melatoninin mcf-7 hücre kültüründeki apoptoz aktivasyonunun ve
advertisement
MELATONİNİN MCF-7 HÜCRE KÜLTÜRÜNDEKİ APOPTOZ AKTİVASYONUNUN VE SİTOTOKSİSİTESİNİN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR), MTT HÜCRE CANLILIK TESTİ VE İMMUNSİTOKİMYA YÖNTEMLERİYLE ARAŞTIRILMASI Semin GEDİKLİ Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Tez Danışmanı Prof. Dr. Elvan ÖZBEK Doktora Tezi - 2013 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MELATONİNİN MCF-7 HÜCRE KÜLTÜRÜNDEKİ APOPTOZ AKTİVASYONUNUN VE SİTOTOKSİSİTESİNİN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR), MTT HÜCRE CANLILIK TESTİ VE İMMUNSİTOKİMYA YÖNTEMLERİYLE ARAŞTIRILMASI Semin GEDİKLİ Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi Tez Danışmanı Prof. Dr. Elvan ÖZBEK ERZURUM 2013 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR.......................................................................................................... III ÖZET...................................................................................................................... IV ABSTRACT........................................................................................................... V SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ...................................................... VI ŞEKİLLER DİZİNİ.............................................................................................. VIII TABLOLAR DİZİNİ…........................................................................................ XI 1. GİRİŞ................................................................................................................. 1 2. GENEL BİLGİLER......................................................................................... 3 2.1. Kanser.............................................................................................................. 3 2.1.1. Kanser Oluşumuna Etki Eden Faktörler....................................................... 4 2.2. Meme Kanseri.................................................................................................. 8 2.2.1. Meme Kanseri Oluşumuna Etki Eden Faktörler........................................... 10 2.2.1.1. Östrojen...................................................................................................... 11 2.2.1.2. Oksidatif Stres............................................................................................ 12 2.2.1.3. Apoptoz (Programlı Hücre Ölümü)........................................................... 15 2.3. Antioksidanlar.................................................................................................. 17 2.3.1. Melatonin...................................................................................................... 18 2.3.1.1. Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi.................................. 21 3. MATERYAL VE METOT.............................................................................. 24 3.1. Hücre Kültürü.................................................................................................. 24 3.1.1. Hücre Kültürü Medyumunun Hazırlanışı...................................................... 24 3.1.2. Hücre İnkübasyon Koşulları......................................................................... 24 3.1.3. Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing)....................................................... 24 3.1.4. Hücrelerin Dondurulması ve Saklanması...................................................... 25 3.1.5. Hücre Sayılarının Hesaplanması................................................................... 25 3.2. Melatonin Dozunun Belirlenmesi.................................................................... 26 3.3. Hücre Proliferasyon Analizi............................................................................. 26 3.4. Biyokimyasal TAS ve TOS Analizleri............................................................. 28 3.5. İmmunsitokimyasal (ICC) Boyama Metodu.................................................... 29 3.6. İmmunsitokimyasal Değerlendirme................................................................. 31 3.7. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real-Time PCR) Analizleri.. 32 3.7.1. mRNA Ekstraksiyonu.................................................................................. 32 I 3.7.2. cDNA (Komplementer Zincir) Sentezlenmesi.............................................. 33 3.7.3. p53 Gen Ekspresyonunun Yarı Kantitatif Olarak Ölçülmesi……………... 34 4. BULGULAR...................................................................................................... 35 4.1. Etkin Melatonin Dozunun Belirlenmesi........................................................... 35 4.2. Melatoninin Anti-proliferatif Etkisinin MTT Yöntemiyle Belirlenmesi........ 36 4.3. Biyokimyasal Total Oksidan Seviyesi ve Total Antioksidan Kapasitesi Değerlendirme Sonuçları........................................................................................ 37 4.4. İmmunsitokimyasal Sonuçlar........................................................................... 39 4.4.1. Stereolojik İmmunsitokimyasal p53 Pozitif Hücre Yoğunluğu………........ 39 4.4.2. İmmunsitokimyasal Bax Pozitif Hücre Yoğunluğunun Stereolojik Analizi Sonuçları…………................................................................................................ 43 4.5. PCR Sonuçları.................................................................................................. 47 5. TARTIŞMA....................................................................................................... 54 6. SONUÇ VE ÖNERİLER................................................................................. 62 KAYNAKLAR....................................................................................................... 64 EKLER................................................................................................................... 82 EK-1. ÖZGEÇMİŞ................................................................................................ 82 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU………………………………………... 83 II TEŞEKKÜR Doktora eğitimim süresince akademik açıdan yetişmemi sağlayan, bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, her konuda destek olan ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen tez danışmanım, değerli hocam Prof. Dr. Elvan Özbek’e sonsuz teşekkürlerimi ve şükranlarımı sunarım. Tez çalışmamın yürütülmesi aşamasında katkılarını esirgemeyen, laboratuvar imkânlarından yararlanmamı sağlayan Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Ahmet Özbek’e, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Başkanı Doç. Dr. Abdulgani Tatar’a, Biyolog Saltuk Buğra Karahan’a, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı akademik personeli Prof. Dr. Bünyami Ünal’a, Doç. Dr. Deniz Ünal’a, Yrd. Doç. Dr. İsmail Can’a ve tez çalışmamın her aşamasında benden desteğini ve yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Adem Kara’ya teşekkür ederim. Beni sabırla her anlamda destekleyen eşime ve kızlarıma da sonsuz teşekkürü bir borç bilirim. Semin GEDİKLİ III ÖZET Melatoninin MCF-7 Hücre Kültüründeki Apoptoz Aktivasyonunun ve Sitotoksisitesinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), MTT Hücre Canlılık Testi ve İmmunsitokimya Yöntemleriyle Araştırılması Amaç: Meme kanseri Türkiye’de ve dünyada en sık görülen kanser türlerinden biridir ve kanser nedeniyle gelişen ölüm oranları arasında en üst sıralarda yer almaktadır. Kanser sadece bir sağlık sorunu değil aynı zamanda sosyal ve ekonomik açıdan bir toplum sorunu haline gelmiştir. Bu kadar önemli bir sağlık sorununa çözüm bulunması ise birçok araştırıcının birinci hedefleri arasındadır. Bu nedenle tedaviye yönelik farklı çalışmalar yapılmakta ve farklı maddelerin bu hastalık üzerindeki etkileri yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bu çalışmada modern tıpta çok yönlü etkileriyle bilinen bir molekül olan melatoninin kanser ile ilişkisini ve kanser hastalığına çözüm açısından sağlayabileceği katkıyı irdelemeyi amaçlamaktayız. Materyal ve Metot: Çalışmada kullanılan insan meme kanseri MCF-7 hücre hattına, melatoninin sitotoksik dozunu ve IC50 değerini belirlemek için, 10 nM - 100 000 nM konsantrasyon aralığında melatonin uygulandı. Bu uygulamanın ardından hücre hatlarında MTT analizi (hücre canlılık testi) yapıldı. Etkin dozlar belirlendikten sonra, melatonin uygulanmayan kontrol grubu ve 10, 100, 1000, 10 000, 100 000 nM konsantrasyonlarda 24 saat süreyle melatonin uygulanan 5 çalışma grubu olmak üzere 6 deney grubu oluşturuldu. Bütün deney gruplarındaki total antioksidan (TAS) ve total oksidan seviyesi (TOS), apoptotik aktivite (Bax ve p53 immunpozitifliği) ve p53 gen ekspresyon düzeyleri araştırıldı. Bulgular: MCF-7 hücrelerine uygulanan melatoninin, hücre çoğalmasını engellediği, yani sitotoksik etki yaptığı ve 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda p53 gen ekspresyonunda ve Bax proteininde artışa neden olduğu gözlemlenmiştir. Bu durum immunositokimyasal boyamada da tespit edilmiştir. Ayrıca melatonin uygulaması sonucunda total antioksidan seviyesinde artış olurken, total oksidan miktarında ise azalmanın olduğunu tespit ettik. Sonuç: Çalışma sonuçları, melatonin uygulaması ile oluşan p53 genindeki ve Bax proteinindeki artışın apoptotik aktiviteyi arttıracağını göstermektedir. Melatoninin bu etkileri göz önüne alındığında kanser tedavisinde kullanılabilecek bir ajan olabileceği sonucuna varılabilir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Bax, Melatonin, Meme kanseri, p53. IV ABSTRACT The Investigastion of Apoptosis Activation and Cyotoxicity of Melatonin in MCF-7 Cell Culture Through Polimerase Chain Reaction (PCR), MTT Cell Viability Assay and Immunocytochemical Methods Aim: Breast cancer is one of the most common types of cancer in the world and Turkey, and is located at the top among death rates developing due to cancer. Cancer is not only health problem but also is a social and economic problem of society. Finding a solution to such an important health problem is among the primary goals of many researchers. That’s why, new researches have been done to treatment of brest cancer and the effects of different subtances on this desease have been investigated extensively. In this study, we aimed to study the melatonin, known as powerful antioxidant with versatile effects in the modern medicine, association with cancer and its contribution to solution of cancer desease. Material and Method: In the study, human breast cancer MCF-7 was used. To determine the cytotoxic doses and IC50 value of melatonin, interval of 10 nM – 100 000 nM concentrations of melatonin were applied in the parenteral MCF-7 cell line. After treatment with various concentration of melatonin, cell viability were analyzed by MTT assay. Then effective doses were determined, MCF-7 cell line was treated with 6 concentration of melatonin doses. These groups consisted of untreated control, 10, 100, 1000, 10 000, and 100 000 nM concentration of melatonin treated groups. All cells were incubated for 24h. In all groups, there examined the melatonin cytotoxicity, TAS, TOS, apoptotic activity (Bax and p53 immunopositivity) and expression levels of p53 gene. Results: Melatonin which was applied MCF-7 cells inhibited cell proliferation, so it did cytotoxic effect, increased the p53 gen expression and Bax protein synthesis at the end of 24 hours incubation. Increased Bax and p53 immunpositivity were determined in immunocytochemical staining. Furthermore, melatonin treatment was increased TAS and decreased TOS. Conclusion: The results of the study, melatonin treatment may induced the activation of apoptosis due to increase in p53 gene expression and Bax protein. These effects revealed that melatonin may be a candidate agent in the treatment of cancer. Key Words: Apoptosis, Bax, Breast cancer, Melatonin, p53. V SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ 2O2•– : Süperoksit Anyonu (Superoxide Anion) APUD : Amine Precursor Uptake Deamin BSA : Sığır Serum Albümini (Bovine Serum Albumine) CAT : Katalaz (Catalase) DCIS : Duktal Karsinoma İn Situ (Ductal Carcinoma In Situ) DMSO : Dimetil Sülfoksit (Dimethyl Sulphoxide) DNA : Deoksiribonükleik Asit (Deoxyribonucleic Acide) E1 : Östron (Estrone) E2 : β-Östradiol (β-Estradiol) E3 : Östriol ER : Östrojen-Reseptör (Estrogen-Receptor) GPx : Glutatyon Peroksidaz (Glutathione Peroxidase) GST : Glutatyon-S-transferaz (Glutathione S-transferase) HIOMT : Hidroksiindol-O-metiltransferaz (Hydroxyindole-Omethyltransferase) H2O2 : Hidrojen Peroksit (Hydrogen Peroxide) HRP : Horseradish Peroksidaz (Horseradish Peroxidase) IARC IC50 : Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (International Agency for Research on Cancer) : Baskılayıcı Konsatrasyon 50 (Inhibition concentration 50) VI ICC : İmmunsitokimyasal (Immunocytochemical) LCIS : Lobüler Karsinoma İn Situ (Lobular Carcinoma In Situ) µM : Mikromolar : 3-(4,5-Dimetiltiytizol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid, 1 sarı MTT tetrazol (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, a yellow tetrazole) NAT : N-Asetil Transferaz (N-Acetyl Transferase) nM : Nanomolar NO• : Nitrik Oksit (Nitric Oxide) •OH : Hidroksil Radikali (Hydrogen Radical) PBS : Fosfat Tamponlu Solüsyon (Phosphate Buffered Saline) ROO• : Peroksil Radikali (Peroxyle Radical) ROS : Reaktif Oksijen Türleri (Reactive Oxygene Species) RT-PCR : Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real Time – Polimerase Chain Reaction) SCG : Superior Servikal Gangliyon (Superior Cervical Ganglion) SCN : Suprakiazmatik Nukleus (Suprachiasmatic Nucleus) SOD : Süperoksit Dismutaz (Superoxide Dismutase) STS : Steroid Sülfataz (Steroid Sulfatase) TAS : Total Antioksidan Seviyesi (Total Antioxidant Capacity) TOS : Total Oksidan Seviyesi (Total Oxidant Capacity) TSG : Tümör Baskılayıcı Gen (Tumor Supressor Gene) VII ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Stereolojik “Fractionator Frame” metodu ile Bax immunpozitifliğinin değerlendirilmesi, Ok başı: immunpozitif hücreyi göstermektedir………………………............................ 32 Melatonin uygulanan ve uygulama yapılmayan gruplara ait MCF-7 hücrelerinin invert mikroskop görüntüsü. A; Kontrol grubu B; 10 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup C; 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup D; 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup E; 10000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup F; 100000 nM melatonin uygulanan grup………………………....................... 35 Şekil 4.2. 24 saatlik inkübasyon süresine ait baskılayıcı konsantrasyon 50 (IC50) değeri……………........................................................... 36 Şekil 4.3. Total antioksidan seviyesinin gruplar arasındaki dağılımını gösteren grafik..……………………………………………....... 38 Total oksidan seviyesinin gruplar arasındaki dağılımını gösteren grafik………………………………………………..... 39 Kontrol grubuna ait MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği..……………………................................................... 40 Şekil 4.6. 10 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği………………………………... 40 Şekil 4.7. 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği……………………………….... 41 Şekil 4.8. 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği………………………................ 41 Şekil 4.9. 10 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği………………………...... 42 Şekil 4.10. 100 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği………………………...... 42 Şekil 4.11. Kontrol grubuna ait MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği..................................................................................... 44 10 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği……………………………….... 44 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği……………………………….... 45 Şekil 3.1. Şekil 4.1. Şekil 4.4. Şekil 4.5. Şekil 4.12. Şekil 4.13 VIII 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği………………………................ 45 10 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği………………………..... 46 Şekil 4.16. 100 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği…………………….......... 46 Şekil 4.17. Gerçek zamanlı PCR’da kontrol grubu p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine yaklaşık 29. döngüde ulaşılmıştır.