Tolga Aytan - Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi
advertisement
1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ İNSÜLİNİN BİYOTEKNOLOJİK ÜRETİMİ Hazırlayan Tolga AYTAN Danışman Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2011 KAYSERİ i “İnsülinin Biyoteknolojik Üretimi” adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Tolga AYTAN Danışman Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji ABD Başkanı Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ONAY: Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı’nın ………....… tarih ve …………..…… sayılı kararı ile onaylanmıştır. ………. /……../ ……… Prof.Dr. Müberra KOŞAR Dekan ii TEŞEKKÜRLER Bitirme ödevim boyunca bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım değerli hocam Doç.Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ‘e Bitirme ödevimi hazırlamamda bana destek olan değerli hocam Berrak BAŞAK DUMLUPINAR ‘a Bitirme ödevimi hazırlamamda bana destek olan değerli arkadaşım Muhammed DOĞAN ‘a Öğrencilik yaşamım boyunca hiçbir emeklerini esirgemeden bana gösterdikleri sabır ve destek için aileme sonsuz teşekkür ederim. iii İNSÜLİNİN BİYOTEKNOLOJİK ÜRETİMİ ÖZET Yirminci asrın harika ilacı ve hormonu olan insülinin keşfinin 84. yılındayız. İnsülin sadece şeker hastalarında kan şekeri düzenleyicisi değildir. Bunun yanı sıra; gelişme, büyüme ve yenilenme fonksiyonlarını da dolaylı yoldan etkileyici bir güce sahiptir. Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken son 10 yıl içinde yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakteriler ve mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri sağlanmıştır. Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır. Rekombinant insan insülini Escherichia coli veya mayalarda proinsülin kodlayan genin klonlanması ile üretilmektedir. Proinsülin bu bakteri veya maya hücrelerinde üretildikten sonra saflaştırılır ve enzimatik işlemlere tabi tutularak insan insülini elde edilir. Anahtar Kelimeler: İnsülin, Rekombinant DNA, Biyoteknoloji iv BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF INSULIN ABSTRACT We are in the 84th year of discovery of insulin which is the wonderful medicine and hormone of 20th century. Insulin is not a hormone that only regulates the blood glucose in diabetics. Besides this, it has a power of effecting the growth, development and renewing functions by indirect ways. The first produced insulin preparation were obtained from animal pancreas , but in the last decade, human insulin has been obtain by using semi synthetic ways and then by injecting human insulin gene into bacteria and yeast, it has been provided them to produce human insulin gene via genetic engineering. Today biosynthetic human insulin is produced by using recombinant DNA technology, and it is commonly used by diabetics. The recombinant DNA technology is the total of the techniques of the studies that aim to insert a gene, which has been insulated from a living thing by any way, into an appropriate host and then provide it to be reproduced there and sometimes to be expressed there. The recombinant human insulin is produced by cloning the gene that codes the Escherichia coli or proinsulin in yeast. After proinsulin is produced in this bacteria or yeast cells, it is purified and then by subjecting it into enzymatic processes, human insulin is obtained. Key Words: Insulin, Recombinant DNA, Biotechnology v İÇİNDEKİLER KABUL ONAY ................................................................................................................. i TEŞEKKÜR ...................................................................................................................... ii ÖZET ............................................................................................................................... iii ABSTRACT .................................................................................................................... iv İÇİNDEKİLER ................................................................................................................ v KISALTMALAR ........................................................................................................................ vii ŞEKİLLER VE TABLOLAR DİZİNİ .......................................................................... viii 1.GİRİŞ VE AMAÇ ........................................................................................................ 1 2.BİYOTEKNOLOJİ ...................................................................................................... 2 2.1.Biyoteknoloji nedir ..................................................................................................... 3 2.2.Biyoteknolojik tanımlamalar ....................................................................................... 3 2.2.1.Modern Biyoteknoloji ..................................................................................... 3 2.2.2.Moleküler Biyoloji .......................................................................................... 4 2.2.3.Bitkisel Biyoteknoloji ..................................................................................... 4 2.2.4.Biyogüvenlik ................................................................................................... 4 2.2.5.Gen Teknolojisi ............................................................................................... 4 2.2.6.Biyolojik Çeşitlilik .......................................................................................... 4 2.2.7.Rekombinant DNA (Deoksiribonükleik Asit) ............................................... 4 2.2.8.Rekombinant DNA Teknolojisi ...................................................................... 4 2.3. Farmasötik biyoteknolojinin tarihsel gelişimi............................................................ 5 2.4 Biyoteknolojik ilaç çeşitleri ........................................................................................ 7 3.REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ .................................................................. 8 vi 3.1. Gen izolasyonu ........................................................................................................................... 11 3.2. Uygun gen faşıma aracı (Vektör) .................................................................................. 11 3.3. Genin hücreye sokulması................................................................................................... 13 3.4. Geni içeren hücrenin seçimi .................................................................................................... 13 4.İNSÜLİN ..................................................................................................................... 14 4.1.İnsülin nedir .............................................................................................................. 14 4.2.İnsülinin tarihçesi ..................................................................................................... 15 4.3.İnsülinin yapısı kimyası ve biyokimyası .................................................................. 16 4.4.İnsülin sentezinin doğası ve amacı ............................................................................ 17 4.5.İnsülin üretimi ........................................................................................................... 19 4.6.İnsan insülini sentezinin basamakları........................................................................ 20 4.7.Rekombinant DNA teknolojisi ile insülin üretimi .................................................... 20 4.7.1.Vektör (Gram Negatif E. coli) .................................................................... 22 4.7.2.Genetik Mühendislerinin Araç Kutusu İçindekiler ...................................... 23 4.7.3.Humulin Üretimi .......................................................................................... 24 4.8.Genetik Olarak İşlenen Rekombinant İnsan İnsülininin Biyolojik İçerikleri .......... 27 4.9.İnsülin üretimi için biyoteknolojik tesisler ............................................................... 