PowerPoint Sunusu

1
Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi
ECZ 344
Prof.Dr. Dilek AK
28.03.2014 /4. DERS
BİYOLOJİK SIVILAR
2
PLAZMA ve SERUM

Kan, antikoagülan ilave edilmeden bir tüpe alınır ve
pıhtılaşması için bekletilirse pıhtı yumağından sarı
renkli bir sıvının ayrıldığı görülür. Buna serum denir.

Serumda kanın pıhtılaşmasında görev alan bazı
pıhtılaşma faktörleri ve proteinler özellikle fibrinojen
ve bazı pıhtılaşma faktörleri (proteinlerin % 2.0-2.5 i)
bulunmaz. Bu yüzden seruma fibrinojensiz plazma
denir.
3
Plazma ve Serum

Plazma ve serumun en önemli özelliği büyük
miktarda protein içermesidir. Protein ölçülecek
küçük moleküllü ilaçtan kimyasal ve fiziksel olarak
farklıdır.

Plazmanın toplam protein içeriği: 7.0-7.5 g/100 ml
plazma

Ancak proteinler ve ilaçlar arasında güçlü bir afinite
vardır ve ultrafiltrasyon veya diyalizle proteinin
uzaklaştırılması, ilacın büyük bir fraksiyonununda
uzaklaştırılmasına neden olur.
4
5
Plazma ve Serum

Diğer taraftan ilacın doğrudan ölçümü mevcut
toplam ilaç ve ölçülen serbest ilacın karışmasına yol
açar.

Mikrobiyolojik tayinlerde sadece serbest ilaç ölçülür
ancak standartlar da ölçülecek aynı sıvıda çalışıldığı
için sonuçların mevcut antimikrobiyal ajanın toplam
miktarına karşı geldiği kabul edilir.

Serbest ilacın fizyolojik olarak önemli varlığı
tartışılmasına karşın ilaçların çoğu protein bağlı
olarak bulunur ve serbest konsantrasyonu önemli
ölçüde düşüktür. Plazma veya serum numunelerinde
toplam ilacı ölçme yolu kullanılır.
6
Plazma ve Serum

Bu yüzden problem ilacın proteine bağlanmasını
fizyolojik olarak tahrip edilmesi ve analiz için toplam
ilacın ekstre edilmesidir.

Bağlı fraksiyon, toplamın sabit bir yüzdesi olduğu ve
analizcinin analizi basitleştirmesi için bir yükseltme
faktörünü kullanması söz konusudur.

Günümüzde bu durum bağlı olmayan fraksiyon için
analizcinin çok duyarlı yöntemler geliştirmesini
gerektirmediği için şanslı bir durumdur; ancak bazı
ilaçların metastabil conformerlerinin aktif formda
olabileceği iddiaları mevcuttur.

Eğer bu iddialar doğruysa farmakokinetiklerinin
aydınlatılması biyolojik sıvılarda spesifik conformerlerin
analizi gerekir.
7
Plazma ve Serum

Analiz için plazma veya serum numunesinin
hazırlanmasında ilk basamak proteinsiz sulu çözelti
elde etmek ve bir organik çözücü ile uygun
ekstraksiyondur.

En basit ve eski yöntem proteinleri çöktürmek ve
filtratı (supernatan) izole etmektir.

Protein çöktürme ile denature edilir ve ilaç bağlama
yeteneği zarar görür. Böylece toplam ilaç filtrata
salınır.
8
Plazma ve Serum

Kostik çözeltiler, plazma ve serumda proteinlerin
denature edilmesi ve çöktürülmesi için eşit etkinlikte
olmasına karşın bunlar genellikle ekstraksiyonda
zorluklara
neden
olan
sabun
oluşturma
özelliklerinden dolayı tercih edilmezler.

Protein çöktürülmesi için yaygın kullanılan asidik
reaktifler trikloroasetik asit, perklorik asit ve tungstik
asittir ancak bu tip kuvvetli asitler ekstre edilecek
ilaca zarar veren etkiye sahip olabilir.

