TAD - tr

Polikistik Over Sendromu
T AD
ARAŞTIRMA
Polikistik Over Sendromlu Kişilerde Antimülleriyan
Hormon, Gonadotropin ve Testesteron Seviyelerindeki
Değişimler
Antimullerian hormone, Gonadhotrophine and Testesterone Changes in
Polycystic Ovarian Syndrome
Anıl Murat Sever1 , Seval Zeren 2, Mehmet Baki Şentürk3 , Yusuf Çakmak1
1
Batman Kadın Doğum ve Çocuk Hastalıkları Hastanesi, Batman, Türkiye
Özel Kolan Hastanesi, Jinekoloji ve Obstetrik Bölümü, İstanbul, Türkiye
3
Zeynep Kamil Kadın Hastalıkları ve Doğum, Çocuk Hastalıkları Hastanesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi, İstanbul,
Türkiye
2
Özet
Amaç: Bu çalışmanın amacı Polikistik over sendromu (POS) olan kişilerdeki antimüllerian hormon,
gonadotropinler (FSH, LH) total testesteron değişimleri ile homeostaziz model (HOMA) sonuçlarını
araştırmaktır.
Gereç ve Yöntemler: Prospektif kontrollü çalışmada 50 polikistik over sendromu olan olgu 38 sağlıklı kişilerle
karşılaştırıldı. Kan antimüllerian hormon, gonadotropin, testesteron ve HOMA sonuçları iki grup arasında
karşılaştırıldı. Karşılaştırma için student t testi ile pearson ki kare testi kullanıldı. P değerinin 0.05 altında
olması anlamlı sonuç olarak kabul edildi.
Bulgular: İki grup arasında vüvut kitle indeksi ile menarş yaşı arasında fark yoktu (p>0.05). AMH, LH/FSH
oranı ile total testesteron POS olgalrında daha yüksek iken (p<0.05), HOMA değerleri iki grup rsında benzerdi
(p>0.05).
Sonuç: AMH değerleri POS’lu kişilerde anovulasyon ve buna bağlı olarak artan immatür folikül sayısından
ötürü yüksektir.
Anahtar Kelimeler: Antimüllerian hormone, menarş, polikistik over sendromu
Abstract
Aim: The aim of this study was to evaluate changes of anti mullein hormone (AMH), gonadotrophines (LH;
FSH), total testosterone and result of homeostasis model assessment (HOMA) in women with polycystic ovary
syndrome (PCOS).
Materials and Methods: Prospective controlled study was conducted. Fifty women with PCOS and 38 healthy
women were compared. Student t test and Pearson chi square test were used for comparison two groups in terms
of AMH, LH/FSH ratio, total testosterone and HOMA. A value of p was considered meaningful under 0.01.
Yazışma Adresi:
Dr. Mehmet Baki ŞENTÜRK
Zeynep Kamil Kadın Hastalıkları ve Doğum, Çocuk
Hastalıkları Hastanesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Op. Dr.
Burhanettin Üstünel caddesi, No 10, 34668, Üsküdar/İstanbul,
Türkiye
Tel: +905417737176
Fax: +90 212 542 44 91
E-mail: dr.baki77@gmail.com
Tıp Araştırmaları Dergisi; 2016: 14(1):37-41
Results: There was no significant difference between
two groups with respect to body maid index and year
of menarche (p>0.05). AMH, LH/FSH ratio and
testosterone were higher in PCOS group (p<0.05)
while value of HOMA was not different between two
groups (p<0.05).
Conclusion: AMH level is high in PCOS patients
because of chronic an ovulation and elevated number
of immature follicles.
Key Words: Anti mullerian
polycystic ovarian syndrome
hormone,
menarche,
37
Sever ve ark.
P
olikistik over sendromu (POS) üreme
çağındaki kadınların yaklaşık %6.6 ile 8 ini
etkileyen
yaygın
endokrinolojik
bir
bozukluktur (1,2). Polikistik overlerde anovulasyon
sonucu primer, sekonder ve tersiyer folliküllerin
sayısında artiş olurken matur follikül sayısında ise
azalma mevcuttur (3). Antimüllerian hormon
(AMH) ise dimerik bir glikoprotein olup primer,
preantral ve küçük antral foliküllerin granülosa
hücrelerinden
salgılanır.