……………………….............................................. Şekil 4.14. Şekil 4.15. Şekil 4.18. Şekil 4.19. Gerçek zamanlı PCR’da 10 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine kontrol grubundan daha önce ulaşılmıştır………………………............ Gerçek zamanlı PCR’da 100 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine önceki 2 gruptan daha sonra ulaşılmıştır (yaklaşık 33. döngü)................. 48 48 48 Gerçek zamanlı PCR’da 1000 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değeri en erken bu döngüde aşılmıştır (yaklaşık 24. döngü)…………...... 49 Gerçek zamanlı PCR’da 10 000 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine kontrol grubu ve 100 nM melatonin çalışma grubu değerlerine yakın bir değerde ulaşılmıştır (yaklaşık 35. döngü)………........ 49 Gerçek zamanlı PCR’da 100 000 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine en son bu grupta ulaşılmıştır (yaklaşık 38. döngü)……………. 49 Şekil 4.23. Negatif kontrol (p53)………………………............................... 50 Şekil 4.24. Farklı bir gen bölgesi olarak “Aktin gen bölgesi”, “internal kontrol” olarak kullanılmıştır. p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyonları gösterilmiştir……………..... 50 Şekil 4.25. 10 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri………………................ 50 Şekil 4.26. 100 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri........................................ 51 Şekil 4.20. Şekil 4.21. Şekil 4.22. IX Şekil 4.27. 1000 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri. Çalışmanın bu grubunda p53 ve Aktin gen amplifikasyonları önemli derecede artmış olarak görülmekte............................................................. 51 Şekil 4.28. 10 000 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri........................................ 51 Şekil 4.29. 100 000 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri………….... 52 Şekil 4.30. Negatif kontrol……………….................................................... 52 Şekil 4.31. p53 ve Aktin gen bölgelerine ait erime (melting) sıcaklıklarının gösterimi: A; aktin (yaklaşık 82.2oC) ve B; p53 (yaklaşık 87.1 oC)........................................................................ 52 Şekil 4.32. Aktin ve p53 gen ekspresyonlarının birlikte ve lineer eğriler olarak gösterilmesi...................................................................... . 53 X TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 3.1. cDNA sentezinde kullanılan kimyasallar………………………... 34 Tablo 4.1. Melatonin konsantrasyonu ve viabilite değerleri……………….. 37 Tablo 4.2. Total antioksidan ve oksidan değerleri analiz sonuçları……….... 38 Tablo 4.3 İmmunsitokimyasal p53 pozitif hücre sayısının stereolojik analiz sonuçları……………………………………………….............. 39 Tablo 4.4. İmmunsitokimyasal Bax pozitif hücre sayısı stereolojik analiz sonuçları…………………………………………………………. 43 Tablo 4.5. p53 ve internal kontrol (aktin) konsantrasyon değerleri……….... 47 XI 1. GİRİŞ Toplumu oluşturan her bireyin tüm ihtiyaçlarını karşılaması, yaşamdan doyum alması, sosyal ilişkilerinde yeterli olması, kişisel amaçlarını başarabilmesi, mutlu olması ve benlik saygısı gibi kavramlara sahip olması yaşam kalitesi olarak adlandırılmaktadır.1,2 İnsanların fiziksel, sosyal ve ruhsal fonksiyonlarını ciddi şekilde etkileyerek bireyin sosyo-ekonomik, psikolojik ve aile hayatı gibi bütün yaşam alanlarını dolayısıyla da yaşam kalitesini her yönüyle etkileyen birçok hastalık bulunmaktadır.1 Bu hastalıklardan birisi olan kanser, en kısa tanımı ile hücrelerin kontrolsüz şekilde çoğalmaları olarak ifade edilen, günümüzde yaygın olarak görülmesi, morbidite ve mortaliteye neden olma riskinin yüksek olması sebebiyle de önemi giderek artan bir sağlık ve yaşam sorunu haline gelmiştir.2-4 Kanser hem dünyada hem de ülkemizde %22'lik oran ile kardiyovasküler hastalıklardan sonra ikinci ölüm nedenidir. 2000'li yılların başında dünyada yılda 6 milyon insan kansere yakalanırken bu sayının önümüzdeki yirmi yıl içerisinde 12 milyona ulaşacağı tahmin edilmektedir. 2005 yılı içinde 12 milyon kişi kansere yakalanmış, 7 milyon insan kanser nedeni ile yaşamını yitirmiştir. Dünya Sağlık Örgütü ve Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı’nın verilerine göre 2030 yılında 24 milyon insanın kansere yakalanacağı, 17 milyon insanın ise aynı yıl kanser nedeniyle yaşamını yitireceği tahmin edilmektedir.5 Türkiye’de ve dünyada bu kadar fazla görülmesi ve ölüm nedenleri arasında üst sıralarda yer alması nedeniyle kanser hastalığı artık bir sağlık sorunu olmanın ötesinde sosyal ve ekonomik açıdan bir toplum sorunu olmuştur.3 Bu kadar önemli bir sağlık sorununa çözüm bulunması hem birçok araştırma laboratuvarının öncelikli hedefi olmakta hem de böyle bir çözüme ulaşmak, sağlığını kaybetmiş ve giderek daha da kötüye giden hasta insanlar açısından da önem arz etmektedir. Birçok kanserli hastada 1 kesin çözüm bulmak bir yana, hastalığın seyrini düzeltmek, yaşam süresini uzatmak ve hayat kalitesini biraz olsun geliştirmek bile halen önem arz etmektedir. Bu nedenle tedaviye yönelik farklı çalışmalar yapılmakta ve farklı maddelerin bu hastalık üzerindeki etkileri yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bu çalışmada modern tıpta çok yönlü etkileriyle bilinen bir molekül olan melatoninin kanser ile ilişkisini ve kanser hastalığına çözüm açısından sağlayabileceği katkıyı irdelemeyi amaçlamaktayız. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kanser Kanser, hücrelerin kontrolsüz büyüme eğilimi ve anormal yayılımını tanımlamak için kullanılan bir terimdir.2 Canlıların temel yapı taşı olan hücreler, enzimler, hormonlar ve diğer uyaranlar altında, ihtiyaca göre düzenli bir şekilde büyür, bölünür, yaşlanır ve ölürler. Kanser hastalığında ise çeşitli etkenlerle değişime uğramış hücrelerin düzensiz ve kontrolsüz bir şekilde sürekli olarak büyümeleri, bölünmeleri söz konusudur.6,7 Çoğalan hücreler kan, lenf ya da vücut boşlukları yoluyla primer lokalizasyonları dışındaki yerlere sıçrayarak (metastaz) oralarda da büyümeye devam eder ve yaşamı tehdit etmeye başlarlar. Kanser hücrelerinde meydana gelen yapısal farklılıkların yanı sıra işlevsel farklılıklar da ortaya çıkmaktadır. Yani hücreler ya normalde yaptıkları fonksiyonları yapamaz duruma gelir ya da bazı yeni fonksiyonlar üstlenirler.3 Kan ve lenf yoluyla metastaz yaparak diğer organlara taşınan bu hücreler, birbirine yapışmaz, hücrelerden gelen sinyallere yanıt vermez, özelleşmez ve apoptoza uğramazlar.8 Kanser teriminin ilk olarak Hipokrat tarafından (M.Ö. 460-377) organizmada şifa bulmayan yeni yapılanmaları anlatmak için kullanıldığı bildirilmektedir. Hipokrat vücut yüzeyinde gelişen, diğerlerinden farklı karakterde olan, kırmızı renkli ve daha yavaş büyüyen şişliklere “Carcinos” ya da “Carcinoma” demiş, Galen (M.S. 2. yüzyıl) ise bu tip oluşumlara yengece benzeyen görünümleri dolayısıyla “kanser” adını vermiştir. Bu dönemde sadece epitel kökenli tümörlere kanser denildiği ve hastalık nedeninin de vücut sıvıları arasındaki dengesizliğe bağlandığı görülmektedir. Türk tıp tarihinde ise kanserin karşılığı olarak Tarsuslu Osman Hayri Efendi’nin “Kenz üssıhhat ül-ebdaniye” (1298) adlı eserinde fındık ya da küçük yumru büyüklüğündeki, 3 ağrılı, etrafı damarlı bir oluşumu anlatmak için “seratan” ifadesini kullandığı tespit edilmiştir.9 2.1.1. Kanser Oluşumuna Etki Eden Faktörler Normal bir hücrenin kanser hücresine dönüşümü sürecinde birçok mekanizmanın rol oynadığı bilinmekle birlikte bu mekanizmaların tümü henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu dönüşümün nasıl meydana geldiğini anlamadan önce normal bir hücrenin yaşamsal döngüsünü bilmemiz gerekmektedir. Hücrenin normal yaşam döngüsü yani hücre siklusu genel olarak dinlenme ve bölünme dönemi olarak ikiye ayrılır. Dinlenme dönemi, yaşamsal faaliyetlerin devam ettiği ve bölünmeye göre daha uzun olan bir dönemdir; bu dönem G0 fazı olarak da adlandırılır. Bölünme dönemi ise mitoz bölünmeye hazırlığın yapıldığı G1, S ve G2 fazları ile mitoz bölünmenin gerçekleştiği M fazından oluşur. G1 fazında DNA replikasyonunda kullanılacak olan RNA ve proteinlerin üretimi yapılır, S fazında DNA replikasyonuna başlanacak bölgeler işaretlenir ve DNA eşlenerek diploid hale getirilir, G2 fazında ise mitoz bölünme için gerekli olan son hazırlıklar yapılır. Bir hücrenin iki eş hücre haline geldiği mitoz bölünme aşamasına da M fazı denilmektedir. Bu dönemlerin art arda ve zamanında başlayabilmesi ve hatasız bir şekilde yürütülebilmesi, kontrol görevi üstlenmiş birçok protein arasındaki uyum ile sağlanmaktadır. Bu proteinlerin sentezini düzenleyen genler ya protoonkogenler ya da tümör baskılayıcı genler (TSG; tumor supressor gene antionkogen)’dir.6 Çeşitli nedenlerle normal hücre büyümesi ve farklılaşması için önemli bazı proteinlere ait kodları içeren protoonkogenler ile tümör baskılayıcı genler arasında var olan dengenin bozulması, normal hücrelerdeki DNA dizilerinde değişikliklere, kansere engel olan bazı proteinlerin sentezinde ise azalmalara sebep olmaktadır.6,8 DNA dizilerinde meydana gelen değişiklikler protoonkogenlerin kansere 4 neden olan onkogenlere dönüşmesine, normalde tümör oluşumunu engelleyen proteinleri üreten tümör baskılayıcı genlerin ise inaktive olmasına neden olmaktadır.8 Normal bir hücrenin kanseröz olmasına neden olabilecek protein ürününe sahip olan onkogenler, hücrenin gerektiğinde çoğalması için gereken gen grubu olup hücreyi çoğalmaya zorlamaktadırlar. Öte yandan tümör baskılayıcı genler, onkogenleri dengeleyen ve hücrenin aşırı çoğalmasını engelleyen yine fizyolojik olarak bulunan gen gruplarıdır. Bunlar arasında p53, RB1, p16, p21 ve ING ailesi gibi genler sayılabilir. Onkogenlerin aktive edici mutasyon sonucu aşırı aktivasyonu ya da bunları dengeleyen tümör baskılayıcı genlerin kromozomal lokalizasyonlarındaki delesyonu ya da inaktive edici mutasyon sonucu fonksiyonlarını yitirmesi ile hücre çoğalmasının aşırı olması ve durdurulamaması sonucunda kanserleşme meydana gelmektedir.10 Tümör baskılayıcı genler arasında en çok incelenen ve her geçen gün yeni bir işlevi olduğu anlaşılan bir gen olan p53 tümör baskılayıcı geni, 17. kromozomun p koluna yerleşmiş (17p13.1), 53 Kd ağırlığında 393 aminoasitlik bir nükleer fosfoproteini kodlayan gendir. 11 exonu ve 10 intronu bulunan p53 geni, 5 ve 8 exonlarına karşı gelen protein bölgesi ile DNA’ya bağlanır. Normalde inaktif halde bulunan p53 molekülü, DNA hasarı ile aktif hale gelmektedir.11 Aktifleşen p53 geni, hücre siklusunu G1 fazında durdurarak ya DNA tamiri için gereken zamanı sağlar ya da düzeltilemeyen bir hata varsa hücreyi yaşlanmaya (senesense) veya apoptoza yönlendirir. DNA bütünlüğünün, hücre canlılığının korunmasında, hücre siklusunun kontrolünde çok işlevli bir transkripsiyon faktörü olan p53 tümör baskılayıcı proteini ve onun fonksiyonlarıyla bağlantılı genler komplike bir gen şebekesi oluştururlar. Bu gen şebekesinde oluşan bir bağlantı kopukluğunda engellenen p53 geni birçok bozukluğa neden olur.12 5 Kanser oluşumuna ya onkogenlerin ekspresyon seviyelerindeki kantitatif değişikliklerin ya da yapılarında meydana gelen değişikliklerin yol açtığı düşünülmektedir. Bu değişiklikler arasında gen delesyonu, nokta mutasyonu, gen amplifikasyonu (gen çoğaltımı), kromozomlarda yeni düzenlenmeler ve insersiyonal mutagenez (yeni DNA katılımı) gibi olaylar sayılabilir. DNA dizisindeki sadece bir bazın değişmesi (nokta mutasyon) ile protoonkogenler, onkogenlere dönüşmekte ve bunun sonucunda anormal gen ürünü olarak sentezlenen onkoproteinler de hücre bölünmesini ve gelişimini uyararak kansere neden olmaktadırlar. Onkogene ait DNA parçasının çok sayıda replike olması ile meydana gelen gen amplifikasyonu kanserli hücrelerde çok sık görülmekle birlikte normal hücrelerde ya hiç gözlenmez ya da çok nadir olarak görülür.13 Büyüme ve gelişmeyi yönlendiren ürünlere sahip olan protoonkogenlerin çalışmalarını kontrol eden, anormal büyümeyi ve malign değişimleri engelleyen tümör baskılayıcı genlerin her iki alleli kaybolduğunda (heterozigotluk kaybı) veya bu genler mutasyona uğradığında kontrol mekanizması ortadan kalkar ve tümör oluşumu gerçekleşir.13 Kanser hastalarında mutasyonu en sık görülen protein, p53 proteinidir ve kanserlerin yaklaşık %50-55’inde mutant olduğu gösterilmiştir. Meme kanseri gibi çeşitli tümörlerde p53 geninin her iki allelinde kayıp veya nokta mutasyonlar olduğu da tespit edilmiştir.12 Tümör hücreleri çevre dokulara yayılma özelliklerine göre benign (iyi huylu, selim) ve malign (kötü huylu, habis) olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Benign tümörlerde, tümör hücreleri yerel dokuları istila etmez veya vücudun diğer bölümlerine invaze olmazlar. Kapsül oluşturarak canlının yaşamını çok fazla tehlikeye sokmayan bening tümörler sinir sistemi, damarlar ve kanallara basınç yaparak hastalık belirtilerini gösterirler ve genellikle operasyonla alınırlar. Kapsül oluşturmayan malign tümörler ise 6 oluştukları yerden ayrılıp vücut içinde başka bir bölgeye giderek ikinci bir tümöre sebep olurlar ki bu olaya da metastaz denilmektedir.12 Kanser oluşumunun nedenleri ile ilgili bilgiler az olmakla birlikte hastalığa neden olan hazırlayıcı pek çok faktörün olduğu da bilinmektedir. Bu faktörler arasında güneş ışığı, radyasyon, ısı, endüstriyel maddeler, kronik irritasyon, ilaçlar, besinler, sigara, alkol, virüs, bakteri ve parazitler, 55 yaş ve üstünde olmak, stres, hareketsiz bir yaşam tarzı, yüksek tansiyon, immün yetmezlik gibi birçok faktör sayılmaktadır. Kanser oluşumunda bu çevresel faktörlerin yanı sıra genetik faktörlerin de rol aldığı bilinmektedir.14 Çevresel faktörlerden kısaca söz edecek olursak: Ultraviyole Işınlar: Açık tenli insanlar, açık havada çalışanlar ve kontrolsüz şekilde güneş ışığına maruz kalanlarda deri kanserleri daha sık görülmektedir.3 İyonize Radyasyon: Başta lösemi ve epitelyal kanserler olmak üzere iyonize radyasyonun da çeşitli kanserlere yol açtığı bildirilmektedir.3 Kimyasal Karsinojenler: Meslekleri dolayısıyla katran ve kömürün yanma ürünleri, benzen, naftilaminler, asbest, vinil klorür, krom vb. maddelerle temas etmek zorunda kalan insanlarda kanserin oluşabileceği bildirilmektedir. Örneğin; boya sanayiinde çalışanlarda mesane kanserlerinin, plastik sanayiinde çalışanlarda karaciğer kanserlerinin, katranla uğraşanlarda ise deri kanserlerinin görüldüğü belirtilmektedir.3 Beslenme Faktörleri: Sindirim sistemi kanserleri belirli beslenme alışkanlıkları ile ilişkili olduğundan düşük yağ ve yüksek lif içeren beslenme şekilleri tavsiye edilmektedir.3 Sigara: Akciğer kanseri ile sigaranın ilişkisi kanıtlanmış olup sigaranın larinks, ağız boşluğu, yutak, mesane ve pankreas kanserleri riskini artırdığı da belirtilmektedir.3 7 Alkol: Uzun süreli alkol alımı ağız, yutak, gırtlak ve yemek borusu kanserleri riskini arttırmaktadır. Çok alkol içenlerin genellikle aynı zamanda sigara da içiyor olması bu kişilerde kanser tehlikesini kat kat arttırmaktadır.3 Virüsler: Bilinen en küçük mikroorganizmalar olan virüslerin deney hayvanlarında kansere yol açtığı gösterilmiştir. İnsanlarda hepatit-B virüsünün karaciğer kanseri ile Ebstein-Barr virüsünün Burkitt lenfoma ile ilişkili olduğu da bilinmektedir.3 Genetik Faktörler: Kanser tek başına genetik bir hastalık değildir. Ancak çocuklarda görülen bir göz kanseri olan retinoblastom gibi bazı kanser türlerinde ailevi geçiş görülmektedir. Sonuç olarak kanser tek bir sebebe değil birden çok sebebe bağlı olarak gelişen bir hastalıktır.3 Kanser insidans hızlarının ve profillerinin gelişmiş ve az gelişmiş ülkeler arasında farklılık gösterdiği de bildirilmektedir. Gelişmiş ülkelerde erkeklerde daha çok akciğer ve prostat kanseri, kadınlarda ise meme kanseri ve kolorektal kanserler görülürken, az gelişmiş ülkelerde erkeklerde akciğer, mide ve karaciğer kanseri, kadınlarda ise meme ve serviks kanseri daha sık görülmektedir. Türkiye’de ise erkek nüfusta akciğer, mesane ve mide kanserlerinin, kadın nüfusta da meme kanseri ve kolorektal kanserlerin daha sıklıkla izlendiği tespit edilmiştir.15 2.2. Meme Kanseri Dünyanın hemen her bölgesinde önemli bir sağlık sorunu olan meme kanseri, kadınlar arasında en sık görülen kanser türüdür ve kansere bağlı ölümlerde akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır.16,17 Yaşam boyunca yaklaşık her 10 kadından birinin bu hastalığa yakalanma riskinin ve yakalananların üçte birinin de yaşamlarını bu hastalık nedeniyle kaybetme risklerinin olduğu bildirilmektedir.18 Dünya Sağlık Örgütü'ne bağlı IARC'nin (International Agency for Research on Cancer_ Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı) 2002 yılında yaptığı değerlendirmede tüm 8 dünyada 1.150.000 yeni tanı konulmuş olan meme kanseri olgusu hesaplanmış, bu sayının 2010 yılında 1.500.000, 2020 yılında ise 2.500.000 olacağı öngörülmüştür.5 Meme kanserleri tümörün oluşumu, boyu ve metastaz durumuna göre çeşitli evrelere ayrılmıştır. Bu evreler şöyledir:19 Evre 0; Aynı zamanda 'in-situ' olarak da adlandırılan bu evre, yerinde kalmış ve çevre dokulara sıçramamış kanser türünü ifade etmek için kullanılmaktadır. Bu evre kanserler oluştukları yere göre ikiye ayrılırlar. Eğer kanser süt bezlerinde (lobes) oluşmuşsa lobular carcinoma in situ (LCIS) olarak, eğer süt kanallarında (ducts) oluşmuşsa ductal carcinoma in situ (DCIS) olarak adlandırılmaktadır. LCIS'nin mikroskopik özellikleri normal hücrelerden farklı ve kanser hücrelerine daha benzer olsa da, genel olarak bakıldığında LCIS kanser olarak davranmaz ve bu yüzden de kanser gibi tedavi edilmez. LCIS yalnızca göğsün herhangi bir yerinde kanser oluşması riskinin arttığını gösteren bir göstergedir. DCIS durumunda ise kanser hücreleri oluştukları süt kanalları içerisinde kalmış, göğsün yağ dokusu ya da lenf bezleri gibi vücudun farklı alanlarına yayılmamıştır.19 Evre I; Yayılabilen meme kanserinin başlangıç safhasıdır. Bu evre tümörün 2 cm’den daha büyük olmadığı ve kanser hücrelerinin memeden başka yerlere (lenf bezleri gibi) yayılmadığı durumdur.19 Evre II; 2 alt bölüme ayrılmaktadır. Bunlardan biri olan Evre IIA: • Memede tümör yoktur, ancak koltuk altındaki lenf bezlerinde kanser vardır. • Ya da tümör 2 cm büyüklüğünde veya daha küçüktür ve koltuk altındaki lenf bezlerine yayılmıştır. 