talasemi hastalarında dmt1 polimorfizminin kan kurşun ve demir
advertisement
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TALASEMİ HASTALARINDA DMT1 POLİMORFİZMİNİN KAN KURŞUN VE DEMİR DÜZEYLERİ İLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Derya SÖYLEMEZ DİSİPLİNLERARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Birsen KAPLAN Yrd. Doç.Dr. Zeliha KAYAALTI 2011- ANKARA TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TALASEMİ HASTALARINDA DMT1 POLİMORFİZMİNİN KAN KURŞUN VE DEMİR DÜZEYLERİ İLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Derya SÖYLEMEZ DİSİPLİNLERARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Birsen KAPLAN Yrd. Doç. Dr Zeliha KAYAALTI Bu tez “Toksik Metaller ve İz Elementlerin Sağlıklı ve Hasta Bireylerde Düzeyleri” başlıklı ve 2003K1201920-6 numaralı DPT Projesi kapsamında desteklenmiştir. 2011-ANKARA ii KABUL VE ONAY İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay Hata! Yer işareti tanımlanmamış. İçindekiler iii Önsöz vi Simgeler ve Kısaltmalar vii Şekiller x Çizelgeler xii 1. GİRİŞ 1 1.1 Hemoglobin 1.1.1 Hemoglobin Molekülü ve Yapısı 1.2 Talasemi 1.2.1 Tanım 1.2.2 Talasemi Tipleri 1.2.2.1 Alfa Talasemiler 1.2.2.1.1 Sessiz α- Talasemi Taşıyıcı Tipi 1.2.2.1.2 α- Talasemi Taşıyıcı Tipi 1.2.2.1.3 Hb H Hastalığı 1.2.2.1.4 Hb Bart’s Hidrops Fetalis Sendromu 1.2.2.2 Beta Talasemi 1.2.2.2.1 Beta Talasemise Klinik Bulgular 1.2.2.2.1.1 Talasemi Major (Homozigot Beta Talasemi) 1.2.2.2.1.2 Talasemi İntermedia 1.2.2.2.1.3 Talasemi Minör ( Heterezigot Beta Talasemi) 1.3 Metaller 1.3.1 Tanım 1.3.2 Demir 1.3.2.1 Demir Metabolizması 1.3.2.2 Demirin Vücutta Dağılımı 1.3.2.3 Demir Emilimi 1.3.2.4 Demir Toksisitesi 1.3.3 Kurşun 1.3.3.1 Kurşunun Özellikleri ve Kurşun Maruziyeti 1.3.3.2 Kurşun Absorbsiyonu ve Metabolizması 1.3.3.3 Kurşun Toksisitesi 1.4 DNA 1.4.1 Genetik Polimorfizm 1.4.1.1 Polimorfizm Çeşitleri 1.4.1.1.1 Tek Nükleotid Değişim (Single Nucleotide Polymorphism:SNP) 1.4.1.1.1.1 SNP’lerin Protein Oluşumu Üzerine Etkileri 1.5 DNA İzolasyonu 1.5.1 Fenol kloroform İzolasyonu 1.6 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction: PCR) 5 5 9 9 9 10 12 13 13 13 15 19 19 19 20 20 20 21 21 21 23 27 29 29 32 33 35 35 35 36 40 40 41 42 iv 1.6.1 PCR’ın Aşamaları 1.6.2 PCR Bileşenleri 1.7 RFLP (Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi: Restriction Fragment Length Polymorphism) Yöntemi 1.7.1 Restriksiyon Endonükleaz (RE) Enzimlerinin Sınıflandırılması 1.8 Gen Ekspresyonu 1.9 Divalent Metal Transporter (DMT1) 1.10 Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAS) 1.10.1 Alevli Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAAS) 1.10.2 Grafit Fırınlı Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi (GFAAS) 43 46 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1 Metal Analizi 2.1.1 Gereçler 2.1.1.1 Numuneler 2.1.1.2 Hasta Rızası 2.1.1.3 Kullanılan Kimyasal Maddeler 2.1.1.4 Kullanılan Araç ve Gereçler 2.1.2 Yöntem 2.1.2.1 Örneklerin Alınması 2.1.2.2 Örneklerin Metal Analizi 2.1.2.2.1 Tam Kan Örneklerinde Demir Analizi 2.1.2.2.2 Tam Kan Örneklerinde Kurşun Analizi 2.2 DMT-1 Polimorfizmi 2.2.1 Gereçler 2.2.1.1 Kullanılan Kimyasal Maddeler 2.2.1.2 Kullanılan Araç ve Gereçler 2.2.2 Yöntem 2.2.2.1 Sıvı Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu 2.2.2.2 Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi 2.2.2.2.1 %0.5’lik Agaroz Jel Hazırlanması 2.2.2.2.2 Agaroz Jel’e Yüklemek İçin Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları 2.2.2.3 PCR 2.2.2.3.1 Primerler 2.2.2.3.2 PCR Bileşenleri ve PCR Programı 2.2.2.3.3 PCR Ürünü İçin Agaroz Jel Hazırlanması 2.2.2.4. PCR Ürününün RFLP Yöntemi ile Kesimi 2.2.2.4.1. Mnl1 Restriksiyon Enziminin Özellikleri 2.2.2.4.2. Mnl1 Enzim ile Kesim İşlemi 2.2.2.4.3. Mnl1 Enzimi ile İnkübasyondan Sonra Agaroz Jel Hazırlanması 2.3 İstatistiksel analizler 57 57 57 57 57 57 58 58 58 59 59 62 65 65 65 66 67 67 68 68 69 69 70 71 72 72 72 73 73 73 47 49 50 52 55 56 56 3. BULGULAR 75 3.1 Toplumumuz Bireylerinde DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları 75 3.2 Ölçülen Parametrelerin Tanımlayıcı İstatistikleri 75 3.3 Yaş Grupları ile Pb,Fe, HCT ve Ferritin Düzeyleri Arasındaki İlişki 75 3.4 Agaroz Jel Elektroforezinde Genomik DNA’nın Yürütülmesi 76 v 3.4.1 DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleot Polimorfizminin PCR Yöntemiyle Amplifiye Edilmesi 3.4.2 DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizminin MnlI Restriksiyon Enzimi ile Amplifiye Edilen Bölgenin Kesimi 3.4.2.1 DNA Örneklerinin Genotiplendirilmesi 3.4.2.2 DMT1 IVS4+44 : “C/C” Genotipli Homozigot Tipik Bireyler 3.4.2.3 DMT1 IVS4+44: “A/A” Genotipli Homozigot Tipik Bireyler 3.4.2.4 ”DMT1 IVS4+44”: “C/A” Genotipli Heterezigot Tipik Bireyler 3.4.3 Mnl1 Enzimi ile Kesilen Baz Çiftlerinin Bant Uzunlukları 3.4.4 DMT1 IVS4+44 Tek Nükleotid Polimorfizminin Genotip Frekansı 3.4.5 DMT1 IVS4+44 Tek Nükleotid Polimorfizminin Alel Frekansı 3.5 Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinin tespiti 3.6 Fe konsantrasyonu ile DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması 3.7 Pb kosantrasyonu ve DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması 3.8 Talasemi Hastalarında Metal Düzeylerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizmi genotipleri ile ilişkisi 3.9 Talasemi Hastalarında Metal Düzeylerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizminin alelleri ile ilişkisi 3.10 Talasemi Hastalarında Ferritin ve Hct parametrelerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizmi genotipleri ile ilişkisi 3.11 Talasemi Hastalarında Ferritin ve Hct parametrelerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizminin alelleri ile ilişkisi 76 77 78 78 80 81 82 83 84 84 85 86 87 88 88 89 4. TARTIŞMA 90 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 95 ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMİŞ 98 99 100 109 111 vi ÖNSÖZ Tez konusu seçiminde, tezimin hazırlanmasında yol gösteren, araştırmaları ve deneylerin yürütülmesinde yardımlarını esirgemeyen, karşılaşılan sorunların çözümünde bilimsel ve sosyal desteğini her zaman yanımda hissettiğim bana toksikolojiyi sevdiren ve öğreten, ufkumu açan değerli hocam Ankara Üniversitesi Adli Bilimler Enstitüsü Müdürü, Sayın Prof. Dr. Tülin SÖYLEMEZOĞLU’na, Çalışmalarımın her aşamasında, özellikle genetik deneylerin yapılmasında ve istatistiksel analizlerin yorumlanmasında çok büyük katkıları ve desteği olan değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Zeliha KAYAALTI’na, Yüksek lisans öğrenimim boyunca her konuda beni destekleyen tez danışmanım sayın Doç. Dr. Birsen KAPLAN’a, Kimyasal analizlerin yapılmasında ve yorumlanmasında emeği geçen Dr. Bio. Vügar Aliyev’e, Örneklerin toplanması ve gerekli verilere ulaşma konusundaki yardımları için Doç. Dr. Birol GÜVENÇ ve Uzm. Dr. Fatih Öçal’a, Adana Kan Hastalıkları Derneği Başkanı Şahin ÖZBİNGÜL ve Tarsus Talasemi Derneği Başkanı Sefa TÜRKEL’e, çalışmamın başlamasında gayretlerini unutamayacağım Uzm. Hemşire Lema ÇAPAR ABACI ve Hemşire Yıldız YÜCE’ye, Hayatıma ayrı bir anlam katan ve katacak olan, çalışmalarım süresince sıkıntılarımın aşılmasında yardımcı olup dertlerimi paylaşan, desteğini her zaman yanımda hissettiğim Yük. Bilg. Müh. Gökhan GÖKYER’e, Laboratuar çalışmalarım dahil, hayatımda manevi destekleriyle her zaman yanımda olan, içten ve gerçek bir dostlukla her konuda yardımıma koşan hocalarım Uzm. Bio. Ayşe KARAKUŞ’a, Uzm. Bio. Emrah DURAL’a arkadaşlarım Kim. Selda SERT’e, Bio. Yasemin KARTAL’a, Bio. Gözde MASATCIOĞLU’na, Kim. Sinem IŞIK’a, Bio. Esma SÖYLEMEZ’e, Uzm. Bio. Ayşegül BACAKSIZ’a, Dr. Dilek KAYA’ya, Sahip olduğum herşeyi borçlu olduğum sevgili, fedakar ve çok sabırlı annem Semiha SÖYLEMEZ, babam Naci SÖYLEMEZ, kardeşlerim Demet SÖYLEMEZ ve Rifat SÖYLEMEZ’e çok teşekkür ederim. vii SİMGELER VE KISALTMALAR AAS Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi GFAAS Grafit Fırınlı Atomik Absorbsiyon Spektrometresi AAAS Alevli Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi Fe Demir Fe+2 Ferröz demir Fe+3 Ferrik demir Pb Kurşun DMT1 Divalent katyon taşıyıcı β-talasemi Beta talasemi α-talasemi Alfa talasemi γ-talasemi Gamma talasemi δ-talasemi Delta talasemi δβ-talasemi DeltaBeta talasemi εγδβ-talasemi EpsilonGammaDeltaBeta talasemi β-globin Beta globin α-globin Alfa globin Hb Hemoglobin HbA HemoglobinA HbA2 HemoglobinA2 HbF HemoglobinF α2β2 HbA α2δ2 HbA2 α2γ2 HbF viii Hb Portland Hemoglobin Portland Hb Gower 1 Hemoglobin Gower 1 Hb Gower 2 Hemoglobin Gower 2 ζ2γ2 Hb Portland ζ 2 ε2 Hb Gower 1 α2ε2 Hb Gower 2 Aγ Alanin [Gamma] Gγ Glisin [Gamma] β+ β-globin zincirinin normal sentezinin azalması βº β-globin zincirinin normal sentezinin kaybolması IVS İntervening Sekans DNA Deoksiribonükleik asit Hct Hematokrit SNP Tek nükleotid poimorfizm (Single Nucleotid Polymorphism) A Adenin C Sitozin T Timin G Guanin PCR Polimeraz zincir reaksiyon (Polymerase chain reaction) dNTP Deoksiribonükleozidtrifosfatlar RNA Ribonükleik asit bp Baz çifti (base pair) RFLP Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi RE Restriksiyon Endonükleaz ix SDS Sodyum dodesil sülfat TE Tris-Edta EDTA Etilen-diamin-tetra-asetik asit DTT Dithiothreitol TBE Tris-Borikasit-Edta F primer Forward Primer (İleri doğru olan primer) R primer Reverse Primer (Aksi yönde olan primer) Tf Transferin TfR Transferrin reseptörü ApoTf Apotransferrin ppm Milyonda Bir Ölçütü ppb Milyarda Bir Ölçütü HNO3 Nitrik Asit x ŞEKİLLER Şekil 1.1. Dünya’da talaseminin sıklık gösterdiği bölgeler 3 Şekil 1.2. Türkiye’nin talasemi haritası 4 Şekil 1.3. Hb molekülü 5 Şekil 1.4. Hem grubu’nun yapısı 6 Şekil 1.5. Hb gen kümeleri 7 Şekil 1.6. Globin zincir sentezinin evreleri 8 Şekil 1.7. Talasemi tipleri 10 Şekil 1.8. α talasemi kromozomu 10 Şekil 1.9. α ve β talasemi’nin patofizyolojisi 11 Şekil 1.10. Alfa talaseminin Dünya üzerindeki dağılımı 12 Şekil 1.11. α talasemi genotip gösterimi 14 Şekil 1.12. β talasemi kromozomu 15 Şekil 1.13. β-globin gen yapısı. 16 Şekil 1.14. İnefektif eritropoez 17 Şekil 1.15. Beta talaseminin dünya üzerindeki dağılımı 18 Şekil 1.16. Erişkinde vücut demir dağılımı 22 Şekil 1.17. Bağırsakta non-hem demir emilimi 25 Şekil 1.18. Transferrin siklüsü 27 Şekil 1.19. Tek nükleotid polimorfizm 36 Şekil 1.20. Transisyon ve transversiyonla tek nükleotid değişim oluşumunun şematik gösterimi. 37 Şekil 1.21. İnsersiyonla (nükleotid eklenmesi) şematik gösterimi 38 Şekil 1.22. Çerçeve kayması oluşumunun şematik gösterimi 39 Şekil 1.23. Delesyon ile amino asit eksilmesinin şematik gösterimi 39 Şekil 1.24. Ana hatlarıyla organik (fenol-kloroform) ekstraksiyonu 41 Şekil 1.25. PCR Siklusunun basamakları 43 Şekil 1.26. PCR programı 44 Şekil 1.27. PCR ürünü 45 Şekil 1.28. PCR ürünü çoğaltılma sayısı. 46 Şekil 1.29. RFLP Tekniği ile canlılar arasındaki genetik farklılığın tespiti 48 Şekil 1.30. DNA replikasyonu 50 Şekil 1.31. Protein Sentezi 51 Şekil 1.32. DMT1’in 12.kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi 52 Şekil 1.33. DMT1’in protein yapısındaki amino asitler 53 Şekil 1.34. DMT1’in 3 boyutlu yapısı 54 Şekil 2.1. Demir analizine ait örnek kalibrasyon grafiği 60 Şekil 2.2. Kurşun analizine ait örnek kalibrasyon grafiği 62 Şekil 2.3. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi. 69 Şekil 2.4. Mnl1 restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ile kesim noktasının şematik gösterimi. 72 Şekil 3.1. Kesme enzimi, kesme bölgesi ve enzimin tanıdığı bölge. 78 xi Şekil 3.2. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot tipik C/C bireylerde, MnlI enzimi ile kesiminin şematik gösterimi. 79 Şekil 3.3. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot tipik C/C genotipli bireylerde, MnlI enzimi ile kesimi ile oluşan bant uzunluklarının şematik gösterimi. 79 Şekil 3.4. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot atipik A/A” genotipli bireylerde, Mnll enzimi ile kesiminin şematik gösterimi. 80 Şekil 3.5. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot atipik A/A genotipli bireylerde, MnlI enzimi ile kesimi ile oluşan bant uzunluklarının şematik gösterimi. 81 Şekil 3.6. Mnl1 enzimi ile kesim sonucunda oluşan baz çiftlerinin bant uzunlukları 81 Şekil 3.7. 351 bp.lik PCR ürününün A aleli ve C aleli varlığında Mnl1 enzimi ile kesim sonucu oluşan bant uzunluklarının şematik gösterimi. 83 Şekil 3.8. Talasemi hastalarından alınan kan örneklerindeki Fe düzeyi ve DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması. 86 Şekil 3.9. Talasemi hastalarından alınan kan örneklerindeki Pb düzeyleri ve DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması. 87 xii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Hb çeşitleri 8 Çizelge 1.2. Standart bir PCR’da bulunması gereken bileşenler ve miktarları. 47 Çizelge 2.1. Mikrodalga fırına ait tam kan yakma programı. 59 Çizelge 2.2. Alevli atomik absorpsiyon cihazı kullanılarak, kan örneğinde demir metalinin analizi için uygulanan metot. 60 Çizelge 2.3. Kan örneklerinde kurşun analizine ait grafit fırın sıcaklık programı. 63 Çizelge 2.4. Kurşun analizi için grafit fırın teknikli atomik absorpsiyon cihazında uygulanan metod. 64 Çizelge 2.5. Amplifikasyonda kullanılan primerler ve özellikleri. 70 Çizelge 2.6. PCR bileşenleri ile stoktaki ve reaksiyondaki konsantrasyonları. 71 Çizelge 2.7. Mnl1 enzimi ile kesim işlemindeki bileşenler ve reaksiyondaki hacimleri. 73 Çizelge 3.1. Metal düzeyleri ve parametrelerin genel değerlendirilmesi. 75 Çizelge 3.2. Kanda belirlenen metal düzeyleri ile yaş grupları arasındaki ilişkiye ait istatistiksel veriler. 76 Çizelge 3.3. PCR’da kullanılan primerler, kromozom üzerindeki lokalizasyonları ve amplifiye edilen bölgenin nükleotid dizilimleri. Koyu ve altı çizik olan “a” bazı 51399050. noktada bulunan ve A→C değişimini gösteren polimorfik nükleotiddir. 77 Çizelge 3.4. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan genotipler ve MnlI enzimi ile kesim sonucundaki bant uzunlukları. 82 Çizelge 3.5. Bireylerin DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan genotiplerin frekansı. 83 Çizelge 3.6. Toplumumuz bireylerinde “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan alellerin frekansı. 84 Çizelge 3.7. Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti. 84 Çizelge 3.8. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotipleri ile Fe ve Pb düzeylerinin istatistiksel değerlendirmesi. 88 Çizelge 3.9. DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid polimorfizmi alelleri ile Fe ve Pb düzeylerinin istatistiksel değerlendirmesi. 88 Çizelge 3.10. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotipleri ile ferritin ve hematokrit parametrelerinin istatistiksel değerlendirmesi. 89 Çizelge 3.11. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi alelleri ile ferritin ve hematokrit parametrelerinin istatistiksel değerlendirmesi. 89 1. GİRİŞ Talasemi hastalığı, hemoglobin (Hb) molekülündeki alfa veya beta globin zincirinin aminoasit biyosentezinde meydana gelen genetik bozukluk olup otozomal resesif geçiş gösteren bir anemi türüdür. Talasemi kansızlığın kalıtsal formudur. Talasemiler, dünyada en sık karşılaşılan tek gen hastalıkları içerisindedir. Talasemi hastalığındaki ana neden hemoglobin molekülünü meydana getiren globin zincirlerinin bir ya da birden fazlasının sentezinin yokluğu veya az sentezlenmesidir. Alfa talasemililerde α-globin zinciri sentezi, beta talasemililerde ise β-globin zincir sentezinde bozukluk oluşmaktadır (Weatherall, 2001a). Talasemi, ilk kez 1925’te Thomas Cooley ve Pearl Lee tarafından İtalyan kökenli çocuklarda şiddetli anemi, dalak büyüklüğü, büyüme geriliği ve karakteristik kemik değişikliklerine benzer bulgulara sahip bir hastalık olarak tanımlanmıştır (Weatherall, 2004a). Bu tanılara benzer olguların görülmesi üzerine bu kalıtsal kan hastalığına Van Jaksch anemisi, splenik anemi, Akdeniz anemisi gibi isimler verilmiştir (Vallance ve ark., 2003). 1936’da ise George Whipple ve Lesley Bradford ilk tanımlayarak inceledikleri vakaların Akdeniz civarı ülkelerdeki çocuklarda daha sık olmasından dolayı, hastalık Yunanca’da deniz anlamına gelen “thalass” sözcüğü ve anemi anlamına gelen “eamia” sözcüğünün birleşmesiyle “thalasseamia” olarak adlandırılmıştır (Weatherall, 2004b). Zaman içerisinde yapılan çalışmalarda bu bozuklukların Akdeniz bölgesi ülkeleriyle kısıtlı olmadığı, tropikal ülkeleri de kapsayan geniş bir bölgede görüldüğü ortaya çıkmıştır. Genellikle Akdeniz bölgesi ve Güneydoğu Asya’da görülen bu genetik hastalık dünya nüfusunun büyük bir bölümünü etkilemekte, tüm etnik gruplarda ve coğrafi bölgelerde görülebilmekte ve bazı bölgelerde ciddi bir halk sağlığı sorununu oluşturmaktadır (Higgs ve ark., 2001). Dünya Sağlık Örgütü’nün yayınlamış olduğu verilere göre, dünyada talasemi ve anormal hemoglobinlerin sıklığı %5,1, taşıyıcı sayısı 266 milyon ve her sene yaklaşık 365,000 hasta çocuğun dünyaya geldiğini rapor etmişlerdir (Canatan, 2007). Talasemiler, dünyada en yaygın karşılaşılan tek 2 gen bozukluklarıdır (Rund ve ark., 2005). Bu genetik hastalık yaygın olarak Akdeniz kuşağı üzerinde, Afrika, Ortadoğu, Hindistan, Güney Çin, Güneydoğu Asya’da görülmekle beraber Avrupa, Amerika ve Avustralya’ya da göçler aracılığıyla yayıldığı düşünülmektedir (Weatherall, 2004a) (Şekil 1.1.). Talasemililer, özellikle malaryanın endemik olduğu bölgelerde Afrika, Ortadoğu, Güneydoğu Asya’da sıklıkla görülmektedir (Hedrick, 2011). Bunun ana nedeni talasemi taşıyıcığının eritrositlerde malaryal parazitlerin barınmasını engellediği, hastalığın taşıyıcılarını malaryaya karşı genetik olarak koruduğu, seçici bir avantaja sahip olduğu düşünülmektedir (Weatherall ark., 2010). Bundan dolayı β talasemilere neden olan gelişim evrelerinin sıtma evrimiyle ilişkili olabileceği düşünülmüştür. Ancak, daha sonra yapılan araştırmalar neticesinde beta talaseminin, aynı zamanda sıtma olmayan bölgelerde de gözlemlenmesi, bu hipotezi çürütmüştür (Birgens ve ark., 2007, Weatherall, 1998). Talasemi mutasyonları, Akdeniz ülkelerinde doğu ve batı kesimlerinde farklı yoğunluklardadır. Akdeniz ülkelerinde doğudan batıya doğru ilerledikçe talasemi yoğunluğu azalmaktadır. Bu yoğunluğun düşmesinin nedeni, mutasyonların belirlendiği toplumlardaki mutasyon dağılımlarının bilinmesi, genetik danışmanın bulunması, evlilik öncesi tarama ve doğum öncesi tanılar için gerekli önlemlerin alınması önem kazanmıştır ( Clark ve ark., 2004). 3 Şekil 1.1. Dünya’da talaseminin sıklık gösterdiği bölgeler (Weatherall ve ark., 2001b). Talasemi diğer Akdeniz ülkelerinde olduğu gibi ülkemizde de yüksek oranda görülen genetik hastalıklar arasında bulunmaktadır ve ülkemizin güney ve batısında ciddi bir sağlık sorunu oluşturmaktadır (Tadmouri ve ark., 1998). Türkiye’de talasemi tanısı konulan ilk iki hasta, 1941 yılında bildirilmiştir. Ancak, bu hastalığın önemli bir sağlık sorunu olduğu 1950 sonrasında anlaşılmıştır (Tadmouri ve ark., 2001). Türkiye’de talasemiyle ilgili ilk çalışmalar Aksoy ve arkadaşları tarafından başlatılmıştır (Aksoy, 1991). İlk tarama çalışması 1971 yılında Çavdar ve arkadaşları tarafından yapılmış ve Türkiye’de talasemi hastalığı oranının %2 olduğu rapor edilmiştir. Ancak, bu oran bölgeden bögeye değişim göstermektedir (Yıldız ve ark., 2005). Sağlık Bakanlığı 2000-2006 arasında onaltı merkezde toplam 377,339 sağlıklı kişiyi taramış olup, taranan kişi sayısı ile talasemi ve anormal hemoglobin sıklığının illere göre dağılımı; Adana:%3,7 (68460), Antakya:%4,6 (47755), Antalya: %13,1 (19594), Aydın: %5,1 (2209), Bursa: %1,7 (4040), Denizli: %2,6 (20000), Diyarbakır: %3,6 (2830), Edirne: %6,4 (2610), Isparta: %2,4 (6654), İstanbul: %4,5 (4944), İzmir: %4,8 (97510), K.Maraş: %0,7 (2398), Kırklareli:%3,4 (2439), Mersin: %2,3 (40977), Muğla: %4,5 (52042) ve Urfa: %6,4 (2913) (Canatan D., 2007). Bu verilere göre Türkiye’de talasemi ve hemoglobinopatilerin oranı %4,3 olarak 4 bulunmuştur. Bu oran farklı bölgelerde %0,6-13,0 arasında değişmektedir (Kılınç, 2006) (Şekil 1.2.). Türkiye’de yaklaşık 1.300.000 talasemi taşıyıcısı ve ortalama 4000 talasemi hastası olduğu rapor edilmiştir (Canatan, 2007). Şekil 1.2. Türkiye’nin talasemi haritası (Canatan, 2007). Genetik mutasyonlar çağımızın önde gelen problemlerinden biridir, oluşan mutasyonlarla vücutta bazı proteinler fonksiyonlarını kaybetmekte ve buna bağlı olarak vücutta birtakım hastalıklar meydana getirmektedir. Talasemili bireylerin biyolojik örneklerinden yapılan DMT1 (Divalent Metal Transporter) polimorfizm analizleri talasemili bireyler hakkında çalışanların bilgilendirilmesi açısından önemlidir. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizm frekansı talasemililerde bilinmemektedir ve bununla ilgili bir çalışmanın olmaması göz önüne alınarak, çalışmamızda, talasemili hastalarda DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin belirlenmesi, bu polimorfizmin hasta bireylerde demir ve kurşun düzeyiyle ilişkinin olup olmadığının tespit edilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca, hastaların ferritin ve hematokrit parametrelerinin polimorfizmle bir ilişkisi olup olmadığı da değerlendirilmiştir. 5 1.1 Hemoglobin 1.1.1 Hemoglobin Molekülü ve Yapısı Hemoglobin (Hb) molekülü, kırmızı kan hücrelerinde bulunan ve oksijen bağlama kapasitesine sahip bir çeşit proteindir ve başlıca görevi akciğerlerden dokulara oksijen (O2) taşımak ve dokularda bulunan karbondioksiti (CO2) akciğerlere taşımaktır. Hb’nin yapmakta olduğu bu görev organ ve dokuların fonksiyonlarını devam ettirebilmeleri için yaşamsal öneme sahiptir (Klinken, 2002). Hb molekülü ortalama 6,4 nm çapında 64,500 dalton molekül ağırlığında ve tetramerik yapıda bir moleküldür (Weatherall, 2001a). Şekil 1.3. Hb molekülü (chemistry.wiki.elanco.net). Hb molekülü globin denilen protein kısmıyla birlikte hem adı verilen gruptan meydana gelmektedir. Hb molekülünün globin kısmında dört tane polipeptid zinciri bulunur ve bu polipeptidlerin her birine, bir hem grubu bağlanır. Polipeptidlerin hem grubuna bağlanması Hb molekülüne oksijen bağlanmasını ve kanın kırmızı renkli olmasını sağlamaktadır (Huisman, 1993). Hb yapısı içinde yer alan hem grubu ve globin zincirleri hücrede farklı yerlerde sentezlendikten sonra birleşerek Hb molekülünü meydana getirmektedir (Nagel ve ark., 2003) (Şekil 1.3.). 6 Tüm Hb’lerde hem grubu aynı yapıya sahiptir. Bu grup, ortasında ferröz (Fe+2) bulunan, yan zincirlere sahip, birbirine metil köprüleriyle bağlanmış dört pirol halkasından meydana gelmektedir (Huisman, 1993) (Şekil 1.4.). Şekil 1.4. Hem grubu’nun yapısı (chemistry.wiki.elanco.net). Globin zincirlerini sentezleyen genler alfa (ζ2–Ψζ1–Ψα2–Ψα1-α2-α1-θ) ve beta (ε-Gγ-Aγ-Ψβ-δ-β) genler olmak üzere iki kümede toplanmışlardır. α polipeptid zincirleri 141 amino asitten, β polipeptid zincirleri ise 146’şar aminoasitten oluşmaktadır (Weatherall, 2001a). Hb molekülündeki farklılıklar globin zincirleri üzerindeki aminoasit değişimi sonucunda oluşmaktadır. Bu değişim ise Hb molekülünün sentezinden sorumlu genler tarafından kodlanmakta olup 11 ve 16 nolu kromozomlar içinde yerleşmiştir (Weatherall ve ark., 2001b) (Şekil 1.5.). α ve β gen kümesinde bulunan pesodo genlerin (Ψζ-Ψα2-Ψα1 ve Ψβ ) bilinen bir işlevi bulunmamaktadır. İşlevi olmayan bu genlerin evrimsel izler olabileceği düşünülmektedir. Teta (θ1) geninin korunmuş yapısı ve aktif olmayan hiçbir mutasyon bulundurmaması işlevsel olabileceğini düşündürmektedir. Şimdiye kadar genin protein ürünü bulunamamış olup θ1’in rolü bilinmemektedir (Weatherall, 2010). 