27 4.9.1.Yeşil Alan Üzerinde Bağımsız Bir Tesis ................................................... 28 4.9.2.Zorlu Üretim Süreci ................................................................................... 30 4.9.3.Proses Görüntüleme ve Dökümantasyon .................................................. 31 5.TARTIŞMA VE SONUÇ........................................................................................... 35 6. KAYNAKLAR .......................................................................................................... 38 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 41 vii KISALTMALAR EPA : Plazminojen aktivatör EPO :Eritropoitein HAT : Hipoksantin, Aminopterin ve Timin HVAC : Isıtma- Havalandırma- Klima tesisatı G-CSF :Granulosit koloni stimule edici faktör GMP : İyi İmalat Uygulamaları IGF1 :Growth factor 1 IGF2 :Growth factor 2 LIMS :Labaratuvar bilgi işletim sistemi LKCA : Linde Tesisi İnşası PCR :Polimeraz zincir reaksiyonu viii TABLO VE ŞEKİL DİZİNİ Tablo 1:Biyoteknolojik yöntemlerle üretilen ve Dünyada en çok satılan 12 terapötik protein türü ilaç ...........................................................................................................7 Şekil 1:Rekombinant DNA’ların üretilmesi .................................................................. 10 Şekil 2:cDNA eldesi ....................................................................................................... 12 Şekil 3: İnsülin zinciri .................................................................................................... 16 Şekil 4: B insülin zinciri için gerekli özel nükleotid zinciri ile birlikte sarılmış DNA .. 16 Şekil 5: Diyabetik kişinin kan glikoz seviyesindeki yükselme ve alçalmalar (dalgalanmalar) sağlıklı bireyler ile karşılaştırılması .......................................... 18 Şekil 6: Rekombinasyon (yeniden birleştirme) işlemine genel bir bakış ....................... 19 Şekil 7: İnsülinin B zincirinin kodlanması için gerekli olan ve açığa çıkan nükleotidler ile birlikte DNA 11. kromozomunun çözülme ipliği .......................................... 20 Şekil 8: Açığa çıkan DNA iplikçiği ................................................................................ 21 Şekil 9: (m)RNA iplikçiği .............................................................................................. 21 Şekil 10: Ribozomdaki tercüme işlemi ........................................................................... 21 Şekil 11: Taşıyıcı RNA molekülleri kodonların bağlandığı özel amino asit .................. 22 Şekil 12: E. coli hücresi içine insülin tanıtılması ........................................................... 22 Şekil 13: Vektörlerin plazmidlerinin elektron mikroskobu ile görünüşü ....................... 23 Şekil 14: İnsülin üretimi ................................................................................................. 24 Şekil 15: İnsan insülini yapısı. amino grup asit RNA’dan DNA’ya dönüşüm ............... 24 Şekil 16: A ve B zincirlerinin E.coli plazmidleri içine yerleştirilmesi ........................... 25 Şekil 17: Mitosiz İşlemi .................................................................................................. 26 ix Şekil 18: A veya B zinciri ile birleşen beta-galaktosidaz ............................................... 26 Şekil 19: İnsan İnsülini Molekülü .................................................................................. 27 Şekil 20: Lantus Aventis at the Höchst Industrial Park. ................................................ 28 Şekil 21: Propanol damıtma tesisi, fermentasyon binası ve tank deposunun görünümü 31 Şekil 22: Depolayıcı özelliğe sahip, genetiği değiştirilmiş insülin türevi üretimi için gerekli olan tesisin 3 boyutlu dizayn modeli ve yapısal planı ......................... 33 Şekil 23: Ana ürünlerin teste tabi tutulduğu kısım. ........................................................ 33 Şekil 24: Höchst Industrial Park’ta bulunan Aventis Lantus tesisinin güney doğusuna bir bakış ............................................................................................................ 34 1 1.GİRİŞ VE AMAÇ İnsülin, insüline bağlı Diabetes Mellitus'un tedavisi için gereklidir. Daha önceki yıllarda insülin sığır veya domuz pankreasından elde edilmekteydi. Fakat bu insülin insan insülininden kimyasal olarak farklılıklar taşıyordu. Şeker hastalarında bu insülinle tedavi sonrası antikorların oluşması, insülinin biyosentezinin rekombinant DNA teknolojisiyle eldesinin önemini daha da arttırmıştır (1). Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken (sığır, domuz ya da sığır/domuz karışımı) son 10 yıl içinde yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş (Hayvanlardan elde edilen insülin biyolojik ve kimyasal reaksiyonlarla insanın ürettiği insülinle aynı hale getirilmiş) ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakteriler ve mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri sağlanmıştır. Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır (1,2). 1980’lere kadar, bütün insülinler inekler ve domuzlar gibi hayvanlardan elde ediliyordu. Bu ilacın bu formu hala çok kullanışlı olmasına rağmen, şimdi insan insülinin aynısını ekmek mayası gibi hücreleri kullanarak üretmek mümkün hale gelmiştir. Bunlar “biyosentetik” insülinler olarak adlandırılır (1,2). İnsülinler en basit biçimde kısa, orta ve uzun etki süreli olmak üzere etki sürelerine göre sınıflandırılabilirse de unutulmaması gereken nokta enjekte edilen insülinin emilimi aynı kişide %25 oranında, kişiler arasında ise %50'ye varan oranda değişkenlik gösterebilir (3). İdeal olan insülinine benzer insülinleri kullanmaktır. Elde edilme biçimine göre iki çeşit insan insülini vardır. Domuz insülininin insan insülinine benzeyecek şekilde değişime uğratılmasıyla elde edilen yarı sentetik insülinler ve insan vücudunun yaptığı insülinin 2 yapısı ile aynı olacak şekilde genetik mühendislik teknikleri ile üretilen rekombinant (biyosentetik) insan insülini vücudumuzun ürettiği insülinine tamamıyla benzer olduğu için kullanıldığında vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinine göre çok daha azdır (1). İnsan insülini insanlardan elde edilmez, insan vücudunun yaptığı insülin moleküler yapısı ile aynı olacak şekilde üretilir. En modern insülin tipidir ve laboratuvar koşullarında bazı kimyasal metodlar kullanılarak elde edilir. İnsan insülini vücudumuzun ürettiği insülinin tamamiyle aynısı olduğu için vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinlerine göre çok daha azdır (1,2). 3 2.BİYOTEKNOLOJİ 2.1.Biyoteknoloji nedir Biyolojik süreçlerin insan yaşamında kullanımı insanlık tarihi kadar eski bir geçmişe dayanır. Bu anlamda geleneksel biyoteknoloji, insan toplulukları tarafından içerisindeki bilimsel mekanizma bilinmeden, yazılı tarihin başından bu yana ekmek yapımında, alkollü içeceklerin mayalandırılmasında, tarım bitkilerinin ve evcil hayvanların ıslahında yüzyıllardır uygulanmaktadır. Başlangıçta zanaatsal bir yaklaşımla kullanılan bu süreçlerin temel biyolojik bilimlerde 18. yüzyılda ortaya çıkan gelişmelere koşut olarak bilimsel ve teknolojik kontrolü devreye girmiştir. 1919 yılında Karl Ershy tarafından biyoteknoloji “biyolojik sistemlerin yardımıyla ham maddelerin yan ürünlere dönüştürüldüğü işlemlerdir” şeklinde tanımlamıştır. Moleküler biyoloji ve moleküler genetik bilimlerinde 1950’li yıllardan itibaren ortaya çıkan gelişmeler, 1970’li yıllarda biyoteknoloji alanında meyvesini vermeye başlamıştır. Buna bağlı olarak da moleküler düzeyde yapılan genetik manipülasyonlarla verimliliğin ve üretkenliğin arttırıldığı, yeni ürünlerin üretebildiği görülmüştür. Bu gelişmelere paralel olarak biyoteknolojinin tanımı değişikliğe uğrayarak; “biyolojik sistem ve canlı organizmaları veya türevlerini kullanarak, özel bir kullanıma yönelik olarak ürün veya işlemleri dönüşüme uğratmak üzere geliştirilen teknolojik uygulamalar” şeklinde tanımlanmaya başlanmıştır (4). 2.2.Biyoteknolojik tanımlamalar 2.2.1.Modern Biyoteknoloji: Geleneksel olmayan ve modern bilgi ve tekniklerin uygulanmasıdır. Bu tanımlama zaman zaman sadece genetik mühendisliğine dayanan tekniklerle gerçekleştirilen biyoteknolojiyi tanımlamakta da kullanılmaktadır (5). 