Serum
AMH
konsantrasyonu overdeki küçük folikül sayısı ve bu
nedenden ötürü ovarian rezerv ile koreledir (4).
Önceki çalışmalar POS hastalarında antral folikül
sayısı arttığı için AMH konsantrasyonun da buna
paralel olarak artığını göstermiştir ve POS
tanısında kullanılabileceğini öne sürmüştür (5,6).
Bu çalışmada POS tanısı konulmuş olgular ile
POS olmayan iki grup arasında AMH oranları ile
Lüteinizan hormon Folikül stimülan hormon
oranları (LH/FSH), total testosteron ve homeostasis
model (HOMA) oranları karşılaştırıldı.
Gereç ve Yöntemler
Bu çalışma Eylül 2011 ile Eylül 2012 tarihleri
arasında Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Kadın Hastalıkları ve Doğum Kliniği’nde etik kurul
onayından sonra yapılmıştır. POS tanısı Roterdam
kriterlerine göre konulan 50 fertil olgu incelendi
(7,8). Kontrol grubu ise fertil ve over yetersizliği
ya da şüphesi olmayan aynı zamanda POS olmayan
38 olgudan oluşmaktaydı.
Çalışmaya alınma kriterleri; yeni POS tanısı
olması veya daha önce tedavi alınmamış olması
(çalışma grubu), reprodüktif dönemde olup POS
tanısı olmaması (kontrol Grubu), prolaktin seviyesi
ve tiroid fonksiyon testlerinin normal olması,
çalışmaya katılıma gönüllü olunması olarak
belirlendi. Çalışmaya alınmama kriterleri ise; daha
önce tedavi almış POS hastaları, premenstruel ile
postmenstruel yaş grubu, ilave endokrin bozukluk
olan hastalar (hiperprolaktinemi, hipertiroidi,
hipotiroidi vs.), çalışmaya katılıma gönüllü
olunmaması, infertil olan ya da daha önce
infertilite tedavisi alanlar, over yetersizliği olan
olgular şeklinde belirlendi.
Çalışmaya
katılan
bütün
olgulardan
menstruasyonlarının 3.günü FSH, LH, troid
stimülan hormon, serbest tiroksin, prolaktin,
progesteron, estradiol, total testosteron, bakıldı.
Yine menstrüasyonun 3.günü antral folikül sayısı
için ultrasonografi uygulanmıştır (Toshiba İstyle
TA510 marka 5 mHz ultrason probu). Hormonal
ölçümler için ELİSA yöntemi (Beckman Coulter,
Anti-AMH Gen II ELİSA A560026, USA)
kullanıldı. POS tanısı olan hastalar ile kontrol
grubu hastalar arasında AMH, vücut kitle indeksi
Tıp Araştırmaları Dergisi; 2016: 14(1):37-41
(VKİ), LH/FSH düzeyleri, total testesteron
düzeyleri, HOMA skoru karşılaştırılmıştır.
Bulguların istatistiksel değerlendirmesi SPSS
(version 13) programı ile gercekleştirildi.
Tanımlayıcı istatistikler yanında iki grup
arasındaki
parametrelerin
karşılaştırılmasında
student t testi, Pearson ki-kare testi uygulandı. p
değeri <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul
edildi.
Bulgular
Gruplar arasındaki ortalama yaş, menarş yaşı,
VKİ tablo 1 de görülmektedir. Çalışma grubunda
ortalama yaş 24 iken kontrol grubunda 33’dür. POS
olan grup daha genç yaşa sahiptir (p=0.000). İki
grup arasında menraş yaşı ile VKİ açısından iki
grup arasında fark saptanmamıştır (p>0.01) (Tablo
1). İki grup arasındaki hormonal parametreler tablo
2 de görülmektedir. AMH düzeyleri POS grubunda
daha yüksek bulunmuştur (p=0.000). Benzer
şekilde LH/FSH oranı ile total testosteron oranı
POS grubunda daha fazla görülmüştür (p<0.01).
Buna karşın HOMA değeri iki grup arasında
benzerdi (p>0.01) (Tablo 2).