7 Şekil 1.5. Hb gen kümeleri (Weatherall D. ve ark., 2001b). Embriyonik, fetal ve erişkin yaşam sırasında farklı oksijen gereksinimleri olmakta ve buna bağlı olarak gelişimin her aşamasında farklı Hb molekülleri sentezlenmektedir. Tüm Hb’ler aynı tetramerik yapıya sahiptirler ancak; her biri farklı iki çift globin zinciri içermekte ve her biri bir hem molekülüne bağlanmaktadır. Erişkin ve fetal dönemdeki Hb’ler β, δ, γ zincirlerinin α zincirleriyle birleşmesinden meydana gelmektedir. Erişkin Hb’leri HbA (α2β2), HbA2 (α2δ2) ve fetal Hb F (α2γ2) yapısındadır (Weatherall ve ark., 2001a). Yetişkin Hb’nin yaklaşık %96’sı major hemoglobin HbA’dır, geri kalan %2-3 kısmını minör yetişkin hemoglobini HbA2 oluşturmaktadır. Fetal dönemin başlıca hemoglobini Hb F’dir (Weatherall, 2004a). Embriyonik hayatın erken gelişim döneminde üç farklı Hb tipi sentezlenmektedir. Bunlar Hb Gower I (ζ2ε2), Hb Gower II (α2ε2), Hb Portland (ζ2γ2)’dır (Weatherall ve ark., 2001a). 8 Çizelge 1.1. Hb çeşitleri (Weatherall, 2001a). Sentezlendiği Hemoglobin Adı Dönem Formülü Hb Gower I Embriyonik Hb ζ2ε2 Hb Gower II Embriyonik Hb α2ε2 Hb Portland Embriyonik Hb ζ2γ2 Hb F Fetal Hb α2γ2 Hb A Erişkin Hb α2β2 HbA2 Erişkin Hb α2δ2 Embriyonik globin sentezi yolk kesesinde gebeliğin üçüncü haftasından sekizinci haftasına kadar olan bölümde oluşur, ancak yaklaşık beşinci haftada eritropoezin başlıca yeri olan yolk kesesinden fetal karaciğere doğru geçiş göstermeye başlar. Eritropoezin karaciğerde başlamasıyla fetal eritrositler oluşmakta ve yaklaşık onikinci haftadan başlayarak dalakta HbF sentezi görülmektedir. Şekil 1.6. Globin zincir sentezinin evreleri (Sankaran ve ark., 2010). Gebeliğin onsekizinci haftasından doğuma kadar kırmızı hücre üretim görevi yavaş yavaş fetal karaciğerinden kemik iliğine geçmektedir (Fathallah ve ark., 2006). 9 Embriyonik, fetal ve erişkin yaşamda hemoglobinlerin birinin sentezi azalırken diğerinin artmaya başladığı gözlenmektedir (Weatherall, 2001a) (Şekil 1.6.). Hb’lerin tümü farklı iki çift globin zincirinden meydana gelen ve her bir globin zincirinin bir hem parçasına bağlandığı, bir tetramerik yapıya sahiptir (Wood ve ark.,1983). Bu farklı globin zincirlerinin amino asit dizilimlerinin belirlenmesi hemoglobinin üç boyutlu yapısını anlamada önemli bir ilerlemedir ve bu ilerleme hemoglobinin bir oksijen taşıyıcısı olarak allosterik özelliklerinin incelenmesini kolaylaştırmıştır (Weatherall, 2004a). 1.2 Talasemi 1.2.1 Tanım Talasemililer, α, β, γ, δ olarak tanımlanan kalıtsal olarak hemoglobin molekülünü oluşturan globin zincirlerinin birinin ya da birden fazlasının sentezindeki azalma veya tamamen yokluğuna bağlı ortaya çıkan otozomal resesif geçiş gösteren (cinsiyet kromozomlarıyla ilişkisi olmayan, kızlarda ve erkeklerde eşit oranda görülen) genetik bir hastalık olarak karakterize edilir (Weatherall, 2001a). En çok gözlemlenen formları α ve β talasemidir, alfa globin yapımı azlığı alfa talasemiye, beta globin yapım azlığı beta talasemiye neden olmakla birlikte γ, δβ , γδβ, εγδβ ve δ eksikliğinde ifade edilen talaseminin farklı türleri de belirlenmiştir (Weatherall, 1998; Birgens, 2007). 1.2.2 Talasemi Tipleri Talasemiler alfa ve beta talasemi olmak üzere iki grupta sınıflandırılırlar. Alfa talaseminin hafif alt grupları sessiz taşıyıcı ve alfa talasemi taşıyıcı tipiyken en önemli alt grupları Hb H hastalığı ve Hb Barts hidrops fetalis sendromu’dur (Şekil 1.7.). Beta talasemililerin major, intermedia ve minör şeklinde alt grupları mevcutur. Bütün talasemi tiplerindeki ortak özellik hemoglobin tetramerini oluşturan globin zincir sentezindeki dengesizliktir (Wearherall, 2001a). 10 Şekil 1.7. Talasemi tipleri (Higgs, 2004). 1.2.2.1 Alfa Talasemiler α gen kümesinde θ, α1, α2, ψα1, ψα2, ψζ ve ζ geni vardır. α benzeri genleri (ζ ve α) 16. kromozomun kısa kolunun p13.3 bölgesinde (Şekil 1.8.) her bir homolog kromozom üzerinde ikişer tane olmak üzere dört tanedir ve 30 kilobaz uzunluğundaki DNA bölgesinde bulunmaktadır. Aynı kromozom üzerindeki αgenlerine, 5΄→3΄ doğrultusunda, alfa 2 (α2) ve alfa 1 (α1) olarak adlandırılmaktadır (Weatherall D., 2001a). İnsan α gen kümesi dört etkin gen (ζ, α2, α1, θ) ve üç etkin olmayan gen (ψα1, ψζ ve ψα2) içermektedir (Coa ve ark., 2002). Şekil 1.8. α talasemi kromozomu (http://tr.wikipedia.org/wiki/Kromozom_16). İnsanda iki α-globin zincir geni anneden, iki tanesi babadan gelmek üzere toplam dört tane α-globin zincir geni bulunur. α talasemide en sık rastlanılan patoloji gen delesyonudur (Higgs ve ark., 1990b). α talasemi nadir görülen genetik bir özellik değildir, aksine insanlar tarafından bilinen en yaygın genetik anormalliklerden biridir (Harteveld ve ark., 2010). Normal α genotipi αα/αα şeklinde gösterilmektedir. α 11 talasemilerde α-globin genlerinin biri, ikisi, üçü ya da dördü birden etkilenmiş olabilir. Dört α-geninden bir tanesi delesyona uğradığında α+ talasemi (sessiz talasemi veya alfa talasemi-2) (α-/αα), iki α geni delesyona uğradığında α0 talasemi (α talasemi taşıyıcılığı veya α talasemi 1) (α-/-α) veya (--/αα), üçünün sentezlenmemesi durumunda HbH (α-/--), dördünün sentezlenmemesine bağlı Hb Barts Hidrop Fetalis Sendromu (--/--) meydana gelmektedir (Higgs, 1990a). α zincirlerinin hem fetal hem de yetişkin hemoglobininde (Şekil 1.9.) bulunması delesyona uğramış α zincir yapımının her iki döneminde kliniğe yansımasına neden olmaktadır (Weatherall ve ark., 1988). Şekil 1.9. α ve β talasemi’nin patofizyolojisi (Higgs, 2004). α talasemi genel olarak β talasemiye benzer bir coğrafik dağılım göstermektedir. Afrika boyunca, Akdeniz bölgesi, Ortadoğu, Hindistan’ı içine alan kısımda, Doğu ve Güneydoğu Asya bölgesinde yoğun bir şekilde bulunmaktadır Ortadoğu ve Afrika populasyonunda nadir olarak bulunur. Ancak; bu populasyonlarda α talaseminin delesyon yapısı oldukça fazladır (Higgs ve ark., 2008) (Şekil 1.10.). 12 Şekil 1.10. Alfa talaseminin Dünya üzerindeki dağılımı (Weatherall, 2001a). α0 talasemiler Güneydoğu Asya’da yüksek frekansta bulunmaktadır ve Güneydoğu Asya’nın bazı bölgelerinde populasyonun %10’dan fazlası α0 taşıyıcısıdır. α0 talasemiler ayrıca Doğu Akdeniz adalarında ve anakaradaki populasyonlarda yaygın olarak bulunduğu ancak Ortadoğu ve Hindistan kıtasını içine alan bölümde düzensiz bir yayılıma sahip olduğu rapor edilmiştir. α+ talaseminin delesyonlu formları tropikal kuşağın tam karşısındaki alanlarda yüksek frekanslarda bulunmaktadır. Bu bölgedeki bazı populasyonlarda α+ taşıyıcılığı %2-70 arasında değişmektedir (Higgs ve ark., 2008). Alfa talasemi taşıyıcılığının falciparum malaria alanlarında selektif avantaja sahip olduğu düşünülmektedir. Yapılan çalışmalarda alfa talasemi taşıyıcılığının polimorfik frekansının %1’den büyük olduğu bulunmuştur (Harteveld ve ark., 2010; Weatherall ve ark., 2002). 1.2.2.1.1 Sessiz α- Talasemi Taşıyıcı Tipi Alfa globin zincir geninin dört tanesinden birinin işlev görmemesine bağlı olarak α+talasemi (sessiz talasemi yada α- talasemi-2) ortaya çıkar. Genotip olarak α-/αα 13 şeklinde olup fenotipte sessizdir. Klinik olarak herhangi bir sorunla karşılaşılmamaktadır (Lin ve ark.,1991). 1.2.2.1.2 α- Talasemi Taşıyıcı Tipi α talasemi taşıyıcılığı iki α-globin zincir geninin delesyonu ve işlevsel olarak iki αglobin geninin bulunması sonucu meydana gelir. Klinik olarak hafif anemi gözlenir. Bu anemi türünün en çok karşılaşıldığı durumu 3,7 kb’lık delesyonunun homozigotluğudur (α3,7/α3,7). Genotip olarak --/αα farklı bi fenotip olarak karşımıza çıkar. β talasemi taşyıcılarında görülen benzer hematolojik bulgulara sahiptir. Doğumdan hemen sonra %5-10 Hb Barts vardır, fakat 6 ay sonra kaybolur (Lin ve ark.,1991). 1.2.2.1.3 Hb H Hastalığı Hb H talasemi tipi yetişkin dönemde, α talasemi çeşidinin en ciddi olanıdır. Hb H talasemi ağırlıklı olarak Güneydoğu Asya, Ortadoğu ve Akdeniz bölgesinde yaygındır. Hb H Hastada α-globin zincir geninin üçünün de işlev görmemesine bağlı olarak meydana gelmektedir --/-α. Bu hastalığa sahip olan bireylerin ebeveynleri sessiz taşıyıcı ya da α talasemi taşıyıcısıdır (Higgs ve ark., 1989). Hb molekülünde yüksek miktarda β-zinciri bulunmakta ve bunun sonucunda β4 tetramerini oluşturmaktadır. Hb’nin oksijene eğilimi fazla olduğu için dokulara yeteri kadar oksijen vermez, bunun sonucunda orta şiddette anemi ağrıları ve dalak büyümesi değişimi de gözlemlenebilir (Weatherall ve ark., 2010). Klinik seyirleri genelde hafiftir ve hafif veya orta düzeyde hemolitik anemi ile kendini gösterir. Doğumdan hemen sonra %20-40 oranında Hb Barts gözlenir daha sonra bunun yerini %5-30 oranında HbH alır. 1.2.2.1.4 Hb Bart’s Hidrops Fetalis Sendromu α talaseminin fetal dönemdeki, en önemli alt grubu Hb Bart’s Hidrops Fetalis Sendromudur (Weatherall, 2010). Hastada α-globin zincir geninin dördü birden defektli olmakta ve etkilenen kromozomda α zincir sentezi durmaktadır (--/--) (Harteveld ve ark.,2010). Fetal dönemde α zinciri sentezlenemez bunun sonucunda 14 fazla γ zinciri sentezlenir ve γ4 tetramerini oluşturur (Higgs ve ark., 2008). Bu anemi türünün oksijene duyarlılığı fazla olduğu için dokulara oksijen vermez ve buna bağlı vücut dokusunda oksijen azalır (Weatherall ve ark., 2010). Bu hastalığa sahip fetusun ebeveynleri α talasemi taşıyıcısıdır (Harteveld ve ark., 2010). Hb Bart’s Hidrops Fetalis Sendromu Güney Asya’da ölü bebek doğumlarının ana sebebidir (Higgs ve ark., 1989). Bu sendromu taşıyan bebeklerde gebeliğin 23-38 haftasında düşük gözlenebilmekte ya da doğum kısa bir süre sonra ölümle sonuçlanmaktadır (Siriratmanawong ve ark., 2009). Ölü doğan bebeklerde deri altında sıvı toplanması, karaciğer büyümesi, normal büyüklükte ya da genişlemiş dalak ve kızarmış plasenta gözlenmiştir (Green ve ark.,1994). Şekil 1.11. α talasemi genotip gösterimi 15 1.2.2.2 Beta Talasemi β-globin genleri (ε, γ, δ ve β) 11. kromozomun kısa kolu üzerindeki 11p 15.5 bölgesinde (Weatherall, 2001a), yaklaşık 70 kb uzunluğundaki DNA bölgesinde lokalizedir (Ho ve ark., 2000) (Şekil 1.12.). β-globin gen kümesi 5’-ε, Gγ, Aγ, Ψβ, δ, β-3’ şeklinde sıralı olarak bulunmaktadır. (Weatherall, 2001a). Bu gen kümesi beş etkin gen ε, Gγ, Aγ, δ, β ve bir etkin olmayan genden Ψβ meydana gelmektedir (Cao ve ark., 2002). Şekil 1.12. β talasemi kromozomu (http://tr.wikipedia.org/wiki/Kromozom_11). β lokusu üzerinde bulunan Gγ ile Aγ genleri yapı olarak aynı protein ürünü vermektedirler. γ globin zincirlerinin bu iki geni 136. pozisyondaki aminoasitlerinin farklı olmasından kaynaklanarak birbirinden ayırt edilebilir. G gama (Gγ) geni 136. pozisyonunda glisini kodlarken, A gama (Aγ) aynı pozisyonda alanini kodlamaktadır (Wood ve ark., 1983; Olivieri ve ark., 1998). β globin geninde üç kodlanan ekzon, iki kodlanmayan intron bölgesi bulunur. β globin geni β globin zincirindeki 146 aminoasidi kodlamak için gerekli bilgiyi üç ekzon, iki intron 3'→5' düzenleyicibölgelerden oluşan yaklaşık 1,8 kb üzerinde taşımaktadır (Thein,1993). 16 (Şekil 1.13.). Şekil 1.13. β-globin gen yapısı. β globin geni üzerindeki Cap bölgesinin 5' tarafındaki DNA dizisine promotor bölge denir. Üç ekzon ve iki introndan oluşan her genin 5' tarafında yaklaşık 50 baz çifti uzunluğunda bir Cap bölgesi ile protein sentezini başlatan kodon (AUG) bulunur. Ekzon üç’ün sonunda stop kodonunu takip eden ve Poli A kuyruğuna (AATAAA) kadar uzanan DNA dizisi transkripsiyonun bitiş sinyallerini bulundurmaktadır. Bu işlemin her aşaması hataya açıktır ve bu aşamaları etkileyen mutasyonlar, kalıtsal hastalıklara neden olmaktadır (Lukens, 1999). β-globin genindeki mutasyonlar, beta zincirinin hiç yapılmamasına veya yeteri kadar yapılamamasına neden olmaktadır. β-globin sentezinin tamamen yokluğuyla β0, beta zinciri az da olsa sentezlenmesiyle β+ talasemi tipi oluşmaktadır (Kazazian ve ark.,1998). β talaseminin oluşmasındaki ana sebep, hemoglobin molekülü içerisindeki alfa ve beta globin zincirlerinin yapımındaki eşitsizliktir (Weatherall, 2001a). Bu eşitsizlik hastalığın derecesini belirler. β-globin sentezinin olmaması ve α-globin sentezi normal hızda devam etmesiyle, α-globin lehine bir zincir dengesizliği olur. Normal sentezlenen α-globinden etkilenmeyen α-geni eritroid hücreleri içerisinde birikir ve burada serbest α-zincir göletini oluşturur. Serbest α-zincirleri geçerli bir hemoglobin zinciri oluşturamaz, bunun yerine eritroid öncül hücrelerine çökerler ve inklüzyon cisimciklerini meydana getirirler. Bu inklüzyon cisimcikleri eritroid öncül 17 hücrelerinin intramedüller hasarlanmasına, anormal hücre olgunlaşmasına ve kemik iliğinde erken Hb yıkımına (inefektif eritropoez) yol açar (Şekil 1.14.) (Tuzmen ve ark., 2001; Efremov, 2007). İnefektif eritropoez nedeniyle, kemik içerisinde yer alan kemik iliği normal hacmini aşar ve normalin üstünde eritrosit hücresi üretmek için çabalar. Bütün bu çabaları yetersiz kalır, çünkü üretilen eritrositler yeteri miktarda Hb taşıyamaz ve kemik iliğinden çıkmadan ölür (Apoptozis). İliğin normalden fazla çalışması kemiklerin genişlemesine, zayıflamasına, şeklinin bozulmasına, patolojik kırıklara ve çeşitli kemik anormalliklerine neden olur. Yanak ve alın kemikleri belirgin olarak ortaya çıkar. Hastaların yüzü herkesin farkına varabileceği karakteristik mongoloid bir şekil alır. Eritrosit yıkımının fazla olmasından dolayı hemosiderin ciltte birikir, cilt pigmentasyonu artar ve koyu sarı renk bir görünüm alır (Wonke, 2001; Benetatos ve ark., 2008). Şekil 1.14. İnefektif eritropoez (Rund, 2005 makalesinden derlenmiştir). Eritrosit hücre zarı hasarı, aşırı α zincirden hemikrom yapılması ve aşırı α zincir ürünlerinin parçalanması olmak üzere iki yolla gerçekleşir. Serbest α zincirlerinin yıkım ürünleri de eritrosit zarına hasar verir. Aşırı demir oluşumu, serbest oksijen radikalleri meydana getirerek eritrosit membranındaki lipid ve protein gibi bileşiklere ve hücre içi organellere zarar verir. Tüm bunlar, esnekliği olmayan sert ve sıvı hacmi az eritrosit yapımına neden olur. Eritrosit içerisinde esnekliği olmayan cisimciklerin varlığı, eritrositlerin dalaktan geçişi sırasında yıkılmasına neden olur (Weatherall, 1998). Anormal eritrosit hücreleri daima dalak tarafından dolaşımdan 18 kaldırıldığı için dalak hücreleri büyümeye başlar. Böylece splenomegali (dalak büyümesi) meydana gelir (Rund, 2005). talasemili hastalarda demir birikiminin iki önemli nedeni vardır. Bunlar; düzenli kan transfüzyonları ve etkin olmayan eritropoez nedeniyle intestinal demir emiliminin tetiklenmesidir. Bu durum kanda serbest demir artışına neden olur (Farmakis ve ark., 2003). Talasemi tedavisinde her 2-4 haftada bir 1-3 ünite düzenli ve kontrollü olarak eritrosit transfüzyonu uygulanır. Bunun ana nedeni eritropoezi baskılamak ve bağırsaktan demir emilimini azaltmaktır. Transfüzyonun sonunda yaklaşık 15-20 mg/gün demir birikimine ve Hb yıkımından açığa çıkan demirin salınmasına neden olur. Demirin indirgeyici özelliği yüzünden proteine bağlı olmayan demirlerin meydana getirdiği demir birikimi toksik oksijen radikallerinin üretimine yol açar (Kontoghiorghes, 2006). Organlar demir toksisitesine çok hassastır. Bu nedenle demir birikimi, vücutta kemik bozuklukları, dalak büyümesi, siroz, endokrin ve kalp hasarlarına neden olur (Weatherall, 1998). Şekil 1.15. Beta talaseminin dünya üzerindeki dağılımı β talasemi ile ilgili Hb molekülünde β-globin geninde bugüne kadar 200’ün üstünde farklı mutasyon tespit edilmiştir (Weatherall, 2001a). Bu mutasyonlar büyük delesyonların aksine, nokta mutasyonlarından nükleotid eklenmeleri ya da delesyonları olduğu bilinmektedir. 19 β talasemi alelleriyle ilgili yapılan çalışmalarda ortalama 25 mutasyonun tüm toplumlarda risk oluşturduğu gözlemlenmiştir (Tuzmen ve ark.,2001). β talasemi’nin Türkiyede şimdiye kadar 30’un üzerinde mutasyon tipi tespit edilmiştir (Tadmouri ve ark.,1998). β talasemi, dünyada en sık görülen talasemi tiplerinden biridir. β talasemi Akdeniz kıyıları boyunca, Hindistan, Kuzey ve Batı Afrika, Ortadoğu ve Güneydoğu Asya ülkelerini kapsayan bir coğrafik yayılım içerisinde yer alan endemik kalıtsal bir hastalıktır (Higgs, 2004) (Şekil 1.15.). Ancak, son yüzyılda dünya nüfusunun yayılmasıyla talasemi endemik olmayan ülkelerde de yüksek sıklıkta görülmektedir (Birgens ve ark., 2007). 1.2.2.2.1 Beta Talasemiye Bağlı Klinik Bulgular Beta Talasemiye bağlı klinik bulgular üç tip olarak sınıflandırılır. 1.2.2.2.1.1 Talasemi Major (Homozigot Beta Talasemi) Talasemi formları içerisinde en ağır seyir gösteren ve klinik olarak en ciddi talasemi tipidir. β talasemi geninin homozigot veya birleşik heterezigot aktarılması (bireyler iki mutant alele sahiptir) durumuna β talasemi majör veya Cooley anemisi denir. Doğumdan altı ay sonra hastalığın belirtileri ortaya çıkar. β talasemi majörde kanın oksijen taşıma kapasitesini artırmak için hastalara düzenli kan transfüzyonları yapılmaktadır. Hastalığın seyri büyük ölçüde yeterli bir transfüzyon programı uygulanıp uygulanmamasına bağlıdır. β talasemili majör hastalar yaşamlarının ilk senesinde talasemi tedavisine başlar ve sonuç olarak hayat boyunca düzenli olarak kan transfüzyonu almaları gerekir. İnefektif eritropoez ve düzenli transfüzyonlar nedeniyle demir birikiminin artmasıyla sorun olmaya başlar. Ergenlik döneminde ölüm gözlenebilir (Olivieri, 1999, Coa, 1988). 1.2.2.2.1.2 Talasemi İntermedia β talasemi majörün aksine talasemi intermedia daha hafif bir anemi tipidir. Hastalığın ara formudur. Büyüme ve gelişme normaldir. Erken çocukluk dönemindeki başlıca belirtiler anemi ve hafif sarılıktır. Splenomegali görülebilir. Kemik değişiklikleri 20 hastadan hastaya farklı olabilir. Hafif seyirli, geç başlangıçlı ve transfüzyon ihtiyacı azdır. Hasta anneden ve babadan gelen talasemi genlerinden biri ağır, diğeri hafif mutasyonludur. Bu nedenle klinik olarak hafif seyreder. Her hastada değişkendir; talasemi minöre yakın bir klinik seyirden, majöre yakın bir tabloya kadar değişebilir. (Oliveri,1999, Coa, 1988). 1.2.2.2.1.3 Talasemi Minör ( Heterezigot Beta Talasemi) Talasemi formları içerisinde en hafif seyir gösteren β talasemi tipidir. β talasemi geninin heterezigot (bir mutant alele sahiptir) taşınması durumudur. Taşıyıcılarda, hatalı genin görevini yapan bir de sağlam gen bulunduğundan, hastalık belirtisi ortaya çıkmaz. Bu talasemili hastalarda hafif düzeyde anemi görülür ve klinik bir anormallik gözlenmez (Weatherall ve ark.,1981; Yaprak, 2004). 1.3 Metaller 1.3.1 Tanım Metaller essential ve nonessential olmak üzere ikiye ayrılırlar. Essential metaller vücut için gerekli ve hücresel fonksiyonları yerine getirebilmesi için vücutta bulunması zorunludur. Bunlardan başlıcası bakır (Cu), çinko (Zn) ve demir (Fe)’dir. Bu metallerin vücuda alınım miktarını düzenleyen mekanizmaları vardır. Nonessential metaller vücut için toksik olan metallerdir ve vücutta bulunmasıyla hücresel fonksiyonları bozarlar. Bunlar cıva (Hg), kadmiyum (Cd) ve kurşun (Pb)’dur. Bu metalleri vücutta alınım miktarını düzenleyen bir mekanizma bulunmamaktadır (Clarkson, 1993; Ballatori, 2002; Zalups, 2000; Zalups ve ark., 2003). Bazı metaller, metabolik olarak benzedikleri elementlerin yerine geçerek toksik etki gösterirler. Örneğin kurşunun merkezi sinir sistemini (MSS) etkilemesi, kalsiyuma benzer metabolizmasıyla; hem metabolizmasını etkilemesiyle de demir ve çinkonun yerini alması ile açıklanır. 21 1.3.2 Demir 1.3.2.1 Demir Metabolizması Demirin biyolojik önemi eski çağlardan beri bilinmektedir. Demir, vücudumuz için son derece önemli bir elementtir ve birçok metabolik olayda hayati rol oynamaktadır (Smith, 1990). Demir elektron alıp verme özelliğinden dolayı dokulara oksijen taşınması, enerji yapımı, DNA, RNA, protein sentezinde görev almakta ayrıca; oksidatif metabolizma, hücre büyümesi ve çoğalmasında, esansiyel reaksiyonların katalizinde kullanılan ve pek çok yaşamsal önemi olan enzimin yapı ve fonksiyonunda görev yapan demir, yaşam için vazgeçilmez bir elementtir. Kolaylıkla ferröz (Fe+2) ve ferrik (Fe+3) şeklinde değişebilen redoks kimyası ile insan yaşamı demire bağlıdır ve demir metabolizmasındaki değişiklikler insan sağlığını önemli şekilde etkilemektedir (Ganz, 2006; Ganz, 2004; Beutler, 2006; Ponka, 1997; Andrews., 1999). Hb ve miyoglobin yapımı ile diğer sitokrom, sitokrom oksidaz, peroksidaz ve katalaz gibi maddeler için demir kritik önem taşımaktadır. Demirin ana görevi aynı zamanda hemoglobinin bir parçası olan Hem’i oluşturmaktır. Kanda oksijen taşımakla görevli olan Hb’nin görevini yapabilmesi için yapısında demir bulunması gereklidir. Hb, vücutta bulunan tüm demir miktarının üçte ikisini bünyesinde bulundurur. Oksijen ayrıca kastaki diğer bir hem proteini olan miyoglobin ile bağlanır. Son yıllarda hücresel düzeyde yeni proteinlerin keşfi ile moleküler kontrol, emilim, depolanma ve organizma demir döngüsünün moleküler yolları ile ilgili demir metobolizmasında çok büyük değişiklikler ve ilerlemeler olmuştur (Ganz, 2006; Ganz, 2004; Bülbül, 2004). 1.3.2.2 Demirin Vücutta Dağılımı İnsanda toplam vücut demir miktarı ağırlık, Hb konsantrasyonu, cins ve yaşa bağlı olarak değişir. Tam zamanlı doğan bir yenidoğanda 75 mg/kg olan vücut demiri bulunur ve bir yaşında 40-50 mg/kg’a kadar düşer (Oski ve ark, 1982). Erişkinlerde bu miktarlar daha düşüktür. Yetişkin erkekte yaklaşık 35–45 mg/kg ve premenopozal 22 kadınlarda yaklaşık 35 mg/kg total vücut demiri bulunur. Demir metabolizması iki cins arasında farklılık göstermez, normal değerler arasındaki farklılık kadınlarda demir eksikliğinin yaygın olarak görülmesinden kaynaklanır (Andrews, 1999). Şekil 1.16. Erişkinde vücut demir dağılımı (Andrews N., 1999). Normal yetişkin bir bireyde toplam vücut demiri yaklaşık olarak 4gr (3-5gr) civarındadır (Hagar ve ark., 2002). Vücuttaki demirin bileşiklerdeki dağılımı yüzdelik olarak incelendiğinde, ortalama olarak Hb’de % 70, ferritin ve 23 hemosiderinde % 25, miyoglobinde % 3-4, transferrin, % 2’si hücreler arası sıvıda, % 0.1’i sitokromlarda, % 0.1’i demir-enzim komplekslerinde, % 0.1’i plazmada transferrine bağlı olarak bulunur (Atanasiu ve ark., 2006; Andrews, 1999) (Şekil 1.16.). Demir vücutta günlük 1-2 mg kadar kaybedilir ve diyetle alınan demirin sadece % 10’u (~1–2 mg) günlük kayıpları telafi etmek veya vücudun ihtiyacına göre depolanmak üzere kaybedilen demir bağırsak epitel hücreleri tarafından aynı oranda emilir (Gantz, 2006; Gantz, 2004; Pietrangelo, 2006). İnsanlarda demirin, yaşlanan eritrositlerden ve diğer kaynaklardan geri dönüşümü sıkı bir şekilde korunmaktadır. Yaşam süresini tamamlamış eritrositlerin yıkılması ile hergün yaklaşık 20 mg kadar demir açığa çıkar, eritrosit yıkımı sonrası demir yeniden dolaşıma verilerek transferrine bağlanır ve yeni kırmızı hücre prekürsörlerinin yapısına katılmak üzere primer olarak kemik iliğine dağılır (Kemik iliginin ihtiyacı olan yaklaşık 20 mg/gün’dür) ve 2,5 mg kadar demir tekrar hemoglobin yapısına girer (Gantz, 2006; Gantz, 2004; Pietrangelo, 2006). Doğurganlık çağındaki kadınlarda menstrüel evrede ve gebelik sırasında demir ihtiyacı belirgin olarak artmaktadır (Brittenham, 2000). Günlük demir gereksinimi çocuklarda ilk 6 ayda günde 10 mg, ikinci 6 ayda 15 mg’dır. 1-11 yaş arasında 10 mg/gün demir yeterli olurken, bu yaştan sonra 18 mg/gün demir ihtiyacı vardır. Günlük besinsel demir gereksinimi erkek 1mg, ergenlerde 2-3 mg, gebelerde 34mg’dır (Ulukol ve ark., 2004). Kanın her mililitresinde 0,4 mg demir vardır ve aylık 60 ml’lik menstrual kayıp, her ay ek olarak 20-30 mg’lık demir emilimi ihtiyacı oluşturur (Pettersson ve ark., 1994). 