetiği
değiştirilmiş mikroorganizmaları kullanarak sınırsız miktarda ve yüksek kalitede insülin
ve insülin analoglarını üretmeyi mümkün hale getirmiştir. Yeni analogların glargin
insülin gibi üretimi için ise son derece modern biyoteknolojik tesisler gerekmektedir.
Farmasötik tesislerin planlanması ve kurulması Dresden’de bulunan Linde Plant
Construction (LKCA)’ın yeni atıldığı bir iş sahasıdır. Buna rağmen LKCA son on yılda
farmasötik ve biyoteknolojik tesislerin planlanması, dizaynı ve kurulumu konusunda
28
lider firma konumuna gelmiş durumdadır. LKCA bu alandaki ilk rolünü Nisan 2000’de
yeni bir biyoteknolojik tesisin kurulumu sürecinde ‘genel planlayıcı’ olarak
üstlenmiştir. Tesis, Frankfurt’ta bulunan Aventis Pharma için kurulacaktı ve tesiste
genetik mühendisliği kullanılarak bir insülin türevi olan glargin insülin üretimi
yapılacaktı. LKCA tesisi Aventis’e sadece 29 ay sonra başarılı bir şekilde teslim etti.
(şekil 20-21) (28).
Şekil 20: Lantus Aventis at the Höchst Industrial Park.
4.9.1.Yeşil Alan Üzerinde Bağımsız Bir Tesis
Tesis birbirinden bağımsız 4 binadan oluşmaktadır ve bu binalarda da temizliğine,
alanına ve patlama tehlikesi olan süreçlere göre ayrılmış ve sınıflandırılmış üretim
işletmeleri bulunmaktadır. Bütün alt tesisler merkezi bir bağlantı yolu vasıtasıyla
beslenmektedir. Bu yoldan alt tesislere hem personel hem de materyal akışı
sağlanmaktadır. Bu yol ayrıca ana binayı ofislere, konferans salonuna, laboratuarlara ve
ana kontrol odasına bağlamaktadır. Birçok depolama tankının yanı sıra, alt yapı hattını
Höchst Industrial Park’taki atık tesisine bağlayan hatlar bulunmaktadır. Tesis her yıl
ortalama 1700 kg glargin insülini üretmektedir (şekil 20) (28).
29
5 Adımda Üretim
Biyosentetik glargin insülini üreten tesiste şu 5 aşama göze çarpıyor:
 Fermantasyon
 Proses 1
 Proses 2
 Saflaştırma
 Son-Ürün
Glargin insülinin üretim sürecindeki basamaklar, hızlı uyarıcı insülinin üretim
sürecindeki basamaklardan özellikle saflaştırma ve son ürün basamaklarında oldukça
farklılık gösteriyor. Fermantasyon ve Proses safhaları ise iki süreç için de hemen hemen
aynıdır. Fermantasyon aşamasında, genetiği değiştirilmiş E.coli bakterisi ardışık
fermenterlerin içinde giderek artan bir kapasiteyle büyütülüyor ve kültür ediliyor. Bir
indükleyici (uyarıcı) eklenerek bu bakterilerin bir füzyon proteini üretmeleri sağlanıyor.
Füzyon proteini oluştuğunda, dezenfektan kullanılarak bakteriler öldürülüyor. Bu kısım
genetiği değiştirilmiş bakterinin kültür edilmesi ve sonra öldürülmesi Genetic
Technology Act tarafından yapılıyor ve işin genetik mühendisliği kısmı olarak
adlandırılıyor (28).
Bakteriler öldürüldükten sonra, kalan süspansiyon sentrifügasyon ile daha konsantre
hale getiriliyor ve çözülüyor (dağıtılıyor). Dağıtım aşamasından sonra, ağır olan füzyon
proteini sürekli sentrifügasyon (continuous centrifugation) ile diğer hücre birimlerinden
ayrılıyor, iki kez su ile yıkanıyor ve izole ediliyor. Molekülün katlanması (folding)
füzyon proteininin doğal 3 boyutlu yapısını alması bir sonraki basamakta gerçekleşiyor.
Bu olay füzyon proteininin sulu üre çözeltisi içerisinde sisteinin (cystein) varlığında
çözünmesiyle oluyor. Yan ürünler pH değişimi ile çöktürülüp, sentrifügasyonla
ayrıştırılıyor. Saflaştırma aşamasında, glargin insülin adzorpsiyon (yüzeyde tutulma)
dezorpsiyon (yüzeysel salınım) yöntemleriyle üre ve inorganik tuzlardan arındırılıyor ve
eş zamanlı olarak da yoğunlaştırılıyor. Dezorpsiyon sulu propanol çözeltisi ile yapılıyor.
