prote*n *zolasyonu - Erzurum Teknik Üniversitesi

PROTEİN
İZOLASYONU
Arş.Gör. F.Necmiye KACI
Erzurum Teknik Üniversitesi,2017
 Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli makromoleküllerden
biridir. Bir ve ya daha fazla sayıda polipeptidten meydana gelirler.
– Yapısal Komponentle
– İletişim
– Savunma
– Hücre Düzenlenmesi
– Enzim Fonksiyonları
 Yaşamla ilgili hiçbir işlem protein olmaksızın gerçekleşemez.
İlgilenilen biyolojik molekül grubunun
izolasyonu amacıyla gerçekleştirilen
ekstraksiyon işlemleri parçalama (lizis)
ve ayırma (saflaştırma) aşamalarından
oluşur.
Protein kaynakları
– Memeli dokuları
– Eritrositler
– Yumuşak bitkisel dokular
– Bitki doku kültürü (yaprak ve tohumdan sabit üreme koşulları)
– Mayalar (logaritmik üreme fazına dikkat!)
– Bakteriler (logaritmik üreme fazına dikkat!)
– Yağlı dokular
– Membran proteinleri
Protein Ekstraksiyonu
– Ekstraksiyonda ilk aşama, ilgili proteinin hücrenin içinde mi, dışında mı
olduğuna, içindeyse lokalizasyonuna bağlı olarak değişkenlik gösterir.
– Ekstrasellüler bir protein ise, kullanılacak yöntem oldukça basittir.
– Membrana bağlı veya sitoplazmik bir protein ise, kullanılacak yöntem
oldukça uzun ve karmaşıktır. Dikkat edilmesi gereken kilit nokta,
proteinin yapısını en az etkileyecek yöntemi seçmektir.
– Eğer protein bir organel içinde bulunuyorsa, ilk olarak o organel
diferansiyel santrifüj ile izole edilmeli; sitoplazmik proteinler
uzaklaştırılmalı, ardından ekstraksiyon yapılmalıdır.
– Tüm ekstraksiyonlardaki en önemli nokta izole edilen proteinin hemen
hemen tamamının sıvı faza geçmesidir.
– Parçalama sonunda elde edilen homojenattaki çözünmeyen materyal
santrifüjlenerek uzaklaştırılır.
– Önemli olan istenilen proteinin
(supernatant) geçmesidir.
hemen
tamamının
sıvı
faza
– Sıvının bir kısmı çözünmeyen hücresel artıklar ile kaybedilir.
Çalışılan proteinin stabilitesini artırmak için ortama:
EDTA (1-5 mM)
2-merkaptoetanol veya sistein (5-20 mM)
Çinko +2 (Çinko içeren enzimler için)
Piridoksal fosfat
Kofaktörler eklenir.
Ortama proteaz inhibitörleri eklenmeli: PMSF (Fenilmetil sülfonil florür)
Aseton veya etanol ile hazırlanır. Çok çabuk hidrolize olduğu için kullanılmadan hemen önce
hazırlanıp, proteazların olduğu ortama verilir.
Streptomisin, protamin ve polietilenimin gibi bazı maddelerin ortama verilmesiyle nükleik
asitler vb. çökebilir. Streptomisin ribozomlarla etkileşerek RNA çökmesini sağlayan bir
antibiyotiktir. Protamin, spermden elde edilen ve DNA ‘yı bağlayan doğal bir proteindir.
Dikkat edilecek noktalar:
– Protein denatürasyonundan ve inaktivasyonundan korunmak için çalışmanın her
aşamasında pH ve sıcaklık (genelde +4°C) kontrol altında tutulmalıdır.
– Ortam pH’sının 7 ya da 7’ye yakın olduğu durumlarda en geniş çapta tris (ticari
adı: Trisma) ve fosfat tamponları kullanılır.
– pH ayarlamada dikkat edilmesi gereken diğer bir faktör de sıcaklıktır. Tamponlara
kullanılacakları sıcaklıklarda pH ayarı yapılmalıdır. (Örn: Tris’in 25°C’de pH’sı 8.06
iken; 0°C’de pH’sı 8.85’e kadar çıkmaktadır.)
– Materyal parçalama sırasında ortaya çıkacak proteazların etkisinden korunmalıdır.
– Hazırlanan tamponlar derişik stoklar (10X, 50X veya 100X) olarak hazırlanmalıdır.
