dna analizinde, laboratuvar kaynaklı kontaminasyonun tespiti ve adli
advertisement
T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ ADLİ TIP ENSTİTÜSÜ FEN BİLİMLERİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. İmdat ELMAS DNA ANALİZİNDE, LABORATUVAR KAYNAKLI KONTAMİNASYONUN TESPİTİ VE ADLİ BİLİMLER AÇISINDAN DEĞERLENDİRİLMESİ ÖZGE USAL DÖNMEZ Biyolog YÜKSEK LİSANS TEZİ İSTANBUL 2008 TEŞEKKÜR İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü’nde aldığım eğitimin, çalışmakta olduğum, sorumluluğu fazla olan kriminal alanda bana büyük katkı sağladığı gerçektir. Tez çalışmam sırasında değerli bilgileriyle bana yol gösteren ve beni destekleyen tez danışmanım Prof. Dr. İmdat ELMAS ve 2. tez danışmanım Yard. Doç. Dr. Havva ALTUNÇUL’a Tez çalışmam için teşvik ve müsadelerinden dolayı İstanbul Kriminal Polis Laboratuarı Müdürü Dr. Ali Rıza ÜZÜM’e, laboratuvar çalışmalarım sırasında yardımlarından dolayı iş arkadaşlarım Adem ÖZDEMİR ile Mehmet ÇETİN’e, Tez çalışmamın istatistiksel hesaplamalarında büyük yardımını gördüğüm kardeşim Opr.Dr. Deniz USAL’a çok teşekkür ederim. Eğitimim ve yaşamımın her sürecinde maddi manevi hep yanımda olan sevgili anneme, babama ve kardeşime, çalışmalarım sırasındaki sabrı ve desteği için değerli eşim Ersan DÖNMEZ ile canım çocukların Cansu ve Can’a en derin sevgi ve saygılarımı sunarım. Özge Usal Dönmez İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR III ÖZET IV ABSTRACT V İÇİNDEKİLER VI KISALTMALAR VIII 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. FİZİKSEL DELİLLER 3 2.2. BİYOLOJİK DELİLLER 3 2.2.1. Biyolojik delillerin toplanması 3 2.2.2. Biyolojik Delillerin İncelemesindeki Kronoloji 5 2.3. DNA’NIN ÖZELLİKLERİ VE ADLİ BİLİMLERDE ÖNEMİ 6 2.4. ARDIŞIK KISA TEKRARLAR VE DNA TİPLEMESİ 7 2.5. PCR TEKNİĞİNİN ADLİ BİLİMLERDE UYGULANMASI 9 2.6. BİYOLOJİK DELİLLERİN KİMLİKLENDİRİLMESİ SIRASINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR 2.6.1. Amplifikasyon Sırasında Karşılaşılan Sorunlar 11 11 2.6.2. DNA’nın Degredasyonu 12 2.6.3. Kontaminasyon 14 2.6.3.1 Kontaminasyonun Nedenleri 14 2.6.3.2. Kontaminasyonun Araştırma Sonuçlarına Etkisi 16 2.7. KARIŞIM (MİX) DNA PROFİLLERİ 2.7.1. Karışım DNA Profili İçeren Örnekleri Çözümlemede Yüksek Polimorfik İşaretlerin Önemi 2.7.2. Ekstra (artifakt) Pikler 17 17 18 2.7.2.1. Biyolojik Artifakt Pikler 18 2.7.2.2. Teknolojiye Bağlı Artifakt Pikler 20 2.7.3. Floresan Ölçümlerden Kuantitatif Bilgilerin Elde Edilmesi 22 2.7.4. Karışım Örneklerinde Genotiplerin Tanımlanması 23 2.8. DNA ANALİZ LABORATUVARLARINDA KALİTE KONTROL 2.8.1. Kuzey Amerika’da Kalite Kontrol Organizasyonları 26 27 2.8.2. Avrupa Birliğinde Kalite Kontrol Organizasyonları 2.9. VALİDASYON 28 29 2.9.1. STR Validasyonu 29 2.9.2. Geliştirici Validasyon Çalışmaları 30 2.9.3. Validasyon Çalışmalarının Presantasyonu 31 2.9.4. Laboratuvarlar Arası Testler 32 2.10. DNA VERİ BANKASI VE ÖNEMİ 32 2.10.1. DNA Veri Bankasındaki Profillerin Karşılaştırılması 34 2.10.2. DNA Veri Bankasında Yer Alacak Bilgiler 35 2.10.3. Türkiye’de DNA Profillemesi ve Bankacılığı 35 3. MATERYAL ve METOD 37 4. BULGULAR 39 5. ÖRNEK OLGULAR 46 6. TARTIŞMA VE SONUÇ 58 KAYNAKLAR 66 EKLER 72 ÖZGEÇMİŞ 76 KISALTMALAR STR Short Tandem Repeat (Kısa Ardışık Tekrar) PCR Polimerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Tepkimesi) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Sınırlandırılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) VNTR Variable Number of Tandem Repeat (Değişken Sayılı Ardışık Tekrar) bç Baz Çifti 1. GİRİŞ VE AMAÇ Kriminal bir olayda, olay yerinden elde edilen tüm deliller, doğru analiz edilip değerlendirildiğinde; şüpheli, mağdur ve olay yeri arasında bağlantı kurmayı sağlar[1]. Olay yeri incelemesinin amaçları; delil niteliği taşıyan örnekleri tanımak, delil niteliğini bozmayacak şekilde toplamak ve incelemenin yapılacağı laboratuvara ulaştırmaktır. Olayla bağlantısı olabileceği düşünülen ve laboratuvarda incelenen tüm belge ve materyaller, fiziksel delildir. Bu delillerin