Transkripsiyon
advertisement
Transkripsiyon Prof. Dr. Selma Yılmazer İ.Ü Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji A.D Gen ekspresyonu (gen anlatımı) • DNA molekülünün taşıdığı bilginin protein moleküllerine çevrilmesine Gen ekspresyonu denir. • Gen ekspresyonu 2 aşamada gerçekleşir: 1.Transkripsiyon (Yazılım): DNA nın taşıdığı bilgi, RNA Moleküllerine aktarılır. 1.Translasyon (Çeviri): Kalıtsal bilgi, mRNA aracılığı ile proteine çevrilir. DNA, ▫ protein sentezi için doğrudan kalıp görevi yapmaz. ▫ Aracı moleküllere yani mRNA lara ihtiyaç vardır. Gen ekspresyonu (gen anlatımı) Gen ekspresyonunun (gen anlatımı) • ilk basamağı RNA sentezidir.(Transkripsiyon) Ökaryot hücrelerde Transkripsiyon; • RNA sentezlenmesi (ilk transkriptin oluşması), • Sentezlenen RNA nın işlevsel forma yani olgun mRNA ya dönüştürülmesi;RNA işlenmesi ile gerçekleşir. (Örn. İntronların kesilip çıkartılması,uç modifikasyonları) Transkripsiyon Transkripsiyon; • DNA nın gen adı verilen bölgelerinin • mRNA, rRNA ve tRNA vermek üzere kopyalanmasıdır. • Transkripsiyonu gerçekleştiren enzim RNA polimerazdır. • 1960’ da J. Hurwitz ve S. Weissman tarafından bulunmuştur • mRNA, DNA nın dizisine komplementer (tamamlayıcı) bir baz dizisi içerir. RNA Çeşitleri • Haberci RNA’ lar (mRNA lar): Protein Sentezi için kalıp görevi yapar. • Ribozomal RNA’ lar (rRNA lar) ve • Taşıyıcı RNA’ lar (tRNA lar) mRNA nın proteine çevrilmesinde görev yapar. • Küçük RNA’ lar – mRNA kırpılması – rRNA işlenmesi v.b. – Gen ekspresyonu düzenlenmesi Transkripsiyon • Transkripsiyon için – DNA Kalıbına – RNA polimeraza – Ribonükleotid trifosfatlara (ATP, GTP, CTP, UTP) – Magnezyum İyonuna ihtiyaç vardır. RNA Sentezinin Aşamaları • • • • RNA Polimerazın DNA Kalıbına bağlanması. Sentezin başlaması Zincirin uzaması Sentezin sonlanması Prokaryotlarda Transkripsiyon • E. Coli, ▫ ▫ ▫ ▫ Transkripsiyon çalışmalarında bir model. mRNA, E. Coli’ de bulundu. RNA Polimeraz, E. Coli’ den saflaştırıldı. Gen ekspresyonu regülasyonunu sağlayan mekanizmalar E. Coli’ de keşfedildi. RNA Polimeraz ve Transkripsiyon • RNA sentezinden sorumlu olan enzim; RNA Polimerazdır. • DNA’ yı kalıp olarak kullanarak • Ona komplementer olan bazları bir araya getirir. • Ribonukleozid 5’-trifosfatların (NTP ler) polimerleşmesini katalizler. RNA Polimeraz • RNA zincirinin uzamasını daima 5’->3’ Yönünde katalizler. (DNA Polimeraz gibi) • Primerlere ihtiyaç duymaz (DNA Polimerazdan farklı olarak) • Sentezlenen RNA zinciri ile kalıp DNA ipliği birbirine antiparaleldir. • Prokaryotlarda tek bir RNA Polimeraz, mRNA, tRNA ve rRNA sentezini gerçekleştirir. RNA Polimeraz • RNA Polimeraz; Çok sayıda polipeptidden oluşmuş kompleks bir enzimdir. • Bakteri RNA Polimerazı, α, β, β’ ω ve σ alt birimlerinden oluşur. • σ(sigma) alt birimi, komplekse daha zayıf bağlanır. • Yeni sentezlenen RNA birkaç nükleotid uzunluğa eriştiğinde σ, diğer alt birimlerden ayrılır. RNA Polimeraz • İki α, bir β, bir β’ ve bir ω (omega) alt biriminden oluşan çekirdek RNA polimeraz, RNA nın uzama aşamasını gerçekleştirir. • Çekirdek RNA Polimeraz NTP lerin RNA ya polimerleşmesini katalizler. • Bu işlem için σ gerekmez. RNA Polimeraz • σ , kompleksin transkripsiyonun başlangıç yeri olan DNA dizisine bağlanması için gereklidir. • İş görebilen bir RNAnın oluşması için sentez, gendeki başlangıç noktasından başlamak zorundadır. • RNA Polimerazın bağlandığı bu özgün DNA dizisine, Promotör denir. • Transkripsiyon, genlerin başlangıcındaki bu özgün yerlerde başlar. Promotör Dizisi • E. Coli’ de keşfedildi. • Değişik genlerde transkripsiyon başlangıç noktasının yukarı yönünde birbirine benzeyen 2 farklı dizi bulundu. • Bu ortak diziler 6 nukleotid içerir. • Transkripsiyon başlangıç yerinin (+1) • -10 ve • -35 baz çifti öncesinde bulunur. E.coli’nin Promotör Dizileri • -10 ve -35 elemanları olarak adlandırılırlar. • Bu diziler, farklı genlerde birbirlerine benzer. • Transkripsiyon başlangıç yeri, +1 olarak tanımlanır. • -10 ve -35 ortak dizilerdeki mutasyonlar, promotör işlevi üzerinde güçlü etki yaratır. • σ alt birimi, -35 ve -10 promotör bölgelerinin ikisine de bağlanır. E.coli’nin promotör dizileri • DNA ayak izi yöntemi ile RNA polimerazın Promotöre bağlandığı yerler tanımlanmıştır Transkripsiyonun başlaması • RNA polimerazın bağlanması,(Kapalı promotör kompleksi) DNA sarmalının lokal olarak 14 bazı açarak (-12den +2 ye kadar) çözülmesine neden olur. Böylece tek iplikli DNA oluşur. (Açık promotör kompleksi) • RNA polimerazın Transkripsiyonu başlatması DNA kalıbını kullanarak buna tamamlayıcı olan ilk iki serbest NTP yi fosfodiester bağı ile birleştirerek başlatır. • RNA polimeraz senteze devam eder. • Sentezlenen zincir, 10 nükleotid uzunluğa erişince, σ ayrılır. . E.Coli RNA polimerazı ile transkripsiyon Zincirin Uzaması • RNA polimeraz ileri doğru hareket eder, sentez devam eder. • RNA zinciri uzar • Uzama sırasında polimeraz, kalıp DNA ile birleşik kalır. • Uzama sırasında polimeraz, (mRNA sentezinde) ▫ Transkripsiyon bölgesinde ~15 bazlık açık bölge kalacak şekilde öndeki DNA yı açar, arkadaki DNA yı geri sarar. ▫ β ve β’ alt birimler arasındaki kanal, 20 bç lik DNA barındırır ve polimerazın aktif bölgesini oluşturur. Sonlanma: – RNA sentezi RNA polimeraz, sonlandırma sinyali ile karşılaşana kadar devam eder. – Burada transkripsiyon durur. – Sentezlenen RNA, polimerazdan ayrılır. – Polimeraz da DNA dan ayrılır. – E. Coli’ de en basit bir sonlandırma sinyali vardır. – GC zengin ters tekrarlar, baz eşleşmesi ile sap-ilmik yapısı oluşturur. – Bu yapı, RNA nın DNA ile ilişkisini bozar. – Transkripsiyon sonlanır. Transkripsiyonun sonlanması 4 adenin nukleotidi tarafından izlenen GC den zengin ters tekrarlar ile belirlenir.Ters tekrarlar RNA da kararlı bir sap-ilmik yapısı oluşturur. Sonuçta RNA Kalıp DNA dan ayrılır. Ökaryotlarda Transkripsiyon • Prokaryot ve Ökaryot Hücreler Arasındaki Farklar: 1- Bakteride tek bir RNA polimeraz (tüm genlerin transkripsiyonundan sorumlu) ▫ Ökaryotik hücrelerde, birden fazla RNA polimerazlar bulunur. 