Tablo 1. Olguların Karakteristiği
PKOS
KONTROL
p
Yaş (yıl)
23,94±6,0
33,51±6,9
0,000 *
Menarş yaşı (yıl)
13,26±1,6
13,09±0,9
0,561
VKİ (kg/m2 )
25,22±5,6
24,35±6,14
0,496
studet t test VKİ: Vücut kitle indeksi
Tablo
2.
İki
Karşılaştırılması
Grup
Arasındaki
Parametrelerin
PCOS
KONTROL
p
4,28166
0,63200
0,000 *
HOMA
2,93±2,36
2,44±2,07
0,321
LH/FSH
1,95±0,91
0,96±0,30
0,000 *
35,05±18,13
15,68±4,73
0,000 *
AMH
Total Testosteron
Pearson Ki kare Test AMH: Anti müllerian Hormon,
HOMA: Homeostasis Model Değerlendirmesi, LH:
Lüteinizan Hormon, FSH: Folikül Stimulan Hormon
Tartışma
Çalışma sonucu göstermiştir ki POS olan grupta
AMH değerleri POS olmayan gruba oranla daha
fazladır. Ayrıca LH/FSH oranı, total testesteron
POS olan hastalarda daha yüksek bulunmuştur.
AMH, dimerik bir glikoprotein olup klinik
pratiğe kötü ovarian cevabın göstergesi olarak
38
Polikistik Over Sendromu
ARAŞTIRMA
girmiştir. Foliküllerin FSH sensivitesini azaltarak
folikülogenezi korumaktadır. AMH seviyeleri
ovarian folikül rezervi ve gücünü tam olarak
yansıtmakta ve ovarian yaşlanma ve rezervi
göstermede sensitif bir marker olarak kabul
edilmektedir (9,10,11). AMH ovarian antral
foliküllerin
granüloza
hücrelerinden
salgılanmaktadır (12-14). Overde primordial antral
folikül sayısı arttıkça AMH seviyesi de yükselme
eğilimindedir. Özellikle ovulasyonun olmadığı ve
bu primordial folikül deposunun giderek arttığı
amenoreik POS hastalarında oligomenoreik POS
hastalarına göre daha fazla olduğu görülmektedir
(15). POS olan hastalar daha geniş preantral folikül
havuzuna sahip oldukları için buradan salgılanan
serum inhibin-B konsantrasyonları da daha yüksek
olmaktadır. Yüksek inhibin-B konsantrasyonları
FSH’yı baskılamaktadır. Böylece folikül gelisimde
ve dominant folikül seçiminde duraksama olmakta,
sonuçta anovulasyon ve menstruel düzensizlikler
olusmaktadır (16). Çalışmamızda AMH seviyeleri
POS grubunda kontrol grubuna oranla anlamlı
derecede yüksektir (p=0,000). POS hastalarında
AMH yüksekliği daha önce belirtilen literatür
bilgilerine paralel olarak bizim çalışmamızda da
gösterilmiştir. Ayrıca bulgularımız Türkiye’den bir
çalışma ile de benzerlik arzetmektedir (17).
Serbest testosteron düzeyleri anovulasyonlu ve
hirsutizmli kadınlarda androjenik mikroçevrenin
artışına bağlı olarak artmaktadır (18). Bağış ve
arkadaşlarının
(19)
çalışmasında
Hastaların
%38.7’sinde total testosteronun, %14.6’sında ise
serbest testosteronun yüksek olduğu görülmüştür.
Turan ve arkadaşlarının çalışmasında POS lu
hastalarda serbest testosteron yüksekligi %48
olarak tespit edilmiştir. Kogure ve arkadaşlarının
(20)
2012
yılı
çalışmalarında
testosteron
seviyelerinin POS grubunda kontrol grubuna
kıyasla yüksek olduğu belirtilmiştir. Çalışmamızda
sözü edilen yayınlar ile uyumlu olarak total
testosteron seviyeleri POS grubunda kontrol
grubuna kıyasla istatistikesel olarak anlamlı oranda
yüksek olarak bulunmuştur.