9 • Ya da tümör 2 cm'den büyük, 5 cm'den küçüktür ve koltuk altı lenf bezlerine yayılmamıştır. Diğer evre olan Evre IIB’de ise: • Tümör 2-5 cm arasındadır ve koltuk altı lenf bezlerine sıçramıştır, ya da 5 cm’den daha büyüktür ve koltuk altı lenf bezlerine sıçramamıştır.19 Evre III; Daha ilerlemiş kanser aşaması olup 3 alt bölüme ayrılmaktadır: Evre IIIA’da, ya koltuk altı lenf bezlerinde kanser vardır ancak memede tümör yoktur. Ya da tümör 5 cm civarında veya daha büyüktür ve çevre dokulara yayılmıştır. Evre IIIB’de tümör herhangi bir boyutta olabilir ve memeye komşu dokulara (deri veya göğüs duvarı, kaburgalar veya göğüs duvarındaki kaslar) ve lenf nodlarına yayılmıştır. Evre IIIC'de ise kanser köprücük kemiği altındaki ve boyundaki lenf nodlarına, kolun altındaki ve meme içerisindeki lenf nodlarına ve memeye komşu dokulara yayılma eğiliminde olabilir.19 Evre IV; Bu evre uzak metastatik kanserdir. Kanser göğüs dışına vücudun diğer bölümlerine de (kemikler, akciğer, karaciğer ya da beyin gibi) sıçramıştır.19 2.2.1. Meme Kanseri Oluşumuna Etki Eden Faktörler Meme kanseri risk faktörleri arasında; BRCA1 ve BRCA2 genlerinin taşınması, ailede meme kanseri hikâyesinin olması, genetik yatkınlık, önceden meme kanseri geçirmiş olmak, alkol alımı, düşük doz radyasyon, pestisitlere maruz kalmak gibi durumlar vardır. Ayrıca erken menarş, geç menopoz, diabetes mellitus, ilerleyen yaşlar, obezite, oral kontraseptiflerin kullanımı, ilk doğumun geç yaşta yapılmış olması veya çocuk doğurmamış olmak gibi durumlar da meme kanseri oluşumuna neden olan önemli faktörler arasındadır.20,21 10 2.2.1.1. Östrojen Meme kanserinin gelişim nedenleri arasında en üst sıraları hormonların aldığı22 ve bu hormonlar arasında en büyük risk faktörünün de östrojen olduğu yapılan çalışmalarla tespit edilmiştir.23,24 Kadın cinsiyet hormonu olan östrojen, büyük ölçüde ovaryumlardaki olgun granüloza hücrelerinden, az miktarda da böbreküstü bezlerinden ve plasentadan salgılanır.25,26 Doğal östrojenler olan β-östradiol (E2), östron (E1) ve östriolden (E3) en fazla salgılanan β-östradiol, en az salgılanan ise östrondur.25 Östriol ise östradiol ve östronun özellikle karaciğerdeki oksidasyonu sonucu ortaya çıkan bir üründür.25,27 Ancak gebelik döneminde plasentadan bol miktarda salgılanmaktadır.27 βöstradiolün, östronun 12, östriolün ise 80 katı östrojenik etkiye sahip olduğu da bilinmektedir.25 Biyolojik olarak meme dokusu üzerinde en aktif olan östrojen ise βöstradioldür.26 Hormonlar hücreler üzerindeki etkilerini, hücre yüzeyinde veya içerisinde bulunan ve ilgili hormona karşı spesifik afinitesi olan reseptör proteinlerine bağlanmak suretiyle gösterirler. Reseptör-hormon bileşkesi hücrede bir takım biyokimyasal değişikliklere yol açar. Meme ve uterus dokusu bulundurdukları östrojen reseptörleri (ER) nedeniyle östrojenin etkilerine açık durumdadır. Meme kanseri vakalarında ER pozitifliğinin %40-80 oranlarında olduğu tespit edilmiştir.28 ER pozitif meme kanseri hücrelerinde östrojen, kendi reseptörünü aktive ederek hücre siklusunun G1 fazını kısaltmakta ve hücrenin daha sık bir şekilde bölünmesine neden olmaktadır.22 Kanserli hücrelerde bulunan ER miktarı, normal hücrelerde bulunan ER miktarından belirgin derecede fazladır.29 Yapısı itibariyle steroid bir hormon olan östrojenin steroid sülfattan aktif olarak sentezlenme mekanizması “intrakrin östrojen sentezi” olarak tanımlanmaktadır. Bu sentez özellikle deri, kemik, kas, yağ ve meme bezi gibi perifer dokularda aromataz 11 enzimi ve steroid sülfataz (STS) ile katalize edilerek gerçekleşir. İntrakrin östrojen sentezinin premenopozal dönemdeki kadınlarda toplam östrojen yapımının yaklaşık %75’ini, postmenopozal dönemdeki kadınlarda ise %100’e yakınını oluşturduğu tespit edilmiştir. Menopoz öncesi ovaryumda meydana gelen östrojen sentezi postmenopozal dönemde durmuştur ve serbest östrojen konsantrasyonu biyolojik etki seviyesinin altına inmiştir. Ancak buna rağmen östrojene-bağımlı meme kanserlerinin büyük bölümü bu dönemde ortaya çıkmaktadır. Bu durum da aktif östrojenin tümör dokusunda steroid sülfatlardan oluşturulduğunu göstermektedir.22 2.2.1.2. Oksidatif Stres Kuantum kimyasına göre ancak iki elektronun bir araya gelmesiyle bir bağ oluşur. İnsan vücudunda bulunan elektronların neredeyse tamamı elektron çiftleri halinde ve oldukça kararlı bir yapıya sahiplerdir. Aradaki bağın kopması durumunda ise elektronlar ya birlikte kalarak başka bir atomun yapısına katılırlar ya da birbirlerinden ayrılarak farklı atomlara bağlanırlar. Birlikte kalmaları durumunda iyonlar, ayrılmaları durumunda ise serbest radikalleri oluştururlar.30 Bir veya daha fazla ortaklanmamış elektrona sahip olan serbest radikaller reaktif özellikte olup kararsız bir yapıya sahiptirler. Eşleşmiş elektronları ayırıp onlardan elektron alabilir ya da elektron verebilirler.30,31 Bu şekilde başka moleküllerle kolaylıkla elektron alışverişi yapıp onların yapısını bozan moleküllere “serbest radikaller”, “oksidan moleküller” ya da “reaktif oksijen türleri (ROS: reactive oxygen species)” adı verilmektedir.31 Doku hasarına yol açan ROS’un aşırı üretimi de oksidatif stres olarak adlandırılmaktadır.32 Oluşan serbest radikaller, oksidatif reaksiyonlar sonucunda protein, lipid, karbonhidrat ve DNA gibi vücuttaki önemli moleküllere etki ederek yapılarının bozulmasına ve pek çok biyolojik soruna neden olmaktadır.30,33 12 Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller oksijenden oluşan ROS’lardır. Bunların en önemlileri süperoksit anyonu (2O2.-), hidroksil radikali (.OH), nitrik oksit (NO.), peroksil radikali (ROO.) ve radikal olmayan hidrojen peroksit (H2O2) tir.33 Normal metabolik işlevlerin bir sonucu olarak ortaya çıkan oksidan moleküller, başlıca glikoz oksidasyonu olmak üzere tüm anabolik ve katabolik reaksiyonlar sonucunda meydana gelmektedir.31 Vücutta ROS’un oluşumunu ve oluşturabileceği hasarı önlemek için antioksidan koruma sistemi denilen bir savunma mekanizması vardır.34 Antioksidanlar, serbest radikallerin bağlanması için uygun elektron hedefler oluşturarak bu radikallerin daha stabil bir hal kazanmalarını sağlarlar. Hücreler ve dokular arasındaki bütünlüğün korunması ve normal işlevlerini yerine getirmeleri için oksidan ve antioksidan sistemler arasındaki dengenin korunması gerekmektedir.30,34 Aslında serbest radikallerin belli bir düzeyde var olmaları organizmanın yabancı moleküllere ve enfeksiyon ajanlarına karşı bağışıklık kazanmasında önemlidir.31 Normalde ROS ve antioksidanlar arasında var olan dengenin serbest radikaller yönünde bozulması durumunda meydana gelen oksidatif stres eğer telafi edilemezse ateroskleroz, diyabet, Alzheimer, koroner kalp hastalıkları ve kanser gibi birçok hastalığın oluşmasına neden olmaktadır.30,34 Halliwell’e göre ROS kaynaklı DNA hasarı oluşumunun temelinde iki mekanizma vardır. Bunlardan birincisi direkt olarak hidroksil radikali tarafından oluşturulan DNA zincir kırılımı, baz modifikasyonu ve deoksiriboz fragmentasyonu, ikincisi ise oksidatif stres sonucu oluşan endonükleaz inaktivasyonu ile meydana gelen DNA fragmentasyonlarıdır.35 Mitoz bölünmenin hasarlı olan DNA’nın kopyalanması ile devam etmesi de tümör hücresi oluşumuyla sonlanabilmektedir. Ayrıca ROS, protein ve lipid peroksidasyonu ile plazma membranında hücresel aktiviteleri etkileyecek yapısal değişiklikler oluşturabilir. Dolayısıyla ROS, membrana bağlı protein kinazları, büyüme faktörlerini ve 13 reseptörlerini etkileyerek sinyal iletiminin bozulmasına, onkogen aktivasyonuna ve baskılayıcı genlerin inaktivasyonuna neden olarak onkogenler ve kanser oluşumu üzerinde de önemli rol oynamaktadır.34 Serbest radikaller hücrelerde endojen ve ekzojen kaynaklı etmenlere bağlı olarak oluşmaktadır. Endojen etmenler arasında organizmada normal olarak meydana gelen oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonları vardır. Ekzojen kaynaklı etmenler arasında stres, virüsler, enfeksiyon, pestisitler, karbon tetraklorür, parasetamol gibi ilaç toksikasyonları, iyonize ve ultraviyole radyasyon, hava kirliliği, sigara dumanı, solventler gibi çevresel faktörler, demir, bakır, kadmiyum, nikel, krom, civa gibi metal iyonları, asbest lifleri, mineral tozlar ve karbonmonoksit sayılabilir.36 Hücresel membranlardaki lipitlerle, DNA’daki nükleotidlerle, proteinlerdeki sülfidril gruplarıyla reaksiyona giren reaktif oksijen bileşikleri dokulara zarar vermektedir.37 Mitokondrial solunum esnasında tekli elektron transferi ile oksijenden süperoksit üretimi ile başlayan ROS oluşum basamakları hidroksil radikallerinin de ana kaynağını teşkil eder. Oluşan süperoksit radikali spontan olarak dismutasyona uğrar ya da süperoksid dismutaz (SOD) enzimi tarafından hidrojen peroksite (H2O2) dönüştürülür. H2O2 hücre içinde katalaz veya glutatyon peroksidaz (GPx) tarafından toksik olmayan ürünlere dönüştürülür. Ancak metal iyonları varlığında Fenton reaksiyonu ile oldukça toksik bir yapıya sahip olan hidroksil radikaline çevrilmektedir.38,39 Hücrelerdeki DNA başta olmak üzere tüm makromoleküllerde oksidatif hasar meydana getiren en reaktif ROS formunun hidroksil radikali olduğu yapılan çalışmalarda tespit edilmiştir.40,41 Hücrelerde normal koşullarda var olan düşük dozlardaki ROS hücre çoğalması ve hücresel homeostazis için gerekli olan büyüme ile ilgili sinyal yollarının aktivasyonunu sağlamaktadır. Ancak bunun aksine hücrelerde artan ROS seviyesinin karsinogenezisin gelişimini oldukça hızlandırdığı da tespit 14 edilmiştir.41 Oksidatif stres hücre ölümüne neden olabildiği gibi hücresel içeriğin ekstrasellüler ortama yayılmasına da neden olabilmektedir.42 Mitokondriler başlıca ROS kaynağı olmanın yanı sıra ROS’un zararlı etkilerinden de en fazla etkilenen organellerin başında gelmektedir. Mitokondride meydana gelen sorunlar mitokondrial DNA (mtDNA) da, mitokondrial RNA (mtRNA) transkripsiyonunda, protein sentezinde ve mitokondrial fonksiyonlarda hasarla kendisini belli etmektedir.43 2.2.1.3. Apoptoz (Programlı Hücre Ölümü) Organizmada görevini tamamlamış ya da hasara uğramış hücrelerin diğer hücrelere zarar vermeden ortadan kaldırıldığı, genetik olarak kontrol edilen programlanmış hücre ölümü olarak da tanımlanan apoptoz44 enerjiye gereksinim duyan ve organizmada var olan homeostazı koruyan bir olaydır.45 Gelişim, yaşlanma ve dokulardaki hücrelerin devamını sağlamak için homeostatik bir mekanizma olarak karşımıza çıkan apoptoz, aynı zamanda hastalık ya da zararlı ajanlar nedeniyle hücreler zarar gördüğünde immün reaksiyonlar gibi bir savunma mekanizması olarak da oluşabilmektedir.46 Apoptotik süreçte, gelen uyarının ardından hücre yapıştığı zeminden ve komşu hücrelerden ayrılarak küçülür. DNA fragmantasyonu, kromatin kondensasyonu oluşmaya ve membranla çevrili veziküller görülmeye başlar. Süreç ilerledikçe bu veziküller komşu hücreler ya da fagositler tarafından fagosite edilir. Apoptotik süreçte inflamasyon oluşmaz. Bir diğer hücre ölüm türü olan nekrozda ise hücre zarı ya da hücredeki metabolik süreçler hasar görür ve hızla bozulan zar geçirgenliği sonucunda hücre şişer. Sonuçta membran patlayarak hücre içindeki maddeler dışarı dağılır ve inflamasyon uyarılmış olur.47 Bir hücrenin apoptoza mı yoksa nekroza mı gideceği uyarıcı tipi ve/veya uyarıcı derecesi ile belirlenir. Sıcaklık, radyasyon, hipoksi ve sitotoksik anti-kanser ilaçlar gibi 15 çeşitli zararlı uyaranlar düşük dozda apoptoza, yüksek dozlarda ise nekroza neden olabilmektedir. Özellikle kanser ile bağlantılı olan apoptoz, kaspazlar olarak adlandırılan bir grup sistein proteazların aktivasyonunu kapsayan çoğunlukla enerji bağımlı bir süreçtir.48 Kaspazlar hücreyi apoptozdan koruyan proteinleri ortadan kaldıran veya inaktive eden bir protein grubudur. Ayrıca apoptozu inhibe eden negatif regülatörleri de yıkarak hücre ölümünü tetiklemektedirler.49 En önemli negatif apoptoz inhibitörü, antiapoptotik ve proapoptotik üyelerden oluşan ve apoptozu düzenlemede önemli role sahip bir onkoprotein grubu olan Bcl-2 ailesidir.49,50 Bir hücrede eğer proapoptotik proteinler fazla ise hücre apoptoza daha fazla eğilimli, antiapoptotik proteinler fazla ise daha az eğilimlidir. Proapoptotik üyeler Bad, Bax, p53, Bid, Bcl-xs, Bak, Bim, Puma ve Noxa’dır. Antiapoptotik üyeler ise Bcl-2, Bcl-xL ve Mcl-1’dir.45 Hücrenin apoptoza gidip gitmeyeceğinin belirlenmesinde hücre içi Bcl-2/Bax oranı son derece önemlidir. Eğer Bax fazla ise hücre apoptoza gidecektir, Bcl-2 fazla ise apoptoz inhibe edilecektir.44 DNA gardiyanı da denilen p53 proteini, proapoptotik bir protein olup tümör baskılayıcı protein olarak da bilinmektedir.47,49 Kaspaz 3, 7, 8 ve 9 enzimlerini aktive ederek apoptozu uyarmakta ve malignant oluşumunu engellemektedir.49 p53, DNA’nın ya da hücrenin hasar görmesi durumunda, DNA’da belli genlerin aktivasyonuna, yani yapımlarının artmasına (Bax, Apaf-1, Fas) belli genlerin ise baskılanmasına (Bcl-2, BclX) yol açarak apoptozu tetikler.47 İnsan kanserlerinde en sık görülen (%50-55) mutant gen p53'tür. Normal bir hücrede DNA hasarı meydana geldiğinde, p53 miktarı artarak hücre siklusunu bölünme kontrol noktalarından G1’de durdurup DNA onarımı için hücreye zaman kazandırır. Hasar tamir edilemezse de hücre apoptoza gider.51 Ancak p53 proteini mutant olan hasarlı hücreler, G1 fazında durmazlar, onarım için yeterli zaman da olmadığından bir sonraki S fazında hata iki katına çıkar.52 16 2.3. Antioksidanlar Canlılarda hücre içi savunma sisteminin bir parçası olan ve ROS oluşumunu önleyen veya etkilerini nötralize ederek meydana getirdikleri hasarı azaltan antioksidan olarak adlandırılan çeşitli savunma mekanizmaları mevcuttur.53,54 Antioksidanlar ya direkt olarak serbest radikalleri ve ROS’ları temizlerler ya da indirekt olarak serbest radikalleri veya onların ara ürünlerini metabolize ederek zararsız ürünlere dönüştürürler.55 Antioksidanlar, endojen ve ekzojen kaynaklı olmak üzere iki gruba ayrılırlar. 1. Endojen antioksidanlar da enzimatik olanlar ve olmayanlar diye ikiye ayrılır. A- Enzimatik olanlar; süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSHPx), katalaz (CAT), glutatyon-s-transferaz (GST), mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemidir. B- Enzimatik olmayanlar ise α-tokoferol (E vitamini), β-karoten, askorbik asit, melatonin, ürik asit, bilirubin, glutatyon, seruloplazmin, albumin, transferin, ferritin vs. dir. 2. Ekzojen antioksidanlar arasında ise allopürinol, folik asit, C vitamini, troloxC, asetilsistein, mannitol ve adenozin sayılabilir.56-59 Antioksidanlar 4 farklı mekanizma ile oksidanları etkisizleştirirler. Bu mekanizmalar: 1. Temizleme (Scavenging) Etkisi: Oksidanları zayıf bir moleküle çevirme şeklinde olan bu etki enzimler tarafından yapılır. 