2- Ökaryotik RNA polimerazlar promotör diziye, ek proteinler ile bağlanır. Ökaryotik RNA Polimerazları ▫ 3 farklı Nükleer RNA Polimeraz bulunur ▫ RNA Polimeraz I ▫ RNA Polimeraz II ▫ RNA Polimeraz III 1-mRNA’ lar ; RNA Polimeraz II ile 2-rRNA’ lar ve tRNA’ lar ; RNA Polimeraz I ve III ile (Pol I 28s, 18s, 5.8s rRNA ların; Pol III 5s rRNA ların sentezi) 3-Küçük RNA lar; snRNA (küçük nükleer RNA ;kesip ekleme ) , scRNA [küçük sitoplazmik RNA; protein taşınması) RNA Pol III ve RNA Pol II tarafından sentezlenir. Ökaryotik RNA Polimerazlar • Kloroplast ve mitokondrilerde farklı RNA polimerazlar vardır. • Nükleer RNA Polimerazların üçü de • 12-17 alt birimden oluşan kompleks enzimlerdir. • Üçü de 9 adet benzer alt birim içerir. • Bunların 5 tanesi bakteri RNA polimerazın α, β, β’ ve ω alt birimlerine benzer. Ökaryotlarda Transkripsiyon • Prokaryotlarda olduğu gibi, 4 aşamada gerçekleşir ▫ ▫ ▫ ▫ RNA Polimerazın DNA ya bağlanması RNA sentezinin başlaması RNA nın uzaması RNA sentezinin sonlanması Ökaryotlarda promotör bölge • Ökaryotlarda promotör bölge; başlangıç noktasının (+1) önünde • -80 konumunda CAAT dizisi, • -30 konumunda TATA dizisi • Bazı genlerde GC elemanı • Ökaryotik RNA polimerazların transkripsiyonu başlatmak için transkripsiyon faktörleri denen özel proteinlere ihtiyacı vardır. Ökaryotik Promotör diziler • TATA kutusunun önünde verimli transkripsiyon için gerekli olan üç dizi elemanı içerir;bir CCAAT kutusu ve iki GC kutusu (konsensus dizisi GGGCGG) ( (mutasyonu hemoglobinopatilere neden olur) ( (mutasyonu Hemofili A ya neden olur) Dokuya özgün genler Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (House keeping gen) Tipik bir insan geni yapısı Transkripsiyon faktörleri • Transkripsiyon faktörleri, 2 gruba ayrılır: • 1- Genel Transkripsiyon Faktörleri • 2- Gene Özgü transkripsiyon faktörleri, Özel genlerin ekspresyonunu denetler. • Genomdaki genlerin %5’ i, transkripsiyon faktörü kodlar. Transkripsiyon faktörleri • Promotör Diziler RNA polimeraz ve Transkripsiyon faktörleri tarafından tanınır • Bu faktörler, birlikte çalıştığı RNA polimeraz enzimine göre adlandırılırlar. • TF-I (RNA Polimeraz I) • TF-II (RNA Polimeraz II) • TF-III (RNA Polimeraz III) mRNA sentezi • Ökaryotik genler; ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ Düzenleyici bölge Promotör Bölge Başlangıç Sinyali Eksonlar İntronlar Sonlanma Sinyalleri’ nden Oluşur. Transkripsiyonun başlaması • RNA Polimeraz II ve transkripsiyon faktörleri tarafından promotör bölgelerin tanınması ile başlar. • 5 genel transkripsiyon faktörüne ihtiyaç vardır. ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ TF II A, TF II B, TF II D, TF II E, TF II F, TF II H Transkripsiyonun başlaması 1- Önce TF II D (genel transkripsiyon faktörü); TATA dizisine bağlanır.(TF II D ;TBP (TATA ya bağlanan protein) ve TAF lardan (TBP e bağlanan faktörler) oluşan 10 polipeptid içeren bir kompleksdir.) 2- Sonra, TF IIB, TBP ye bağlanır. 3- TF IIF ile birlikte polimeraz bağlanır 4- En son olarak TF IIE ve TF IIH komplekse eklenir. Transkripsiyonun başlaması • TFII H, çok alt birimli bir faktördür. • TFII H nin 2 alt birimi, başlama yeri yakınında DNA yı çözen helikazlardır. • TFII H nin diğer alt birimi, Polimeraz II nin C ucu (CTD) bölgesindeki tekrarlayan dizileri fosforilleyen bir protein kinazdır. RNA Polimerazın karboksi ucu (CTD) • CTD; 7 Aminoasit tekrarından oluşur. (52 tekrar) • CTD fosfatlanması, polimerazı başlama kompleksinden ayırır. • Böylece Polimerazın transkripsiyonu başlatmasını sağlayan diğer proteinler bağlanabilir. • Fosforile olmuş CTD mRNA sentezi ve işlenmesine katılan enzim kompleksleri, uzama ve işleme faktörleri için bağlanma bölgesi oluşturur. Transkripsiyonun başlaması • TF IIH nin Helikaz etkinliği ile DNA 2 ipliği birbirinden ayrılır. TF IIH ın protein kinaz etkinliği ile • RNA Polimerazın karboksi ucu (CTD) fosforillenince, transkripsiyon başlar. • Sentez başlayınca tüm faktörler RNA pol II den ayrılır • Sentez tamamlanınca hem ekson hem de intronları içeren öncül mRNA (pre-mRNA) oluşur. mRNA işlenmesi • Sonraki Aşamalar: ▫ Primer transkriptin 5’ ucuna CAP grubunun eklenmesi ▫ 3’ ucuna Poli-A yapısının eklenmesi ▫ Kırpılma (Splicing) İntronların kesilip çıkartılması, eksonların bir araya getirilmesi. ▫ Kimyasal değişiklikler (metillenme) ▫ mRNA transkriptin 5’ ucunda metile olmuş CAP yapısı 3’ ucunda Poli-A dizisi bulunur. Ökaryot mRNA ların 5’ ucunda, kapsül (CAP) bölgesi • mRNA nın 5’ ve 3’ terminal kısmında translasyonu yapılmayan diziler bulunur (3’-UTR ve 5’-UTR) • Ökaryot mRNA ların 5’ ucunda, kapsül veya başlık denilen bir bölge vardır. • Bu yapının protein sentezinin başlangıç aşamasında Ribozomun bağlanma bölgesinin (AUG başlangıç kodonu) belirlenmesinde iş gördüğü • mRNA yı ekzonukleaz yıkımından koruduğu düşünülmekte. Ökaryot mRNA ların 5’ ucuna, başlık (CAP) bölgesinin eklenmesi İşlenmede ilk basamak; • Transkriptin 5’ ucuna 7 metilguanozin başlık denen yapının eklenmesidir (m7G) İlk 20 – 30 nükleotidin transkripsiyonundan sonra başlık eklenir. 