çoklu ilaca dirençli
advertisement
TÜRKİYE CUMHURİYETİ MARMARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ÇOKLU İLACA DİRENÇLİ (ÇİD) KLİNİK İZOLATLARDA BİYOFİLM OLUŞUMU VE BİYOSİDAL AKTİVİTE SAPTANMASI BURCU SEBİT YÜKSEK LİSANS TEZİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI DANIŞMAN Prof. Dr. Ayşegül Karahasan İSTANBUL-2015 BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığı beyan ederim. Burcu SEBİT İmza I )ÖNSÖZ Yüksek lisans eğitimime baĢladığım ilk günden beri engin bilgi, görüĢ ve deneyimleriyle bana yol gösteren, bilimsel katkıları ile karĢılaĢtığım sıkıntı ve engelleri aĢmamı sağlayan, değerli danıĢman hocam Prof. Dr. AyĢegül KARAHASAN'a, Yüksek lisans eğitimim ve tez çalıĢmam boyunca hiçbir zaman desteğini ve sabrını esirgemeyen değerli hocam Yar.Doç. Dr. Burak AKSU'ya, Eğitimim süresince engin bilgilerini benimle paylaĢan ve bana mikrobiyolojiyi bir kez daha sevdiren değerli hocalarım Prof. Dr. Münevver Ufuk HASDEMĠR'e, Prof. Dr. Güner SÖYLETĠR’e, Prof. Dr. Nilgün ÇERĠKÇĠOĞLU’na, Prof. Dr. Nurver ÜLGER’e, Doç. Dr. Zeynep Arzu ĠLKĠ'ye, Her zaman sevgi ve destekleriyle yanımda olan ve bu yaĢıma kadar benden maddi, manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen ve en büyük hazinem olan babam Tuncer SEBĠT'e, annem Bilge MORGÜL'e, beni büyüten sevgili babaannem AyĢe SEBĠT'e ve bana öğrettikleriyle bugünlere gelmemi sağlayan çok özlediğim sevgili dedem Selahattin SEBĠT'e, Yüksek lisans eğitimime baĢladığım ilk günden beri desteği, önerileri ve en önemlisi arkadaĢlığıyla her zaman yanımda olan Biyolog Pelin TAġKINA’a, Her zaman yanımda olan, göstermiĢ olduğu anlayıĢ, yardım ve desteklerinden dolayı hastanedeki çalıĢma arkadaĢım Seval ALBAġ'a, Hastanemizin ve anabilim dalımızın tüm asistan ve çalıĢanlarına, Her zaman yanımda olan, hiç bir zaman esirgemediği sevgisi, dostluğu ve desteği için ve canım sıkkın olduğunda dahi yüzümü güldürmeyi baĢardığı için, hayatımdaki yeri ayrı olan Hülya GÜNDÜZ'e, Sonsuz teĢekkürler... i II ) İÇİNDEKİLER sayfa no I) Önsöz......................................................................................................................i II) İçindekiler............................................................................................................ii III) Kısaltmalar Listesi............................................................................................iv IV) Şekil Resimler ve Tablolar Listesi....................................................................v Özet …………………………………………………………………..............1 Summary……………………………………………………………............2 1. Giriş ve Amaç ……...………………………………………………………........3 2. Genel Bilgiler …..……………………………………………………………......6 2.1. Tarihçe ve Sınıflama............……………………………………….........6 2.1.1. Acinetobacter baumannii...........................................................6 2.1.2. Pseudomonas aeruginosa..........................................................7 2.2.Mikrobiyolojik Özellikleri.........................................................................8 2.2.1. Acinetobacter baumannii...........................................................8 2.2.2. Pseudomonas aeruginosa..........................................................9 2.3. Epidemiyolojik Özellikleri ve klinik önemi............................................11 2.3.1. Acinetobacter baumannii..........................................................11 2.3.2. Pseudomonas aeruginosa.........................................................13 2.4.Dezenfektanlar: Sınıflama ve Kullanım Alanları.....................................14 2.5. Dezenfektan Etkinlik Testleri..................................................................19 2.6. Bakterilerde Antiseptik ve Dezenfektanlara KarĢı Direnç......................25 ii 2.7.Bakterilerde Dezenfektan Direnç Mekanizmaları....................................27 3.Gereç ve Yöntemler...............................................................................................29 3.1. Gereçler....................................................................................................29 3.1.1. Standart Kökenler.....................................................................29 3.1.1.1. Biyofilm için..............................................................29 3.1.1.2. Dezenfektan aktivitesi için.........................................29 3.1.2.Besiyerleri..................................................................................29 3.1.3.Kimyasal Maddeler....................................................................29 3.1.4.Dezenfektan maddeler...............................................................30 3.1.5.Cihazlar ve laboratuvar malzemeleri..........................................30 3.2.Yöntemler.................................................................................................31 3.2.1.ÇalıĢma Kökenleri......................................................................31 3.2.2.Biyofilm üretiminin belirlenmesi...............................................32 3.2.3.Dezenfektan etkinliğini belirlenmesi.........................................33 3.2.4. Ġstatistiksel değerlendirme........................................................34 4.Bulgular..................................................................................................................35 4.1.Biyofilm Testi Bulguları...........................................................................35 4.1.Dezenfektan Etkinlik Testi Bulgular........................................................36 5. Tartışma ve Sonuç...............................................................................................41 6. Kaynaklar.............................................................................................................45 Özgeçmiş Etik Kurul Onayı iii III) KISALTMALAR CLSI:Clinical and Laboratory Standards Institute ÇĠD: Çoklu Ġlaç Dirençli KAB: Kuaterner Amonyum BileĢikleri LB: Luria Bertani MBK: Minimum Bakterisidal Konsantrasyonu MĠK: Minimum Ġnhibisyon Konsantrasyonu MRSA: Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus OPA: orta-fetalaldehit PA: Perasetik Asit SPSS: Statistical Package for the Social Sciences TSA:Triptik Soy Agar VRE: Vankomisine Dirençli Enterokok YBÜ: Yoğun Bakım Ünitesi iv IV) ŞEKİLLER, RESİMLER VE TABLOLAR I. Şekillerin Listesi Şekil 1: Biyofilm üreten ve üretemeyen, P.aeruginosa ve A.baumannii izolatların, toplam dezenfektan duyarlılığı ve dirençi Şekil 2: P.aeruginosa ile A.baumannii arasındaki dezenfektan direncinin istatistiksel değerlendirilmesi II.Resim Listesi Resim 1: Biyofilm üretiminin mikroplakta saptanması Resim 2: Seri dilüsyonların triptik soy agara (TSA) damla ekimi Resim 3: Triptik soy agara (TSA)'da A7 suĢunun dezenfektan etkinliği III. Tabloların Listesi Tablo1: Tıbbi cihaz ve malzemelerin sterilizasyon-dezenfeksiyonu Tablo 2: Mikroorganizmaları etkileme derecelerine göre dezenfektanlar Tablo 3: Yüksek düzey dezenfektanların avantajları ve dezavantajları Tablo 4: Antiseptik ve dezenfektanlara karĢı bakterilerde intrinsik direncin mekanizmaları Tablo 5: Klinik Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobater baumannii suĢlarında biyofilm üretimi Tablo 6: Klinik P.aeruginosa ve A. baumannii suĢlarında dezenfektan direnç oluĢumu Tablo 7a: Klinik Acinetobater baumannii kökenleri (n:50) biyofilm üretmesi ve dezenfektan etkinliklerinin değerlendirilmesi v Tablo 7b: Klinik Pseudomonas aeruginosa kökenleri (n:50) biyofilm üretmesi ve dezenfektan etkinliklerinin değerlendirilmesi vi ÖZET Çoklu İlaca Dirençli (ÇİD) Klinik İzolatlarda Biyofilm Oluşumu ve Biyosidal Aktivite Saptama Burcu Sebit, Prof. Dr. Ayşegül Karahasan, Marmara Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, İstanbul Amaç: Hastanede kullanılan antiseptik ve dezenfektanların çoklu ilaç direnci gösteren nonfermantatif gram negatif bakterilerde etkinliğini belirlemek ve biyofilm üretimi ile antiseptik ve dezenfektan direnci arasında bir ilişki olup olmadığını belirlemek. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda çoklu ilaç dirençli P.aeruginosa (n:21), A.baumannii (n:29) ve ilaç direnci göstermeyen P.aeruginosa (n:29), A.baumannii (n:21) dahil edilmiştir. Biyofilm üreten P.aeruginosa PAO-1 ve A.baumannii ATCC 19606, biyofilm üretmeyen P.aeruginosa PAO-JP3; dezenfektan etkinliği için P.aeruginosa ATCC 15442, E.coli ATCC 10536, S.aureus ATCC 6538 standartları kontrol kökenler olarak kullanılmıştır. İzolatların biyofilm oluşturma özellikleri kantitatif mikroplak yöntem ile belirlenmiştir. Süspansiyon testi kullanılarak sodyum hipoklorit, klorhekzidin, orto-fitalaldehit(OPA), perasetik asit(PA) ve perasetik asit/hidrojen peroksit'in dezenfektan aktiviteleri saptanmıştır. Bulgular: Çoklu ilaç dirençli A.baumannii ve P.aeruginosa suşlarında, hastanemizde sıklıkla kullanılan dezenfektanlardan klorhekzidin %98, sodyum hipoklorit %90, OPA %96, PA %94, perasetik asit/hidrojen peroksit %96 oranında etkili bulunurken; ilaç direnci göstermeyen A.baumannii ve P.aeruginosa suşlarında ise klorhekzidin, OPA ve PA %100, sodyum hipoklorit %98, perasetik asit/hidrojen peroksit ise %94 oranında etkin saptanmıştır. Biyofilm üretimi A.baumannii 'de %74 (ÇİD A.baumannii %75.8), P.aeruginosa'da %40 (ÇİD P.aeruginosa %42.8) olarak bulunmuştur. Sonuçlar: Test ettiğimiz antiseptik ve dezenfetanlar çoklu ilaç direnci gösteren, biyofilm üreten izolatlar, dahil tüm izolatlarımızda etkinliğini %90'ın üzerinde olduğunu göstermiştir. Ancak A.baumannii ile P.aeruginosa dezenfektan etkinliği açısından karşılaştırıldıklarında antiseptik ve dezenfektanların P.aeruginosa 'daki etkinliğinin %96'nın üzerinde olduğu görülmüştür. Biyofilm üretenlerle üretmeyenler arasında dezenfektan etkinliği açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (P.aeruginosa P= 0,351 ve A.baumannii P= 0,981). Anahtar kelimeler:P.aeruginosa, A.baumannii, Dezenfektan, Biyofilm, Direnç 1 SUMMARY Biofilm formation in Clinical isolates with Multiple Drug Resistant (MDR) and Detection of Biocidal Activity Burcu Sebit, Prof. Dr. Ayşegül Karahasan, Marmara Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, İstanbul Aim:Multidrug resistance of antiseptics and disinfectants used in hospitals to determine the effectiveness of nonfermantatif gram-negative bacteria and to determine whether there is a relationship between the production of biofilm resistance to antiseptics and disinfectants. Material and methods:In this study, multidrug resistant(MDR) P.aeruginosa(n:21), A.baumannii(n:29) and antibiotic sensitive that P.aeruginosa(n:29), A.baumannii(n:21) were included. Biofilm-producing P.aeruginosaPAO-1 and A.baumanniiATCC19606, biofilm-negative P.aeruginosaPAO-JP3, for the disinfection efficacy of P.aeruginosa ATCC15442, E.coli ATCC10536 and S.aureusATCC6538 was used as control standards roots. Biofilm production of the isolates were determined by quantitative microplate method. The suspension test using sodium hypochlorite, chlorhexidine, ortho-phthalaldehyde(OPA), peracetic acid(PA) and peracetic acid/hydrogen peroxide disinfectant activity was detected. Results:Commonly used disinfectants were found to be effective against multi-drug resistant A.baumannii and P.aeruginosa strains as follows chlorhexidine 98%, sodium hypochlorite 90%, OPA 96%, PA and peracetic acid/hydrogen peroxide 94%. Effectivity rates for antibiotic susceptible A.baumannii and P.aeruginosa strains were found to be 100% for chlorhexidine, OPA and PA; 98% for hypochlorous acid and 94% for peracetic acid/hydrogen peroxide. Biofilm production, 74% in A.baumannii (MDRA.baumannii 75.8%), 40% in P.aeruginosa (MDRP.aeruginosa 42.8%), was determined. Conclusion:We tested antiseptics and disinfectants; showing multidrug resistance, including biofilm producing strains, all isolates showed that the effectiveness of our above 90%.However, A.baumannii and P.aeruginosa, when compared in terms of effectiveness of disinfectants, antiseptics and disinfectants, P.aeruginosa were found to be above 96% of the activity in. Among producing biofilm and not producing, there was no significant difference in the effectiveness of disinfectants (P.aeruginosa P=0,351 ve A.baumannii P=0,981). Keywords:P.aeruginosa, A.baumannii, Disinfectant, Biofilm, Resistant 2 1.GİRİŞ ve AMAÇ Hastane enfeksiyonları (nozokomiyal enfeksiyonlar), hastaların hastaneye yatışından sonra gelişen ve başvuru anında inkübasyon döneminde olmayan ya da hastanede gelişmemiş olmasına rağmen, taburcu olduktan sonra ortaya çıkabilen infeksiyonlardır. Hastaneye yattıktan 48-72 saat sonra yada taburcu olduktan sonraki 10 gün içinde gelişen infeksiyonlar hastane enfeksiyonu olarak kabul edilir (28). Nozokomiyal enfeksiyonların artması dünyada büyük bir problemdir ve çok sayıda insan hastane enfeksiyonu kurbanı olmaktadır. Amerika da yılda 2 milyon nozokomiyal enfeksiyon antibiyotiklerle tedavi edilirken, hastane enfeksiyonlarına neden olan mikroorganizmaların yayılması uygun antiseptik yada dezenfektan kullanımıyla engellenebilir (31). En önemli hastane enfeksiyonu etkenleri arasında yer alan gram negatif bakteriler P.aeruginosa, A.baumannii, E.coli, Klebsiella spp., S.maltophilia ve Serratia spp. 