özellikleri analitik tekniklerle belirlenir ve delillerin kaynaklarının bulunması amacıyla kontrol örnek ile karşılaştırılır. Kan, kemik, saç, kıl, diş, tırnak, doku, semen, tükürük, idrar gibi deoksiribonükleik asit (DNA) içeren tüm biyolojik deliller, fiziksel delildir. Son yıllarda DNA içeren tüm fiziksel deliller kriminal incelemede önemli hale gelmiştir ve olay yerinin hemen her yerinde bulunabilir. Biyolojik deliller DNA içerdiklerinden dolayı önem taşır ve DNA analizi yoluyla değerlendirilir[2]. Çıplak gözle görülemeyen bu deliller hırsızlık olayını çözmede, cinsel saldırıda failin kimliğini saptamada, öldürülen bir kişinin katilini bulmada tek delil olabilmektedir. Öte yandan aynı kentte, aynı ülkede hatta farklı ülkelerde aynı kişi tarafından işlenen suçların aydınlatılmasında en etkili yöntemlerden biridir. DNA delilleri yalnız kişileri suçlamakta kullanılmaz, aynı zamanda suçsuz olanın da haksız yere suçlanmasını engelleyecek çok güçlü bir veridir. Çünkü şüpheli, mağdur ve olay yeri arasındaki bağlantıyı kurup yüksek ayrım gücü ile kim sorusunun cevabını verebilmektedir[3]. DNA verileri yargılama dışı amaçlarla da kullanılır. Örneğin; deprem, sel, maden göçmesi, gibi doğal afetlerde ve uçak kazalarında çoğu zaman ölenlerin cesedi bozulduğundan bu kişilerin kimliklerinin tespiti bakımından DNA analizi yapılır. Laboratuvara gelen her belge veya materyal, ancak doğru ve kabul görmüş bilimsel tekniklerle incelenip yorumlandığında, mahkemelerde delil niteliği kazanır. Adli bilimler alanında, biyolojik örneklerin DNA analizi için kabul görmüş bilimsel tekniklerin başında kısa ardışık tekrar (STR) dizinlerinin analizi gelir. DNA üzerinde bulunan tekrar bölgelerinin adli bilimlerde önemi ve kullanım kolaylığı ilk kez 1985 yılında anlaşılmıştır. Tekrarlayan bölümlerin dış görünüş üzerinde bir etkisi olmamasına ve temel genetik fonksiyonlardan hiçbirini kontrol etmemesine rağmen bunlar genetik yapının bir parçasıdır ve ebeveynlerden çocuğa kalıtım yoluyla aktarılmaktadır. Her insan tüm diğer özellikleri gibi bu tekrarlardan bir aleli annesinden ve diğerini babasından alır. Tüm insanlar aynı tip tekrarlara sahiptir ancak tekrar sayıları bireyler arasında farklılık gösterir. Adli bilimlerde, DNA’nın bu özelliğinden yararlanarak, elde bulunan biyolojik materyalin kime ait olduğunu (şüpheli/mağdur) güvenilir ve yüksek ayırım gücü ile belirlemek, kişileri dışlamak veya olaya dâhil etmek, akrabalık ilişkilerini incelemek mümkün olabilmektedir[4]. Kimliklendirme amacı ile biyolojik materyallerden DNA analizi çok güçlü bir araç olmasına karşın, PCR işlemi örnekte hangi DNA’lar mevcut ise onları kopyalayıp çoğalttığından, delil kaynaklı DNA ile başka kaynaktan karışan DNA’yı ayırt edemez. Bu nedenle, asıl incelenmesi gereken DNA’nın yanı sıra ortamdan kaynaklanan kontaminasyondan dolayı, yabancı DNA’ların da çoğaltılması mümkündür. İki sebeple kontaminasyonun önlenmesi zorunludur. Birincisi, genellikle kriminal laboratuarlara gönderilen biyolojik materyallerin az miktarlarda olması ve tekrar elde edilememesi, ikincisi ise kontaminasyonun fark edilememesi durumunda hatalı sonuç verme ihtimalinin bulunmasıdır. Bu nedenle delilin toplanması, taşınması ve analiz aşamasında kontaminasyonun engellenmesi için gerekli önlemler alınmalıdır [3]. Laboratuvar aşamasında iki şekilde kontaminasyon oluşabilir. İlki, laboratuar personelinin kendi biyolojik materyalinin delile bulaşması (tükrüğü, kepeği, teri), diğeri ise analiz aşamasında kullanılan araç ve gereçlerin dikkatsiz ve özensiz kullanımından doğan iki farklı olay yeri delillerinin birbirini kontamine etmesidir. Bu nedenle laboratuarda internal kontrol sağlamak önemlidir. Bu çalışmanın amacı; İstanbul Kriminal Polis Laboratuvarı personelinin biyolojik delilleri kontaminasyona uğratma riskleri ve önleme yöntemlerini araştırmak ve internal kontrol mekanizmaları oluşturmaktır. 