Böyle bir prosedür klasik genel reaktiflerle kullanılan
biçim yerine standart bileşiklerle test edilmelidir.
9
Plazma ve Serum

Stevens ve Bunker bu asitlerin yanı sıra 80 oC de 5 M
HCl, alüminyum klorür ve amonyum sülfatın kullanımı
üzerine bir araştırma yapmış ve genel olarak hiçbir
yöntemin uygulanabilir olmamasına karşın tüm
kanda proteinlerin çöktürülmesi için alüminyum
klorürün en güvenli reaktif olduğu, bazı ilaçların
düşük geri kazanımlarının ilaçların proteinlerle
çökmesine ve degredasyonuna bağlı olduğu
sonucuna varmışlardır.
10
Plazma ve Serum

Düşük pH da ilaçların stabil olmaması, proteinlerin
denaturasyonu ve çöktürülmesi için organik çözücülerin
kullanımı ile önlenebilir.

Dell, bütün plazma proteinlerini çöktürmek için en az iki
misli hacmi gerekli olan metanol veya etanolü tavsiye
eder.

Diğer bir popüler çözücü özellikle HPLC de yaygın
kullanılan asetonitrildir. Mathies ve Austin, antikonvülzan
ve analjeziklerin analizi için plazmanın eşit hacim
asetonitrille karıştırıldığı ve çözeltinin sodyum bisülfat
/sodyum klorür ile doyurulduğu ve üst fazın doğrudan
kromatografik kolona enjekte edildiği bir yöntem tarif
eder.
11
Plazma ve Serum

Proteinler, proteolotik enzimler kullanılarak da denature edilebilir.
Kimyasal denaturasyon kullanıldığında analitin zarar görme
olasılığını azaltmak için uygun bir yoldur.

Proteolitik enzimler genellikle doku preparatlarındaki ilaç analizi için
uygulanır. Ancak subtilizin enzimi plazma proteinlerinin dijesyonu için
başarıyla kullanılmıştır.

Osselton, bütün kan ve plazmanın analizinde, doğrudan
ekstraksiyon ile enzim hidrolizini karşılaştırdığı çalışmasında dokudan
ilacın geri kazanımında enzim hidrolizi ile daha iyi geri kazanım elde
edildiğini göstermiştir.

Osselton’un prosedüründe 200 µL plazma 50 µL TRIS tamponu ile pH
10.5 değerine tamponlanır, enzim katılır ve karışım 50 µL bütil asetat
ile ekstraksiyondan önce 55 C de 1 saat inkübe edilir. Organik faz
daha sonra uygun bir yöntemle analiz edilir.

Osselton spesifik bir bileşik için normal ekstraksiyon işlemlerinin
optimizasyonunun olanaklı olmadığı koşullarda genel tarama
işlemleri için enzim hidrolizinin çok kullanışlı olduğunu bildirir.
Analit içeren çözeltiden proteinlerin ayrılması icin 12
yöntemler
Yöntem
Yorum
90 oC de 5-15 dk ısıtmak
Çok etkin değildir. Analit dekompoze olabilir.
Dondurma – çözündürme siklusları
Çok etkin değildir. Zaman alıcı bir işlemdir.
Amonyum sülfat ile doyurma
Orta düzeyde etkindir. Supernatanda yüksek tuz derişimi, final pH 7.0
dolayındadır
ZnSO4 - sulfosalisilik asit
Temiz bir çözelti, RIA için uygun
ZnSO4 – sodyum hidroksit
Mükemmel verim, pH 7.0 dolayında ince bir çökelti, düşük
sıcaklıklarda uygun
Metafosforik asit
Mükemmel verim, reaktifin soğuk tutulması gerekir, asitlik (pH<3)
analiti dekompoze edebilir.
Perklorik asit
Mükemmel verim, reaktifin soğuk tutulması gerekir, patlayıcı reaktif,
final pH analite zararlı olabilir. Bir çok bazik ilaç güvenle ekstre
edilebilir.
Trikloroasetik asit
İyi verimlilik, reaktifin soğuk tutulması gerekir, analitten uzaklaştırılması
zor olabilir.
Tungstic asit
Etanol
İki hacim etanol tamamlanmış denaturasyon için gereklidir. Düşük pH
da ilaç dayanıksız ise uygundur.
Asetonitril
Tamamlanmış denaturasyon için 1.5 hacim gerekir. Zayıf floc analitin
birlikte çökmesini engeller. Özellikle takiben HPLC varsa uygundur.
Aluminyum klorür
Bazik bileşikler için amonyum sülfat ve tungstik asitten daha
uygundur.
13
Plazma ve Serum

Proteinlere bağlanma ilacın kanda transportu için ve
bazen de ilacın çözünürlüğü için önemli bir olaydır.