'dir (35). Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter türleri, hastane enfeksiyonu etkenleri arasında ilk sıralarda yer almaktadırlar. Fırsatçı patojen özellik gösteren bu mikroorganizmalar sıklıkla personel veya hasta araç–gereci yoluyla ciddi hastane enfeksiyonlarına yol açabilmektedirler. Çapraz kontaminasyon ile hastadan hastaya geçiş en önemli yayılım yollarından biridir (4). Pseudomonas aeruginosa son yıllarda artan insidansı, ürettiği virülans faktörlerinin çeşitliliği ve sürekli yükselen antibiyotik direnç oranlarıyla sık rastlanan, mortalite ve morbiditesi yüksek, tedavisi güç enfeksiyonların etkeni olarak karşımıza çıkmaktadır (24). Acinetobacter baumannii nonfermentatif, gram negatif bir bakteri olup yoğun bakım ünite (YBÜ)'leri başta olmak üzere nozokomiyal enfeksiyonların önemli nedenlerindendir. 3 Nozokomiyal A.baumannii enfeksiyonlarına bağlı mortalite oranları oldukça yüksek olup, bakteriyemide %2534, pnömonide %40-80 olarak bildirilmektedir (98). P. aeruginosa enfeksiyonlarında olası kaynaklar arasında mekanik solunum destekleme cihazları, endoskoplar, infüzyon çözeltileri, damar içi kateterler, lavabolar ve musluk başları sayılabilir (70). Acinetobacter baumannii, merkezlere göre değişmekle birlikte, hastane kaynaklı pnömoni etkenleri arasında Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa ile birlikte ilk sıralarda izole edilen türlerden biridir (39). Ülkemizde 12 hastanede yapılan çok merkezli bir çalışmada, Acinetobacter türlerinin solunum cihazı ilişkili pnömoni etkenleri arasında ilk sırada yer aldığı gösterilmiştir (49). Acinetobacter baumannii YBÜ enfeksiyonlarının yanı sıra salgınlara da yol açabilmektedir. Bakterinin salgınlara yol açabilmesi kuru ortamlarda uzun süre canlılığını sürdürmesi ve antibiyotik direnci ile ilişkili bulunmaktadır. Salgınlara yol açan bazı kaynaklar arasında hasta yatakları, solunum cihazı boruları, eldivenler, yastıklar, bilgisayar klavyeleri, tansiyon aleti, cep telefonu ve parenteral beslenme solüsyonları sayılabilir (26). Acinetobacter baumannii‘nin hastane enfeksiyonlarına yol açmasına neden olan cansız yüzeylerde uzun süre hayatta kalabilme özelliği biyofilm üretimi ile ilişkili bulunmaktadır (91). Antibiyotik ve dezenfektanların yaygın kullanıldığı hastane ortamında, duyarlı bakterilerin yok edilmesi, buna karşılık bu maddelere karşı direnebilen ve direnç geliştirebilen mikroorganizmaların seçilmesi, hastane enfeksiyonlarını ciddi bir sorun haline getirmektedir. Bu enfeksiyonların ortaya çıkması zorlu ameliyatları boşa çıkarabilmekte, hasta tedavisine ağır bir mali yük getirmekte, hastanede kalış süresini uzatmakta ve hastanın kaybedilmesine neden olabilmektedir. Bakterilerin antibiyotiklere karşı hızla direnç geliştirebildiği bilinmektedir. Bakteriler kullanılan dezenfektan ve antiseptiklere de direnç geliştirebilmekte, doğru dezenfektan seçimi hastane enfeksiyonlarının önlenmesinde önem kazanmaktadır (77). 4 Dirençli gram-negatif basillerin neden olduğu nozokomiyal infeksiyonlar son yıllarda hastanelerin önemli problemi haline gelmiştir. Antiseptikler ve dezenfektanlar, hastane enfeksiyonlarının önlenmesi ve enfeksiyon kontrolünde önemli bir role sahiptir. Belirli bir amaç için kullanılacak dezenfektanın seçimi bu nedenle önemlidir. Amaca uygun olmayan ürün seçimi hem kullanımda sorun oluşturacak hem de maliyetin artmasına neden olacaktır. Kullanılan antiseptik ve dezenfektanlara gram-negatif basillerin bir kısmı direnç göstermekte, dirençli mikroorganizmalar tarafından oluşturulan nozokomiyal enfeksiyonları önlemek için uygun antiseptik ve dezenfektanların seçimi önem kazanmaktadır (47). Bu çalışmada hastanemizde izole edilen Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii suşlarında biyofilm oluşturma oranları ve hastanemizde kullanılan antiseptik ve dezenfektan maddelerin etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla; Sodyum hipoklorid, klorhekzidin, Orto-fitalaldehit (OPA), perasetik asit ve perasetik asit+hidrojen peroksit test edilmiştir. 5 2.GENEL BİLGİLER 2.1. Tarihçe ve sınıflandırma 2.1.1. Acinetobacter baumannii Acinetobacter türleri ilk olarak Hollanda'lı mikrobiyolog Beijerinck tarafından 1911 yılında, topraktan izole edilmiş ve bilim adamı bu mikroorganizmaları Micrococcus calcoaceticus olarak adlandırmıştır (69). Sonraki yıllarda benzer mikroorganizmalar farklı araştırıcılar tarafından 15’ten fazla farklı cins ve tür düzeyinde isimlendirilmiştir(14,68). Acinetobacter kelimesi; Yunanca ‘akinetos’ kelimesinden köken alır ve hareketsiz anlamına gelmektedir. 1954 yılında Brisou ve Prevot, Achromobacter cinsindeki hareketsiz mikroorganizmaları, hareketli mikroorganizmalardan ayırmak için Acinetobacter ismini cins ismi olarak önermiş, ancak bu öneri 1968 yılında Baumann ve arkadaşlarının yaptığı çalışmadan sonra kabul görmüştür (68). 1986 yılında Bouvet ve Grimont, DNA hibridizasyon yöntemi ile Acinetobacter cinsini 12 gruba (genospecies) ayırmıştır. Elde ettikleri 12 DNA grubundan 6’sını fenotipik özelliklere göre de gruplandırmışlardır(12). 1989’da Bouvet ve Jeanjean; proteolitik Acinetobacter genomik türlerinden oluşan ve 13–17 arasında numaralandırılan 5 DNA grubu (Acinetobacter gen. sp.) daha tanımlamışlardır (13). 2001 ve 2003 yıllarında Nemec ve ark., klinik örneklerden izole edilen örneklerden 3 yeni Acinetobacter türü (Acinetobacter ursingii, Acinetobacter schindleri ve Acinetobacter parvus) tanımlamışlardır. Aynı zamanda atık su arıtma 6 tesislerinden izole edilen sulu çamur örneklerinden de 7 yeni Acinetobacter türü (Acinetobacter baylyi, Acinetobacterbouvetii, Acinetobacter grimontii, Acinetobacter tjernbergiae, Acinetobacter towneri, Acinetobacter tandoii ve Acinetobacter gerneri) tanımlandığı bildirilmiştir(63,64). 2008 yılında orman toprağından izole edilen (Acinetobacter soli) bir tür ve 2009 yılında ise insan ve hayvan örneklerinden izole edilen 2 yeni tür (A.beijerinckii ve A.gyllenbergii) daha bildirilmiştir (65). 2.1.2. Pseudomonas aeruginosa Modern mikrobiyolojinin gelişiminden önce Pseudomonas aeruginosa’nın ciddi yara ve cerrahi yara enfeksiyonlarına neden olduğu Doggett tarafından gösterilmiştir. 1850’de Sédillot cerrahi yaralarda mavi-yeşil akıntının geliştiğini ve bunun enfeksiyon ile ilişkili olduğunu söylemiştir. 1862’de Luke mavi-yeşil irinde çomak şeklinde mikroskobik canlıların olduğunu gözlemlemiştir. 1882’de Gessard bakteriyi ilk kez izole etmiştir ve Bacillus pyocyaneus olarak adlandırmıştır. Daha sonra diğer mikrobiyologlar da çeşitli enfeksiyon bölgelerinden mikroorganizmayı izole etmişlerdir (70). Bakteri, günümüzde kullandığımız adı almadan önce Bacterium aeruginosum, Bacterium aerugineum, Micrococcus pyocianeus, Pseudomonas pyocianea, Bacterium pyocianeum, Pseudomonas polycolor gibi isimler ile anılmıştır (9). 1925’te Osler ilk kez P. aeruginosa’nın primer enfeksiyonlardan ziyade sekonder ya da fırsatçı enfeksiyonlara neden olduğunu dile getirmiştir. P. aeruginosa bağışıklık sistemini baskılayan tedavilerin gelişmesiyle özellikle akciğer, kan ve üriner sistemde hastane kaynaklı ciddi enfeksiyonlara neden olmaktadır (70). 7 Pseudomonas aeruginosa Palleroni’nin yaptığı sınıflandırmaya göre rRNA grup I de ve Gilardi’nin yaptığı sınıflandırmada Fluorescent grubunda yer alır. Fluorescent grubundaki türler (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida), suda çözünen ve ultraviyole ışık (400nm) altında sarı olarak görünen piyoverdin adı verilen pigment üretimi ile karakterize edilir. Bu grupta yer alan 3 tür de piyoverdin üretmesine rağmen sadece P. aeruginosa suda çözünen piyosiyanin adı verilen pigmenti üretir. P. aeruginosa, piyosiyanin üretimi ve 42C’de üreme özelliğiyle Fluorescent grubunun diğer üyelerinden ayrılır (46). 2.2.Mikrobiyolojik Özellikleri 2.2.1. Acinetobacter baumannii Acinetobacter türleri kimi zaman kapsüllü, 35-37°C'de üreyen, hareketsiz, karbonhidratları fermente etmeyen gram negatif bakterilerdir (3). İdeal olarak aerop ortamda ürerler. Oksidaz negatif, indol negatif, katalaz pozitif ve nitratları indirgemeyen mikroorganizmalardır. Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex içinde yer alan türler, diğer türlerin aksine sakkarolitiktir ve Hugh Leifson oksidasyon fermentasyon buyyonda yer alan karbonhidratların çoğundan asit oluşturabilirler (96). Bakterinin Gram boyama morfolojisi yaşam döngüsündeki evresine göre değişiklik gösterir. Üremenin logaritmik evresinde basil, durağan evresinde ise kokobasil-diplokok şeklinde görülür. Bu nedenle ilk izolasyondan elde edilen kültürler ile sıvı besiyerinde bulunan taze kültürler kok-kokobasil, son kültürler ile katı besiyerindeki eski kültürler ise basil görünümündedir (3). 8 İnsandan izole edilen Acinetobacter türleri klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan koyun kanlı agar, triptik soy agar gibi zengin besiyerlerinde 37°C de ürerler. Acinetobacter cinsi bakteriler koyun kanlı agarda 24. saatin sonunda 0,5-2mm çapında saydam veya mat, yüzeyden kabarık S tipi koloniler oluşturur. Acinetobacter haemolyticus koyun kanlı agarda hemolize neden olurken, diğer türler hemoliz yapmaz. Acinetobacter lwoffii dışındaki Acinetobacter türlerinin çoğu MacConkey agarda üreyebilir ve hafif pembemsi renkte koloniler oluştururlar. Glikozdan asit oluşturabilen A. baumannii gibi türler tirozin içeren kalp infüzyon agarda ve glukoz katkılı kanlı agarda kahverengi koloniler oluştururlar (96). Acinetobacter türlerinin ayrımında kullanılan fenotipik tanımlama şeması, üreme derecesi, hemoliz oluşturma, jelatin hidrolizi, glukozdan asit oluşturma ve farklı karbon kaynaklarının asimilasyonuna dayanmaktadır (12). Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında zahmetli ve uzun sürede sonuç veren bu geleneksel fenotipik testlerin yerini, karbon kaynaklarının asimilasyonuna dayanan ticari otomatize ve yarı otomatize tanımlama sistemleri almıştır (6). 2.2.2. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonadaceae ailesi içerisinde yer alan en önemli patojendir. Gram negatif, düz ya da hafif kıvrık çomak morfolojisinde olup aerob bir bakteridir. Polar yerleşimli flagellası sayesinde hareketlidir. Uzunluğu 1-3 m ve genişliği 0,5-10 m arasındadır. Kültürlerinde en önemli karakteristik özelliği suda çözünen piyosiyanin adı verilen fenazin pigmeti üretimidir (70). Bu pigment Müller Hinton gibi renksiz besiyerlerinde daha belirgin halde görülebilir. Başka hiçbir bakteride bulunmayan bu pigment sayesinde P. aeruginosa kolaylıkla tanınır (92). Bazı suşlar kırmızı ya da siyah koloniler oluştururlar. Bu, ürettikleri piyorubin (kırmızı) ve piyomelanin (siyah) pigmentleri sayesinde olur. P. aeruginosa tarafından üretilen ve difüze olabilen diğer bir pigment ise piyoverdindir. Piyoverdin, piyosiyanin ile birlikte üretildiği zaman katı besiyerinde belirgin mavi-yeşil koloniler oluşur (70). 9 P. aeruginosa çok çeşitli besiyerlerinde üreyebilir. En iyi aerob ortamlarda ürerken ortamda nitrat varlığında, nitratı termal elektron alıcısı olarak kullanarak anaerob ortamda da üreyebilir (6). %5 koyun kanlı agarda 3-5mm büyüklüğünde kenarları düzensiz, üzeri düz, β-hemolitik koloniler oluşturur. Kolonilerinin kendine özgü fazla olgunlaşmış üzüme benzetilen tipik bir kokusu vardır (92). P. aeruginosa, oksidaz testi güçlü pozitif olması ve glukozu fermente etmemesiyle Enterobacteriaceae’dan ayırt edilir (92). Karbonhidratları fermente etmemesine rağmen glukoz, fruktoz ve ksilozdan oksidatif metabolizma ile asit oluşturur ama laktoz ve sükrozdan asit oluşturmaz. 42C’de üreyebilme özelliğiyle P. fluorescens ve P. putida’dan ayrılır. Asetamid alkalizasyonu pozitiftir, nitrat ve nitriti denitrifiye eder. Simson’s sitrat besiyerinde üreyerek pozitif reaksiyon verir, hidrojen sülfit üretimi negatiftir. L-arjinin dehidrolaz testi pozitiftir. L-lizin dekarboksilaz ve L-ornitin dekarboksilaz testleri negatiftir (70). Çok sayıda köken alginat olarak bilinen ekstrasellüler polisakkarit üreten genlere sahiptir. Alginat üretimine bağlı olarak mukoid koloniler oluşturur. Mukoid koloni oluşturan kökenler, sıklıkla kistik fibrozis hastalarından, bunun yanı sıra nadiren P. aeruginosa’ya bağlı kronik pulmoner hastalığı olan ve üriner katetere sahip hastalardan izole edilir. Genel olarak çevreden ve hastane kaynaklı enfeksiyonlardan izole edilen P. aeruginosa suşları mukoid değildir. Fakat mukoid olmayan kökenler in vitro üretildikleri zaman düşük seviyelerde alginat üretebilirler (70). 10 2.3. Epidemiyolojik Özellikleri ve klinik önemi 2.3.1. Acinetobacter baumannii Acinetobacter türleri sağlıklı bireylerin en az %25' inde; koltuk altı, kasık, parmak arası gibi nemli bölgelerin deri florasında bulunabilirken; günümüzde tüm hastane kaynaklı enfeksiyonların %5-10'undan sorumlu olup sıklıkla solunum yolu enfeksiyonlarına yol açmaktadır (88,29). Acinetobacter baumannii , hastane kaynaklı pnömoni etkenleri arasında en çok izole edilen türlerden biridir (39). Ülkemizde yapılan çok merkezli bir çalışma Acinetobacter cinsinin özellikle solunum cihazı ilişkili pnömonide en sık etken olduğunu göstermektedir (49). YBÜ'lerde endemik enfeksiyonlara yol açmasının yanısıra salgınlara da yol açabilmektedir. Acinetobacter türlerinin salgınlara yol açabilmesi kuru ortamlarda uzun süre canlılığını sürdürebilmesi ve antibiyotik direnci ile ilişkili bulunmaktadır. Cansız yüzeylerde günlerce canlılıklarını sürdürebilmektedirler (26). Acinetobacter baumannii solunum yolu enfeksiyonlarından sonra en sık kan dolaşımı enfeksiyonlarına yol açmaktadır. Bu enfeksiyonlar polimikrobiyal olabilmekte, bakteriye en sık olarak koagülaz negatif stafilokoklar ve enterokoklar eşlik etmektedir (97). Bakteriyemi hastane enfeksiyonları arasında en yüksek mortaliteye sahip olan enfeksiyondur. Acinetobacter baumannii ile gelişen enfeksiyonun ciddiyeti, enfeksiyon bölgesi ve hastanın altta yatan hastalıkları ile ilişkili olarak bağışıklık sisteminin durumuna bağlıdır. A.baumannii bakteriyemisinin mortalitesi %26-68 oranında bildirilmektedir (51). 11 Acinetobacter baumannii YBÜ'lerde salgınlara yol açması, mortalitesi yüksek enfeksiyonlara neden olmasının yanısıra çoklu antibiyotik direnci ile de büyük bir klinik önem kazanmaktadır Çoklu ilaç dirençi için kökenler son on yılda belirgin bir biçimde artmıştır (68,52). Çoklu ilaç direnci için kullanılan standart bir tanım olmamakla beraber, en sık tercih edilen tanım tüm penisilinlere dirençli ve sefalosporin, kinolon, karbapenemler, aminoglikozid sınıflarından en az üç antimikrobiyal sınıfa direnç bulunmasıdır (50). Acinetobacter sp. enfekte ya da kolonize bireylerden diğer hastalara kolayca yayılıp salgınlara neden olabilmektedir (96). İnsan deri ve mukozalarında %43 oranında kolonize olabilir. En sık izole edilen türler A.lwoffii (%58), A. johnsonii (%20), A. junii (%10) ve Acinetobacter genomik tür 3 (%6) olarak raporlanmıştır (87). Sağlıklı bireylerde %44 oranında taşıyıcılık saptanan türler A. lwoffii (%61), Acinetobacter genomic species 15BJ (%12), A. radioresistens (%8) ve Acinetobacter genomic species 3 (%5) olarak bulunmuştur (8). Yoğun Bakım Üniteleri' nde (YBÜ) yatan hastalarda solunum sistemi kolonizasyonunun yüksek oranda görülmesi, ekipmanları kontamine ederek salgınlarına yol açtığı gösterilmiştir. Salgınlar sırasında hastaların cildinin kolonizasyonu, hastane personelinin ellerinin kontamine olması sonucu salgının devam etmesine ve hastane içerisinde yayılmasına neden olmaktadır (7). In vitro çalışmalar; formika, seramik, paslanmaz çelik, kauçuk, polivinil klorür içeren çeşitli yüzeylerde yaşayabileceğini göstermiştir. Yatak rayları, minder, perde, hasta kaldırma askısı, temizlik için kullanılan bezler, kovalar, kapı kolları, lavabolar, ventilatör yüzeyleri, ekipmanlar, steteskoplar, resüsitasyon ekipmanları ve bilgisayar klavyeleri kontamine olduğu bölgelerdir (32,95). 12 2.3.2. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa hastane dışında sıklıkla toprak, su ve bitkilerde bulunurken nadiren sağlıklı insanlarda ve hayvanlarda kolonize olabilir. 45-50C sıcaklığa dirençlidir ve distile suda dahi üreyebilir. Fakat düşük pH değerlerinde (≤ 4,5) canlılığını sürdüremez (70). Hastanelerde, hastaların nemli vücut bölgelerinde (aksilla, kulak, perine) kolonize olabilir ve lavabolar, musluklar, tuvaletler ve duşlar gibi nemli cansız yüzeylerden de izole edilebilir . P. aeruginosa hastanelerde özellikle uzun süreli geniş spektrumlu antibiyotik tedavisi ve kemoterapi alan, aynı zamanda mekanik ventilasyon ve cerrahi işlemlere maruz kalan hastalarda, hastane kaynaklı enfeksiyonlara neden olur (70). Pişmemiş sebzeler, hastane atıkları ve hatta hasta odalarındaki çiçekler endemik P. aeruginosa enfeksiyonu için potansiyel kaynaklardır (92). Sağlıklı insanlarda P. aeruginosa taşıyıcılığı boğaz, nazal mukoza ve ciltte % 7 ve dışkıda ise % 24 olarak rapor edilmiştir (70). Amerika’da 2003 yılında yapılan bir çalışmada, yoğun bakım ünitelerinde P.aeruginosa’nın hastane kaynaklı pnömonilerin % 24’ünden, üriner sistem enfeksiyonlarının % 16,3’ünden, cerrahi bölge enfeksiyonlarının %9,5’inden, kan akımı enfeksiyonlarının % 34’ünden sorumlu olduğu gösterilmiştir (29). 13 2.4.Dezenfektanlar: Sınıflama ve Kullanım Alanları Hastanelerde nozokomiyal enfeksiyon riski her zaman mevcut olup, dezenfektanların uygun kullanımı ile mikroorganizmaların kolonizasyonu büyük ölçüde önlenir ve enfeksiyon oluşturma riski azaltılır. Dezenfeksiyon işlemlerinde hastalar, hastane personeli ve çevre için tehlike oluşturabilecek kimyasal maddelerden kaçınılmalıdır. Tehlike oluşturabilecek kimyasal maddelerin mutlaka kullanımı gerekiyor ise, koruyucu önlemler alındıktan sonra rutin işlemlere başlanmalıdır (23,86). Sağlık alanında kullanılan ve hasta ile temas eden gereçleri ve diğer tıbbi yüzeyleri taşıdıkları enfeksiyon riskine göre kritik, yarı kritik ve kritik olmayan malzemeler olmak üzere üç gruba ayrılmıştır (80). Spaulding sınıflaması uzun yıllardır tüm dünyada enfeksiyon kontrol profesyonelleri tarafından başarı ile uygulanmış ve günümüzde halen kabul edilmektedir (81,85). Tıbbi gerece uygulanacak sterilizasyon veya dezenfeksiyon yöntemi bu sınıflamaya göre planlanmaktadır (Tablo 1). Tablo1: Tıbbi cihaz ve malzemelerin sterilizasyon-dezenfeksiyonu sınıf Kritik Yöntem/Dezenfeksiyon Cihaz, Alet ve Malzeme Steril dokuya, vücut boşluğuna veya damar Sterilizasyon yoluna giren tıbbi gereçler. Yarı Kritik Mukoza veya bütünlüğü bozulmuş deriye Sterilizasyon veya temas eden tıbbi gereçler. yüksek düzey dezenfeksiyon Kritik olmayan Sağlam deriye temas eden tıbbi gereçler Düşük düzey dezenfeksiyon 14 Kritik malzemeler Steril vücut boşlukları veya damar içine giren tüm tıbbi gereçler kritik malzemedir. Cerrahi aletler, damar içi kateterler, steril organ veya boşluklara yerleştirilen direnler, üriner sonda kritik gereçlere birer örnektir. Bu bahsedilen gereçlerin bir kısmı tek kullanımlıktır ve ticari firma tarafından steril olarak kullanıma sunulmaktadır. Tekrar kullanılması gerekli ise gerekli temizlik işlemlerinden sonra geçerli sterilizasyon yöntemlerinden biri ile steril edilmelidir (81). Yarı kritik malzemeler Mukozaya veya bütünlüğü bozulmuş deriye temas eden malzemelerdir. Yarı kritik malzemelerin dezenfeksiyonunda bakteri sporlarının dışında tüm mikroorganizmaların öldürülmesi amaçlanır (81,82). Bir dezenfektanın yüksek düzey dezenfektan olarak kabul edilmesi için mikobakteriler ve zarfsız küçük virüslere etkili olması ve bu etkinlik için tanımlanmış olan etkinlik testlerini geçmesi gereklidir (69,84). Kritik olmayan gereçler Hastanın sağlam derisine temas eden stetoskop, tansiyon aleti, EKG elektrotları gibi tıbbi malzemeler düşük düzey bir dezenfektanla, kullanım sıklığı hastane enfeksiyon kontrol komitesince belirlenen aralıklarla dezenfekte edilmelidir. Ortam kontaminasyonunun yoğun olduğu ve hastane enfeksiyonları ile ortam kontaminasyonu arasında ilişki bulunan vankomisin dirençli enterokok (VRE), Acinetobacter spp. ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA)’un sorun olduğu durumlarda hidrojen peroksit buharlama gibi yeni yöntemler kullanılabilmektedir (21,95). Dezenfektanlar; mikroorganizmaları etkileme derecelerine, etki mekanizmalarına, kimyasal yapılarına ve kullanım alanlarına göre değişik şekillerde sınıflandırılır (66). 15 A-Mikroorganizmaları etkileme derecelerine göre dezenfektanlar; yüksek düzey dezenfektanlar, orta düzey dezenfektanlar ve düşük düzey dezenfektanlar olmak üzere üç grupta toplanabilirler (66). (Tablo2) Tablo 2. Mikroorganizmaları etkileme derecelerine göre dezenfektanlar SPOR MİKOBAKTERİ ZARFSIZ MANTAR VEJETATİF ZARFLI BAKTERİ VİRÜS VİRÜS Yüksek Düzey Orta Düzey Düşük Düzey +/- + + + + + - + + + + + - - - + + + Yüksek düzey dezenfektanlar; bakteriyel endosporlar hariç mikroorganizmaların tümünü ≤10 dakikadan kısa sürede öldürebilen dezenfektanlar bu gruba girer. Yüksek düzey dezenfeksiyonda kullanılabilecek dezenfektanlara gün geçtikçe yenileri eklenmektedir. Gluteraldehit, Orto-fitalaldehit (OPA), Hidrojen peroksit, Hidrojen peroksit+perasetikasit, Gluteraldehit+fenol/fenat, Gluteraldehit +izopropil alkol, Süperokside su, Klor dioksit, Perasetik asit yüksek düzey dezenfektanlardır (83). Dezenfektanların kullanım sırasında sağlık çalışanı, hasta, tıbbi gereç ve çevre için istemeyen etkileri de ortaya çıkabilmektedir. Sık kullanılan yüksek düzey dezenfektanların avantajları ve dezavantajları Tablo 3’te verilmiştir (81). 