4 2.2.2.Moleküler Biyoloji: Biyolojinin bir alt alanını kapsayan bu tanım, canlıların ve biyolojik olguların moleküler düzeyde (çoğu kez DNA, RNA ve protein düzeyinde) tanımlanmasına yönelik bilgi ve teknikleri kapsamaktadır (5). 2.2.3.Bitkisel Biyoteknoloji: Tarımsal ürünlerin hali hazırda, üretim sürecinde maruz kaldıkları çeşitli hastalık, zararlı ve yabancı ot problemlerinin verim üzerine bilinen olumsuz etkilerinin ortadan kaldırılması ile kalitelerinin yükseltilmesinde kullanılan, modern biyoteknoloji yöntemleri ile geliştirilmiş tohumların elde edilmesi ile uğraşan bilim dalıdır (5). 2.2.4.Biyogüvenlik: Modern biyoteknoloji tekniklerinin, uygulamalarının ve modern biyoteknoloji ürünlerinin insan sağlığı ve biyolojik çeşitlilik üzerinde oluşturabileceği olumsuz etkilerin belirlenmesi sürecini ve belirlenen risklerin meydana gelme olasılığının ortadan kaldırılması ya da meydana gelme durumunda oluşacak zararların kontrol altında tutulması için alınan tedbirleri kapsayan bir kavramdır (5). 2.2.5.Gen Teknolojisi: Bir canlı türüne başka bir canlı türünden gen aktarılması veya mevcut genetik yapıya müdahale edilmesi yoluyla yeni genetik özellikler kazandırılmasını sağlayan modern biyoteknoloji teknikleridir (5). 2.2.6.Biyolojik Çeşitlilik: Ekosistemlerin insanlığın gönenci için elzem olan yaşam destek sürecini sürdürebilme yeteneğinin ve sağlıklı çevrenin göstergesidir (5). 2.2.7.Rekombinant DNA (Deoksiribonükleik Asit): Yabancı DNA parçalarının eklenmesi, bazı DNA parçalarının çıkartılması ve benzeri yöntemlerle doğal diziliş sırası değiştirilmiş olan DNA’dır (5). 2.2.8.Rekombinant DNA Teknolojisi: Rekombinant DNA teknolojisi, çeşitli materyallerden genlerin izole edilmesi, genler üzerinde değişik manipülasyonların uygulanması, genlerin klonlanması ve daha sonra da araştırmalarda kullanılması gibi moleküler uygulamalar şeklinde tanımlanmaktadır. Bu teknolojinin kullanıldığı alanlardan bazıları; zararlılara karşı direnç sağlayan genlerin bitkilere transferi; bitkilere tuzluluk ve herbisitlere dayanıklılığı sağlayan genlerin transferi; bakterilere toksik atıkları temizleme özelliği kazandıran genlerin ilavesi; ürünlerin kalite ve veriminin artırılmasıdır (5). 5 2.3. Farmasötik biyoteknolojinin tarihsel gelişimi Bu tanıma göre biyoteknolojinin tarihini, insanoğlunun yerleşik düzene geçtiği on bin yıl öncesine kadar götürmek mümkündür. Yabani bitki ve hayvanların evcilleştirilmesi, bunların melezlerinin oluşturulması ile insanın gereksinimlerin uygun yeni türlerin geliştirilmesi, bugünkü genetik olarak değiştirilmiş bitki ve hayvanların geliştirilmesine örnek olan uygulamalardır. Diğer taraftan, bitkisel ve hayvansal ürünlerin (üzüm, süt, et gibi) fermantasyon gibi tekniklerle şarap, yoğurt, peynir veya pastırmaya dönüştürülmesi de biyoteknolojinin ilk örnekleridir. Ürün geliştirmede biyolojinin kullanımını, 1866'da başlayan Mendel'in bezelye deneylerine kadar götürmek mümkündür. Mendel'in bu gözlemleri, modern genetiğin temellerini oluşturmuştur. Modern biyoteknoloji ile ilgili belgelerde, bu teknolojinin başlama tarihi olarak 1979 kabul edilse de, rekombinant protein üretiminde bugün kullanılmakta olan fermantasyon teknolojisi ilk kez 1. Dünya Savaşında, mısır şekeri fermantasyonunda ve patlayıcı amaçlı aseton üretmek için kullanılmıştır. Aynı fermantasyon teknolojisi daha sonra, 2. Dünya savaşında, antibiyotik üretiminde kullanıldı ve böylece yüz binlerce insanın ölümü engellenebildi. 1869'da Friederich Miescher'in DNA'yı izole etmesi, 1928'de Alexander Flemming'in penisilini bulması, 1953'de James Watson, Francis Crick ve Rosalinda Franklin'in DNA'nın yapısını tanımlamaları, 1961 'de Marshall Nirenberg ve Gobind Khorana'nın genetik kodu çözmeleri, modern biyoteknoloji endüstrisine geçişte önemli kilometre taşlarını oluşturmuştur. 1970'ler de hücre bölünmesi ve protein yapısının anlaşılması, DNA kesici enzimleri ve polimerazları da içeren DNA replikasyon enzimlerin izolasyonuyla başlayan Walter Gilbert'in ilk rekombinant DNA deneyleri, 1975'de ilk hibridomanın yapılması, 1976'da ilk biyotek firması olan Genentech'in kuruluşu, 1982'de tanı amaçlı ilk monoklonal antikorun üretimi, yine aynı yılda insülinin ilk insan terapötik proteini olarak üretilmesi, bu yoldaki en önemli gelişmeler olmuştur (6). Modern biyoteknolojinin tedavi alanında uygulanabilirliği 1980'lerde kesinlik kazanınca, bundan 20 yıl kadar önce, başlangıcında çoğu ABD'de olmak üzere, "start-up" biofarmasötik şirketleri kurulmaya başladı. E.coli’de ilk gen nakli 1973 yılında Boyer ve Cohen tarafından gerçekleştirildi. Böylece modern biyoteknoloji bu iki yönteme dayalı olarak günümüzdeki gelişmiş düzeyine ulaşmıştır; zira, DNA zincirinin parçalara ayrılabilmesi ve çoğaltılarak mikroorganizmalara yerleştirilmesi olanaklı hale gelmiştir (7). 6 Bugün sayıları bir kaç yüzle ifade edilen bu şirketlerin çoğu girişimci moleküler biyologlar tarafından kuruldu. Dolayısı ile, bu küçük firmalar, biyoteknoloji arenasında kendilerine avantaj sağlayacak akademik ve teknik deneyime sahip olmalarına rağmen, ilaç üretim tecrübelerinin olmaması gibi önemli bir handikap taşımaktaydılar. Diğer taraftan, önde gelen farmasötik şirketleri ise, bu hızla büyüyen çok önemli teknolojinin yüksek potansiyelini önceleri fark edemeyerek modern biyoteknoloji alanına girmekte yavaş davrandılar. Zamanla, bu ikili sorun, küçük biyoteknoloji firmalarının büyük ilaç firmaları ile kurduğu ittifaklar yoluyla aşıldı. Örneğin, Genentech biyoteknoloji firması rekombinant insan insülinini geliştirdi. Eli Lilly bu ilacı Humulin® marka adı ile piyasaya sürdü. Son zamanlarda ise başarılı küçük biyoteknoloji firmaları, büyük ilaç firmaları tarafından, çok yüksek fiyatlarla satın alınmaktadır (6). 1980’li yıllarda, laboratuvar koşullarında DNA parçalarının kopyalarının üretilmesini sağlayan PCR yöntemi geliştirilmiştir. Günümüzde ilaç olarak kullanılan terapötik proteinlerin neredeyse tamamı, ya memeli hayvan hücresinde, ya E.coli'’de ya da Saccharomyces cerevisiae maya türünde üretilmektedir. Ancak, başka sistemler de terapötik protein üretimi için denenmektedir. Modern biyoteknoloji firmalarının başlattığı bu yeni akım, 20 yıl gibi kısa bir sürede 50'den fazla farklı terapötik proteinin hastaların kullanımına sunulmasını sağlamıştır. 1982'de insan insülininin E.coli'de üretilmesinden sonra, sayıları her yıl hızla artan bu ilaçlardan Protropin (1985), Intron A (1986-1992), Alferon N (1989), Activase (1990), Recoınbinate (1992), Epogen (1993), Procrit (1993), Orthoclon (1993), Betasemn (1993), Kogenate (1993), Cerezyme (1994), Nutropin (1994), Neupogen (1994) örnek olarak verilebilir. Toplam ilaç türlerinin binlere ulaştığı bir ilaç endüstrisinde, 50 yeni molekülün anlamının sınırlı olabileceği gibi bir kanıya kapılmadan önce, bu 50 kadar ilacın, kısa bir süre içinde yılda 30 milyar dolarlık bir paya sahip olduklarını hatırlamak gerekir. Tablo 1'de terapötik proteinler içinde satış rakamları açısından en önde yer alanların bir listesi sunulmaktadır (6,8). 7 Tablo 1:Biyoteknolojik yöntemlerle üretilen ve Dünyada en çok satılan 12 terapötik protein türü ilaç 2.4 Biyoteknolojik ilaç çeşitleri Biyoteknoloji, geliştirme veya ürüne dönüştürme aşamasında canlı organizmaların kullanıldığı bir teknoloji alanını ifade ettiği için, bugün geleneksel ilaçlar haline gelmiş olan hayvan kaynaklı (androjenler, östrojenler, kortikosteroidler vb.), bitkisel kaynaklı (atropin, morfin, kardiyak glikosidler, aspirin vb.) ve mikrobiyolojik kaynaklı ilaçlar (antibiyotikler vb.) biyoteknolojik ilaçlar kapsamında tanımlanmaktadır. Ancak, günümüzün biyoteknolojisi, yani modern biyoteknoloji, geleneksel biyoteknolojiden farklı bir konumdadır. Modern biyoteknolojiye dayanan yeni ilaçlar kısaca "biyofarmasötikler" olarak tanımlanabilir. Biyofarmasötikler ise iki ana sınıfta incelenebilir: küçük moleküllerden oluşan "kimyasal ilaçlar" ve daha büyük moleküllerden oluşan "terapötik proteinler" dir (6). 