5’ başlık • mRNA nın 5’ ucuna ters yönde bir GTP eklenmesi ile bir 5’-5’ bağlantı oluşturulur. • Eklenen guanosin daha sonra N7 konumunda metillenir ve • mRNA daki ilk bir veya iki nukleotidin ribozlarına metil grupları eklenir. Ökaryot mRNAlarının işlenmesi 5’ ucunun 7-metil guanosin (m7G) başlık ile ve 3’ ucunun poliadenillenme ile değiştirilmesini,ayrıca İntronların kesilip çıkarılmasını kapsar.5’ başlık mRNA nın 5’ ucuna ters yönde bir GTP eklenmesi ile Bir 5’-5’ bağlantı oluşturulur. Eklenen guanosin daha sonra N7 konumunda metillenir ve mRNA daki ilk bir veya iki nukleotidin ribozlarına metil grupları eklenir. Ökaryot mRNA ların 3’ ucunda Poli-A kuyruğu vardır • 3’ ucunda çok sayıda Adeninden oluşan Poli-A kuyruğu vardır. • Poli-A polimeraz tarafından mRNA ya eklenir. • Poli-A dizisine, Poli-A bağlayan proteinlerin bağlanması ile mRNA 3’ ekzonukleaz yıkımından korunur. • mRNA kararlılığını sağlar, • mRNA ların sitoplazmaya taşınmasında görev yapar. Poli–A Kuyruğunun Eklenmesi • 3’ ucu primer transkriptin kesilmesi ve Poli-A kuyruğunun eklenmesi • Poliadenillenme sinyalleri; • Aşağıda G U dan zengin bir dizi • Yukarda korunmuş bir heksanükleotid (memelide AAUAAA) • Onun yukarısında U dan zengin bir dizi • RNA yı kesen bir endonükleaz ve • ~200 nükleotidlik bir Poli-A kuyruğu ekleyen bir • Poli-A polimeraz bu dizileri tanır. Ökaryot mRNAlarının 3’ uçlarının oluşumu:Memeli hücrelerinde poliadenilasyon sinyalleri yukarı ve aşağı GU dan zengin diziler ve AAUAAA heksanukleotid dizisinden oluşur.Bir endonukleaz premRNA yı AAUAAA nın 10-30 nukleotid aşağısından bir CA dizisinden keser.Sonra poli-A polimeraz ~200 A içeren poli-A kuyruğunu RNA nın 3’ ucuna ekler Ökaryot mRNA ların 3’ ucuna Poli-A kuyruğunun eklenmesi mRNA nın nukleustan sitoplazmaya taşınması mRNA nın nukleustan sitoplazmaya taşınması Poli -A kuyruk uzunluğu mRNA çevrimini denetler • Erken gelişimde Poli -A kuyruk uzunluğu mRNA çevrimini denetler • Düzenleyici rol oynar • Döllenmemiş yumurtada kısa Poli -A kuyruklu çok sayıda mRNA (30 – 50 nükleotid uzunlukta) proteine çevrilmeden saklanır • Döllenme depolanan mRNA Poli -A kuyruklarının uzamasını uyarır • Protein sentezini aktive eder Intronların Kesilip Çıkarılması; Kırpılma (Splicing) İn vitro kesip ekleme İntron içeren bir gen bir bakteriyofaj RNA polimerazı tarafından tanınan promotörün aşağı bölgesinde klonlanır.Plazmid, eklenen genin 3’ ucundan kesim yapan bir restriksiyon enzimi ile kesilerek, doğrusal bir DNA Molekülü oluşturulur.Daha sonra bu DNA, bakteriyofaj polimerazı ile in vitro olarak kopyalanarak pre-mRNA üretilir.Bu pre-mRNA memeli hücrelerinin nuklear ekstraktlarına eklenerek kırpılma(kesip ekleme) Reaksiyonları in vitro olarak çalışılabilir Intronların Kesilip Çıkarılması; Kırpılma (Splicing) • Pre-mRNA kırpılması 2 aşamada gerçekleşir; 1- pre-mRNA nın 5’ kesim noktasından (SS) (GU) kesilmesi ve • intronun kesilen 5’ ucunun intron içindeki bir Adenin ile (dallanma noktası) birleştirilmesi 2- İntronun 3’ kesim noktasından kesilmesi (AG) ve • eş zamanlı olarak eksonların birleştirilmesi • intronun ilmek benzeri bir yapı şeklinde çıkarılması ve nukleusta yıkılması Pre-mRNA nın kırpılması : 1-pre-mRNA nın 5’kesim noktasından (SS)(GU) kesilmesi ve intronun kesilen 5’ucunun intron içindeki bir Adenin ile (dallanma noktası) birleştirilmesi 2- İntronun 3’ kesim noktasından kesilmesi (AG) ve eş zamanlı olarak eksonların birleştirilmesi intronun ilmek benzeri bir yapı şeklinde çıkarılması ve nukleusta yıkılması Pre-mRNA ların kırpılma işlemi için gerekli olan 3 önemli dizi • 5’ kesim noktası (SS) dizileri (GU) • 3’ kesim noktası dizileri (AG) • İntron içinde dallanma noktasındaki diziler (adenin) kement benzeri yapıyı oluşturmak üzere intronun 5’ ucunun bağlandığı nokta Kırpılma işlemi • Kırpılma işlemi; • Splisozom denilen RNA+protein kompleksi ile yapılır. • RNA bileşenleri U1 , U2 , U4 , U5 , U6 denen 5 adet küçük nüklear RNA lardır (snRNA) • 50 – 200 nükleotidlik snRNA lar • 6 – 10 protein molekülü ile kompleks yaparak= küçük nüklear ribonukleoprotein taneciklerini (snRNP) oluşturur. Splisozomun Oluşumu ve Kırpılma • U1 snRNP ler pre-mRNA nın 5’ kesim bölgesine (GU) bağlanır. • U2 snRNP ler intronun dallanma noktası dizisine bağlanır • U4/U6 ve U5 snRNP kompleksi splisozoma katılır • U5; 5’ kesim noktasının öncesindeki dizilere bağlanır • U6, U4 den ayrılır ve 5’ kesim bölgesindeki U1 in yerine bağlanır, • U1 ayrılır • U5; 3’ kesim bölgesine de bağlanır Splisozomun yapılanması •İlk basamak U1 snRNP lerin pre-mRNA nın 5’ kesim bölgesine (GU) bağlanması. •Sonra U2 snRNP lerin intronun dallanma noktasına bağlanması. •U4/U6 ve U5 snRNP leri içeren kompleksin splisozoma katılması. •U5, 5’ kesim noktasının yukarısındaki dizilere bağlanır ve U6/ U4 kement benzeri yapı oluşmadan önce U1 ile yer değiştirir U1 ayrılır. •Daha sonra U5 ,3’ kesim bölgesine bağlanır •İntronun çıkartılması ve eksonların birleştirilmesi Splisozomun Oluşumu ve Kırpılma • Kement benzeri bir yapı oluşur • Intron kesilip çıkarılır • Eksonlar birleştirilir • snRNA lar; 1- pre mRNA ların kesim bölgelerini ve dallanma noktalarındaki ortak dizileri tanır 2- Kesilip ekleme reaksiyonunu katalizlerler U1 sn RNA nın 5’ kesim bölgesine bağlanması U1 sn RNA nın 5’ ucu, komplementer baz eşleşmesi