2. Baskılama (Quencher) Etkisi: Oksidanlara bir hidrojen aktararak etkisiz hale getirme şeklinde olan bu etki vitaminler ve flavonoidler tarafından yapılır. 17 3. Onarma Etkisi: Hedef moleküllerin hasar sonrası tamir edilmesi veya temizlenmesi ile gerçekleşir. 4. Zincir Koparma Etkisi: Oksidanları bağlayarak fonksiyonlarını engelleyen ağır metaller şeklinde olan bu etki hemoglobin, seruloplazmin ve E vitamini tarafından yapılır.60,61 Son yıllarda yapılan çalışmalarda, melatoninin oksidatif stres ile bağlantısının olduğu, hem direkt bir radikal toplayıcı, hem de antioksidan özelliğe sahip olduğu gösterilmiştir.57,59,62-64 Bilinen en güçlü antioksidanlardan biri olan melatoninin, değişik dokulardaki koruyucu etkileri halen çeşitli deneysel modellerde araştırılmaktadır.59 2.3.1. Melatonin Kimyasal olarak N-asetil-5-metoksitriptamin olarak bilinen melatonin hormonu, ilk olarak 1958 yılında Lerner ve arkadaşları tarafından sığır pineal bezinden izole edilmiş olan doğal bir nörotransmitterdir.65,66 Pineal bez (epifiz bezi) tarafından sirkadiyen ritimde, karanlıkta salgılanan bir hormondur.67 İnsanlarda 3. ventrikülün arkasında yerleşim gösteren pineal bez, böbreklerden sonra vücudun en çok kan akımına sahip olan 2. organıdır.65,68 Pineal bez parankimasında, pinealositler ve glia hücreleri olmak üzere iki tip hücre bulunmaktadır. Parankimal hücrelerin çoğunluğunu oluşturan pinealositler melatonin üretiminden sorumludur, daha az sayıda olan glia hücreleri ise destekleyici fonksiyon üstlenmişlerdir.67 Melatonin yapımından sorumlu tek organın pineal bez olmadığı diffüz (yaygın) nöroendokrin sistem (DNES - APUD: Amine Precursor Uptake Deamin) hücrelerinin de melatonin sentezlediği son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Bu hücreler karaciğer, böbrekler, retina, lakrimal bezler, timus, plasenta, bronşlar, adrenal bezler, gastrointestinal sistem, over, testis ve endometriumda yer almaktadır Ayrıca mast 18 hücresi, lökosit ve naturel killer hücrelerinden de melatonin sentezlenmektedir.69 Ancak bu hücrelerden sentezlenen miktarın kan dolaşımında mevcut olan melatonin düzeyine katkısı çok azdır.66 Pineal bezde melatonin yapılması ve salgılanması karanlık ile uyarılır, ışık ile baskılanır. Aydınlıkta hiperpolarize olan retinal hücreler, karanlıkla beraber depolarize olarak, pineal bezde melatonin sentezini başlatırlar.70 Ortam ışıklanmasına duyarlı olan melatonin salınımı, geceleri gündüze oranla 7-10 kat daha fazladır. Işık retina ve suprakiazmatik nukleus (SCN) üzerinden superior servikal gangliyonu inhibe eder. Bu nedenle aydınlık periyod boyunca superior servikal gangliyon (SCG) pineal bezi uyaramaz. Karanlıkta retinal inhibisyon kalkar ve superior servikal gangliyon (SCG) adrenerjik yolak üzerinden pineal bezi uyarır. Bu uyarı karanlık periyod boyunca pineal bezden melatonin salgılanmasına neden olur.6 Düşük molekül ağırlığına sahip olması, ayrıca lipofilik ve hidrofilik özelliğinden dolayı pinealositlerden pasif difüzyonla hızlı bir biçimde atılan melatonin hormonu depolanmadan hızlı bir şekilde kapillerlere geçer.67,71 Pineal bez kan-beyin bariyerinin dışında olduğundan üretilen melatonin direkt olarak kan dolaşımına oradan da vücuttaki bütün biyolojik sıvılara ve dokulara dağılır. Yapılan analizlerde, birçok dokuda ve vücut sıvısında (beyin omurilik sıvısı, tükürük, lenf, amniotik sıvı, idrar, sperm, retina ve siyatik sinir) melatoninin varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca bu hormon anneden fetusa plasental yolla geçerken yenidoğanda ise süt vasıtasıyla geçmektedir.67 Melatonin sentezinde öncü madde olan triptofan, esansiyel bir aminoasittir. Pineal bez tarafından plazmadan alınan triptofanın zorunlu olarak besinlerle dışarıdan alınması gerekmektedir. Pinealositlerde triptofan, triptofan hidroksilaz ile öncelikle 5hidroksitriptofana hidroksillenir. Oluşan 5-hidroksitriptofan, nörotransmittter olan 19 serotonin ve melatonin sentezi için doğal olarak ortaya çıkan bir ara metabolittir ve dekarboksilaz (dopa dekarboksilaz) vasıtasıyla 5-hidroksitriptamine (serotonin) dönüştürülür. Serotonin de N-asetiltransferaz (NAT) ile N-asetilserotonine, Nasetilserotonin de hidroksiindol-O-metiltransferaz (HIOMT) enzimi tarafından melatonine dönüştürülür.66,67 Melatonin hormonunun salgılanması pinealosit hücrelerinin ışığa duyarlılığıyla ilgili bir durum olduğundan özellikle gece saat 23.00-05.00 sıralarında melatonin salgılanması zirve yapmakta ve kandaki konsantrasyonu 3-10 kat arasında artmaktadır. Melatonin salınımı akşam 21.00-22.00 saatlerinde artmaya başlar, 02.00-04.00 saatlerinde en üst seviyeye ulaşır. Sabah 05.00-07.00’de azalmaya başlar ve 07.00’den sonra bazal seviyelere düşer. Melatoninin kandaki konsantrasyonu gündüz saatlerinde yaklaşık 0-20 pg/dl seviyelerinde iken, gece saatlerinde 50-200 pg/dl düzeylerine yükselir.72 Melatonin hormonunun dolaşımdaki yarılanma süresi 10-40 dakika arasında olup, başlıca karaciğerde ve böbreklerde metabolize olur. Melatoninin %90’ı karaciğerden ilk geçişinde metabolize olmaktadır ve mikrozomal enzimler tarafından 6hidroksimelatonine dönüştürülmektedir. Bu madde sülfat veya daha az olarak da glukoronik aside bağlanır ve idrarla dışarı atılır.67 İnsanlarda ve memelilerde, melatonine ait iki farklı G protein bağlı (G proteincoupled receptor) reseptör olduğu tespit edilmiştir. Bu reseptörler MT1 ve MT2 olarak tanımlanmıştır. MT1 reseptörlerinin hipofizin pars tuberalis kısmında ve hipotalamusun suprakiyazmatik nukleusunda bulunduğu, MT2 reseptörünün ise retinada bulunduğu bilinmektedir. Ayrıca MT1 ve MT2 reseptörlerinin serebellumda, retinal yollarda ve ganglion hücrelerinde de bulunduğu bildirilmektedir.73,74 Reseptör çeşitliliği sayesinde 20 melatonin farklı dokularda, farklı işlevler görebilen, çok yönlü bir molekül olarak dikkat çekmektedir. İşlev ve etkileri arasında şu ana kadar ön plana çıkmış olanlar arasında; kronobiyolojik düzenleyici, immün destekleyici, anti-kanserojenik etki, kan basıncı düzenleyici, antioksidan olma özelliği, üreme fonksiyonları düzenleyici, uyku düzenleyici olması sayılabilir.75,76 2.3.1.1. Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi Melatoninin onkostatik etkiye sahip doğal bir sitotoksin olduğu, birçok kanser çeşidinin semptomlarını hafiflettiği,77 tümör anjiogenezini,78 proliferasyonunu ve metastazını inhibe edici etkiye sahip olduğu gözlenmiştir.79 Pek çok tümör çeşidinde özellikle de hormon bağımlı meme kanserlerinde, melatoninin onkostatik etkiye sahip olduğunu gösteren birçok çalışma mevcuttur. Rodentlerde yapılan in vivo çalışmalarda melatoninin meme tümörünün büyümesini ve gelişmesini önlediği tespit edilmiş, ayrıca meme kanseri hücre proliferasyonunu inhibe ettiği de in vitro olarak gösterilmiştir.80-82 Rutin kanser tedavisi uygulanan kişilere oranla, melatonin uygulanan bireylerde tümör hücresi büyümesinin daha az olduğu, hayat da kalma süresinin ise daha fazla olduğu görülmüştür.83 Melatonin bu etkilerini; - Kanser hücreleri tarafından yağ asidi büyüme faktörü alımını baskılayarak, - Telomer uzunluğunun azaltılması yoluyla telomeraz aktivitesini azaltıp kanser hücrelerinde apoptozu başlatarak, - Tümörlerde damar büyümesine neden olan anjiogenik bir faktör olan endotelin-1 sentezini baskılayarak, 21 - p53 tümör baskılayıcı geninin transkripsiyonunu düzenleyerek gerçekleştirmektedir.77 Genetik, endokrin ve çevresel pek çok faktörün bir araya gelmesiyle oluştuğu ve geliştiği bilinen meme kanserinde, neoplastik meme epiteli oluşumuna neden olan en büyük etkenin östrojen olduğu bilinmektedir.84 Cohen ve arkadaşları tarafından 1978 yılında ilk kez meme kanseri etiyolojisinde pineal bezin muhtemel bir role sahip olabileceği ileri sürülmüştür. Bu araştırmacılara göre pineal bez fonksiyonunda meydana gelen azalma melatonin sekresyonunda düşüşe ve dolayısıyla hiperöstrojenizme neden olmakta, bu durumun sonucunda uzun süreli östrojene maruz kalan meme dokusunda da kanser gelişimi olmaktadır.85 Ratlarda yapılan deneysel çalışmalarda da pinealektomi sonucunda hayvanlarda meme kanseri geliştiği tespit edilmiştir.86 Östrojen reseptör pozitif (ER pozitif) meme kanserli hastalarda melatoninin nocturnal (geceleyin) plazma konsantrasyonunun, sağlıklı kadınlardan ve ER negatif meme kanserli kadınlardan daha az olduğu tespit edilmiştir.82 Yapılan in vitro çalışmalarda, 1 nM’lık melatonin konsantrasyonunun insan meme kanseri hücrelerindeki proliferasyonu ve yayılmayı inhibe ettiği gözlenmiştir. Melatonin bu etkisini hücre siklusu kinetiğini değiştirerek yani G0/G1 fazındaki MCF-7 hücre popülasyonunu artırarak,87 hücre siklusunun uzunluğunu normalden 3 kat daha fazla süreyle uzatarak88,89 ve DNA sentezini azaltarak göstermektedir.89 Hücre siklusunun düzenlenmesinde görev alan genlerden biri p53 tümör süpresör genidir.87 Melatoninin antimitotik ve antioksidan etkisini p53 geninin ekspresyonunu artırmak suretiyle gösterdiğine inanılmaktadır ve p53 eksikliği olan hücrelerin genetiksel olarak stabil olmadıkları ve tümör oluşumuna daha yatkın oldukları görülmüştür.90 p53 tümör süpresör geninin, radyasyon ve kemoterapötik 22 ajanlar gibi etkenler dolayısıyla gelişen DNA hasarında apoptotik sürecin başlatılmasında çok önemli olduğu tespit edilmiştir.91 Melatoninin insanlardaki miyeloid HL-60 hücreleri, B-lenfoma hücreleri, HT-29 kolorektal kanser hücreleri gibi bazı kanser hücrelerinde apoptotik hücre ölümünü başlatıcı etkiye sahip olduğunu gösteren çalışmalar da vardır.92 Son yıllarda apoptotik sürecin kontrolünde görev alan Bcl-2 ailesi olarak tanımlanan protein grubu tespit edilmiştir. Bu protein ailesi hem Bak, Bax, Bcl-XS (Bcl-X short-form) ve Bad gibi apoptoz promotörlerine, hem de Bcl-2, BclXL (Bcl-X long form) ve Mcl-1 gibi apoptoz inhibitörlerine sahiptir. Bu proteinler östrojen duyarlı MCF-7 hücre hattında apoptotik olayları düzenlemektedir.93 23 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Hücre Kültürü 3.1.1. Hücre Kültürü Medyumunun Hazırlanışı 75 ml hazır amniyon hücre kültürü medyumu (Bio-ANF-1) 15 ml suplament (Bio-ANF-1, 01-192-1) 1.5 ml Penisilin+Streptomisin+Amfoterisin B 2 ml L-glutamin Maddeleri eklenerek kullanıma hazır hücre kültür medyumu elde edildi. 3.1.2. Hücre İnkübasyon Koşulları Parental MCF-7 monolayer hücre kültürü (4. pasaj) Tarım Bakanlığı Şap Enstitüsünden (Ankara) temin edildi. Bu hücreler hazır amniyon kültür hücresi medyumu (BioANF-1, 01-190-1) içerisinde, %5 CO2 ve 37oC sıcaklıktaki etüvde (Nuaire), 25 cm2’lik flasklar içerisinde steril şartlarda inkübe edildi. Böylelikle hücrelerin çoğalmaları sağlanmış oldu. 3.1.3. Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing) Üremekte olan hücre pasajları %80-90 doygunluğa (confluent) ulaşınca yeniden pasajlandı.94 Bu amaçla üremekte olan hücreler istenen çoğunluğa ulaştığında; Flaskların içerisindeki besi yeri pipetle alınarak steril fostat tampon solüsyonu (PBS) (25 cm2 için 2 ml) ile yıkandı. Ardından PBS pipetle uzaklaştırıldı ve hücrelerin yapıştıkları alandan kaldırılması için 3 ml tripsin-EDTA solüsyonu ilave edilerek etüvde 10 dk bekletildi. Tüm yüzeye yapışık olan hücrelerin kaldırılmasının ardından süspansiyon halindeki hücre+tripsin-EDTA solüsyonu 15 ml hacimli bir tüp içerisine alındı. Solüsyonun üzerine tripsinin inhibisyonu için tripsin hacminin 2 katı medyum eklendi. 24 Tüpe alınan süspansiyon 1300 rpm’de 10 dk santrifüj edildi, ardından tripsinEDTA solüsyonu uzaklaştırıldı ve hücreler taze hücre medyumu ile süspanse edilerek 3 adet 25 cm2’lik flaska bölünerek yeniden pasajlandı. Yeniden pasajlanan hücreler 37oC’de %5 CO2 ortamında inkübe edildi. 3.1.4. Hücrelerin Dondurulması ve Saklanması Tripsin-EDTA ile yüzeyden kaldırılan hücreler santrifüj edildi ve tripsin besi yerinden uzaklaştırıldı. Sonra hücre pelleti 1 ml besiyeri ile sulandırılarak sayıldı. Tripsin, hacminin en az iki katı serumlu besiyeriyle inhibe edildi. Hücreler pipetlenerek tek hücre süspansiyonu haline getirilip bir falkon tüpe aktarıldı. Üzerine 2-3 ml daha medyum ilave edildi. Hücre süspansiyonu 1300 rpm’de 10 dakika santrifüjlenerek süpernatant uzaklaştırıldı. Pelet 900 µl hücre medyumu ile sulandırılarak sayıldı. Dondurma tüpleri içerisine 100 µl dimetil sülfoksit (DMSO) ve 900 µl hücre medyumu ile süspanse edilen hücre solüsyonu eklendi. Tüpler dondurma kabına yerleştirilerek -80oC’de derin dondurucuda gerektiğinde kullanılmak üzere saklandı. 3.1.5. Hücre Sayılarının Hesaplanması 1 ml kültür medyumunda sulandırılan hücre süspansiyonundan 10 µl alınarak ependorf tüpe konuldu ve üzerine 90 µl tripan blue boyası eklenerek karıştırıldı. Bu karışım Neubauer lamı üzerine konularak 5 bölmedeki hücreler sayıldı, daha sonra bulunan bu sayı -sulandırma miktarı x 50 000- sayısı ile çarpıldı. Sonuç olarak 1 ml medyumda kaç milyon hücre olduğu bulundu. Böylece ekim yapılacak sayı belirlenip hücrelerin petriye ekimleri yapıldı. 100 mm’lik kültür petrisine 5x106 hücre ve 96 kuyucuklu kültür plağının her kuyucuğuna 5000 hücre transfer edildi. 25 3.2. Melatonin Dozunun Belirlenmesi Melatonin uygulaması için uygun dozun belirlenmesi amacıyla 96 kuyucuklu plağa eşit sayıda hücreler konuldu. Ardından hücre kontrol, medyum kontrol, 10, 25, 50, 100, 1000, 10 000, 50 000 ve 100 000 nM konsantrasyonlarda melatonin hücre medyumlarına katıldı ve hücreler inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyon sürelerinin ardından 3-(4,5-Dimetiltiyazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid, sarı tetrazol (MTT) analiz yöntemi ile hücre viabilitesi (sitotoksisite durumu) değerlendirildi. 3.3. Hücre Proliferasyon Analizi MTT Yöntemi MTT analizi, formazon boyalarının ya da MTT azalmasına bağlı olarak enzimatik aktivitenin kolorimetrik ölçümüne dayanan hücre çoğalma miktarının tespit edildiği bir yöntemdir. Bu yöntemle kullanılacak olan herhangi bir terapotik ajanın hücre üzerindeki sitotoksik ya da proliferatif etkileri belirlenebilmektedir. Melatoninin MCF-7 hücre hattı üzerindeki olası sitotoksik etkisi MTT kiti ile üretici firmanın (Sigma Co. Germany) kullanım talimatına göre uygulandı. Yöntem MTT ajanı ile inkübe edilen hücrelerde meydana gelen renk değişiminin kolorimetrik olarak belirlenmesi prensibine dayanmaktadır. Oluşan renk değişikliği sarı ile renklendirilmiş formazon tuzlarının aktif hücre mitokondrilerinde tetrazolyum tuzunun azalması sonucunda oluşmaktadır. Bu bileşiklerin absorbans değeri metabolik olarak aktivitelerinin belirlenebilmesi ile orantılıdır. Yapılış Yöntemi; MTT yönteminin uygulamasından 1 gün önce 96’lık plak içerisine sayımı yapılan 5000 hücre (5000/kuyu) ile 100 µl medyum hazırlandı ve kuyulara ekimi yapıldı. Mikroplak 24 saat 37°C ve %5 CO2 ayarlı inkübatörde bekletilerek hücrelerin yüzeye yapışmaları sağlandı. Bu yolla tripsin enziminin hücre membran proteinleri ve 26 büyüme faktör reseptörleri üzerinde oluşturduğu zararlar ortadan kaldırılmış oldu. Bu proteinlerin ve büyüme faktörlerinin yeniden sentezlenebilmesi için 24 saatlik bir süre gerekmektedir.95 Ayrıca bu yolla medyum içerisindeki terapotik ajanların hücreyle muamelesinden önce hücrelerin metabolik aktivite kazanmaları da sağlanmış olmaktadır. 24 saatlik inkübasyondan sonra seri dilüsyonlar halinde hazırlanan melatonin maddesi seriler halinde gruplara bölünen hücre hattı medyumuna ilave edildi (100 µl olan medyum ve hücre karışımı üzerine 100 µl içerisinde dilüsyonu yapılan ve konsantrasyonu ayarlanan melatonin eklendi). A serisinin birinci sütunu hücre kontrol ve ikinci sütunu ise meydum kontrol olarak ayarlandı. Melatonin uygulanan hücre hatlarına 24 saat süreli inkübasyondan sonra MTT yöntemi uygulandı. Bu yöntem analizine başlanmadan önce 96’lık plaklarda bulunan medyumun 100 µl’si total antioksidan ve total oksidan miktarlarının belirlenmesi amacıyla başka bir 96’lık plağa gruplar karışmayacak şekilde aktarıldı ve MTT analizine başlandı. MTT analizi; 1- 96’lık plak kuyucuklarında bulunan 100 µl medyum ve hücre karışımı üzerine, hazırlanmış tiazolil mavi tetrazolium bromid solüsyonundan 10 µl ilave edildi. Bu solüsyon ilavesini takiben 96’lık plak inkübatöre alınarak 3 saat bekletildi. 2- Üç saatlik inkübasyonun ardından hücrelerin yüzeyinde bulunan medyum bir pipet ile alınarak MTT çözücü solüsyonundan 100 µl ilave edildi ve 20 dk daha inkübatörde bekletildi. 3- İnkübasyonu yapılan hücrelerin, mikroplak okuyucu spektrofotometre (µQuant, BioTek Instruments, Winooski, Vermont, USA) ile 570 nm absorbans değerinde ölçümleri 3 tekrarlı olarak yapıldı. 