2. GENEL BİLGİLER 2.1. FİZİKSEL DELİLLER Adli bir olayla bağlantısı olabileceği düşünülen her türlü delil, fiziksel delil veya hukuki tanımı ile maddi delildir. Fiziksel deliller kimliklendirme ve karşılaştırma yapılabilmesi açısından önemlidir. Olay yerinde bulunabilecek başlıca fiziksel deliller şunlardır: Patlayıcılar (olay ile ilgi kurabilmeyi sağlayan delillerdendir.), ilaçlar, lifler, belgeler, ateşli silahlar, parmak izleri, cam, diğer izler ( ayakkabı izi, alet ve araç izleri), tozlar, seri numaralar, boyalar, petrol ürünleri, tahta, toprak, organik ve fizyolojik sıvılar, biyolojik deliller [5]. 2.2. BİYOLOJİK DELİLLER DNA içeren her türlü fiziksel delil, aslında biyolojik bir delildir. Başka bir deyişle, içinde DNA’nın var olduğu her türlü örnek biyolojik bir örnektir ve bir suç ya da suçluyla ilişkisi tespit edildiği durumda delil olma özelliği taşır. Biyolojik deliller, kan, kemik, meni, doku, tükürük, burun akıntısı, ter, idrar, tırnak, dışkı, ve kıl, olay yerinde doğrudan bulunabileceği gibi, başka nesneler üzerinde de bulunabilir. Sakız, sigara izmariti, zarf, pul ya da bardak üzerinde bulunabilen tükürük; tırnak içlerinde bulunabilen doku artıkları; giysiler üzerinde bulunabilen saç ya da kıllar; giysi, koltuk, halı, vb. her türlü eşyada bulunabilen kan ya da semen lekeleri buna örnek olarak verilebilir[3;6]. 2.2.1. Biyolojik delillerin toplanması Olay yeri incelemesi, fiziksel delilin, olay yeri inceleme birimi görevlisi ve kriminal laboratuvar tarafından doğru kullanılmasının başlangıç noktasıdır. Bunun için, olay yeri usulüne uygun şekilde incelenmelidir. Bu inceleme bilimsel olarak şu basamaklardan oluşur: olay yeri araştırması, kaydetme, toplama ve koruma. Olay yeri incelemesi, bilimsel bir yönteme dayanır ve sistematiktir[1;7]. Delillerin uygun şekilde toplanmaması ve/veya delil transfer zincirinde kabul gören kuralların ihmali durumunda, elde edilen kanıtların delil sıfatını yitirmelerine neden olabilir. O.J. Simson davasında olduğu gibi elde bir biyolojik kanıt mevcut olmasına ve sanığın genotipine ulaşılmasına rağmen delil transfer zincirinde tespit edilen aksaklıklar nedeni ile mahkeme bu sonuçları hukuka uygun delil olarak kabul etmemiştir [4]. Biyolojik delillerin toplanmasında dikkat edilmesi gereken bazı hususlar vardır[8-10]: • Olay yeri inceleme ekibi, fiziksel temas sonucu oluşabilecek bir kontaminasyonu, bone ve özel giysiler giyerek, sık sık eldiven değiştirerek, delillerin toplanması sırasında steril malzeme kullanarak (makas, pens, bıçak vs.) engelleyebilir. • Delillerin toplanması sırasında istem dışı aksırıp öksürmek gibi durumlarda oluşabilecek kontaminasyon maske kullanılarak giderilebilir. • Eldiven giyildikten sonra, elin ağıza, buruna veya vücudun çıplak cildi ile temas etmesi durumunda, delil toplama işlemine eldiven değiştirilmeden devam edilmemelidir. • Olay yerinde hiçbir şey yiyip içilmemelidir. • Deliller birbiri ile temas etmeyecek şekilde ayrı ayrı ve uygun malzeme kullanılarak paketlenmelidir. • Delilin nereden ve kimden alındığının kaydı tutulmalıdır. • Mağdur ve sanığa ait örneklerin birbiri ile teması önlenmelidir. • Cinayet olaylarında maktulün defin işlemi gerçekleşmeden mukayese kan, kıl ya da doku örnekleri temin edilmelidir. • Kişiye kan nakli yapılmış ise laboratuvar bilgilendirilmeli ve hastaneden nakledilen kanın özellikleri belirlenmelidir. • Her türlü delil için karşılaştırma örneği olarak sanık ya da mağdurdan kan, kılıflı saç örneği ya da buccal svap (yanak içi sürüntü) alınıp laboratuvara gönderilmelidir. • Makas, pens ve bıçak ağzı gibi kullanılan aletler, her bir örnek alındıktan sonra %5'lik H2O2 (ya da alkol) ile iyice temizlenmelidir . 2.2.2. Biyolojik Delillerin İncelemesindeki Kronoloji Biyolojik kalıntıların incelenmesi, DNA analizlerinin bulunmasından çok önce de gerçekleştirilmekteydi. Saç telleri mikroskop altında morfolojik yöntemlerle, kemikler antropometrik ölçümlerle, kan ve sperm lekeleri geleneksel serolojik yöntemlerle incelenmekteydi. 