CVM 206 – ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ Lab 1 Gram Boyama

CVM 206 – ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ
Lab 1
Gram Boyama
Ocak 22, 2016
Gram Boyama, çok kullanılan temel mikrobiyolojik metotlardan biridir. Bu metot, gram-pozitif ve
gram-negatif bakterileri ayırt etmek için kullanılmaktadır. Bu teknik ile iki grup arasındaki hc.
duvarı farkı ortaya konur. Bir seri boyalar ve karşıt boya kullanılarak, gram-pozitif bakteriler mor,
gram-negatif bakteriler pembe boyanır. Lab ortamında boyama prosedürü uygulandı ve
beklenen sonuç elde edildi. E.coli (gram- negatif) bakteri pembe, S. coccus (gram- pozitif)
bakteri de mor boyandı.
Öğrenci Adı Soyadı, No
I. Giriş
Gram boyama metodu, Hans Christian Gram tarafından geliştirilip 1884 te yayınlanmıştır
(Maier et al., 2000; Bartholomew and Mittwer, 1952). Bu metot bakteriyolojide ilk ve en önemli
ayırt edici boyama metotlarındandır (Maier et al., 2000; Bartholomew and Mittwer, 1952). Gram
boyama başlıca iki ana grup olan bakteri hc. lerin ayırt etmekte kullanılır: gram-pozitif ve gramnegatif. Bu iki grup bakteri arasındaki başlıca temel fark, hc. duvarlarından kaynaklanmaktadır.
Gram-pozitif bakteriler, yoğun hc. duvarına sahiptir ve birkaç kat peptidoglikan tabaka
içermektedirler. Gram-negatif bakterilerin hc. duvarı ise incedir, 2-3 tabaka peptidoglikan içerir.
(Laboratuar Föy). Gram-negatif hc. ler ayrıca lipit membran varlığı ile de karakterize edilirler.
Gram boyama yöntemi kullanılarak iki bakteri grubu hc. duvarına göre ayırt edilir ve gram-pozitif
bakteriler mor, gram-negatif bakteriler de pembe boyanır. Bu lab uygulamasının amacı, gram
boyama teknikleri kullanılarak bu prosedürü anlamak, gram-pozitif ve gram-negatif bakteri hc.
lerini ayırt etmektir.
II. Sonuç ve Tartışma
Zaman ve ekipman kısıtlaması yüzünden öğrenciler, gram boyama metodunu
uygulayamadılar. Uygulama, Laboratuvar görevlisi tarafından gerçekleştirildi. İlave olarak
öğrenciler mikroskopta sonuçları inceleme fırsatına sahip olamadılar. Bu sebeplerden dolayı
Escherichia coli (gram-negatif, çubuk yapıda) bakteri olup olmadığını, pembe boyandığı,
Staphylococcus epidermidis (gram-pozitif, kok yapıda) in mor boyandığı doğrulanamadı ve
gözlemlenemedi. Öğrenciler, gram boyama prosedürünü fiziksel olarak uygulayabilselerdi Lab.
föyünden ve lab görevlisinin gözlemlerinden daha fazla bilgi sahibi olabileceklerdir.
Gram boyama tekniği ile gram-pozitif ve gram-negatif hc. leri ayırt etmek, bakterioloji ve
çevre mikrobiyolojisi açısından önem arz etmektedir. Bu prosedürde iki önemli boya ayırt edici
olarak kullanılmıştır: kristal viyole ve safranin. Kristal viyole ilk olarak, hem gram-pozitif hemde
gram-negatif hc. leri mor boyar. Kristal viyole ile boyama yapıldıktan sonra iyodin ile suda
çozünmeyen büyük molekül oluşturulur. Bu molekül, gram-pozitif bakterilerde çok tabakalı
peptidoglikan tabakısını dehidre eder. Molekül ile hc. duvarı arasındaki mesafenin azalması,
kristal viyole/iyodine molekülünün hc. tarafından yakalanması ile sonuçlanır. Gram-negatif ve
gram-pozitif bakteri temel hc. duvarı farklılığı, bu moleküllerin farklı etki yapması ile sonuçlanır.
Gram pozitif hc. duvarına kıyasla gram-negatif bakteride iyodin çözeltisi, hc. duvarı dışında çok
hızlı çözünür. Ve kristal/iyodin molekülü, gram negatif hc. duvarında kalmaz. İlave olarak bu
aşamada rengi slimek için alkol kullanılır. Bu durumda gram-pozitifler mor, gram-negatifler
renksizdir. Son aşamada da zıt boya olarak safranin kullanılır. Gram-pozitif bakteriler, zıt
2
boyamadan etkilenmezler. Gram-negatifler ise safranin ile pembe boyanır. Mikroskop altında
Mikrograf 1 ve 2 de görüldüğü gibi E.coli pembe, Staphilococcus epidermis ise mor görünür.
Mikrograf 1 – Gram Boyama
Escherichia coli (Kaiser)
Mikrograf 2 – Gram Boyama
Staphylococcus epidermis
Gram boyama çok yaygın kullanılan bir teknik olsada büyük dikkat ile pratik yapılması
gerekmektedir. Bazen gram-pozitif hc. ler, mor renklerini kaybedip, pembe boyanabilirler.
Bu şartlar ne zaman oluşur (Lab Föy):