27 Microsoft Excel programı yardımı ile uygulanan doz ve % hücre viabilite eğrisi belirlenerek %50 baskılayıcı konsantrasyon (IC50) değeri logaritmik eğim grafiği ile hesaplandı. 3.4. Biyokimyasal TAS ve TOS Analizleri TOS yöntemi; 1- Standart 2 solüsyonundan 50 µl alınarak bir falkon tüp içerisine konuldu. Bunun üzerine 10 ml deiyonize su ilave edildi. 2- Buradan da 50 µl alınarak 10 ml deiyonize su ile dilüe edildi. Böylece günlük çalışma standardının son konsantrasyonu 20 µM H2O2 şeklinde ayarlanmış oldu. 3- Reagent 1’den 500 µl ve hücre medyumundan 75 µl alınarak plak üzerine eklendi. Hafifçe çalkalanarak boş kuyucuklara eklendi ve µ-Quant mikroplak okuyucuda 530 nm absorbans değerinde okutuldu. Bu ilk absorbans olarak kabul edildi. 4- Daha sonra Reagent 2’den 25 µl alınarak plak üzerine ilave edildi. 5 dakika 37oC’de inkübatörde bekletildikten sonra, 530 nm absorbansta mikroplak okuyucuda okutuldu. Çıkan değer aşağıdaki formül ile hesaplandı. Sonuç = (Absorb Örnek / Absorb Standard 2) X 20 (Standard 2 değeri) Örnek Absorb = (Örnek ikinci Absorb – ilk örnek Absorb) Absorb Standard 2 = (İkinci Absorb Standard 2 – ilk Absorb Standard 2) TAS yöntemi; Standart 2 Value = 20 μmol H2O2 Equiv./L 1- 500 µl Reagent 1’den alınarak plağa konuldu. Üzerine 30 µl standart ve numuneden eklenerek mikroplak okuyucu ile 660 nm absorbans değerinde okutuldu. 2- Daha sonra 75 µl Reagent 2’den ilave edilerek 5 dakika 37oC’de inkübatörde bekletildi ve 660 nm absorbans değerinde okutuldu. 28 3- Boş 3 kuyucuğa standart 1 ve boş 3 kuyucuğa standart 2’den ilave edilerek aynı absorbans değeri ile okutuldu. Çıkan değerler aşağıdaki formül ile hesaplanarak elde edilen son konsantrasyondaki çalışma standardı 20 µM H2O2 günlük çalışma solüsyonu şeklinde elde edilmiş oldu. 4- Sonuçlar mikroplak okuyucu’da 660 nm absorbans değeri ile okutuldu ve sonuçlar mmol Trolox Equiv/L olarak ifade edildi. Sonuç= [ (∆Absorb Standard 1) - (∆Absorb Örnek) ] / [ (∆Abs Standard 1) - (∆Abs Standard 2)] Sonuç = Absorb Standard 1= (İkinci Absorb Standard 1- ilk Absorb Standard 1) Absorb Standard 2= (İkinci Absorb Standard 2 - ilk Absorb Standartd 2) Örnek Absorb = (İkinci Absorb örnek – ilk örnek Absorb) 3.5. İmmunsitokimyasal (ICC) Boyama Metodu Hücrelerin Lamda Üretilmesi 1. Poly-L-lysine kaplı lamlar (Thermo Fisher Scientific, USA) 10 cm çapındaki petri kutularına hücre ekimi yapılmadan önce yerleştirilerek class II tip biyogüvenlik kabini içerisinde 4 saat süreyle ultraviyole ışık altında sterilize edildi. 2. 25 cm2’lik flasklarda çoğaltılan hücrelerden, UV ışık altında steril edilen petrilere her bir petri içerisindeki lamların üst yüzeylerine eşit miktarda (100 µL medyumda süspanse yaklaşık 5000) hücre gelecek şekilde ekim yapıldı. 3. Lam üzerine hücrelerin yapışmasını takiben (ortalama 24 saat sonra), petriler gruplara ayrıldı ve melatonin uygulanacak olan grupların petrilerine çeşitli konsantrasyonlarda melatonin eklenirken, kontrol grubundakilere aynı miktarda kültür medyumu konuldu. 29 4. İnkübasyon süresinin bitimini takiben (24 saat sonra) petri içindeki medyum, pipet yardımıyla uzaklaştırıldı ve fosfat tampon solüsyonu (PBS) eklenerek hücre yıkama işlemi yapıldı. Fiksasyon; 1. PBS ile yıkanan ve lam üzerinde yapışık bulunan hücreler petrilerden çıkarılarak -20oC’de soğutulmuş metanol içerisinde 10 dakika tespit edildi. 2. Tespit edilen lamlar PBS ile yıkandı, kurutuldu ve boyama prosedürüne başlanıncaya kadar -20oC’de saklandı. İmmunperoksidaz boyama tekniği; Boyama işlemine alınacak lamlar derin dondurucudan çıkarılarak oda ısısına gelinceye kadar bir süre bekletildi ve takiben PBS ile yıkandı. Endojen peroksitlerin bloklanması için %3’lük H2O2 solüsyonuda 10 dk bekletildi. Daha sonra 5 dk süre ile 3 kez PBS solüsyonuyla yıkandı. Permeabilizasyon için (intrasellüler protein tespiti için oldukça önemlidir); lamlar %0,1 Triton X-100-PBS solüsyonunda 10 dk bekletildi. Lamlar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra %1 BSA-PBS (bloklama) solüsyonunda 30 dk bekletilerek non-spesifik bağlanmaların önüne geçildi. Daha sonra %1 BSA-PBS solüsyonu ile sulandırılan primer antikorda (p53, Mouse monoclonal, ab1101 - Bax, Mouse monoclonal, ab5714) 37oC’de 1 saat nemlendiricili kabinde bekletildi. Lamlar üzerindeki primer antikor solüsyonu lamı eğip kenarından döküldükten sonra, PBS solüsyonu ile her biri 5 dk olmak üzere 3 kez yıkandıktan sonra üzerine sekonder antikor solüsyonu döküldü. Sonra 1 saat boyunca nemlendiricili kabin içerisinde inkübe edildi. 30 Sekonder antikor lamların üzerinden uzaklaştırıldıktan sonra, her biri 5’er dk olacak şekilde PBS ile 3 kez yıkandı. Lamların üzerine Horseradish peroksidaz (HRP) konjugeli streptovidin biotin damlatılarak 30 dk inkübe edildi. Streptovidin biotin solüsyonu lamlardan uzaklaştırıldıktan sonra 3 kez 5 dk süreli PBS ile yıkandı. Lamlar çekirdek boyaması için Harris’in Hematoksilen solüsyonunda 5 dk bekletildikten sonra dereceli alkol ve ksilol serilerinden geçirilip entellan (Merck, Germany) ile kapatıldı. 3.6. İmmunsitokimyasal Değerlendirme İmmunsitokimyasal boyama sonuçlarının gruplar arası kıyaslamalarını yapabilmek için “Stereolojik Fractionator Frame” metotu kullanıldı. Bu analizler stereoloji workstation sistemi (BioPrecision MAC 5000 controller system) ve stereoloji software (Stereo Investigator version 9.0, Microbrightfield, Colchester, VT) ataçmanlı ışık mikroskop (Leica DM4000 B, Tokyo, Japan) altında yapıldı.96,97 Çalışmamızda MCF-7 hücre preparatları üzerinde p53 ve Bax immunpozitifliğini tespit edebilmek için “Unbiased Counting Frame and Fractionator” metodu95,96 kullanıldı. Tüm gruplara ait her bir preparattaki 1000 adet hücre sayılarak bunlar içerisinde pozitif hücreler fractinator programıyla işaretlendi. Preparattaki sayım sonrası 1000 hüre içerisindeki pozitif hüre yoğunluğu Tablo 4.3 ve 4.4’te verilmiştir. Stereolojik Fractionator programı ile hücrelerin sayımı Şekil 3.1’de gösterilmektedir. 31 Şekil 3.1. Stereolojik “Fractionator Frame” metodu ile Bax immunpozitifliğinin değerlendirilmesi, Ok başı: immunpozitif hücreyi göstermektedir. 3.7. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real-Time PCR) Analizleri 3.7.1. mRNA Ekstraksiyonu 1- +4 0C de çözülen hücre ve medyum karışımı ependorf tüplere aktarıldı. 450x g’de 5 dakika santrifüj edildi, süpernatant aspire edilerek uzaklaştırıldı. 2- Pelet üzerine 600 µl RLT buffer (lizis buffer) 600 µl %70’lik alkol eklendi. (Yaklaşık 1200 µl olan solüsyonun önce 700 µl’si, sonra kalan kısmı santrifüjlendi). 3- Alınan 700 µl spine column’a aktarıldı. 8000x g’de 15 saniye santrifüjlendi. Dibe çöken sıvı döküldü. Üstteki filtre, almak istediğimiz RNA’yı bağlayan kısımdır. Solüsyonun geri kalanı tekrar aynı spine column’a döküldü ve 8000x g’de 15 saniye santrifüjlendi. Dibe akan sıvı döküldü, üstteki filtrede RNA toplanmış oldu. 4- Filtrede toplanmış RNA, yıkama işlemine alındı. Bunun için spine column’a 700 µl RW1 konulup 8000x g’de 15 saniye santrifüjlendi. Dip kısmı döküldü. 5- Sonra 500 µl RPE konulup 8000x g’de 15 saniye santrifüjlendi. 32 6- Tekrar 500 µl RPE konulup 8000x g’de 2 dakika santrifüjlendi. Dibi döküldü, kalanı 13000x g’de 2 dakika santrifüjlendi. 7- Spine column ters çevrilip oda ısısında 10 dakika bırakılarak alkolün tamamen uzaklaşması sağlandı. 8- Spine column’lar yeni tüplere yerleştirilip üzerlerine 50 µl “elution buffer” eklenip yine ısıtıcıya konuldu. Bir dakika böyle bekledikten sonra 8000x g’de 1 dakika santrifüjlendi. Böylece RNA alttaki toplama tüpüne geçmiş oldu; spine column atıldı. 3.7.2. cDNA (Komplementer Zincir) Sentezlenmesi RNA izolasyonundan sonra kültüre edilmiş doku hücrelerinden elde edilen total RNA miktarları spektrofotometre kullanılarak 260/280 nm oranına göre hesaplandı ve sonuçlar ng/µl olarak bulundu. Tek zincirli total RNA zincirleri kullanılarak tamamlayıcı (komplementer) zincirleri, “QuantiTec® Reverse Transcriptase Kit Qiagen, Germany” ile sentezlendi ve cDNA yapılarına dönüştürüldü. İşlem, kit üreticisi firmanın kullanım kılavuzunda gösterdiği basamaklar izlenerek yapıldı. Evvelce derin dondurucudan (-20oC) çıkarılarak buz kabı içerisinde erimeye bırakılan kit içeriğinin yanına, izole edilmiş RNA örnekleri de kondu ve kit içeriği ile RNA örneklerinin aynı sıcaklığa gelmeleri için 10 dakika beklendi. Her bir örnek için kit içeriğindeki “gDNA Wippeout buffer, X 7”’den 2 µl, “templete RNA’dan 1 µl ve kit içeriğindeki “RNasefree”’sudan 11 µl’lik hacimler 200 µl’lik PCR tüplerine konarak pipetleme yoluyla iyice karıştırıldı. Her bir örnek için ayrı ayrı hazırlanan tüpler sıcaklığı 42oC’a getirilmiş ısı bloğuna konarak 10 dakika süreyle bekletildi. Bu aşamada örneklerden elde edilen total RNA’nın içerisinde yer alan genomik DNA yapıları uzaklaştırıldı. 10 dakikalık ısı bloğundaki inkübasyonu takiben örnekler hemen buz kabına aktarılarak reaksiyonun sonlandırılması sağlandı. Bu aşamayı takiben cDNA oluşturulması basamağına geçildi. 33 Buz kabında bekletilen kit içeriği, Tablo 3.1.’de, her bir örnek için belirtilen hacimlerde yeni bir 200 µl’lik PCR tüpü içerisinde hazırlandı. Hazırlanan örnekler cDNA reaksiyonu için “Rotor Gene Q” PCR cihazına konarak, 42oC’da 15 dakika ve 95oC’da 3 dakika inkübe edilerek cDNA’lar sentezlendi. Tablo 3.1. cDNA sentezinde kullanılan kimyasallar Reverse-transcription master mix 1 µl Quantiscript RT-Buffer, 5X 4 µl RT Primer mix 1 µl Templete RNA (bir önceki basamakta elde edilen) 14 µl Toplam 20 µl 3.7.3. p53 Gen Ekspresyonunun Yarı Kantitatif Olarak Ölçülmesi p53 ve aktin proteinlerini kodlayan mRNA’ların kantitatif olarak ölçülmeleri için “QuantiTec® Primer Assay, Qiagen kits for SYBR® Green-based real-time PCR” kitleri kullanıldı. p53 çalışması için QT00060235, internal kontrol ve sanal standart eğim hesaplaması için kullanılan aktin protein için QT01680476 katalog numaralı ürünler kullanıldı. Yapılan PCR amplifikasyonu üretici firmanın belirttiği protokollere uygun olarak “Rotor Gene Q” PCR cihazı kullanılarak yapıldı. 34 4. BULGULAR 4.1. Etkin Melatonin Dozunun Belirlenmesi MCF-7 meme kanseri hücre hattı üzerine, en etkin dozu belirleyebilmek amacıyla farklı dozlarda melatonin uygulandı. Ardından MTT yöntemiyle melatoninin sitotoksisitesi ve baskılayıcı konsantrasyon 50 (IC50) değeri belirlendi. Ayrıca flasklara ekilen hücrelerdeki proliferasyonu göstermek amacıyla hücrelerin Trinoküler invert mikroskop (Olympus CKX41) ile görüntüleri alındı (Şekil 4.1). Şekil 4.1. Melatonin uygulanan ve uygulama yapılmayan gruplara ait MCF-7 hücrelerinin invert mikroskop görüntüsü. A; Kontrol grubu B; 10 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup C; 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup D; 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup E; 10 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grup F; 100 000 nM melatonin uygulanan grup 35 4.2. Melatoninin Anti-proliferatif Etkisinin MTT Yöntemiyle Belirlenmesi Hücre yoğunluğu, spektrofotometrik olarak ölçme metotuna dayanan MTT yöntemi kiti (Sigma Aldrich, USA) ile belirlendi. 96’lık plak içerisine MCF-7 hücre hattı ekildikten sonra 24 saat süreyle hücrelerin metabolik fonksiyonlarını düzenlemeleri beklendi. Metabolik fonksiyonlarını düzenleyen hücrelerin medyumu içerisine, kültür medyumu ile dilue edilen çeşitli konsantrasyonlarda melatonin ilavesi yapılarak 24 saat süreyle inkübasyonu yapıldı. Bu sürenin sonunda, MTT yöntemi ile hücre yoğunluğu ya da melatoninin hücreler üzerindeki olası etkisi mikroplak okuyucu ile okutularak logaritmik eğim çizgisi çizildi. Logaritmik eğim çizgisinden melatoninin baskılayıcı konsantrasyon 50 (IC50) değeri 98 µM olarak belirlendi (Şekil 4.2). Şekil 4.2. 24 saatlik inkübasyon süresine ait baskılayıcı konsantrasyon 50 (IC50) değeri Melatonin uygulanan hücrelerden 24 saatlik inkübasyon süreci sonucunda elde edilen viabilite değerlerinin değerlendirmesinde; melatonin uygulanmayan grubun hücre yoğunluğunun en yüksek olduğu ve bu değerin konsantrasyon artışına bağlı olarak 36 düştüğü görülürken IC50 değerinin 98 µM olduğu belirlenmiştir. Hücre yoğunluğunun doz artışına bağlı olarak değiştiği tespit edilmiştir (Tablo 4.1). Tablo 4.1. Melatonin konsantrasyonu ve viabilite değerleri Gruplar Viabilite Kontrol 0,3667± 0,0770a 10 nM 0,3542± 0,0525a 25 nM 0,3527± 0,0573a 50 nM 0,3528± 0,0544a 100 nM 0,3240± 0,0294a 1000 nM 0,2795± 0,0563b 10 000 nM 0,2041± 0,0416c 50 000 nM 0,1905± 0,0661c 100 000 nM 0,1820± 0,0305c Tüm veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi. İstatistiksel analizler düzenli dağılım gösterdiği için parametrik One-Way Anova, Post Hoc. Duncan Testi ile değerlendirildi. Aynı sütundaki farklı harfler istatistiksel önemi göstermektedir. İstatistiksel önem p<0.05 olarak kabul edildi. 4.3. Biyokimyasal Total Oksidan Seviyesi ve Total Antioksidan Kapasitesi Değerlendirme Sonuçları Total oksidan seviyesi değerlendirmesinde; melatonin uygulaması yapılan gruplardan en yüksek seviyenin 100 nm konsantrasyonda melatonin uygulanan grupta, en düşük seviyenin ise 100 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grupta olduğu görüldü. Total oksidan seviyesi açısından 100 nm konsantrasyon uygulanan grupla diğer gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark olduğu görüldü. (p<0.05). Total antioksidan kapasitelerine baktığımızda ise en düşük değerin 100 000 nM konsantrasyonda, en yüksek antioksidan kapasitesinin ise 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grupta olduğu görüldü. Yine arada istatistiksel açıdan anlamlı bir fark olduğu (p<0.05) tespit edildi (Tablo 4.2, Şekil 4.3, Şekil 4.4). 37 Tablo 4.2. Total antioksidan ve oksidan değerleri analiz sonuçları TAS değeri TOS değeri (µmol H2O2 Equv/L) (µmol H2O2 Equv/L) Kontrol 0,1395± 0,0318a 4,1503± 0,2899a 10 nM 0,2929± 0,0763b 4,3313± 0,9410a 100 nM 0,3148± 0,1188b 4,8039± 0,6612b 1000 nM 0,2896± 0,0790b 4,1830± 0,2135a 10 000 nM 0,2843± 0,0791b 4,0196± 0,4319a 100 000 nM 0,1925± 0,0946ab 3,6275± 0,5882a Grup Tüm veriler ortalama ± SD olarak belirtildi. İstatistiksel analizler One-Way Anova, Post Hoc. Duncan Testi ile değerlendirildi. İstatistiksel önem p < 0.05 olarak kabul edildi. 0,35 TAS analizi sonuçları 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 kontrol 10 nM 100 nM 1000 nM 10000 nM 100000 nM Şekil 4.3. Total antioksidan seviyesinin gruplar arasındaki dağılımını gösteren grafik 38 6,0 TOS analizi sonuçları 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 kontrol 10 nM 100 nM 1000 nM 10000 nM 100000 nM Şekil 4.4. Total oksidan seviyesinin gruplar arasındaki dağılımını gösteren grafik 4.4. İmmunsitokimyasal Sonuçlar 4.4.1. Stereolojik İmmunsitokimyasal p53 Pozitif Hücre Yoğunluğu İmmunsitokimyasal p53 boyaması sonucunda immunpozitifliğin değerlendirilmesinde, stereolojik olarak saydığımız toplam 1000 hücre içerisinde p53 pozitif hücre sayısının kontrol grubunda en az olduğu, melatonin dozundaki artışa paralel olarak da pozitifliğin arttığı ve en yoğun pozitifliğin 100 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grupta olduğu görüldü (Tablo 4.3). Tablo 4.3. İmmunsitokimyasal p53 pozitif hücre sayısının stereolojik analiz sonuçları Toplam Hücre p53 Pozitif Hücre Sayısı Sayısı Kontrol 1000 230 10 nM 1000 204 100 nM 1000 296 1000 nM 1000 440 10 000 nM 1000 443 100 000 nM 1000 441 Gruplar 39 Şekil 4.5. Kontrol grubuna ait MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği Şekil 4.6. 10 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği 40 Şekil 4.7. 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği Şekil 4.8. 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği 41 Şekil 4.9. 10 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği Şekil 4.10. 100 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında p53 immun pozitifliği 42 4.4.2. İmmunsitokimyasal Bax Pozitif Hücre Yoğunluğunun Stereolojik Analizi Sonuçları İmmunsitokimyasal Bax boyaması sonucunda immunpozitifliğin değerlendirilmesinde, stereolojik olarak saydığımız toplam 1000 hücre içerisinde Bax pozitif hücre sayısının kontrol grubunda ve 100 nM’lık melatonin uygulanan grupta az olduğu, melatonin dozundaki artışa paralel olarak da pozitifliğin arttığı, en yoğun pozitifliğin ise 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan grupta olduğu görüldü (Tablo 4.4). Tablo 4.4. İmmunsitokimyasal Bax pozitif hücre sayısı stereolojik analiz sonuçları Toplam Hücre Bax Pozitif Hücre Sayısı Sayısı Kontrol 1000 270 10 nM 1000 313 100 nM 1000 252 1000 nM 1000 656 10 000 nM 1000 479 100 000 nM 1000 484 Gruplar 43 Şekil 4.11. Kontrol grubuna ait MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği Şekil 4.12. 