Yukarıda açıklandığı gibi ekstraksiyonun alışılmış
yöntemleri bu tip bağlanmayı kırma eğilimindedir.
Böylece genellikle sıvılardaki toplam ilaç ölçülür.

Normal olarak proteine bağlanma kapsamından
habersiz olarak serbest ilaç ölçülmek istendiğinde
bazı durumlarla karşılaşılabilir. Barbituratlar gibi asidik
ilaçlar kuvvetli bağlanır. Bazik ilaçların bağlanma
eğilimi yoktur. Fenitoinin proteinlere bağlanması
valproik asitten etkilenir.
14
Plazma ve Serum

Plazma çok kompleks bir sıvı olmasına karşın
kompozisyonu önemli ölçüde stabildir ve hastalarda
bile içeriğinde büyük değişiklik olmaz.

pH 7.30 ile 7.50 aralığındadır ve bu aralığın dışına
çıkmaz. Toplam protein ve tuz konsantrasyonları da iyi
kontrol edilir.

Ancak yağ içeriği yemeğin zamanına ve cinsine göre
önemli ölçüde değişebilir.

Plazma konsantrasyonu-zaman grafiği çizildiği zaman
yağ içeriği analizi etkileyen bir faktör olabilir ve özellikle
yağlı numunelerde yağları uzaklaştırmak için özel bir
ekstraksiyon basamağı gerekebilir.
15
Plazma ve Serum

Plazma bileşenlerindeki bazı değişikliklerin ilacın gerçek düzeyi
üzerine etkisi olabilir. Örneğin bazı ilaçlar protein bağlanma
kısımlarında diğerleriyle yer değiştirebilir. Böyle durumlarda
ilacın fizyolojik etkisi sadece serbest ya da bağlanmayan
konsantrasyona bağlı olabilir. Çünkü daha az bağlanma yerleri
mevcut olduğu için ölçülen toplam ilaç gözlenen etki için son
derece düşük görünecektir. Bu yüzden bir çok araştırmacı
serbest ilacın analizini gerçek bir indikatör olarak savunur.

Bu tip tayinlerde serbest ilacın bağlı ilaçtan ayrılması için ticari
filtrelerin kullanıldığı ultrafiltrasyon yöntemleri popülerdir. Ancak
serbest ilacın düşük konsantrasyonları saptama sınırının dışında
kalabilir.

Alternatif bir işlem toplam ilaç için analizinden önce aynı
plazma numunesini radyoaktif işaretli ilaç ile dengeleyerek
bağlı yüzdesini belirlemek olabilir.
16
Plazma ve Serum

İlaçlar
plazma
proteinlerine
kuvvetlice
bağlanabilmesine karşın bağlanma tersinirdir. Bundan
dolayı uygun pH da numune organik bir çözücüyle
ekstre edilebilir.

İyonize olmayan formdaki ilacın organik çözücüye
partisyonu yeterince yüksekse, bağlanma dengesi
organik çözücüye verimli ekstraksiyonu sağlayacak
şekilde kaydırılabilir. Bu strateji tamponun en az miktarı
ile gerekli pH ya ayarlamak ve çözücünün bağıl olarak
büyük hacmiyle ekstre etmektir.