16 Tablo 3: Yüksek düzey dezenfektanların avantajları ve dezavantajları Dezenfektan Avantajları Dezavantajları Gluteraldehit Pahalı değildir Materyal uyumu çok iyidir Solunum irritasyonu yapar Sağlam deriye temas ederse alerjik reaksiyon yapar Kötü kokuludur Kullanım alanı iyi havalandırılmalıdır Toksiktir Tüberkülosidal aktivitesi yavaştır Yüzeylerdeki kan ve dokuları fikse eder Ortofitalaldehit Hızlı etkilidir Aktivasyon gerektirmez Belirgin bir kokusu yoktur Materyal uyumu iyidir Kanı koagüle etmez, doku fiksasyonu yapmaz Deriyi, giysileri ve çevre yüzeyleri boyar Gluteraldehitten pahalıdır Hidrojen peroksit Aktivasyon gerektirmez Organik maddelerin ve bakterilerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır Atıkları zararlı değildir Koku ve irritasyon problemi yoktur Materyal uyumu iyidir Kanı koagüle etmez, doku fiksasyonu yapmaz Çinko, bakır, nikel/gümüş kaplama aletlerde kozmetik ve fonksiyonel uyumsuzluk problemi vardır Temas halinde ciddi göz hasarına yol açar Perasetik asit Son ürünleri çevreye zarar vermez Otomatize sistemi vardır Kullanıcıya zararı yoktur Materyal uyumu iyidir Kanı koagüle etmez, doku fiksasyonu yapmaz Hızlı sporisidal etkilidir Alüminyum kaplamalı materyallerde uyumsuzluk olabilir (OPA) (PA) Aktivasyon gerektirmez /Hidrojen peroksit Önemli bir rahatsız edici etkisi ya da kokusu yoktur Çevreye toksik değil Perasetik asit 17 Kozmetik ve fonksiyonel açıdan materyal uyum problemi olabilir (bakır, çinko gibi) Orta düzey dezenfektanlar; bakteriyel sporlara etki etmez, fakat mikobakterilere etkilidir. Bu dezenfektanlar aynı zamanda mantarlara, zarflı ve zarfsız, orta ve küçük boyutlu viruslere karşı da etkilidir. Alkoller (% 70-90 etanol ya da izopropanol) bazı fenolikler ve iyodofor preparatları orta düzey dezenfektanlar olarak yer alır (37). Düşük düzey dezenfektanlar; belirli bir süre içerisinde bakteriyel sporları, mikobakterileri, mantar sporlarını ve küçük veya zarfsız virusleri yok etme konusunda yeterli olmayan dezenfektanlardır. Bu dezenfektanlar rutin uygulamada faydalı olabilir, çünkü vejetatif bakteri formlarını ve çoğu mantarı, aynı zamanda zarflı virüsleri hızla öldürebilirler. Kuaterner amonyum bileşikleri ve bazı iyodoforlar ya da fenolikler düşük seviyeli dezenfektan olarak kullanılan kimyasallardır (37). B- Etki mekanizmalarına göre; Hücre zarını etkileyenler Hücre proteinlerini denatüre edenler Protein ve nükleik asitlerin fonksiyonel gruplarında modifikasyon yapanlar Enzimlerin işlevini bozarak veya değiştirerek etki edenler Bakteri sporlarına etki edenler olmak üzere beş gruba ayrılabilirler (1). C- Kimyasal yapılarına göre; Fenol ve fenol bileşikleri Klor ve klor bileşikleri İyot ve iyot bileşikleri Aldehidler Alkoller Kuarterner amonyum bileşikleri Amonyum komponentleri Hidrojen peroksit Etilen oksit olarak ayrılabilir (1). 18 D-Kullanınım alanların göre: Alet dezenfektanları Yüzey dezenfektanları Antiseptikler olarak üç grupta toplanabilir (1). Bakterilerin antibiyotiklere karşı hızla direnç geliştirebildiği bilinmektedir. Ancak bakterilerin sadece antibiyotiklere değil, kullanılan dezenfektan ve antiseptiklere de direnç geliştirebildikleri bilinmektedir fakat bakterilerde dezenfektanlara direnç geliştirmek zordur. Doğru dezenfektanla ve doğru uygulamalarla ortam ve malzemelerin dezenfekte edilmesi bu tip birçok infeksiyonun ortaya çıkmasını önleyebilecektir. Dezenfektanın hastane ortamında bulunabilen mikroorganizmalara etkili olduğunun güvenilir testlerle gösterilmesi, uygulama yöntemi ve uygulama konsantrasyonlarının doğru olarak belirlenebilmesi gerekmektedir (90). 2.5. Dezenfektan Etkinlik Testleri Dezenfektan etkinlik testleri yapılırken, test mikroorganizmasının doğru seçilmesi, süspansiyonunun dikkatli yapılması gerekmektedir. Antiseptik ve dezenfektanlar bakteriyolojinin altın çağından önce erken tarihlerde bulunmuş olmalarına rağmen uluslararası kabul gören test şemaları oluşturulabilmesi son yıllara kadar sürmüştür. Günümüzde halen değişik ülkelerde değişik prensiplere dayanan farklı testler uygulanmaktadır (77,34). Dezenfektan testleri ile ilgili çalışmalar dezenfektan kinetiğine dayandırılmaktadır. Gözlemler, bakterinin dezenfektan tarafından öldürülmesinin, dezenfektan konsantrasyonu ve bakterinin dezenfektanla temas süresine bağlı olduğunu göstermiştir (93,56). 19 Dezenfeksiyon başarısı birçok faktörden etkilenebilmektedir. Bu nedenle dezenfektan etkinlik ölçüm testleri yapılırken bu faktörler dikkate alınmalıdır. Ortamın ısı ve pH’sı, inokülüm büyüklüğü, öldürülmesi amaçlanan mikroorganizmanın cinsi, mikroorganizmanın yüzey yapısı, kullanılan dezenfektanın konsantrasyonu, ortamda dezenfektan etkisini azaltacak maddelerin bulunması, dezenfeksiyonun uygulama süresi dezenfeksiyonun başarısını etkileyen başlıca faktörlerdir (77,74). Dezenfeksiyon işlemini ve dezenfektan etkinlik test sonuçlarını etkileyen faktörler mikroorganizmalara, dezenfektana ve çevresel faktörlere bağlı olabilmektedir (53). Mikroorganizmalar mutasyonlar sonucu dezenfektana kazanılmış direnç geliştirebilir. Dezenfektana bağlı faktörler içinde dezenfektanın konsantrasyonu, dezenfektanla temas süresi ve dezenfektan solüsyonunun tazeliği sayılabilir. Ortamın ısısı, pH’sı, dezenfektanın sulandırıldığı suyun sertlik derecesi, ortamdaki kir ve organik madde yükü dezenfeksiyonu etkileyen çevresel faktörlerdir (2). Bir dezenfektanın test edilen mikroorganizmaya etkili olduğunun kabul edilmesi için, dezenfektanın bakteri ile temasından sonra canlı bakteri sayısında 5 log’luk (%99.999) bir azalmaya yol açması gerekmektedir (27). Dezenfektan etkinlik testleri uluslararası standardizasyon kuruluşlarının (Amerikan Assocation of Analytical Chemist ve German Society for Hygien and Microbiology) önerdiği standart mikroorganizma suşları ile yapılmaktadır. Vejetatif bakterilerde bakterisidal etkinlik için; Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Escherichia coli ATCC 10536, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Proteus mirabilis ATCC 14153, Enterococcus hirae ATCC 10541, Salmonella typhimurium ATCC 13311.Küf ve maya formunda fungasidal etkinlik için; Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 ve Aspergillus niger ATCC 16404 suşları önerilmektedir (73). Bir dezenfektanın vejetatif bakterilere etkisi incelenirken en az bir gram-negatif (P. aeruginosa ATCC 15442) bir de gram-pozitif 20 (S. aureus ATCC 6538) bakteri kullanılması gereklidir (42). Dezenfektanın standart suşlara etkili olduğunun gösterilmesi, ürünün aynı grupta yer alan tüm suşlara her zaman etkili olacağı anlamına gelmez, zira standart suşlar ile hastane ortamından izole edilen bakteri izolatlarının dezenfektanlara duyarlılığı farklı olabilmektedir (30). Dezenfektan etkinlik testleri 3 fazda incelenir. Birinci fazda dezenfektan maddenin antimikrobiyal etkisinin olup olmadığı araştırılır. Bu faz, ilk tarama testlerini kapsar. Süspansiyon ve fenol katsayısı gibi basit testlerin çoğu birinci safha ön testleridir. Dezenfektan maddenin antimikrobiyal etkisi varsa ikinci faz testlerine geçilir. İkinci faz deneyleri yine laboratuvar ortamında in vitro olarak yapılır. Bu testlerde gerçek yaşamdaki uygulamalar taklit edilir, böylece çok daha gerçekçi sonuçlar elde edilir. Bu aşamada dezenfeksiyon işlemi ve dezenfektanın değişik uygulamalardaki etkili konsantrasyonu belirlenmiş olur. Bu amaçla süspansiyon testlerine ek olarak kapasite testleri ve taşıyıcı testleri kullanılır. Üçüncü faz ise sahada yapılan ve dezenfektanın gerçek performansını ortaya koyan testlerdir. Bu testler cansız ya da canlı ortamlarda yapılabilir. Ancak bu son faz testleri daha az kullanılmaktadır. Zira alanda tam standardizasyon mümkün olamamaktadır (77,74). Testler, yapılış özellikleri ve farklı uygulama alanlarına göre sınıflandırılmıştır (77). A.Test mikroorganizmasına göre sınıflama: 1.Antibakteriyel aktivitenin gösterilmesi: Aside dirençli olmayan vejetatif bakteriler için bakterisidal testler, aside dirençli bakteriler için tüberkülosidal testler, bakteriyel sporlar için sporisidal testler. 2.Antifungal aktivitenin gösterilmesi: Fungusidal testler. 3.Antiviral aktivitenin gösterilmesi: Virüsidal testler. 21 B.Etki tarzına göre sınıflandırma: Bakteriyostatik ve bakterisidal, tüberkülostatik ve tüberkülosidal, sporisidal, fungustatik ve fungusidal ve virüsidal testler. C.Test yapısına göre sınıflandırma 1.İn vitro testler • Minimum inhibisyon konsatrasyonunu (MİK) ölçen testler • Süspansiyon testleri • Kapasite testleri • Taşıyıcı testler 2.Uygulama testleri: Yüzey, alet, oda yüzeyleri, dokuma, hava, el ve deri dezenfektanlarının etkisini ölçen testler. 3.Kullanım anında dezenfektanın etkinliğini ölçen (in-use) testler. D.Amaçlarına göre testlerin sınıflandırılması 1.Birinci faz testleri: Bir kimyasal maddenin antibakteriyal etkisinin olup olmadığını gösteren testlerdir. Temas süresi ve dezenfektan konsantrasyonunun ilişkisini gösteren, ayrıca serum gibi organik maddelerin etkisini inceleyen testleri kapsar. 2.İkinci faz testleri: Spesifik bir uygulama için kullanım konsantrasyonunu belirleyen testlerdir. 3.Üçüncü faz testleri: Uygulama alanı için testler olup dış ortam ve doku için dezenfektanın uygulamadaki performansını inceleyen testlerdir. 22 İn Vitro Testler: 1.Minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) Dezenfektanın testi: bakteriyostatik etkisini ölçer. Bakteri üreme inhibisyonunun ölçümüne dayanır ve antibiyotik duyarlılığın ölçüldüğü seri tüp dilüsyona benzer (77). Bir bakteri suşu dezenfektanın pratikte kullanılan konsantrasyonuna maruz kaldığında ölürken, o dezenfektana karşı MİK değerleri yükselmiş olabilir (11). Bakterilerin dezenfektanlara duyarlılığında değişiklik olup olmadığı kantitatif olarak MİK testleri ile belirlenebilir (45). 2.Süspansiyon testleri: Süspansiyon testleri, hem birinci faz, hem de ikinci faz deneylerinde kullanılır. Belirli sayıda mikroorganizma içeren bakteri süspansiyonunun dezenfektan ile karıştırılması esasına dayanmaktadır. Belli bir temas süresi sonunda, karışım nötralize edilir ve katı besiyerine ekilir ve uygun inkübasyon sonrası değerlendirilir (77). Günümüzde en çok kullanılan testler kantitatif süspansiyon testleridir. Süspansiyon testinde dezenfektan madde ve bakteriler doğrudan etkileşmektedir. Bu testler en iyi standardize edilen dezenfektan etkinlik testleridir (75). Süspansiyon testlerinin çok sayıda avantajı vardır. Diğer testlere göre basittir ve maliyeti düşüktür. Laboratuvarda çok rahat uygulanabilmekte ve özel ekipmana ihtiyaç duyulmaz. İyi standardize edilmiş olmaları, tekrarlanabilir olmaları ve aynı şartlarda yeniden yapılabilir olmaları en önemli avantajlarıdır. Geniş bir kullanım alanları vardır. Bu testlerde temas süresi, ısı, mikroorganizma türü, engelleyici maddeler gibi birçok değişken aynı anda incelenebilir (40). Süspansiyon testlerinin en önemli dezavantajları gerçek yaşam koşullarını yansıtmamalarıdır. Gerçek yaşamda mikroorganizmalar süspansiyon şeklinde değildir. Organik maddelerin biriktiği, kuruduğu, yüzeye tutunduğu ortamlarda bulunabilirler. Yüzeylere tutunmuş bakterilerin dezenfektanlara daha dayanıklı olduğu bilinmektedir. Süspansiyon testleri sonuçları pratiğe yönelik testler ile her 23 zaman korelasyon göstermez. Tüm bu nedenlerden tarama testi olarak kullanılır; alınan sonuçlar uygulama test sonuçları ile doğrulanmalıdır (33). 3.Kapasite testi: Süspansiyon testleri iyi standardize edilmiş olmalarına ve kolay uygulanabilmelerine karşın, gerçek yaşam koşullarını iyi yansıtmamaktadır. Bu amaçla geliştirilmiş yöntemlerden biri kapasite testidir. Kapasite testinde, dezenfektana birkaç kez bakteri eklenir ve dezenfektanın bakteri öldürme kapasitesi test edilir. Dezenfektan için sonuç iyi veya yetersiz diye belirlenir. Bu testte katsayı gibi sayısal bir değer kullanılmamakta ve değişik mikroorganizmalar test edilebilmektedir. Kirli ve temiz koşullardaki dezenfektan etkisinin gösterilmesi ise testin en önemli yanıdır (44,22,38,5). Kapasite testleri alet ve yüzey dezenfeksiyonundaki pratik şartları iyi taklit eder. Ancak bu testleri standardize etmek kolay değildir. En önemli dezavantajları yorucu olmaları, zor yapılmaları ve tam olarak standardize edilememiş olmalarıdır (55). 