10 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği 44 Şekil 4.13. 100 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği Şekil 4.14. 1000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği 45 Şekil 4.15. 10 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği Şekil 4.16. 100 000 nM konsantrasyonda melatonin uygulanan MCF-7 hücre hattında Bax immun pozitifliği 46 4.5. PCR Sonuçları Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile değerlendirilen p53 gen ekspresyon düzeyi, 1000 nM konsantrasyondaki melatonin grubunda (Tablo 4.5) oldukça yüksek olarak bulundu. Tablo 4.5. p53 ve internal kontrol (aktin) konsantrasyon değerleri p53 Gruplar konsantrasyonu (IU/ml) Aktin (internal kontrol) konsantrasyonu (IU/ml) p53 konsantrasyonu/ (aktin konsantrasyonu (IU/ml) Kontrol 42 587296 0,0000715 10 nM 56 413394 0,0001360 100 nM 13 221140 0,0000588 1000 nM 2091 6154066 0,0004710 10 000 nM 34 533581 0,0000637 100 000 nM 3 101028 0,0000297 Gen ekspresyon düzeyi, “örnek konsantrasyonu (IU/ml) /internal kontrol konsantrasyonu” formülü ile hesaplandı. Çalışılan bütün deney gruplarında p53 gen bölgesine ait gerçek zamanlı amplifikasyonlar grafik olarak gösterildi (Şekil 4.17 - 4.23). Gen ekspresyonunun en yüksek olduğu çalışma grubu, 1000 nM melatonin uygulanan grupta elde edildi. İnternal kontrol olarak aktin gen bölgesi hedeflendi ve bu gen bölgesine ait amplifikasyonlar, p53 gen bölgesine ait amplifikasyonlarla birlikte Şekil 4.24 - Şekil 4.30 arasında gösterildi. Aktin, tüm hücreler için vazgeçilmez bir hücre içi protein olduğundan çalışmada internal kontrol olarak kullanıldı. Ayrıca internal kontrol (aktin) konsantrasyon değerini elde etmemiz bize, bulduğumuz p53 konsantrasyon değerini 47 aktin konsantrasyonuna oranlayarak, hedef bölge gen ekspresyon değerini bulmamızı sağladı. Şekil 4.17. Gerçek zamanlı PCR’da kontrol grubu p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine yaklaşık 29. döngüde ulaşılmıştır. Şekil 4.18. Gerçek zamanlı PCR’da 10 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine kontrol grubundan daha önce ulaşılmıştır. Şekil 4.19. Gerçek zamanlı PCR’da 100 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine önceki 2 gruptan daha sonra ulaşılmıştır (yaklaşık 33. döngü). 48 Şekil 4.20. Gerçek zamanlı PCR’da 1000 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değeri en erken bu döngüde aşılmıştır (yaklaşık 24. döngü). Şekil 4.21. Gerçek zamanlı PCR’da 10 000 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine kontrol grubu ve 100 nM melatonin çalışma grubu değerlerine yakın bir değerde ulaşılmıştır (yaklaşık 35. döngü). Şekil 4.22. Gerçek zamanlı PCR’da 100 000 nM melatonin uygulanan çalışma grubunun p53 mRNA amplifikasyonu. Eşik değerine en son bu grupta ulaşılmıştır (yaklaşık 38. döngü). 49 Şekil 4.23. Negatif kontrol (p53) Şekil 4.24. Farklı bir gen bölgesi olarak “Aktin gen bölgesi”, “internal kontrol” olarak kullanılmıştır. p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyonları gösterilmiştir. Şekil 4.25. 10 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri. 50 Şekil 4.26. 100 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri. Şekil 4.27. 1000 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri. Çalışmanın bu grubunda p53 ve Aktin gen amplifikasyonları önemli derecede artmış olarak görülmekte. Şekil 4.28. 10 000 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri. 51 Şekil 4.29. 100 000 nM melatonin grubunda, p53 ve Aktin gen bölgelerinin gerçek zamanlı amplifikasyon eğrileri. Şekil 4.30. Negatif kontrol Şekil 4.31. p53 ve Aktin gen bölgelerine ait erime (melting) sıcaklıklarının gösterimi: A; aktin (yaklaşık 82.2oC) ve B; p53 (yaklaşık 87.1 oC). 52 Şekil 4.32. Aktin ve p53 gen ekspresyonlarının birlikte ve lineer eğriler olarak gösterilmesi. 53 5. TARTIŞMA Dünya genelinde kadınlarda en sık görülen kanser türü olan meme kanserinin, 2008 yılı itibariyle diğer kanser türlerine oranla kadınlarda görülme oranının %23’ünü, 98,99 kanser nedeniyle gerçekleşen ölüm oranlarının ise %14’ünü oluşturduğu tespit edilmiştir.99 Meme kanserinin teşhis ve tedavisinde kaydedilen gelişmelere rağmen bu hastalıktan kaynaklanan ölüm oranları son 20 yıl içerisinde artış göstermiştir.100,101 Hastalığa çözüm olabilmesi ve objektif bir sonuç elde edilmesi için endokrin tedavinin ya da kemoterapinin tek tek veya beraber uygulanması sonucunda bile süreç ölümle sonuçlanabilmektedir.102 Son on yıl boyunca bu hastalığın tedavisinde kullanılan pek çok ilaç geliştirilmiştir. Bu ilaçlar arasında vinorelbin, paklitaksel, dosetaksel, letrozol, anastrozol gibi ilaçlar sayılabilir.103 Bu şekilde kullanılan ve yeni uygulanan anti-tümör ilaçları ile kanser kemoterapisi hızla gelişmekte ve böylelikle pek çok kanser türü üzerinde daha pozitif sonuçlar elde edilmektedir. Çoğunlukla çeşitli kanser türleri üzerinde uygulanan kemoterapi başarılı sonuçlar doğururken, bazı durumlarda bu ilaçlar normal doku ve hücreler üzerinde yan etkiler oluşturmaktadır. Ayrıca vücudun ilaca karşı geliştirdiği direnç sonucunda da tedavi etkili olamamaktadır. Klinik olarak da çok ciddi bir problem olan ilaç direncinin sebepleri ve mekanizmaları hâlihazırda araştırılmakta olan bir konu olarak önem arz etmektedir. Hücrenin apoptoz ya da antiapoptoz yolunu seçmesi tamamen ilaca karşı göstermiş olduğu hassasiyetle veya dirençle ilgilidir.104 Bazen çeşitli anti-tümör ajanları vasıtasıyla kanser hücrelerinde aktif hücre ölüm mekanizması olan apoptoz başlatılabilmektedir.105 Ancak bazı durumlarda apoptozun durdurulması ya da engellenmesi söz konusu olmakta bu durum da meydana gelen ilaç direncinin nedeninin ne olduğunu ortaya koymaktadır.104 Kemoterapötik ajanların amacı, normal hücrelere göre oldukça hızlı büyüyen ve çoğalan neoplastik hücreleri proliferatif dönemde iken tahrip edip ortadan kaldırmaktır. 54 Ancak bunu yaparken bazı normal hücreler bile kemoterapiden etkilenmekte ve bu durum da yan etkilere neden olmaktadır. Yan etkilerden de en çok kan hücreleri, gastrointestinal sistemdeki hücreler, kıl folikülleri, spermler, kalp, mesane, böbrekler, akciğerler ve sinir sistemi organları gibi hayati organlar etkilenmektedir.106 Ayrıca bu ilaçlar ROS düzeylerinde artışa ve antioksidanlarda (GSH, GSH-Px, katalaz, vitamin A, E, C, çinko, melatonin ve sitokrom C) azalmalara neden olmaktadır.107 Bu nedenle parenteral veya oral yolla alınan farklı yapı ve özellikteki antioksidan maddeler yardımıyla ROS düzeyleri azaltılmaya ve antioksidan aktiviteleri arttırılarak kemoterapötiklerin oluşturduğu muhtemel yan etkiler azaltılmaya veya tamamen önlenmeye çalışılmaktadır.106 Melatoninin kanser hücrelerinde proliferasyonu inhibe ettiğini ve apoptotik hücre ölümünü artırdığını gösteren çok sayıda çalışma vardır.108-110 Kanser gelişiminin apoptotik programın yürütülmesindeki aksaklıklardan kaynaklandığı bilinmekte111 ve bu durum da melatoninin kanser gelişimini önleyici aktivitesini gözler önüne sermektedir.112 Ayrıca farklı hastalık türlerindeki bireylere verilen melatoninin ciddi yan etkileri olduğunu gösteren bir çalışma da yoktur. Tam aksine çoğu terminal dönemdeki kanser hastasının yaşam kalitesini artırdığı yönünde bulgular da mevcuttur. Tüm bu veriler melatoninin immün sistem üzerinde var olan sitümülatör etkisini, güçlü ve çok yönlü bir antioksidan ve serbest radikal süpürücü olduğunu kanıtlamaktadır.113 Biz de çalışmamızda yukarıda bahsedilen şekliyle yan etkisi olmayan, ilaç direnci geliştirmeyen, antioksidan ve anti-kanserojenik etkileri bilinen melatoninin MCF-7 meme kanseri hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisini in-vitro ortamda göstermeyi amaçladık. Çalışmamızda gruplarımızdaki hücre yoğunluğunun, melatonin uygulanmayan grupta en yüksek değere sahip olduğunu ve bu değerin melatonin konsantrasyonunudaki artışa bağlı olarak düştüğünü tespit ettik. Yapılan araştırmalarda 55 melatoninin %50 baskılayıcı değerinin (IC50) 23 µM, 35 µM’dan başlayıp 426 µM’a kadar geniş bir yelpaze içerdiğini gördük.114-116 Biz de çalışmamızda 24 saatlik inkübasyon süresinin sonunda melatoninin IC50 değerini 98 µM olarak belirledik. Baskılayıcı konsantrasyonda görülen bu doz farklılığının vücut hücrelerindeki farklılığa bağlı olabilceği anlaşıldı. İlk olarak Mosmann tarafından uygulanan, daha sonra Alley ve ark. tarafından geliştirilen 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) yöntemi hücre canlılığının belirlenmesi için sıkça kullanılan pratik bir yöntemdir.117,118 MTT, hücrelere aktif olarak absorbe olan ve mitokondriye bağlı bir reaksiyon ile renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenen bir maddedir.118,119 Hücrelerin MTT indirgeme özelliği hücre canlılığının ölçütü olarak alınır ve MTT analizi sonucunda elde edilen boya yoğunluğu canlı hücre sayısı ile korelasyon gösterir.120 Biz de çalışmamızda, 24 saat süreyle melatoninle inkübe ettiğimiz MCF-7 hücrelerine uyguladığımız MTT analizi sonuçlarından, hücre yoğunluğunun kontrol grubuna göre azaldığını tespit ettik. Yapılan in vivo ve in vitro çalışmalarda melatoninin antiproliferatif, kemopreventif, onkostatik ve tümör inhibe edici etkisi gösterilmiştir.121 MTT analizi sonucunda bizim de belirlediğimiz gibi hücre yoğunluğundaki azalmayı, Cos ve ark. melatoninin hücre siklusunun G1/S fazına geçişini engellemesine ve de S fazında ilerleyen hücrelerde DNA sentezini azaltmasına bağlamışlardır.122 Yaşam için oksijene ihtiyaç duyan aerobik organizmalarda, metabolizmanın normal işleyişi için oksijen kullanılmakta ancak bunun sonucunda hücre ve dokular için oldukça zararlı olan serbest radikaller (ROS)123 ve oksidatif stres ortaya çıkmaktadır.124 En çok bulunan serbest radikal ise mitokondri ve endoplazmik retikulumdaki elektron transportu sırasında ortaya çıkan süperoksit radikali (O2.-) dir. Oluşan serbest radikaller canlı hücrelerdeki lipid, şeker, amino asit, nükleotid ve DNA gibi hemen hemen bütün 56 moleküllerle reaksiyona girerek hücreye zarar vermekte, sonuçta da kanser, nörodejenerasyon ve otoimmün hastalıklar gibi pek çok hastalığın gelişimine neden olmaktadırlar.123,124 Serbest radikallerin ve onlara ait reaktantların neden olduğu hasarlardan hücreyi korumak için organizmalar bazı savunma sistemleri geliştirerek intrasellüler ortamı serbest radikallerin zararlı etkilerinden korumak isterler ve bunu gerçekleştirmek için de hemen antioksidan sistemleri devreye sokarlar.58 Melatoninin de serbest radikal temizleme aktivitesine sahip güçlü bir antioksidan olduğunu gösteren çok sayıda çalışma vardır.125-127 Melatonin sahip olduğu direkt onkostatik etkisini onkogen ekspresyonunu kontrol ederek, kanser hücrelerinde apoptozu indükleyerek ya da serbest radikallerin oluşumunu inhibe ederek göstermektedir. Bunun dışında sahip olduğu immünomodülatör etkisini ise IL-2 bağımlı anti-kanser yanıtın aktivasyonuyla göstermektedir.128 Albarrán ve ark. yaptıkları çalışmada gece boyunca artan melatonin salgısına plazmada total antioksidan seviyesindeki artışın eşlik ettiğini, gece ışığa maruz bırakılan civcivlerde ise melatonin salgılanmasının baskılandığını ve bunun sonucunda da total antioksidan seviyesinin düştüğünü göstermişlerdir.129 Ayrıca yapılan başka bir çalışmada viral enfeksiyonlarda iyileşme sırasında oluşan inflamatuar yanıt ile oksidatif stresin azaltılmasının en erken göstergesinin antioksidan seviyesindeki artışın olduğu gösterilmiştir.130 Yaptığımız çalışmada biz de total antioksidan seviyesinin, kontrol grubuna oranla diğer gruplarda melatoninindeki doz artışına bağlı olarak arttığını tespit ettik. Total oksidan seviyesinin en düşük değerini ise kontrol grubuna kıyasla 100 000 nM konsantrasyonda meletonin uygulanan grupta aldığını gördük. Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen hormona bağımlı malignite modelini oluşturmaktadır. Var olan kanıtlar meme kanseri gelişimine neden olarak, erken menarş, 57 geç menopoz veya hormon tedavisi gibi uzun süreli dişi hormonlarına özellikle de östrojene maruz kalmayı göstermektedir.131,132 Melatoninin var olan antitümör etkisini ise nöroendokrin aksla etkileşime girip, gonadal östrojen başta olmak üzere tümör gelişimine neden olan bazı hormonların sekresyonunda azalmayı sağlama yoluyla gösterdiği de bilinmektedir.80,133 Melatoninin fizyolojik konsantrasyonunun östrojen reseptör α-pozitif (ER α-positive) olan meme kanseri hücrelerinde çoğalmayı durdurduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur.134 Ancak ER α-negatif olan hücreler üzerinde proliferasyonu inhibe ettiğini134 ve etmediğini135 gösteren çalışmalar da vardır. Melatoninin sahip olduğu antiproliferatif etkisi sadece meme kanseri hücreleri üzerinde değil prostat kanseri, karaciğer kanseri, endometriyal kanser ve osteosarkoma gibi pek çok tümör tipinde de gösterilmiştir.135 Melatonin ve östradiol arasındaki etkileşim hücre siklusu kinetikleri üzerindeki düzenleyici etkilerinden kaynaklanmaktadır. Östradiol hücre proliferasyonunu uyararak hücresel döngünün G1-S fazında durmasını sağlarken meme kanseri tedavisinde kullanılan tamoxifen gibi östrojen-reseptör antagonistleri G1 fazının erken dönemlerinde hücre büyümesini durdurarak S fazına geçişi erteler ve böylece kanser hücrelerindeki proliferasyonu inhibe ederler.136 Tamoxifen gibi melatonin de S fazındaki hücre oranında %50 azalmaya sebep olurken aynı zamanda da G0/G1 fazındaki hücre oranında da artışa neden olmaktadır.122 Hücre siklusu çeşitli faktörlerin etkisiyle negatif veya pozitif yönde hareket eden bir takım basamaklardan oluşur. Bu basamaklarda etkili olan negatif düzenleyiciler arasında ise birinci sırayı p53 proteini almaktadır.137 17. kromozomun p kolunda yerleşmiş olan p53 tümör süpresör geni, kanser etiyolojisinde oldukça önemlidir ve insan kanserlerinin yarısından fazlasında mutasyona uğrayan, iptal olan ya da yeniden düzenlenen bir gendir. DNA hasarına cevap olarak p53 ya apoptoza eşlik eder ya da 58 hücre siklusunu kontrol eder, bu yapısından dolayı da moleküler bir “genom gardiyanı” olarak adlandırılmaktadır.138 Mutasyonla p53’ün değişmesi veya inaktive olması durumunda ise kanser gelişimi görülmektedir.137,139 Normalde inaktif halde bulunan p53 molekülü DNA hasarı ile aktif hale geçer ve miktarında artış görülür.140 p53’ün en önemli hedefleri arasında, hücre siklusunu düzenlemeye yardım eden siklin bağımlı kinazların çoğunun inhibitörü olan p21WAF1 geni,138 GADD45, siklin G1, Bax, Fas ve IGF-BP3 gibi genler gelmektedir.141 Rodentlerde yapılan in vivo çalışmalarda melatonin uygulaması ile meme tümörlerinin insidansında azalma, in vitro çalışmalarda ise MCF-7 hücrelerinin östrojen reseptörüne bağlanma aktivitesinde artış sonucunda hücre proliferasyonunda düşüş olduğu gösterilmiştir. Dahası melatonin MCF-7 hücrelerinde hem p53 hem de p21WAF1 proteinlerinin ekspresyonunu artırmakta ve böylelikle p53 bağımlı yol üzerinden apoptozun başlatılması olasılığını artırmaktadır.90,142 p53 geni eksik olan hücrelerin ise genetik açıdan kararsız olduğu ve tümör oluşumuna daha yatkın oldukları da tespit edilmiştir.90 Ayrıca melatoninin sadece meme kanseri üzerinde değil endometrial kanser,143 ovaryum kanseri,144 Lewis akciğer kanseri,145 prostat kanseri146 ve intestinal tümörler147 üzerinde de büyümeyi önleyici etkiye sahip olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur. Biz de çalışmamızda melatoninin doza bağımlı olarak MCF-7 hücreleri üzerindeki apoptotik aktivasyonunu araştırmayı amaçladık ve sonuçta melatonin uygulaması ile p53 gen ekspresyon düzeyinin 24 saat inkübasyon sonunda 1000 nM dozda en yüksek değeri aldığını RT-PCR ile tespit ettik. Tümör gelişiminde en önemli adımlardan biri olarak kabul edilen ve insan tümörlerinin yaklaşık %50’sinde görülen olay p53 geninde meydana gelen mutasyondur. Protein stabilizasyonundan dolayı biriken mutant p53 immunohistokimyasal tekniklerle saptanabilmektedir. İmmunohistokimyasal teknikler 59 hem p53’ün hücresel lokalizasyonunun, intraselüler dağılımının tespiti için oldukça önemlidir, hem de diğer proteinlerle çiftli boyama imkânı sağlamaktadır.148 Son yıllarda kanser hücrelerinde p53 aktivasyonunun belirlenmesi için ICC tercih edilen bir yöntem olmuştur.149 Biz de çalışmamızda immunohistokimyasal p53 boyamalarımız sonucunda, kontrol grubuna kıyasla melatonin uygulanan gruplarda pozitif hücre sayısında artış olduğunu tespit ettik. Bu sonuç da bize, uyguladığımız melatoninin p53 aktivasyonunu artırmış ve bu yolla MCF-7 hücrelerinde apoptozu uyarmış olabileceğini düşündürmektedir. İnsan kanserlerinin birçoğunda apoptozu inhibe edici en önemli faktörlerden birinin, Bcl-2 ailesi olarak tanımlanan bir protein grubu olduğu da bilinmektedir. Bu proteinlerden Bax, Bak, Bcl-Xs ve Bad proteinleri apoptozu düzenlerken, Bcl-2, BclXL ve Mcl-1 apoptozu inhibe etmektedir.150,151 Düşük konsantrasyondaki melatoninin bile insan pankreas kanserlerinde kaspaz-9 aktivasyonu ve Bax proteininin seviyesindeki artışı sağlayarak, proapoptotik süreci başlattığı gösterilmiştir.152 Joo ve ark. yaptıkları çalışmada, prostat kanserinde uygulanan melatoninin, Bax proteininde ve sitokrom c’de artışa, Bcl-2 proteininde ise azalmaya neden olduğunu göstermişlerdir.153 Aynı şekilde melatoninin, tümör hücreleri üzerindeki onkostatik etkisini Bax ekspresyonundaki artışı ve Bcl-2 üretimindeki azalmayı sağlamak yoluyla yaptığını gösteren çalışmalar da mevcuttur.91,154 Biz de yaptığımız deney sonucunda uyguladığımız melatoninin, Bax proteinindeki aktivasyonu kontrol grubuna kıyasla artırdığını immunsitokimyasal çalışmalar sonucunda gördük. Sonuç olarak, östrojen pozitif meme kanseri hücrelerinde çeşitli dozlarda melatonin uygulaması neticesinde hücresel total antioksidan madde miktarında artış, total oksidan madde miktarında azalma tespit edilirken, p53 gen ekpresyonundaki artış yapılan RT-PCR ve immunsitokimyasal analizler sonucunda tespit edilmiştir. Ayrıca 60 pro-apoptotik proteinlerden olan Bax proteini aktivitesinde de artışa neden olduğu gözlenmiştir. Melatonin uygulamasının bu etkilerine bakıldığında, meme kanseri tedavisinde koruyucu ve tedavi amaçlı olarak kullanılabilecek bir ajan olabileceği sonucuna varılabilmektedir. 