1.3.2.3 Demir Emilimi Demir önemli bir mikronutrienttir ve tüm hücreler için gerekli olan esansiyel bir elementtir. Yeryüzünde en fazla bulunan metallerden biri olan demir, canlıların metabolizması için anahtar bir elementtir. Demir, vücutta kullanılan protein ve enzimlerin tamamlayıcı bir parçasıdır (Andrews, 1998). 24 Demirin emilim yolu çok iyi bilinmemektedir. Demir emilimini belirleyen üç önemli etken; vücut demir depoları, eritropoez hızı ve alınan demirin biyoyararlanımıdır (Hallberg, 1987). Vücüttaki toplam demir miktarı büyük oranda demir emilimi sağlamaktadır. Eğer depo demiri azalırsa demir emilimi artar. Buna karşılık depo demiri yeterli ise demir emilimi azalır. Bu durum depo regülator olarak adlandırılır. Depo regülator sayesinde demir eksikliğinde demir emilimi iki veya üç kat artar (Buys ve ark., 1991). Eritropoezin efektif veya ineffektif olması eritroid regülator olarak adlandırılır. Eğer kırmızı hücre yapımı arttı ise intestinal demir emilimi de artar (Beutler ve ark., 2000). Hem içeren yiyeceklerin dışındaki yiyeceklerin içindeki demir, Fe+3 değerliklidir başka bir deyişle ferrik yapıdadır. Suda çözünme gibi bir yapısı olmadığı için, emilim gerçekleştirilemez. Demir gastrointestinal kanalın her bölümünden emilebilmekle birlikte, emilimin en fazla olduğu yer duodenum ve jejenumun üst kısımlarında gerçekleşir. Bağırsakların son kısmına doğru emilim giderek azalır (Hagar ve ark., 2002). Üst bölgesinden daha çok emilmesinin başlıca nedeni, bu bölgenin pH’sının, duodenumun ve diğer ince barsak bölgelerinin pH’sına göre daha asidik olmasıdır. Demir emiliminin ilk basamağında, duodenumun fırçamsı kenarlarında yer alan “ferrik redüktaz” enzimi, Fe+3 ferrik demiri Fe+2 haline, yani ferröz yapıya dönüştürür. Ferröz yapıdaki demir suda çözünür olduğundan emilebilir bir yapıya kavuşur. Böylelikle incebağırsak lümeninde, enterosite alınımı kolaylaştırılmış olur. Enterositin bağırsak boşluğuna bakan membranı üzerinde “divalent metal taşıyıcı 1 (DMT1)” yer alır. Ferröz demiri bağlar enterosit içine taşır ve enterositlerin bazolateral membranından plazmaya transferini kolaylaştırmak için enterositlerin villöz yüzeylerinin bazolateralinde lokalize bir protein olan hephaestin tarafından tekrar Fe+3 dönüşümü sağlanır (Yen ve ark., 2006) (Şekil 1.17.). Enterosit içideki demirin yapısı Fe+2 değerliğindedir. Bu değerlikteki demir, serbest radikallerin oluşumunu hızlandırdığından biyolojik ortamlarda toksik etki gösterir. Bundan dolayı hızlı bir işleme tabi tutulması gerekir. Herhangi bir işlemde kullanılmayan ve plazmaya transfer olamayan Fe+2 ikinci basamakta ya ferritin 25 olarak depolanır, ya da transferine bağlanıp dolaşıma katılmak üzere, ferroportin 1 (FPN 1) tarafından bazolateral membran boyunca taşınır (Feder ve ark., 1996). Şekil 1.17. Bağırsakta non-hem demir emilimi (Andrews N., 1999). Demirin, demir transfer eden hücreler olan enterosit, hepatosit ve makrofajlardan çıkışını sağlayan tek protein olan FPN aracılı salınımı, demir dengesinin önemli bir belirtisidir. Plazmada demiri bağlayan proteinin adı, apotransferrindir. Demir ile birleşmiş apotransferrine, transferrin (TfR) denir ve bu şekilde kan plazmasında taşınır. Demirin taşınmasında ana rolü oynayan glikoprotein yapısındaki transferin 26 molekülü, karaciğer parankim hücreleri tarafından yapılmaktadır. Dolaşıma salınan demir transferine bağlanmakta, demir ihtiyacı olan hücrelerin yüzeyinde bulunan transferrin reseptörü 1 (Tfr1) aracılığı ile hücrelere endositoz şeklinde alınmaktadır (Umbreit, 2005; Atanasiu ve ark., 2007; Fleming ve ark., 2005; Charlton ve ark., 1983; Layrisse ve ark., 1974; Baynes, 1996). Transferrin iki formda bulunur; tek molekül bağlayan tipine monoferrik (bir demir atomu içerir), çift molekül bağlayanına diferrik transferrin (iki demir atomu içerir) adı verilir (Andrews, 2000). Transferrin demir metabolizmasında ana rol oynar. Çünkü demir plazmada transferin ile taşınarak gereksinimi olan dokuya verilir. Hücrelerin çoğu demiri plazmadan transferrin aracılığı ile alır. Serbest demir eritrosite geçemez. Eritroid hücre içlerine demirin girebilmesi için transferrin reseptörlerine bağlanması gerekir. Bu reseptörlerin diferrik transferrine afiniteleri daha fazladır. Transferrin ile hücre yüzeyine gelen demir, hücre yüzeyindeki transferrin reseptörleri yoluyla hücre içine alınır. Endozom zarı üzerindeki H+ pompası enterosit sitoplazmasında bulunan H+ iyonlarını endozom içine pompalayarak içerinin pH’sını 6’ya kadar düşürür (Andrews, 2000). “Transferrin-demir” molekülünün hücre yüzeyindeki transferrin reseptörlerine bağlanmasından sonra “transferrin reseptörü-transferrin-demir kompleksi” endositozla hücre içine alınır. Asidik ortamda (pH:5.5’in altında) demir, transferrinden ayrılır ve sitoplazma içine ve buradan da mitokondriye hem sentezinde kullanılmak üzere bırakılır. Ayrılan demir hücre tarafından kullanılır ya da ferritin olarak depolanır (Roy ve ark., 2000a; Griffiths ve ark., 1999; Roy ve ark.,2000b). Endozomal asidifikasyondan sonra demirsiz kalan apotransferrinin, transferrin reseptörüne affinitesi yüksektir. Apotransferrin-reseptör kompleksi endositozla birlikte tekrar hücre yüzeyine transfer edilir. Hücre yüzeyinde nötral pH ile temas sonucu apotransferrin, reseptöre olan affinitesini kaybeder. Böylece reseptör yüzeyi, tekrar kullanıma uygun hale gelir (Hunt, 2001). Normal 8 günlük ömrü süresince transferin reseptörü yaklaşık olarak 100 kez bu işlemi yapar. Eritrositlerin olgunlaşması süresince yüzeylerindeki transferrin reseptör sayısı değişir. Eritrositler olgunlaştıkça bu reseptörler eritrositten ayrılır ve plazmaya geçerler. Plazma transferin reseptör konsantrasyonu eritropoez hızı ile orantılıdır (Thomas ve ark., 2002). 27 Hb sentezi için gerekli olan demirin ana kaynağı, dolaşımdaki yaşlanmış eritrositlerin dalak makrofajları tarafından fagosite edilmesi ile sağlanır. Yaşlı eritrositlerden salınan demir, transferin ile hızlı bir şekilde kemik iliğine taşınarak hemoglobin sentezinin ihtiyacı için kullanılır. Fazla olan demir ise ferritin ve hemosiderin olarak depo edilir (Gantz, 2006) (Şekil 1.18.). Şekil 1.18. Transferrin siklüsü (Andrews N., 1999). 1.3.2.4 Demir Toksisitesi Eşleşmemiş elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Bu tip maddeler, eşlenmemiş elektronlarından dolayı tepkimeye girme isteği oldukça yüksektir. Eşleşmemiş elektronun kazandırdığı en önemli özellik birçok radikal ile bu elektronun paylaşılabilinmesidir (Halliwell, 1994). Fe+3, Cu+2, Mn+2 ve Mo+5 gibi geçiş metalleri de ortaklaşmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar. Serbest radikaller pozitif yüklü, negatif yüklü veya elektriksel olarak nötral olabilirler ayrıca organik veya inorganik moleküller şeklinde de olabilirler (Cheeseman ve ark., 1993). Ancak biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Moleküler oksijen (O2) iki eşleşmemiş elektrona sahiptir. Serbest radikallerin aerobik hücrelerde en önemli 28 tepkimeleri moleküler oksijen ve onun reaktif türleri (süperoksit anyonu ve hidroksil radikali), peroksitler ve geçiş metallerinin olduğu tepkimelerdir (Zwart ve ark., 1999; Valko ve ark., 2007). Klinikte sık kan transfüzyonu yapılarak aşırı demir yüküne maruz kalan hastalarda, serbest radikaller artarak dokularda hasar oluşmaktadır. talasemi majörlü hastalarda düzenli kan transfüzyonları ve etkin olmayan eritropoez sonucunda intestinal demir emiliminin tetiklenir ve organlarda demir birikimi gözlemlenir. Bu hastalarda; yaklaşık eritrosit 1-3 ünite transfüzyon 2-4 haftada bir tekrarlanır. Bu yaklaşık 15-20 mg/gün demir birikimine ve Hb katabolizmasından açığa çıkan demirin salınmasına neden olur. Daha sonra transferin tarafından bağlanan demir kalp gibi organlara taşınır. Kardiyak hasar, düzenli transfüzyon olan talasemi hastalarında demir depozisyonuna ve hasara neden olur. Bu şartlar altında demir depozisyonu miyofibrillerin kaybına ve kalp kasında miyositlerin bozulmasına neden olabilir (Kontoghiorghes, 2006). Oksidatif hasar durumunda ve demir gibi metal iyonlarının varlığında serbest radikallerin üretimi artar (Rund ve ark., 2000). β-talasemi hastalarında artmış α globin zinciri nedeniyle yüksek derecede oksidatif hasar gözlenir. Eşleşmemiş α zincirlerinin hem ile birleşme isteği, hem yarattığı oksidatif hasar nedeniyle eritrosit membranının antijenik yapısında değişiklik olmaktadır (Fridovich, 2001; Zwart ve ark., 1999). Serbest, eşleşmemiş, sağlam olmayan globin altbirimleri süperoksit ve hidroksil radikalini oluştururlar. Bunlar oksidatif hasar olaylarını başlatırlar. Önce methemoglobin oluşur, sonra geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz hemikrom olarak çökerler ve membranın çeşitli bileşikleri ile tepkimeye girerler. Hem ve globulini parçalarlar. Hemin yıkımı ile açığa çıkan serbest demir Fenton reaksiyonu yolu ile çok güçlü şekilde serbest radikal oluşumuna yol açmaktadır (Comporti ve ark., 2002). Fenton reaksiyonunda ferrik demiri ferröz demire indirgeyerek hidrojen peroksitle etkileşmeye uygun olan süperoksit radikalinin üretimine neden olur. Ferröz yapı Fenton tepkimesi ile ferrik forma tekrar yükseltgenirken ˙OH ve OH־ üretilir. Enterosit içine alınan demirin yapısı ++ değerliklidir. Bu yapıdaki demir, 29 serbest radikallerin oluşmasını artırdığından biyolojik ortamlarda toksik etki gösterir (Burton, 1989). O2˙ + Fe+3 → O2 + Fe+2 Fe+2 + H2O2 → Fe+3 + ˙OH + OH־ O2˙ + H2O2 → ˙OH + OH ־+ O2 Demirin indirgeyici özelliğinden dolayı proteine bağlanmayan demirlerin oluşturduğu demir birikimi toksik oksijen radikallerinin yapılmasına neden olur. Oluşan bu oksijen radikalleri protein hasarına, hücre zarındaki ve lizozom, mitokondri gibi diğer organellerdeki lipidlerin peroksidasyonuna aracılık ederek hücre ölümü ve organ yetmezliğine neden olur. Aşırı demir emilimi, transferrin, ferritin ve diğer demir bağlayıcı proteinlerin bozuklukları, önemli organlarda demir birikimi ile sonuçlanır. Organlar demir toksisitesine çok hassastır. Bu nedenle demir birikimi, kalp yetmezligi, siroz ve endokrin anormalliklere yol açar (Harrison ve ark., 2003; Birgens ve ark., 2007). Demir başlıca bağırsak hücreleri, safra, dışkı, tırnaklar, saç ve idrarla vücuttan atılır. Sağlıklı erişkin bir erkekte kaybın 1 mg/gün, kadınlarda ise menstrüasyonla kaybedilen demirin eklenmesi ile daha fazla olduğu saptanmıştır (Beutler, 2006). 1.3.3 Kurşun 1.3.3.1 Kurşunun Özellikleri ve Kurşun Maruziyeti Kurşun, yerkabuğunda doğal olarak bulunabilen, erime noktası düşük, mavi gri renkli ağır bir metaldir. Kurşun doğada nadiren element olarak bulunur. Kurşunun en çok rastlanılan cevherleri sülfür minerali galen (PbS) ve onun oksitlenmiş ürünleri olan serüsit (PbCO3) ve anglezittir (PbSO4). Bu mineraller arasında en önemli olan galendir. Kurşun çevrede doğal olarak bulunan ve periyodik tablonun IVA grubuna ait olan bir elementtir (ATSDR, 2007). 30 Kurşun yumuşak bir metal olduğu için erime ve kaynama noktaları oldukça düşüktür. Erime noktası 327, kaynama noktası ise 1600 0C’dir. Kurşun zehirlenmesi bakımından önemli olan nokta, 500-600 derecenin üzerindeki sıcaklıklarda kurşunun buharlaşmaya başlamasıdır. Doğal kurşun, (20.5–23%) ve 204 208 Pb (51–53%), 206 Pb (23.5–27%), 207 Pb Pb (1.35–1.5%) olmak üzere dört kararlı izotopunun karışımından oluşur. (ATSDR, 2007). Kurşun doğada fazla bulunmaz ancak kurşun madeni yatakları ve rezevleri yaygın olarak bulunur. Kurşun yataklarının işletilmesi bu metallerin endüstri dallarında yaygın olarak kullanılmasıyla kurşun tüm dünyaya kolayca yayılır. Kurşun başlıca doğaya antropojenik faaliyetlerin sonucunda yayılmıştır (ATSDR, 2007). Ağır metallerden biri olan kurşun doğada nadir olarak metal şeklinde bulunur genellikle iki ya da daha fazla elementle birleşerek kurşun bileşiklerini oluşturur ve çoğunlukla gümüş, bakır, çinko, antimon ve demir metalleriyle birleşmiş şekilde bulunur (ATSDR, 2007; Leita ve ark.,1991). Metalik kurşun hava ve su ile kolay tepkimeye girmediği için paslanmaya karşı dayanıklıdır. Kurşun bileşikleri havaya ya da suya maruz kaldığı zaman ince bir film tabakası oluşturur. Bu filmler paslanmayı durdurucu veya yavaşlatıcı bir koruyucu bariyer görevini üstlenirler (ATSDR, 2007). Kurşun ister metal, ister tuz (PbO, PbO2, Pb2O3, PbCO3, PbSO4) veya organik bileşik (Pb(C2H4)4) şeklinde olsun, toksik etkileri vardır. Toksisite genel olarak erime noktasıyla doğru orantılıdır (Hornick,1970). Etrafımızdaki doğal alanlarda ve canlı organizmalarda iz halinde kurşuna rastlanır. Canlı organizmada rastladığımız kurşun fizyolojik yaşam için gerekli olduğu için değil doğal çevrede, yiyecek ve içeceklerde bulunan kurşunun kaçınılmaz bir yansımasıdır (Leita ve ark.,1991). Çevredeki kurşun başlıca hava yolu, besinler ve içme sularıyla organizmaya ulaşır (Piomelli, 2002). Kurşun su, toprak ve hava arasında doğal, kimyasal veya fiziksel yollarla çevrilmektedir. Suda farklı formlarda bulunabilmektedir. Kurşun yoğun olarak 31 toprakta tutulmaktadır, yüzeysel akarsularda ya da yeraltı sularında çok az rastlanılmaktadır. Havada parçacık şeklinde bulunur, yağmur ve yerçekiminin etkisiyle uzaklara taşınmaktadır (ATSDR, 2007). Kurşun kolay bükülür ve kurşuna kolayca şekil verilir. Kurşun alaşımları oluşturulmak üzere diğer metaller ile kombine edilebilir. Kurşun ve alaşımlarının, paslanmaya karşı olan direnci, yüksek yoğunluğu, erime noktasının düşük olması, asit rezistansı ve kurşunun kolay işlenebilen bir metal olmasından dolayı endüstride oldukça fazla kullanılır. Kurşun akü üretiminde, boru, cephane ve kurşun bileşikleri, pil, kurşun levha, radyasyon kalkanı, tahta kaplama, jet yapımı, lehim, seramik cilası, kablo kaplamasında, cam yapımında kullanılır (ATSDR, 1997). Kurşun fazla kullanılmasından dolayı endüstrileşmiş toplumlarda insan sağlığını tehdit eden toksik bir elementir. Sanayi devrimi sonrası insanlarda kurşun maruziyeti artmıştır (Flegal ve ark., 1992). Kurşuna çeşitli çevresel kaynaklardan düşük düzeyde maruz kalındığında bile toksik etkiler gözlenmektedir. Kurşun bazlı boyalar en önemli maruziyet kaynaklarından birisidir. Eski kurşun bazlı boyaların yenilmesi, solunması ve dermal yolla temas edilmesi yaygın olarak kurşun maruziyeti yollarından birisidir. 1978’e kadar çoğu ev boyaları %40 oranında kurşun içermekteydi (ATSDR, 2003). Kurşun maruziyetinin en önemli kaynağı kontamine yiyecekler, solunan hava, içme sularıdır. Kurşun ve formlarının etkilerine özellikle çocuklar daha hassastır. Çocuklar toksik metallere kontamine olmuş topraklarla oynaması ve bu toprağı yanlışlıkla sindirmesi sonucunda maruz kalır (ATSDR, 2003). Su borularında kullanılan kurşun kaynaklar ve eski evlerde bulunan kurşun tesisatlarda, kurşunun suya karışmasına sebep olabilmektedir. Kurşun aynı zamanda cilalanmış seramiklerde bulunur ve kurşun boyalarla boyanmış kaplarda saklanan yiyecekler yoğun miktarda kurşun içermektedir (ATSDR, 2007). Almanya ve bununla beraber diğer gelişmiş ülkelerde 1971’de boya maddelerindeki, 1979’da ise yemek saklama kutularındaki kurşun kullanımını sınırlayıcı yasalar çıkarılmıştır. Bazı saç boyaları ve kozmetik ürünlerinde bulunan birçok pigment kurşun bileşikleri içermektedir (ATSDR, 2007). Kurşunlanmış kristaller, sigara içimi, kurşun lehim kullanılan 32 konserve kutuları, bazı ülkelerden ihraç edilen oyuncakların da önemli miktarda kurşun içerdiği bilinmektedir (EPA, 2002). Her yıl tahmini olarak 0.5-1.5 milyon kişi çalıştıkları yerde mesleki kurşun toksisitesine maruz kalmaktadır (ATSDR, 2003). 1920’li yıllarda kurşun bileşikleri (Kurşuntetraetil Pb(C2H5)4) benzine eklenmeye başlanmıştır. Kurşunun bu tip kullanım alanı ekolojik sisteme dağılmasında büyük bir rol oynamıştır. Bugünlerde kurşunsuz benzinin kullanılmasıyla yeryüzün kurşun yayılımı azalmıştır, fakat kurşunsuz benzin bileşiminde yer alan kurşun çoğu birincil metal üretim aşamasından yeryüzüne kurşun ve bileşiklerinin yayılımı devam etmektedir (Baldwin ve ark., 1999). 1.3.3.2 Kurşun Absorbsiyonu ve Metabolizması Kurşun çok yönlü etkileri olan bir elementtir. Anorganik kurşun inhalasyon, oral ve dermal maruziyeti sonrasında absorbe olabilir. Kurşun en fazla solunum yoluyla ve az miktarda da sindirim kanalından vücuda alınır (ATSDR, 1999). Solunum yoluyla alınan kurşunun % 40’ı absorbe olup, kan dolaşımına katılırken sindirim kanalından alınan kurşunun ancak % 10-15’i absorbe olmaktadır. Organik kurşun bileşiklerinin deri yoluyla da absorbsiyonu olabilir. Bu nedenle zehirlenme bakımından solunum yolu ile maruz kalma daha önemli olmaktadır (Phillip ve ark. 1994a). Solunum yoluyla alınan kurşunun büyük bir kısmı solunum sisteminin çeşitli bölümlerinde tutularak birikim meydana gelir. Bir kısmı savunma sistemi tarafından tutularak atılır ve bir kısmı da absorbe edilerek kana geçer. Solunum sisteminde biriken partiküllerin büyüklüğüne, bileşiğin biyolojik sıvıda erime özelliğine ve solunum kapasitesine bağlı olarak azalıp çoğalır (ATSDR, 1999). Kurşun vücutta depolanan bir metaldir ve vücuttaki birikim yeri zamanla değişebilir. Kurşun ve diğer toksik metaller ilk olarak kan akımının fazla olduğu, dokunun toksik maddeye duyarlılığı, permeabilitesi ve toksik maddenin hemen uygun bir bağlanma bölgesine gelmesi ile ilgilidir. Toksik madde bu bağlanma bölgelerinden zaman içerisinde kan akımının az olduğu bölgeye ancak daha çok birikim olanağı olan bölgelere dağılabilir. Anorganik kurşunun birikimi ve dağılımı buna örnektir. Kan dolaşımındaki kurşun eritrositlere bağlanarak taşınır ve emilen 33 kurşunun %99’u 30-35 gün süreyle dolaşımda eritrositlere bağlı olarak bulunur (Silbergeld ve ark., 1988). Emilen kurşun, kana geçerek kısa zamanda dengeye ulaşır, kan dolaşımı yolu ile çeşitli organlara aort, kıkırdak, böbrek, pankreas, akciğer, dalak ve kaslara dağılır. En çok kemiklerde olmak üzere yumuşak dokularda ve parankimal organlarda da depolanır. Kurşun yaklaşık 20-30 yıl kadar kemiklerde depolanır. Yaşın ilerlemesiyle birlikte kemikteki kurşun miktarı belirgin olarak artar (Wittmers ve ark., 1988). Bireyin gıda tüketimi ve gıda tüketim sıklığı kurşunun sindirim sistemindeki emilimini etkilemektedir. Açlık durumunda kurşunun emilimi, çok daha fazladır (Ahamed ve ark., 2007). Gastrointestinal emilim beslenme durumuna ve yaşa bağlı olarak değişir (Ziegler ve ark. 1978). Magnezyum, fosfat, alkol ve yağ alımı da kurşun emilimini azaltmaktadır (Barltrop, 1975; Barltrop, 1979). Demir eksikliği olan kişilerde kurşun emilimi ve birikimi daha fazladır. Kalsiyum düzeyi düşük diyet kurşun emilimini ve toksisitesini arttırır. Kalsiyumu az diyette kemikte kurşun birikir. Hamilelikte ve emzirme dönemlerinde kemikten salınır. Kalsiyum dengesini kurşun bozar. Kalsiyum desteği alımı kurşun absorpsiyonunu azaltır (Ahamed ve ark., 2007). Çinko ve kurşun emilim bölgelerinde ve enzimatik bölgelerde interaksiyona girmektedir. Çinko fareler üzerinde yapılan araştırmada tek başına ya da metiyonin ve tiamin’le beraber kurşun toksisitesini azaltmaktadır. Bu kombinasyonun kurşunun neden oldugu delta-aminolevulinik asit dehidrataz (δALAD) aktivitesinin inhibisyonunu azalttığı ve delta-aminolevulinik asit (δ-ALA) in üriner atılımını azalttığı görülmüştür (Flora ve ark., 1989; Flora ve ark.,1990). 1.3.3.3 Kurşun Toksisitesi Kurşunun sinir, hematopoietik, renal, endokrin ve iskelet sistemi gibi birçok organ sistemi üzerinde ciddi etkileri vardır (ATSDR, 2003c; Goyer ve ark., 1995; National Research Council, 1993). Kurşunun toksik etkilerine toplumdaki her kesim aynı derece hassas değildir. En hassas kesim; süt çocukları, hamile kadınlar ve kurşunla fazla teması olan meslek dallarıdır (Bushnell ve ark., 1986). Kurşun zehirlenmesi erişkinlere göre çocuklarda daha fazladır (Goyer ve ark., 1995; Needleman ve ark., 1990). Bunun nedenleri, solunum ve gastrointestinal sistemlerinde absorpsiyon 34 hızlarının daha fazla olması, ellerini kontrolsüz olarak daha fazla ağızlarına götürmeleri ve sinir sistemleri gelişmekte olduğundan toksisiteye karşı daha duyarlı olmalarıdır (Ahamed ve ark., 2007). Çocuklarda oral dozla suda çözülebilir kurşunun % 40-50’sinin emilimi gerçekleşiyorken, erişkinlerde bu oran % 3-10’dur (ATSDR, 2007). Çocuklarda fiziksel ve bilişsel gelişimde gerileme, dikkat dağınıklığı, duyma ve öğrenme zorluğu, başağrısı, konvülsiyon, ataksi, öğrenme bozuklukları ve hiperaktif davranışlar gibi nörolojik belirtilerle karakterize edilir (Goyer ve ark., 1995; Needleman ve ark., 1990). Nedeni tam olarak açıklanamamış olsa da, gebelik süresince kullanılan sigara ve alkolün anne ve kord kanı kurşun düzeylerini artırdığı gösterilmiştir (Ernhart ve ark., 1985). Kurşunun kardiyovasküler sistem üzerine etkileri çelişkilidir yapılan birçok klinik çalışmada kurşun zehirlenmesiyle kan basıncı arasında bir ilişki olduğunu vurgulamaktadır, oysa ikisi arasında böyle bir bağ yoktur (ATSDR, 2003c; Goyer, 1993) ancak; EPA kurşun zehirlenmesiyle kan basıncının arttığını kabul etmektedir (EPA, 1989). Kan kurşun düzeyinin 20-29 μg/dL düzeyine çıkması dolaşım sistemi ve kardiyovasküler sistem bozukluklarına bağlı ölüm oranını arttırmaktadır (Lustberg ve ark. 2002). İskelet sistemi özellikle kemikte kurşun birikimi için önemli bir yerdir. Bu birikim kemik hücrelerinin görevini riske atmakta hormonlara yanıt vermesini değiştirmektedir ve bunun sonucunda plazmada 1,25-dihydroxy-vitamin D3 düzeyini değiştirmektedir (Goyer, 1993; Pounds ve ark., 1991). Erişkinlerde vücuttaki kurşunun %94’ü, çocuklarda ise %73’ü kemiklerde bulunur (ATSDR, 2007). Çocuklarda yumuşak dokulardaki kurşun, erişkinlerden daha fazladır. Çoğunlukla yumuşak dokularda bulunan kurşunun yarılanma ömrü 2 aydır. Kurşunun kemikteki yarı ömrü 20-30 yıldır (Phillip ve Gerson, 1994a). Kurşunun vücutta zararsız sayılacak bir dozu belirlenmemiştir (Silbergeld, 2004); ancak Dünya Sağlık Örgütü (WHO)’nün son yıllarda önerdiği normal kan kurşun düzeyi "0" dır (Koller ve ark.,2004), Su ve ortamdaki maksimum kurşun dozu 35 kurşuna maruz kalan bireylerin kurşun toksisitesinin belirlenmesinde çoğunlukla kullanılan yöntem kan kurşun düzeyinin ölçümüdür (Silbergeld, 2004). Vücuttan atılımı da başlıca idrar yolu ile olur. Az miktarı dışkıyla, ter içinde, epitel deskuamasyon yoluyla ya da saç, tırnak kesilmesi, kadınlarda menstruasyonla ve emzirme sırasında sütle vücuttan atılabilir (Rabinowitz ve ark., 1976). 