Bu aşamadaki ham ürün kromatografik yöntemlerle iki proses aşamasında daha da
saflaştırılıyor. Sonra, kristalize ediliyor, emme gücüyle filtreleniyor ve geçici olarak
nemli kristaller halinde depo ediliyor. Yüksek saflıktaki glargin insülin kristalleri
30
yeniden çözülüyor ve daha homojen gruplar (yığınlar) elde etmek için kristaller
dondurularak kurutuluyor. Son ürün işlemleri ise Class C steril oda şartlarında
gerçekleştiriliyor (28).
4.9.2.Zorlu Üretim Süreci
Tüm süreç boyunca, deiyonize olmuş su veya saf su kullanılıyor. Mikrobiyolojik ve
fiziko-kimyasal kalitesi rutin olarak kontrol ediliyor. Ozon kullanıldığı noktaya
ulaşmadan önce, UV ışınlarıyla sudan uzaklaştırılıyor. Bu su tüketicilere ring boru
sistemiyle ulaştırılıyor. Pirojensiz (pyrogen-free) saf su ultrafiltrasyonla elde ediliyor ve
sadece son iki basamakta kullanılıyor (saflaştırma ve son ürün).Ayrıca, tüm ham
maddeler ve yardımcı materyaller (çözeltiler, asitler, bazlar, tampon çözeltiler)
farmasötik kalitede ve ihtiyaca cevap verecek nitelikteler. Bunlar da düzenli olarak
kontrol ediliyor. Çözücü, propanol, kullanımdan sonra damıtılıyor ve sürece geri
gönderiliyor. Kullanılan nitrojen ise kontaminasyonu önlemek için HEPA filtresinden
geçirilerek saflaştırılıyor. Sürecin bütün basamakları, birbirine borularla bağlı kapalı
tanklar içerisinde gerçekleşiyor. Bu sayede ürünün manüel kullanımı minimuma
indiriliyor. Tanklar ve borular, belirli bir yüzey pürüzlülüğüne sahip aşınmaya dayanıklı
paslanmaz çelikten yapılıyor. Bu da temizliğin sağlıklı ve sorunsuz yapılmasını sağlıyor
(28).
31
Şekil 21: Propanol damıtma tesisi, fermentasyon binası ve tank deposunun görünümü
4.9.3.Proses Görüntüleme ve Dökümantasyon
Bir glargin insülin üretim tesisinin kalbi yüksek kapasiteli yaklaşık 18,000 kalem girdi
ve çıktıyı görüntüleyip kontrolünü yapabilen bir proses kontrol sistemidir. Bütün kaliteli
aletler, işleme kondukları zaman önce kalibre edilirler. Bu kalibrasyon belirli zaman
aralıklarıyla tekrarlanır. Süreç içerisinde ara ürünler dahi, beklenilen kaliteyi sağlayıp
sağlamadığı ile ilgili teste tabi tutulurlar (şekil 23) (28).
Bütün süreç ve analitik veriler ister rutin operasyon sonucu gelsin isterse sapmalardan
kaynaklansın proses kontrol sisteminde ya da laboratuar bilgi işletim sisteminde (LIMS)
depolanıyor (28).
Bu proje Aventis’in geliştirdiği ve pilot tesis seviyesinde test ettiği bir süreçle başladı.
İnsülin üretimi için daha önceden tamamlanmış benzer bir projenin yapısının
kullanılması önemli ipuçları sağlamıştır. Tam da bu aşamada tesisi dizayn edenlerden
beklenen tecrübelerini konuşturmaları ve dizayn sürecinin içerisinde özellikle de proses
optimizasyonu, orantılı büyütme ve belirlenmiş ürün konsepti konularında aktif olarak
yer almalarıydı (28).
32
Planlamada esas
önemli
olan ürünün tekrarlanabilir şartlar altında üretilip
üretilmediğidir. LKCA bu proje için 12 işçi görevlendirmiştir. Bu ekip başlangıçtaki
tesis konseptini geliştirmek için Aventis proje ekibiyle tam 3 ay beraber çalışmışlardır.