1970’lere kadar, kan grupları ve altgruplarıyla süren çalışmalar, 1980’lerin sonuna kadar kandaki enzim ve proteinlerin polimorfik şekillerinin incelenmesiyle gelişmiş olmakla birlikte, hala bir kişinin olayla ilişkisini %100 doğrulukta verecek güce sahip değildi. Ne bir kan ya da sperm lekesinin şüphelenilen kişiye ait olduğunu, ne de çocuğun biyolojik babasının itham edilen erkek olduğunu kesin biçimde söylemek olasıydı[11]. Gerek kan grup ve altgrupları gerekse enzim ve protein polimorfizmine dayalı incelemeler hep belirli bir oranda hata payı içermekteydi. Bu sistemlerle yapılan çalışmalarda bir şüpheliyi dışlamak mümkündür. Ancak dahil et mek için o lasılık bugün olduğundan daha düşüktür. Üstelik bu teknikler kurumuş ve eski lekelerle saç ve kemik gibi materyallerde ya hiç sonuç vermiyor ya da ciddi yanılgılara neden olabiliyordu. Bugün gelişmiş moleküler genet ik teknikleri kullanılarak bu sorunlar aşılabilmektedir [11]. DNA verilerinin ilk kez delil olarak kabulü, 1985’te İngiltere’de bir cinsel saldırı olgusunun Leıchester Üniversitesi profesörlerinden Sir Alec Jeffreys tarafından sonuçlandırılması ile olmuştur[12]. 1990’lı yılların başında çeşitli araştırmacılar[13;14] tarafından mikrosatelit polimorfizmi keşfedildi. DNA’nın tekrar bölgelerinin adli bilimlerde önemi ve kullanım kolaylığının fark edilmesiyle 1996 yılında delillerin toplanması ve inceleme şekillerinin standardizasyonu tamamlanmış, bu tarihten sonra DNA verileri deneysel olmaktan çıkmış, kanuna uygun delil kategorisinde yerini almıştır. Ülkemizde DNA profillemesine dayalı kimliklendirme, dünyadaki çalışmalara paralel olarak 90'lı yılların ikinci yarısında yaygınlaşmıştır[4]. 2.3. DNA’NIN ÖZELLİKLERİ VE ADLİ BİLİMLERDE ÖNEMİ Deoksiribonükleik asit bir kişinin genetik bilgisinin tamamının yer aldığı temel yapı taşıdır. DNA insan vücudunun çekirdekli her hücresinde bulunur ve tüm hücrelerde aynı özelliğe sahiptir. Örneğin bir erkeğin kanından elde edilen DNA ile tükürüğü, spermi ya da cildinden elde edilen DNA tamamen birbirine eşittir. Yeryüzünde, tek yumurta ikizleri hariç DNA’sı birbiri ile tam olarak örtüşen iki kişi bulunmamaktadır. Bu önemli özellik nedeniyle, olay yerinden elde edilen DNA profili ile olayla ilgi kurulmaya çalışılan kişilerin DNA profilleri karşılaştırıldığında, tıpkı parmak izinde olduğu gibi benzerlik ve farklılıklara dayanılarak olayla kişiler arasında bağlantı olup olmadığı tespit edilebilmektedir[3]. DNA incelemeleri çok az başlangıç materyali gerektirdiğinden, olay yerinde bulunabilecek minimal düzeydeki örneklerden sonuca ulaşabilmek mümkündür. DNA molekülünün stabil olması, bozulsa dahi adli bilimler alanında küçük polimorfik lokuslarla çalışılması nedeni ile, enzim ve proteinlere göre avantajlıdır. Ayrıca birçok proteinlerinkinden yüksektir. polimorfik lokusun ayrım gücüde enzim ve Yukarıda söz edilen avantajlardan dolayı DNA lokusları ile çalışılırken teknik hata olmadığı sürece yanlış kişileştirme yapma olanağı yoktur. Biyolojik deliller canlı ortam dışında yıllarca beklese bile, adli açıdan incelemeye elverişli DNA elde edilebilir. Güneş, bakteri, ısı, nem ve küf gibi çevresel etkenler her ne kadar deneyleri güçleştirse de, günümüz teknolojik olanakları ile, ne kadar eski olursa olsun biyolojik örneklerin tamamından DNA profili elde edilebilir[3;15]. DNA tekniklerinin henüz kullanılamadığı dönemlerde ABD’de yargılanıp suçlu bulunan fakat suçsuz olduğunu iddia eden kişiler veya bunların yakınları tarafından günümüz teknolojisi kullanılarak delillerin yeniden değerlendirilmesi ve yeniden yargılanma talebinde bulunulmaktadır. New York kentinde ‘Suçsuzluk Projesi’’ adı altında, söz konusu kişilere ait biyolojik delillerinin DNA düzeyinde tekrar incelenmesi yoluna gidilmiş, yargıda yeni bir uygulama gerçekleşmiştir[4]. Açılan davaların ancak % 30’unda DNA analizi için biyolojik materyal temin edilebildi. Bunların % 60’ının suçsuz oldukları saptandı. Bu proje delilin elde edilmesi kadar onu değerlendirme yöntemlerinin de önemini ve elde edilen delillerin saklanması gereğini ortaya koymuştur. Zira başvuruların % 70’inde biyolojik materyalin daha önceki yargılama sırasında tüketilmiş olması veya