1.4 DNA 1.4.1 Genetik Polimorfizm Bir genin belli bir lokusta yer alan alternatif kopyalarından her birine allel adı verilir. Genel populasyonda alellerde bir karakter için iki veya daha fazla varyasyon bulunuyorsa ve bu varyasyonların her biri toplumda %1’den daha fazla sıklıkla görülüyorsa bu bireyler arasında bir fiziksel farklılık, hastalıklara yatkınlık veya direnç açısından bir farklılık yaratıyorsa bu duruma “genetik polimorfizm”, bulunma sıklığı %1’den daha az sıklıkta ise bu genetik değişikliklere “genetik mutasyon” denir. Polimorfizmler doğrudan hastalıklara neden olmayıp canlıların üreme kapasitelerini etkilemezler, bu nedenle nesilden nesile aktarılabildiklerinden frekansları fazladır. Mutasyonlarda ise canlıların üreme kapasiteleri ve canlılıklarını sürdürebilme özellikleri doğrudan etkilendiğinden toplumdaki frekansları fazla değildir (Gonzalez, 1999). 1.4.1.1 Polimorfizm Çeşitleri Polimorfizmler, genetik yapıda meydana gelen küçük değişimlerdir ve toplumun en az % 1'inde görülürler. Örneğin, bir genetik "harf" (genetik kodu oluşturan bir birim) bir diğeri ile yer değiştirebilir. Polimorfizmler vücutta değişik süreçlere neden olabilirler, sadece bir genetik harfi etkilerse buna "tek nükleotid polimorfizmi" (SNP) denir. SNP’lerin yanı sıra, delesyon/insersiyon adı verilen polimorfizmler de bulunmaktadır. Bu prolimorfizmlerde genin bir kısmı veya tamamının ‘silinmesi’ yani bulunmaması söz konusudur. Bu durumda genin ‘silinmiş’ versiyonuna ‘delesyon’, ‘silinmemiş’ versiyonuna ise ‘insersiyon’ adı verilmektedir. 36 1.4.1.1.1 Tek Nükleotid Değişim (Single Nucleotide Polymorphism:SNP) SNP’ler genetik bir lokusta farklı alleller oluşturacak biçimde spesifik bir bölgedeki bir baz veya bazlarda meydana gelen nokta mutasyonlarının neden olduğu polimorfizmlerdir (Şekil 1.19.). SNP insan genomundaki en basit ve en yaygın genetik polimorfizm çeşididir. Çoğunlukla her iki allelde de meydana gelir (Öktem ve ark.,2001). Bir kişideki kromozom ile diğer kişideki aynı kromozomu karşılaştırdığımız zaman aradaki fark tahmini olarak 7.51x10-4 olarak karşımıza çıkmaktadır (Miller ve ark, 2001). Buda bize ortalama her 1000 bazda bir nükleotit değişiminin ortaya çıktığını göstermektedir (Öktem ve ark.,2001). İki X kromozomu ve iki Y kromozomu farklı kişilerde karşılaştırıldığında X ve Y kromozomlarında sırasıyla her 2.132 ve 6.625 bazda bir tek nükleotit değişiminin görülmesi olasıdır (Miller ve ark, 2001). Şekil 1.19. Tek nükleotid polimorfizm (http://www.mygenetree.com/images/img-snps.jpg). Varyasyonun SNP olduğunun düşünülebilmesi için, populasyonun en az %1’ inde bulunması gerekmektedir. SNP’ler insan genetik varyasyonlarının %90’ını oluştururlar. Polimorfizimler genin farklı kalıtsal formlarını veya genomun farklı bölgelerini ayırt edebilmek için kullanılmaktadır (Öktem ve ark.,2001). 2001 yılında tamamlanan insan genom projesi’nden sonra birbiriyle ilişkisi olmayan farklı bireylerin genomları arasında %99’dan fazla benzerlik olduğu 37 anlaşılmıştır (Venter ve ark., 2001; Sachidanandam ve ark., 2001). Genom içerisindeki bu farklılık kodlanan ve kodlanmayan bölgelere dağılmasına göre tahmini 4,5 milyon tek nükleotid polimorfizimden meydana gelmektedir Aynı zamanda bu farklılıklar bireylerin birçok açıdan farklı niteliklerine sahip benzeri olmayan bireyler olmasında etkili bir rol oynamaktadır (Gareth ve ark., 2005). A ve G insanlarda en çok gözlemlenen tek nükleotit değişimidir. İnsanda tek nükleotit değişimlerinin dağılımı incelediğinde %63 A/G (ve T/C), %17 A/C (ve T/G), %8 CG, %4 AT ve %8 insersiyonu ve delesyonları saptanmıştır (Miller ve ark, 2001). Tek nükleotid değişim polimorfizminin bazı alt grupları vardır. Şekil 1.20. Transisyon ve transversiyonla tek nükleotid değişim oluşumunun şematik gösterimi. Transisyon: Dizi içindeki bir pürin bazının (A, G) diğer bir pürin bazına veya bir primidin bazının (T, C) diğer bir pirimidin bazına dönüşmesine transisyon denir. A, G→G, A C, T →T, C 38 Transversiyon: Dizi içindeki bir pürin bazının (A,G) bir primidin bazına (T,C) veya bir primidin bazının bir pürin bazına dönüşmesine transversiyon denir (Şekil 1.20.). A, G →T, C T, C →G, A İnsersiyon: DNA içerisine tek bir nükleotid ya da nükleotidlerin eklenmesine insersiyon denilmektedir. Nükleotidlerin eklenmesi, genin normal uzunluğundan daha uzun olmasına sebep olur. Bu protein kodlayan bir gen ise, proteinin amino asit dizisinde artış söz konusudur (Şekil 1.21.). Şekil 1.21. İnsersiyonla (nükleotid eklenmesi) şematik gösterimi (http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=insertion). İnsersiyonla tek bir nükleotid eklendiğinde bile çerçeve kayması meydana gelerek tüm proteinin amino asit dizilimi değişebilir bu nedenle sentezlenecek olan proteinin tamamen yapısı bozulabilir (Şekil 1.22.). 39 Şekil 1.22. Çerçeve kayması oluşumunun şematik gösterimi (http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=frameshift). Delesyonlar: DNA dizisi içerisinden tek bir nükleotidin ya da nükleotidlerin kırılıp ayrılması delesyon olarak adlandırılmaktadır. DNA üzerindeki bir delesyon, genin normal uzunluğundan daha kısa olmasına neden olur (Emir ve Özden, 2006) (Şekil 1.23). Şekil 1.23. Delesyon ile amino asit eksilmesinin şematik gösterimi (http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/mutationtypes?show=deletion). 40 1.4.1.1.1.1 SNP’lerin Protein Oluşumu Üzerine Etkileri Tek nükleotid polimorfizmi; DNA üzerindeki bulunduğu nokta ve oluş şekline göre, proteinin yapı ve fonksiyonu üzerinde değişik etkiler yapabilmektedir: Kodlanan bölgede oluşan sessiz (silent) bir SNP, amino asit farklılığı oluşturmuyorsa, sentezlenen proteinin yapı ve fonksiyonunda herhangi bir değişikliğe neden olmayacaktır. DNA üzerinde meydana gelen bir SNP, tesadüfen “Dur” kodonunu (TAA, TAG, TGA) oluşturuyorsa, SNP’nin bulunduğu noktadan itibaren protein sentezi duracak ve yarım kalan protein aktif bir şekilde fonksiyonlarını tam anlamıyla yerine getiremeyecektir. SNP, bir genin sentezi ile ilgili düzenlemeleri içeren promotor bölgede meydana geliyor ise; transkripsiyonla oluşan mRNA düzeyi ve stabilitesi, dolayısı ile gen ekspresyon düzeyi değişecektir (Williams ve Hayward, 2001). 1.5 DNA İzolasyonu DNA hücre içerisinde serbest halde bulunmaz. DNA’nın büyük bir kısmı hücresel materyallerde bulunur. DNA molekülleri inceleme aşamasına alınmadan önce hücresel materyalden ayrılmalıdır. Bazı kimyasal maddeler ve enzimler ile canlı hücrelere ait hücre zarı veya canlı hücre duvarının yıkılıp DNA nın ortaya çıkarılmasına DNA izolasyonu denir. DNA hücre ortamından korunmak amacıyla hücresel proteinler tarafından koruma altına alınmıştır. Bu koruma kalkanı DNA analizlerini etkiler. Bundan dolayı, DNA molekülünden diğer proteinleri ve hücresel materyalleri ayırmak amacıyla farklı DNA izolasyon yöntemleri kullanılır. DNA laboratuvarlarında DNA ekstraksiyonu için üç farklı yöntem kullanılmaktadır: a) Organik (Fenol-Kloroform) İzolasyon b) Chelex İzolasyon c) FTA Kağıt 41 DNA izolasyonunda kullanılacak izolasyon yöntemi biyolojik materyalin özelliğine bağlıdır. Tam kan ile kan lekesi veya kemik dokusu farklı yöntemlerle izole edilmelidir. DNA izole edildikten sonra saf su ya da TE (tris-EDTA) tamponu içerisinde -200C’de saklanır (Butler, 2005). 1.5.1 Fenol kloroform İzolasyonu Fenol kloroform izolasyonu en çok tercih edilen yöntemlerin başında gelir. Fenol ile proteinler ve DNA parçaları birbirinden ayrılır ve uzaklaşmaları sağlanır. Fenol proteinlerin sekonder yapısını parçalayan denatüre edici bir ajandır. Fenol kloroform izolasyonu birçok kimyasalın arka arkaya eklenmesi ile gerçekleştirilir (Şekil 1.24.). Şekil 1.24. Ana hatlarıyla organik (fenol-kloroform) ekstraksiyonu (Butler 2005’ten derlenmiştir). 1) Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve proteinaz K: Hücre duvarlarını yıkar. Kromozomlar içinde bulunan DNA’yı koruyan proteinleri parçalar. 42 2) Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı: DNA’yı proteinlerden ayırmak için kullanılır. Fenol proteini bağlar. Kloroform fenolü bağlar. İzoamil alkol fenol fazı ile sulu fazın daha net bir biçimde ayrılmasını sağlar. DNA negatif yüklü suda çözünebilen ama alkolde çözünemeyen bir moleküldür. Santrifüj edildiğinde, istenmeyen proteinler ve hücresel atıklar sulu fazdan ayrılır ve çift sarmal DNA molekülleri bu sayede analiz için ayrıştırılır. Fenol kloroform izolasyonu, yüksek moleküler ağırlıklı DNA’nın izolasyonu için uygun bir yöntemdir. Ancak sağlığa zararlı kimyasalların kullanıldığı ve zaman alıcı bir yöntemdir. Ayrıca numune birkaç defa farklı tüpe alındıgı için kontaminasyon riski fazladır. Ancak yöntem ucuzdur ve her DNA laboratuarında dikkatlice uygulandığında yüksek verimlilikle kullanılabilir (Butler, 2005). 1.6 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction: PCR) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 1985’te ABD’nin Kalifornia eyaletinin Emeryville kentindeki Cetus Corporation adlı firmanın araştırmacılarından Kary B. Mullis tarafından bulunmuştur. Kary Mullis 1993’te bulduğu ve geliştirdigi PCR tekniği sayesinde Nobel Kimya Ödülü’nü kazanmıştır (Kubista ve ark., 2006). PCR, herhangi bir organizmaya ait DNA’daki dizisi bilinen herhangi bir bölgenin çoğaltılmasını sağlayan hücre-dışı bir DNA çoğaltma yöntemidir. PCR’ın prensibini, izole edilen veya patolojik materyalde bulunan hedef genetik materyallerin (DNA, RNA)’nın, istenilen bölgesine özgü kısa zincirli primerler yardımı ile, enzimatik olarak çoğaltılması oluşturmaktadır (Dinkel A. ve ark., 2004). Bu amaçla ısı döngü aygıtları kullanılarak DNA’nın özel bir bölgesinin defalarca çoğalması (replikasyonu) sağlanır. PCR analizi; moleküler biyoloji, insan genetiği, evrim, farmakoloji, toksikoloji, kriminoloji ve paleontoloji gibi çok geniş disiplinlerde; farmakogenetik ve toksikogenetik çalışmalarda, mutasyon ve polimorfizm çalışmalarında, adli tıpta, 43 in vitro mutasyon oluşturulmasında, genetik bozuklukların teşhisinde, sekanslama amacıyla DNA hazırlanmasında, enfekte hastalıklarda virüs ve bakterilerin teşhisinde, fosillerden DNA amplifiye edilmesi ve evrimin aydınlatılmasında, onkogenlerin belirlenmesinde, doğum öncesi genetik teşhis konulması gibi çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır (Butler, 2005; Wright ve Wynford-Thomas, 1990). 1.6.1 PCR’ın Aşamaları PCR reaksiyonu başlıca denatürasyon, primerlerin bağlanması (annealing) ve amplifikasyon (extension) olmak üzere üç aşamada gerçekleşmektedir (Dinkel A. ve ark., 2004) (Şekil 1.25.). Şekil 1.25. PCR Siklusunun basamakları (Andy, 1999). 44 1- Denatürasyon Aşaması: 90-95 0C’de gerçekleşir. Bu aşamada önce amplifiye edilecek DNA’nın çift zinciri açılarak tek zincirli hale geçer. DNA tek zincirlere ayrılana dek yaklaşık 5-15 dakika ısıtılır. Ayrılan bu zincirler yeni sentezlenecek DNA için kalıp görevini üstlenirler. 2- Primerlerin bağlanması ( Annealing) Aşaması: 17-35 nükleotidden oluşan DNA bölgesine özgün iki primer sıcaklığın 50-70 0C’ye düşürülmesiyle, tek zincirli primerle tek zincirli kalıp DNA arasında hidrojen bağları oluşur. Biraz kararlı bağlar oluştuğunda polimeraz, nükleotidleri eklemek üzere bağlanır. Primerler ilk basamakta ayrılmış olan kalıp DNA’nın hedef bölgelerine bağlanırlar. Bağlanma yeri hedeflenen DNA bölgesinin çoğalmaya başladığı noktadır. Bu basamakta primerleri oluşturan bazlar esas alınarak bulunan Tm değerine göre bağlanma ısısı belirlenir. Isıtılarak birbirinden ayrılmış DNA soğutularak baz çiftleri ile hibridize edilir ve bu basamağa primer bağlanması adı verilir. Şekil 1.26. PCR programı (http://www.genetiklab.com/altsayfa.php?giris_ID=1&tablo=tbl_yontemler). 45 3- Primerlerin Uzatılması (polimerizasyon, extention, elongation) Aşaması: 72 °C civarında gerçekleşir. Isıya dayanıklı bir DNA polimeraz olan Taq polimeraz reaksiyon ortamına ilave edilir. Polimeraz enzimi, nükleotidleri 5’ten 3’e doğru ekleyerek primerlerin uzamasını sağlar ve hedef DNA’nın iki zincirli bir kopyasını oluşturur (Şekil 1.26.). Bu üç basamak bir döngüyü oluşturur ve 30-40 defa tekrarlanır. PCR bir zincir reaksiyonudur, çünkü, yeni DNA zincirlerinin sayısı her döngüde iki katına çıkar ve yeni zincirler bir sonraki döngüde kalıp görevi görürler (Şekil 1.27.). Şekil 1.27. PCR ürünü Her döngü koşullara bağlı olarak değişir ancak ortalama 5dk. sürer ve istenildiği kadar tekrar edilir. DNA parçaları geometrik olarak artar. Teoride özgül DNA parçası; devir sayısı (n) ve başlangıçtaki hedef sayısına (t) bağlı olarak yaklaşık tx2n sayısına ulaşır. Böylelikle incelenecek bölgenin milyarlarca kez çoğaltılmasıyla PCR ürününün kolay analiz edilmesi olanaklı hale gelir (Kubista ve ark., 2006; Bozkurt, ve ark., 2000; Nelson, 1991; Siqueira, 2003; Butler, 2005). (Şekil 1.28.). 46 Şekil 1.28. PCR ürünü çoğaltılma sayısı. 1.6.2 PCR Bileşenleri Bir PCR döngüsü için gerekli olan beş ana madde vardır; kalıp DNA örneği, çoğaltılacak bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik oligonükleotid primer; deoksinükleotit trifosfatlar (dNTP); yüksek ısıya dayanıklı Taq DNA polimeraz enzimi; kullanılan DNA polimeraz için uygun bir kimyasal çevre sağlayacak olan tampon karışımlardır (Wilson, 1997). 1) Kalıp DNA örneği: Nükleer, mitokondriyal, bakteriyal ve plazmid DNA olabilir. DNA herhangi bir biyolojik materyalden (kan, kıl, tükürük, vücut sıvısı, ter, tırnak, doku vd.) elde edilebilir. 2) Sentetik oligonükleotid primerler: DNA üzerindeki çoğaltılacak her bir bölge için bir çift (Forward:F ve Reverse:R) primer kullanılmalıdır. Primer tasarımında dikkat edilmesi gereken kurallar şunlardır: Primerde bazlar dengeli dağılmalıdır. 17-30 nükleotid uzunluğunda ve Tm (erime noktası) değerleri birbirine yakın olmalı, Primer dizisinde kendi içinde bağlanmaya neden olacak dizi bulunmamalıdır. Primer, kalıp DNA içindeki dizileri yanlışlıkla tanıyacak baz dizisine sahip olmamalıdır (Pusterla ve ark., 2006). 3) dNTP'ler (A,T,C,G): dNTP karışımındaki A, T, C ve G bazları eşit derişimde olmalıdır. 4) Taq DNA Polimeraz enzimi: Thermus Aquaticus adlı bakteriden elde edilen ısıya dayanıklı DNA polimeraz enzimidir. Tag DNA polimeraz, maksimum aktivite gösterdiği 72 0C’de dNTP'leri tanıyarak ayırabilme ve saniyede 47 yaklaşık 100 dNTP’yi diziye katabilme yeteneğindedir. PCR sırasında DNA sentezi yaparken zincirlerin sonlarına Adenin nükleotiti ekleyerek zincirden ayrılır. Taq polimerazın 5’-3’ egzonükleaz aktivitesi bulunmaktadır. Denatürasyon aşaması uzun olan PCR’larda Hot Star Taq DNA Polimeraz enzimleri tercih edilmelidir. 5) Tampon karışımı: Tampon içerisinde Tris, magnezyum (Mg), KCl, çeşitli deterjanlar ve tuzlar bulunur. Reaksiyon tamponunda kullanılan MgCl2 nonspesfik amplifikasyonu nötralize ederken, KCl, Taq polimeraz’ın sentez hızını artırmaktadır. Çizelge 1.2. Standart bir PCR’da bulunması gereken bileşenler ve miktarları. 50 μl’lik Reaksiyon Bileşen Tüpündeki Konsantrasyon 10X PCR Buffer 1X MgCl2 (25mM stok çözelti) 1-5mM dNTP mix Her birinden 0.2 mM Primer 1 0.2-0.5 μM Primer 2 0.2-0.5 μM Taq DNA Polimeraz 1.25-2.5 Unit Genomik DNA 200 ng 1.7 RFLP (Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi: Restriction Fragment Length Polymorphism) Yöntemi Restriksiyon enzimleri (RE), çift iplikçikli DNA’da spesifik bölgelerden kesim yaparak, DNA’dan bir genin veya gen taşıyan bir DNA segmentinin çıkarılmasında etkin fonksiyonları olan enzimlerdir. DNA’nın, bu enzimlerden bir veya birkaçı ile kesime uğratıldıktan sonra agaroz jel elektroforezine tabi tutulması ve sonra ethidium bromid ile boyanan jelde oluşan DNA bandlarının yeri ve sayısı kıyaslanarak elde edilen çeşitliliğe Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) adı 48 verilmektedir. Bu parçalar arasındaki fark, yer değiştirme veya mutasyon sonucu, DNA üzerinde tanınma bölgesinin kazanılması veya kaybedilmesi sonucudur (Şekil 1.29.) (Xue ve ark., 1993; McManus ve ark.,1994). Şekil 1.29. RFLP Tekniği ile canlılar arasındaki genetik farklılığın tespiti (Turan, 2002). DNA üzerindeki bu dizeler genellikle 4-6 baz çifti uzunluğundadır ve kendi içinde nükleotidlerin dizilimine ve nükleotid üzerindeki kesim noktasının durumuna göre farklılık göstermektedir (Green, 1998). Restriksiyon enzimleri ile kesim işleminden sonra; agaroz jelde görüntülenen farklı uzunluktaki bantlara göre, nokta mutasyonlar, polimorfizmler, insersiyon ve delesyonlar belirlenebilmektedir. RE’ler sadece o bölgeye spesifik olduklarından doğru ve güvenilir sonuçlarla alel tiplemeleri yapılabilmektedir (Dowling ve ark., 1996). 49 1970’lerde ilk restriksiyon endonükleazı Hamilton Smith ve Kent Wilcox tarafından izole edilmiştir (Roberts ve Macelis, 1991) ve bu buluştan sonra hızla gelişen rekombinant DNA teknolojisinde, protein üretiminde, gen dizilimlerinin belirlenmesinde ve polimorfizm çalışmalarında kullanılmaya başlanmıştır (Aggarwal, 1995). Bugün 230’un üzerinde farklı DNA dizilimini tanıyan, yaklaşık 3000’den fazla restriksiyon enziminin varlığından söz edilmektedir. RE enzimlerinin büyük bir kısmı bakterilerde, çok az bir kısmı da virüs ve ökaryotlarda bulunmaktadır (Murray, 2000; Pingoud ve ark., 1997). 1.7.1 Restriksiyon Endonükleaz (RE) Enzimlerinin Sınıflandırılması Şimdiye kadar üç değişik tipte restriksiyon enzimine rastlanmıştır. Her tip ayrı ayrı hem kısıtlama hem de modifikasyon (metilasyon) aktivitesini beraberinde göstermektedir ve çift zincirli DNA’yı kırmaktadır. Bu restriksiyon enzimleri birbirinden çok az farklılık gösteren üç farklı sınıfta tanımlanmıştır. Bunlar TipI, TipII ve TipIII’tür. TipII restriksiyon endonükleaz, kesme işleminde en sık kullanılan ve en önemli olanıdır. (Green, 1998) Tip I: Hem metilasyon hem de modifikasyon yapabilen iki fonksiyonlu enzimlerdir. Referans baz dizisini, 1000 baz çifti uzağından keser. TipI tarafından tanınan nükleotitler asimetriktir. Bu enzimler hedef dizilimlere bağlanmalarına rağmen kesimleri dizilim dışında tesadüfi olarak gerçekleşmektedir. Kesim olayında belirleyici faktör enzimin metilasyon aktivitesidir. Tip II: Referans baz dizisini tam içerisinden veya çok yakın bir bölgesinden kesen enzimdir. Restriksiyon Endonükleaz tip II Enzimleri nükleaz aktivitesi gösterirken enerjiye ihtiyaç duymazlar. Bu özelliklerinden dolayı moleküler genetik uygulamalarda tercih edilirler. Hemen hemen hepsi homodimer yapıdadır ve alt birim molekül ağırlıkları 30–40 kDa arasında değişmektedir. Tip III: Referans baz dizisini 24-26 baz çifti uzağından keser. Tip III restriksiyon enzimleri TipI enzimleri gibi; hem metilasyon hem de modifikasyon aktivitesini birlikte gösterir. Bu enzimler hedef dizilimlere bağlanmalarına rağmen 50 kesimi farklı bölgeden ve rastgele yapmaktadır. Kesim tanıma bölgesine çok yakındır (Marfurt, 2003; Murray, 2000; Pingoud ve ark., 1997; Meisel ve ark., 1995). Sonuçlar agaroz jelde görüntülenecekse ve kesim sonucunda birbirine yakın uzunlukta bantlar oluşuyorsa, bu yöntemle ayırım yapmak oldukça zor olmaktadır. Analiz için kaliteli ve fazla miktarda DNA’ya gereksinim duyulmaktadır. Enzim kesiminde inkübasyon süresinden dolayı uzun laboratuar çalışması gerektirmesi ve kullanılan enzimlerin pahalı olması gibi dezavantajları da bulunmaktadır (Dowling ve ark., 1996). 1.8 Gen Ekspresyonu 1. Replikasyon: DNA molekülünün, sakladığı genetik bilgilerin sonraki nesillere aktarılması için kendi kopyasını oluşturmasıdır. Bu aşamada DNA polimeraz, DNA ligaz, topoizomeraz gibi enzimler görev almaktadırlar. DNA’nın replikasyonu semikonservatifdir; bir DNA molekülünün iki kolundan her biri yeni bir DNA kolu sentezi için bir kalıp olarak görev görür ve sonuçta meydana gelen iki yeni DNA molekülü yeni ve eski kollar içerirler (Şekil 1.30.). Şekil 1.30. DNA replikasyonu. 2. Transkripsiyon: DNA’da saklanan genetik bilgilerin bir RNA molekülü (mRNA, tRNA, rRNA) şeklinde kopyalanması veya yazılması olayıdır. Transkripsiyonla, bir DNA kalıbından bir RNA molekülü sentezlenir. Bu basamakta 51 önce DNA öncül mRNA’ya dönüşür. Sonra “splicing: uç uca birleştirme” işlemi ile intronlar (öncül mRNA’dan çıkarılarak protein sentezine katılmayan DNA dizileri) çıkarılır ve ekzonlar (kesintilere uğramış bir genin olgun mRNA da yer alan DNA dizileri) olgun mRNA oluşumuna katılırlar. Bu işlem sırasında RNA polimeraz II enzimi görev almaktadır. Transkripsiyon, DNA sekansının RNA polimeraz enzimi ile mRNA’ya kopyalanması işlemidir. Diğer bir ifade ile DNA’da bulunan genetik bilginin RNA’ya aktarılmasıdır. Transkripsiyon işlemi, genetik kodu fonksiyonel bir proteine dönüştüren translasyon işleminin bir başlangıcıdır. 3. Translasyon: Transkripsiyonla RNA’ya kopyalanan, bir protein molekülüne ait genetik bilgilerin okunması veya bir protein molekülü haline çevrilmesine translasyon adı verilir. Şekil 1.31. Protein Sentezi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/est.html). Transkripsiyonda; DNA üzerinde bulunan, başlama noktasından gen bölgesinin sentezlendiği kısma doğru olan bölge “downstream”(+1…); başlama 52 noktası öncesinde bulunan ve kor promotor, promotor bölge ve TATA kutusu gibi gen sentezinin başlatıcılarını içeren bölge ise “upstream(…-1)” olarak tanımlanır. Transkripsiyonu yapılacak genin önünde bulunan, yaklaşık 250 nükleotid uzunluğundaki (-1 ile -250) transkripsiyonun başladığı bölgeye “promotor bölge” denilir. Bu bölgenin içinde bulunan ve TATA bölgesini de içeren yaklaşık 30 nükleotid uzunluğundaki (-1 ile -30) bölge ise “kor promotor” olarak isimlendirilir. Transkripsiyonu gerçekleştiren RNA Polimeraz II enziminin aktivitesini yapabilmesi için promotor bölgeye bağlanması gerekmektedir (Conaway ve Conaway, 1993; Butler ve Kadonaga, 2002). 1.9 Divalent Metal Transporter (DMT1) DMT1 (divalent metal transporter) demir alımını sağlayan en önemli proteinlerden biridir (Fleming ve ark., 2005). DMT1, aynı zamanda Nramp-2, DCT-1 ve SLC11A2 olarak da bilinir. İnsanda DMT1’in dört tane izoformu bulunmakta; (1A/+IRE, 1A/IRE, 2/+IRE ve 2/-IRE) ve 12. kromozomun 12q13 bölgesinde yer almaktadır (Şekil 1.32.) (Kayaaltı ve ark., 2011). DMT1 çok polimorfik bir gendir ve bu polimorfizmler demir metabolizmasında görev alan proteinlerin yapısını bozmaktadır. Proteinlerin yapısını etkileyen mutasyonlar insan sağlığında önemli olan demir metabolizmasının rolünü etkileyebilir. DMT1’in düzeninin bozulması demir eksikliğini tetikler. DMT1 geninde yer alan polimorfizimlerden biri de IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmidir ve intron 2 üzerinde yer almaktadır. Polimorfizmler genellikle genlerin kodlanan ve kodlanmayan bölgelerinde bulunabilirler. Şekil 1.32. DMT1’in 12.kromozom üzerindeki lokalizasyonunun şematik gösterimi (http://www.genecards.org). İnsanda DMT1 geni, 1671 bp uzunluğunda, 557 aminoasitten oluşan, 17 ekzon ve 3002 SNP noktası bulunan 3,6 kb’lık bir gen bölgesidir (Şekil 1.32). Bu 53 SNP’lerden biri de 12. kromozom üzerindeki 51399050. noktaya denk gelen nükleotiddir. Şekil 1.33. DMT1’in protein yapısındaki amino asitler. 