8 3.REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ Moleküler genetik araştırma tekniklerinin gelişmesi araştırıcılara farklı kaynaklardan yani organizmalardan gelen DNA moleküllerinin in vitro'da birleştirilebilme olanağı sağlamıştır. Farklı kaynaklardan gelen moleküllerin birleştirilmesi ile oluşan DNA moleküllerine rekombinant DNA denir ve kısaca rDNA olarak yazılır. Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislik teknolojisiyle kesilmesine ve elde edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir. Rekombinant DNA üzerinde restriksiyon endonükleaz analizleri, DNA dizileme ve yönlendirilmiş mutasyon gibi genetik analiz ve manipulasyonlar gerçekleştirilebilir. Bütün bu işlemleri yapmak için kullanılan tekniklerin tamamına rekombinant DNA teknolojisi denir. Bu teknik genetik mühendisliği olarak da adlandırılır. Bu alanda yapılan işlemler, kısaca genlerin herhangi bir organizmadan alınarak üretilmesi ve üretilen genlerin gerek temel, gerekse uygulamalı araştırmalar için kullanılması olarak özetlenebilir. Bu teknoloji bugün temel bilimler, tıp, endüstri, hayvancılık, ziraat, çevre mühendisliği gibi alanlarda yaygın bir biçimde kullanılmaya başlamıştır (9). Bu teknolojinin bilimsel temeli olan çeşitlenme (rekombinasyon) genetik bir olaydır ve doğada canlılar arasında görülen çeşitliliğin önemli nedenlerinden birini oluşturur. Rekombinasyon; farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler söz konusu olduğunda, anne babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya gelmesine yol açan olaylar dizisidir. Bu olay moleküler düzeyde, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alışverişi sonucunda meydana gelen yeni gruplamalardır. Bunun için DNA molekülleri arasında kırılmalar meydana gelir ve kırılma bölgelerinde DNA molekülleri arasında parça alışverişi oluşur. Sonuçta orijinal durumdaki DNA moleküllerine tam 9 olarak benzemeyen ve onlara ait nükleotid dizilerini kısmen taşıyan rekombinant DNA molekülleri oluşur (9,10). Homolog çeşitlenme (rekombinasyon), eşeyli üremeyle genelde mayoz bölünmedeki kromozomal parça değişimi sonucunda meydana gelir. Bakterilerde çeşitlenme farklı işleyişlerle, transformasyon konjugasyon ve trandüksiyon olaylarıyla görülür. Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında homoloji olmasına dayanmaktadır. Bu yüzden doğada çeşitlenme, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında kısıtlıdır. Farklı türler arasında var olan çeşitli düzeydeki eşleşme engelleri farklı türlere ait bireyler arasında genetik bilgi aktarımına, dolayısıyla da rekombinasyona olanak sağlamamaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinin tanımı ve kapsamı çeşitli toplumlara ya da bilim insanlarına göre farklılıklar göstermektedir. Bununla birlikte, bu değişik tanımlar arasında hepsindeki ortak yönleri birleştiren oldukça geniş ve günümüzün modern ölçütlerine uygun bir tanım şu şekilde yapılabilir: Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır (11). Belirli bir amaç için doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan bu teknolojiyle, in vitro şartlarda genetik materyalde planlı değişiklikler yapılabilmekte, istenilen genlerin istenilen canlıya sokularak, doğal biçimde bulunmadığı bu konakta çoğaltılması ve istenilen ürünü vermesi için nakledilen genin ifadesi sağlanabilmektedir. Bu teknolojiyle, prokaryotik ve ökaryotik gruplara ait türlerin kendi aralarında olduğu kadar, gruplar arasında da gen aktarımları yapmak ve çeşitlilikler meydana getirmek mümkün olmaktadır. Transgenik hayvanlar kendi genomunda başka bir organizmaya ait rekombinant bir geni taşıyan hayvanlar olarak tanımlanmaktadır (10,11). 10 Şekil 1: Rekombinant DNA’ların üretilmesi Rekombinant DNA teknolojisindeki süratli gelişme gen aktiviteleri ile ilgili çalışmalar yapmak için yeni fırsatlar ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği alanında yapılan çalışmalarda, gen aktarım teknolojilerinin önemi gün geçtikçe artmaktadır. Çiftlik hayvanlarına gen transferi; elde edilen yavru sayısı, süt miktarı, yapağı miktar ve kalitesi, yemden yararlanma kabiliyeti ve hastalıklara direncin yükseltilmesi amacı ile yapılmaktadır. Önemli bir diğer hedef ise transgenik hayvanların organ vericisi haline getirilmesidir. Rekombinant DNA tekniği geliştirildiğinde, sadece genlerin organizasyonu, düzenlenmesi ve mutasyonlar gibi, temeli akademik çalışmalara dayanan araştırmalar için kullanılırdı. Bilim adamları, bu teknolojiden yararlanarak endüstriyel uygulamasını da bulmuşlar ve bugün biyoteknoloji adı altında tıp, kozmetik ve tarım gibi farklı alanla da ekonomiye milyarlarca liralık katkısı ile önemli bir endüstri doğmuştur (9). 11 Rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak bir genin klonlanması 4 aşamada gerçekleştirilebilir. Gen klonlanması ise şöyle tanımlanabilir: Önemli bir ürünün yani hedef DNA bölgesinin bir vektör ile birleştirilerek özel konak hücreler içinde çok sayıda kopyasını elde etme işlemidir (11,12). 3.1. Gen izolasyonu a) mRNA'sından komplementer DNA (cDNA)’ nın sentezlenmesi, b) Gen kütüphanelerinin kullanılması: Aranan genin etiketli kopyası ya da etiketli mRNA'sı elde mevcutsa tüm genomu parça parça içeren klonlar arasından aranan geni içeren klon tespit edilip, bol miktarda gen izolasyonunda kullanılabilir (9,10). 3.2. Uygun gen taşıma aracı (Vektör) a) Plazmidler: Konak E.coli hücresi içerisinde çoklu kopyaları bulunan 2kb200kb ebatlı küçük kromozomdan ayrı olarak bulunan dairesel moleküllerdir. En çok kullanılan pBR322 plazmiti Ampisilin ve Tetrasiklin antibiyotiklerine direnç bölgeleri içerir. Pek çok restriksiyon enzimi için tek bir kesme yerine sahip olup, 6000 bp'e kadar yabancı DNA parçaları taşıyabilir. b) Virüsler: 1978’de yapılan Asimolar konferasınsında en az tehlikeli ve en çok incelenmiş virüs olarak ƛ-faji kullanılmaya karar verilmiştir.ƛDNA'sı 49 kb boyunda çift iplikli bir moleküldür. Her iki ucunda birbirlerine komplementer 12 nükleotitlik tek iplikli zincirlere sahiptir. Bu uçlara "cos" (cohesive = yapışkan) uçlar denir. Infekte olmuş hücrede DNA'ları cos bölgelerinden birbirine bağlı peşpeşe DNA zincirleri halinde sentezlenir ve sonra faj halinde paketlenirler. 12 Şekil 2: cDNA eldesi c) Kozmidler: Plazmit ve fajların kullanışlı özelliklerini bünyesinde toplayan melez bir vektördür. 35000 - 45 000 bp'ye kadar DNA parçalarını klonlamada kullanılabilir. ƛ fajını paketleyen enzimlerin "cos" bölgelerini tanımasından yararlanılır. ƛ fajının "cos" bölgeleri örneğin pBR322'nin tet geni içine klonlanır. Amp1 geni sağlam kalır. Yabancı DNA nispeten büyük parçalara kesilip her biri (biraz şans ile) "cos" bölgeli plazmit ile birleştirilir. Bakteriler ekilerek ampisiline dirençli, tetrasikline duyarlı olanlar seçilir. d) Ekspresyon vektörleri: Yabancı genin ekleneceği bölgenin önünde tercihli bir promoter bölge içeren yapay plazmitlerdir. Klone edilecek genin ürünü olan proteinin sentezlenmesi arzu ediliyorsa ekspresyon vektörleri kullanılır (9,10). 13 3.3. Genin hücreye sokulması a) Plasmid ya da virüslerle, b) Kimyasal yöntemle: Ca3(PO4)2 kullanılarak DNA'yı tuzakladıktan sonra seçici bir ortamda ( ±tk geni ile seçerek), c) Fiziksel yöntem: Hücre çekirdeğine sokulacak cam (ya da plastik) mikro pipetlerle (uçları 0,1 - 0,5 mikron olmalı) DNA injeksiyonudur. Bu yöntemle herhangi bir DNA parçası herhangi bir hücreye direkt olarak sokulabilir. d) Füzyon ile: Lipozomlar ya da eritrosit hayaletler (içlerindeki hemoglobin ve diğer proteinler boşaltılmış, bütünlüğü korunmuş eritrosit membranları) kullanılarak içerdikleri DNA'nın hücre erimesi yöntemiyle diğer bir hücre ile birleştirilmesi yöntemidir (9,10). 3.4. Geni içeren hücrenin seçimi a) Antibiyotiklere dirençlilik, b) Seçici ortamlar (örneğin HAT: Hipoksantin, Aminopterin ve Timin) ortamında tk- hücreler üreyemez. Çünkü Aminopterin, dCTP ->dTDP yolunu bloke eder (9,10). Yabancı geni içeren hücre seçildikten sonra uygun koşullarda saklanabilir ya da arzu edildiğinde adı geçen geni üreten bir fabrika gibi kullanılabilir. Günümüzde değerli proteinlerin genleri (insülin, büyüme hormonu vb.) ekspresyon vektörlerine klone edilmiş olarak mevcuttur. Hatta çeşitli firmalardan ücreti ödenerek temin edilebilir (9,10). Rekombinant DNA teknolojisi uygulamaları özellikle genetik mühendisliği ve biyoteknolojide kullanılmaktadır. Dünya nüfusunun %3-5'nin genellikle tedavi olanağı bulmayan kalıtsal hastalıklardan etkilendiği bilinmektedir. Bu alandaki en büyük ümit ve beklenti genetik bozuklukların gen aktarımı yöntemleriyle düzeltilmesi ya da etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesidir. Kısa zamanda çok geniş bir uygulama alanı bulan bu yöntemin gerçek değeri önümüzdeki yıllarda çok daha iyi anlaşılacaktır (12). 