Tekniğin doğru uygulanması – Isı fiksasyonunda fazla ısıya maruz bırakmak ve aşırı su
kaybı gram-pozitif hc. lerin renk kaybına neden olur.

Kültürün yaşı – 24 saat içinde kristal viyole/iyot molekülü kalıntısı azalabilir.

Organizma çeşitliliği – kristal viyole/iyot molekülünun bakteri hc. lerinde eğilimi çeşitlilik
gösterebilir.
III. Değerlendirme
Zaman ve ekipman kısıtlaması yüzünden lab. şartlarında gram boyama tekniği
tamamlanamamıştır. Fakat Laboratuvar görevlisi tekniğin nasıl yapıldığını göstermiş ve
anlatmıştır.
Şu sonuçlara ulaşılmıştır:

Çevre mikrobiyolojisi açısından önemli olan iki grup bakteri, gram boyama tekniği
uygulanarak düşük maliyetle ayırt edilmiştir.

Teknik, temelde hc. duvarı farkından yola çıkarak gram pozitifleri mor boyayarak, gramnegatifleri pembe boyayarak ayırt etmeyi sağlamıştır.
3
IV. Sorular
1. Gram boyamaya neden ayırt edici boyama tekniği denildiğini belirtiniz.
Gram boyamaya ayırt edici boyama tekniği denilmesinin sebebi, gram-pozitif ve gram-negatif
bakteri gruplarını ayırt etmek için kullanılmasıdır. Prosedürler uygulanarak, gram-pozitifler mor,
gram–negatifler pembe boyanır.
2. Gram-pozitif ve gram–negatif hc. duvarı arasındaki farkı tanımlayınız.
Gram-pozitif bakteri duvarı yoğundur ve birkaç tabaka peptidoglikan tabakasından oluşur. Hc.
duvarı, 20–80nm kalınlığında ve 60–90% peptidoglikan’ dan oluşmaktadır. Gram-negatif bakteri
hc. duvarı incedir, 2-3 tabaka peptidoglikan dan oluşur (10–20% hc. duvarı) (Deney Föyü).
3. Gram-pozitif bakterilerde kristal viyole-iyodin kompleksinin hc. de neden kaldığı, gramnegatifte neden kalmadığının teorisi nedir.
4. Gram-pozitif hücrelerin gram-negatif gibi pembe boyanmasının sebepleri nedir.
V. Referanslar
Bartholomew, J.W.; Mittwer, T. 1952. The gram stain. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 16:1:1-29.
Kaiser, Gary E. “Gram Stain of Escherichia coli.” 16 March 1999. Doc Kaiser’s Microbiology
Homepage. 20 Sept. 2003
<http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/gramstain/gnrod.html>.
Laboratory Guide. “Aseptic Technique and Transfer of Microorganisms.” 10 Sept. 2003.
Prescott, L.M.
“The Gram Stain.”
Microbiology.
20 Sept. 2003 <http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/video/Gram.html>.
4