4.Taşıyıcı testi: İkinci faz deneylerinde kullanılan taşıyıcı testi bir dezenfektan maddenin alet veya yüzey dezenfeksiyona yönelik etkinliğini belirleyebilmek için yapılır. Bu testte kumaş, cam, porselen, metal gibi taşıyıcı bir nesnenin yapay olarak mikroorganizmalarla bulaştırılır ve dezenfektanın önerilen kullanım konsantrasyonuna daldırılır. Belirli bir temas süresi sonrasında mikroorganizmaların ölüp ölmediği kontrol edilir. Taşıyıcı testi kalitatif veya kantitatif şekilde yapılabilir. Kalitatif taşıyıcı testinde bakteri bulaştırılmış bir kumaş parçası dezenfektana daldırılır ve 5-120 dakikalık temas süresi sonunda sıvı besiyerine kültürü yapılır. Üreme olmaması test edilen ürünün etkili olduğunu gösterir. Taşıyıcı testi, temas süresi ve aktif konsantrasyon ilişkisini belirlemeye yarar (77,72,60). 24 2.6. Bakterilerde Antiseptik ve Dezenfektanlara Karşı Direnç Antiseptik, dezenfektan ve koruyucu maddeler, hücrede özgül bir hedefi bulunan antibiyotiklerden daha geniş bir etki spektrumuna sahiptir; çünkü bunların mikroorganizmalar üzerinde daha çok hedefi bulunmaktadır (79). Antibiyotiklerde olduğu gibi biyosit maddeler de değişik mekanizmalarla mikroplar üzerinde üremeyi durdurucu veya öldürücü etki gösterir. Aynı madde bir veya daha fazla mekanizma ile etki edebilir. Biyositler, hücre duvarını bozma (sentezi önleme, lipidleri, eritme), sitoplazma zarını bozma, hücre içi bileşenlerinin dışarıya sızmasına neden olma, mikroorganizmaların enzim, koenzim ve diğer protein yapılarını bozma (oksitleme, alkilleme), elektron transportu ve oksidatif fosforilasyonu inhibe etme, makromoleküllerle etkileşme veya bunların sentezini önleme gibi mekanizmalarla etki etmektedir (79,17,78, 57). Antibiyotiklere karşı olduğu gibi antiseptik ve dezenfektan maddelere karşı direnç görülebilir; bu intrinsik ve kazanılmış direnç diye iki ana bölümde incelenebilir (78). İntrinsik direnç; mikroorganizmanın doğal olarak ilgili maddeye karşı direnç durumunu ifade eder. Genellikle hücre geçirgenliğinde bozulma ile, bazen yapısal parçalayıcı enzimler ile ilişkilidir. Biyofilm oluşumu da bir intrensek direnç mekanizmasıdır. Bu durum fizyolojik direnç olarak tanımlanmakla birlikte aslında bir fizyolojik (fenotipik) adaptasyondur. Biyofilm tabakası içindeki bakteriler sıvı ortamda serbest üreyen bakterilere göre dezenfektanlara 10-100 kat daha dirençlidir (78,43). (Tablo 4) 25 Tablo 4. Antiseptik ve dezenfektanlara karşı bakterilerde intrinsik direncin mekanizmaları Direnç tipi Örnekler Direnç Mekanizması Gram negatif bakteriler KAB*, Triklozan Dış membranla ilgili permeabilite engeli biyositin geçirgenliğini (hücreye alınımını) önler; glikokaliks de bu olaya katkıda bulunabilir Mikobakteriler Klorhekzidin, KAB*, Gluteraldehit Mikobakteri hücre duvarındaki balmumsu madde, mikolat ve arabinogalaktan yeterli biyosit girişini engeller Bakteri sporları Klorhekzidin, KAB*, Fenol Bileşikleri Spor biyosit girişine engel olur. Gram pozitif bakteriler Klorhekzidin İnaktivasyon (kromozom aracılıklı) Klorhekzidin Hücre duvarı değişiklikleri: pepdidoglikan değişiklikleri, lipid artışı; glikokaliks/mukoekzopolisakkarit biyosit difüzyonunu azaltır. Klorhekzidinin parçalanması KAB*:Kuaterner amonyum bileşikleri Kazanılmış direnç; kromozomlardaki mutasyon veya plazmid ya da transpozonlar aracılığı ile olmaktadır (78,57). Biyositlere karşı plazmid aracılıklı bir direncin olup olmadığı konusunda değişik çalışmalar yapılmıştır. Gümüş, diğer metaller ve organik civa bileşikleri dışındaki biyositler için böyle bir ilişki kanıtlanamamıştır. Bununla birlikte bakterilerde klorhekzidin, KAB (kuaterner amonyum bileşikler), triklozanla birlikte diamidinler, akridinler ve etidyum bromide karşı artmış toleransın plazmid ilişkisi konusundaki iddialar literatürde mevcutttur (51,56,65). 26 Hastane izolatlarında saptanan yüksek dezenfektan direncinin plazmid ilişkisi konusunda açık delil yoktur. Katyonik ajanların yaygın kullanımı biyosit dirençli kökenlerin seçiliminden sorumlu olabilse de bu hükmü doğrulayacak fazla veri yoktur. Yapılan çalışmaların sonucunda normal koşullarda klorhekzidin veya KAB direncini transfer etmenin zor olduğunu ve gram negatif bakterilerde biyositlere karşı plazmid aracılı direncin olası olmayan bir durum olduğu görülmüştür. Aksine, R124 plazmidi E. coli’de OmpF dış membran proteinini değiştirir ve bu plazmidi içeren bakteriler KAB ve diğer maddelere karşı daha dirençli hale gelir (78,57). Gentamisin direncini kodlayan plazmidi taşıyan S. aureus kökenlerinin klorhekzidin, diamidinler, KAB, etidyum bromid, propamidin izotionat ve akridinler gibi bazı biyositler için MIK düzeyi yükselmektedir. Metisilin dirençli S. aureus kökenlerinin povidon iyota karşı toleransında 500 kat gibi ileri düzeyde artış saptanmıştır (57,61). 2.7.Bakterilerde Dezenfektan Direnç Mekanizmaları 1.Dezenfektanın bakteri hücresindeki hedefinin değişime uğraması: Antibiyotikler hücredeki spesifik bir hedefi etkilerler, antibiyotiklerin tersine dezenfektanların hücrede genelde çoklu hedef yapıları/ molekülleri bulunur (71). 2.Geçirgenlik: Hücre içerisinde dezenfektan madde birikmesinin engellenmesi dezenfektan direncine yol açar. Lipopolisakkarit, dezenfektanın hücre içine geçişi engellemede önemlidir. Dış membranın dezenfektan direncinde önemli bir yeri olduğu açıktır. Gram-negatif bakteriler gram-pozitif bakterilere göre dezenfektanlara daha dirençlidir. Gram-negatif bakterilerdeki dış membran tabakası bir fiziksel bariyer olarak rol oynar ve antimikrobiyal maddelerin hücreye girişini kısıtlar. Lipopolisakkarit (LPS) molekülleri hidrofobik maddelerin hücre içine girişini engeller. Gram-negatif bakteriler arasında, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia 27 cepacia, Proteus spp. ve Providencia stuartii birçok dezenfektanlara en fazla dirençli olan bakterilerdir. dezenfektanlara Eskiden daha beri dirençli P.aeruginosa’nın olduğu iyi birçok bilinmektedir. bakteriye göre P.aeruginosa’nın dezenfektanlara ve antibiyotiklere daha dirençli olmasının nedeni temel olarak dış membranlarının daha az geçirgen olmasına bağlıdır. P.aeruginosa’larda hücre duvarının yüksek magnezyum içeriği, LPS kompozisyonundaki farklılık ve küçük porin moleküllerinin varlığı dezenfektan maddenin hücreye difüzyonunu zorlaştırır(71). A.baumannii'de LPS'nin anyonik olması, LPS molekülleri arasında kuvvetli yan bağların varlığı, doymamış asitlerin eksikliği ve LPS de ortaya çıkan değişimler dezenfektanların hücreye girişini etkiler. Dış membranın harabiyete uğratılması dezenfektanlara duyarlılığı arttırmaktadır (94). Geçirgenliği etkileyen bir diğer mekanizmada biyofilm oluşumudur. Biyofilmin içinde üreyen bakterilerde dezenfektan direnç gözlenmesi büyük olasılıkla biyofilm tabakasının dezenfektan maddenin geçişine engel oluşturmasına bağlıdır (71). 3.’’Efflux’’ (hücre dışına atılım) pompaları: Bakterilerde bulunan bazı ‘’efflux’’ sistemleri geniş spektrumlu olup, yapısal olarak birbiri ile ilişkisiz olan birçok dezenfektan maddeyi hücre dışına atabilmektedir (71). Antibiyotik direnç mekanizmaları ile dezenfektan direnç mekanizmaları arasında benzerlik ve farklılıklar vardır. Uygun dezenfektan, uygun konsantrasyonlarda ve uygun temas süresinde kullanılmazsa dezenfektanlara karşı direnç gelişebilir ve buna bağlı olarak antibiyotikler dirençli suşlar seçilebilir (71). 28 3.GEREÇ VE YÖNTEMLER 3.1. Gereçler 3.1.1. Standart Kökenler 3.1.1.1 Biyofilm üretimi için; Biyofilm üreten standart kökenler; Acinetobacter baumannii ATCC 19606 ve Pseudomonas aeruginosa PAO-1 (sokak tipiwild type) Biyofilm üretemeyen standart köken; Pseudomonas aeruginosa PAO-JP3 (lasR, rhlR mutantı) 3.1.1.2 Dezenfektan aktivitesi için; Dezenfektanlara duyarlı standart kökenler; Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Escherichia coli ATCC 10536 ve Staphylococcus aureus ATCC 6538 3.1.2.Besiyerleri MacConkey Agar (BioMerieux/ Fransa) Luria Bertani Sıvı Besiyeri (Sigma/ USA) Triptik soy Agar (Biolife/ İtalya) Skim milk powder (Oxoid/ İngiltere) 3.1.3.Kimyasal Maddeler Kristal viyole (Merck/ Türkiye) Etanol (%95'lik) Potasyum dihidrojen fosfat (Merck/ Türkiye) Di-sodyum hidrojen fosfat (Merck/ Türkiye) 29 3.1.4.Dezenfektan maddeler Sodyum hipoklorid (%1'lik) OPA (Orto-fitalaldehit) (%0,5'lik) (Anios) Klorhekzidin (%4'lük) (Anios) Paresetik asit (%2'lik) (EcoLab) Paresetik asit + hidrojen peroksit (%0,2+ %7,5) (EcoLab) 3.1.5.Cihazlar ve laboratuvar malzemeleri Manyetik karıştırıcı (Yellow Line) Kaba terazi (Scaltec) Hassas terazi (Sartorius) Etüv (Memmert) Buzdolabı (Arçelik) Derin dondurucu (Ilshin) pH Metre (WTW Wissenschaftlich) Otoklav (HV-85 Hirayama) Pastör fırını (Elektro-Mag) Plastik petri (Fıratmed) Cam pipetler (1, 2, 5 ml ölçekli) (MedLab) Cam deney tüpleri (12x75 mm ve 16x100 mm) (MedLab) Otomatik pipetler (1-20, 10-100, 20-200, 100-1000l) (Finnpipette, Pipetman) Pipet ucları (1-10, 10-100, 20-200, 100-1000l ) 96 kuyucuklu düz taban plak (TPP) Ependorf ELISA plak okuyucu (Labsystems Multiskan MS) Vorteks karıştırıcı (Yellow Line) 30 3.2.Yöntemler 3.2.1.Çalışma Kökenleri 2013 yılında Marmara Üniversitesi Pendik Eğitim ve Araştırma Hastanesi’ne başvuran hastalardan etken olarak izole edilen 21'i çoklu ilaç dirençli (ÇİD) 50 Pseudomonas aeruginosa ve 29'u ÇİD'li 50 Acinetobacter baumannii klinik izolat çalışmaya dahil edilmiştir. Kökenlerin tanımlanma işlemleri Maldi-TOF MS (bioMérieux) otomatize sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Kökenlerin antibiyotik dirençleri CLSI'ın M100-S23 dökümanına göre disk difüzyon yöntemiyle değerlendirilmiştir (20). Antibiyotik direnç durumlarına göre iki gruba ayrılmıştır. İlk grup bütün antibiyotiklere duyarlıyken, ikinci grup ise karbapenem, aminoglikozid ve florokinolon gruplarının üçüne de direnç gösteren P.aeruginosa (n:21) kökenleri ve tüm penisilinlere dirençli ve sefalosporin, kinolon, karbapenemler , aminoglikozid gruplarından en az üç gruba direnç gösteren A.baumannii (n:29) kökenleri ÇİD olarak tanımlanmıştır (62,50). Çalışmada biyofilm üretimine göre standart suşlardan A. baumannii ATCC 19606 ve P.aeruginosa PAO-1 kökenleri, negatif kontrol olarak ise steril LB sıvı besiyeri ve P.aeruginosa PAO-JP3 kökeni (58), Dezenfektan aktiviteisine görede standart suşlardan Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Escherichia coli ATCC 10536, Staphylococcus aureus ATCC 6538 kökenleri kullanılmıştır (73). Gliserollü skim milk stok besiyerinde -20°C'de saklanan kökenler çalışma öncesi MacConkey agara pasajlanmış ve ikinci pasajın ardından ilgili deneyin gerektirdiği işlemler yapılmıştır.Hasta kaynaklı kökenlerin kullanılması nedeniyle çalışmamız, Marmara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü girişimsel olmayan klinik araştırmalar etik kurulundan onay alınarak gerçekleştirilmiştir. 