imha edilmiş olması nedeni ile yeniden yargılanma imkanı olmamıştır[4]. Aynı uygulamanın diğer ülkelerde de başlatılabilmesi durumunda, geriye dönük çalışabilmesi için, biyolojik delillerin uygun koşullarda saklanması gerekmektedir[16]. DNA profili (genotip), DNA’nın önceden belirlenmiş polimorfik bölgelerinin incelenerek barkodlanması şeklinde tanımlanabilir. DNA profili elde etmenin ilk basamağını hücre içinden DNA’nın çıkarılması yani çekitleme, ikincisini elde edilen kalıp DNA’nın PCR (Polimerase Chain Reaction: Polimeraz Zincir Reaksiyonu) tekniği ile çoğaltılması, son aşamasını ise görünürleştirme teknikleri oluşturmaktadır. Elde edilen profillerin değerlendirilebilmesi için, karşılaştırma yapılacak başka DNA profillerine ihtiyaç vardır. Örneğin, olay yerinden alınan biyolojik materyalden bir DNA profili elde edildikten sonra bu profilin şüpheli ve/veya mağdurun DNA profili ile karşılaştırılması gereklidir. Dışlama durumunda; uyuşmayan iki DNA örneğinin, %100 olasılıkla aynı kişiden gelmediği sonucuna varılır. Dışlama görülmeyen durumlarda, kişi suçlu olarak kabul edilmez[9;17;18]. Böyle bir durumda olay yerinden elde edilen biyolojik örneğin kişiye ait olma olasılığının hesaplanması gerekir. Bunun için kullanılan genetik işaretin alel sıklığının belirlenmesi gereklidir. Bu amaçla suçun işlendiği bölgedeki toplumun genelini temsil eden güvenilir veri tabanlarına ihtiyaç duyulmaktadır[19;20]. 2.4. ARDIŞIK KISA TEKRARLAR VE DNA TİPLEMESİ Dikkat edilecek olursa, adli identifikasyona yönelik çalışmalarda DNA molekülünün tamamı değil, ancak belirli bazı bölgeleri incelenmektedir. DNA molekülünün baz dizisinin tümü, protein üretiminden sorumlu değildir[2]. Protein kodlayan kısım tüm genomun yaklaşık %3’dür. Geri kalan kısım ise protein kodlaması gerçekleştirmez ve bu kısmın büyük çoğunluğuda tekrarlardan oluşur[13;20;21]. Söz konusu kısımların işlevi bilinmemekle birlikte son derece polimorfik ve oldukça yüksek ayrım gücüne sahip olduğu bilinmektedir. Bir ünitenin ardışık olarak tekrarlanması sonucu oluşan polimorfizm bu bölgelerdeki dizinden değil tekrar sayısındaki farklılıktan kaynaklananır ve aktarımları Mendel Yasasına uygun şekilde gerçekleşir[2;17]. Ardışık tekrarlar, tekrar eden ünitenin büyüklüğüne göre çeşitli gruplara ayrılmaktadır. Minisatelitler (değişken sayıda ardışık tekrarlar, Variable Number of Tandem Repeats: VNTRler) 15-70 bç'lik, mikrosatelitler (kısa ardışık tekrarlar, short tandem repeats: STR’ler) 2-5 bç'lik bir ünitenin tekrarlanmasından oluşmaktadırlar. STR'lerin adli bilimlerde kullanılmasının nedenleri, küçük parçalar olmaları nedeniyle oldukça hasar görmüş DNA örneklerinde bile sonuç vermesi, eldeki çok az miktardaki DNA’dan çoğaltılabilmesi, elde edilen sonuçların tekrarlanabilir olması, yüksek polimorfizme bağlı olarak ayrım gücünün yüksek, mutasyon oranının düşük olması ve otomasyona ya da çoklu analize imkan vermesi olarak sıralanabilir[13;22]. Tüm bu nedenlerden dolayı, tetranukleotid içeren STR’ler adli bilimlerde kullanılmaktadır. Fakat bu tip kısa tekrarlarda da sınırlamalar vardır. Çoğaltılması sırasında kontaminasyon olasılığı fazladır, otomatik aletlerde analizi pahalıdır, dengesiz pikler meydana gelebilir ve karışımların analizi zor değerlendirilir[2;17;23]. PCR tekniği kullanılarak incelenen STR'ler, daha büyük olan ve southern blotting teknikleri ile incelenebilen VNTR'lara kıyasla daha avantajlıdır. Daha küçük olduklarından ayrılabilen net aleller şeklinde elde edilebilmekte, tek baz çifti farkı bile, incelemelerde yakalanabilmektedir. Netlikleri belli bantlar şeklinde ayrılabilen aleller, sonuçların farklı laboratuvarlarla paylaşılabileceği laboratuvarlar arası işbirliği yapılabileceği anlamına gelir[2]. Bir çok ülkesinde yapan ve ABD'de adli amaçlı DNA analizi ve Avrupa tüm laboratuvarlarda aynı STR bölgeleri incelenmektedir. Amerika Birleşik Devletleri’nde tüm eyaletler çapında FBI tarafından 1990'da kurulan bir veri bankası olan Combined DNA Index System (CODIS) tarafından kabul edilen ve yeterli olduğu belirlenen 13 STR lokusu (CSFİPO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11) vardır. Bunlardan ikisi hariç diğer hepsi, farklı kromozomlar üzerinde bulunur. CSFIPO ve D5S818 lokusları ise, aynı kromozom üzerinde ancak birbirinden uzak noktalarda yer alır[24;25]. 