61 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Çalışmadan elde edilen sonuçları özetleyecek olursak; 1- Sitotoksitite analizleri yapılarak en etkili melatonin dozu belirlendi. Melatoninin baskılayıcı konsantrasyon (IC50) değerinin 98 µM olduğu tespit edildi. 2- MCF-7 meme kanseri hücre hattına uygulanan, antioksidan bir madde olan melatoninin, total antioksidan ve oksidan seviyelerinde değişikliklere neden olduğu belirlenirken, bu durumun hücre çoğalması üzerinde olan etkisi irdelendi. 3- Tümör süpresör genlerden biri olan p53 geninin ekpresyonu hem immunsitokimyasal hem de RT-PCR metotları ile belirlendi. 4- Çalışmadan elde edilen bulguların değerlendirilmesi, kanser tedavisinde yeni açılımların, yeni ilaçların ve tedavi ajanlarının geliştirilmesine katkıda bulunabilecektir. Kanserli hastaların tedavi sürecinde yaşadığı olumsuzluklar ve ilaçların yarattığı güçlü yan etkiler düşünüldüğünde, antioksidan ve antikanserojen etkisi olan yeni ilaçların geliştirilmesi ve kullanılması önem arzetmektedir. Çalışmamızdan elde edilebilecek çıkarımları özetlediğimizde ise; Kanser hastalığının tedavisi için dünyada pek çok laboratuvarda, hastanede araştırmalar yapılmakta, alternatif tedavi yolları üretilmeye ve ilaçlar geliştirilmeye çalışılmaktadır. Hâlihazırda kullanılan kemoterapötiklerin hedef organ ve doku dışında hayati pek çok organı kötü yönde etkilediği de düşünülünce gösterilen çabaların ne kadar yerinde olduğu anlaşılmaktadır. Ayrıca kanser tedavisinde kullanılan ilaçlar hücrede serbest radikallerin artmasına neden olmakta dolayısıyla bu durumda hücre ölümünü tetiklemekte ve sonuçta hedef hücrelerde daha fazla DNA hasarının ve mutasyonun oluşmasına neden olmaktadır. Bu etkiler göz önüne alındığında, antikanserojen özellik taşıyan maddelerin farmakolojik ajanlar ile kombine kullanımının önemi ortaya çıkmaktadır. 62 Bizim çalışmamız, kanser tedavisinde etkinliğin arttırılması, DNA hasarlarının önlenmesi ve birtakım ilaç dirençlerinin gelişiminin engellenmesinde etkili olabilecek redoks dengesi tabanlı yeni terapötik ajanların geliştirilmesine katkıda bulunabilecektir. Ayrıca, tümör hücrelerinin seçici ölümünün uyarılması için yeni bir bakış açısı sağlayarak, yapılacak olan daha detaylı moleküler çalışmalara kaynak teşkil edecektir. 63 KAYNAKLAR 1. Arslan S, Bölükbaş N. Kanserli hastalarda yaşam kalitesinin değerlendirilmesi. Atatürk Üniversitesi Hemşirelik Yüksekokulu Dergisi, 2003, 6: 38-47. 2. Gürel DK. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Erişkin Onkoloji, Hematoloji Kliniklerinde Kemoterapi Uygulanan Hastaların Yaşam Kalitesi Ve Bunu Etkileyen Faktörlerin İncelenmesi. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Hemşirelik Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, Adana: Çukurova Üniversitesi, 2007. 3. Kutluk T, Kars A. Kanser konusunda genel bilgiler. http://sbu.saglik.gov.tr/Ekutuphane/kitaplar/kanser.pdf. 11 Temmuz 2013. 4. Alıcı S, İzmirli M, Doğan E. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Onkoloji Bilim Dalı’na başvuran kanser hastalarının epidemiyolojik değerlendirilmesi. Türk Onkoloji Dergisi, 2006, 21: 87-97. 5. T.C. Sağlık Bakanlığı. Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı. Türkiye’de Kanser Kontrolü. http://onkofar.com/vImages/pdfler/2009_Turkiyedekanserkontrolu.pdf. 15 Temmuz 20113. 6. Topal T, Öter Ş, Korkmaz A. Melatonin ve kanserle ilişkisi. Genel Tıp Dergisi, 2009, 19: 137-143. 7. Öncel M. Isı şok proteinleri ve kanser. European Journal of Basic Medical Sciences, 2012, 2: 16-23. 8. Aslan G. Tümör immünolojisi. Turkish Journal of Immunology, 2010, 15: 7-13. 9. Atıcı E. Tıp tarihinde kanser ve lösemi. Türk Onkoloji Dergisi, 2007, 22: 197-204. 10. Gündüz E, Gündüz M, Beder L, Yamanaka N, Shımızu K, Nagatsuka H. p53 tümör baskılayıcı genin 72. kodon polimorfizminin baş-boyun kanserlerindeki prognostik rolü. Yeni Tıp Dergisi, 2009, 26: 96-101. 64 11. Karaman A. Mide kanserinde p53 tümör supresör geninin rolü. Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 2003, 23: 67-73. 12. Yılmaz E, Altunok V. Kanser ve p53 geni. Adana Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Dergisi, 2011, 1: 19-23. 13. Öztürk M. İ. Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri. Meme Kanseri. http://www.ctf.edu.tr/stek/pdfs/54/5402.pdf. 16 Temmuz 2013. 14. Erman Y. Erkek ve kadınların diyet-kanser ilişkisi hakkında bilgi ve inanışları. Ev Ekonomisi Yüksekokulu, Beslenme Bilimleri Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, Ankara: Ankara Üniversitesi, 2007. 15. T.C. Sağlık Bakanlığı, Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı. Ulusal Kanser Programı. http://www.tapdk.gov.tr/tutunalkolkontrol/Ulusal%20Kanser%20Kontrol%20Pro gram%C4%B1,%202009-2015.pdf. 27.10.2013. 16. Somunoğlu S. Meme kanseri: Belirtileri ve erken tanıda kullanılan tarama yöntemleri. Fırat Sağlık Hizmetleri Dergisi, 2009, 4: 103-122. 17. Saip P, Keskin S, Özkan M, Kaplan MA, Aydoğan F, Demirağ GG, Uzunoğlu S, Engin H, Başaran G, Güler N, Uygun K, Demirkan B, Özdemir F, Çubukçu E, Salepçi T, Çiçin İ. Türkiye’de meme kanserli hastaların tanı ve tedavi yöntemlerine ulaşım hızı; çok merkezli gözlemsel çalışma. The Journal of Breast Health, 2011, 7: 109-117. 18. Gölbaşı Z, Çetin R, Kalkan S, Durmuş T. Üniversite öğrencisi kızların meme kanseri ve kendi kendine meme muayenesi ile ilgili bilgi ve davranışları. The Journal of Breast Health, 2010, 6: 69-73. 65 19. National Cancer Institute. Stages of Breast Cancer. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/breast/Patient/page2. 30.06.2013. 20. Kosova F, Arı Z. Adipositokinler ve meme kanseri. Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi, 2008, 22: 377-384. 21. Somunoğlu S. Meme kanserinde risk faktörleri. Fırat Sağlık Hizmetleri Dergisi, 2007, 2: 1-12. 22. Karakuş E. Östrojen-bağımlı meme kanseri ve sodyum-bağımlı organik anyon taşıyıcı. Atatürk Üniversitesi Veteriner Bilimleri Dergisi, 2010, 5: 155-166. 23. Martin AM, Weber BL. Genetic and hormonal risk factors in breast cancer. Journal of the National Cancer Institute, 2000, 92: 1126-1135. 24. Martin SP, Pike MC, Ross RK, Jones PA, Henderson BE. Increased cell division as a cause of human cancer. Cancer Research, 1990, 50: 7415-7421. 25. Altunkaynak BZ, Ünal D, Aksak S, Ünal B. Östrojen hormonu ve menopoz. Deneysel ve Klinik Tıp Dergisi, 2012, 29: 252-256. 26. Russo J, Lareef MH, Balogh G, Guo S, Russo IH. Estrogen and its metabolites are carcinogenic agents in human breast epithelial cells. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2003, 87: 1-25. 27. Ozan ST, Yaralıoğlu S, İleri T, Halifeoğlu İ. Akkaraman ve ivesi koyunlarında, gebelikte ve doğumdan sonra eritrosit, tükürük ve serum arginaz aktiviteleri ile serum üre ve östrojen düzeyleri. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences, 1999, 23: 345-350. 28. Kömürcü HE. Memenin Malign Epitelyal Tümörlerinde İmmünohistokimyasal Olarak Saptanan pS2 Proteininin Östrojen Ve Progesteron Reseptörleriyle Karşılaştırması. Gülhane Askeri Tıp Akademisi Askeri Tıp Fakültesi, Patoloji 66 Anabilim Dalı Başkanlığı. Uzmanlık Tezi, Ankara: Genelkurmay Başkanlığı, 1995. 29. Tüzüner MB. Östrojen Metabolizması Genlerinden CYP 17 ve CYP 19 Polimorfizmlerinin Meme Kanseri İle İlişkisinin İncelenmesi. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Tıp Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, İstanbul: İstanbul Üniversitesi, 2008. 30. Aydemir B, Sarı EK. Antioksidanlar ve büyüme faktörleri ile ilişkisi. Kocatepe Veteriner Dergisi, 2009, 2: 56-60. 31. Tamer L, Polat G, Eskandari G, Ercan B, Atik U. Serbest radikaller. Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 2000, 1: 52-58. 32. Başkol M, Başkol G, Koçer D, Artış T, Z Yılmaz. Mide kanserli hastalarda oksidan ve antioksidan parametreler ve birbiriyle ilişkileri. Türk Klinik Biyokimya Dergisi, 2007, 5: 83-89. 33. Altan N, Dinçel AS, Koca C. Diabetes mellitus ve oksidatif stres. Türk Biyokimya Dergisi, 2006, 31: 51-56. 34. Yokuş B, Çakır DÜ. Kanser biyokimyası. Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 2012, 1: 7-18. 35. Halliwell B, Aruoma OI. DNA damage by oxygen-derived species. Its mechanism and measurement in mammalian systems. Federation of European Biochemical Societies, 1991, 281: 9-19. 36. Atmaca E, Aksoy A. Oksidatif DNA hasarı ve kromatografik yöntemlerle tespit edilmesi. YYU Veteriner Fakültesi Dergisi, 2009, 20: 79-83. 37. Waris G, Ahsan H. Reactive oxygen species: role in the development of cancer and various chronic conditions. Journal of Carcinogenesis, 2006, 5: 14-22. 67 38. Hekimoğlu A. Likopenin antikarsinojenik etki mekanizmaları. Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Tıp Dergisi, 2010, 25: 57-62. 39. Özel Y. Ratlarda Karaciğer İskemi/Reperfüzyon Hasarında Grape Seed Proanthocyanidinin Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi. Haydarpaşa Numune Eğitim Ve Araştırma Hastanesi, 5. Genel Cerrahi Kliniği. Uzmanlık Tezi, İstanbul: Sağlık Bakanlığı, 2006. 40. Storz P. Reactive oxygen species in tumor progression. Frontiers in Bioscience, 2005, 10: 1881-1896. 41. Chan SW, Nguyen PN, Ayele D, Chevalier S, Aprikian A, Chen JZ. Mitochondrial DNA damage is sensitive to exogenous H2O2 but independent of cellular ROS production in prostate cancer cells. Mutation Research, 2011, 716: 40-50. 42. Henrotin YE, Bruckner P, Pujol JPL. The role of reactive oxygen species in homeostasis and degradation of cartilage. OsteoArthritis and Cartilage, 2003, 11: 747-755. 43. Ide T, Tsutsui H, Hayashidani S, Kang D, Suematsu N, Nakamura K, Utsumi H, Hamasaki N, Takeshita A. Mitochondrial DNA damage and dysfunction associated with oxidative stress in failing hearts after myocardial infarction. Circulation Research, 2001, 88: 529-535. 44. Ersöz M. İnsan Meme Kanseri (MCF 7) ve Fare Fibroblast (L-929) Hücre Kültürlerinde Poliakrilik Asidin Toksisitesinin İncelenmesi. Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, İstanbul: Yıldız Teknik Üniversitesi, 2007. 45. Coşkun G, Özgür H. Apoptoz ve nekrozun moleküler mekanizması. Arşiv Kaynak Tarama Dergisi, 2011, 20: 145-158. 68 46. Eröz R, Karataş A, Alkoç OA, Baltacı D, Oktay M, Çolakoğlu S. Apoptozis hakkında bilinenler (Literatür Taraması). Düzce Tıp Dergisi, 2012, 14: 87-101. 47. Solakoğlu Z. Apoptoz varlığı ya da yokluğu bir hastalık nedeni. Klinik Gelişim, 2009, 22: 20-25. 48. Elmore S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology, 2007, 35: 495-516. 49. Yerlikaya A, Dokudur H. Protein yıkımının önemi. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 2009, 35: 93-99. 50. Altunkaynak BZ, Özbek E. Programlanmış hücre ölümü: Apoptoz nedir? Tıp Araştırmaları Dergisi, 2008, 6: 93-104. 51. Cabadak H. Hücre siklusu ve kanser. Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 2008, 9: 51-61. 52. Pazarbaşı A, Kasap M. Kanser genetiği. Arşiv Kaynak Tarama Dergisi, 2003, 12: 328-340. 53. Sarıkaya G. Alüminyum İle Oluşturulan Sıçan İnce Bağırsak Toksisitesi Üzerinde Melatoninin Rolü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, İstanbul: İstanbul Üniversitesi, 2011. 54. Aruoma OI. Free radicals, oxidative stress, and antioxidants in human health and disease. Journal of the American Oil Chemists' Society, 1998, 75: 199-212. 55. Reiter RJ. Melatonin: Lowering the high price of free radicals. Physiology, 2000, 15: 246-250. 56. Soyalp M. Çevresel Asbeste Maruz Kalanlarda Oksidatif Stres Ve Kollajen Metabolizmasının Değerlendirilmesi. Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı. Uzmanlık Tezi, Şanlıurfa: Harran Üniversitesi, 2011. 69 57. Korkmaz F. CO2 İle Pnömoperitonyum Oluşturulan Hayvan Modelinde Melatoninin Periton Ve Overlerdeki Oksidatif Stres Üzerine Etkisinin Araştırılması. Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları Ve Doğum Anabilim Dalı. Tıpta Uzmanlık Tezi, Isparta: Süleyman Demirel Üniversitesi, 2010. 58. Matѐs JM. Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology. Toxicology, 2000, 153: 83-104. 59. Gök V, Kayacıer A, Telli R. Hayvansal ve mikrobiyal kaynaklı doğal antioksidanlar. Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi, 2006, 2: 35-40. 60. Young IS, Woodside JV. Antioxidants in health and disease. Journal of Clinical Pathology, 2001, 54: 176-186. 61. Memişoğulları R. Diyabette serbest radikallerin rolü ve antioksidanların etkisi. Düzce Tıp Fakültesi Dergisi, 2005, 3: 30-39. 62. Stasica P, Ulanski P, Rosiak JM. Melatonin as a hvdroxyl radical scavenger. Journal of Pineal Research, 1998, 25: 65-66. 63. Longoni B, Salgo MG, Pryor WA, Marchiafava PL. Effects of melatonin on lipid peroxidation induced by oxygen radicals. Life Sciences, 1998, 62: 853-859. 64. Uysal A, Burma O, Akar İ, Özsin KK, Rahman A, Üstündağ B, Özercan Hİ. Alt ekstremite iskemi reperfüzyonunun yol açtığı akciğer hasarında melatoninin koruyucu etkinliği. Turkish Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2006, 14: 308-314. 65. Kaya Y. Siyatik Sinirin Farklı Hasar Modellerinde Melatonin Uygulamasının Sinir Rejenerasyonu Üzerine Etkisinin Ultrastrüktürel Ve Biyokimyasal İncelenmesi. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Anatomi Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, Antalya: Akdeniz Üniversitesi, 2011. 70 66. Özçelik F, Erdem M, Bolu A, Gülsün M. Melatonin: Genel özellikleri ve psikiyatrik bozukluklardaki rolü. Current Approaches in Psychiatry, 2013, 5: 179203. 67. Kuş MA. Sıçanlarda Formaldehit Maruziyetiyle Testislerde Oluşan Morfolojik Değişiklikler Üzerine Melatonin Hormonunun Koruyucu Etkisi. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Anatomi Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, Afyonkarahisar: Afyonkarahisar Kocatepe Üniversitesi, 2006. 68. Yazıcı C, Köse K. Melatonin: Karanlığın antioksidan gücü. Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi, 2004, 13: 56-65. 69. Altun A, Vardar A, Altun BU. Melatonin ve kardiyovasküler sistem. Anadolu Kardiyoloji Dergisi, 2001, 1: 283-288. 70. Vanecek J. Cellular mechanisms of melatonin action. Physiologıcal Reviews, 1998, 78: 687-721. 71. Yıldız A. Gebelik Ve Laktasyon Döneminde Nikotine Maruz Kalan Wistar Albino Sıçanların Yavrularının Akciğerlerinde Meydana Gelen Değişiklikler Ve Bu Değişiklikler Üzerine Melatoninin Etkileri. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Histoloji Ve Embriyoloji Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, Malatya: İnönü Üniversitesi, 2012. 72. Çam A, Erdoğan MF. Melatonin. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mecmuası, 2003, 56: 103-112. 73. Boutin JA, Audinot V, Ferry G, Delagrange P. Molecular tools to study melatonin pathways and actions. Trends in Pharmacological Sciences, 2005, 26: 412-419. 