1997’de Gunshin ferröz demir, kurşun ve diğer metal katyonların geçişini sağlayan memeli hücrelerinde bir metal transporterın keşfini yayınladı. Bu metal transporterın insan intestinal hücrelerinde kurşun ve demirin geçişini sağladığı gösterilmiş (Bannon ve ark., 2003) ve daha sonra Divalent Metal Transporter (DMT1) olarak adlandırılmıştır. DMT1 intestinal demir emilimi, eritroid demir kullanımı, karaciğerde demir birikimi ve plasental demir transferinde önemli rol oynamaktadır. DMT1 genel bir katyon taşıyıcıdır. DMT1’in önemli biyolojik fonksiyonu duedonumdan Fe+2 taşıma dışında , essential element olan Zn+2, Mn+2, Cu+2, Co+2, Ni+2 ve toksik metaller olan Cd+2 ve Pb+2 gibi diğer metalleri de taşır (Kayaaltı ve ark., 2010). DMT1 enterositin bağırsak boşluğuna bakan membranın üzerinde yer alır. DMT1 intestinal lümenden demir emilimi için ana yoldur. Bu transporterın ekspresyonu insanlarda demir ve kurşunun absorbsiyon durumu ile tutarlı olarak 54 duedonumda yüksektir (Gunshin ve ark., 1997). Demir eksikliğinde demir redüktaz ve DMT1 artar iken, demir fazlalığında azalır (West ve ark., 2008). Şekil 1.34. DMT1’in 3 boyutlu yapısı (http://www.uscnk.com/directory/Solute-Carrier-Family-11Member-2(SLC11A2)-4426.htm). Metal transporterın daha ileri tanımlaması demir yoksunluğu sırasında artmış kurşun absorbsiyonunu mümkün kılan biyolojik mekanizmaları açığa çıkarır. Düşük demir depoları varlığı sırasında duedonumda DMT1’in ekspresyonu, sadece demir absorbsiyonuna izin verecek şekilde değil, aynı zamanda kurşun absorbsiyonuna da izin verecek şekilde büyük oranda artar (Gunshin ve ark., 1997). Bir deneyde, insan hücrelerinde DMT1’in aşırı-ekspresyonu kontrollere kıyasla kurşun transportunda 7kereden daha fazla bir artışla sonuçlanmıştır (Bannon ve ark., 2002). DMT1’in yüksek düzeyde ekspresyonu kurşun absorbsiyonunda önemli bir artış için gerekli gibi görünmektedir. Watson ve ark. (1986) kurşun absorbsiyonunun demir absorbsiyonu normalin üzerinde yeterince iyi değerlere ulaşıncaya kadar artmayacağını gözlemişlerdir. Bannon ve ark. (2003) DMT1’in düşükten normal düzeylere kadar olan DMT1 ekspresyonunda kurşun absorbsiyonu DMT1 ekspresyonundaki değişiklikler tarafından etkilenemez. Bu nedenle normal oranda demir depolarındaki çeşitlilikte makul bir sistemin var olabilmesi kurşun absorbsiyonunda önemli bir artışa sebep olmaz fakat demir eksikliği sırasında olabilir, DMT1’in düzeyi artmış kurşun absorbsiyonuna neden olacak kadar yüksek olur. 55 Yeterli demir alımı kurşun absorbsiyonunu önleyen ikili bir fonksiyon olarak hizmet edebilir (Bannon ve ark., 2002). İlk olarak, demir alımı bağırsaktaki kurşun transporterların sayısını düşürür, çünkü duedonumdaki DMT1 düzenlemesi demir alımına karşı hassastır (Tallkvist ve ark., 2000; Morgan ve Oates, 2002). İkinci olarak, DMT1 demire karşı kurşundan daha fazla bir affiniteye sahiptir. Bağırsakta demirin varlığı yarışmalı olarak kurşun alımını engeller. Demirin DMT1 tarafından tamamen kurşun alımını inhibe etme yeteneği gösterilmiştir (Bannon ve ark., 2002). Demirin kurşun alımını yarışmalı olarak engelleyebilmesine rağmen kurşunun demir alımına karşı aynı şeyi yapabildiği açık değildir. Bunun yerine kurşun kadmiyuma benzer bir farklı mekanizma ile demir alımını sınırlayabilir. İnsanlarda fizyolojik mekanizması bilinmemekle birlikte DMT1 tarafından transport edilen kurşun gibi kadmiyum da divalent bir metaldir. Hücre içi demir arttığında ise barsak villuslarında DMT1 sentezi azalır, diyetle alınan demir emilimi azalır. Demir azaldığında ise tam tersi mekanizma işler. Böylece normalde ferritin ile duodenal mukozadaki DMT1 seviyesi arasında ters orantı mevcuttur (Zoller ve ark., 1999). 1.10 Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAS) Atomlaştırma, atomların absorbansının ölçülmesi için uygun duruma getirilmesini sağlayan bir yöntemdir. Atomik absorbsiyon analizi, temel enerji seviyesinde oluşturulmuş serbest analit atomlarının oluşturulmasına ve bu atom popülasyonuna özgü dalga boyundaki ışığın kullanılmasına bağlıdır. Diğer spektrokimyasal teknikler gibi atomik absorbsiyon spektroskopisi genellikle sıvı halde olmak üzere elementlerin konsantrasyonunun belirlenmesinde kullanılır. AAS, çözülmüş sulu çözeltilerin veya seyreltilmiş örneklerin veya organik çözücü gibi diğer çözücülerle seyreltilmiş elementlerin analizi için en uygun yöntemdir. Atomik absorpsiyon spektroskopisinde kullanılandığımız alevli ve grafit fırınlı atomik absorpsiyon spektroskopisidir. 56 1.10.1 Alevli Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAAS) En çok kullanılan atomlaştırıcı hücre tipi alevdir. Alev, kullanılan gaz, alevin kendi sıcaklığı, gazın akışı ve karıştırılma şekli, gazın boyutu ve biçimi ile karakterize edilir (Ramirez-Munoz, 1968). Cihazın çalışma yöntemi bakımından bir absorbsiyon tekniği olması nedeniyle, elementin ayırt edici özelliği olarak belirlenen ışık, örneğin içinden geçirilmelidir. Gerçekleşen bu durum düşük basınçta, bir soy gazla doldurulmuş bir cam kabuktan oluşan ve oyuk katot lambası olarak adlandırılan özel bir lambada meydana getirilir (Ewing, 1985). Çözeltideki çözünmüş örnek aleve girdiğinde uçucunun buharlaşma sıcaklığına kadar ısıtılır. Bunu takiben, yeterince yüksek sıcaklığa kadar ısıtılan katılar bileşiklerine ayrılırlar ve en sonunda elementel forma dönüşürler. Daha sonra gaz halindeki atomlar ışık kaynağından yayılan elektromanyetik radyasyonu emerler (Bennett ve Rothery, 1983). Alevli atomlaştırıcıyla yapılabilen ölçümler genellikle ppm seviyesindedir (Varian Australia Ltd., 1997). 1.10.2 Grafit Fırınlı Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi (GFAAS) Grafit Fırın metodunun prensibi; yüksek sıcaklıkta gaz halinde bulunan element atomlarının elektromanyetik ışınları absorblaması temeline dayanır. Grafit fırınlı atomlaştırıcılarla, alev yerini bir argon yatağında bulunan elektrikle ısıtılan grafit tüpe bırakır. Az bir miktarda örneğin bir grafit tüpüne yerleştirilmesiyle argon gazı, grafit tüpün hızlı bir şekilde yüksek uygulama sıcaklıklarına ulaşmasını ve kurutma ve külleme basamaklarıyla matriks bileşenlerinin ve diğer engelleyici maddelerin ışık yolundan uzaklaştırılmasını sağlar. Grafit tüpe verilen tüm analit atomlaşır ve atomlar grafit tüp içinde alıkonulur. Gaz fazında serbest analit atomların varlığı nedeniyle oluşan absorbans ölçülür (Holcombe ve Borges, 2006). Sonuç olarak, hassasiyet ve deteksiyon sınırları ppb seviyesine düşürülür (Varian Australia Ltd., 1997). 57 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1 Metal Analizi 2.1.1 Gereçler 2.1.1.1 Numuneler Tez çalışması için Adana Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Hematoloji Bölümü’ne düzenli olarak kan transfüzyonuna gelen 50 talasemili hastadan Eylül 2010 - Kasım 2010 tarihleri arasında kan örnekleri alındı. Çalışmada her gönüllü için belirlenen sağlık sorunu yanında; yaş, cinsiyet, sigara kullanımı ve süresi kaydedildi. Talasemi tanısı konmuş, 18–65 yaş arasında ve en az bir yıldır eritrosit süspansiyon transfüzyonu yapılan hastalar çalışmaya alındı. Talasemi dışında başka bir hematolojik hastalığı ve metal maruziyeti olan bireyler çalışmaya alınmamıştır. Bu kan örnekleri DNA elde etmek üzere kullanıldı. 2.1.1.2 Hasta Rızası Bu çalışmada yer alan tüm hastalar Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulları Araştırma Projesi Bilgi ve Taahhüt Formunda belirtilen kurallara uygun olarak hazırlanmış Bilgilendirilme Onam Formları doldurularak çalışmaya katılmıştır. 2.1.1.3 Kullanılan Kimyasal Maddeler Pb Standart Çözeltisi AA Standart Etanol pour SCP SCIENCE Fe Standart Çözeltisi AA Standart Etanol pour SCP SCIENCE Amonyumdihidrojen fosfat Merck Nitrik asit Merck Triton X Scharlau 58 2.1.1.4 Kullanılan Araç ve Gereçler Atomik Absorpsiyon Spektrometresi VarianAA240FSFast Sequantial Atomik Absorpsiyon Spektrometresi Varian AA240Z Zeeman Grafit Tüp Atomlaştırıcı Varian GTA 120 Grafit Tüpleri Varian GTA Hassas Terazi Mettler Toledo 4 digit Mikrodalga Fırın Mars Xpress Su Pürifikasyon Sistemi Human UP 900 Scholar-UV Santrifuj Heraeus Sepatech Labofyge 200 Otomatik Pipetler Ephendorf Etüv Memmert Cam Malzemeler Polipropilen, Kapaklı Tüpler (15, 25 ml’lik) Hava - Asetilen Tüpü Argon Tüpü Manyetik Karıştırıcı MIRAK Sample Cup 2 ml Vial Pothtech Elkay 2.1.2 Yöntem Çalışmamız iki bölümden oluşmaktadır. İlk bölümde toplumumuzdaki bireylerin DMT1 polimorfizmi belirlenmiş, ikinci bölümde ise tam kan örneklerinde Fe ve Pb düzeyleri ölçülerek DMT1 polimorfizmi ile ilişkisi olup olmadığı araştırılmıştır. 2.1.2.1 Örneklerin Alınması Kan örnekleri, Adana Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Hematoloji Bölümü’ne düzenli olarak kan transfüzyonuna gelen 28 erkek 22 kadın toplam 50 talasemili hastadan alınmıştır. Demir ve kurşun analizleri ve genetik çalışmalar için kullanılan kan örnekleri, antikoagulan olarak K2EDTA içeren mor kapaklı vakumlu tüplere alınıp soğuk zincirde korundu, genetik çalışma için gerekli 59 miktarda kan kurutulup ayrıldıktan sonra polietilen tüplere aktarılan örnekler çalışma zamanına kadar -20°C de saklandı. 2.1.2.2 Örneklerin Metal Analizi Tam kan örneklerinden 1’er ml alınarak üzerine 9 ml % 65 ‘lik HNO3 eklenerek mikrodalga fırına ait yüksek ısıya dayanıklı teflon tüplere kondu. Yakma işlemine ait mikrodalga fırın programı Çizelge 2.1.’de verilmiştir. Asitle yakılan kan örnekleri kapaklı 50 ml’lik polipropilen tüplere alınarak toplam hacim deiyonize su ile 20 ml’ye tamamlandı. Karışım vorteksle karıştırıldıktan sonra örnekler analiz işlemine kadar kapaklı polipropilen tüplerin içinde, +4 0C’ de saklandı. Çizelge 2.1. Mikrodalga fırına ait tam kan yakma programı. Max. Güç Güç % (Watt) 800 100 Zaman Sıcaklık Bekleme (dak.) (oC) (dak.) 15:00 200 5:00 Yakılmış olan örneklerin metal düzeyleri demir iz elementi için Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometre (Varian AA240FS Fast Sequantial Flame Atomic Absorption Spectrometry) cihazı ile, kurşun metali için ise Grafit Fırın Atomik Absorpsiyon Spektrometresi (Varian AA240Z Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry) ile belirlenmiştir. Demir ve kurşun analiz detayları bu sırayla aşağıda verilmiştir. 2.1.2.2.1 Tam Kan Örneklerinde Demir Analizi Demir analizi yönteminde kalibrasyon eğrisi oluşturmak amacıyla konsantrasyonu 1000 ppm olan demir ana stok çözeltisinden 5, 10, 20 ve 40 ppm’lik konsantrasyonlarda standart çözeltiler hazırlanmıştır. Hazırlanan standartlara piklerin düzgün çıkmasını sağlamak amacıyla 5 ml %65 saflıkta HNO3 eklendi. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her bir standart çözelti için ölçüm 3 kez tekrarlandı. Demir 60 analizine ait kalibrasyon grafiği ve kalibrasyon standartlarına ait veriler Şekil 2.1.’de özetlenmiştir. Konsantrasyon Absorbans %RSD CAL ZERO 0,000 ppm - 0,0007 7,6 STANDART 1 5,000 ppm 0,0470 0,1 STANDART 2 10,000 ppm 0,0867 1,0 STANDART 3 20,000 ppm 0,1736 1,2 STANDART 4 40,000 ppm 0, 3381 0,7 Şekil 2.1. Demir analizine ait örnek kalibrasyon grafiği. Alevli AAS cihazı ile demir analizi için Hava/Asetilen alev tipi kullanıldı ve hava akısı 13.50 L/dak, asetilen akışı 2.00 L/dak olarak ayarlandı. Dalga boyu 372.0 nm olarak ayarlandı. Piklerin ölçümü integrasyon modu ile, kalibrasyon hesabı ise konsantrasyon ile yapıldı. Kalibrasyon 20 örnekte bir tekrarlandı. Örnekler için 3 kez ölçüm yapıldı. Demir analizi için kullanılan metod Çizelge 2.2.’de özetlenmiştir. Çizelge 2.2. Alevli atomik absorpsiyon cihazı kullanılarak, kan örneğinde demir metalinin analizi için uygulanan metot. Element - matriks : Fe - Kan Enstrüman : Flame Konsantrasyon birimi : mg/L Enstrüman modu : Absorbans Örnekleme : Manuel 61 Kalibrasyon modu : Konsantrasyon Ölçüm modu : İntegrasyon Standart tekrarı :3 Örnek tekrarı :3 Ekspansiyon faktör : 1,0 Eğri çizimi : 7 noktalı Konsantrasyon ondalık aralığı : 3 basamak Dalga boyu : 372,0 nm Slit genişliği : 0,2 nm Gain : % 58 Akım : 5,0 mA Background : BC on Lamba Pozisyonu :1 Standart 1 : 5,000 mg/L Standart 2 : 10,000 mg/L Standart 3 : 20,000 mg/L Standart 4 : 40,000 mg/L Reslope standardı : Standart 2 Reslope alt limit : % 75 Reslope üst limit : % 125 Rekalibrasyon : 20 Örnekte bir Kalibrasyon algoritması : Linear Kalibrasyon alt limit : % 20,0 Kalibrasyon üst limit : % 150 Ölçüm Zamanı : 5s Okuma öncesi bekleme : 10s Alev tipi : Hava / Asetilen Asetilen akışı Hava akışı : 2.00L/dak : 13,50L/dak 62 2.1.2.2.2 Tam Kan Örneklerinde Kurşun Analizi Kurşun analizi yönteminde kalibrasyon eğrisi oluşturmak amacıyla konsantrasyonu 1000 ppm olan kurşun ana stok çözeltisinden 15ppb’lik ara stok hazırlandı. Bu stok cihaz tarafından 5, 10 ve 15 ppb’lik konsantrasyonlarda standart çözeltiler olarak belirlendi ve kalibrasyon eğrisi oluşturuldu. Hazırlanan standartlara piklerin düzgün çıkmasını sağlamak amacıyla 5 ml %65 saflıkta HNO3 eklendi. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her bir standart çözelti için ölçüm 3 kez tekrarlandı. Kurşun analizine ait kalibrasyon grafiği ve kalibrasyon standartlarına ait veriler Şekil 2.2.’de gösterilmiştir. Konsantrasyon Absorbans %RSD CAL ZERO 0,000 ppb 0,0034 9,6 STANDART 1 5,000 ppb 0,0723 1,9 STANDART 2 10,00 ppb 0,1487 1,8 STANDART 3 15,00 ppb 0,2301 2,4 Şekil 2.2. Kurşun analizine ait örnek kalibrasyon grafiği. Kurşun analizine ait grafit fırın sıcaklık program Çizelge 2.3.’te özetlenmiştir. 63 Çizelge 2.3. Kan örneklerinde kurşun analizine ait grafit fırın sıcaklık programı. Sıcaklık Zaman Akış Sinyal (oC) (s) (L/min) Toplama 1 85 5 0,3 × Hayır × Hayır 2 95 50 0,3 × Hayır × Hayır 3 120 15 0,3 × Hayır × Hayır 4 550 5 0,3 × Hayır × Hayır 5 550 5 0,3 × Hayır × Hayır 6 550 2 0,3 × Hayır × Hayır 7 200 6,1 0,3 × Hayır × Hayır 8 200 10 0,0 √ Evet √ Evet 9 2150 0,9 0,0 √ Evet √ Evet 10 2150 2 0,0 √ Evet √ Evet 11 2150 2 0,3 × Hayır √ Evet 12 2600 2 0,3 × Hayır × Hayır 13 2600 2 0,3 × Hayır × Hayır Step Okuma Kurşun analizi için dalga boyu 283,3 nm olarak ayarlandı, absorbans verisi 0 2150 C’de toplandı. Kalibrasyon 20 örnekte bir tekrarlandı. Örnekler için ise 3 kez ölçüm yapıldı. Atomlaştırıcı olarak grafit fırın, ortam gazı olarak Argon gazı kullanılmıştır. Kurşun analizi için grafit fırın teknikli atomik absorpsiyon cihazında uygulanan metod Çizelge 2.4.’te özetlenmiştir. 64 Çizelge 2.4. Kurşun analizi için grafit fırın teknikli atomik absorpsiyon cihazında uygulanan metod. Element - matriks : Pb - Kan Enstrüman : Zeeman Konsantrasyon birimi : ug/L Enstrüman modu : Absorbans Örnekleme : Otomatik Kalibrasyon modu : Konsatrasyon Ölçüm modu : Pik yüksekliği Standart tekrarı :3 Örnek tekrarı :3 Ekspansiyon faktör :1,0 Eğri çizimi : 7 noktalı Konsantrasyon ondalık aralığı : 2 basamak Dalga boyu : 283,3 nm Slit genişliği : 0,5 nm Gain : % 45 Akım : 10,0 mA Background : BC on Lamba Pozisyonu :1 Standart 1 : 5,00 ug/L Standart 2 : 10,00 ug/L Standart 3 : 15,00 ug/L Reslope standardı : Standart 2 Reslope alt limit : % 75 Reslope üst limit : % 125 Rekalibrasyon : 20 Örnekte bir Kalibrasyon algoritması : Doğrusal orijin Kalibrasyon alt limit : % 20,0 Kalibrasyon üst limit : % 150 65 2.2 DMT-1 Polimorfizmi 2.2.1 Gereçler 2.2.1.1 Kullanılan Kimyasal Maddeler Doku DNA izolasyon kiti Qiagen Restriksiyon Enzimi (Mnl1) Neb (New England Biolab) Primerler Alpha DNA, Montreal Etanol Merck Agaroz Prona Trizma Base Merck Borik asit Merck EDTA Merck DTT Sigma Etidyum Bromür Applichem 6X loading çözeltisi Qiagen Saf etanol Scharlau, Dop DNA’s RNA’s free water Qiagen Hot Star Taq DNA polimeraz Qiagen Fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) Applichem Sodyum dodesil sülfat (SDS) Applichem Sodyum klorür (NaCl) Merck Proteinaz K Merck 100 bp ladder Fermentaz Triton X Scharlau 66 2.2.1.2 Kullanılan Araç ve Gereçler Laminar Flow kabin Esco Thermal Cycle PCR cihazı Techne Tc 512 Jel Görüntüleme cihazı Syngene Yatay elektroforez cihazı Scie-Plas Güç Kaynağı Bio-Rad Su banyosu Nüve Bm 402 Otoklav Nüve Soğutmalı santrifüj cihazı Hettich Mikrodalga fırın Arçelik Elektrikli hassas terazi Schimadzu Libror Vorteks karıştırıcı Biosan pH metre Mettler Toledo Laptop Cooler (–20°C) Sigma 1.5 ml. ve 0.2 ml’lik ependorf steril tüpler Axygen Genuine pirojen free filtreli, pipet uçları Finntip (10 l, 100 l, 1000 l. ) Otomatik mikropipet Ependorf, Thermo, Tipor-V Etüv Memmert Santrifüj Heraeus Sepatech Labofyge 200 Manyetik Karıştırıcı Mirak Ph metre Seven Multi Mettler Toledo Su Purifikasyon Sistem Human Up 900 Mikrodalga fırın Mars X Press Hassas terazi Mettler Toledo 4 Digit 67 2.2.2 Yöntem 2.2.2.1 Sıvı Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu Sıvı kan örneklerindeki nükleer DNA’yı açığa çıkarabilmek amacıyla fenolkloroform-izoamil-alkol ekstraksiyon yöntemi kullanıldı. 1. Sıvı kan örneğinden 200 l alınarak 1,5 ml’lik ependof tüp içerisine konuldu. 2. Kan örneğinin üzerine 1000 l. TE konularak 12000 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. Alt faz 100 l kalıncaya kadar üst faz atıldı. Bu işlem 3 defa tekrarlandı. 3. Pelet üzerine; 45 l NaCl (1 M), 40 l SDS (%10’luk) 100 l TE ve 5-10 l proteinaz K eklenerek kısaca vortekslendi. 4. 560C’lik su banyosunda 1.5-2 saat inkübe edildi, 5. Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımından 500 l ilave edildi ve kısaca vortekslendi. 6. 2500 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. 7. Alt faz kıpırdatılmadan üst faz yeni bir ependorf tüpe alındı ve alt faz atıldı. 8. 1000 l soğuk saf etil alkol ilave edildi. 9. 10000 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi. 10. Alkol oluşan pelete zarar vermeden dikkatli bir şekilde atıldı. 11. 500 l %70’lik oda sıcaklığında etil alkol ilave edildi. 12. 10000 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. 13. Ependorf tüpün içerisinde bulunan tüm alkol dikkatlice atıldı. 68 14. Tüpün dibinde kalan alkol de tamamen uçurulduktan sonra 100 l DNAseRNAse free su ilave edildi. Tüm DNA örnekleri analizlere alınıncaya kadar -20 0C’de muhafaza edildi. 2.2.2.2 Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi Kan örneklerinden genomik DNA’nın izole edilip edilmediğinin analizi %2.5’lik agaroz jel elektroforezi ile belirlendi. 2.2.2.2.1 %0.5’lik Agaroz Jel Hazırlanması 1. 0.6 gr agaroz tartıldı ve 120 ml 1X TBE çözeltisi içerisinde çözüldü. 2. Mikrodalga fırında ağzı alimünyum folyo ile kapatılıp üzerinde delikler açılarak maksimum ayarda kaynatıldı. 3. Çözelti oda sıcaklığında 50–60 0C’ye düşünceye kadar bekletildi. 4. Üzerine 10 l EtBr (10 mg/ml) eklendi ve hafifçe çözelti pembeleşip homojen karışım sağlanıncaya kadar erlen çalkalandı. 5. Kalıbın bariyerleri takıldı ve jel tarakları yerleştirildikten sonra agar kalıba döküldü. Jel üzerinde hava kabarcıkları oluşmuş ise, jel katılaşmaya başlamadan hemen pipet ucu yardımı ile patlatıldı. 6. Jelin katılaşması için oda sıcaklığında 30–45 dakika bekletildi. 7. Taraklar ve bariyerler çıkarılarak kalıp elektroforez tankına yerleştirildi. Jel kuyucuklarının, yürüme tankının katot elektrot (-) tarafına yerleştirilmesine dikkat edildi. 8. Jelin üzerini 2–3 mm kaplayacak miktarda tank içerisine 1X TBE çözeltisi eklendi. 69 2.2.2.2.2 Agaroz Jel’e Yüklemek İçin Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları 1. 15 cm uzunluğunda parafilm kesilerek buz kalıbı üzerine yerleştirildi. 2. 1l 6X Jel Loading Buffer ve 5 l DNA örneği parafilm üzerine konuldu ve homojenizasyon için mikropipet yardımı ile yavaşça karıştırıldı. Şekil 2.3. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi. 3. Toplam 6 l karışım dikkatli bir şekilde, jeli delmeden, jel kuyucuklarına yerleştirildi (Şekil 2.3.). 4. Tank kapağı kapatıldı, anot ve katot uçlarının bağlantıları takıldı. 5. Güç kaynağı 100 volt ve 70 ampere ayarlanarak, numuneler 45 dakika jel üzerinde yürütüldü. 6. UV ışığında, Jel görüntüleme cihazında sonuçlar değerlendirildi. 2.2.2.3 PCR PCR işlemi TECHNE TC 512 Thermal Cycle cihazı ile gerçekleştirildi ve aşağıda belirtilen işlemler uygulanarak hedeflenen DNA bölgesinin her biri 235 defa çoğaltıldı. Her PCR analizinde kontrol amacıyla, pozitif ve negatif örnekler de kullanıldı. PCR işleminde kontaminasyonu önlemek amacıyla; 1. PCR ve DNA izolasyonları farklı ortamlarda yapıldı, 2. Her analiz öncesi ve sonrasında kullanılacak çalışma ortamı ve otomatik pipetler alkol ile temizlendi, 70 3. Steril tüpler ile filtreli pipet uçları kullanıldı, 4. Amplifikasyon ve enzim kesim işlemleri hava sirkülasyonlu laminar kabin içerisinde yapıldı, işlem öncesi ve sonrasında en az 45 dakika UV ışık kaynağı çalıştırıldı, 5. Analizler sırasında steril, pudrasız eldivenler kullanıldı ve sık sık eldivenler değiştirildi. 2.2.2.3.1 Primerler Amplifikasyon için Forward (F: direkt) ve Reverse (R: karşıt) primerleri kullanıldı. Primer çiftinden F primer DNA’nın bir ipliğine bağlanırken, R primer DNA’nın diğer ipliğine bağlanır. Primerlerin bağlanmasıyla hedeflenen bölgenin çoğaltılması başlatılmış olur. Primerler HPSF (High Performance Salt Free) yöntemi ile Montreal’deki Alpha DNA firmasına sentezlettirildi. Kullanılan primerler ve özellikleri Çizelge 2.6.’da (Kita ve ark. 2006). Çizelge 2.5. Amplifikasyonda kullanılan primerler ve özellikleri. F PRİMER R PRİMER 5’gacacatgcaatatctgacattg3’ 5’aggctactatccaacatgcag3’ (51399007-51399031) (51399335-51399357) Uzunluk 23 bp 21 bp GC içeriği %39,1 %47,6 Erime Sıcaklığı (Tm) 58,0 oC 57,0 oC ÖZELLİKLER Primerler arası Tm farkı 1,0 oC 351 bp PCR ürününün uzunluğu 5’GACACATGCAATATCTGACATTGtaaatccttttttcttgtgaggctggattttgttgcttcatatg 51399007-51399357 tgataacagaccaattatatcagtagttcaatggtgatgttcagtttaatctcttttcctctcttgtacagtactcttgttttagctt tcgtaaactctgggctttcaccggaccaggttttcttatgagcattgcctacctggatccaggaaatattgaatccgatttgc bazlar arasındaki sekansı agtctggagcagtggctggatttaaggtgaacatctagtcctacccctgtccttttaagcacataataccctctcacatccttt tctccacc CTGCATGTTGGATAGTAGCCT 3’ 71 2.2.2.3.2 PCR Bileşenleri ve PCR Programı Standart bir PCR reaksiyonun PCR Buffer, MgCl2, dNTP karışımı, Hot Star Taq DNA Polimeraz, F Primer, R Primer ve DNA bileşenleri bulunmaktadır. Çalışmada kullanılan 50 µl’lik PCR reaksiyonunun bileşenleri, bileşenlerin stok konsantrasyonları, reaksiyondaki miktarları ile reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonlarına ait bilgiler Şekil 2.7.’deki çizelgede verilmiştir. Çizelge 2.6. PCR bileşenleri ile stoktaki ve reaksiyondaki konsantrasyonları. 50 µl’lik Reaksiyon Stok Reaksiyona Konulan Konsantrasyon Miktar 10 X PCR Buffer 10X 5 µl 1X MgCl2 25 mM 3 1,5 mM dNTP karışımı 2mM 5 200 µM F Primer 10 pmol/ µl 1 µl 10 pmol R Primer 10 pmol/ µl 1 µl 10 pmol 5 U/ µl 0,25 µl 1,25 U DNA - - ~200 ng Steril H2O - BİLEŞEN Hot Star Taq DNA Polimeraz Karışımındaki Final Konsantrasyon 50 µl’ye - tamamlayıncaya kadar PCR programı aşağıda belirtilen şekilde gerçekleştirildi. + 94 0 C’de 10 dakika + 94 0 C’de 1 dakika (denatürasyon) + 60 0 C’de 1 dakika (eşleşme) + 72 0 C’de 1 dakika (sentez) + 72 0 C’de 5 dakika +4 0 C’de dakika 35 döngü 72 PCR ürünleri, agaroz jel elektroforezinde yürütülünceye kadar -20 oC’de muhafaza edildi. 