1995-2000 yılları arasında Avrupa'da (İngiltere, Hollanda, Avusturya ve Almanya'da) yapılan çalışmalarla bu lokuslardan altısının çok önemli ve ayırıcı özellikte olduğu tespit edilmiştir. Bunlar lokuslarıdır[26]. FGA, TH01, VWA, D8S1179, D18S51 ve D21S11 2.5. PCR TEKNİĞİNİN ADLİ BİLİMLERDE UYGULANMASI RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism: Sınırlandırılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) tekniğine göre birçok avantaja sahip olan PCR tekniği ilk defa 1985 yılında tanımlandı ve bugün adli bilimler alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR; in vitro klonlama ve gen amplifıkasyonu olarak da adlandırılmaktadır. Bu teknik, DNA'nın primerler (hedef bölgeye bitişik DNA kısmının komplementeri olan küçük oligonükleotidler) ile belirlenen kısımlarının çoğaltılmasını sağlamaktadır. Teknik; hücre içinde gerçekleşen DNA replikasyonuna benzerdir. Kısaca, DNA’nın tüp içinde çoğaltılması işlemi olarak tanımlanabilir. İşlem üç aşamadan oluşmaktadır. İlki; DNA'nın iki zincirinin ısı etkisi ile birbirinden ayrılması (denatürasyonu), ikincisi primerlerin denatüre olmuş DNA'ya bağlanması (hibridize olması) ve sonuncu aşaması DNA polimeraz enziminin (Taq Polimeraz) her bir primerden başlayarak hedef bölgenin komplementerini sentezleterek zinciri uzatmasıdır. Bu üç aşama bir PCR döngüsü olarak adlandırılır ve 20 döngü sonuda hedeflenen DNA bölgesinin yaklaşık bir milyon kopyası sentezlenmiş olur[27]. PCR tekniğ inin bir çok avantajı vardır. Bunlardan en önemlisi, adli çalışmalar için 1-2,5 ng gibi eser miktarda kalıp DNA’nın çoğaltılabilmesidir[28;29]. Bu yöntemle, teorik olarak tek bir hücre PCR analizi için yeterlidir. Örneğin, bir saç telinden ya da sigara izmariti üzerinde kalan epitel hücrelerinden PCR tekniğini kullanarak DNA tiplemesi yapmak mümkündür[30]. Tekniğin diğer bir avantajı hızlı ve kolay olmasıdır. Analiz bir gün içinde tamamlanır. Bunlara ek o lar ak P CR t ekniğ i ile DN A mil yo n ya da d aha faz la k at ı çoğaldığından, görünürleştirme işlemi radyoaktiv madde içermeyen metodlarla yapılabilmektedir[31]. Bir bölgedeki varyasyonun PCR ve ardından jel elektroforezi ile belirlenebilmesi için, allel uzunluğu 500 bç'den küçük ve alelleri arasındaki uzunluk farkı çok olmayan, çok polimorfîk diziler tercih edilmelidir. STR'ler bu özelliklere en uygun genetik işaretlerdir[20;32]. STR'ların alel büyüklükleri genellikle 350 bç'den küçüktür. Bu nedenle eski ve iyi korunmamış biyolojik örneklerde kolaylıkla tipleme yapılabilmektedir[33]. Alellerin boyu birbirine yakın olduğundan ve heterozigot bir örnekten elde edilen iki alel birbirine yakın büyüklükte olduğundan alelik atlama çok nadirdir[34]. Çoklu sistemler kullanılarak birkaç STR lokusun tek bir PCR reaksiyonunda çoğaltılması mümkündür. Çoklu sistemler oluşturulurken hedef mümkün olabilecek en yüksek polimorfizmi elde etmek için yüksek polimorfizme sahip lokusları bir araya getirmek değildir. Önemli olan yüksek ayrım gücüne, kolay ve güvenilir şekilde tanımlanabilme rahatlığına sahip çoklu sistemler oluşturmaktır[28]. Bu amaçla hazırlanmış birçok PCR amplifikasyon kiti mevcuttur. Bu çalışmada kullanılan AmpF/STR Identıfıler PCR Amplifikasyon kiti, tek bir PCR amplifikasyonunda 15 tetranukleotid tekrar lokusu ve cinsiyet tanımlayıcı işaret olan Amelogenin lokusunu çoğaltır. DNA konsantrasyonu 0.05 -0.125 ng/µ l arasında olan örneklerden sonuç verebilen kit, PCR amplifikasyonu sırasında floresan işaretleme yöntemlerinden biri olan 5' ucu işaretli primerlerle çalışır. D8S1179, D21S11, D7S820 ve CSFİPO lokusları mavi ile, D3S1358, THO1, D13S3317, D16S539 ve D2S1338 lokusları yeşil ile, D19S433, vWA, TPOX ve D18S51 lokusları sarı ile, Amelogenin, D5S818 ve FGA lokusları kırmızı ile işaretli primerler tarafından çoğaltılır. Ayrıca otomatik DNA parça analizi için 4 boyalı sisteme ek olarak bir boya daha içermekte ve 5 boyalı floresans sistemini kullanmaktadır. Çok bileşenli analiz, 5 farklı floresan renkte boyayı, sınırlı spektral bileşenlere ayıran bir olaydır. Örnekleri işaretlemek için kitte kullanılan 4 boya; 6-FAM (mavi), VIC (yeşil), NED (sarı) ve PET (kırmızı) boyalarıdır. 