14 4.İNSÜLİN 4.1.İnsülin nedir İnsülin pankreastaki langerhans adacıklarının beta-hücreleri tarafından üretilen polipeptit yapıda 6000 dalton molekül ağırlığında bir hormondur. Molekülü 2 aminoasit zincirinden oluşmaktadır. Zincirler birbirlerine iki disülfür köprüsüyle ile bağlanmıştır. Bu hücreler pankreas kütlesinin yaklaşık %1’ini oluştururlar. İnsülin, dokular tarafından yakıtların kullanımını düzenleyen en önemli hormonlardan biridir. Metobolik etkileri anaboliktir, ör: glikojen, triaçilgliserol ve protein sentezini desteklemektedir (13). Bunların dışında membran enzimlerini aktive ve inaktive edebilirler, birçok protein ve mRNA’nın sentez veya yıkım hızını değiştirebilir, hücre büyüme ve farklılaşmasını etkileyebilirler (14). İnsülinin karbonhidrat özüştürmesinin birincil dengeleyicisi olmasının yanında, karbonhidrat metabolizması ile ilişki içinde bulunan yağ ve protein metabolizmaları üzerinde de önemi vardır ve kandaki insülin derişimi değişikliklerinin tüm bedende yaygın etkileri bulunmaktadır. Bu hormonun tam yokluğu, şeker hastalığının 1. tipine ; görece azlığı ya da insüline karşı direnç ya da her ikisinin birlikte olması ise 2. tip şeker hastalığına yol açar. Bu doğrultuda, endüstriyel olarak üretilmiş olan insülin, 1. tip şeker hastalığında ve başka ilaçların yetersiz kaldığı 2. tip şeker hastalığı vakalarında ilaç olarak da kullanılır. İnsülinin yapısı hayvanlar arasında görece küçük farklara bağlı bir çeşitlilik gösterir ve insan insülinine en benzer yapıdaki insülin, arada tek bir aminoasit biriminin farklı oluşuyla, domuz insülinidir. İnsülinin karbonhidrat metabolizması üzerindeki düzenleyici gösterebilmektedir (15). işlevinin etkinliği de insandan insana değişkenlik 15 4.2.İnsülinin tarihçesi 1869 yılında Langerhans pankreas adacıklarını islet Cell diye isimlendiriliyordu. 1889 da Minkowsky ve V. Mering total pankreatektomi yaptıkları köpeğin diyabet olduğunu göstermeleriyle şeker hastalığının merkezi organını tanımlamış oldular. 1909’da Jean de Mayer, pankreasın bu adacıklarının salgıladığı endojen salgıya İnsülin adını teklif ettiler. 1916’da Nicoulau Paulesco pankreasın bu ekstresine pencrein adını vererek, diyabetik hastalarda bunun kan şekerini düşürdüğünü yayınladılar (1,16). 1920’ler heyecan verici yıllardı. Gelişimin heyecan verici sürecinde ilk adım olarak dünyanın ilk insülini elde edildi. İnsülin tedavisi Danimarka’da başladı, Novo terapötik laboratuvarları ve Nordisk insülin laboratuvarları kuruldu.30 Ekim 1920 de Banting dış kanalı bağlı pankreasta adacıkları izole edildi. 1921’de Best, Banting, Mac Leod ve J. Collip pankreas ekstresiyle diyabetik köpeğin kan şekerini düşürüp, hipoglisemi ve şoka sokuldu ve böylelikle insülin keşfedilmiş oldu. 1922 yılı mayıs ayında Lilly ilaç firmasıyla Best Collip insülin üretim kontratı imzaladı ve insülin tedavi sahasına sokuldu (1). Biyofarmasötik endüstrisi 1971 yılında Berkeley’deki Cetus’un kurulması ile başladı. 1975’de ilk monoklonal antikor üretildi.1976’da Genentech in kurulması ile DNA dizileme, replikasyon ve maya DNA’sının ekspresyonunun sunumu yapıldı. Bir sonraki yıl, insan geni bakteride ifade edildi ve tavşan insülin geni klonlandı. 1978 yılında Biogen kuruldu ve aynı yıl rekombinant insan insülini ve insan büyüme hormonu üretildi. Bakteriyal DNA başarılı bir şekilde maya kromozomuna sokuldu. 1979’da maya protoplastı bir hibrit E. coli/maya plazmidi ile transforme edildi. 1980’de Amgen kuruldu ve canlı organizmaların patentlenebileceği US yüksek mahkemesi ile kurallandırıldı. 1981’de ilk rekombinant diagnostik kit FDA tarafından onaylandı ve 3 şirket daha oluşturuldu: Genetics Institute, Chiron ve Genzyme. Rekombinant insan insülini 1982 yılında onaylandı (1,16). 16 4.3.İnsülinin yapısı kimyası ve biyokimyası Kimyasal olarak insülin küçük basit bir proteindir. 30 tanesinin bir polipeptit zincirini ve 21 tanesinin de ikinci bir zinciri oluşturduğu 51 amino asitten oluşur. Bu iki zincir bir disülfit bağı ile bağlanır (şekil 3 ) (2). Şekil 3: İnsülin zinciri İnsüline ait genetik kod DNA içindeki on birinci kromozomun kısa kolunun üzerinde bulunmuştur. Bu, 153 azot kökü içerir (63 ü A zincirinde ve 90 tanesi de B zincirinde). İki uzun birbirine sarılı helisel içeren kromozomu oluşturan DNA, her biri bir şeker deoksiribozu bir fosfat ve azot kökünden oluşan bir nükleotidler zincirinden inşa edilir. Dört farklı azot kökü vardır; bunlar adenin, timin, sitozin ve guanindir. İnsülin gibi özel bir proteinin sentezi bu köklerin tekrar edildikleri bir zincir ile tespit edilir (Şekil 4 ) (17,18). Şekil 4: B insülin zinciri için gerekli özel nükleotid zinciri ile birlikte sarılmış DNA 17 İnsülin molekülünün yapısı bakımından, türler arasında farklılıklar bulunmaktadır. Bu farklılığın klinik önemi vardır. Örneğin domuz, sığır, at ve memeli deniz hayvanlarının insülinlerindeki kimyasal olarak en büyük farklılık 8. 9. ve 10. amino asitteki değişikliktir. İnsan insülinine en yakın olan domuz insülinidir. Domuz insülinindeki tek fark B zincirinde karboksi terminalinde alanin treonin (threonine) olmasıdır. Başlangıç maddesi olarak domuz İnsülinin kullanılması yan sentetik olarak insan insülinin elde edilmesini nispeten kolaylaştırmıştır. 1983 yılında Frank ve Chance, E.coli DNA' sının klonlanması ile insan insülini elde etmişlerdir. Bu heyecan verici yeni teknolojik gelişme ile insan insülini üretilmiş, diyabet hastalarının daha etkin ve memnuniyet verici bir şekilde tedavi edilmesi sağlanmıştır. İnsan insülininin bulunması diyabet hastalarının tedavisinde önemli bir yolun aşıldığı anlamını taşımaktadır. 1995 yılında rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi ile bir başka ilk gerçekleştirilmiştir. İlk kez insan insülini analogu elde edilmiştir. B zincirinin C terminalindeki prolin (B28) ile lizinin (B29); yer değiştirmesi sağlanarak insan insülin analogu elde edilmiştir. Bu gelişmelerden, açıkça izleneceği gibi diyabet hastalığının tedavisinde kullanılan insülinin, tedavi etkinliğini arttırmak amacı ile yapılan çalışmalar, keşfinden günümüze kadar aralıksız olarak devam etmiştir. Tedavide en iyi sonucun alınması ve sorunsuz olarak kullanılması ile ilgili olarak insülin molekülünün geliştirilmesi ile ilgili çalışmalarda sınır tanınmamıştır. Diyabet tedavisi ve insülin molekülünün geliştirilmesi ile ilgili olarak gelecekte erişilecek düzeyin bir gün hayal gücümüzü bile aşacağını düşünmek uzak bir tahmin olmayacaktır (19). 4.4.İnsülin sentezinin doğası ve amacı Banting ve Best in 1921’de keşfettikleri hormon olan insülinden bu yana; bozulan insülin hormonuna bağlı olarak artan şeker düzeyleri olan diyabet hastaları (Şekil 5); mezbaha hayvanlarının pankreas bezelerinden (salgı bezi) türetilen insülin ile tedavi edilmektedir. Langerhans’ın pankreas adacıklarının beta hücrelerinden üretilen ve salgılanan bu hormon, yiyeceğin; özellikle karbonhidratların depolanmasını düzenler (20,21). kullanımını ve 18 Şekil 5 Diyabetik kişinin kan glikoz seviyesindeki yükselme ve alçalmalar (dalgalanmalar) sağlıklı bireyler ile karşılaştırıldı. Sığır ve domuz insülini insan insülinine benzer olmasına rağmen bunların yapısı az da olsa farklıdır. Sonuç olarak bir seri hastanın bağışıklık sistemi buna karşı bunun faaliyetlerini nötrleştiren antikor üretir ve bu da enjeksiyon alanlarında iltihaplı tepkilerle sonuçlanır. Sığır ve domuz insülininin bu ters etkilerine ek olarak, yabancı bir maddenin düzenli olarak enjeksiyonundan sonra gelen uzun süreli komplikasyonlardan korkulmaktadır ve bu da hayvandan üretilen insülinin üretiminde azalma olarak yansımıştır (22). Bu faktörler; araştırmacıları, uygun bir vektör E. coli bakteriyel hücresi içine insülin geni yerleştirerek doğal olarak üretilen eşiyle kimyasal olarak aynı olan, insülin üretmek için, humulin sentezlemeyi düşünmeye yönlendirmiştir. Bu da rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak başarılmıştır. Bu metot mezbahadan yan ürününü çıkartmak ve bunu arıtmaktan çok daha güvenilir ve devamlı bir metottur (Şekil 6 ) (2). 