Bu prosedürün avantajı çok sayıda numune için bir rutin
işlem olan filtrasyon veya aktarma gibi işlemlerden
kaçınmaktır. Toksikoloji ve klinik farmakoloji çalışmalarını
destekleyen laboratuarlar için bu işlemler gerçek bir
problemdir.
17
Plazma ve Serum

Çok sayıda numunenin analizinde gerekli zamanı
azaltmak için ekstraksiyon işlemleri ile ilgili basamağı
basitleştirmek amacıyla


çözeltideki analitin katı bir matrikse adsorpsiyonu ve
ardından çözücünün daha küçük bir hacmi ile elüsyonu
işlemleri uygulanabilir.
Bu amaçla aktif kömür, modifiye silika veya iyon
değiştirici reçine gibi bir materyal içeren bir kolona
işlem görmemiş numune çözeltisinin eklenir. (katı faz
ekstraksiyonu)
18
Plazma ve Serum

Ayrıca, numune sağlandıktan sonra plazma veya
serum bileşeni olarak bulunan enzimlerin ilaç
degredasyonunu sürdürmesi ihtimali mevcuttur.

Nonspesifik esterazlar özellikle önemlidir ve esterleri
serbest alkol ve asitlere parçalar. Bu esterazların
doğası ve aktivitesi kişiye göre değişir.
19
Plazma ve Serum

Plazma ve serum büyük miktarda protein içerdiği için ilaçlar
kendi fizikokimyasal özelliklerine göre çeşitli derecelerde
proteinlere bağlanacaktır.

Genelde asit ve nötral yapıdaki laçlar başlıca albümine, bazik
ilaçlar ise asit glikoproteinlere bağlanır. Ekstravasküler dağılım
ve eliminasyon için sadece serbest ilaç mevcuttur ve hücre
membranlarını geçebilecek ve ilaç reseptörleri ile etkileşecek
kısım serbest ilaç fraksiyonudur.

Amaç toplam ilaç derişiminin ölçülmesi olduğunda proteinsiz
serum veya plazmada ilacın doğrudan analizi toplam ilaç
derişimini yansıtmayacaktır. Bu yüzden protein, bir organik
çözücü ile ekstraksiyon işleminden önce denature edilir.
Alternatif olarak proteine kuvvetlice bağlanan ilaçlar pH nin
uygun şekilde ayarlanması ile serbest hale geçirilebilir.
20
Numune Hazırlama

1. Osmotik parçalama

2. Protein çöktürme

3. Asit muamelesi

4. İnorganik tuzlar

5. Sonikasyon
21
Numune Hazırlama
1. Osmotik parçalama

1 ml, kan, serum veya plazmaya 4 ml distile su
eklenir.

Vortex ile karıştırılır veya 5 dk bekletilir.

670 g de 10 dk santrifüj edilir ve pellet atılır.

Tampon çözelti ilave edilerek süpernatan pH değeri
ayarlanır.
22
Numune Hazırlama
2. Protein çöktürme

1 kısım plazma veya serum için 2 kısım organik çözücü
kullanılır.

Karıştırılır ve 5-10 dk bekletilir.

Numune vortexlenir ve santrifüj edilir.

Süpernatan elde edilir ve ekstraksiyon öncesinde
tamponlanır.

Organik çözücüler içinde protein bağını tahrip etmek
için en kuvvetli olanı asetonitrildir.

Organik çözücünün daha düşük miktarları % 10-30 da
etkili olabilir.
23
Numune Hazırlama
3. Asit muamelesi

Kuvvetli asitler (formik, perklorik, trikloroasetik asit)
proteinleri ve yapılarını tahrip eder.

50 mkro litre 0.1-1.0 M perklorik veya formik asit 1 ml
serum veya plazmaya eklenir.

Triklorasetik ast %10 derişimde kullanılır.

Numune karıştırılır ve 5-10 dk bekletilir.

Vortex ve santrifüj yapılır pellet atılır.

Supernatan analiz edilir.
24
Numune Hazırlama
4. İnorganik tuzlar

Amonyum sülfat ve çinko sülfat (% 10-20) 1:1
oranında dilüsyon ile proteinleri çöktürmek için
kullanılabilir.
25
Numune Hazırlama
5. Sonikasyon
(kimyasal, biyolojik, farmakolojik ve fizyolojik
çalışmalarda materyallerin parçalanarak homojenize
edilmesi )

Biyolojik sıvı 15 dk oda sıcaklığında sonike edilir.

Uygun pH değerindeki tampon eklenir ve karıştırılır.

Santrifüj (670 g) 15 dk yapılır.

Pellet atılır ve supernatan analiz edilir.
26
İlginiz için teşekkür ederim.