ile 5’ kesim noktasındaki ortak Dizilere bağlanır. pre-mRNA dan, İntronların Kesilip Çıkarılması, Eksonların Biraraya Getirilmesi • Kırpılmaya katılan diziler; • İntronların 5’ ve 3’ terminalinde dinukleotid dizileri GU ve AG • Bunlarda mutasyon mRNA kırpılmasında hatalara neden olur Gen ekspresyonunun kontrolü Gen ekspresyonunun kontrolü • mRNA nın transkripsiyonu (yazılımı) aşamasında • mRNA nın işlenmesi sırasında • mRNA nın taşınması sırasında • mRNA nın yıkım aşamasında • Protein etkinliğinin kontrolü Represörler ve transkripsiyonun negatif kontrolü: • 1950 lerde Jacob ve Monod ilk çalışmalar • E.coli’de • Laktoz (yıkılarak glukoz ve galaktoza çevrilir) metabolizmasına katılan enzimlerin ekspresyonunu incelediler • Laktozun yıkılması; • Yıkımı katalizleyen β- galaktozidaz enzimi ve diğer iki enzim (laktoz permeaz ve transasetilaz) ortamda laktoz varsa ifade edilir. • Laktoz kendi metabolizmasında yer alan enzimlerin ekspresyonunu uyarır. • E.coli’de Mutantları tanımladılar. O ve i geni mutantları;sürekli ekspresyon yapan veya uyarılamayan E.Colide transkripsiyonun negatif kontrolü: • Lac operonu negatif kontrolü • Lac operonu denen üç genden oluşan tek bir birim;(z;beta Galaktozidaz, y;permeaz, a; transasetilaz) • İ geni ; transkripsiyonu engelleyen bir represörü kodlar ,laktoz represöre bağlanır ve represörün operatöre bağlanmasını önler. E.Colide transkripsiyonun negatif kontrolü: • represör laktoz yokluğunda operatöre bağlanır ve polimerazın bu üç genin transkripsiyonunu yapmak üzere promotöre bağlanmasını önler. • ortamda Laktoz varsa laktoz represöre bağlanır ve represörün operatöre bağlanmasını önler. • Böylece operonun transkripsiyonu uyarılır. E.Colide transkripsiyonun negatif kontrolü: Lac operonu negatif kontrolü Lac operonu denen üç genden oluşan tek bir birim;(z;betaGalaktozidaz,y;permeaz, a; transasetilaz) İ geni laktoz yokluğunda operatöre bağlanan ve polimerazın bu üç genin transkripsiyonunu yapmak üzere promotöre bağlanmasını önleyen bir represörü kodlar.Laktoz ortamda mevcut ise represöre bağlanır ve represörün operatöre bağlanmasını önler.Böylece operonun transkripsiyonu uyarılır. !960 larda protein izole edildi operator DNA ya bağlandığı gösterildi. Lac operonu çalışmaları • Sonuç: • Transkripsiyonun • DNA dizileri ile • regülatör proteinlerin etkileşmesi yoluyla denetlendiğinin gösterilmesi E.coli’de transkripsiyonun Pozitif kontrolü: • Glukoz, diğer şekerlerin yıkılmasında görevli enzimleri kodlayan genlerin ekspresyonunu kontrol eder • Glukoz varsa glukoz kullanılır diğer sekerlerin yıkım yollarındaki enzimler sentezlenmez. Örn. Ortamda hem Glukoz hem de laktoz varsa lac operonu uyarılmaz.(laktoz varlığında bile) • bakteri glukoz kullanır • Glukoz lac operonunu baskılar. E.coli’de transkripsiyonun Pozitif kontrolü: • Glukoz lac operonunu baskılar. • Bu baskılama cAMP düzeyine bağlı pozitif kontrol • Düşük glukoz düzeyi adenil siklaz enzimini aktifler • .cAMP sentezi artar • cAMP katabolit aktivatör protein (CAP) denen transkripsiyon düzenleyici proteine bağlanır. • cAMP+CAP kompleksi Lac operonu içindeki hedef DNA dizisine bağlanır. E.coli’de transkripsiyonun Pozitif kontrolü: • cAMP+CAP kompleksi Lac operonu içindeki hedef DNA dizisine bağlanır. • Bu dizi transkripsiyon başlama yerinin 60 baz yukarısındadır. • CAP, RNA polimerazın alfa altbirimi ile etkileşime girer. • Polimeraz promotöre bağlanır • Transkripsiyon aktive olur E.coli’de transkripsiyonun Pozitif kontrolü: Düşük glukoz düzeyi adenil siklaz enzimini aktifler.cAMP sentezi artar •cAMP katabolit aktivatör protein (CAP) denen transkripsiyon düzenleyici proteine bağlanır. •cAMP+CAP kompleksi Lac operonu içindeki hedef DNA dizisine bağlanır.Bu dizi transkripsiyon başlama yerinin 60 baz yukarısındadır. •CAP, RNA polimerazın alfa altbirimi ile Etkileşime girer.Polimeraz promotöre Bağlanır.Transkripsiyon aktive olur Ökaryot Gen Ekspresyonunun Kontrolü • Transkripsiyonun başlangıç aşamasında kontrol; • Bakterilerdeki gibi düzenleyici dizilere bağlanan ve RNA polimerazın etkinliğini düzenleyen proteinler tarafından kontrol edilir • Prokaryotlardan farklı olarak Ökaryotlarda kromatin yapısı değişiklikleri Transkripsiyon kontrolünde anahtar rol oynar. • Başlangıç dizisinin ön tarafında bulunan çok sayıdaki regülatör diziler transkripsiyonun kontrolünden sorumludur. Ökaryotlarda Transkripsiyon • Prokaryot ve Ökaryot Hücreler Arasındaki Farklar: 1- Bakteride tek bir RNA polimeraz (tüm genlerin transkripsiyonundan sorumlu) ▫ Ökaryotik hücrelerde, birden fazla farklı RNA polimerazlar bulunur. 2- Ökaryotik RNA polimerazlar promotör diziye, ek proteinler ile bağlanır. Transkripsiyon daha karmaşık Daha gelişmiş gen ekspresyonu regülasyonu gerekli Ökaryotik RNA Polimerazları ▫ 3 farklı Nükleer RNA Polimeraz bulunur ▫ RNA Polimeraz I ▫ RNA Polimeraz II ▫ RNA Polimeraz III 1-mRNA’ lar ; RNA Polimeraz II ile 2-rRNA’ lar ve tRNA’ lar ; RNA Polimeraz I ve III ile (Pol I 28s, 18s, 5.8s rRNA ların; Pol III 5s rRNA ların sentezi) 3-Küçük RNA lar; snRNA (küçük nükleer RNA ;kesip ekleme ) , scRNA [küçük sitoplazmik RNA; protein taşınması) RNA Pol III ve RNA Pol II tarafından sentezlenir. Ökaryotlarda promotör bölge • Ökaryotlarda promotör bölge; başlangıç noktasının (+1) önünde • -30 konumunda TATA dizisi (genel transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgeleri) • -80 konumunda CAAT dizisi, • Bazı genlerde GC elemanı • Ökaryotik RNA polimerazların transkripsiyonu başlatmak için transkripsiyon faktörleri denen özel proteinlere ihtiyacı vardır. Ökaryotik Promotör diziler • Herpeks simpleks timidin kinaz geni promotörü TATA kutusunun önünde verimli transkripsiyon için gerekli olan üç dizi elemanı içerir;bir CCAAT kutusu ve iki GC kutusu (konsensus dizisi GGGCGG) Transkripsiyonun başlaması • RNA Polimeraz II ve transkripsiyon faktörleri tarafından promotör bölgelerin tanınması ile başlar. • 5 genel transkripsiyon faktörüne ihtiyaç vardır. ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ TF II A, TF II B, TF II D, TF II E, TF II F, TF II H Ökaryot regülatör dizilerin belirlenmesi Klonlanan regülatör dizi kolay belirlenen bir raportör gene bağlanır • Bu plazmid kültürdeki hücrelere transfeksiyonla verilir. •regülatör dizi raportör genin transkripsiyonunu ilerletir ve enzim varlığı hücrede belirlenir Regülatör diziler • Promotörler ve • Güçlendiriciler • RNA Polimeraz II ile transkripsiyonu yapılan genlerin genel transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgesi oluşturan • TATA kutusunu kapsayan esas promotör elemanları vardır. • TATA kutusunun yukarı bölgesinde diğer regülatör diziler yerleşmiştir.Örn. CCAAT ve GGGCGG (GC kutusu) konsensus dizileri (TATA kutusunun 100 bç yukarısında) (özel genlerin ekspresyonunu kontrol eden) Ökaryotik bir Promotör • H. Simpleks timidin kinaz geni promotörü.TATA kutusunun önünde verimli transkripsiyon için gerekli olan üç dizi elemanı içerir;bir CCAAT kutusu ve iki GC kutusu (konsensus dizisi GGGCGG) Memeli hücrelerindeki pek çok gen • Transkripsiyon başlangıç yerine daha uzak olarak yerleşmiş (bazen 10 kb den fazla) regülatör diziler tarafından kontrol edilir. • Bunlar güçlendirici (enhancer) olarak adlandırılır • İlk olarak SV 40 promotöründe tanımlanmıştır • Transkripsiyonun verimliliği için TATA kutusu ve altı adet GC kutusuna ek olarak daha yukarıda yerleşmiş iki adet 72 bç lik tekrar gereklidir. • Etkinliği ne uzaklığı ile ne de yönü ile ilişkili değil • Promotörün hem yukarı hem de aşağı yönde yerleştiğinde uyarabilirler SV 40 güçlendiricisi: SV 40 ın erken gen ekspresyonu için kullandığı promotörü, TATA kutusu ve üç grup halinde tekrarlanan altı GC kutusu içerir.Buna ek olarak verimli transkripsiyon için yukarı yönde yerleşmiş iki adet 72 baz çiftlik tekrardan oluşmuş güçlendirici gereklidir. Güçlendiriciler, • Bu diziler promotörün hem yukarı hemde aşağı yönünde yerleştiklerinde transkripsiyonu uyarabilirler. • Başlama yerinden uzakta bulunduklarında dahi iş görürler • Güçlendiriciler de promotörler gibi transkripsiyon faktörlerinin bağlanması ile iş görürler • Uzaktaki Güçlendiriciye bağlanan TF ler promotör bölgede RNA polimeraza bağlanan proteinlerle DNA ilmiklenmesi sayesinde etkileşirler. Güçlendiricilerin çalışma şekli (A). Güçlendirici etkisinde olmayan gen düşük seviyede transkripsiyon Yapar. Bir güçlendirici (E) eklenmesi (örn. SV 40 ın 72 baz çifti tekrarları) transkripsiyonu uyarır. Güçlendirici, sadece promotörün tam yukarı yönünde yerleştiğinde (B) değil, transkripsiyon başlama yerinin birkaç kilobaz yukarısı veya aşağısına eklendiğinde de (Cve D) Aktivite gösterir. DNA nın ilmiklenmesi DNA nın ilmik oluşturabilmesi sayesinde uzak güçlendiricilere bağlı transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II/ aracı kompleksi veya promotördeki genel transkripsiyon faktörleriyle etkileşebilirler.Bu yüzden transkripsiyon faktörlerinin DNA ya, promotörün tam yukarısında bağlanmaları ile uzak bir güçlendiriciye bağlanmaları arasında işlevsellik açısından farklılık yoktur • Özel Transkripsiyon düzenleyici proteinlerin güçlendiricilere bağlanması • Gelişim ve farklılaşma süreclerinde • Hormon ve GF lere yanıtlarda • Gen ifadesi kontrolünden sorumlu • B lenfositlerinde Ig genlerinin transkripsiyonunu kontrol eden güçlendiriciler diğer hücrelerde aktif değil • Farklılaşmış hücrelerde Ig genlerinin dokuya özgü ekspresyondan sorumlu Regülatör diziler • Güçlendiriciler, • farklı dokuda, farklı genlerin promotör etkinliğini arttırabilir. • Genin ekspresyonunun yapılıp yapılmayacağını da belirler. • Dokuya özgü proteinlerle etkileşirler. • Güçlendiriciler • Farklı düzenleyici proteinlerin bağlandığı çok sayıda dizi elemanı içerir. • Bu proteinler beraberce gen ekspresyonu düzenlenmesini sağlar • Ig ağır zincir güçlendiricisi 200 bç dir ve 9 işlevsel dizi elemanı içerir İmmünoglobulin güçlendiricisi • En çok çalışılan memeli güçlendiricisi • B lenfositlerde immünoglobulin genlerinin transkripsiyonunu kontrol eden güçlendiricidir • Bu güçlendirici lenfositlerden başka hücrelerde aktif değil • Dokuya özgü ekspresyondan sorumlu • Güçlendiriciler genellikle Farklı düzenleyici proteinlerin bağlandığı çok sayıda dizi elemanı içerirler. • Bunlardan herhangi birindeki mutasyon güçlendirici etkinliğini düşürür.Fakat durdurmaz. İmmünoglobulin güçlendiricisi İmmünoglobulin ağır zincir güçlendiricisi, yaklaşık 200 baz uzunluktadır ve B lenfositlerinde,birlikte transkripsiyonu uyaran 9 işlevsel dizi elemanı içerir Regülatör diziler ▫ ▫ ▫ ▫ transkripsiyon başlangıç yerine uzaktır. Transkripsiyonu başlatmaz Transkripsiyon miktarını kontrol eder. Etkileri hücre tipine bağlıdır ▫ Promotörlerin çoğunun etkinliği, ayrı bir düzenleyici dizi tarafından düzenlenir Transkripsiyon kontrol eden proteinler • Regülatör dizilere bağlanan ve RNA Polimeraz II etkinliğini düzenleyen proteinler tarafından yapılır. • Bunlardan • transkripsiyon aktivatörleri : ▫ Transkripsiyon faktörleri ile etkileşerek (TFIIB ve TFIID) RNA polimerazın aktifleşmesini sağlayarak ▫ Kromatin yapısını değiştirerek ▫ Transkripsiyonu uyaran ko-aktivatörlerle etkileşerek etkilerini gösterirler. ▫ transkripsiyon aktivatörleri ▫ Promotöre veya güçlendirici dizilere bağlanır Transkripsiyon düzenleyici proteinler • Promotör dizilerden; • CAAT ve GGGCGG [GC Kutusu] dizilerine bağlanan ve • transkripsiyonu uyaran proteinler vardır.