74. Sugden D, Davidson K, Hough KA, Teh MT. Melatonin, melatonin receptors and melanophores: A moving story. Pigment Cell Research, 2004, 17: 454–460. 71 75. Reiter RJ, Korkmaz A. Clinical aspects of melatonin. Saudi Medical Journal, 2008, 29: 1537-1547. 76. Reiter RJ. Melatonin: clinical relevance. Best Practice & Research Clinical Endocrinology and Metabolism, 2003, 17: 273-285. 77. Ravindra T, Lakshmi NK, Ahuja YR. Melatonin in pathogenesis and therapy of cancer. Indian Journal of Medical Sciences, 2006, 60: 523-535. 78. Lissoni P, Rovelli F, Malugani F, Bucovec R, Conti A, Maestroni GJ. Antiangiogenic activity of melatonin in advanced cancer patients. NeuroEndocrinology Letters, 2001, 22: 45-47. 79. Fernández R, Güézmes A, Sánchez-Barceló EJ. Influence of melatonin on invasive and metastatic properties of MCF-7 human breast cancer cells. Cancer Research, 1998, 58: 4383-4390. 80. Cos S, González A, Martínez-Campa C, Mediavilla MD, Alonso- González C, Sánchez-Barceló EJ. Estrogen-signaling pathway: A link between breast cancer and melatonin oncostatic actions. Cancer Detection and Prevention, 2006, 30: 118-128. 81. Cos S, Sánchez-Barceló EJ. Melatonin and mammary pathological growth. Frontiers in Neuroendocrinology, 2000, 21: 133-170. 82. Sánchez-Barceló EJ, Cos S, Fernández R, Mediavilla MD. Melatonin and mammary cancer: a short review. Endocrine-Related Cancer, 2003, 10: 153-159. 83. Lissoni P. Is there a role for melatonin in supportive care? Support Care Cancer, 2002, 10: 110-116. 84. Nandi S, Guzman RC, Yang J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: A unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA, 1995, 92: 3650-3657. 72 85. Cohen M, Lippman M, Chabner B. Role of pineal gland in aetiology and treatment of breast cancer. Lancet, 1978, 2: 814-816. 86. Cos S, Sánchez-Barceló EJ. Melatonin inhibition of MCF-7 human breast-cancer cells growth: influence of cell proliferation rate. Cancer Letters, 1995, 93: 207212. 87. Mediavilla MD, Cos S, Sánchez-Barceló EJ. Melatonin increases p53 and p21WAFl expression in MCF-7 human breast cancer cells in vitro. Life Sciences, 1999, 65: 415-420. 88. Cos S, Recio J, Sánchez-Barceló EJ. Modulation of the length of the cell cycle time of MCF-7 human breast cancer cells by melatonin. Life Sciences, 1996, 58: 811-816. 89. Cos S, Fernández F, Sánchez-Barceló EJ. Melatonin inhibits DNA synthesis in MCF-7 human breast cancer cells in vitro. Life Sciences, 1996, 58: 2447-2453. 90. Schernhammer ES, Schulmeister K. Melatonin and cancer risk: does light at night compromise physiologic cancer protection by lowering serum melatonin levels? British Journal of Cancer, 2004, 90: 941-943. 91. Jang SS, Kim WD, Park WY. Melatonin exerts differential actions on X-ray radiation-induced apoptosis in normal mice splenocytes and Jurkat leukemia cells. Journal of Pineal Research, 2009, 47: 147-155. 92. Bejarano I, Redondo PC, Espino J, Rosado JA, Paredes SD, Barriga C, Reiter RJ, Pariente JA, Rodríguez AB. Melatonin induces mitochondrial-mediated apoptosis in human myeloid HL-60 cells. Journal of Pineal Research, 2009, 46: 392-400. 93. Eck-Enriquez K, Kiefer TL, Spriggs LL, Hill SM. Pathways through which a regimen of melatonin and retinoic acid induces apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment, 2000, 61: 229-239. 73 94. Yıldırım H. Karbonik anhidraz 9 geninin transkripsiyonel kontrolünün moleküler analizi. Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı. Doktora Tezi, Balıkesir: Balıkesir Üniversitesi, 2009. 95. Huang HL, Hsing HW, Lai TC, Chen YW, Lee TR, Chan HT, Lyu PC, Wu CL, Lu YC, Lin ST, Lin CW, Lai CH, Chang HT, Chou HC, Chan HL. Trypsininduced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science, 2010, 17: 36. 96. Kalkan Y, Kapakin KAT, Kara A, Atabay T, Karadeniz A, Simsek N, Karakus E, Can I, Yildirim S, Ozkanlar S. Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and apoptosis in kidney of rats treated with gentamicin sulphate. Journal of Molecular Histology, 2012: 43: 603-613. 97. Akman S, Canakci V, Kara A, Tozoglu U, Arabaci T, Dagsuyu İM. Therapeutic effects of alpha lipoic acid and vitamin C on alveolar bone resorption after experimental periodontitis in rats: a biochemical, histochemical, and stereologic study. A Biochemical, Histochemical and Stereologic Study. Journal of Periodontology, 2013: 84: 666-674. 98. Duijts SFA, Faber MM, Oldenburg HSA, Beurden M, Aaronson NK. Effectiveness of behavioral techniques and physical exercise on psychosocial functioning and health-related quality of life in breast cancer patients and survivors-a meta-analysis. Psycho-Oncology, 2011, 20: 115-126. 99. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2011, 61: 69-90. 100. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100: 3983-3988. 74 101. Andre F, Broglıo K, Pusztaı L, Berrada N, Mackey JR, Nabholtz JM, Chan S, Hortobagyı GN. Estrogen receptor expression and docetaxel efficacy in patients with metastatic breast cancer: A pooled analysis of four randomized trials. The Oncologist, 2010, 15: 476-483. 102. Muss HB, Case LD, Richards F, White DR, Cooper MR, Cruz JM, Powell BL, Spurr CL, Capizzi RL. Interrupted versus continuous chemotherapy in patients with metastatic breast cancer. The New England Journal Of Medicine, 1991, 325: 1342-1348. 103. Andre F, Slimane K, Bachelot T, Dunant A, Namer M, Barrelier A, Kabbaj O, Spano JP, Marsiglia H, Rouzier R, Delaloge S, Spielmann M. Breast cancer with synchronous metastases: trends in survival during a 14-year period. Journal Of Clinical Oncology, 2004, 22: 3302-3308. 104. Tsuruo T, Naito M, Tomida A, Fujita N, Mashima T, sakamoto H, Haga N. Molecular targeting therapy of cancer: drug resistance, apoptosis and survival signal. Cancer Science, 2003, 94: 15-21. 105. Kaufmann SH, Earnshaw WC. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. Experimental Cell Research, 2000, 256: 42-49. 106. Türk G. Kemoterapötiklerin erkek üreme sistemi üzerindeki yan etkileri ve koruyucu stratejiler. Marmara Pharmaceutical Journal, 2013, 17: 73-92. 107. Aitken RJ, Roman SD. Antioxidant systems and oxidative stress in the testes. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2008, 1: 15-24. 108. Sainz RM, Mayo JC, Rodriguez C, Tan DX, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Melatonin and cell death: differential actions on apoptosis in normal and cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003, 60: 1407-1426. 75 109. Wenzel U, Nickel A, Daniel H. Melatonin potentiates flavone-induced apoptosis in human colon cancer cells by increasing the level of glycolytic end products. International Journal of Cancer, 2005, 116: 236-242. 110. Eck-Enriquez K, Kiefer TL, Spriggs LL, Hill SM. Pathways through which a regimen of melatonin and retinoic acid induces apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment, 2000, 61: 229-239. 111. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell, 2000, 100: 57-70. 112. Winczyk K, Pawlikowski M, Lawnicka H, Kunert-Radek J, Spadoni G, Tarzia G, Karasek M. Effects of melatonin and melatonin receptors ligand N-[(4-methoxy1H-indol-2-yl)methyl]propanamide on murine Colon 38 cancer growth in vitro and in vivo. Neuroendocrınology Letters, 2002, 23: 50-54. 113. Vijayalaxmi B, Thomas CR, Reiter RJ, Herman TS. Melatonin: From basic research to cancer treatment clinics. Journal of Clinical Oncology, 2002, 20: 2575-2601. 114. Brömme HJ, Mörke W, Peschke E, Ebelt H, Peschke D. Scavenging effect of melatonin on hydroxyl radicals generated by alloxan. Journal of Pineal Research, 2000, 29: 201-208. 115. Ebelt H, Peschke D, Brömme HJ, Mörke W, Blume R, Peschke E. Influence of melatonin on free radical-induced changes in rat pancreatic beta-cells in vitro. Journal of Pineal Research, 2000, 28: 65-72. 116. Gitto E, Tan DX, Reiter RJ, Karbownik M, Manchester LC, Cuzzocrea S, Fulia F, Barberi I. Individual and synergistic antioxidative actions of melatonin: studies with vitamin E, vitamin C, glutathione and desferrrioxamine (desferoxamine) in rat liver homogenates. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2001, 53: 13931401. 76 117. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of lmmunological Methods, 1983, 65: 55-63. 118. Alley MC, Scudiere DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, Abbott BJ, Mayo JG, Shoemaker RH, Boyd MR. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research, 1988, 48: 589-601. 119. Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research, 1987, 47: 936-942. 120. Abe K, Matsuki N. Measurement of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction activity and lactate dehydrogenase release using MTT. Neuroscience Research, 2000, 38: 325-329. 121. Jung-Hynes B, Schmit TL, Reagan- Shaw SR, Siddiqui IA, Mukhtar H, Ahmad N. Melatonin, a novel Sirt1 inhibitor, imparts antiproliferative effects against prostate cancer in vitro in culture and in vivo in TRAMP model. Journal of Pineal Research, 2011, 50: 140-149. 122. Cos S, Blask DE, Lemus-Wilson A, Hill AB. Effects of melatonin on the cell cycle kinetics and "estrogen-rescue" of MCF-7 human breast cancer cells in culture. Journal of Pineal Research, 1991, 10: 36-42. 123. Rodriguez C, Mayo JC, Sainz RM, Antolín I, Herrera F, Martín V, Reiter RJ. Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin. Journal of Pineal Research, 2004, 36: 1-9. 77 124. Karbownik M, Lewinski A, Reiter RJ. Anticarcinogenic actions of melatonin which involve antioxidative processes: comparison with other antioxidants. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2001, 33: 735-753. 125. Reiter RJ. Aging and oxygen toxicity: relation to changes in melatonin. Age, 1997, 20: 201-213. 126. Reiter RJ. Oxidaive damage in the central nervous system: protection by melatonin. Progress in Neurobiology, 1998, 56: 359-384. 127. Reiter RJ, Tan DX, Qi W, Manchester LC, Karbownik M, Calvo JR. Pharmacology and physiology of melatonin in the reduction of oxidative stress in vivo. Biological Signals and Receptors, 2000, 9: 160-171. 128. Lissoni P, Barni S, Mandalá M, Ardizzoia A, Paolorossi F, Vaghi M, Longarini R, Malugani F, Tancini G. Decreased toxicity and increased efficacy of cancer chemotherapy using the pineal hormone melatonin in metastatic solid tumour patients with poor clinical status. European Journal of Cancer, 1999, 35: 16881692. 129. Albarrán MT, López-Burillo S, Pablos MI, Reiter RJ, Agapito MT. Endogenous rhythms of melatonin, total antioxidant status and superoxide dismutase activity in several tissues of chick and their inhibition by light. Journal of Pineal Research, 2001, 30: 227-233. 130. Sırmatel F, Duygu F, Çelik H, Selek Ş, Sırmatel Ö, Gürsoy B, Eriş FN. Kronik viral hepatit olgularında total oksidatif seviye ve total antioksidan kapasitenin değerlendirilmesi. Klimik Dergisi, 2009, 22: 92-96. 131. Russo IH, Russo J. Role of hormones in mammary cancer initiation and progression. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, 1998, 3: 49-61. 78 132. Clemons M, Goss P. Estrogen and the risk of breast cancer. The New England Journal of Medicine, 2001, 344: 276-285. 133. Sánchez-Barceló EJ, Cos S, Mediavilla D, Martínez-Campa C, González A, Alonso- González C. Melatonin–estrogen interactions in breast cancer. Journal of Pineal Research, 2005, 38: 217-222. 134. Kiefer T, Ram PT, Yuan L, Hill SM. Melatonin inhibits estrogen receptor transactivation and cAMP levels in breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment, 2002, 71: 37-45. 135. Hill SM, Frasch T, Xiang S, Yuan L, Duplessis T, Mao L. Molecular mechanisms of melatonin anticancer effects. Integrative Cancer Therapies, 2009, 8: 337-346. 136. Osborne CK, Hobbs K, Clark GM. Effect of estrogens and antiestrogens on growth of human breast cancer cells in athymic nude mice. Cancer Research, 1985, 45: 584-590. 137. Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 1991, 351: 453-456. 138. Agarwal ML, Agarwal A, Taylor WR, Stark GR. p53 controls both the G2/M and the G1 cell cycle checkpoints and mediates reversible growth arrest in human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92: 84938497. 139. Mirza A, McGuirk M, Hockenberry TN, Wu Q, Ashar H, Black S, Wen SF, Wang L, Kirschmeier P, Bishop WR, Nielsen LL, Pickett CB, Liu S. Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-dependent apoptotic pathway. Oncogene, 2002, 21: 2613-2622. 79 140. Janusa F, Albrechtsena N, Dornreitera I, Wiesmüller L, Grosseb F, Depperta W. The dual role model for p53 in maintaining genomic integrity. Cellular and Molecular Life Sciences, 1999, 55: 12-27. 141. Asker C, Wiman KG, Selivanova G. p53-Induced apoptosis as a safeguard against cancer. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999, 265: 1-6. 142. Dillon DC, Easley SE, Asch BB, Cheney RT, Brydon L, Jockers R, Winston JS, Brooks JS, Hurd T, Asch HL. Differential expression of high-affinity melatonin receptors (MT1) in normal and malignant human breast tissue. American Journal of Clinical Pathology, 2002, 118: 451-458. 143. Kanishi Y, Kobayashi Y, Noda S, Ishizuka B, Saito K. Differential growth inhibitory effect of melatonin on two endometrial cancer cell lines. Journal of Pineal Research, 2000, 28: 227-233. 144. Petranka J, Baldwin W, Biermann J, Jayadev S, Barrett JC, Murphy E. The oncostatic action of melatonin in an ovarian carcinoma cell line. Journal of Pineal Research, 1999, 26: 129-136. 145. Mocchegiani E, Perissin L, Santarelli L, Tibaldi A, Zorzet S, Rapozzi V, Giacconi R, Bulian D, Giraldi T. Melatonin administration in tumor-bearing mice (intact and pinealectomized) in relation to stress, zinc, thymulin and IL-2. International Journal of Immunopharmacology, 1999, 21: 27-46. 146. Gilad E, Laufer M, Matzkin H, Zisapel N. Melatonin receptors in PC3 human prostate tumor cells. Journal of Pineal Research, 1999, 26: 211-220. 147. Anisimov VN, Popovich IG, Shtylik AV, Zabezhinski MA, Ben-Huh H, Gurevich P, Berman V, Tendler Y, Zusman I. Melatonin and colon carcinogenesis III. Effect of melatonin on proliferative activity and apoptosis in colon mucosa and 80 colon tumors induced by l,2-dimethylhydrazine in rats. Experimental and Toxicologic Pathology, 2000, 52: 71-76. 148. Hilde E.van Gijssel, Rob P.M.van Gijlswijk, Richard R.de Haas, C Stark, Mulder GJ, JHN Meerman. Immunohistochemical visualization of wild-type p53 protein in paraffin-embedded rat liver using tyramide amplification: Zonal hepatic distribution of p53 protein after N-hydroxy-2-acetylaminofluorene administration. Carcinogenesis, 1998, 19: 219-222. 149. Ogawara Y, Kishishita S, Obata T, Isazawa Y, Suzuki T, Tanaka K, Masuyama N, Gotoh Y. Akt enhances Mdm2-mediated ubiquitination and degradation of p53. The Journal Of Biological Chemistry, 2002, 277: 21843-21850. 150. Hishikawa K, Oemar BS, Tanner FC, Nakaki T, Lüscher TF, Fujii T. Connective tissue growth factor induces apoptosis in human breast cancer cell line MCF-7. The Journal Of Biological Chemistry, 1999, 274: 37461-37466. 151. Naumovski L, Clean ML. Bcl-2 Inhibits apoptosis associated with terminal differentiation of HL-60 myeloid leukemia cells. Blood, 1994, 83: 2261-2267. 152. Leja-Szpak A, Jaworek J, Pierzchalski P, Reiter RJ. Melatonin induces proapoptotic signaling pathway in human pancreatic carcinoma cells (PANC-1). Journal of Pineal Research, 2010, 49: 248-255. 153. Joo SS, Yoo YM. Melatonin induces apoptotic death in LNCaP cells via p38 and JNK pathways: therapeutic implications for prostate cancer. Journal of Pineal Research, 2009, 47: 8-14. 154. Cucina A, Proietti S, D’Anselmi F, Coluccia P, Dinicola S, Frati L, Bizzarri M. Evidence for a biphasic apoptotic pathway induced by melatonin in MCF-7 breast cancer cells. Journal of Pineal Research, 2009, 46: 172-180. 81 EKLER EK-1. ÖZGEÇMİŞ KİŞİSEL BİLGİLER Adı Soyadı Doğum Tarihi : Semin GEDİKLİ : 1978 Doğum Yeri : Erzurum Medeni Hali : Evli, 2 çocuk Uyruğu Adres : T.C. : Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Telefon : 0 537 011 00 81 E- Posta : semingedikli@hotmail.com EĞİTİM Lise : Erzurum Lisesi Lisans : Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü Yüksek : Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Lisans Doktora Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı : Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı 82 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU 83