2.2.2.3.3 PCR Ürünü İçin Agaroz Jel Hazırlanması PCR ürünleri %2’lik agaroz jel elektroforezi ile analiz edildi. Bunun için 2.4 gr. agaroz tartılarak 120 ml 1XTBE içerisinde çözüldü ve bölüm 2.2.2.2.1’de yapıldığı şekilde işleme devam edildi. 7 μl PCR ürünü ile 1l 6X Jel Loading Buffer karıştırılarak jel kuyucuklarına yüklendi. Her 6 numuneden sonra 100 bp DNA ladder’ı kullanıldı. 1l DNA ladder’ı, 1l 6X Jel Loading Buffer ve 6 l distile su karıştırılarak yükleme yapıldı. Jel, 100 Volt ve 70 Amperde 1 saat yürütüldükten sonra sonuçlar UV ışığında, jel görüntüleme sistemi ile değerlendirildi. 2.2.2.4. PCR Ürününün RFLP Yöntemi ile Kesimi Çalışmamızda, DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmini belirlemek için, amplifikasyon sonucunda oluşan PCR ürünü, Mnl1 Restriksiyon enzimi ile kesildi. PCR ürününün RFLP yöntemi ile kesim işleminde negatif ve pozitif örnekler de kontrol amacıyla analizlere alındı. 2.2.2.4.1. Mnl1 Restriksiyon Enziminin Özellikleri Bu çalışmada, Morexella nonliquefaciens bakterisinden elde edilen Mnl1 restriksiyon enzimi kullanılmıştır. (Şekil 2.4.). Şekil 2.4. Mnl1 restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ile kesim noktasının şematik gösterimi. 73 Mnl1 enzimi 5’ ucundan CCTC sekansını tanıyarak 7.bazdan, 3’ ucundan da GGAG sekansını tanıyarak 6. bazdan diziyi keser. 2.2.2.4.2. Mnl1 Enzim ile Kesim İşlemi Amplifikasyon ürünün kesimi için 30 μl’lik reaksiyon karışımı hazırlandı. Reaksiyon bileşenleri, bileşenlerin stok ve final konsantrasyonları Şekil 2.8.’de belirtildiği şekilde yapıldı. Çizelge 2.7. Mnl1 enzimi ile kesim işlemindeki bileşenler ve reaksiyondaki hacimleri. 30 µl. lik Reaksiyon BİLEŞEN Karışımındaki Hacimleri NEB4 Buffer 2 µl Bovine Seum Albumin (BSA) 0,2 µl Mnl1 Enzim 1 µl PCR ürünü 10 µl dH2O 30 µl’ye tamamlayıncaya kadar İnkübasyon; 37oC’de 1,5–2 saat yapılmış ve ürünler analizlerde kullanılıncaya kadar +4oC’de muhafaza edilmiştir. 2.2.2.4.3. Mnl1 Enzimi ile İnkübasyondan Sonra Agaroz Jel Hazırlanması Mnl1 enzimi ile kesim işleminden sonra oluşan baz çiftlerinin analizleri, bölüm 2.2.2.3.3’de anlatıldığı şekilde %2’lik agaroz jel elektroforezi ile gerçekleştirildi. Sonuçlar UV ışığında, jel görüntüleme sistemi ile değerlendirildi. 2.3 İstatistiksel analizler Tüm istatistiksel analizlerde SPSS V16 kullanılmıştır. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin frekansları direkt olarak hesaplanmış ve Hardy-Weinberg 74 eşitliğinde Haldane exact testi ile yapılmıştır. Katagorik veriler için χ2 testi, İkili grupların karşılaştırılmasında Mann Whitney U testi, İkiden fazla grupların karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis testi kullanılmıştır. Data ortalama±S.S ve median, minimum, maksimum değerleri kullanılarak verilmiştir. P<0,05 ve p<0,01 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. 75 3. BULGULAR 3.1 Toplumumuz Bireylerinde DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları Çalışmaya Eylül 2010 - Kasım 2010 tarihleri arasında Adana Çukurova Balcalı Araştırma Hastanesi Hematoloji Bölümü’nde düzenli olarak tedavi gören gönüllü hastalardan alınmıştır. Hastalar sık infeksiyon geçirme veya kronik hastalığı olmayan ve yaşları 18 ile 65 arasında değişen 50’dan hasta alındı. Çalışmaya alınan 50 hastanın 28’si (% 56,0) erkek ve 22’si (% 44,0) kadın hastaydı. Hastaların yaş ortalaması 28,0±9,0 yıl (Minimum:18, Maksimum:65; Ortanca:28) olarak hesaplandı. 3.2 Ölçülen Parametrelerin Tanımlayıcı İstatistikleri Talasemi hastalarında çalışılan örnekler için alınan metal sonuçları Pb, Fe metalleri ve HCT, Ferritin parametrelerinin ölçümleri yapılarak sonuçlarının minimum, maksimum ve ortalama değerleri ile standart sapmaları hesaplanarak Çizelge 3.1.’de gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Metal düzeyleri ve parametrelerin genel değerlendirilmesi. n Ortalama Pb (ppb) 50 37,53 Fe (ppm) 50 Hct (%) Ferritin (ng/mL) Standart Minimum Maksimum 17,71 20,99 108,66 901,58 196,08 306,95 1310,38 50 22,06 3,59 13,00 36,00 50 1605,08 728,58 580,00 3300,00 Sapma 3.3 Yaş Grupları ile Pb,Fe, HCT ve Ferritin Düzeyleri Arasındaki İlişki Fe, Pb metalleri ve HCT, Ferritin değerlerinin kandaki düzeyleri yaş bilgilerine göre istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Yaş aralıkları 18-40 ve 40 yaş üstü olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Sonuçlar çizelge 3.2.’de gösterilmiştir. 76 Çizelge 3.2. Kanda belirlenen metal düzeyleri ile yaş grupları arasındaki ilişkiye ait istatistiksel veriler. Fe (ppm) Pb (ppb) HCT (%) Ferritin (ng/mL) Yaş Grupları n Ortalama Yaş (18-40) 44 926,74 Yaş (40 ve üstü) 6 Toplam Standart Minimum Maksimum 181,80 471,97 1310,38 717,08 214,75 306,95 863,75 50 901,58 196,07 306,95 1310,38 Yaş (18-40) 44 38,30 18,73 20,99 108,66 Yaş (40 ve üstü) 6 31,98 4,61 25,41 37,53 Toplam 50 37,53 17,71 20,99 108,66 Yaş (18-40) 44 22,09 3,60 13,00 36,00 Yaş (40 ve üstü) 6 21,83 3,82 17,00 26,00 Toplam 50 22,06 3,58 13,00 36,00 Yaş (18-40) 44 1567,47 711,88 600,00 3300,00 Yaş (40 ve üstü) 6 1880,83 860,37 580,00 3000,00 Toplam 50 1605,08 728,58 580,00 3000,00 Sapma p 0,034 0,522 0,988 0,411 3.4 Agaroz Jel Elektroforezinde Genomik DNA’nın Yürütülmesi Çalışmada kullandığımız 50 kan örneğinin tamamı, DNA izolasyon işleminden sonra agaroz jel elektroforezinde yürütüldü. Her bir örneğin DNA’larının izole edildiği görüldü. 3.4.1 DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleot Polimorfizminin PCR Yöntemiyle Amplifiye Edilmesi DMT1, 12. kromozomun 12q13 bölgesinde lokalize olmuş, 1671 bp uzunluğunda ve 3002 SNP noktası bulunan bir gen bölgesidir. Bu SNP’lerden biri de 12. kromozom üzerindeki 51399050. noktaya denk gelen nükleotiddir. Bu noktadaki, DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi tipik bireylerde nükleotid C iken, atipik bireylerde A’ya değişim göstermektedir. 77 Kullanılan primerler ile amplifiye edilen bölgenin baz dizilimi aşağıdaki tabloda gösterilmiştir (Çizelge.3.3). Çizelge 3.3. PCR’da kullanılan primerler, kromozom üzerindeki lokalizasyonları ve amplifiye edilen bölgenin nükleotid dizilimleri. Koyu ve altı çizik olan “a” bazı 51399050. noktada bulunan ve A→C değişimini gösteren polimorfik nükleotiddir. Primerler 12. Kromozomda Primerlerin Bağlandığı Nokta Amplifiye Edilen Bölge (51399007-51399357) (351 bp) 5’GACACATGCAATATCTGACATTG 3’ 5’GACACATGCAATATCTGACATTGtaa F PRİMER (51399007-51399031) atccttttttcttgtgaggctggatttt gttgcttcatatgtgataacagaccaat tatatcagtagttcaatggtgatgttca gtttaatctcttttcctctcttgtacag tactcttgttttagctttcgtaaactct gggctttcaccggaccaggttttcttat gagcattgcctacctggatccaggaaat 5’ AGGCTACTATCCAACATGCAG 3’ R PRİMER attgaatccgatttgcagtctggagcag tggctggatttaaggtgaacatctagtc ctacccctgtccttttaagcacataata (51399335-51399357) cactctcacatccttttctccaccCTG CATGTTGGATAGTAGCCT 3’ 3.4.2 DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizminin MnlI Restriksiyon Enzimi ile Amplifiye Edilen Bölgenin Kesimi Sinyal peptitte bulunan tek bazlık değişme, restriksiyon enziminin tanıdığı sekans içerisinde bulunmakta ve değişimin var olduğu sekansı tanımamaktadır. Restriksiyon enzimleri kesecekleri bölgeyi tam olarak tanımadığı sürece o bölgeye yapışmamakta ve dolayısıyla kesme reaksiyonunu gerçekleştirememektedir. Dolayısıyla, değişimin var olmadığı DNA örneklerinde Mnl1 kesme reaksiyonunu gerçekleştirebilmekte; ancak değişimin bulunduğu DNA örneklerinde ise enzim, sekansı tanıyamadığı için bağlanamamakta ve dolayısıyla kesme reaksiyonunu gerçekleştirememektedir. 78 DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizm bölgesini de kapsayacak şekilde çoğaltılan 351 bp’lik PCR ürünü, C→A polimorfizmini belirlemek amacıyla; Mnl1 enzimi ile 37 oC’de 1,5–2 saat inkübe edildi. Şekil 3.1. Kesme enzimi, kesme bölgesi ve enzimin tanıdığı bölge. MnlI enzimi 351 bp’lik PCR ürününü; 5’ ucundan CCTC sekansını tanıyarak 7. bazdan, 3’ ucundan da GGAG sekansını tanıyarak 6. bazdan keser (Şekil 3.1.). 3.4.2.1 DNA Örneklerinin Genotiplendirilmesi Hasta gruplarına ait DNA örneklerinin genotiplendirilmesi, kesme sonrası jel analizi sonuçları baz alınarak yapılmıştır. Amplifiye PCR Ürünlerinin Kesilmesi ve DNA Örneklerinin Genotiplenmesi kesme sonrası jel analizlerinde üç farklı sonuç gözlendi. Bunlardan CC ve AA genotipleri homozigot olarak değerlendirilmektedir. CC genotipi, her iki allelinde de polimorfizm taşımaması açısından homozigot; AA genotipi, her iki allelinde de polimorfizm taşıması bakımından homozigottur. CA genotipi ise bir allelinde polimorfizm taşıyıp diğer allelinde taşımaması bakımından heterozigottur. 3.4.2.2 DMT1 IVS4+44 : “C/C” Genotipli Homozigot Tipik Bireyler Mnl1 enzimi, 351 bp’lik bölgeyi hem 5’ ucundan CCTC dizilimini tanıyarak 7. bazdan, hem de 3’ ucundan GGAG dizilimini tanıyarak 6. bazdan kesimini yapar. (Şekil 3.2.). Mnl1 enzimiyle kesme işleminin gerçekleştiği 351 bp’lik amplifikasyon ürününden; 33 bp, 35 bp, 100 bp, 183 bp uzunluğunda bant veren örnekler CC olarak genotiplendirildi (Şekil 3.3.) 79 Şekil 3.2. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot tipik C/C bireylerde, MnlI enzimi ile kesiminin şematik gösterimi. Şekil 3.3. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot tipik C/C genotipli bireylerde, MnlI enzimi ile kesimi ile oluşan bant uzunluklarının şematik gösterimi. 80 3.4.2.3 DMT1 IVS4+44: “A/A” Genotipli Homozigot Tipik Bireyler Mnl1 enzimi 351 bp’lik bölgeyi 5’ ucundan CCTC dizilimini tanıyarak 7. bazdan keser ancak 5’→3’ baz A olduğunda, Mnll enzimi 5’ ucundan CCTC dizilimine bağlanamaz ve bu bölgedeki kesim işlemini gerçekleştiremez. Bundan dolayı, “A”lı bireylerde Mnll enzimi, sadece iki noktadan kesim yapabilir (Şekil 3.4.). Şekil 3.4. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot atipik A/A” genotipli bireylerde, Mnll enzimi ile kesiminin şematik gösterimi. 81 Mnl1 enzimiyle kesme işleminin gerçekleştiği 351 bp’lik amplifikasyon ürününden; 35 bp, 100 bp, 216 bp uzunluğunda bant veren örnekler AA olarak genotiplendirildi (Şekil 3.5.). Şekil 3.5. 351 bp uzunluğundaki PCR ürününün “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin” homozigot atipik A/A genotipli bireylerde, MnlI enzimi ile kesimi ile oluşan bant uzunluklarının şematik gösterimi. Şekil 3.6. Mnl1 enzimi ile kesim sonucunda oluşan baz çiftlerinin bant uzunlukları 3.4.2.4 ”DMT1 IVS4+44”: “C/A” Genotipli Heterezigot Tipik Bireyler Mnl1 enzimiyle kesme işleminin gerçekleştiği 351 bp’lik amplifikasyon ürününden; 33 bp, 35 bp, 100 bp, 183 bp, 216 bp uzunluğunda bant veren örnekler CA olarak 82 genotiplendirildi. Sonuçlar jel görüntüleme cihazında UV ışık altında fotoğraflanarak değerlendirildi (Şekil 3.6.). 3.4.3 Mnl1 Enzimi ile Kesilen Baz Çiftlerinin Bant Uzunlukları DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizm bölgesini de kapsayacak şekilde çoğaltılan 351 bp’lik PCR ürününün Mnl1 enzimi ile kesim sonucunda oluşan baz çifti uzunlukları aşağıdaki tabloda gösterilmiştir (Çizelge.3.4) ve şematik olarak belirtilmiştir (Şekil 3.7). CA genotipli bireylerin tek DNA ipliğinde “C”, diğer DNA ipliğinde “A” bulunmaktadır. 351 bp’lik PCR ürününün Mnl1 enzimi ile kesim sonucunda; bir DNA ipliği, “C” genotipli bireylerde 33 bp, 35 bp, 100 bp ve 183 bp olarak dört bant gözlemlenir. Çizelge 3.4. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan genotipler ve MnlI enzimi ile kesim sonucundaki bant uzunlukları. GENOTİPLER Mnl1 Enzimi ile Kesilen baz çiftlerinin bant uzunlukları CC Homozigot tipik CA Heterezigot AA Homozigot atipik 33 bp + + - 35 bp + + + 100 bp + + + 183 bp + + - 216 bp - + + Diğer DNA ipliği ise “A” genotipli bireylerde, 35 bp, 100 bp ve 216 bp olarak üç bant gözlemlenir. Bundan dolayı, jel üzerinde ve UV ışık altında heterozigot genotiplilerin oligonükleotid bantları; 33 bp, 35 bp, 100 bp, 183 bp ve 216 bp olarak görülmektedir (Şekil 3.7.). 83 Şekil 3.7. 351 bp.lik PCR ürününün A aleli ve C aleli varlığında Mnl1 enzimi ile kesim sonucu oluşan bant uzunluklarının şematik gösterimi. 3.4.4 DMT1 IVS4+44 Tek Nükleotid Polimorfizminin Genotip Frekansı Kan örneklerinden yapılan genetik çalışmada, DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizminin toplumumuz bireylerinin C→A polimorfizmi ile oluşan genotiplere göre gruplandırılmış, 50 toplam bireye göre genotip frekansı Çizelge 3.5.’te gösterilmiştir (Çizelge 3.5.). Çizelge 3.5. Bireylerin DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan genotiplerin frekansı. Genotip Frekansı Polimorfizm (n:50) n % CC (Homozigot tipik) 15 30,0 CA (Heterozigot) 23 46,0 AA (Homozigot atipik) 12 24,0 84 3.4.5 DMT1 IVS4+44 Tek Nükleotid Polimorfizminin Alel Frekansı Kan örneklerinden yapılan genetik çalışmada, DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan alel frekansları (n:100) gruplandırılmış, 50 toplam bireye ait alel frekansı Çizelge 3.6.’da gösterilmiştir. Çizelge 3.6. Toplumumuz bireylerinde “DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile oluşan alellerin frekansı. Alel Frekansı Alel (n:100) (C/A) n % C 53 53,0 A 47 47,0 3.5 Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinin tespiti Çalışmamızda yapılan istatistiksel analizler sonucunda çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olduğu bulundu. Hardy-Weinberg uygunluk hipotezinin istatistik olarak karşılaştırılmasında χ2 testi kullanıldı. Bu işlemler sonucunda elde edilen bulgular Çizelge 3.7.’de gösterilmiştir. Çizelge 3.7. Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti. Hasta Sayısı Genotipler (n:50) Gözlenen Beklenen CC 15 14,05 CA 23 24,91 AA 12 11,05 Toplam 50 50 χ2 0,29 85 Elde edilen sonuçlara göre, χ2 cetvel değeri, α=0.05 önem düzeyinde ve df = 1 serbestlik derecesinde χ2=3,84 olup χ2hesap≤ χ2 cetvel yani 0,29 < 3,84 olduğundan populasyon gen bakımından Hardy-Weinberg dengesindedir. Bir populasyonda alel frekansları Hardy-Weinberg dengesinde bulunur. Belirli sabit şartlar altında her iki alelin frekansının ve genotipik oranının stabil kalması durumudur. Bu genetik dengenin sağlanabilmesi için aşağıda belirilen koşulların olması gerekmektedir; Yapılan istatistiksel analizler sonucunda çalıstığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olduğu bulunmuştur Populasyon genetik analizler için yeterli sayıda olmalıdır. Mutasyon gözlenmemelidir. Populasyondan dışarı ve içeri fazla sayıda göç olmamalıdır. Üreme tamamen rasgele olmalıdır. Hardy-Weinberg dengesi ise; p2 + 2pq + q2 = 1 eşitliği ile hesaplanmalıdır. p: birinci alelin frekansı q: diğer alelin frekansı. (Ayala ve Kiger 1980). 3.6 Fe konsantrasyonu ile DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması Fe konsantrasyonu ile DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi genotipleri karşılaştırıldı (Şekil 3.8.). 86 Şekil 3.8. Talasemi hastalarından alınan kan örneklerindeki Fe düzeyi ve DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması. 3.7 Pb kosantrasyonu ve DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması Pb düzeyi ile DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi genotipleri karşılaştırıldı (Şekil 3.9.). 87 Şekil 3.9. Talasemi hastalarından alınan kan örneklerindeki Pb düzeyleri ve DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotiplerinin karşılaştırılması. 3.8 Talasemi Hastalarında Metal Düzeylerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizmi genotipleri ile ilişkisi DMT1 IVS4+44 C/A tek gen polimorfizm genotipleri ve metal düzeyleri istatistiksel olarak değerlendirildi. Sonuçlar Çizelge 3.8’de özetlenmiştir. 88 Çizelge 3.8. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotipleri ile Fe ve Pb düzeylerinin istatistiksel değerlendirmesi. AC genotip METALLER Pb (ppb) Fe (ppm) Mak. Ortanca Ortalama±S.S. Min. Mak. Ortanca Ortalama±S.S. Min. 15 (%30) 31,26±8,01 20,99 46,47 30,87 1021,68±113,90 853,09 1179,21 1001,35 23 (%46) 33,23±6,11 23,13 43,05 35,07 884,32±208,07 471,97 1310,38 837,20 AA genotip 12 (%24) DMT1 gen polimorfizmi CC genotip n % 53,84±28,82 p 27,39 108,66 784,55±181,47 306,94 987,74 45,20 0,013* 806,07 0,002** *p<0,05 **p<0,01 3.9 Talasemi Hastalarında Metal Düzeylerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizminin alelleri ile ilişkisi DMT1 IVS4+44 C/A tek gen polimorfizm alel grupları ve metal düzeyleri istatistiksel olarak değerlendirildi. Sonuçlar Çizelge 3.9’da gösterilmiştir. Çizelge 3.9. DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid polimorfizmi alelleri ile Fe ve Pb düzeylerinin istatistiksel değerlendirmesi. DMT1 gen polimorfizmi A (+) (AC+AA) A (-) (CC) n % 35 (%70) 15 (%30) METALLER Pb (ppb) Fe (ppm) Mak. Ortalama±S.S. Min. Mak. Ortanca Ortalama±S.S. Min. Ortanca 40,29±19,78 23,13 108,66 35,56 850,11±202,43 306,94 1310,38 31,26±8,01 20,99 46,47 30,87 1021,68±113,90 853,09 1179,21 1001,35 p 0,048* 833,50 0,001** *p<0,05 **p<0,01 3.10 Talasemi Hastalarında Ferritin ve Hct parametrelerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizmi genotipleri ile ilişkisi DMT1 IVS4+44 C/A tek gen polimorfizm genotipleri ve ferritin, hematokrit parametreleri gösterilmiştir. istatistiksel olarak değerlendirildi. Sonuçlar Çizelge 3.10’da 89 Çizelge 3.10. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi genotipleri ile ferritin ve hematokrit parametrelerinin istatistiksel değerlendirmesi. DMT1 gen polimorfizmi n% METALLER Ferritin (ng/mL) HCT (%) Ortalama±S.S. Min. Mak. Ortanca Ortalama±S.S. Min. Mak. Ortanca 15 1669,33±825,26 580 3300 (%30) 23 1475,47±669,94 600 2563 AC genotip (%46) 12 1773,16±727,05 800 3300 AA genotip (%24) 0,463 p CC genotip 1900 22,53±2,41 18 26 24 1500 22,13±4,30 13 36 22 1700 21,33±3,44 15 26 22,5 0,603 3.11 Talasemi Hastalarında Ferritin ve Hct parametrelerinin DMT1 IVS4+44 C/A Tek Gen Polimorfizminin alelleri ile ilişkisi DMT1 IVS4+44 C/A tek gen polimorfizm alel grupları ve ferritin, hematokrit parametreleri istatistiksel olarak değerlendirildi. Sonuçlar Çizelge 3.11’de gösterilmiştir. Çizelge 3.11. DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi alelleri ile ferritin ve hematokrit rarametrelerinin istatistiksel değerlendirmesi. METALLER DMT1 gen polimorfizmi A (+)(AC+AA) A (-) (CC) p n% Ferritin (ng/mL) Ortalama±S.S. Min. Mak. 35 1669,33±825,26 (%70) 15 1557,54±694,25 (%30) Ortanca HCT (%) Ortalama±S.S Min. Mak. . Ortanc a 580 3300 1900 21,86±4,00 13 36 22 600 3000 1600 22,53±2,41 18 26 24 0,882 0,322 90 4. TARTIŞMA Metallerin toplumumuzdaki bireylerin kan ve idrarlarındaki normal ortalama değerlerinin ve aynı zamanda çevresel maruziyet sonucu metal düzeylerinin belirlenmesi yönünden önem taşımaktadır. Bu veriler genetik farklılıkların metal maruziyetinde ne denli etkili olabileceğini düşündürdüğünden metallerle doğrudan veya dolaylı etkileşen proteinlerin polimorfik yapısının önemli olduğunu düşündürmektedir. Talasemi hastalarında sürekli kan transfüzyonu yapılması nedeniyle demir birikmesi sonucu toksisite görülmektedir, bu çalışmada talasemi hastalığının tedavisi sürecinde kan transfüzyonu nedeniyle hastalarda ortaya çıkan demir birikimi yanında, kan kurşun düzeyi de belirlendi, metal taşıyan proteinlerden birisi olan DMT1 genindeki tek nükleotid polimorfizminin bu metallerin düzeylerine etkisi araştırıldı. Talasemi hastalığı, genellikle globin zincirinin yetersiz sentezi ya da hiç sentez edilmeyişiyle ilgilidir. β-globin geninde oluşan mutasyonlar β talasemiye ve anormal hemoglobinlere neden olmaktadır (Weatheral ve ark., 2001). β-globin zincir yapım mekanizması beta talasemi hastalarında bozuktur. Bu durumun tersine α geni etkilenmediğinden α globin zincir sentezi normal olarak devam eder. β-globin zinciri ile birleşemeyip açıkta kalan fazla miktardaki α-globin zincirleri Hb tetramerlerini oluşturamazlar (Rund ve ark., 2001; Weatherall, 2001a). Bununla birlikte, normal Hb molekülü oldukça kararlı suda çözünürlüğü yüksek olmasına rağmen talasemilerde dengesiz sentez sonucu biriken fazla α veya β zincirleri aynı özelliği gösteremez. Eritrosit içinde biriken fazla globin zincirleri çökelerek bu hücrelerin erken yıkımına neden olur. Bu durum, talasemilerde başarısız eritropoez ve hemolize neden olmaktadır (Kazazian, 1990; Lukens, 1999). Eritropoez hızı demir emiliminin tayininde rol oynar (Brittenham, 2000). Eritropoezin efektif veya ineffektif olması eritroid düzenleyicisi olarak adlandırılır. Eğer kırmızı hücre yapımı arttı ise bağırsaktan demir emilimi de artar (Beutler ve ark., 2000; Ganong, 1991), bunun sonucunda eritropoez ve retikilositozda veya β talasemi gibi inefektif eritropoezinde artmasına 91 neden olur (Conrad ve ark., 1993). Böylece β talasemi majör hem inefektif eritropoez hem de eritrositlerin yaşam sürelerinin kısalmasından kaynaklanmaktadır. β talasemide anemi, böbreklerden eritropoietin yapımının artışı için bir uyarıdır (Higgs, 2004). β talasemi majörlü hastalarda; düzenli kan transfüzyonları, etkin olmayan eritropoez nedeniyle bağırsakta demir emiliminin tetiklenmesi ve eritrositlerin hemolizi demir depolanmasına yol açmaktadır (Farmakis ve ark., 2003; Consolini ve ark., 2001). DMT1 özellikle ince barsağın ilk kısımlarında çok sayıda üretilir ve bağırsak lümeninden demirin emilimini artırır (Zoller ve ark. 1999). Çalışmamızda talasemili bireylerden alınan kan örneklerinde DMT1 polimorfizminin genotipleri (CC/CA/AA) ve Fe düzeyleri açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir ilişki bulundu (p=0,002). Homozigot tipik (CC) talasemili bireylerdeki Fe ortalamaları, heterezigot (CA) ve homozigot atipik (AA) bireylerin ortalamalarından daha yüksek bulundu. Yaptığımız çalışmada, A aleline sahip (A+) talasemili bireylerde A aleline sahip olmayan (A-) bireyler Fe düzeyleri açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu (p=0,001). Bu sonucu yorumladığımızda, (A-) talasemili bireylerde demir düzeyinin (A+) talasemili bireylere göre daha az olduğunu ve dolayısıyla da (A-) talasemili bireylerin, (A+) talasemili bireylere göre daha avantajlı olduğunu düşündürmektedir. Elde edilen bu sonuçlar homozigot tipik bireylerin heterezigot ve homozigot atipik bireylere göre genetik olarak daha fazla demir birikimine yatkın olduğunu göstermektedir. DMT1 mutasyona uğradığında ince bağırsaktan demir emilimi azalmaktadır. Böylelikle, homozigot atipik ve heterezigot genotiplere sahip olan talasemili bireyler, homozigot tipik genotipli bireylere göre daha avantajlıdır denilebilir. Zoller ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada normal bireylerde ince bağırsak lümeninde intrasellüler demir arttığında DMT1 sentezi azalmakta ve bunun sonucu olarakta diyetle alınan demir emilimi azalmaktadır. Buna karşı demir azaldığında ise tam tersi mekanizma işlemektedir. Normal bireylerde ferritin ile duodenal mukozadaki DMT1 seviyesi arasında ters orantı mevcuttur (p=0.001). Fakat, herediter hemokromatoziste ise bu denge bozulmuş olarak bulunmuştur (p=0.8). Herediter hemokromatoziste olduğu gibi, talesemili bireylerde demir birikimi 92 mevcuttur. Bizim çalışmamız ile Zoller ve arkadaşlarının yaptığı çalışmaların verileri kıyaslandığında aralarında uyumluluk görülmektedir. Çalışmamızdaki verilerimize göre, DMT1 polimorfizmi ile ferritin değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlılık olmaması bu durumu desteklemektedir (p=0,463). Bir diğer Thompson ve arkadaşlarının çalışmasında kullanılan Belgrat ratlarında DMT1 bölgesi mutasyona uğratılarak talasemili hastalara benzetilmiştir ve üç hafta boyunca demir ağırlıklı olarak beslemişlerdir. Bu homozigot genotipli ratlarda demir arttıkça Hct değerinin arttığı gözlemlenmiş, bununla birlikte hezerezigot genotipli ratların Hct değerinin homozigot genotiplilere göre belirgin olarak düşük olduğu görülmüştür (Thompson ve ark., 2007). Çalışmamızdaki sonuçlara göre DMT1 polimorfizmi ve Hct değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlılık bulunmamakla birlikte, ortalamalar açısından Thompson ve arkadaşlarının yaptığı çalışmayla uyumluluk görülmektedir. DMT1 sadece Fe+2‘e özgü değildir, demir yanında Mn+2, Co+2, Cu+2, Zn+2, Cd+2 ve Pb+2 gibi divalent metal iyonları için de taşıyıcı görevi görür (Andrews, 1999) ve hücre zarından aynı taşıyıcı ile taşındıklarından dolayı demir eksikliği durumunda artan DMT1 nedeni ile daha fazla emilirler (Leong ve ark., 2003), bu nedenle demir eksikliği durumunda kurşun toksikasyonuna sık rastlanmaktadır (Wright ve ark., 2003). Ancak DMT1, kurşun için tek taşıyıcı protein değildir. (Gruenheid ve ark., 1995; Gunshin ve ark., 1997). Pb ‘nun en iyi bilinen etkisi hem sentezi yolağındaki delta-aminolevülinik asit dehidrataz (delta-ALAD) enziminin inhibisyonudur. ALA porfobilinojen dönüşümünü katalizleyen delta-ALAD enziminin Pb ile inhibisyonu demirin protoporfin halkasına girişini inhibe eder. Bunun sonucunda hemoglobin ve hücresel solunum için gerekli olan Hem sentezi azaldığından anemi ve yorgunluk görülür (Needleman 2004; Philip 1994).). ALAD enzimi insanlarda ALAD1 ve ALAD2 olmak üzere iki geni olan polimorfik bir enzimdir. ALAD2 allelinin ekspresyonundaki genetik polimorfizm kurşun toksisitesinin nedeni olarak düşünülmektedir. Kurşun maruziyeti olan farklı toplumlarda yapılmış çalışmalarda ALAD2 geni taşıyan bireylerde kan ve kemikteki kurşun düzeyi anlamlı bir şekilde yüksek bulunmuştur (Smith ve ark. 1995). 