Örn. • SP-1 faktörü (spesifisite-1 faktörü) GC kutusuna bağlanır. GC yoksa uyaramaz. • İlk bulunan transkripsiyon aktivatörüdür • SP-1, iki altbirimden oluşur. • Biri DNA’ ya, • diğeri transkripsiyon faktörlerine bağlanır. . Transkripsiyon aktivatörlerinin belirlenmesi için denatüre etmeyen jelde elektroforez yöntemi kullanılması Transkripsiyon represörleri • Regülatör dizilere bağlanarak, transkripsiyonu baskılar. Promotöre • transkripsiyon faktörlerinin ya da • RNA polimerazın bağlanmasını engelleyerek etkilerini gerçekleştirirler • Bazı represörler regülatör diziye bağlanmak için aktivatörler ile yarışır. Ökaryot represörlerinin işleyiş şekli . A)Bazı represörler aktivatörlerin regülatör dizilere bağlanmasını engeller B)Diğerleri aracı proteinlerle etkileşerek (veya genel transkripsiyon faktörleri ile ve kromatin yapılanmasını değiştiren ko-represörlerle etkileşerek transkripsiyonu engeller KROMATİN YAPISI İLE TRANSKRİPSİYON İLİŞKİSİ Aktivatör ve represörler Hem Transkripsiyon sisteminin diğer bileşenleri ile etkileşerek Hem de kromatin yapısındaki değişiklikler ile düzenler. Ökaryotlarda; • DNA histonlarla sıkıca bağlı • Nükleozom • H2A, H2B, H3,H4 histonların her birinden (2 şer adet) • 146bç DNA • Aktif genler 30nm.lik İplik yapısında • Az yoğun kromatin Az yoğun kromatin de görülen özellikler • Histon modifikasyonu • Nükleozom yeniden düzenlenmesi • HMGN proteinlerinin (non-histon protein ) aktif transkripsiyonu yapılan genlerin nükleozomlarına bağlanması HMGN proteinleri nukleozom üzerinde ; • H1’in bağlanma yerine bağlanıyor. • H1’in nükleozom ile etkileşimini bozarak yoğun olmayan kromatin yapısının devamlılığını sağlar. • Transkripsiyonu uyarır. Histon modifikasyonları HİSTON ASETİLLENMESİ • Aktif kromatinde görülür. • Kor Histonların N ucu (kuyruk) nükleozomdan dışa uzanır, lizinden zengin LİZİNLERİN ASETİLLENMESİ ile modifiye edilir • Histonların pozitif yükünü azaltır • onların DNAya bağlanma ve diğer proteinlerle bağlanmasını zayıflatabilir. • Nükleozomal DNA ya transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasını kolaylaştırır. • Proteinlerin kromatine ulaşılabilirliğini de arttırır AKTİVATÖRLERİN Histon asetiltransferaz(HAT) REPRESÖRLERİN Histon deasetilaz (HDAC) ile birleştikleri 1996 da gösterildi. Histon asetilasyonu ile transkripsiyon ilişkisi ortaya kondu. Tetrahymena nın HAT geni klonlandı. Transkripsiyon kofaktörü (mayanın) Gcn5p ile dizisi çok benzer çıktı . Gcn5p Transkripsiyon aktivatörleri ile birleşerek transkripsiyonu uyarır.Gcn5p HAT etkinliği gösterir HAT ın birçok memeli transkripsiyon faktörü ile ve TFIID ile benzer olduğu gösterildi. • Memeli ve mayalarda Represörler HDAC işlevi görür. • • • • • • • Ayrıca Histonlar Serin kalıntılarında fosfatlanarak Lizin ve argininden metillenerek Lizinlerin ubikutinlenmesi ile modifiye edilirler (histon kuyruklarından) Bunların hepsi birlikte Bazı düzenleyici proteinleri kromatine getiren ve gen ifadesini düzenleyen bir histon kodu oluşturur • • • • Aktif kromatin H3 ün lizin4 de metillenme Serin 10 da fosfatlanma Lizin 9 ve lizin 14 asetillenmesini kapsayan özgün modifikasyonlar içerir. • İnaktif kromatin ise • Lizin 9 metillenmesi ile ilişkili Kromatin yoğunlaşması ile ilgili • histonları değiştiren enzimler ile kromatin yapısının düzenlenmesi Nukleozom yeniden biçimlendirme faktörleri • Nukleozomların yapısını • Histonları modifiye etmeden değiştiren protein kompleksleridir • Etki mekanizmalarından biri • Histon oktamerlerinin DNA üzerinde kaymasını katalizleyerek nukleozomların yerleşimini değiştirmek • Transkripsiyon faktörlerinin spesifik DNA dizilerine ulaşmasını sağlamak Nukleozom yeniden biçimlendirme faktörleri • Bu faktörler nukleozom şeklinin değişimine neden olarak da transkripsiyon düzenleyen proteinlerin spesifik DNA dizileri ile etkileşmesini sağlayabilir. • Histon modifiye eden enzimler ve • Nukleozom yeniden biçimlendirme faktörlerinin • Transkripsiyon aktivatörleri ile birlikte bağlanması • Güçlendirici ve promotör bölgelerde kromatin yapısını değiştirerek transkripsiyonun başlamasını sağlar DNA metillenmesi • Omurgalılarda transkripsiyon kontrolünde kromatin yapısı ile ilişkili genel bir mekanizmadır. • DNA daki Sitozin birimleri 5-pozisyonundaki karbona metil grupları takılarak modifiye edilir. • CpG adacıklarında metillenme bunları içeren genlerin transkripsiyon etkinliğinin azaltılması ile ilişkilidir • Transkripsiyon aktivatörlerinin bağlanmasını engelleyerek veya • Metillenmiş DNA ya bağlanan represörlerin katılımını sağlayarak • Gelişim sürecinde gen inaktivasyonunun sürekliliğinde ve korunmasında katkı sağlar GEN İFADESİNİN KONTROLÜ Gen ifadesini gerçekleştiren her basamakta düzenlenebilir. • En çok kullanılan transkripsiyon un başlangıcının kontrolü • Daha sonra devreye giren denetimler ürün miktarını değiştirebilir • Posttranskripsiyonel kontroller birçok gen için çok önemlidir Transkripsiyonun zayıflatılması • Bakterilerde bazı genlerin ifadesi transkripsiyonun erken sonlandırılması ile önlenir. • Sentezlenen RNA zinciri RNA polimerazın trankripsiyonu sonlandırmasına neden olan bir yapı kazanır. • Ürüne ihtiyaç olduğunda düzenleyici proteinler, oluşan RNA zincirine bağlanır ve • sonlandırmaya neden olan durum ortadan kaldırılır. • RNA’nın transkripsiyonu gerçekleşir. Ökaryotlarda transkripsiyonun zayıflatılması farklı mekanizmalarla olur. HIV virüsü iyi incelenmiş bir örnek • Virüs konak genomuna girdikten sonra • hücrenin RNA pol II si viral DNA’nın transkripsiyonunu sağlar • Konak polimeraz birkaç yüz nükleotid sentezledikten sonra transkripsiyonu sonlandırır. • Viral DNA’nın tümünün trankripsiyonu gerçekleşmez. • Uygun şartlar olduğunda virüs tarafından kodlanan Tat proteini erken sonlanmayı önler. • Tat proteini uzayan RNA da özgün bir sap ilmek yapısına bağlanır.