5.boya ise, LIZ (turuncu) olup GeneScan 500 Liz Size Standart'ı (iç standart) işaretler. Bu floresan boyaların her biri, farklı dalga boylarında kendisinin maksimum floresansını yayar. 6-FAM boyası, en kısa dalga boyunda ışıma yapar ve mavi olarak görülür, bunu takiben VIC, NED, PET ve LIZ gelir[35]. 2.6. BİYOLOJİK DELİLLERİN KİMLİKLENDİRİLMESİ SIRASINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR 2.6.1 Amplifikasyon Sırasında Karşılaşılan Sorunlar PCR reaksiyonunun bileşenleri çok önemlidir. Amplifıkasyonun en uygun şekilde gerçekleşmesi için, her bileşen, belirli derişimde önceden belirlenen miktarda ve doğru zamanda eklenmelidir. Hatta özel çoğalma koşulları (denatürasyon, bağlanma ve uzama sıcaklıkları, bu sıcaklıklarda gerçekleşecek reaksiyonların süresi ve çoğalma döngülerinin sayısı) geliştirme ve geçerlilik testleri sırasında artefaktların varlığını en aza indirecek şekilde ayarlanmalıdır[36]. Bu amaçlarla ticari kitler ile yapılan doğruluk testlerinde, kitin her içeriğinin konsantrasyonu ve döngü parametrelerindeki sıcaklık ve süreler için en uygun koşullar hazırlanmış ve önerilmiştir[37]. Tüm bu parametreler optimize edilmesine rağmen bazı faktörler, PCR’ın güvenilirliğinin yani amplifıkasyon işlemi sırasında elde edilen ürünün orijinal DNA'yı ne kadar yansıttığının sorgulanmasına sebep olmaktadır. Bunlardan biri primerin hibridizasyonu sırasında meydana gelen düşük özgüllüktür. Bu durumda istenmeyen ürünler oluşabilir ve bunlar amplifıkasyonun ilerleyen basamaklarında yeni kalıp olarak kullanılır. Hibrid izasyo n özgüllüğünde primerlerin uzunluğu ve dizini önemlidir. Bunun yanı sıra bağlanma sıcaklığı da ayrı bir önem taşır. Hatalı amplifıkasyonda yanlış bağlanma DNA dizininin özel bir bölümünde ve anlamlı bir oranda meydana gelebilir. Bu durum kalitatif güvenirliliğini etkilemektedir. Amplifikasyonun kalitesi hedef dizinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa dizinler (100200 bç) amplifikasyonda iyi sonuç verir. İkincisi tercihli amplifikasyondur. Bu, aynı reaksiyonda diğerinden daha çok tercih edilen bir alelin çoğaltılmasıdır. Böylece heterozigot bir kişi homozigot olarak görülür. Bu durum alel düşmesi (allelic drop out) olarak isimlendirilir. DNA'yı bir arada tutan kimyasal bağlardan G:C arasındakilerin daha güçlü olması, bunları denatüre etmek için biraz daha yüksek sıcaklığa ihtiyaç duymasına sebep olur. Eğer iki alelden biri, ortalamadan daha fazla G.C oranı içeriyorsa, denatürasyon sıcaklığı biraz daha düşük olduğunda tamamen denatüre olmaz. Tamamlanmamış denatürasyon, amplifikasyon sırasında primerleri engeller ve G:C bakımından zengin olan alelin geri kalmasına sebep olur. Bu durumda heterozigot bireyler hatalı bir şekilde homozigot olarak tiplenir[36;38]. Yapılan çalışmalarda, farklı kitlerle analiz edilen STR lokuslarında tercihli amplifıkasyonun sağlam bir kanıtı bulunmamıştır. Bu durumun, her lokusta alel boyutlarının küçük (60 bazdan az) olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir[37;39]. Hatta bazı PCR aletlerinde, denatürasyon sırasında ısıtıcı birimin dış köşelerindeki bazı bölgeler, iç taraftakilerle aynı ısıya ulaşmaz. Bu da, örneklerin çoğaltılmasında aynı etkiyi yaratabilir [36]. Üçüncüsü, stokastik dalgalanmalardır (stochastic fluctuations). Bu durum, DNA'nın çok seyreltik derişimlerinde (DNA yaklaşık 100 pg’nin altında ise) örnekleme hatalarından kaynaklanan farklılıklar olarak tanımlanmaktadır[30]. Amplifikasyon için sadece bir kısım DNA çekiti başka bir tüpe aktarıldığında bu t ip hatalar meydana gelir. Tüm örnekte birkaç hücreden gelen DNA bulunuyorsa, çekit