Bu planlama aşamasında proses teknolojisini aşağıdaki gereksinimlerle bir ahenk
içerisine sokmak önemliydi:
 Bina mimarisi
 Steril
oda
sınıflandırması
ve
HVAC
(heating-ventilation-air
conditioning)
 Lojistik ve depolama
 Bilgi teknolojisi ve proses kontrolü
 Fonksiyonel tanımlamalar
 Ürün kalitesi ve GMP (good manufacturing practise) konsepti
Tesis bazlı dizayn planı kuruldu. Proses bazlı dizayn ilkeleri (şekil 22) (28) :
 Fonksiyonel plan
 Bina konsepti
 Tesis dizaynı, mevcut alt yapıya bağlı olarak
Bu süreç çok önemli olduğu için, yapım kontratı ve FEPA kontratı için istenen belgeler
bir an önce hazırlandı ve ilgili birimlere teslim edildi (28).
Konsept dizaynı ise şu temellere dayanıyordu:

Kritik tesis alanlarının yerleşim çalışmaları

Madde sağlanması ve atılması, elektrik düzeni, ölçümler, kontrol
teknolojisi için yerleşim dizaynı

Materyal, personel ve ürün akışı için lojistik konseptler (28).
33
Şekil 22:Depolayıcı özelliğe sahip, genetiği değiştirilmiş insülin türevi üretimi
için gerekli olan tesisin 3-boyutlu dizayn modeli ve yapısal planı
Şekil 23:Ana ürünlerin teste tabi tutulduğu kısım
34
Şekil 24: Höchst Industrial Park’ta bulunan Aventis Lantus tesisinin güneydoğusuna bir
bakış
35
5.TARTIŞMA VE SONUÇ
Yirminci yüzyıl, geleneksel biyoteknolojinin modern biyoteknolojiye dönüştüğü ve
insanoğlu için, yepyeni ufukların açıldığı bir yüzyıl olup, farmasötik biyoteknoloji
açısından en önemli iki gelişme ise Rekombinant DNA Teknolojisi ile hibridoma teknolojisi
olmuştur (6).
Türkiye biyoteknoloji konusunda, yetişmiş eleman, laboratuar altyapısı ve araştırma
olanaklarındaki yetersizlikler nedeniyle geride kalmıştır. Üniversitelerde 1996 yılından
bu yana moleküler biyoloji ve genetik konusunda lisans eğitimi verilmeye başlamıştır.
Araştırma-geliştirme için ayrılan fonlar yetersiz olmakla birlikte son yıllarda bir gelişme
olduğu belirtilmektedir. Araştırma sayısının ve niteliğinin artmasını engelleyen bir
neden de çalışmalarda kullanılan maddelerin çok maliyetli olmasıdır (31).
1982 yılında, ilk kez insan insülini ile ilaç pazarına giren terapötik proteinler günümüzde
sayı olarak elliyi aşmıştır. Ayrıca halen 300'den fazla terapötik protein preklinik ve klinik
araştırmalar aşamasında olup önümüzdeki 10 yıl içinde her yıl bir düzine yeni terapötik
proteinin ruhsatlandırılması beklenmektedir. Uzun yıllardır kullanımda olan insülin,
eritropoietin, interferon-alfa, interferon-beta, filgrastim (koloni uyarıcı faktör) ve büyüme
hormonu yanında, son yıllarda monoklonal antikor türü ilaçlarla, rekombinant kan
faktörleri ve rekombinant enzimlerin de ruhsatlandırılması başlamıştır. Önümüzdeki
yıllarda özellikle büyüme faktörleri ve monoklonal antikor grubuna ait ilaç sayısının hızla
artması beklenmektedir, insan genom projesinin tamamlanması ile önümüzdeki 15-20 yıl
içinde kullanıma sunulan terapötik protein sayısının bir kaç yüze ulaşması şaşırtıcı
olmamalıdır. Bu nedenlerle, terapötik proteinler, gerek eczacılık uygulamalarında, gerekse
sağlık ekonomisinde giderek önem kazanmaktadır. Terapötik proteinler rekombinant
DNA teknolojisine dayalı olarak bakteri, maya veya memeli hayvan hücrelerinde
üretilmekte ve tamamına yakını parenteral ilaçlar olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçlar
patentle korunmakta olduklarından, gelişmiş ülkelerde orijinal ilaçlar olarak üretilmekte
ve yüksek fiyatlarla tüketiciye sunulmaktadır. Ancak bu ilaçlardan yaygın olarak
36
kullanılanları, patent koruma sisteminin dışında olan bazı Asya ve Latin Amerika
ülkelerinde jenerik olarak üretilmeye başlanmıştır. Jenerik terapötik proteinler, diğer