Yüksek LH ve düşük FSH şeklindeki anormal
gonadotropin salgısı POS lu hastalarda yaygın
olarak görülmektedir (21). Bu anormallik
anovulasyonun devam etmesine bağlı olarak
progesteron sekresyonunun olmaması, antral
folikül sayısının ve ovarian volumun artışına
bağlıdır (22,23). Turan ve arkadaşlarının (24)
çalısmasında POS hastalarının %54’ünde bu
anormal oran görülmüştür iken, Bağış ve
arkadaşları (19) ise sadece %15 olarak
bildirmişleridr.
Bizim
çalışmamızda
POS
grubundaki vakaların %39,62’sinde LH/FSH>2
olarak tespit edilmiştir. POS grubunda LH/FSH
Tıp Araştırmaları Dergisi; 2016: 14(1):37-41
ortalaması 1,9531±0,91806; kontrol grubunda
0,9677±0,30607 olarak bulunmuştur (p=0,000).
Bizim POS grubunda HOMA 2.93±2.36, kontrol
grubunda 2,44±2,07 olarak bulunmuştur. HOMA
değeri POS grubunda daha yüksek olmakla birlikte
istatistiksel
olarak
anlamlı
farklılık
saptanamamıştır. Bağış ve arkadaşlarının (19)
yaptıkları çalışmada POS hastalarında HOMA
değeri 2.67±1.79 olarak yayınlanmıştır. Kogure ve
arkadaşlarının (20) POS ile kontrol grubunun
karşılaştırıldığı bir çalışmasında POS grubunda
HOMA değeri 2.3±2.32, kontrol grubunda değeri
1.06±0.79
olarak
bulunmuştur
(p=0.01).
Çalışmamızda elde edilen HOMA değerleri
belirtilen çalışmalar ile örtüşmektedir. Ancak
çalışmamızda kontrol grubu ile POS vakaları
arasında HOMA değerleri açısından istatistiksel
olarak anlamlı fark görülmemiştir. HOMA değeri
artışı beraberinde insülin resistansı gibi metabolik
sendromda görülen birtakım klinik bulgular POS
olgularının da da görülmektedir (25). Bu ortak
klnik bulgularından ötürü özellikle de obez POS
hastalarında da AMH artışı ile beraber diğer
bulguların (hiperinsülinemi, açlık kan şekeri
yüksekliği, yüksek dansiteli kolesterolün düşük
olması gibi) varlığı aynı zamanda bu hastalarda
metabolik sendrom ve kompikasyonları hakkında
bilgilendirmeyi gerekli kılmaktadır.
Çalışmamızda POS grubundaki vakaların VKİ
ortalaması 25,22±5,67 olarak bulunmuştur. Bu oran
Turan ve arkadaşlarının çalışmasındaki VKİ
ortalamasına
benzemektedir.
Turan
ve
arkadaşlarının (24) çalışmasında POS sendromlu
hastaların ortalama vücut kitle indeksi 24,1±4,4
olarak verilmiştir. Bağış ve arkadaşlarının (19)
çalışmasında POS hastalarının VKİ ortalamaları
28.34±7.04
olarak
belirlenmiştir.
A.B.D’de
DeUgarte (26) ve arkadaşlarının çalışmalarında 271
POS hastasının ortalama VKİ’leri 36.4±9.6 olarak
bulunmuştur.
Anovulatuar kadınlarda total primordial folikül
sayısı da dahil her aşamadaki folikül sayıları aynı
yaş grubundaki normo-ovulatuar kadınlarınkinden
fazladır. Bu nedenle folikül havuzunun tükenmesi
daha geç olmaktadır. Daha ötesinde yaşla birlikte
havuzdaki folikül sayısının azalmasını yavaşlatan
AMH sayesinde POS’ lu hastalarda ovaryan
yaşlanmanın geciktigi ve over rezervinin daha iyi
korunduğu ve ilerleyen yasla iliskili olarak ortaya
çıkan menstruel döngü düzensizlikleri ve sonunda
gerçeklesen menopoz POS hastalarında daha geç
yaslarda oluşmaktadır (27-30).
Sınırlı sayıda olgu incelendiği için çalışmanın
limitasyonu olarak kabul edilebilir. Öte yandan
prospektif çalışma olması, kontrol grubunun olması
ve diğer hormonal parametrelerin çalışılarak
39
Sever ve ark.
detaylandırılması çalışmanın avantajı olarak kabul
edilebilir. Sınırlı sayıda olguya rağmen çalışma
göstermiştir ki POS olgularında AMH seviyesi
yüksek seyretmektedir. Bu immatür preantral ya da
antral foliküllerin artışına bağlıdır.