31 3.2.2.Biyofilm üretiminin belirlenmesi MacConkeyde’ de üretilen A.baumannii (n:50) ve P.aeruginosa (n:50) kökenleri ile kontrol kökenlerinden birer koloni alınıp, 5ml Luria Bertani (LB) sıvı besiyeri içeren tüplere ekim yapılmış ve 37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. LB sıvı besiyeri içerisinde 1:100 oranında sulandırmayı takiben 100’er l alınarak üç kuyucuğa dağıtılmıştır. Plaklar 24 saat 37°C’de inkübe edildikten sonra üç kez distile su ile yıkanmıştır. Yıkama işleminin ardından her kuyucuğa %0,1’lik kristal viyole çözeltisinden 100’er μl eklenerek plaklar oda ısısında 10 dakika bekletilmiştir. Ardından plaklar üç kez distile su ile yıkanarak serbest boya çözeltisi uzaklaştırılmış ve oluşan biyofilmin kantitasyonu amacıyla kuyucuklara 200 μl %95’lik etanol eklenmiş, 5 dakika beklendikten sonra absorbans değerleri 550 nm’de optik okuyucu ile ölçülmüştür (Resim 1). Her köken için 3 kuyucuğun absorbans değerlerinin ortalaması alınmış ve deney 3 defa tekrarlanmıştır. Eşik değerin (cut-off) belirlenebilmesi amacıyla, biyofilm üretimi negatif olan P. aeruginosa PAO-JP3 kökenleri ile yapılan çalışmaların ortalamalarına 2 standart sapma eklenerek, %95 duyarlılıkla eşik değer >0.169 olarak belirlenmiş, 550 nm’de absorbans değeri >0.169 saptanan kökenler biyofilm üretimi açısından değerlendirilmiştir (58). Resim 1: Biyofilm üretiminin mikroplakta saptanması A1-2-3:P. aeruginosa PAO-1 kökeni (Pozitif Kontrol) A4-5-6: P. aeruginosa PAO-JP3 kökeni (Negatif Kontrol) A7-8-9: Steril LB sıvı besiyeri (Negatif Kontrol) A10-11-12, B1-2-3: Klinik A.baumannii kökenleri (Pozitif) B7-8-9, B10-11-12: Klinik P. aeruginosa kökenleri (Pozitif) B4-5-6: Klinik P. aeruginosa kökenleri (Negatif) 32 pozitif olarak 3.2.3.Dezenfektan etkinliğini belirlenmesi Antiseptik ve dezenfektanların seçilen suşlar üzerine etkilerinin incelenmesi için, Michel ve Zach (59)'ın kullandığı süspansiyon test yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem, German Society for Hygiene and Microbiology'nin önerdiği kalitatif ve kantitatif süspansiyon testinin modifiye şeklidir. MacConkey'de üretilen Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Escherichia coli ATCC 10536, Staphylococcus aureus ATCC 6538, klinik A.baumannii (n:50) ve klinik P.aeruginosa (n:50) kökenlerinden fosfat tamponunda 0.5 McFarland standardında bir süspansiyon hazırlanmış ve 1/100 oranında sulandırılmıştır. Bu süspansiyondan 100 μl alınarak 100 μl dezenfektan solüsyonu bulunan steril ependorflara oda ısısında (20-25°C) aktarılmış ve 5 dakika sonra seri dilüsyonları yapılmıştır (48,59). Her bir seri dilüsyondan 10μl alınarak triptik soy agara (TSA) damla ekim yapılmış (Resim 2) ve 37°C de 18 saat inkübe edilmiştir (Resim3) (19). Belirlenen temas süresi ve konsantrasyonda üreme olmaması, dezenfektanın etkin olduğu şeklinde değerlendirilirken (48,59); Pozitif kontrole kıyasla %99,999'luk (≥10 koloni) azalma görülmeyen dezenfektan solüsyonları etkisiz olarak bulunmuştur (27). Her bir kökenin dezenfektan solüsyonu içermeyen süspansiyonları pozitif kontrol olarak kullanılmıştır (48,59). 33 Resim 2: Seri dilüsyonların triptik soy agara (TSA) damla ekimi Resim 3: Triptik soy agara (TSA)'da A7 suşunun dezenfektan etkinliği A7 pozitif kontrol OPA NaClO 3.2.4. İstatistiksel değerlendirme İstatistiksel analizler SPSS yazılımı (v.15, SPSS, A.B.D) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kullanılan testler için p<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. 34 4.BULGULAR 4.1.Biyofilm Testi Bulguları Negatif kontrol suş (P. aeruginosa PAO-JP3) ile gerçekleştirilen deneyler sonucunda biyofilm üretimi için eşik değer 0,169 olarak belirlenmiş ve buna göre biyofilm pozitifliği A.baumannii' de %74, P.aeruginosa' de %40 olarak bulunmuştur. ÇİD P.aeruginosa suşlarının %42.8’i biyofilm pozitif iken, ÇİD A.baumannii suşlarında bu oran %75.8 olarak saptanmıştır. Antibiyotik duyarlı P.aeruginosa suşlarının %37.9’u, A.baumannii suşlarının ise %71.4’ü biyofilm pozitif bulunmuştur (Tablo 5). Tablo 5. Klinik Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobater baumannii suşlarında biyofilm üretimi P.aeruginosa A.baumannii (N:50) (N:50) ÇİD Duyarlı Toplam ÇİD Duyarlı Toplam N (%) N (%) N (%) N (%) N (%) N (%) 9(42,8) 11 (37,9) 20 (40) 22 (75,8) 15 (71,4) 37 (74) negatif 12 (57,2) 18 (62,1) 30(60) 7(24,2) 6(28,6) 13(26) Toplam 21 29 50 29 21 50 Biyofilm pozitif Biyofilm 35 4.2.Dezenfektan Etkinlik Testi Bulguları Kullandığımız tüm dezenfektan ve antiseptikler Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Escherichia coli ATCC 10536, Staphylococcus aureus ATCC 6538 kökenlerinde etkili bulunmuştur. ÇİD A.baumannii ve P.aeruginosa suşlarında (n:50), hastanemizde sıklıkla kullanılan el antiseptiklerinden klorhekzidin %98 (n:49/50), dezenfektanlardan sodyum hipoklorit %90 (n:45/50), OPA %96 (n:48/50), PA %94 (n:47/50), perasetik asit/hidrojen peroksit %96 oranında etkili bulunmuştur. Duyarlı A.baumannii ve P.aeruginosa suşlarında (n:50) ise klorhekzidin, OPA ve PA %100 (n:50/50) etkili bulunurken, sodyum hipoklorit %98 (n:49/50), perasetik asit/hidrojen peroksit ise %94 (n:47/50) oranında etkili bulunmuştur (Tablo 6). Tablo 6: Klinik P.aeruginosa ve A. baumannii suşlarında dezenfektan direnç durumu Pseudomonas aeruginosa ÇİD (n:21) Duyarlı (n:29) ÇİD (n:29) Duyarlı (n:21) Biyofilm Biyofilm Biyofilm Biyofilm Biyofilm Biyofilm Biyofilm Biyofilm pozitif negatif pozitif negatif pozitif negatif pozitif negatif (n:9) (n:12) (n:11) (n:18) (n:22) (n:7) (n:15) (n:6) E 1 a E OPA E E Klorhekzidin E Perasetik asit Sodyum Acinetobacter baumannii E 4 a E 1 a E E E 2a E E E 1a E E E E E E E E E E 3a E E E E 1a 1a E 1a E 1a 1a Hipoklorit (PA) PA+Hidrojen peroksit Kısaltmalar: E:Etkin a:Rakamlar dirençli suş sayısını tanımlamaktadır. 36 Elli klinik P.aeruginosa suşundan 3'ü çeşitli dezenfektanlara karşı dirençli bulunmuştur, bunlardan sadece bir tanesi de biyofilm pozitif saptanmıştır. P.aeruginosa suşlarında biyofilm oluşumuyla dezenfektan direnci arasındaki bağlantı anlamlı bulunmamıştır. Biyofilm üretmeyen bir P.aeruginosa suşu, aynı anda klorhekzidin ve perasetik asit/hidrojen peroksite dirençli saptanmıştır. Klinik A.baumannii suşlarının sonuçları incelendiğinde, toplam 10 suş bir veya birden fazla dezenfektana dirençli bulunurken, bunlardan sadece bir tanesi biyofilm üretimi açısından negatif bulunmuştur. Dezenfektan dirençli saptanan 10 A.baumannii suşundan 9'u biyofilm pozitif olarak saptanmıştır. A.baumannii grubunda 3 suş aynı anda iki dezenfektana birden dirençli bulunmuştur. Bunlardan ikisi sodyum hipoklorit ve perasetik aside dirençli, bir suş ise OPA ve perasetik aside dirençli saptanmıştır (Şekil 1). Şekil 1. Biyofilm üreten ve üretemeyen, P.aeruginosa ve A.baumannii izolatların, toplam dezenfektan duyarlılığı ve dirençi 37 A.baumannii dış membran geçirgenliği P.aeruginosa'dan 2-7 kat daha daha azdır. P.aeruginosa ile karşılaştırıldığında, A.baumannii suşlarında dezenfektan direnci istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde yüksek olduğu şekil 2 de görülmektedir. (Pearson ki-kare testi ile değerlendirildiğinde, p<0.05) Şekil 2. P.aeruginosa ile A.baumannii arasındaki dezenfektan direncinin istatistiksel değerlendirilmesi Suşların biyofilm üretimleri ve dezenfektan etkinlik sonuçları tablo 7 de verilmiştir. 38 Tablo 7a: Klinik Acinetobater baumannii kökenleri (n:50) biyofilm üretmesi ve dezenfektan etkinliklerinin değerlendirilmesi Klinik Antibiyotik köken no direnç A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30 A31 A32 A33 A34 A35 A36 A37 A38 A39 A40 A41 A42 A43 A44 A45 A46 A47 A48 A49 ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD ÇİD Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Duyarlı Biyofilm NaClO NEGATİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF NEGATİF NEGATİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF POZİTİF NEGATİF NEGATİF POZİTİF NEGATİF POZİTİF E E E E E E 0 E E E E E E 0 E E E 0 E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E E E E E OPA Klorhekzidin E 0 E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E A: A.baumannii ve P: P.aeruginosa, E: Etkin , 0: Etkin değil 39 PA PA +H2 O2 E 0 E E E E E E E E E E E 0 E E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E Tablo 7b: Klinik Pseudomonas aeruginosa kökenleri (n:50) biyofilm üretmesi ve dezenfektan etkinliklerinin değerlendirilmesi Klinik Antibiyotik Biyofilm köken no direnç P1 ÇİD POZİTİF P2 ÇİD POZİTİF P3 ÇİD POZİTİF P4 ÇİD NEGATİF P5 ÇİD NEGATİF P6 ÇİD NEGATİF P7 ÇİD NEGATİF P8 ÇİD POZİTİF P9 ÇİD NEGATİF P10 ÇİD NEGATİF P11 ÇİD POZİTİF P12 ÇİD POZİTİF P13 ÇİD NEGATİF P14 ÇİD NEGATİF P15 ÇİD NEGATİF P16 ÇİD NEGATİF P17 ÇİD NEGATİF P18 ÇİD NEGATİF P19 ÇİD NEGATİF P20 ÇİD NEGATİF P21 ÇİD NEGATİF P22 Duyarlı POZİTİF P23 Duyarlı POZİTİF P24 Duyarlı POZİTİF P25 Duyarlı NEGATİF P26 Duyarlı POZİTİF P27 Duyarlı POZİTİF P28 Duyarlı NEGATİF P29 Duyarlı POZİTİF P30 Duyarlı NEGATİF P31 Duyarlı NEGATİF P32 Duyarlı POZİTİF P33 Duyarlı POZİTİF P34 Duyarlı POZİTİF P35 Duyarlı NEGATİF P36 Duyarlı NEGATİF P37 Duyarlı POZİTİF P38 Duyarlı NEGATİF P39 Duyarlı NEGATİF P40 Duyarlı NEGATİF P41 Duyarlı NEGATİF P42 Duyarlı NEGATİF P43 Duyarlı NEGATİF P44 Duyarlı NEGATİF P45 Duyarlı NEGATİF P46 Duyarlı POZİTİF P47 Duyarlı NEGATİF P48 Duyarlı NEGATİF P49 Duyarlı NEGATİF P50 Duyarlı POZİTİF NaClO OPA klorhekzidin PA PA +H2 O2 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 0 A: A.baumannii ve P: P.aeruginosa, E: Etkin , 0: Etkin değil 40 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Bakterilerin hastane ortamındaki varlığı, hastalar ve personelin sürekli kontaminasyonuna ve bununla ilişkili olarak hastane enfeksiyonlarının kontrolünde güçlüğe neden olmaktadır. Bu nedenle ortamın dezenfeksiyonu ve el yıkama uygulaması büyük bir önem taşımaktadır. P.aeruginosa ve A.baumannii hastane enfeksiyonlarının en sık rastlanan etkenleri arasında yer alan gram-negatif mikroorganizmalardır (18). P.aeruginosa ve A.baumannii türleri hastane enfeksiyonlarının en sık etkeni olan nonfermentatif gram-negatif mikroorganizmalardır. İzmir de 2014 yılında yapılan bir çalışmada gram negatif bakterilere bağlı hastane enfeksiyon dağılımın da P.aeruginosa %33 , A.baumannii %30 , K.pneumoniae %25, E.coli %12 olarak izlenmiştir (10). Bu patojenlerin çoklu antibiyotik direnci geliştirme yetenekleri, çevre yüzeylerde uzun süre yaşayabilmeleri ve salgınlara yol açmaları nedeniyle önemleri her geçen gün artmaktadır (18). Hastanemizde 2013 yılı içerisinde yoğun bakım ünitelerinde yatan hastalardan 164 adet Pseudomonas sp. ve 395 adet Acinetobacter sp. suşu izole edilmiştir. Antiseptik ve dezenfektanların uygun temas süresi, yeterli konsantrasyon gibi özellikler açısından doğru şekilde kullanılmaması sonucu hastane ortamında bu maddelere karşı direnç gösteren mikroorganizmaların seçilmesi ve yerleşmesi mümkün olmaktadır (54,90). Bu yüzden doğru dezenfektan seçilmeli ve doğru temas süresi, uygun kosantrasyonlarda uygulanmalıdır. Dezenfektanların etkinliğini saptamada, yöntemin uygulama koşulları, test edilecek dezenfektanın formülasyonu ve etki spektrumu ile ortamda bulunabilecek organik ya da inorganik maddelerin varlığı dikkate alınmalıdır (67). 