jenerik ilaçlarda olduğu gibi, çok daha ucuz fiyatlarda satıldıklarından, özellikle
gelişmekte olan ülkelerde, orijinal ilaçların yerini almaya başlamışlardır. Türkiye'de halen
25 terapötik protein ruhsatlandırılmış bulunmaktadır. Ülke ihtiyacı tamamıyla, orijinal
ürünlerin ithalatı yolu ile karşılanmakta olup, jenerik ürünlerin ithalatı henüz söz konusu
değildir. Ülkemizde, halen kullanılmakta olan terapötik proteinler patent koruması altında
değildir, yani bu tür ilaçların Türkiye'de jenerik olarak üretimi veya ruhsatlandırılmasının
önünde herhangi bir yasal engel yoktur. Bu önemli avantaja rağmen, bazı Asya ve Latin
Amerika ülkelerinin aksine, ülkemizde jenerik terapötik protein üretimi henüz söz konusu
değildir. Bunun en önemli nedenleri arasında, bu tür ürünlerin üretim ve ruhsatlandırılması
konusunda yasal düzenlemelerin yapılmamış olması, ilaç sanayimizin ileri teknoloji
ürünlerine yabancı kalması ve innovatif firmalarca pazarı koruma amacıyla gerçekleştirilen rekabet faaliyetleri yer almaktadır. 1998 yılında 16 milyar dolar olan küresel
terapötik protein pazarı her yıl ortalama %20 büyüyerek 2002 yılı sonunda 33.3 milyar
dolara ulaşmıştır. Bugüne kadar ki hızlı büyümenin lokomotif ürünleri eritropoietin ve
insülindir. Uluslararası güvenilir kaynakların tahminlerine göre, bu pazar yıllık
ortalama %9'luk büyüme hızı ile 2010 yılında 59 milyar dolarlık büyüklüğe
ulaşacaktır. Bu süreçte, eritropoietin ve insülin önemli ürünler olmaya devarn edecek
ancak monoklonal antikorlar, terapötik aşılar ve interferonlar, yüksek büyüme oranları
ile sektörde önemli boyutlara ulaşacaktır (6).
Dünyanın her yerinde bilimsel araştırma kurumlarının ve yüksek teknoloji şirketlerinin
laboratuarlarında, çok çeşitli malzeme ve tekniklerle, çok çeşitli rDNA araştırmaları
yürütülmektedir. rDNA tekniğinin bulucularından biri olan Herbert Boyer ile Robert A.
Swanson'un 1973 yılında kurdukları özel biyoteknoloji şirketi olan Genentech, 1977
yılında, kandaki glikojen (şeker) oranını düşüren insülin hormonunu sentezleyen Gani,
rDNA tekniğiyle E.coli'ye sokarak, bu bakteriye sentezletip, sonra da üretilen insülini
yalıtlamayı başardıklarını duyurmuşlardır. İnsülin gerekli testlerden geçirilip gerekli
izinleri alarak, 1985'de pazara sürülen ilk çağdaş biyoteknoloji ürünü, daha özgül olarak
söylersek ilk rDNA tekniği ürünü olmuştur. Rekombinant DNA tekniğinin önemini ve
gizli gücünü kavramak için insülinin daha önce nasıl sağlandığına bakmak yetecektir.
İnsülin daha önce sığır ve domuz pankreaslarından bin bir güçlükle ekstre edilen bir
biyokimyasal madde olup yalnızca ABD'de ki şeker hastalarının gereksinim duydukları
37
miktarın toplanabilmesi için 80 milyon pankreasın harcanmasını gerektiriyordu.
Bedenin üç saniye gibi kısa bir sürede sentezleyebildiği bu maddenin kimyasal yollarla
sentezi ise ancak üç yıl süren, birbirini izleyen 223 kimyasal tepkimeden sonra
gerçekleştirilebilmiştir (30).
Sonuç olarak insülin preparatları şeker hastalarının tedavisinde kullanılan mucizevi bir
üründür. Kullanım şekilleri gelişen teknoloji ve hız verilen AR-GE çalışmaları
sayesinde gün geçtikçe insanların daha rahat ve güvenli kullanabilmelerine olanak
sağlanacağı tahmin edilmektedir.
38
KAYNAKLAR
1. Erişim: [http://makinecim.com/bilgi_1586_Insulin-Uretimi] Erişim tarihi 3
Nisan 2011.
2. Pandey S, Suba N. Recombınant DNA Technology. Applıcatıons In The Fıeld of
Bıotechnology and Crıme Scıences 2010;(1):1:43-49
3. Erişim:
[http://www.ctf.edu.tr/anabilimdallari/pdf/517/Insulin_Tedavisi.pdf]
Erişim tarihi 5 Mart 2011.