Kaynaklar
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Azziz R, Woods KS, Reyna R, Key TJ,
Knochenhauer ES, Yildiz BO. The prevalence
and features of the polycystic ovary syndrome in
an unselected population. J Clin Endorcinol
Metab.2004;89:2745–2749.
Kousta E, White DM, Franks S. Modern use of
clomiphene citrate in induction of ovulation.
Hum Reprod Update 1997;3:359–365.
Barnes R, Rosenfield R L. The Polycystic Ovary
Syndrome: Pathogenesis and Treatment. Ann
intern Med 1989; 110: 386-399.
Weenen C, Laven JS, von Bergh AR, et al. AntiMullerian hormone expression pattern in the
human ovary: potential implications for initial
and cyclic follicle recruitment. Mol Hum Reprod
2004;10:77–83.
Pigny P, Merlen E, Cortet-Rudelli C, et al.
Elevated serum level of anti-Mu¨ llerian hormone
in patients with polycystic ovary syndrome:
relationship to the ovarian follicle excess and to
the follicular arrest. J Clin Endocrinol Metab
2003;88:5957–5962.
Laven JS, Mulders AG, Visser JA, Themmen AP,
De Jong FH, Fauser BC. Anti-Mu¨ lllerian
hormone serum concentrations in normoovulatory
and anovulatory women of reproductive age. J
Clin Endocrinol Metab 2004;89:318-323.
Rotterdam ESHRE/ASRM Sponsored PCOS
Consensus Workshop Group. Revised 2003
consensus on diagnostic criteria and long-term
health risks related to potycystic ovary syndrome.
Fertil Steril 2004; 81:19-25.
Rotterdam ESHRE/ASRM Sponsored PCOS
Consensus Workshop Group. Revised 2003
consensus on diagnostic criteria and long-term
health risks related to polycystic ovary syndrome
(PCOS). Hum Reprod 2004; 19:41-47.
Picard J.Y., Josso N. Purification of testiculer
anti-Mullerian
hormone
allowing
direct
visualization of the pure glycoprotein and
determination of yield and purification factor.
Mol Cell Endocrinol. 1984;34(1):23-29.
Usta T, Oral E. Is the measurement of antiMüllerian hormone essential? Department of
Obstetrics & Gynecology Bagcilar Education and
Research Hospital, Istanbul, Turkey.Curr Opin
Obstet Gynecol. 2012 Jun;24(3):151-157.,
Behringer RR, Finegold MJ, Cate RL. Müllerian
inhibiting substance function dur-ing mammalian
sexual development. Cell 1994; 79: 415–425.
Teixeria J, Maheswaran S, Donahoe PK.
Müllerian inhibiting substanc, an in-structive
Tıp Araştırmaları Dergisi; 2016: 14(1):37-41
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
developmental hormone with diagnostic and
possible therapeutic ap-plications. Endoc Rev
2001; 22(5): 657-74.
Matzuk MM, Burns KH, Viverios MM, Eppig JJ.
Intercellular communication in the mammalian
ovary: oocytes carry the conversation. Science
2002; 296(5576): 2178-2180.
Hirobe S, He WW, Lee MMi, Donahoe PK.
Müllerian inhibiting substance mes-senger
ribonucleic acid expression in granulosa and
sertoli cells coincides with their mitotic activity.
Endocrinology 1992; 131: 854 – 862.
Seyam, Emad M.; Mohamed, T.G.; Hasan,
Momen M.; Abd Al Mawgood, Marwa H.
Evaluation of ultrasonographic and AntiMullerian Hormone (AMH) changes as predictors
for ovarian reserve after laparoscopic ovarian
drilling for women with polycystic ovarian
syndrome Middle East Fertility Society Journal
(2014) 19, 314–323
Elting MW, Karsen J.M, Lyset TM. Women with
PCOS gain regular menstrual cycles when aging
Hum. Reprod 2000; 15: 24-28
Uludağ SZ. Polikistik over sendromlu hastalar ile
aynı yaş grubu normo-ovulatuar hastaların over
rezevlerinin karşılastırılması. Tıpta Uzmanlık
Tezi. Kayseri, 2008.