19 Şekil.6: Rekombinasyon (yeniden birleştirme) işlemine genel bir bakış. 4.5.İnsülin üretimi İnsülin genel olarak; Sığır (Beef İnsülin) Sığırların pankreaslarından ekstraksiyon yöntemi ile elde edilir. 3 amino asidi insan insülininden faklıdır. Domuz (Pork İnsülin) Domuzların pankreaslarından ekstraksiyon yöntemi ile sağlanır. İnsan insülininden bir amino asidi farklıdır. Bakteriler/Mayalar(Biosentetik) Bakteri ve maya (mantar)'ların DNA yapıları değiştirilerek (rekombinasyon) insan insülini üretilir. (Rekombinant DNA teknolojisi) (23). 20 4.6.İnsan insülini sentezinin basamakları 1. Nükleusta insulin kodlayan genlerden mRNA transkripsiyonu olur. 2. mRNA stoplazmaya gelir ve kaba endoplazmik retikuluma bağlı polizom ile translasyona uğrar. 3. Polipeptit sentezi, N-Terminal sinyal polipeptidi oluşumuyla başlatılır ve kaba endoplazmik retikulum membranı içine penetre olur. 4. Polipeptit zinciri, kaba endoplazmik retikulum lumeni içine doğru uzar, sonuçta preproinsülin oluşur. 5. Sinyal peptidi ayrılır ve sisternada proinsülin oluşur. 6. Proinsülin kaba endoplazmik retikulumdan golgi kompleksine taşınır, orada proteazların etkisiyle c-peptit segmentini kaybederek insüline dönüşür. Dönüşüm golgi aparatından kopma sonucu oluşan insülin depo veziküllerinde devam eder. 7. İnsülin parsiyel ekzositozla salgılanırken onunla birlikte ekimolar miktarda Cpeptitide salgılanır (13). 4.7.Rekombinant DNA teknolojisi ile insülin üretimi DNA’nın on birinci kromozomunun çift ipliği insülin üretiminde özel olan eşleşmemiş azot köklerini açığa çıkararak ikiye bölünür (şekil 7 ) (21). Şekil 7: İnsülinin B zincirinin kodlanması için gerekli olan ve açığa çıkan nükleotidler ile birlikte DNA 11. kromozomunun çözülme ipliği 21 Açığa çıkan DNA iplikçilerini şablon olarak kullanarak (Şekil 8 ) transkripsiyon (kopyalama) işlemindeki mesajcı RNA oluşur (şekil 9 ) (24). Şekil 8:Açığa çıkan DNA iplikçiği. Şekil 9 (m)RNA iplikçiği. Urasil tarafından değiştirilen azot köklü timin üzerindeki mRNA iplikçiğinin rolü genetik bilgiyi taşımaktır. Mesela insüline ait olan bilgiyi çekirdekten sitoplazmaya, ribozoma bağlandığı yere, taşıması gibi (Şekil 10 ) (21,24). Şekil 10: Ribozomdaki tercüme işlemi. mRNA’nın azot kökleri kodonlar adı verilen ağaçlarda gruplanırlar. Taşıyıcı RNA (tRNA) molekülleri, üç eşlenmemiş azot kökü, toplu olarak mRNA üzerinde 22 tamamlayıcı kökler olan kodonlar ile birlikte toplu olarak bir anti kodon çifti olarak bilinen özel bir amino aside bağlanırlar (Şekil 11) (21,24). Şekil 11:Taşıyıcı RNA molekülleri kodonların bağlandığı özel amino asit Ribozomda mRNA’nın tRNA tarafından okunması tercüme (yazma) olarak bilinir. tRNA tarafından oluşturulan özel bir amino asit zinciri mRNA tarafından tespit edilen kodu takip eder. mRNA’nın kök zinciri, insülin gibi özel proteinleri oluşturmak için bununla birlikte bağlanan amino asit zinciri içine yazılır (21,24). 4.7.1.Vektör (Gram Negatif E.coli) E.coli adlı yaygın bakterinin zayıflamış iplikçiği insan sindirim sisteminin bir sakinidir ve bu; genetik insülin mühendisliği fabrikasıdır (Şekil 12) (2). Şekil 12: E. coli hücresi içine insülin tanıtılması 23 Bakteri ürediğinde DNA’ nın sirküler bir kısmı olan plazmid ile birlikte insülin de kopyalanır (Şekil 13). E. coli insülin gibi yabancı maddeleri hızla azaltan enzimleri üretir. Bu enzimlerden yoksun mutant iplikçikleri kullanarak problemden kaçınılır (2). Şekil 13: Vektörlerin plazmidlerinin elektron mikroskobu ile görünüşü 4.7.2.Genetik Mühendislerinin Araç Kutusu İçindekiler Doğal olarak bakteri tarafından üretilen sınırlandırıcı enzimler, biyolojik cerrah bıçakları olarak rol oynarlar ve insülin kodları gibi sadece özel nükleotidlerin uzantılarını tanırlar. Bu belli azot kökü çiftlerini ayırmayı mümkün kılar ve organizmaya ait kromozomdan DNA’yı kodlayan insülin kısmını ayırır böylece insülini üretebilir (Şekil 14) (22,25). DNA ligaz açığa çıkan nükleotidleri yapışkan uçlarından birbirine kaynaklayan genetik bir yapışkan, olarak hizmet eden bir enzimdir (2). 24 Şekil 14: İnsülin üretimi 4.7.3.Humulin Üretimi Birinci basamak insülinin A ve B polipeptit zincirlerini karakterize eden özel nükleotid zincirlerini taşıyan DNA zincirlerini kimyasal olarak sentezlemektir. (Şekil 15) (2). Şekil 15: İnsan insülini yapısı. amino grup asit RNA’dan DNA’ya dönüşüm. 25 Gerekli DNA zinciri tespit edilebilir çünkü her iki zincirin amino asit içeriklerinin şifresi çözülmüştür. A zincirini sentezlemek için altmış üç nükleotid ve B zinciri içinde doksan nükleotid gereklidir. Bu zincirlerin her birinin ucuna protein sentezinin bitirildiğini işaret eden artı bir kolon eklenir. Daha sonra bakteri hücresinin amino asidinden insülin proteininin ayrılmasına izin vermek için amino asit ile işbirliği yapan bir anti-kodon da, methionin, her bir zincirin başına yerleştirilir. Bundan sonra vektörün plazmidi içine taşınan B-galaktosidaz, bakteri enzimi için, sentetik A ve B zinciri “genler” gen içine ayrıca yerleştirilir. Bu safhada, sentetik genlerin kodonlarının Bgalaktosidazınkilerle uyumlu olması hayati önem taşır (Şekil 16) (2). Şekil 16: A ve B zincirlerinin E.coli plazmidleri içine yerleştirilmesi. Rekombinant plazmidler daha sonra E. coli hücrelerine tanıtılırlar. Rekombinant DNA teknolojisinin insan insülini sentezindeki uygulamasında insülin verebilmek için insülin geni ile birleşecek plazmidleri olan milyonlarca bakteri kopyası gerektirir. İnsülin geni hücre içinde mitosize maruz kalan B-galaktosidaz ile birlikte kopyalandığında tanımlanır (şekil 17) (2). 26 Şekil 17: Mitosiz İşlemi Oluşan protein insülinin A veya B zinciri ile birleşen B-galaktosidazın bir kısmını içerir. Daha sonra B-galaktosidaz parçacığından A ve B zincirleri tanımlanır ve arıtılır (Şekil18) (2). Şekil 18: A veya B zinciri ile birleşen beta-galaktosidaz Bu iki zincir karıştırılır ve disülfit geçiş köprülerini oluşturan bir reaksiyonda yeniden bağlanırlar ki bu da saf Humulin sentetik insan insülini ile sonuçlanır (Şekil 19) (2). 27 Şekil 19: İnsan İnsülini Molekülü 4.8.Genetik Olarak İşlenen Rekombinant İnsan İnsülininin Biyolojik İçerikleri İnsan insülini bu şekilde bakteriler içinde yapılan tek hayvan proteinidir ki yapısı doğal molekülünki ile tamamen aynıdır (26,27). Bu, antikor üretimi ile sonuçlanan komplikasyon ihtimalini azaltmaktadır. Kimyasal ve farmakolojik çalışmalarda ticari olarak elde edilebilen rekombinant DNA insan insülininin pankreas tarafından üretilen insan insülininden ayırt edilemediği kanıtlanmıştır. Burada yüz yüze gelinen ana sorun ev sahibi hücreler ile son ürünün kirletilmesiydi ki bu da fermantasyon suyunda kirlenme riskini arttırmaktaydı. Bu tehlike arıtma işleminin işleme konulması ile kökünden halledildi. Son insülin ürünü bir seri testlere maruz bırakıldığında, ki buna en ince radyo imüno ayar teknikleri de dâhildir, hiçbir kirlilik tespit edilemez. Şimdi tüm prosedür büyüme aracı olarak maya hücreleri kullanılarak yapıldı, çünkü bunlar mükemmel üç boyutlu yapıda neredeyse tamamen insan insülini molekülü salgılarlar. Bu da karışık ve maliyetli arıtma işlemlerine ihtiyacı en aza indirir (26). 4.9.