– Ekstraksiyon sonrası protein örnekleri, -25°C’nin altında, mümkünse –80°C’de
saklanmalıdır. Protein kullanılmadan önce 40-50 °C’de ısıtımış su banyosu
içerisinde hızlıca çözülmelidir.
Dikkat edilecek noktalar:
– Hemen hemen tüm proteinler, sodyum dodesil sülfat (sds) veya setil
trimetilamonyum bromür (CTAB) gibi iyonik deterjanlarla çözünür
hale getirilebilir ancak çoğunlukla geri dönüşümsüz şekilde denature
olurlar.
– Dolayısıyla ektraksiyonda proteinin doğal yapısını bozmayacak,
yumuşak bir deterjan kullanılır. Sıklıkla iyonik olmayan Triton X-100
kullanılır.
1. Ektrasellüler protein
– Sentezlendikten sonra hücre dışına
salınan proteinleri santrifüjleme veya
filtrasyon tekniği ile bulundukları
ortamdan ayırmak mümkündür.
– İleri saflaştırma yapılabilir.
2. Membrana bağlı –sitoplazmik
protein
– Ekstrakte edilecek protein membrana
bağlı veya sitoplazmik (intrasellüler) bir
proteinse önce hücre çeperi engeli
aşılmalıdır.
– Bu aşamada kullanılabilecek uygun teknik
seçilmeli ve protein yapısının zarar
görmesi engellenmelidir.
Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı
parçalama teknikleri
Teknik
Yumuşak
Orta
Ozmotik şok
Materyal
Eritrositler
Enzim ile parçalama
Bakteriler, mayalar
Deterjan ile parçalama
Doku kültürü hücreleri
El homojenizatörü (veya havan)
Karaciğer vb.
Doğrama
Kas vb.
Bıçaklı homojenizatör
Ultrasonikasyon
Hayvansal ve bitkisel
dokular
Bitkisel dokular,
bakteriler
Bitkisel dokular,
bakteriler
Hücre süspansiyonları
Bilyeli mil
Hücre süspansiyonları
Kum, alumina ile ezme
Sert
Fransız basınç hücresi
3. İntrasellüler (Organel) içinde
protein
• Organel içindeki proteinlerin izolasyonunda
öncelikle organel izolasyonu yapmak daha
temiz ekstre sağlar.
• Diferansiyel santrifüjleme ile istenilen organel
izole edilebilir. (düşük hızlarda önce nukleus,
sonra artan hızlarda mitokondri ve son olarak
da ribozom gibi en küçük moleküller
çöktürülür)
Diferansiyel santrifüjleme ile organel
izolasyonu
Protein Konsantrasyonun
Belirlenmesi
a) Biüret Yöntemi
– Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle
geniş çapta kullanılan bir yöntemdir.
– Reaksiyonun temeli belirteçteki bakır iyonlarının (Cu+2) peptid
azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540-560 nm’de
maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleksin oluşumuna
dayanır.
– Cu+2 iyonlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino
çeşitlerinin ölçümler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.
asit
b) Lowry Yöntemi
–
Lowry yöntemi alkali koşullarda meydana gelen iki farklı reaksiyona dayalıdır.
–
Hassasiyet aralığı 5 - 100 µg/ml’dir.
–
Bunlardan birincisi amid bağları ile bakır arasında meydana gelir ve indirgenmiş bakır oluşumu ile
sonuçlanan Biüret reaksiyonudur.
–
İkincisi ise Folin-Ciocalteu ayıracının (fosfomolibden ve fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino
asitleri ile tepkimeye girerek indirgenmesidir.
–
İndirgenmiş ayıraç mavi renktedir ve 500-700 nm arasında absorbans verir ancak çoğu zaman tercih
edilen değer 660 nm’dir.
–
Bu iki reaksiyonu bir arada gerçekleşmesi Biüret reaksiyonu hassasiyetini 100 kat artırır.
–
Lowry yöntemi pH hassasiyeti gösterir, ortam pH’sı 10-10.5 olmalıdır.
–
Yöntem pek çok farklı tamponun içeriğinde yer alan Tris, EDTA ve potasyum bileşikleri ile
enterferans yaratabilir, bu durumda yanıltıcı absorbans değerlerinin ortaya çıkmasına neden olur.
–
Yöntem triptofan ve tirozin içeriği fazla olan proteinlerin miktar tayini için avantajlıdır zira ayıraç
bu amino asitlere daha yüksek hassasiyet gösterir.
c)Warburg-Christian Yöntemi
– Diyaliz ya da fraksinasyon yoluyla protein olmayan maddelerin
uzaklaştırılmasından sonra 280/260 nm’de UV. absorbsiyon analizleri
yapılır.