Horton R, Hawks D, Lobo R. 3 alfa,17 beta –
androstenediol glucuronide in plysma : A marker
of androgen action in idiopatic hirsutism. J C I
,1982; 69:1203
Halil Tayfun Bağış , Servet Hacıvelioğlu, Bülent
Haydardedeoğlu ve ark. Polikistik Over
Sendrom’lu Kadınlarda İnsulin Rezistansı
Bozulmuş Oral Glukoz Testi Ve Diabetes
Mellitus Sıklığı; 235 Hastanın Analizi Başkent
Üniversitesi Adana Uygulama Ve Araştırma
Merkezi, Kadın Hastalıkları Ve Doğum Anabilim
Dalı, Ankara Başkent Üniversitesi Adana
Uygulama Ve Araştırma Merkezi, Aile Hekimliği
Birimi, Ankara Türk Jinekoloji Ve Obstetrik
Derneği Dergisi, (Tjod Derg), 2008; 5 (2):99104.
Kogure GS, Piccki FK, Vieira CS, Martins Wde
P, Reis RM. Analysis of muscle strength and
body composition of women with Polycystic
Ovary Syndrome. Rev Bras Ginecol Obstet. 2012
;34(7):316-322.
Fritz MA, Speroff L, editors. Clinical
gynecologic endocrinology and infertility. 8th ed.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins;
2011. p. 501-18.
Shim AR, Hwang YI, Lim KJ, et al. Inappropriate gonadotropin secretion in polycystic
ovary syndrome: the relationship with clinical,
hormonal and metabolic charac- teristics. Korean
J Obstet Gynecol 2011;54:659-665.
Wiser A, Shehata F, Holzer H, et al. Effect of
high LH/FSH ratio on women with polycystic
ovary syndrome undergoing in vitro maturation
treatment. J Reprod Med. 2013;58(5-6):219-223.
40
Polikistik Over Sendromu
ARAŞTIRMA
24.
25.
26.
27.
Turan V, Erdogan M, Yeniel Ö, Ergenoglu M,
Kazandı M. Polikistik over sendromu tanısı
konmuş 89 hastanın biyokimyasal, hormonal kan
parametrelerinin
ve
klinik
bulgularının
incelenmesi Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi,
Kadın Hastalıkları ve Dogum Anabilim Dalı,
İzmir, Türkiye Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi,
Endokrinoloji Bilim Dalı, İzmir, Türkiye,Ege Tıp
Dergisi / Ege Journal of Medicine 2011, 50 (3):
179-182,
İslamoğlu Y, Koplay M, Sunay S, Açıkel M.
Obezite ve metabolik sendrom. Tıp Araştırmaları
Dergisi: 2008 : 6 (3):168-174.
De Ugarte CM, Bartolucci AA, Azziz R.
Prevalence of insulin resistance in the polycystic
ovary syndrome using the homeostasis model
assessment; 2005;83(5): 1454-1460.
Mulders AG, Laven JS, Eijkemans MJ, et al.
Changes
in
anti-Müllerianhormone
serum
concentrations over time suggest delayed ovarian
Tıp Araştırmaları Dergisi; 2016: 14(1):37-41
28.
29.
30.
ageing in normogonadotrophic anovulatory
infertility. Hum Reprod. 2004;19: 2036-2042.
Piltonen T, Morin-Papunen L, Koivunen R, et al.
Serum anti-Müllerian hormone levels remain
high until late reproductive age and decrease
during metformin therapy in women with
polycystic ovary syndrome. Hum Reprod. 2005;
20: 1820-1826.
Dahlgren E, Johansson S, Lindstedt G, et al.
Women with polycystic ovary syndrome wedge
resected in 1956 to 1965: a long-term follow-up
focusing on natural history and circulating
hormones. Fertil Steril. 1992; 57: 505-513.
Bili H, Laven J, Imani B, Eijkemans MJ, Fauser
BC. Age-related differences in features
associated with polycystic ovary syndrome in
normogonadotrophic oligo-amenorrhoeic infertile
women of reproductive years. Eur J Endocrinol.
2001; 145: 749-755
41