93 Talasemili bireylerden alınan kan örneklerinde Pb düzeyleri ile DMT1 polimorfizminin genotipleri (CC/CA/AA) açısından karşılaştırıldığında elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,013). Yine Pb düzeyleri açısından, (A-) talasemili bireyler ile (A+) bireyler arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık olduğu tespit edildi (p=0,048). Elde ettiğimiz bu sonuca göre, (A+) talasemili bireylerde kurşun düzeyi (A-) talasemili bireylere göre daha azdır ve bundan dolayı da (A-) talasemili bireylerin (A+) talasemili bireylere göre daha avantajlı olduğunu söylenebilir. Bu durum çocuklarla ilgili yapılan epidemiyolojik çalışmalarda da ortaya çıkmış, demir eksikliği olan ve çevresel kurşuna maruz kalan çocuklarda da, kandaki kurşun düzeyi demir eksikliği olmayan çocuklarla karşılaştırıldığında daha yüksek bulunmuştur (Brandman ve ark., 2001). Ayrıca, Bressler ve arkadaşları DMT1 ile ilgili yaptığı çalışmada, sağlıklı bireylerde Fe emilimi artarken Pb emilimi azaldığını tespit etmişler, yani aralarında negatif korelasyon olduğunu belirlemişlerdir. Bununla birlikte bir çok çalışmada bu korelasyon tespit edilmiştir (Wright ve ark., 2003, Hegazy ve ark., 2010, Wolf ve ark., 2003). Kwong ve arkadaşlarının çalışmasında da, demir anemisi eksikliği olan bireylerde vücutta demir azaldığında kurşun toksisitesi gözlemlenmiştir. Araştırma grubunda demir tedavisi uygulandığında kurşun toksisitesi azalmıştır (Kwong ve ark., 2004). Yine Hammad (1996) ve arkadaşlarının çocuklarda yaptığı kan kurşun ve demirle diyet alımı arasındaki ilişki araştırılmış ve kan kurşun düzeyi ve demir arasında negatif korelasyon bulunmuştur (p=0,03). Çalışmamızdaki sonuçlara göre ise Pb ve Fe değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte negatif korelasyon gözlemlendi. Schell ve arkadaşları da yaptıkları çalışmada, kan kurşun düzeyinin yeni doğmuş bebekte, annenin demir düzeyi ile ters orantılı olduğunu göstermişlerdir (Schell ve ark., 2003). Bununla birlikte, demir iyon taşıyıcısı olan DMT1’in maya ve insan fibroblastlarında yüksek miktarda bulunmasının bu hücrelerde kurşunun taşınmasının artırdığı gösterilmiştir (Bannon ve ark., 2003). Bu taşınma DMT1’in substratı olan Fe2+ iyonu arttıkça, azalma gösterir. Yapılan tüm çalışmalar göz önüne alındığında Fe+2 ve Pb+2 bu iki iyonun aynı taşıyıcı mekanizmayı kullandıkları hipotezi ortaya atılmıştır. Pb+2‘nun DMT1 tarafından taşınıldığı ve moleküler 94 benzerlik yoluyla Fe+2 taklit ettiği ve bu yolla hücre içi bölmelerine eriştiği tahmin edilmektedir (Bridges ve Zalups, 2005). Toplumumuzda, DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmi ile ilgili populasyon çalışması yapılmış ve toplumumuzdaki frekans dağılımı belirlenmiştir (Kayaaltı ve ark., 2011 ). DMT1 geninin farklı bölgelerindeki çeşitli çalışmalar hasta gruplarında ve deney hayvanlarında çalışılmıştır. Ancak, DMT1 IVS4+44 C/A tek nükleotid polimorfizmi ile ilgili talasemili bireylerde yapılmış bir çalışma mevcut değildir. Bundan dolayı, bu çalışma, talasemi hastalarında, DMT1 polimorfizmi ile metal düzeyleri arasındaki ilişkinin araştırıldığı literatürdeki ilk çalışmadır. Bizim çalışmamızda DMT1 polimorfizmi Fe ve Pb metal düzeyleri, Hct ve Ferritin parametreleri açısından değerlendirilmişir. Yukarıda belittiğimiz metal düzeyleri ve biyokimyasal parametreler açısından talasemili bireylerde yapılmış ve karşılaştırabileceğimiz bir veri bulunmamaktadır. Bu yüzden çalışmamız bundan sonraki talasemi ve diğer transfüzyon bağımlı anemi modellerinin araştırılacağı diğer çalışmalara ışık tutabilir. 95 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Bu çalışmada, Adana Çukurova Balcalı Araştırma Hastanesi Hematoloji Bölümü’nde düzenli olarak tedavi gören 50 gönüllü hastadan alınan kan örneklerinde belirlenen; 1. Ortalama metal konsantrasyonları; Fe = 901,58 ppm; Pb= 37,53 ppb; Ferritin = 1605,08 (ng/mL); Hct = 22,06 (%). 2. Homozigot tipik bireylerde C/C (n:15); Fe= 1021,68±113,90 ppm; Pb= 31,26±8,01 ppb; Ferritin = 1669,33±825,26 (ng/mL); Hct = 22,53±2,41 (%). 3. Heterozigot bireylerde C/A (n:23); Fe= 884,32±208,07 ppm; Pb=33,23±6,11 ppb; Ferritin = 1475,47±669,94 (ng/mL); Hct = 22,13±4,30 (%). 4. Homozigot atipik bireyde A/A ise (n:12); Fe=784.55±181.47 ppm; Pb=53.84±28.82 ppb; Ferritin = 1773,16±727,05 (ng/mL); Hct = 21,33±3,44 (%). 5. A aleline sahip bireylerde A(+) (n:35); Fe= 850.11±202.43 ppm; Pb= 40.29±19.78 ppb; Ferritin = 1669,33±825,26 (ng/mL); Hct = 21,86±4,00 (%). 6. A aleline sahip olmayan bireylerde A(-) (n:15); Fe=1021.68±113.90 ppm; Pb= 31.26±8.01 ppb; Ferritin= 1557,54±694,25 (ng/mL); Hct= 22,53±2,41 (%). Bu sonuçlara göre; Talasemi hastalarından alınan 50 kan örneğinin, DMT1 IVS4+44 C→A Tek Nükleotid Polimorfizminin; 1. Fe düzeyleri genotip (CC, CA, AA) açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak oldukça anlamlı olduğu tespit edildi (p=0,002). Bununla birlikte Fe düzeyleri aleller (A+, A-) açısından karşılaştırıldığında aynı şekilde istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu (p=0,001). 2. Pb düzeyleri genotip (CC, CA, AA) açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlılık tespit edilmiştir (p=0,013). Bununla birlikte Pb değerleri aleller (A+, A-) açısından karşılaştırıldığında aynı şekilde istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu (p=0,048). 96 3. Ferritin değerleri genotip (CC, CA, AA) olarak karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamadı (p=0,463). Bununla beraber ferritin değerleri aleller (A+, A-) açısından kıyaslandığında benzer şekilde istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunamadı (p=0,882) (p>0.05). 4. Hematokrit değerleri genotip (CC, CA, AA) olarak karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamadı (p=0,603). Bununla beraber hematokrit değerleri aleller (A+, A-) açısından kıyaslandığında benzer şekilde istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki tespit edilemedi (p=0,322) (p>0.05). 5. Homozigot (CC) ve heterozigot (CA) genotipe sahip bireyler, homozigot atipik (AA) bireylere göre, Fe düzeyinin oldukça yüksek olduğu belirlendi. 6. Pb düzeyleri homozigot tipik (CC) ve heterozigot genotipe (CA) sahip bireylerde, homozigot atipik (AA) bireylere göre düşük olduğu belirlendi. 7. A (+) aleline sahip bireylerde Fe düzeyi A (-) aleline sahip bireylere göre düşük olduğu belirlendi. Bununla beraber A (+) aleline sahip bireylerde Pb konsantrasyonu A (-) aleline sahip bireylere göre yüksek olduğu belirlendi. DMT1 IVS4+44 C→A Tek Nükleotid Polimorfizmi ile ilgili diğer sonuçlar; Talasemi hastalarında kişiler cinsiyetlere göre değerlendirildiğinde, cinsiyet ile Pb ve Fe arasında istatistiksel olarak anlamlılık tespit edilmemiştir (p>0.05). Kadınlarda (n=22) Pb ve Fe düzeyleri sırasıyla 39.47±20.12 ppb ve 922.56±147.07 ppm iken, erkeklerde (n=28) Pb ve Fe düzeyleri 36.10±15.42 ppb ve 885.10±228.71 ppm olarak tespit edildi. Kadın ve erkekler arasında DMT1 polimorfizmi açısından farklılık değerlendirildiğinde, kadın ve erkekler arasında DMT1 gen polimorfizmi frekans dağılımı arasında farklılık bulunamadı (p>0.05). Pb ve Fe arasındaki korelasyona bakıldığında, talesemi hastalarında Pb düzeyleri artarken, Fe düzeyleri azalmaktadır. Ancak; aralarında istatistiksel olarak anlamlı korelasyon bulunamadı (r= -0.141; p>0.05). Yapılan bu çalışmada, DMT1 IVS4+44 C→A tek nükleotid polimorfizmine sahip bireylerde, Fe toksisitesinin az olduğu ve bununla beraber DMT1 97 IVS4+44 C→A tek nükleotid polimorfizmine sahip olmayan bireylere göre daha avantajlı olduğu söylenebilir. Yaptığımız çalışma sonucunda, DMT1 IVS4+44 C→A tek nükleotid polimorfizmine sahip bireylerde, Pb toksisitesinin DMT1 IVS4+44 C→A tek nükleotid polimorfizmine sahip olmayan bireylere göre daha fazla olabileceği söylenebilir. 98 ÖZET Çalışmamızın amacı Talasemili hastalarda DMT1 IVS4+44 C/A Tek Nükleotid Polimorfizmini Belirlemek ve bu polimorfizmin Fe ve Pb düzeyleri ile ilişkinin olup olmadığını tespit etmektir. Talesemi kalıtsal (genlerin ebeveynlerden çocuklara aktarılması) kan hastalıkları içerisinde yer alan, hemoglobin molekülünün üretimi süresince, globin zincir sentezlerindeki düzenlenme dengesizliklerine dayalı, globin zincir sentez bozukluğudur. Dengesiz, globin zincir sentezi düşük hemoglobin üretiminin başlıca nedenidir ve anemiye neden olur. Talesemi (özellikle beta-talasemi), en önemli küresel sağlık sorunlarından biridir ve Akdeniz, Afrika. Hindistan ve Güney Asya’da yaygın olarak bulunmaktadır. Beta talaseminin ana nedeni β-globin sentezinin yetersiz olması dengesiz globin zincir üretimine ve α-zincirlerinin aşırı birikimine neden olur. Çalışmanın ilk bölümünde, 50 talasemili bireyde DMT1 C→A tek nükleotid polimorfizmi (SNP) araştırıldı. İzole edilen DNA’ların DMT1 bölgesi, PCR tekniği ile çoğaltılarak, amplifiye edildi. PCR ürünü amplifiye edilen oligonükleotid’ler RFLP tekniği ile kesildi. Talasemili hastalarda DMT1 tek nükleotid polimorfizmin genotip frekansları; % 30.0 homozigot tipik, %.46,0, heterozigot % 46.0 homozigot atipik genotip % 24.0 olarak belirlendi. Alel frekansı C aleline sahip bireylerde A(+) %53, C aleline sahip olmayan bireylerde A(-) %47 olarak tespit edildi. İkinci bölümde ise; DMT1 C→A tek nükleotid polimorfizmi belirlenmiş olan 50 kan örneğinin Fe, Pb konsantrasyonları ölçüldü ve polimorfik özellikle metal düzeyi arasında ilişki olup olmadığı araştırıldı. Fe için Atomik absorpsiyon spektrometresi (AAS) kullanılırken Pb tespiti için grafit fırınlı AAS sistemi kullanıldı. Çalışma sonucunda, demir düzeyi homozigot genotiplerde (1021.68±113.90 ppm) heterezigot (884.32±208.07 ppm) ve homozigot atipik genotiplere (784.55±181.47 ppm) göre daha yüksek olarak tespit edildi (p=0,002). Ancak, Kurşun düzeyi homozigot genotiplerde (31.26±8.01 ppb) heterezigot (33.23±6.11 ppb) ve homozigot atipik genotiplere (53,84±28.82 ppb) göre daha düşük tespit edildi (p=0,013). C aleline sahip bireylerde A(+) demir düzeyi (850.11±202.43 ppm), C aleline sahip olmayan bireylere A(-) göre düşük olduğu tespit edildi (1021.68±113.90 ppm) (p=0,001). Kurşun düzeyi C aleline sahip olmayan bireylerde A(-) (31.26±8.01 ppb), C aleline sahip bireylere (40,29±19,78 ppb) (p=0,048) göre daha düşük çıkmıştır. Çalışmamızda demir ve kurşun arasında negatif korelasyon gözlemlenmiştir, ancak bu sonuç istatistiksel olarak anlamlı değildir. Anahtar Sözcükler: DMT1, Talasemi, Demir, Kurşun, Polimorfizm 99 SUMMARY Determination of iron and lead levels in thalassemic patients blood samples and investigation of its relation between DMT1 gene polymorphisms. The aim of this study is to determine the polymorphism of DMT1 in thalessemic patients and investigate whether this polymorphism has an effect on Fe element levels and Pb metal levels in the blood samples. Thalassemias are hereditary blood diseases (that is, they're passed from parents to children through the genes) due to unbalanced globin chain synthesis. Unbalanced globin chain synthesis is the major cause of low level hemoglobin production leading to anemia. The Thalassaemias (especially beta-thalassemia) pose by far the most important global public health problem, which are widespread throughout the Mediterranean region Africa, the Middle East, the Indian subcontinent, and Southeast Asia. Main cause of the beta thalassemias is defective β-globin synthesis, which leads to imbalanced globin chain production and an excess of α-chains. For the first part of the this study, determine genetic polymorphism of the DMT1 were analyzed in 50 blood samples. C→A single nucleotide polymorphism (SNP) was investigated in DMT1 IVS4+44 region C/A extraction DNAs, were amplified with the PCR technique. Then, the amplified oligonucleotides were cut with the RFLP technique. The genotype frequencies of the SNP in the patients DMT1 IVS4+44 region C/A were determined as follows; 30.0% homozygote typical (CC), 46.0% heterozygote (CA) and 24.0% homozygote atypical (AA) genotype. Additionally, the frequency of C allele A(-) was found as 53.0% and of A allele A(+) as 47.0%. For the second part of this study, determination of C→A SNP in the DMT1, the Fe and Pb, levels of the 50 blood samples were measured and the correlation between the polymorphic characteristics and metal level were investigated. Lead levels were measured by Varian AA240Z Zeeman Graphite Furnace Atomic Spectrometer, Iron levels were measured by Varian AA240FS Fast Sequantial Flame Atomic Absorbtion Spectrometer. Iron levels are higher in homozygote genotype (1021.68±113.90 ppm) than heterozygote genotype (884.32±208.07 ppm) and homozygote atypical genotype (784.55±181.47 ppm). This is statistically significant (p=0,002). On the other hand, Leads levels in homozygote genotype (31.26±8.01 ppb) are lower than heterozygote genotype (33.23±6.11 ppb) and homozygote atypical genotype (53,84±28.82 ppb). This finding is also statistically significant (p=0,013). Iron levels are significantly lower in A(+) allele (850.11±202.43 ppm) than in A(-) allele (1021.68±113.90 ppm) (p=0,001). Furthermore, lead levels are statistically significant lower in A(-) allele (31.26±8.01 ppb) than in A(+) allele (40,29±19,78 ppb) (p=0,048). In our study, data show that negative correlation between iron and lead. However, this result is not statistically significant. Key Words: DMT1, Iron, Lead, Polymorphism, Thalessemia. 100 KAYNAKLAR AHAMED, M., SIDDIQUI, M.K.J. (2007). Environmental lead toxicity and nutritional factors. Clinical. Nutrition., 26 (4): 400–408. AKSOY, M. (1968). Abnormal Hemoglobins and Thalassemia in Eti Turks Living in Antakya. Med. Bull. Ist, 1:296-301. AKSOY, M. (1991). The history of β-thalassemia in Turkey. Turk. J. Pediat., 33 (3):195-7. ANDREWS, N.C. (1999). Disorders of iron metabolism. N. Eng. J. Med., 341 (26): 19861995. ANDREWS, N.C. (2000). Iron Hemostasis: Insights from genetics and animal models. Nat. Gene. Rev., 1: 208–217. ANDREWS, N.C., LEVY, J.E. (1998) Iron is hot: an update on the pathophysiology of hemochromatosis. Blood . 92:1845–1851. ANDY VIERSTRATE. Principle of the PCR 199. http://users.ugent.be/~avierstr/ ATANASIU, V., MANOLESCU, B., STOIAN, I. (2006). Hepcidin the link between inflammation and anemia in chronic renal failure. Rom J Intern Med., 44(1):25-33. ATANASIU, V., MANOLESCU, B., STOIAN, I. (2007). Hepcidin-central regulator of iron metabolism. European Journal of Haematology Journal Compilation. 78 (1):1-10. ATSDR. (2007). Toxicological profile for lead. AUDESİRK T., AUDESİRK G., BYERS E.B. (1999). Life on Earth. 248-250. AYALA, F. J., KIGER, F. J. (1980). Modern Genetics. Benjamin/Cumming Publishing Company, Inc, California. syf.: 601-605. BALDWIN, D.R., MARSHALL, W.J. (1999). Heavy Metal Poisoning and Its Laboratory Investigation. Annals of Clinical Biochemistry., 36 (3): 267-300. BALLATORI N. (2002). Transport of toxic metals by molecular mimicry. Environ Health Perspect., 5:689-94. BANNON, D.I., ABOUNADER, R., LEES P.S., BRESSLER, J.P. (2003). Effect of DMT1 knockdown on iron, cadmium, and lead uptake in Caco-2 cells. Am J Physiol Cell Physiol., 284(1):C44-50. BARLTROP, D., KHOO, H.E. (1975). The influence of nutritional factors on lead absorption. Postgrad. Med. J., 51:795-800. BARLTROP, D., MEEK, F. (1979). Effect of particle size on lead absorption from the gut. Arch. Environ. Health., 34:280-285. BASAK, N. (2007). Molekular Pathology of beta-Thalassemia: the Boğaziçi university experience in Turkey. Heamoglobin., 31 (2): 233-241. BAYNES, R.D. (1996). Assesment of Iron Status. Clinical Observations. 29(3): 15. BELLINGER, D.C. (2004). Lead. Pediatrics. 113(4):1016-22. BENETATOS, L., ALYMARA, V., VASSOU, A., BOURANTAS, K.L. (2008). Malignancies in -thalassemia patients: a single-center experience and a concise review of the literature. Int Jnl Lab Hem., 30: 167–172. BENNETT, P.A., ROTHERY, E. (1983) Introducing Atomic Absorption Analysis. Mulgrave, Australia : Varian Associates. BEUTLER, E. (2006). Hemochromatosis: genetics and pathophysiology. Annu. Rev. Med., 57:331-47. BEUTLER, E., GELBART, T., LEE, P., TREVİNO, R., FERNANDEZ, M.A., FAİRBANKS V.F. (2000). Molecular characterization of a case of atransferrinemia. Blood., 96(13):4071-4074. BIRGENS, H., LJUNG, R. (2007). The Thalassaemia Syndromes. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 67 (1): 11–25. 101 BIRGENS, H., LJUNG, R. (2007). The Thalassaemia Syndromes. Scand J Clin Lab Invest., 67: 11–26. BOND, G.L., HU, W., ARNOLD, LEVINE, A. (2005). A Single Nucleotide Polymorphism in the MDM2 Gene: From a Molecular and Cellular Explanation to Clinical Effect. Cancer Res., 65 (13):5481-4. BOND, G.L., HU, W., LEVINE, A. (2005). A Single Nucleotide Polymorphism in the MDM2 Gene: From a Molecular and Cellular Explanation to Clinical Effect. Cancer Res., 65(13):5481-4. BOTTEMA, C.D., SOMMER, S.S. (1993). PCR amplification of specific alleles: rapid detection of known mutation and polymorphisms. Mutat. Res., 288:93-102. BOZKURT G, ALGÜNEŞ Ç. (2000). Tıpta moleküler genetik uygulamaları genel prensipleri. Trakya Üniversitesi Matbaa Tesisleri, p.:42-46, 66-69. BRANDMAN, A., ESKENAZI, B., SUTTON, P., ATHANASOULIS, M., GOLDMAN, L.R. (2001). Iron deficiency associated with higher blood lead in children living in contaminated environments. Environ. Health Perspect., 109:1079–1084. BRESSLER, J.P., OLIVI, L., CHEONG, J.H., KIM, Y., BANNONA, D. (2004). Divalent metal transporter 1 in lead and cadmium transport. Ann N Y Acad Sci., 1012:142-52. BRIDGES, C.C., ZALUPS, R.K. (2005). Molecular and ionic mimicry and the transport of toxic metals. Tox. Appl. Pharm., 204: 274–308. BRITTENHAM, G.M. (2000). Disorders of iron metabolism: iron deficiency and overload. In hematology, basic principles and practice. Ed: R. Hoffman, E. Benz, S. Shattıl, B. Furie, H. Cohen, L. Sılberstein, P. Mcglave P. New York: Churchill Livingstone, p.:397-428. BURTON, G.W. (1989). Antioxidant action of carotenoids. J. Nutr., 119 (1):109-11. BUTLER, J.E. AND KADONAGA, J.T. (2002). The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev., 16(20):2583-92. BUTLER, J.M. (2005). Forensic DNA typing. Biology Technology and Genetics of STR Markers.USA: Elsevier Press, p.: 33-84. BUYS, S.S., MARTIN, C.B., ELDRIDGE, M., KUSHNER, J.P., KAPLAN, J. (1991). Iron absorbtion hypotransferrinemic mice. Blood., 78(12):3288-3290.. BÜLBÜL, S.H. (2004). Çocuk beslenmesinde demirin yeri ve önemi.Sürekli Tıp Eğitimi Dergisi., 13(12):446-50. CANATAN, D. (2007). Dünyada ve Türkiye’de Talasemi ve Anormal Hemoglobinler. Canatan D, Aydınok Y. Talasemi ve Hemoglobinopatiler, p: 11-19. CHARLTON, R.W., BOTHWELL, T.H. (1983). Iron absorption. Annu. Rev. Med., 34: 5568. CHEESEMAN, K.H., SLATER, T.F. (1993). An Introduction To Free Radical Biochemistry. Br.Med.Bull., 49 (3): 479-80. CLARKSON, T.W. (1993). Molecular and ionic mimicry of toxic metals. Annu Rev Pharmacol Toxicol., 33:545-71. COLLINS, F.S. (1997). Sequencing the human genome. Hosp. Pract. (Minneap.), 32 (1):3543. COMPORTI M.,SIGNORINI C., BUONOCORE G., CICCOLI L. (2002). Iron Release, Oxidative Stres and Erythrocyte Ageing. Fre Rad Bio Med., 32(7):568-57. COMPORTI, M., SIGNORINI, C., BUONOCORE, G., CICCOLI, L. (2002)., Iron release, oxidative stress and erythrocyte ageing. Free Radic Biol Med., 32(7):568-76. CONAWAY, R.C., CONAWAY, J.W. (1993). General initiation factors for RNA polymerase II. Annu. Rev. Biochem., 62:161-190. CONRAD, M.E., UMBREIT, J.N. (1993). A concise review: Iron absorption the mucinmobilferrinintegrin pathway. A competitive pathway for metal absorption. Am. J. Hematol., 42 (1): 67-73. CONSOLINI, R., CALLERI, A., LEGITIMO, A., MASSEI, F. (2001). Immunological evaluation of patients with beta-thalassemia major. Acta. Haematol., 105: 7-12.. 102 DIAMOND, G.L. (2005). Risk assessment of nephrotoxic metals. Ed: J. Tarloff, L. Lash, The Toxicology of the Kidney. London, England: CRC Pres, p.:1099-1132. DINKEL, A., NJOROGE, E.M., ZIMMERMANN, A., WALZ, M., ZEYHLE, E., ELHAMDI, I.E., MACKENSTDT, U., ROMIG, T. (2004). A PCR system for detection of species and genotypes of the Echinococcus granulosus–complex, with reference to the epidemiological situation in Eastern Africa. Int. J. for Parasitol., 34(5): 645-653. DOWLING, T.E., MORITZ, C., PALMER, J.D., RIESEBERG, L.H. (1996). Nucleic acids III: analysis of fragments and restriction sites. Molecular Systematics, 88 (9):249-320. EFREMOV, G.D. (2007). Thalassemias and Other Hemoglobinopathies in the Republic of Macedonia. Hemoglobin. 31 (1): 1–15. EMİR, F., ÖZDEN, A. (2006). Genetik polimorfizm ve polimorfizm çalışmaları. Güncel Gastroenteroloji., 10 (1): 24-28. EPA. (2002). National primary drinking water regulations. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency. EPA816F02013. ERNHART, C.B., WOLF, A.W., SOKOL, R.J., BRITTENHAM, G.M., ERHARD, P. (1985). Fetal lead exposure: antenatal factors. Environ Res., 38(1):54-66. FARMAKIS, D., GLAKOUMIS, A., POLYMEROPOULOS, E., AESSOPOS, A. (2003). Pathogenetic aspects of immune deficiency associated with Beta-thalassemia. Med. Sci. Monit., 9(1): RA19-22.. FATHALLAH, H., ATWEH, F.G. (2006). DNA Hypomethylation Therapy for Hemoglobin Disorders:Molecular mechanisms and clinical applications. Blood Reviews., 20 (4): 227-234. FEDER, J.N., GNIRKE, A., THOMAS, W, ET, AL. (1996). A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat. Genet., 13(4): 399–408. FIRTSCH, E.F., LAWN, R.M., MANATIS, T. R.M. (1980). Molecular cloning and characterization of human beta like globin gene cluster. Cell., 19 (4), 959 -972. FLEGAL, A.R., SMITH, D.R. (1992). Lead levels in preindustrial humans. New. Eng. J. Med., 326 (19):1293-1294. FLEMING, R.E., BACON, B.R. (2005). Orchestration of Iron Homeostasis. New England Journal of Medicine., 352(17):1741-4. FLORA, S.J.S., SINGH, S., TANDON, S.K. (1989). Thiamine and zinc in prevention or therapy of lead intoxication. J. Intern. Med. Res., 17 (1):68–75. FLORA, S.J.S., TANDON, S.K. (1990). Beneficial effects of zinc supplementation during chelation treatment of lead intoxication in rats. Toxicology, 64 (2):129–139. FRİDOVICH, I. (2001). Reflections of a fortunate biochemist. J. Biol. Chem., 276(31):28629-36. GANONG, W.F. (1991). Digestion and Abserption. Review of Medical Phyorology. 15th Edition. Applelen and Lange. p: 25:437–447. GANZ, T. (2004). Hepcidin in iron metabolism. Current Opinion in Hematology. 11(4):251-4. GANZ, T. (2006). Hepcidin and its role in regulating systemic iron metabolism. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program., 507:29-35. GANZ, T. (2006). Hepcidin and its role in regulating systemic iron metabolism. Hematology Am. Soc., 507: 29-35. GIARDINA, P.J., HILGARTNER, M.W. (1992). Update on Thalassemia. Pediatr. Rev., 13(2):55-62. GONZALEZ, F. J. (1999). Polymorphisms in xenobiotic metabolism. In Molecular and Applied Aspects of Oxidative Drug Metabolizing Enzymes. Life Sciences Pharmacogenetics., 303: 91-110. GOYER, R.A. (1993). Lead toxicity: current concerns. Environ Health Perspect., 100:17787. 103 GOYER, R.A., CHERIAN, M.G., JONES, M.M. (1995). Role of chelating agents for prevention, intervention, and treatment of exposures to toxic metals. Environ. Health Perspect., 103:1048–52.^ GREEN, D.W., WALTERS, L., ACKERMAN, N.B. JR. (1994). Pathological case of the month. Case 1. Bart's hemoglobin hydrops fetalis syndrome. Arch. Pediatr. Adolesc. Med., 148 (3):283-284. GREEN, E.K. (1998). Restriction Fragment- Length Polymorphism. Eds; Rapley R, Walker J. In. Molecular Biomethods Handbook. New Jersey: Humana Press, 8: 271-279. GRIFFITHS, W.J.H., KELLY, A.L., COX, T.M. (1999). Inherited disorders of iron storage and transport. Mol Med Today., 5(10):431-8. GRIFFITHS, W.J.H., KELLY, A.L., COX, T.M. (2000). Localization of iron transport and regulatory proteins in human cells. American Journey of Dis. Chi., 93(9): 575-87. GUNSHIN, H., MACKENZIE, B., BERGER, U.V., GUNSHIN, Y., ROMERO, M.F., BORON, W.F., NUSSBERGER, S., GOLLAN, J.L., HEDIGER, M.A. (1997). Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metaliontransporter. Natur., 388:482– 488. HAGAR, W., THEIL, E.C., VICHINSKY, E.P. (2002). Diseases of iron metabolism. Pediatr. Clin. N. Am., 49(5):893-909. HALLBERG, L., ROSSANDER, L., SKANBERG, A.B. (1987). Phytates and the inhibitory effect of bran on iron absorption in man. Am J Clin Nutr., 45(5):988-96. HALLIWELL, B. (1994). Free radicals and antioxidants: a personal view. Nutr Rev. 52:25365. HAMMAD, T.A., SEXTON, M., LANGENBERG, P. (1996). Relationship between blood lead and dietary iron intake in preschool children. A cross-sectional study. Ann. Epidemiol, 6(1):30-3. HARRISON, S.A., BACON, B.R. (2003). Hereditary hemochromatosis: update for 2003. J. Hepatol., 38 (1): 14–23. HEDRICK, P.W. (2011). Selection and Mutation for α Thalassemia in Nonmalarial and Malarial Environments. Ann Hum Genet., 75 (4):468-74. HEGAZY, A.A,. ZAHER, M.M., ABD EL-HAFEZ, M.A., MORSY, A.A., SALEH, R.A. (2010). Relation between anemia and blood levels of lead, copper, zinc and iron among children. BMC Res Notes, 12;3:133. HIGGS, D.R. (1990a). 1990 Mack Forster Prize lecture. The molecular genetics of the alpha globin gene family. Eur J Clin Invest., 20 (4):340-7. HIGGS, D.R. (2004). Gene regulation in hematopoiesis: New lessons from thalassemia. Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ.Program. p.:1-13. HIGGS, D.R., VERNIMMEN, D., WOOD, B. (2008). Long-range regulation of alphaglobin gene expression. Adv Genet., 61:143-73. HIGGS, D.R., VICKERS, M.A., WILKIE, A.O., PRETORIUS, I.M., JARMAN, A.P., AGGARWAL, A.K. (1995). Structure and function of restriction endonucleases.Curr. Opin. Struct. Biol., 5(1):11-9. HIGGS, D.R., VICKERS, M.A., WILKIE, A.O., PRETORIUS, I.M., JARMAN, A.P., WEATHERALL D.J. (1989). A review of the molecular genetics of the human alphaglobin gene cluster. Blood., 73(5):1081-104. HIGGS, D.R., WOOD, W.G., JARMAN, A.P., SHARPE, J., LIDA, J., PRETORIUS, I.M., AYYUB, H. (1990). A major positive regulatory region located far upstream of the human alpha-globin gene locus. Genes Dev., 4(9):1588-601. HIGGS, D.R., WOOD, W.G., JARMAN, A.P., VICKERS, M.A., WILKIE, A.O., LAMB, J., VYAS, P., BENNETT, J.P. (1990b). The alpha-thalassemias. Ann. N. Y. Acad. Sci., 612:15-22. HO, P.J., THEIN, S.L. (2000). Gene regulation and deregulation: a β globin perspective. Blood Reviews., 14 (2): 78-93. 104 HORNICK, R.B., GREISMAN, S.E., WOODWARD, T.E., DUPONT, H.L., DAWKINS, A.T., SNYDER, M.J. (1970). Typhoid Fever, Pathogenesis and Immunologic Control. New England Journal of Medicine., 283 (13), 686-91. HUISMAN, T.H.J. (1993). The Structure and Function of Normal and Abnormal Hemoglobins. Bailieres Clin. Haematol., 6(1):1-30. HUNT, J. (2001). How important is dietary iron bioavability? American Journey of Clin. Nutr., 73(1): 3-4. KAYAALTI, Z., ODABAŞI M., SÖYLEMEZOĞLU, T. (2010). Genotype and allele frequencies of divalent metal transporter 1 polymorphism in Turkish population. Mol Biol Rep., 38(4):2679-84. KAZAZIAN, H.H. JR. (1990). The thalassemia syndromes: molecular basis and prenatal diagnosis in 1990. Semin. Hematol., 27(3):209-228. KAZAZIAN, H.H. JR., MORAN, J.V. (1998). The impact of L1 retrotransposons on the human genome. Nat Genet., 19(1):19-24. KILINÇ, Y. (2006). Hemoglobinopathies in Turkey. Turk J Hematol. 23: 214-216. KLINKEN, S.P. (2000). Red blood cells. IntJ Biochem Cell Biol., 34:1513-1518. KOLLER, K., BROWN, T., SPURGEON, A., LEVY, L. (2004). Recent developments in low-level lead exposure and intellectual impairment in children.Environ Health Perspect., 112(9):987-94. KONTOGHIORGHES, G.J. (2006). Iron Mobilization From Transferin And NonTransferin-Bound-Iron by Deferiprone. Implications in the Treatment of Thalassemia,Anemia of Chronic Disease, Cancer and Other Conditions. Hemoglobin, 30(2): 183–200. KONTOGHIORGHES, G.J. (2006). Iron mobilization from transferrin and non-transferrinbound-iron by deferiprone. Implications in the treatment of thalassemia, anemia of chronic disease, cancer and other conditions. Hemoglobin. 30(2):183-200. KUBISTA, M., ANDRADE, J.M., BENGTSSON, M., FOROOTAN, A., JONÁK, J., LIND, K., SINDELKA, R., SJÖBACK, R., SJÖGREEN, B., STRÖMBOM, L., STÅHLBERG, A., ZORIC, N. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med., 27(2-3):95-125. KUIPER-KRAMER, E.P., COENEN, J.L.M., HUISMAN, C.M.S. (1998). Relationship between soluble transferrin receptors in serum and membran bound transferrin receptors. Acta Haematol., 99(1): 8-11. KWONG, W.T., FRIELLO, P., SEMBA, R.D. (2004). Interactions between iron deficiency and lead poisoning: epidemiology and pathogenesis. Sci Total Environ., 330(1-3):2137. LAYRISSE, M., MARTINEZ-TORREZ, C.. GONZALEZ, M. (1974). Measurement of total daily dietary iron absorption by the extrinsic tag model. American Journey of Clin. Nutr., 27: 152-62. LEITA, L., ENNE, G., DE NOBILI, M., BALDINI, M., SEQUI, P. (1991). Heavy Metal Bioaccumulaüon in Lamp and Sheep Bred in Smelting and Mining Areas of S. W. Sardinia (Italy). Bull. Environ. Contam. Toxicol., 46(6): 887-893. LEONG, W.I., BOWLUS, C.L., TALLKVIST, J., LONNERDAL, B. (2003). DMT1 and FPN1 expression during infancy: developmental regulation of iron absorption. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol., 285 (6):G1153-61. LIEBHABER, S.A. (1989). Alpha thalassemia. Hemoglobin, 13 (7-8):685-731. LIN, C.K., YANG, M.L., JIANG, M.L., CHIEN, C.C., LIN, H.H., PENG, H.W. (1991). Comparison of two screening methods, modified Hb H preparation and the osmotic fragility test, for alpha-thalassemic traits on the basis of gene mapping. J. Clin. Lab. Anal., 5(6):392-395. LOUKOPOULOS, D. (1991). Thalassemia: Genotypes and phenotypes. Ann Hematol., 62 (4): 85-94. 105 LUKENS, J.N. (1999). The Thalassemias and Related Disorders: Quantitative disorders of hemoglobin synthiesis. Ed: G.R. Lee, J. Foerster, J.N. Lukens, F. Paraskcvas, J.P. Greer, G.M. Rodgers. Bds. Wintrobe's Cliııical Hematology. Egypt: Mass Publishing Co, p.:1405-1448. LUSTBERG, M., SILBERGELD, E. (2002). Blood lead levels and mortality. Arch Intern Med., 162:2443-2449. MARFURT, J., NIEDERWIESER, I., MAKIA DIVINE, N., BECK, H., FELGER, I. (2003). Diagnostic genotyping of Old and New World Leishmania species by PCR-RFLP. Diagnoistic Microbiology and Infectıous Disease., 46:115-124. MCMANUS, D.P., DING, Z., BOWLES, J. (1994). A molecular genetic survey indicates the presence of a single, homogeneous strain of Echinococcus granulosus in NorthWestern China. Acta Trop., 56 (1): 7-14. MCPHERSON M. J.; MOLLER S. G.(2000). PCR. Heredity, 86: 513–514. MEISEL, A., MACKELDANZ, P., BICKLE, T.A., KRUGER, D.H., SCHROEDER, C. (1995). Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. Embo J., 14(12):2958-66. MILLER, R.D., TAILLON, M.P., KWOK, P.Y. (2001). Regions of Low Single-Nucleotide Polymorphism Incidence in Human and Orangutan Xq: Deserts and Recent Coalescences. Genomics., 71(1); 78-88. MURRAY, N.E. (2000). Type I restriction systems: sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle). Microbiol Mol Biol Rev., 64(2):412-34. NAGEL, R. L. (2003). Disorder of Hemoglobin Function and Stability. Ed.: Handin, R I,, Lux, S.E. and Stossel, T.P. Philadelpphia. Lippincott Williams&Wilkins, Blood: Principles and Practice of Hematology. p.:1597-1654. NEEDLEMAN, H. (2004). Lead poisoning. Annu Rev Med., 55:209-222. NEEDLEMAN, H.L., SCHELL, A., BELLINGER, D., LEVITON, A., ALLRED, E.N. (1990). The long-term effects of exposure to low doses of lead in childhood. An 11year follow-up report. N Engl J Med., 322(2):83-8. NELSON, D.L. (1991). applications of polymerase chain reaction methods in genome mapping. Curr. Opin. Genet. Dev., 1(1):62-68. NICOLAS, G., VIATTE, L., BENNOUN, M., BEAUMONT, C., KAHN, A., VAULONT, S. (2002). Hepcidin, A New Iron Regulatory Peptide. Blood Cells, Molecules, and Diseases., 29 (3):327–335. OLIVIERI, N.F. (1999). The Beta-Thalassemias. N. Engl. J. Med., 341(2): 99-109. OLIVIERI, N.F., WEATHERALL, D.J. (1998). The therapeutic reactivation of fetal haemoglobin. Hum Mol Genet., 7(10):1655-8. OSKI, F.A., NAIMAN, J.L. (1982). Hematologic problems in the newborn. Third edition. Major problems in clinical pediatrics, 4(1);1-360. ÖKTEM. S., ÖZHAN, M. (2001). Apoptozisin önemi. Toraks dergisi, 2(1): 91-95. PETTERSSON, T., KIVIVUOR, S.M., SIIMES, M.A. (1994). Is serum transferrin receptor useful for detecting iron deficiency in anaemic patients with chronic inflammatory diseases. Brit. J.Rheum., 33(8):740-744.. PHILIP, A.T., GERSON, B. (1994). Lead poisoning – Part II. Effects and assay. Clin Lab Med., 14:651-670. PHILLIP, A.T., GERSON, B. (1994a). Lead poisoning – Part I. Incidence, etiology, and toxicokinetics. Clin. Lab. Med., 14:423-444. PIETRANGELO, A. (2006). Hereditary Hemochromatosis. Biochimica et Biophysica Acta., 1763 (7): 700–710. PINGOUD, A, JELTSCH, A. (1997). Recognition and cleavage of DNA by type-II restriction endonucleases. Eur J Biochem., 246(1):1-22. PIOMELLI, S. (2002). Childhood lead poisoning. Pediatr. Clin. North. Am., 49 (6): 12851304. 106 PONKA, P. (1997). Tissue Spesific Regulation of Iron Metabolism and Heme Synthesis: Distinct Control Mechanisms in Erythroid Cells. Blood., 89(1): 1-25. POUNDS, J.G., LONG, G.J., ROSEN, J.F. (1991). Cellular and molecular toxicity of lead in bone. Environ Health Perspect., 91:17-32. principles/pcr.html (Erişim tarihi: 30 Mayıs 2010). PUSTERLA, N., MADIGAN, J.E., LEUTENEGGER, C.M. (2006). Real-Time Polymerase Chain Reaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for Equine Infectious Diseases N. J Vet Intern Med., 20:3–12. RABINOWITZ, M.B., WETHERILL, G.W., KOPPLE, J.D. (1976). Kinetic analysis of lead metabolism in healthy humans. J. Clin. Invest., 58:260-270. RAMIREZ-MUNOZ, J. (1968). Atomic-absorption spectroscopy and analysis by atomicabsorption flame photometry. Amsterdam, New York, Elsevier Pub. Co., ROBERTS, R.J., MACELIS, D. (1991). Restriction enzymes and their isoschizomers. Nucleic Acids Res., 19:2077-2109. ROSATELLI, M.C., DOZY, A., FAA, V., MELONI, A., SARDU, R., SABA, L., KAN, Y.W., CAO, A. (1992). Molecular characterization of β-thalassemia in the Sardinian population. Am. J. Hum. Genet., 50 (2):422-426. ROY, C., CARISON, E.,ANDERSON, L. (2000b). Interactions of the ectodomain of HFE with the transferrin receptor are criticil for iron homeostasis in cells. 484(3); 271-274. ROY, C., ENNS, C. (2000a). Iron homeostasis: New tales from the crypt. Blood. ,96(13): 420-427. RUND, D, RACHMILEWITZ, E. (2000). New treatment of β-thalassemia. Critical Reviews in Oncol. Hematol., 33 (2):105-118.. RUND, D., RACHMİLEWITZ, E. (2001). Pathophysiology of alpha- and beta-thalassemia: therapeutic implications. Semin Hematol., 38(4):343-9. SACHIDANANDAM, R., WEISSMAN, D., SCHMIDT, S.C., KAKOL, J.M., STEIN, L. D., MARTH, G., SHERRY, S., MULLIKIN, J. C., MORTIMORE, B.J., WILLEY, D.L., HUNT, S.E., COLE, C.G., COGGILL, P.C., RICE C,.M., NING, Z., ROGERS, J., BENTLEY, D.R., KWOK, P.Y., MARDIS, E.R., YEH, R.T., SCHULTZ, B., COOK, L., DAVENPORT, R., DANTE, M., FULTON, L., HILLIER, L., WATERSTON, R.H., MCPHERSON, J.D., GILMAN, B., SCHAFFNER, S., VAN ETTEN, W.J., REICH, D., HIGGINS, J., DALY, M.J., BLUMENSTIEL, B., BALDWIN, J., STANGE-THOMANN, N., ZODY, M.C., LINTON, L., LANDER, E.S., ALTSHULER, D. (2001). International SNP Map Working Group. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature., 409(6829):928–33. SANKARAN, V.G., NATHAN, D.G. (2010). Reversing the hemoglobin switch. N. Engl. J. Med., 363(23):2258-60. SCHELL, L.M., DENHAM, M., STARK, A.D., GOMEZ, M., RAVENSCROFT, J., PARSONS, P.J., AYDERMIR, A., SAMELSON, R. (2003). Maternal blood lead concentration, diet during pregnancy, and anthropometry predict neonatal blood lead in a socio-economically disadvantaged population. Environ. Health Perspect., 111:195– 200. SILBERGELD, E.K. (2004). Commentary: the role of toxicology in prevention and precaution. Int J Occup Med Environ Health., 17(1):91-102. SIQUEIRA, J.F., ROCAS, I.N. (2003). PCR methodology as a valuable tool for identification of endodontic pathogens. J. Dent., 31(5): 333-9. SIRIRATMANAWONG, N., CHANSRI, W., SINGSANAN, S., FUCHAROEN, G., FUCHAROEN, S. (2009). Complex interaction of Hb E [beta26(B8)Glu-->Lys], Hb Korle-Bu [beta73(E17)Asp-->Asn] and a deletional alpha-thalassemia-1 in pregnancy. Hemoglobin., 33(6):507-14. SIX, K.M., GOYER, R.A., (1972). The influence of iron deficiency on tissue content and toxicity of ingested lead in the rat. J. Lab. Clin. Med., 79:128– 136. 107 SMITH, C.M., WANG, X., HU, H., KELSEY K.T. (1995). A polymorphism in the deltaaminolevulinic acid dehydratase gene may modify the pharmacokinetics and toxicity of lead. Environ Health Perspect., 103:248-253. SMITH, L.H. J.R. (1990). Overview of hemochromatosis. West J. Med., 153 (3): 296-308. STR Markers.USA: Elsevier Press, p.: 33-84. TADMOURI, G.O., TUZMEN, S., ÖZÇELİK, H., ÖZER, A., BAIG, S.M., SENGA, E.B., BAŞAK, A.N. (1998). Molecular and population genetic analyses of β- thalassemia in Turkey. Am. J. Hem., 57 (3): 215-220. TADMOURİ, G.O., BAŞAK, A.N. (2001). β-Thalassemia in Turkey: A Review of the Clinical, Epidemiological, Molecular and Evolutionary Aspects Hemoglobin., 25 (2), 227-239. TADMOURİ, G.O., TUZMEN, S., OZÇELİK, H., OZER, A., BAİG, S.M., SENGA, E.B., BASAK, A.N. (1998). Molecular and Population Genetic Analyses of β-Thalassemia in Turkey. Am J Hematol., 57: 215–220. THEIN, S.L. (1993). β-thalassemia. Bailliere’s Clinical Haematology. 6:1, 151-175. THOMAS, C., THOMAS, L. (2002). Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of functional iron deficiency. Clin Chem., 48(7):1066-1076. THOMPSON, K., MOLINA, R.M., BRAIN, J.D., WESSLING-RESNICK M. (2007). Belgrade rats display liver iron loading. J Nutr., 136(12):3010-4.. TURAN, C. (2002). Genetik. Mustafa Kemal Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Ders Kitabı, Yayın No: 2, Hatay, 169 s. TUZMEN, S., SCHECHTER, A.N. (2001). Genetic diseases of hemoglobin: diagnostic methods for elucidating β-talasemia mutations. Blood. Reviews., 15 (1): 19-29. ULUKOL, B., TEZCAN, S., AKAR, N., GÖKCE, H., CİN, S. (2004). Evaluation of Erythropoiesis by Serum Transferrin Receptor and Ferritin in infants aged 0-6 months. Pediatric Hematology and Oncology., 21(4); 293-305. UMBREIT, J. (2005). Iron deficiency: a concise review. Am. J. Hematol., 78 (3): 225-31. VALKO, M., LEIBFRITZ, D., MONCOL, J., CRONIN, M.T., MAZUR, M., TELSER, J. (2007). Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J.Biochem. Cell. Biol.,39(1): 44-84.. VALLANCE, H., FORD, J. (2003). Carrier testing for autosomal-recessive disorders. Critical Reviews in Clinical Laboratory Science, 40(4): 473-97. Varian Basic Atomic Absorption Theory Australia Pty Ltd (A.C.N. 004 559 540)1997. VENTER, J.C., ADAMS, M,D., MYERS, E.W. et all. (2001). The sequenceof the humangenome. Science, 291(5507):1304–51. VURAL, N. (2005). Toksikoloji, Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara, p.:504-508. WEATHERALL D.J., CLEGG J.B. (2002). Genetic variability in response to infection: malaria and after. Genes Immun., 3(6):331-7. WEATHERALL, D.J. (1998). Pathophysiology of thalassaemia. Baillieres Clin Haematol., 11(1):127-46. WEATHERALL, D.J. (2001a). Phenotype-genotype relationships in monogenic disease: lessons from the thalassaemias. Nat Rev Genet. 2(4):245-55. WEATHERALL, D.J. (2004a). Thalassaemia: the long road from bedside to genome.Nat Rev Genet., 5(8):625-31. WEATHERALL, D.J. (2010). The Thalassemias: Disorders of Globin Synthesis . Ed : K. Kaushansky, M Lichtman, U. Seligson, T. Kipps, and T. Prchal, Williams Hematoloji, 8th ed. New York: McGraw-Hill, pp.: 675-707. WEATHERALL, D.J., CLEGG, J.B. (2001b). Inherited haemoglobin disorders: an increasing global health problem. Bull World Health Organ;79(8):704-12. WEATHERALL, D.J., HIGGS, D.R., CLEGG, J.B. (1988). The molecular pathology of the alpha globin genes. Br J Cancer Suppl., 9:17-22. 108 WEATHERALL, D.J., PRESLEY, L., WOOD, W.G., HİGGS, D.R., CLEGG, J.B. (1981). Molecular basis for mild forms of homozygous beta-thalassaemia. Lancet. 1(8219):527-9. WEATHERALL, D.J., WİLLİAMS, T.N., ALLEN, S.J., O'DONNELL, A. (2010). The population genetics and dynamics of the thalassemias. Hematol Oncol Clin North Am., 24 (6):1021-31. WEATHERALL. D.J. (2004b). The Thalassemias: the role of molecular genetics in an evolving global health problem. Am J Hum Genet., 74(3):385-92. WEST, A.R., OATES, P.S. (2008). Mechanisms of heme iron absorption: current questions and controversies. World J Gastroenterol., 14(26):4101-10. WILLIAMS, S.J., HAYWARD N.K. (2001). The impact of the human genome project on medical genetics. Trends in Molecular Medicine., 7(5). 187-231. WILSON, I. G. (1997). Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl. Environ. Microbiol., 63:3741-3751. WITTMERS, L.E. JR., AUFDERHEIDE, A.C., WALLGREN, J. (1988). Lead in bone. IV. Distribution of lead in the human skeleton. Arch. Environ. Health., 43:381-391. WOLF, A.W., JİMENEZ, E., LOZOFF, B. (2003). Effects of iron therapy on infant blood lead levels. J Pediatr.,143(6):789-95. WONKE, B. (2001). Clinical Management of β-Thlasemia Major. Semin Hematol., 38: 350359. WOOD, W.G., WEATHERALL, D.J. (1983). Developmental genetics of the human haemoglobins. Biochem J., 215(1):1-10. WRIGHT, P.A., WYNFORD-THOMAS, D. (1990). The polymerase chain reaction: miracle or mirage? A critical review of its uses and limitations in diagnosis and research. J Pathol., 162(2):99-117. WRIGHT, R.O., TSAIH, S.W., SCHWARTZ, J., WRIGHT, R.J., HU, H. (2003). Association between iron deficiency and blood lead level in a longitudinal analysis of children followed in an urban primary care clinc. J. Pediatr., 142(1):9-14. XUE, H.C., QIU, L.S., ZHU, C.W. (1993). RFLP analysis of DNA from Echinococcus granulosus collected from four provinces/autonomous region in China. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi., 11 (3): 201-203. YAPRAK, I. (2004). Beta Talasemi Tanı ve Tedavisinde Güncel Yaklaşımlar. STED. 13 (2) 58-59. YEN, A.W., FANCHER, T.L., BOWLUS, C.L. (2006). Revisiting Hereditary Hemochromatosis: Current Concepts and Progress. The American Journal of Medicine., 119 (5): 391–399. YILDIZ, S., ATALAY, A., BAĞCI, H., ATALAY, E.Ö. (2005). Beta-thalassemia mutations in Denizli province of Turkey. Turk J Hematol., 22: 19-23. ZALUPS, R.K. (2000). Molecular interactions with mercury in the kidney. Pharmacol Rev., 52(1):113-43. ZALUPS, R.K., AHMAD, S. (2003). Molecular handling of cadmium in transporting epithelia. Toxicol Appl Pharmacol., 186(3):163-88. ZIEGLER, E.E., EDWARDS, B.B., JENSEN, R.L., MAHAFFEY, K.R., FORMON, S.J. (1978). Absorption and retention of lead by infants. Pediatr. Res., 12: 29– 34. ZOLLER, H., PIETRANGELO, A., VOGEL, W., WEISS, G. (1999). Duodenal metaltransporter (DMT-1,NRAMP-2) expression in patients with hereditary haemochromatosis. Lancet., 353 (9170):2120-3. ZWART DE, L.L., MEERMAN, J.H.N., COMMANDEUR, J.N.M., VERMEULEN, N.P.E. (1999). Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radical Biology and Medicin, 26(1-2): 202-226. 109 EKLER 110 111 ÖZGEÇMİŞ I- Bireysel Bilgiler Adı : Derya Soyadı : Söylemez Doğum Yeri ve Tarihi : Hatay 27/ 05 / 1983 İletişim Adresi : A.Ü. Adli Bil. Enstitüsü, Tıp Fakültesi Cebeci Kampüsü Dikimevi/ANKARA +90 (312) 3192734 II- Eğitimi 2006-2001 Abant izzet Baysal Üniversitesi – Fen ve Edebiyat- Fakültesi – Biyoloji Ana Bil. Dal. – BOLU 2000-1997 İskenderun Lisesi - (Fen) – HATAY Yabancı Dil: İngilizce (iyi düzeyde) III- Bilimsel İlgi Alanları Uluslararası Yayınlar ve Ulusal Bilimsel Toplantılarda Sunulan Bildiriler: Kayaalti Z., Söylemez D., Aliyev V., Kaplan B., Söylemezoğlu T. (2011). Effect of Divalent Metal Transporter gene polymorphism in the blood iron levels of Turkish Thalassemia patients. 36th FEBS Congress Biochemistry for Tomorrow’s Medicine Torino.