– Proteinlerin triptofon ve tirozin reziduları 275-280 nm’de UV.
absorbansını arttırır.
– Çünkü beraber durumdaki bu iki amino asitin saf bir protein
çözeltisindeki derişimleri birçok proteinde genellikle sabittir.
– 280/260 nm yönteminde duyarlılık 0,05-2.0 mg/ml dır.
– ml.'deki mg protein = A280 - A260 dır. (1.5 x A280 )- (0.75 x A260) = mg
protein/ ml.
d)Bradford (Coomassie Blue: G-250) Yöntemi
– Oldukça duyarlı olan bu yöntem (5-100 µg/ml); organik boyaların,
proteinlerin asidik ve bazik grupları ile etkileşerek, renk
oluşturmasını esas alır.
– Mavi rengin oluşmasında proteinin amino asit bileşimi (özellikle arjinin
gibi bazik amino asitler ve aromatik amino asitler) önemlidir.
– Yöntemde temel alınan olgu, asidik boya normal şartlarda 465 nm’de
maksimum absorbans verirken, protein ile bağlandığı zaman 595 nm
dalga boyunda maksimum absorbans vermesidir.
– Anlatılan metotların yanısıra protein tayini yapılırken, koşullar uygun
olduğu taktirde,
– Smith yöntemi,
– Kjeldahl analizi,
– bulanıklık ölçümleri (turbidimetri),
– özgül aktivitenini ölçülmesi,
– kırılma indeksinin ölçülmesi (refraktometri) ve
– saflaştırılıp kurutulmuş örneklerin doğrudan tartılması yöntemlerinden de
faydalanılabilir.
Protein Ekstresinin Konsantre
Edilmesi
– Proteini konsantre hale getirmek için;
– Kuru Polimer Kullanımı( Sephadex G-25 kullanımı)
– Ultrafiltrasyon (tercih edilen)
– Diyaliz (seyreltik protein çözeltisini derişik hale getirmek)
– Liyofilizasyon (diyaliz işlemi sonrası yapılır (ilk olarak tuz vb uzaklaştırılır;ardından
süblimleşme ile su uzaklaştırılır ve toz halde protein elde edilir)
– Çöktürme
–
Trikloroasetik asit ile çöktürme (protein denaturasyonuna yol açar)
–
Organik çözücülerle çöktürme (Aseton,
denaturasyona yol açmadan çökme sağlar)
–
Tuzla çöktürme (Amonyum sülfat örnektir; denaturasyona yol açmadan protein agregasyonu
sağlar)
–
Polietilen glikol (PEG) ile çöktürme (iyonik olmayan, suda çözünebilen bir polimerdir. %20-30
PEG konsantrasyonu max. protein çökmesi sağlar)
etanol,
metanol.
Soğukta,
10°C
altında
Deney : Kandan Hemoglobin
İzolasyonu
Materyaller:
– Antikoagülanlı (pıhtılaşmayı önleyen) kan örneği
– % 0.9 NaCl
– Distile su
– Toluen
Metot :
1. 1 ml EDTA'lı kan örneği alınır. 3000 rpm'de 5 dakika santrifüj
edilerek üstteki plazma kısmı pipet ile alınır.
2. Kan örneği üç kez serum fizyolojik ile yıkanır.
Yıkama İşlemi: Örnek üzerine % 0.9 NaCl ilave edilir ve hafifçe
çalkalanır. Ardından 3000 rpm'de 5' santrifüj edilir. Süpernatant kısmı
aspire edilir.
3. Santrifügasyondan sonra altta kalan alyuvar tabakası üzerine 1.5 katı
distile su ve yarısı kadar da toluen ilave edilir.
4. 8 dakika elle çalkalanır.
5. 20 dakika 3000 rpm'de santrifüj edilir.
6. Aradaki berrak kısım mikropipetle dikkatlice alınır.
NOTLAR:
EDTA: Ca++ iyonlarını bağlayarak kanın
pıhtılaşmasını önler.
% 0.9 NaCl : Alyuvarların oluşturduğu çöküntü
kısmında plazmadan kalan artıkları temizlemek için
yıkama işleminde kullanılır.
Toluen: Hücre membranındaki lipid tabakasını
eriterek hücre membranının parçalanmasını sağlar.