41 Çalışmamızda yer alan suşlar biyofilm üretimi açısından incelendiğinde, P.aeruginosa suşlarının %40’ı, A.baumannii suşlarının ise %74’ünün biyofilm ürettiği belirlenmiştir. Çoklu antibiyotik dirençli P.aeruginosa suşlarında ise %42.8, A.baumannii suşlarında biyofilm üretimi %75.8 olarak saptanmıştır. Çoklu ilaca dirençli suşlarla , ilaç dirençi olmayan suşlar arasında biyofilm oluşturma açısından fark yoktur. Bano ve ark. 92 A.baumannii kökeninde biyofilm üretimini %63 olarak (76) , Cevahir ve ark. 86 kökende biyofilm üretimini %74 olarak saptamıştır (16). Füsun ve ark. 2009 'da yaptığı bir çalışmada 59 A.baumannii kökeninde biyofilm üretimini %52.5 olarak raporlamış ve tigesiklinin planktonik A.baumannii suşları üzerinde güçlü etkinliğinin olduğu, ancak biyofilmdeki sesil hücrelere etkisinin belirgin olarak azaldığı saptanmıştır. (15). Dezenfektan etkinlik testlerinde minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) testi, bakteri üreme inhibisyonunun ölçümüne dayanır ve antibiyotik duyarlılığın ölçüldüğü seri dilüsyonlara benzer. MİK testi antibiyotik direncini çok iyi gösterir, ancak dezenfektanlar için fazla önem taşımaz. Dezenfektan etkinlik testlerinde ölçülmek istenen mikroorganizmanın dezenfektan tarafından öldürülüp öldürülmediğidir. Oysa MİK testi bakterinin üremesinin inhibe olup olmadığını belirtir. Üremesi inhibe olmuş olan bakteri ise uygun ortamı bulunca tekrar üreyebilir. Bu yüzden sadece MİK değerlerine bakılarak dezenfektanın kullanılıp kullanılmayacağına karar verilemez. Bunun yanı sıra Süspansiyon testleri çok iyi standardize edilmiştir ve bakterisidal etki ölçülür (90). Bu yüzden çalışmamızda dezenfektan etkinliğinin değerlendirilmesinde süspansiyon testi kullanılmıştır. Ghotasloul ve ark. Minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) yerine minimum bakterisidal konsantrasyon (MBK) kullanılması gerektiğini ve gram negatiflerin gram pozitiflerden daha dirençli olduğunu savunmaktadır Yaptıkları çalışmada Perasetik asit ve klorhekzidini, alkol bazlı bileşiklerden daha etkili bulunmuştur (31). 42 Biyofilm üretimi ile çalışmada kullanılan antiseptik/dezenfektanlara karşı direnç ilişkisine bakıldığında, P.aeruginosa grubunda dezenfektan dirençli saptanan 4 suştan 3’ü biyofilm negatif iken, A.baumannii grubunda dirençli olan 10 suştan 9’u beklendiği gibi biyofilm pozitif bulunmuştur (%90). Çalışmamızda dezenfektan etkinliği testleri bakterilerin planktonik formları üzerinde yapılmıştır; Spoering ve Lewis’in (89) araştırmasında, P.aeruginosa planktonik hücrelerinin ve biyofilminin antibiyotik ve perasetik asidin öldürücü etkisine benzer derecede direnç gösterdikleri ortaya konmuştur. Yazarlar, biyosidal etkiye karşı direncin, bakterinin metabolik durumuyla ilişkili olduğunu ve durağan fazda bakterinin en yüksek direnci gösterdiğini vurgulamışlardır. Bu çalışmada, hem biyofilm üretimi hem de antiseptik/dezenfektan direnci, A.baumannii grubunda P.aeruginosa göre anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (sırasıyla P<0.001 ve P<0.05). Bu sonuç, A.baumannii'nin dış membran yapısının P.aeruginosa'ya göre daha az geçirgen olduğu ile açıklanabilir (94) . Tüm çalışma suşları üzerinde en etkili dezenfektan klorhekzidin (%99) ve bunu izleyerek OPA (%98) ve PA (%97)’dir. Test ettiğimiz maddeler arasında, P.aeruginosa suşları üzerinde en etkili dezenfektanlar OPA ve perasetik asit olarak belirlenmiştir. Ekizoğlu ve ark., (25) bizim uyguladığımız şekilde, 5 dakika temas süresi sonunda, P.aeruginosa suşlarına karşı klorhekzidin (%4) ve 1:50 (1000ppm) sodyum hipokloriti en etkili bulurken 1:500 (100ppm) dilüsyonda sodyum hipoklorit yeteri kadar etkili bulunmamıştır. A.baumannii suşları göz önüne alındığında, bu grupta en etkili dezenfektan %5’lik klorhekzidin olarak saptanmıştır. Ekizoğlu ve ark. (25) benzer şekilde bu patojene karşı klorhekzidini etkin bulmuşlar, buna karşın 1:50 (1000ppm) dilüsyonda sodyum hipokloritin etkisinin yeterli olmadığını belirtmişlerdir. İnan ve ark. (41) gerçekleştirdikleri 2009 tarihli çalışmada, klinik P.aeruginosa ve A.baumannii suşlarında 1:10 ve 1:100 dilusyonda %5’lik sodyum hipoklorit etkili olarak 43 bulunmasına rağmen bizim çalışmamızda %90 başarı oranıyla sodyum hipoklorit, A.baumannii suşlarında en az etkinlik gösteren dezenfektan maddedir. Sodyum hipoklorit çalışmaya alınan tüm klinik izolatlar açısından değerlendirildiğinde, en düşük etkiye sahip (%94) dezenfektandır. Görgül ve ark. (36) , 1/100 oranında sulandırılmış sodyum hipokloriti denedikleri klinik izolatlara karşı 15.dakikalık temas süresi ile etkin bulmuşlardır. Çalışmamızda etkinlik testlerinde, güncel uygulama koşulları dikkate alınarak 5 dakikalık temas süresi kullanılmıştır. Temas süresi uzatılsaydı dezenfektan etkili hale gelebilirdi. İncelenen suş sayısının azlığı ve test ettiğimiz dezenfektanların bakterilerin biyofilm kültürlerine karşı etkinliğinin saptanmaması bu çalışmanın zayıf yönlerini oluşturmaktadır. Sonuç olarak incelenen antiseptik/dezenfektanların, hastanemiz yoğun bakım ünitesinden izole edilen nonfermentatif gram negatif bakterilere karşı %90 ve üzeri oranda etkin oldukları saptanmıştır. Yoğun bakım ünitesinde yatan hastaların özellikleri dikkate alındığında, bu birimlerde antisepsi ve dezenfeksiyon işlemlerinin önemi ortaya çıkmaktadır. Dezenfeksiyon ve antisepside başarı, doğru uygulama ve uygun konsantrasyon ile sağlanmaktadır. 44 6.KAYNAKLAR 1. Abbasoğlu U. Dezenfektanlar: Sınıflama ve Amaca Uygun Kullanım Alanları. DAS Kongre Kitabı, Antalya; 2009, s:109-120. 2. Alıcı Ö. Dezenfeksiyonu etkileyen faktörler. 5.Ulusal Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Kongre Kitabı, Ankara Bilimsel Tıp Yayınevi; 2007: 35-40. 3. Allen DM, Hartmann BJ. Principles and Practice of Infectious Diseases Acibetobacter Species. In: Blaser, Dolin and Bennett's. 7th edition Philadelphia; 2010, p:2632-2638. 4. Ardıç N, Özyurt hastalardan M, Ilga U, Erdemoğlu A, Haznedaroğlu T. Yatan izole edilen Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii suşlarının karbapenemlere ve bazı antibiyotiklere duyarlılıkları. Ankem Dergi. 2004;18: 145-148. 5. Bergan T, Lystad A. Disinfectant evaluation by a capacity use dilution test. Journal of Applied Bacteriology. 1971;34: 741-750. 6. Bergogne-Berezin E, Friedman H, Bendinelli M. Acinetobacter Biology and Pathogenesis. In: Seifert H, Dijkshoorn L. Springer, New York, USA; 2008, p:19-47. 7. Bergogne-Berezin E, Towner KJ. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens, microbiological and epidemiological features. Clinical Microbiology rewievs. 1996;9: 148-165. 8. Berlau J, Aucken H, Malnick H, Pitt T. Distribution of Acinetobacter species on skin of healthy humans. European Journal of Clinical Microbiology Infectious Diseasesm.1999;18: 179-183. 45 9. Bilgehan H. Klinik Mikrobiyoloji Özel Bakteriyoloji ve Bakteri Enfeksiyonları. Eds, Pseudomonas aeruginosa. İzmir, Fakülteler Kitabevi Barış Yatınları. 2000;10:175-188. 10. Bilmam FB, Ayaydın Z, Turhanoğlu M, Onur A, Aktar GS. Nonfermentative gram negative microorganisms isolated from intensive care units and their resistance profiles in a training and research hospital. Journal of Clinical and Experimental Investigations. 2014;5(3): 391-396. 11. Block C, Furman M. Association between intensity of chlorhexidine use and microorganisms of reduced susceptibility in a hospital environment. Journal of Hospital Infection. 2005;51: 201-266. 12. Bouvet PJM, Grimont PAD. Taxonomy of the genus Acinetobacter with the recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov, Acinetobacter haemolyticus sp. nov, Acinetobacter johnsonii sp. nov, and Acinetobacter junii sp. nov. and emended descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwoffii. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 1986;36(2): 228-240. 13. Bouvet PJ, Jeanjean S. Delineation of new proteolytic genomic species in the genus Acinetobacter. Res Microbiol. 1989;140: 291-299. 14. Bradford PA. Tigecycline: a first clas glycylcycline. Clinal Microbiol Newsletter.2004; 26: 163-168. 15. Can F, Kaya M, Bayındır F, Uncu H. Tigesiklinin Acinetobacter baumannii planktonik ve biyofilm hücrelerine etkisi. Mikrobiyol Bülteni. 2009; 43: 587595. 46 16. Cevahir N, Demir M, Kaleli I. Evaluation of production, gelatinase activity, and mannose resistant hemagglutination in Acinetobacter baumannii strains. Journal Microbiol Immunol Infect.2008; 41(6): 513-518. 17. Chambers HF, Hadley WK. Miscellaneous antimicrobial agents; disinfectants, antiseptics and sterilants. In:Katzung BG, eds. Basic and Clinical Pharmacology. 7th, Connecticut, Appleton and Lange.1998; p:80311. 18. Chemaly RF, Simmons S, Dale C JR, Ghantoji SS, Rodriguez M, Gubb J, StachowiakJ, Stibich M. The role of the healthcare environment in the spread of multidrug-resistant organisms: update on current best practices for containment. Therapeutic Advances in Infectious Disease. 2014; 2(3-4) :7990. 19. Chen C, Nace G, Irwin P. A 6×6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Medical Microbiology. 2003;5: 475-479. 20. Clinical Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty Third Informational Supplement. CLSI document M100-S23. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013. 21. Cooper T, O’Leary M, Yezli S, Rutala WA, Weber DJ. How to assess risk of disease transmission to patients Otter JA. Impact of environmental decontamination using hydrogen peroxide vapour on the incidence of Clostridium difficile infection in one hospital Trust. Journal of Hospal Infect. 2011;78(13): 238-40. 47 22. Cowen RA. Kelsey-Sykes capacity test a critical review. The Pharmaceutical Journal. 1978;4: 202-204. 23. Denyer SP, Hodges NA. Principle and practice of sterilization. In: Hugo WB, Russel AD, eds. Pharmaceutical Microbiology, 6th Philadelphia: Blackwell Science; 1998, p:385-409. 24. Driscoll JA, Brody SL, Kollef MH. The Epidemiology, pathogenesis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections. Drugs 2007;67(3): 351368. 25. Ekizoglu ME, Özalp M, Sultan N. An Investigation of the bactericidal effect of certain antiseptics and disinfectants on some hospital isolates of gram negative bacteria. Infection Control and Hospital Epidemiology. 2003;3: 225227. 26. Fournier PE, Richet H, Weinstein RA. The epidemiology and control of Acinetobacter baumannii in health care facilities. Clinical Infection Diseases. 2006;42(5): 692-699. 27. Fraise AP. European norms for disinfection testing. Journal of Hospital Infection. 2008;70: 810-815. 28. Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC et al. CDC definitions for nosocomial infections. American Journal of Infection Control. 1988;3: 128140. 29. Gaynes R, Edwards JR. Overview of nosocomial infections caused by gram negative bacilli. Clinical Infection Diseases. 2005;41: 848-854. 30. Gebel J, Sonntag HB, Werner HP, Vacata V, Exner M, Kistemann T. The higher disinfectant resistance of nosocomial isolates of Klebsiella oxytoca: 48 How reliable are indicator organisms in disinfectant testing. Journal of Hospital Infection. 2002;50: 309-311. 31. Ghotaslou R, Bahrami N. Antimicrobial activity of chlorhexidine, peracetic acid/ peroxide hydrogen and alcohol based compound on isolated bacteria in Madani Heart Hospital, Tabriz, Azerbaijan. Advanced Pharmaceutical Bulleti. 2012:2(1): 57-59. 32. Giamarellou H, Antoniadou A, Kanellakopoulou K. Acinetobacter baumannii: a universal threat to public health. International Journal of Antimicrobial Agents. 2008;32: 106-119. 33. Gibson H, Elton R, Peters W, Holah JT. Surface and suspension testing: Conflict or complementary. International Biodeterioration Biodegradation. 1995;36: 375-384. 34. Gröschel DHM. Disinfectant testing in USA. Journal of Hospital Infection. 1991;18: 274-279. 35. Gülay Z. Gram negatif çomaklarda antibiyotik direnci 2003-2004 Türkiye haritası. Ankem Dergisi. 2005;19(Ek2): 66-77. 36. Görgül G, Başbuğ N, Ömürlü H. Bis-degalinum asetat ve sodyumhipoklorid solüsyonlarının antibakteriyel etkinliklerinin değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni. 1987;21: 289-295. 37. Gürler B. Dezenfektan gerekli mi? Ne zaman? Hangi dezenfektan? In: Günaydın M, Esen Ş, Saniç A, Leblebicioğlu H, eds. Sterilizasyon, Dezenfeksiyon ve Hastane enfeksiyonları Samsun;2002, s: 9-12. 49 kitabı. Simad Yayınları, 38. Hegna IK, Clausen OG. An investigation of the bactericidal and fungicidal effects of certain disinfectants by use of a capacity test. Annales de l'Institut Pasteur Microbiology. 