İnsülin üretimi için biyoteknolojik tesisler Sadece Almanya’da her gün 800,000 insan kan şekeri düzeyini korumak için insülin kullanmak zorundadır. Genetik teknolojisinin son 30 yıldaki hızlı gelişimi, genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaları kullanarak sınırsız miktarda ve yüksek kalitede insülin ve insülin analoglarını üretmeyi mümkün hale getirmiştir. Yeni analogların glargin insülin gibi üretimi için ise son derece modern biyoteknolojik tesisler gerekmektedir. Farmasötik tesislerin planlanması ve kurulması Dresden’de bulunan Linde Plant Construction (LKCA)’ın yeni atıldığı bir iş sahasıdır. Buna rağmen LKCA son on yılda farmasötik ve biyoteknolojik tesislerin planlanması, dizaynı ve kurulumu konusunda 28 lider firma konumuna gelmiş durumdadır. LKCA bu alandaki ilk rolünü Nisan 2000’de yeni bir biyoteknolojik tesisin kurulumu sürecinde ‘genel planlayıcı’ olarak üstlenmiştir. Tesis, Frankfurt’ta bulunan Aventis Pharma için kurulacaktı ve tesiste genetik mühendisliği kullanılarak bir insülin türevi olan glargin insülin üretimi yapılacaktı. LKCA tesisi Aventis’e sadece 29 ay sonra başarılı bir şekilde teslim etti. (şekil 20-21) (28). Şekil 20: Lantus Aventis at the Höchst Industrial Park. 4.9.1.Yeşil Alan Üzerinde Bağımsız Bir Tesis Tesis birbirinden bağımsız 4 binadan oluşmaktadır ve bu binalarda da temizliğine, alanına ve patlama tehlikesi olan süreçlere göre ayrılmış ve sınıflandırılmış üretim işletmeleri bulunmaktadır. Bütün alt tesisler merkezi bir bağlantı yolu vasıtasıyla beslenmektedir. Bu yoldan alt tesislere hem personel hem de materyal akışı sağlanmaktadır. Bu yol ayrıca ana binayı ofislere, konferans salonuna, laboratuarlara ve ana kontrol odasına bağlamaktadır. Birçok depolama tankının yanı sıra, alt yapı hattını Höchst Industrial Park’taki atık tesisine bağlayan hatlar bulunmaktadır. Tesis her yıl ortalama 1700 kg glargin insülini üretmektedir (şekil 20) (28). 29 5 Adımda Üretim Biyosentetik glargin insülini üreten tesiste şu 5 aşama göze çarpıyor: Fermantasyon Proses 1 Proses 2 Saflaştırma Son-Ürün Glargin insülinin üretim sürecindeki basamaklar, hızlı uyarıcı insülinin üretim sürecindeki basamaklardan özellikle saflaştırma ve son ürün basamaklarında oldukça farklılık gösteriyor. Fermantasyon ve Proses safhaları ise iki süreç için de hemen hemen aynıdır. Fermantasyon aşamasında, genetiği değiştirilmiş E.coli bakterisi ardışık fermenterlerin içinde giderek artan bir kapasiteyle büyütülüyor ve kültür ediliyor. Bir indükleyici (uyarıcı) eklenerek bu bakterilerin bir füzyon proteini üretmeleri sağlanıyor. Füzyon proteini oluştuğunda, dezenfektan kullanılarak bakteriler öldürülüyor. Bu kısım genetiği değiştirilmiş bakterinin kültür edilmesi ve sonra öldürülmesi Genetic Technology Act tarafından yapılıyor ve işin genetik mühendisliği kısmı olarak adlandırılıyor (28). Bakteriler öldürüldükten sonra, kalan süspansiyon sentrifügasyon ile daha konsantre hale getiriliyor ve çözülüyor (dağıtılıyor). Dağıtım aşamasından sonra, ağır olan füzyon proteini sürekli sentrifügasyon (continuous centrifugation) ile diğer hücre birimlerinden ayrılıyor, iki kez su ile yıkanıyor ve izole ediliyor. Molekülün katlanması (folding) füzyon proteininin doğal 3 boyutlu yapısını alması bir sonraki basamakta gerçekleşiyor. Bu olay füzyon proteininin sulu üre çözeltisi içerisinde sisteinin (cystein) varlığında çözünmesiyle oluyor. Yan ürünler pH değişimi ile çöktürülüp, sentrifügasyonla ayrıştırılıyor. Saflaştırma aşamasında, glargin insülin adzorpsiyon (yüzeyde tutulma) dezorpsiyon (yüzeysel salınım) yöntemleriyle üre ve inorganik tuzlardan arındırılıyor ve eş zamanlı olarak da yoğunlaştırılıyor. Dezorpsiyon sulu propanol çözeltisi ile yapılıyor. Bu aşamadaki ham ürün kromatografik yöntemlerle iki proses aşamasında daha da saflaştırılıyor. Sonra, kristalize ediliyor, emme gücüyle filtreleniyor ve geçici olarak nemli kristaller halinde depo ediliyor. Yüksek saflıktaki glargin insülin kristalleri 30 yeniden çözülüyor ve daha homojen gruplar (yığınlar) elde etmek için kristaller dondurularak kurutuluyor. Son ürün işlemleri ise Class C steril oda şartlarında gerçekleştiriliyor (28). 4.9.2.Zorlu Üretim Süreci Tüm süreç boyunca, deiyonize olmuş su veya saf su kullanılıyor. Mikrobiyolojik ve fiziko-kimyasal kalitesi rutin olarak kontrol ediliyor. Ozon kullanıldığı noktaya ulaşmadan önce, UV ışınlarıyla sudan uzaklaştırılıyor. Bu su tüketicilere ring boru sistemiyle ulaştırılıyor. Pirojensiz (pyrogen-free) saf su ultrafiltrasyonla elde ediliyor ve sadece son iki basamakta kullanılıyor (saflaştırma ve son ürün).Ayrıca, tüm ham maddeler ve yardımcı materyaller (çözeltiler, asitler, bazlar, tampon çözeltiler) farmasötik kalitede ve ihtiyaca cevap verecek nitelikteler. Bunlar da düzenli olarak kontrol ediliyor. Çözücü, propanol, kullanımdan sonra damıtılıyor ve sürece geri gönderiliyor. Kullanılan nitrojen ise kontaminasyonu önlemek için HEPA filtresinden geçirilerek saflaştırılıyor. Sürecin bütün basamakları, birbirine borularla bağlı kapalı tanklar içerisinde gerçekleşiyor. Bu sayede ürünün manüel kullanımı minimuma indiriliyor. Tanklar ve borular, belirli bir yüzey pürüzlülüğüne sahip aşınmaya dayanıklı paslanmaz çelikten yapılıyor. Bu da temizliğin sağlıklı ve sorunsuz yapılmasını sağlıyor (28). 31 Şekil 21: Propanol damıtma tesisi, fermentasyon binası ve tank deposunun görünümü 4.9.3.Proses Görüntüleme ve Dökümantasyon Bir glargin insülin üretim tesisinin kalbi yüksek kapasiteli yaklaşık 18,000 kalem girdi ve çıktıyı görüntüleyip kontrolünü yapabilen bir proses kontrol sistemidir. Bütün kaliteli aletler, işleme kondukları zaman önce kalibre edilirler. Bu kalibrasyon belirli zaman aralıklarıyla tekrarlanır. Süreç içerisinde ara ürünler dahi, beklenilen kaliteyi sağlayıp sağlamadığı ile ilgili teste tabi tutulurlar (şekil 23) (28). Bütün süreç ve analitik veriler ister rutin operasyon sonucu gelsin isterse sapmalardan kaynaklansın proses kontrol sisteminde ya da laboratuar bilgi işletim sisteminde (LIMS) depolanıyor (28). Bu proje Aventis’in geliştirdiği ve pilot tesis seviyesinde test ettiği bir süreçle başladı. İnsülin üretimi için daha önceden tamamlanmış benzer bir projenin yapısının kullanılması önemli ipuçları sağlamıştır. Tam da bu aşamada tesisi dizayn edenlerden beklenen tecrübelerini konuşturmaları ve dizayn sürecinin içerisinde özellikle de proses optimizasyonu, orantılı büyütme ve belirlenmiş ürün konsepti konularında aktif olarak yer almalarıydı (28). 32 Planlamada esas önemli olan ürünün tekrarlanabilir şartlar altında üretilip üretilmediğidir. LKCA bu proje için 12 işçi görevlendirmiştir. Bu ekip başlangıçtaki tesis konseptini geliştirmek için Aventis proje ekibiyle tam 3 ay beraber çalışmışlardır. Bu planlama aşamasında proses teknolojisini aşağıdaki gereksinimlerle bir ahenk içerisine sokmak önemliydi: Bina mimarisi Steril oda sınıflandırması ve HVAC (heating-ventilation-air conditioning) Lojistik ve depolama Bilgi teknolojisi ve proses kontrolü Fonksiyonel tanımlamalar Ürün kalitesi ve GMP (good manufacturing practise) konsepti Tesis bazlı dizayn planı kuruldu. Proses bazlı dizayn ilkeleri (şekil 22) (28) : Fonksiyonel plan Bina konsepti Tesis dizaynı, mevcut alt yapıya bağlı olarak Bu süreç çok önemli olduğu için, yapım kontratı ve FEPA kontratı için istenen belgeler bir an önce hazırlandı ve ilgili birimlere teslim edildi (28). Konsept dizaynı ise şu temellere dayanıyordu: Kritik tesis alanlarının yerleşim çalışmaları Madde sağlanması ve atılması, elektrik düzeni, ölçümler, kontrol teknolojisi için yerleşim dizaynı Materyal, personel ve ürün akışı için lojistik konseptler (28). 33 Şekil 22:Depolayıcı özelliğe sahip, genetiği değiştirilmiş insülin türevi üretimi için gerekli olan tesisin 3-boyutlu dizayn modeli ve yapısal planı Şekil 23:Ana ürünlerin teste tabi tutulduğu kısım 34 Şekil 24: Höchst Industrial Park’ta bulunan Aventis Lantus tesisinin güneydoğusuna bir bakış 35 5.TARTIŞMA VE SONUÇ Yirminci yüzyıl, geleneksel biyoteknolojinin modern biyoteknolojiye dönüştüğü ve insanoğlu için, yepyeni ufukların açıldığı bir yüzyıl olup, farmasötik biyoteknoloji açısından en önemli iki gelişme ise Rekombinant DNA Teknolojisi ile hibridoma teknolojisi olmuştur (6). Türkiye biyoteknoloji konusunda, yetişmiş eleman, laboratuar altyapısı ve araştırma olanaklarındaki yetersizlikler nedeniyle geride kalmıştır. Üniversitelerde 1996 yılından bu yana moleküler biyoloji ve genetik konusunda lisans eğitimi verilmeye başlamıştır. Araştırma-geliştirme için ayrılan fonlar yetersiz olmakla birlikte son yıllarda bir gelişme olduğu belirtilmektedir. Araştırma sayısının ve niteliğinin artmasını engelleyen bir neden de çalışmalarda kullanılan maddelerin çok maliyetli olmasıdır (31). 