4. ANONİM, 2005. Erişim: [www.zmo.org.tr] Erişim tarihi 9 Aralık 2010.
5. Yıldırım N.A,Genetiği değiştirilmiş ürünlerin mevcut yapısı ve Adana ‘daki
tüketicilerin bilgi düzeyleri, yüksek lisans tezi, Çukurova Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü,Adana 2006:56.
6. Balta E. Biyoteknolojik ürünler, TEB haberler dergisi.2007; (4): 8-13
7. Paıllotın G. The Impact of Biotechnologyon the Agro-Food Sector, Future of
Food Dergisi, 1997:71.
8. Paarlberg R. The Global Food Fight.Foreign Affairs Dergisi, Mayıs/Haz.
2000;24.
9. Ekici A, Timur M ve Bağış H. Transgenik canlılar ve aküakültürdeki önemi.
EÜ Su Ürünleri Dergisi. 2006; 23: 211-214
10. Ekinci M.S, Akyol İ, Karaman M. ve Özköse E. Hayvansal biyoteknoloji
uygulamalarında güncel gelişmeler. KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 2005;(8):
89-95.
11. Karakaya H. Moleküler Genetik, İstanbul Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim
Dalı-Biyofizik Ders Notları
12. Beldüz A.O. 2008 yılı Moleküler Biyoloji Ders Notları Wikipedia.org
13. Lippincott’s Illustrated Review: Biochemistry, second Edition, by Pamela C.
Champe and Richard A, Harvey, J.B. Lippincott company, PA 1994;269-277
39
14. Millar DJ, Dawnay AB. Heat sterilization of PHD fluid promotes advanced
glycation end product (AGE) formation. J Am Soc Nephrol 1995;6(3):551
15. Erişim: [http://tr.wikipedia.org/wiki/%C4%B0ns%C3%BClin] Erişim tarihi 16
Eylül 2010.
16. Erişim: [ http://www.odevarsivi.com/dosya.asp?islem=gor&dosya_no=90091]
Erişim tarihi 23 Eylül 2010.
17. McCall C. Taming the beast of Diabetes. The Washington Times
Washington,1992;432
18. Kammermayor K. and Clark V.L.Genetic Engineering Fundamentals, An
introduction to Principles & Applications. Marcel Decker Inc, 1989; 502.
19. Gündoğdu N.Ü.İnsülin keşfinin 80.yıl dönümü nedeni ile diyabet hastalığı ve
insülin keşfinin tarihi, Başkent Üniversitesi, p 104-107
20. Hayward G. Applied Genetics, University of Bath. Thomas Nelson and Sons
Ltd, Edinburgh 1991; 542.
21. Hilson R. Diabetes, a Beyond Basics Guide. Methuen, Melbourne 1987; 321.
22. Hmge. Human insulin from second generation genetic engineering, Novo.
Insulin, Grolier Electronic Publishing Inc. 1992; 234-237.
23. Erişim: [http://www.sekerhastaligi.info/insulin_kullanimi.htm] Erişim tarihi 24
Şubat 2011.
24. Morris B. Genetic Engineering. Science in Action 1998; 342
25. Serjeartson S. The Genetics of Diabetes, John Curtin School of Medical
Research
26. Wibon J, Tooze J, Hetz D. Recombinant DNA -A Short Course, Scientific
American Books USA,1983; 468.
27. "Tryptophan Summary" by John B. Fagan, November 1997, retrieved 27
October 2006; 506
28. Peter J. Mendelsohn Planning and Construction of Complete Pharmaceutical
Plants, Biotechnology Plant for Insulin Production Linde Technology
2004;(1):9-14
40
29. Walsh G. Pharmaceutical Biotechnology concepts and applications, England,
2007; p 297-300
30. Kulïlı Ö, Gürel O. "En Uzun Tepkime", Cumhuriyet Bilim Teknik, sayı 39
(1987); 13.
31. Kaya Z, Tolun A.A. Transgenik Organizma Kullanımının Sonuçları, Bilim ve
Teknik Dergisi, Eylül 2000; 52.
41
ÖZGEÇMİŞ
1988 yılında Nevşehir’de doğdum. İlköğretim eğitimimi Nevşehir’de tamamladım.2005
yılında Kayseri Şeker Lisesi’ni bitirdim.2006 yılında Erciyes Üniversitesi Eczacılık
Fakültesini kazandım.
İletişim:
Tel. no: 555 624 98 03
E mail : ecztolgaaytan@gmail.com
Download