1987;139: 473-83. 39. Hidron Al, Edwards JR, Patel J. NHSN annual update: antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare associated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention 2006-2007. Infect Control Hosp Epidemiol 2008;29(11): 996-1011. 40. Holah JT, Lavaud A, Peters W, Dye KA. Future techniques for disinfectant efficacy testing. International Biodeterioration Biodegradation. 1998;41: 273-279. 41. İnan A, Akçay Ş, Özyürek Ç. Hastane kökenli patojenlere karşı çeşitli dezenfektan ve antiseptiklerin etkinliği. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti derg. 2009;39(3-4): 97-102. 42. Kampf G, Hollingsworth A. Validity of the four European test strains of EN 12054 for the determination of comprehensive bactericidal activity of an alcohol-based hand rub. Journal of Hospital Infection. 2003;55: 226-31. 43. Kartal E. Bakteriler ve dezenfektanlara direnç. 5.Ulusal Sterilizasyon Dezenfeksiyon Kongresi Kongre Kitabı. Ankara: Bilimsel Tıp Yayınevi. 2007, s:63-69. 44. Kelsey JC, Maurer IM. An improved Kelsey-Sykes test for disinfectants. The Pharmaceutical Journal. 1974;30: 528-530. 50 45. Koljalg S, Naaber P, Mikelsaar M. Antibiotic resistance as an indicator of bacterial chlorhexidine susceptibility. Journal of Hospital Infection. 2002;51:106-13. 46. Koneman EW, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn Jr. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. In: The nonfermentative Gram negative bacilli. 6th Edition, Philadelphia, Lippincott; 2006, p:316-323. 47. Kuzucu Ç, Baktır E, Uncu H, Acar N, Erdinç Ş. Nozokomiyal infeksiyonlardan izole edilen Gram Negatif ve nonfermentatif basillere karşı antiseptik ve dezenfektanların etkinliğinin karşılaştırılması. Turkish Journal of Hospital Infections. 2001;5: 308-313. 48. Külah C, Doğan B, Gökdal İİ, Yalınay Çırak M, Rota S. Yoğun bakım ünitesi kaynaklı bazı nonfermentatif Gram Negatif bakterilerin çeşitli antiseptik ve dezenfektanlara duyarlılıkları. Ankem Dergi. 2002;16: 31-35. 49. Leblecioglu H, Rosenthal VD, Arikan OA et al. Device associated hospital acquired infection rates in Turkish intensive care units. Findings of the International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC). Journal of Hospital Infection. 2007;65(3): 251-257. 50. Machande V, Sanchaita S, Singh NP. Multidrug Resistant Acinetobacter. Journal Glob Infect Dis. 2010;2(3): 291-304. 51. Maragakis L, Perl T. Acinetobacter baumannii: epidemiology, antimicrobial resistance, and treatment options. Clin Infect Dis. 2008;46(8): 1254-1263. 52. Marcella A, Klompas M. Acinetobacter baumannii: An Emerging and Important Pathogen. Journal of Clinical Outcomes Management. 2010;17(8): 363-369. 51 53. Mariscal A, Carnaro-Varo fluorescentmethod for assesing M, Gutierrez-Bedmar M, et al. A the antimicrobial efficiacy disinfectant against E. coli ATCC 35218 biofilm. Appl Microbiol Biotechnol. 2007;77: 233-40. 54. Mataracı E, Gerçeker A. Evaluation of the minimum bactericidal concentrations of various disinfectants against Pseudomonas aeruginosa in Biofilm Cultures. Ankem Derg. 2011;25(4): 209-214. 55. Mattila T. A modified Kelsey-Sykes method for testing disinfectants 2,3,5triphenyltetrazolium chloride reduction as an indicator of bacterial growth. J Appl Bacteriol 1987;62: 551-4. 56. Maureen B, Springhorpe S, Sattar SA. Feasibility of a combined carrier test for disinfectants: Studies with a mixture of five types of microorganisms. American Journal of Infection Control. 1994;22: 152-62. 57. McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants:activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews. 1999;12: 147-79. 58. Merritt JH, Kadouri DE, O’Toole GA; Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 2005;1B.1.1-1B.1.17. 59. Michel D, Zach GA. Antiseptic efficacy of disinfection test in vitro againts methicillin resistant Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Esherichia coli in pressure sore wounds after spinal cord injury. Dermatology. 1997;195: 36-41. 52 60. Miner N. Principle to guide international standard tests for liquid chemical germicides a proposal. Journal of AOAC International Int. 1999;82: 669-75. 61. Mycock G. Methicillin antiseptic-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 1985: 949-50. 62. Nakamura I, Yamaguchi T, Tsukimori A, Sato A. Effectiveness of antibiotic combination therapy as evaluated by the Break-point Checkerboard Plate method for multidrug-resistant Pseduomonas aeruginosa in clinical use. Journal of Infection and Chemotherapy. 2014;20(4): 266-269. 63. Nemec A, De Baere T, Tjernberg I, Vaneechoutte M, van der Reijden TJ, Dijkshoorn L. Acinetobacter ursingii sp. nov. and Acinetobacter schindleri sp. nov, isolated from human clinical specimens. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 2001;51: 1891-1899. 64. Nemec A, Musilek M, Maixnerova M, De Baere T, van der Reijden TJ, Vaneechoutte M, Dijkshoorn L. Acinetobacter beijerinckii sp. nov. and Acinetobacter gyllenbergii sp. nov, haemolytic organisms isolated from humans. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 2009;59: 118-124. 65. Özalp M. Antiseptik, dezenfektan ve koruyuculara karşı bakteriyal direnç. 28.Türk Mikrobiyoloji Kongre Özet Kitabı, Antalya; 1998: s.20-23. 66. Özyurt M. Dezenfeksiyon ve sterilizasyon yöntemleri. Klimik Derg. 2000;özel sayı: 41-48. 67. Özyurt M. Dezenfektanlara in vitro duyarlılığı belirleyen 8.Antimikrobik Kemoterapi Günleri Kitabı, İstanbul; 2008: s:156-190. 53 testler. 68. Peleg AY, Seifert H, Paterson DL. Acinetobacter baumannii: Emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 2008; 21: 538-82. 69. Petersen BT, Chennat J, Cohen J et al. Multisociety guideline on reprocessing flexible gastrointestinal endoscopes. Gastrointest Endosc. 2011;73(6): 107584 . 70. Mandell, Dolin and Bennett. Principles and Practice of Infectious Diseases. In: Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. 7th edition Philadelphia: Elsevier, USA; 2010, p: 2518-2531. 71. Poole K. Mechanism of bacterial biocide and antibiotic resistance. J Appl Microbiol. 2002;92: 55-64. 72. Reybrouck G. A theoretical approach of disinfectant testing. Zentralblatt fur Bakteriologie, mikrobiologie. 1975;160: 342-67. 73. Reybrouck G. Evaluation of the antibacterial and antifungal activity of disinfectants. In: Fraise AP, Lambert PA, Mailard JY, eds. Principles and Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization. 4th ed. Oxford: Blackwell; 2004, p: 220-40. 74. Reybrouck G. International standardisation of disinfectant testing: is it possible? Hosp Infect J. 1991;18: 280-8. 75. Reybrouck G. The testing of disinfectants. International Biodeterioration Biodegradation. 1998;41: 269-72. 54 76. Rodriguez-Bano J, Marti S, Soto S, et al. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: associated features and clinical implications. Clin Microbiol Infect. 2008;14(3): 276-278. 77. Russel AD, Hugo WB, Ayliffe GAJ. Principles and Practice of Disinfection Preservation and Sterilisation. Blackwell Scietifitic Publication. 1982:134-57. 78. Russell AD. Microbial susceptibility and resistance to chemical and physical agents. In: Borriello SP, Murray PR, Funke G, eds. Topley&Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 10th Edition,Hodder Arnold, London. 2005, p: 421,465. 79. Russell AD. Principles of antimicrobial activity, In:Block SS, eds. Disinfection, Sterilization, and Preservation, Fourth ed, Philadelphia, Lea Febiger, 1991, p:29-58. 80. Rutala WA. Disinfection and sterilization of patient-care items. Infect Control Hosp Epidemiol. 1996;17(6): 377-84. 81. Rutala WA, Weber DJ. Disinfection and sterilization in health care facilities: what clinicians need to know. Clin Infect Dis 2004;39(5): 702-709. 82. Rutala WA, Weber DJ. How to assess risk of disease transmission to patients when there is a failure to follow recommended disinfection and sterilization guidelines. Infect Control Hosp Epidemiol. 2007;28(2): 146-55. 83. Rutala WA, Weber DJ. New disinfection and sterilization methods. Emerg Infect Dis. 2001;7(2): 348-53. 84. Rutala WA, Weber DJ. Reprocessing endoscopes: United States perspective. Journal of Hospital Infection. 2004;56(Suppl 2): 27-39. 55 85. Rutala WA, Weber DJ. Sterilization, high-level disinfection, and environmental cleaning. Infect Dis Clin North Am. 2011;25(1): 45-76. 86. Sanic A. Tıbbi cihaz ve aletlerin sterilizasyon ve dezenfeksiyonunda genel prensipler. In: Günaydın M, Esen, Sanic A, Leblebicioğlu H, eds. Sterilizasyon, Dezenfeksiyon ve Hastane enfeksiyonları kitabı. Simad Yayınları, Samsun; 2002, s:13-22. 87. Seifert H, Dijkshoorn L, Gerner Smidt P, Pelzer N, Tjernberg I, Vaneechoutte M. Distribution of Acinetobacter species on human skin: comparison of phenotypic and genotypic identification methods. J Clin Microbiol. 1997;35: 2819–2825. 88. Somerville DA, WC Noble. A note on the Gram-negative bacilli of human skin. Eur J Clin Biol Res. 1970;40: 669–670. 89. Spoering AL, Lewis K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 2001;183(23): 6746-6751. 90. Sultan N. Dezenfektan aktivitesini etkileyen faktörler ve dezenfektan etkinliğinin değerlendirilmesi. 6. Ulusal Sterilizasyon Dezenfeksiyon Kongresi Kitabı,Antalya; 2009, s: 121-137. 91. Tomaras AP, Dorsey CW. Edelmann RE. Attachment to and biofilm formation on abiotic surfaces by Acinetobacter baumannii: involvement of a novel chaperone-usher pili assembly system. Microbiology 2003;149(12): 3473-3484. 92. Vahaboğlu H, Akhan S. Pseudomonas aeruginosa. In: Topçu A, Söyletir G, Doğanay M, eds. Enfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi. 3.baskı İstanbul: Nobel Kitabevi; 2008, s: 2175-2195. 56 93. Van Klingeren B. Disnfectant testing on surfaces. Journal of Hospital Infection. 1995;30: 397-408. 94. Vila J, Marti S, Sanchez-Cespedes J. Porins, efflux pumps and multidrug resistance in Acinetobacter baumannii. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2007; 59: 1210-1215. 95. Weber DJ, Rutala WA, Miller MB, Huslage K, Sickbert-Bennett E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 2010;38: 25-33. 96. Winn Jr. W, Allen S, Janda W. Koneman's Color Atlas and textbook of diagnostic Microbiology. In: The nonfermentative gram negative bacilli. 6th Edition, Philadelphia, Lippincott; 2006, p: 303-391. 97. Wisplinghoff H, Edmond MB, Pfaller MA. Nosocomial bloodstream infection caused by Acinetobacter species in United States hospitals: clinical features, molecular epidemiology, and antimicrobial susceptibility. Clin Infect Dis. 2000;31(3): 690-697. 98. Zer Y, Akın E, Namıduru M. Acinetobacer baumannii Suşlarında tigesiklin etkinliğinin araştırılması. İnfeksiyon Dergisi. 2007;21(4): 193-196. 57 ÖZGEÇMİŞ Adı Burcu Soyadı Sebit Doğum Yeri BEYOĞLU Doğum Tarihi 04/11/1989 Uyruğu T.C. Tel 0539 890 77 67 E-mail burcusebit@hotmail.com Eğitim Düzeyi Mezun Olduğu Kurumun Adı Mezuniyet Yılı Marmara Üniversitesi 2015 Lisans Adnan Menderes Üniversitesi 2011 Lise Üsküdar Lisesi 2006 Doktora/Uzmanlık Yüksek Lisans İş Deneyimi Görevi Süre (Yıl - Yıl) Kurum Biyoloji Öğretmeni 1 Anka Etüt Merkezi Biyolog (Mikrobioyoloji laboratuvarı) 2 Yabancı Dilleri Marmara Üniversitesi Pendik Eğitim ve 2014- Araştırma Hastanesi Okuduğunu Anlama* Ġngilizce 2012-2014 iyi Konuşma* Yazma* orta orta Yabancı Dil Sınav Notu YDS ÜDS IELTS TOEFL IBT TOEFL PBT TOEFL FCE CAE CPE CBT 40 Sayısal ALES Puanı 80 KPSS Puanı 70 Eşit Ağırlık Bilgisayar Bilgisi Program Kullanma becerisi Microsoft Office iyi *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendiriniz. Sözel