(bu yapıya Tar denir.) • Tat • RNA polimerazın transkripsiyona devamını sağlayan proteinleri buraya toplar • (bunların bir kısmı erken sonlanmayı önleyen proteinlerdir.) • Böylece HIV tek bir viral proteinin etkisiyle ve • normal hücresel mekanizmalardan faydalanarak kendi genomunun transkripsiyonunu sağlar. Alternatif kırpılma ile gen ifadesinin kontrolu Drozofila’da cinsiyetin belirlenmesi bir dizi RNA kırpılma olayına bağlıdır. • RNA kırpılmasının düzenlenmesi en iyi bilinen örnek Drozofilanın erkek veya dişi olacağının X kromozomu/ otozom oranı ile belirlenmesi • 2X + 2 otozom = dişi • X + 2 otozom = erkek (0,5) Düzenleyici (Regülatör) RNA lar • Jacob ve Monod, 50 yıl önce gen regülasyonu çalışmaları ile represörleri buldular. • Ancak; bunların protein mi RNA mı olduğunu söyleyemediler. • Çoğu durumda düzenleyiciler DNA ya bağlanan proteinler • RNA molekülleri olabileceğine işaret ettiler • Protein düzenleyiciler bulundukça bu düşünce unutuldu • Son yıllarda • RNA düzenleyicilerin araştırılmasında patlama yaşandı (Transkripsiyon seviyesinde ve translasyon seviyesinde iş görüyordu) • Bu yeni alan 2 kaynaktan çıktı • 1- MikroRNA ların keşfi (1990 ların başı) • 2-RNA interferans olgusunun keşfi ( geç 1990 lar) Küçük RNA lar • Küçük RNA lar bakterilerde tanımlandı • Bazısı plazmid replikasyonuna • Diğerleri gen ifadesinin düzenlenmesine katılıyordu mikroRNA (miRNA) •yaklaşık 21-23 nükleotid uzunluğunda kodlayıcı olmayan RNA lardandır •Tek iplikli RNA molekülleridir • gen ifadesinin düzenlenmesinde rol oynar. •miRNA'lar,. Pri-miRNA olarak adlandırılan primer transkriptler işlenerek • önce pre-miRNA adlı kısa sap- ilmek yapılarına, • sonra da fonksiyonel miRNA'ya dönüşürler. •Olgun miRNA molekülleri bir veya daha çok (mRNA) ile kısmen tamamlayıcıdır ve •başlıca işlevleri gen ifadesini azaltmaktır •1993'te Lee ve çalışma arkadaşları tarafından keşfedilmişlerdir mikroRNA terimi ilk 2001'de kullanıma girimiştir RNA interferens • RNA interferens, ökaryotlarda temel bir düzenleyici mekanizmadır. • Bazı ökaryotik, genlerin transkriptlerinde düzenleyici RNA elemanları vardır. • Bunlar, regülatör proteinlere bağlanarak (ör. HIVTAT protein) iş görür. • Bugün RNA ların gen regülasyonunda çok daha yaygın bir rol oynadığı açığa çıkmıştır • Çeşitli Çok kısa RNA lar, kendileriyle homoloji bölgeleri içeren bazı genlerin ekspresyonunu baskılar veya susturur.Buna RNA interferans adı verilir RNA interferens (RNAi) • Bu susturmaya RNA interferens (RNAi) denir. • Çeşitli şekillerde görülür; ▫ mRNA translasyonunu inhibe ederek ▫ mRNA nın yıkılmasını sağlayarak ▫ mRNA nın ekspresyonunu yöneten promotörün transkripsiyonel susturulması ile Kısa RNA lar • Bu kısa RNA lar, çeşitli daha uzun çift iplikli RNA lardan özel enzimler ile oluşturulur. • Bu RNA ların işlevlerinin; ▫ Gelişim sırasındaki regülasyondan ▫ Organizmayı viral enfeksiyonlara karşı koruyan mekanizmalara ▫ kadar geniş bir alanda olduğu kesindir. ▫ Ayrıca RNAi; güçlü bir deneysel yöntem olarak özel bir genin ekspresyonunun kapatılması (durdurulması) için kolay bir yol oluşturmaktadır. Küçük RNA lar Orijinlerine göre farklı isim alırlar Mikro RNA lar, (miRNA) • hücrede genlerde şifrelenen prekürsör RNA lardan oluşur ve özgün regülatör işlevleri vardır • • • • Diğer bir düzenleyici RNA grubu. Yapay olarak yapılan ya da in vivo olarak dsRNA öncüllerinden yapılanlar, küçük interfering RNA adını alır (siRNA) Olgun miRNA’lar o Tek iplikli ve 21 nukleotidlik RNA molekülleridir. o miRNA genlerinin genellikle RNA polimeraz II ile transkripsiyonu yapılır. o Primer transkript (yüzlerce nt uzunlukta olabilir)pri-miRNA o pri-miRNA Nukleusta Drosha enzimi (RNAz III) ile işlenir pre-miRNA oluşur. o (pre-miRNA)lar 70-100 nukleotidlik saç tokası şeklindeki öncül miRNAlardır o Sitoplazmaya taşınır (exportin-5 ile) miRNA oluşumu o Sitoplazmada Dicer enzimi (RNAz III) ile tekrar işlenir. • si-RNA benzeri bir dupleks oluşur. • 5’ ucundan zayıf baz eşleşmesi ile RISC = (RNA ile indüklenen susturma kompleksi) içine girer o miRNA nın hedefine bağlanması RISC içinde olur. o miRNA’nın 5’ ucu ile hedef mRNA’nın 3’ UTR bölgesi arasındaki komplementerlik bağlanma için esastır. o Susturulma için Argonaute ailesinden (AGO) proteinler gerekli. • RISC miRNA veya siRNA ya ek olarak Argonaute ailesinden proteinler de içerir Argonaute katalitik alt birimdir mRNA nın ilk kesilmesini gerçekleştirir (Slicer da denir) • Eğer dizi çok iyi komplementer ise hedef yıkılır • Eğer eşleşme iyi değil ise ( birkaç bç eşleşmemişse) • translasyon inhibisyonu olur • RNAİ susturması çok verimlidir • Çok az miktarda ds RNA hedek genlerin ekspresyonunun nerdeyse tamamen