1982 yılında, ilk kez insan insülini ile ilaç pazarına giren terapötik proteinler günümüzde sayı olarak elliyi aşmıştır. Ayrıca halen 300'den fazla terapötik protein preklinik ve klinik araştırmalar aşamasında olup önümüzdeki 10 yıl içinde her yıl bir düzine yeni terapötik proteinin ruhsatlandırılması beklenmektedir. Uzun yıllardır kullanımda olan insülin, eritropoietin, interferon-alfa, interferon-beta, filgrastim (koloni uyarıcı faktör) ve büyüme hormonu yanında, son yıllarda monoklonal antikor türü ilaçlarla, rekombinant kan faktörleri ve rekombinant enzimlerin de ruhsatlandırılması başlamıştır. Önümüzdeki yıllarda özellikle büyüme faktörleri ve monoklonal antikor grubuna ait ilaç sayısının hızla artması beklenmektedir, insan genom projesinin tamamlanması ile önümüzdeki 15-20 yıl içinde kullanıma sunulan terapötik protein sayısının bir kaç yüze ulaşması şaşırtıcı olmamalıdır. Bu nedenlerle, terapötik proteinler, gerek eczacılık uygulamalarında, gerekse sağlık ekonomisinde giderek önem kazanmaktadır. Terapötik proteinler rekombinant DNA teknolojisine dayalı olarak bakteri, maya veya memeli hayvan hücrelerinde üretilmekte ve tamamına yakını parenteral ilaçlar olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçlar patentle korunmakta olduklarından, gelişmiş ülkelerde orijinal ilaçlar olarak üretilmekte ve yüksek fiyatlarla tüketiciye sunulmaktadır. Ancak bu ilaçlardan yaygın olarak 36 kullanılanları, patent koruma sisteminin dışında olan bazı Asya ve Latin Amerika ülkelerinde jenerik olarak üretilmeye başlanmıştır. Jenerik terapötik proteinler, diğer jenerik ilaçlarda olduğu gibi, çok daha ucuz fiyatlarda satıldıklarından, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, orijinal ilaçların yerini almaya başlamışlardır. Türkiye'de halen 25 terapötik protein ruhsatlandırılmış bulunmaktadır. Ülke ihtiyacı tamamıyla, orijinal ürünlerin ithalatı yolu ile karşılanmakta olup, jenerik ürünlerin ithalatı henüz söz konusu değildir. Ülkemizde, halen kullanılmakta olan terapötik proteinler patent koruması altında değildir, yani bu tür ilaçların Türkiye'de jenerik olarak üretimi veya ruhsatlandırılmasının önünde herhangi bir yasal engel yoktur. Bu önemli avantaja rağmen, bazı Asya ve Latin Amerika ülkelerinin aksine, ülkemizde jenerik terapötik protein üretimi henüz söz konusu değildir. Bunun en önemli nedenleri arasında, bu tür ürünlerin üretim ve ruhsatlandırılması konusunda yasal düzenlemelerin yapılmamış olması, ilaç sanayimizin ileri teknoloji ürünlerine yabancı kalması ve innovatif firmalarca pazarı koruma amacıyla gerçekleştirilen rekabet faaliyetleri yer almaktadır. 1998 yılında 16 milyar dolar olan küresel terapötik protein pazarı her yıl ortalama %20 büyüyerek 2002 yılı sonunda 33.3 milyar dolara ulaşmıştır. Bugüne kadar ki hızlı büyümenin lokomotif ürünleri eritropoietin ve insülindir. Uluslararası güvenilir kaynakların tahminlerine göre, bu pazar yıllık ortalama %9'luk büyüme hızı ile 2010 yılında 59 milyar dolarlık büyüklüğe ulaşacaktır. Bu süreçte, eritropoietin ve insülin önemli ürünler olmaya devarn edecek ancak monoklonal antikorlar, terapötik aşılar ve interferonlar, yüksek büyüme oranları ile sektörde önemli boyutlara ulaşacaktır (6). Dünyanın her yerinde bilimsel araştırma kurumlarının ve yüksek teknoloji şirketlerinin laboratuarlarında, çok çeşitli malzeme ve tekniklerle, çok çeşitli rDNA araştırmaları yürütülmektedir. rDNA tekniğinin bulucularından biri olan Herbert Boyer ile Robert A. Swanson'un 1973 yılında kurdukları özel biyoteknoloji şirketi olan Genentech, 1977 yılında, kandaki glikojen (şeker) oranını düşüren insülin hormonunu sentezleyen Gani, rDNA tekniğiyle E.coli'ye sokarak, bu bakteriye sentezletip, sonra da üretilen insülini yalıtlamayı başardıklarını duyurmuşlardır. İnsülin gerekli testlerden geçirilip gerekli izinleri alarak, 1985'de pazara sürülen ilk çağdaş biyoteknoloji ürünü, daha özgül olarak söylersek ilk rDNA tekniği ürünü olmuştur. Rekombinant DNA tekniğinin önemini ve gizli gücünü kavramak için insülinin daha önce nasıl sağlandığına bakmak yetecektir. İnsülin daha önce sığır ve domuz pankreaslarından bin bir güçlükle ekstre edilen bir biyokimyasal madde olup yalnızca ABD'de ki şeker hastalarının gereksinim duydukları 37 miktarın toplanabilmesi için 80 milyon pankreasın harcanmasını gerektiriyordu. Bedenin üç saniye gibi kısa bir sürede sentezleyebildiği bu maddenin kimyasal yollarla sentezi ise ancak üç yıl süren, birbirini izleyen 223 kimyasal tepkimeden sonra gerçekleştirilebilmiştir (30). Sonuç olarak insülin preparatları şeker hastalarının tedavisinde kullanılan mucizevi bir üründür. Kullanım şekilleri gelişen teknoloji ve hız verilen AR-GE çalışmaları sayesinde gün geçtikçe insanların daha rahat ve güvenli kullanabilmelerine olanak sağlanacağı tahmin edilmektedir. 38 KAYNAKLAR 1. Erişim: [http://makinecim.com/bilgi_1586_Insulin-Uretimi] Erişim tarihi 3 Nisan 2011. 2. Pandey S, Suba N. Recombınant DNA Technology. Applıcatıons In The Fıeld of Bıotechnology and Crıme Scıences 2010;(1):1:43-49 3. Erişim: [http://www.ctf.edu.tr/anabilimdallari/pdf/517/Insulin_Tedavisi.pdf] Erişim tarihi 5 Mart 2011. 4. ANONİM, 2005. Erişim: [www.zmo.org.tr] Erişim tarihi 9 Aralık 2010. 5. Yıldırım N.A,Genetiği değiştirilmiş ürünlerin mevcut yapısı ve Adana ‘daki tüketicilerin bilgi düzeyleri, yüksek lisans tezi, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,Adana 2006:56. 6. Balta E. Biyoteknolojik ürünler, TEB haberler dergisi.2007; (4): 8-13 7. Paıllotın G. The Impact of Biotechnologyon the Agro-Food Sector, Future of Food Dergisi, 1997:71. 8. Paarlberg R. The Global Food Fight.Foreign Affairs Dergisi, Mayıs/Haz. 2000;24. 9. Ekici A, Timur M ve Bağış H. Transgenik canlılar ve aküakültürdeki önemi. EÜ Su Ürünleri Dergisi. 2006; 23: 211-214 10. Ekinci M.S, Akyol İ, Karaman M. ve Özköse E. Hayvansal biyoteknoloji uygulamalarında güncel gelişmeler. KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 2005;(8): 89-95. 11. Karakaya H. Moleküler Genetik, İstanbul Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı-Biyofizik Ders Notları 12. Beldüz A.O. 2008 yılı Moleküler Biyoloji Ders Notları Wikipedia.org 13. Lippincott’s Illustrated Review: Biochemistry, second Edition, by Pamela C. Champe and Richard A, Harvey, J.B. Lippincott company, PA 1994;269-277 39 14. Millar DJ, Dawnay AB. Heat sterilization of PHD fluid promotes advanced glycation end product (AGE) formation. J Am Soc Nephrol 1995;6(3):551 15. Erişim: [http://tr.wikipedia.org/wiki/%C4%B0ns%C3%BClin] Erişim tarihi 16 Eylül 2010. 16. Erişim: [ http://www.odevarsivi.com/dosya.asp?islem=gor&dosya_no=90091] Erişim tarihi 23 Eylül 2010. 17. McCall C. Taming the beast of Diabetes. The Washington Times Washington,1992;432 18. Kammermayor K. and Clark V.L.Genetic Engineering Fundamentals, An introduction to Principles & Applications. Marcel Decker Inc, 1989; 502. 19. Gündoğdu N.Ü.İnsülin keşfinin 80.yıl dönümü nedeni ile diyabet hastalığı ve insülin keşfinin tarihi, Başkent Üniversitesi, p 104-107 20. Hayward G. Applied Genetics, University of Bath. Thomas Nelson and Sons Ltd, Edinburgh 1991; 542. 21. Hilson R. Diabetes, a Beyond Basics Guide. Methuen, Melbourne 1987; 321. 22. Hmge. Human insulin from second generation genetic engineering, Novo. Insulin, Grolier Electronic Publishing Inc. 1992; 234-237. 23. Erişim: [http://www.sekerhastaligi.info/insulin_kullanimi.htm] Erişim tarihi 24 Şubat 2011. 24. Morris B. Genetic Engineering. Science in Action 1998; 342 25. Serjeartson S. The Genetics of Diabetes, John Curtin School of Medical Research 26. Wibon J, Tooze J, Hetz D. Recombinant DNA -A Short Course, Scientific American Books USA,1983; 468. 27. "Tryptophan Summary" by John B. Fagan, November 1997, retrieved 27 October 2006; 506 28. Peter J. Mendelsohn Planning and Construction of Complete Pharmaceutical Plants, Biotechnology Plant for Insulin Production Linde Technology 2004;(1):9-14 40 29. Walsh G. Pharmaceutical Biotechnology concepts and applications, England, 2007; p 297-300 30. Kulïlı Ö, Gürel O. "En Uzun Tepkime", Cumhuriyet Bilim Teknik, sayı 39 (1987); 13. 31. Kaya Z, Tolun A.A. Transgenik Organizma Kullanımının Sonuçları, Bilim ve Teknik Dergisi, Eylül 2000; 52. 41 ÖZGEÇMİŞ 1988 yılında Nevşehir’de doğdum. İlköğretim eğitimimi Nevşehir’de tamamladım.2005 yılında Kayseri Şeker Lisesi’ni bitirdim.2006 yılında Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesini kazandım. İletişim: Tel. no: 555 624 98 03 E mail : ecztolgaaytan@gmail.com