durdurulmasını indüklemek için yeterlidir MicroRNA (miRNA) prekursör mikroRNA (pre-miRNA)'dan meydana gelir, o da bir mikroRNA primer transkriptinden (pri-miRNA'dan) meydana gelir MicroRNA (miRNA) prekursör mikroRNA (pre-miRNA)'dan meydana gelir, o da bir mikroRNA primer transkriptinden (primiRNA'dan) meydana gelir. . g i f RNAi silencing is initiated when double-stranded RNA (dsRNA) is - miRNAs encode a novel class of small, ncRNAs that regulate fig1_blurb-3.jpg vitro studies of RNA-induced gene silencing, or RNA This model is based on the results of in vitro studies of RNA-induced gene silencing, or RNA interference (RNAi), in animal extracts (reviewed in Ref. 23). RNAi is believed to operate in a similar manner in plants because small interfering RNAs (siRNAs) are found in silenced plants, and plants have homologues of the animal gene Dicer. Double-stranded RNA (dsRNA) from replicating viral RNA, viral-vector-derived (VIGS, or virus-induced gene silencing) RNA or hairpin RNA (hpRNA) transcribed from a transgene, is processed by a Dicercontaining complex to generate siRNAs. An endonuclease-containing complex (called the RNAi silencing complex, RISC), is guided by the antisense strand of the siRNA to cleave specific mRNAs, so promoting their degradation. siRNA ve miRNA • Her ikisi de Dicer adlı bir enzimle daha uzun RNA lardan oluşturulur. • Bu RNAse III e benzer bir enzimdir. • Uzun dsRNA veya miRNA öncüllerinin oluşturduğu sap-ilmik yapılarını tanır. • siRNA ve miRNA 21-23 nükleotid uzunluktadır. Bunlar, homolog hedef genlerin ekspresyonunu 3 şekilde baskılar. • mRNA nın yıkılmasını tetikler • mRNA translasyonunu inhibe eder veya • Gen içindeki Kromatin modifikasyonlarını indükleyerek transkripsiyonu susturur. • Hangi yol kullanılırsa kullanılsın RISC gereklidir RNA susturulması Bir gene homoloji bölgesi içeren bir çift iplikli RNA molekülü hücreye girdiğinde veya hücrede Yapıldığında genin ekspresyonu Durdurulur. Bu etki çift iplikli RNA nın siRNA veya miRNA oluşturmak üzere Dicer denilen enzimle İşlenmesini içerir.MiRNA oluşumuna ise Drosha adlı bir diğer enzim daha katılır. siRNA ve miRNA genleri 3 yoldan susturmak üzere RISC adlı komplekse gider 1-SiRNA ile homoloji taşıyan mRNA ya saldırır ve sindirir 2- mRNA nın translasyonunu önler veya 3- Kromatin modifiye eden enzimleri mRNA nın Ekspresyonunu yöneten promotöre yönlendirir • RISC miRNA veya siRNA ya ek olarak Argonaute ailesinden proteinler de içerir Argonaute katalitik alt birimdir mRNA nın ilk kesilmesini gerçekleştirir (Slicer da denir) • Eğer dizi çok iyi komplementer ise hedef yıkılır • Eğer eşleşme iyi değil ise ( birkaç bç eşleşmemişse) • translasyon inhibisyonu olur • RNAİ susturması çok verimlidir • Çok az miktarda ds RNA hedek genlerin ekspresyonunun nerdeyse tamamen durdurulmasını indüklemek için yeterlidir Sinir Sistemi ve miRNA’lar Posttranskripsiyonel düzenleme • Nöron gelişimi ve • MSS işlevlerine katılan bir mekanizmadır • Bu yolağın karmaşıklığı miRNA’ların keşfi ile daha iyi anlaşıldı. Bunlar kodlayıcı olmayan bir küçük RNA sınıfıdır. • Hedef mRNA’nın translasyonunu baskılar veya • Yıkılmasını indükler (mRNA’nın 3’ UTR bölgesine baz eşleşmesi tam ise) Susturma mekanizmaları 1. Translasyonun başlamasını önlemek • miRNA aracılı deadenilasyon ve yıkılma • • • • • İşlenme cisimleri (processing) P-cisimcikleri mRNA depolanma ve yıkılma yerleri MSS, miRNA’larca çok zengin ve beyine özgü Tek miRNA birkaç 100 farklı mRNA’yı hedefleyebilir. MSS gelişimi ve işlevlerinde çok sayıda rolü var. Sinir Sisteminde miRNA ekspresyonu Beyinden ve nöral hücre hatlarından • Çok sayıda benzeri olmayan miRNA izole edildi. • Çoğu poliribozomlarla ilişkili • miRNA’ların translasyonun düzenlenmesine katıldığını gösterir • Mikrodizin teknolojisi ile miRNA ekspresyonunun sinir sisteminde dokuya özgü şekilde dinamik olarak düzenlendiği gösterildi MSS’de • mir-138 • mir-124 çok fazla ifade edilir. • Bazısı bölgeye veya hücreye özgü; mir-222 sadece telensefalonda (zebra balığında) mir-29 astrositlerde • Bazısı gelişim sırasunda düzenlenir. mir-92b nöronal progenitör hücrelerde yüksek Düzeyde iken farklılaşmış nöronlarda yok ,veya tam tersi. Örneğin; mir-124 Mechanism of RNA interference. (Reprinted by permission of Phillip D. Zamore.) .. vitro studies of RNA-induced gene silencing, or RNA 600 × 738 600 × 738 bir pre-microRNA'nın sap-ilmik yapısı. miRNA'yı kodlayan genler işlenmiş olgun miRNA molekülünden çok daha uzundur. miRNA'lar önce birincil (primer) transkript, veya pri-miRNA olarak yazılırlar, bu transkriptlerin birer başlığı ve poli-A kuyruğu vardır. Bunlar işlem görüp hücre çekirdeğinde pre-miRNA olarak bilinen kısa, 70 nükleotit uzunlukta, sap-ilmik şekilli, öncül (prekürsör) yapılara dönüşür. Bu işlenme hayvanlarda Mikroişlemci kompleks (İng. Microprocessor complex) adlı bir protein kompleksi tarafından gerçekleştirilir. Mikroişlemci kompleks'te Drosha adlı bir nükleaz, ve Pasha adlı çift iplikli RNA bağlayıcı protein bulunur.[3] Pre-miRNA'lar sonra sitoplazmada Dicer adlı endonükleaz ile etkileşerek olgun miRNA'ya dönüşürler. Dicer aynı zamanda RNA-indüklenmiş susturma kompleksi (İng. RNA-induced silencing complex; RISC) oluşumunun başlatır.[4] Bu kompleks miRNA ifadesi ve RNA interferanstan kaynaklanan gen susturmasından f . m 360 × 356 - ... i R Ntranscripts occurs A _ P r o c e s s i n g _ a n d _ A c t i v i t y _ through a multi-step process that is 421 × 463 RNAi pathway