içinden PCR tüpüne aktarılan örnekte kromozom çiftleri eşit olarak bulunmayabilir. Bunun sonucu olarak, iki alelden sadece birinin belirlenmesi, aslında heterozigot olan bir kişiyi homozigot olarak tiplemeye yol açabilir[36]. DNA’nın çoğaltılması esnasında stokastik etkilerin meydana gelmesi ihtimalinden dolayı, ürünün yoğunluğunu artırmak için, döngü sayısını artıran PCR parametreleri ve enjeksiyon süresini artıran elektroforetik koşullar dikkatli ayarlanmalıdır. Dördüncüsü, bazların yanlış eşleşmesine bağlı amplifikasyonun etkilenmesi durumudur. Yanlış eşleşme, primerin bağlandığı yere yakın ya da primerin bağlandığı bölgenin iç tarafında gerçekleşiyorsa, primerin bağlanma etkinliğini azaltarak amplifıkasyonun kalitesini düşürür. 2.6.2 DNA’nın Degredasyonu Tüm organizmaların DNA içermesi nedeni ile, insan dışı canlılara ait DNA içerikleri tarafından kontamine edilen delillerin sorun yaratacağı düşünülebilir. Özellikle, bakteri, mantar gibi mikro organizmaları içeren örnekler, bitki ya da hayvan kaynaklı DNA kadar, fizyolojik sıvılarda ve toprakta da bulunabilir. Ancak insana ait olmayan DNA bir sorun yaratmaz, çünkü adli amaçlı kullanılan DNA testleri insana (en azından en yüksek primata) özgüdür. PCR işleminde kullanılan primerler insan DNA’sına spesifiktir. Başka bir deyişle, insan DNA'sı diğer canlı türleri ile etkileşime girmez ya da en azından diğer türlerle olan herhangi bir reaksiyon insana özgü sonuçların meydana gelmesi beklenilen bölgenin dışında bir yerde oluşur[36]. Fakat, DNA'ya zarar veren enzimleri (nukleazlar) üreten mikro organizmaların kontaminasyonu söz konusu ise, bunlar insan DNA'sının degradasyonuna sebep olacağı için, PCR sonrası sonuç alınamamasına neden olur[36;37]. Bu tür mikroorganizmalar dışında, DNA’nın degredasyonuna neden olan diğer faktörler de mevcuttur. DNA vücut dışında herhangi bir dış ortama maruz kaldığında, vücut içinde olduğu kadar stabil değildir. Çevresel koşulların uygun olmadığı durumlarda, DNA'nın fızikokimyasal özellikleri değişebilir. DNA, oksidatif veya hidrolitik hasara uğrar. Oksidatif reaksiyonlar, DNA üzerinde birçok baz farklılıklarına sebep olurken, DNA analizine etkisi, bazların yanlış birleşmesi ve DNA ipliğinin uzayamaması şeklinde olur. Hidrolitik reaksiyonlar ise; DNA üzerinde fosfodiester bağlarının kırılması ile DNA'nın parçalanmasına, N-glikozil bağlarının kırılması ya da deaminasyon ile bazların yanlış birleşmesine sebep olur. Tüm bu durumlarda DNA degrade olur, bir başka deyişle örnekteki DNA parçalarının ortalama boyutlarında bir azalma meydana gelir. DNA'nın parçalanması, belirli koşullara bağlı olarak ılımlı ya da şiddetli olabilir[40;41]. PCR amplifikasyonunun olabilmesi için primerlerin DNA’ya bağlandığı bölgelerin (ve/veya iki bağlantı bölgesi arasında) herhangi bir degredasyonun olmaması gereklidir. Böyle bir durumun varlığında PCR sonucu başarılı olmamaktadır. Ayrıca, degradasyon küçük boyutlu aleli sağlam bırakırken, büyük boyutlu alelin kaybı ile sonuçlanabilir. Dolayısıyla heterozigot bir birey, homozigot olarak görülebilir. Adli analizde kullanılan STR lokuslarının hepsinde alel boyutları birbirine çok yakındır, dolayısıyla degradasyondan dolayı heterozigot alel çiftinden birinin kaybolması pek sık rastlanır bir durum değildir. Alel kaybı, sadece alt belirleme sınırına yakın ya da bu sınırda olan bant ya da piklerle sonuçlanan, sınırlı DNA miktarı varlığında meydana gelir[36]. Bu yüzden, değerlendirilmesi gereklidir. zayıf DNA profillerinin dikkatli 2.6.3 Kontaminasyon PCR işleminin çok az miktardaki DNA’yı amplifiye edebilme özelliği, yeterli özen gösterilmediği takdirde bir dezavantaja dönüşebilir. İncelenen örneğin içine başka bir DNA kaynağının transfer olması kontaminasyon anlamına gelmektedir. DNA kontaminasyonunu engellemek için onaylanmış laboratuvar protokolleri kullanılmalıdır. Kontaminasyonun gerçekleşmesi durumunda, incelenen materyalin DNA profilinin çıkarılamamasına sebep olabilir. Bu durumda suçlunun lehine bir sonuç doğurur. 2.6.3.1 Kontaminasyonun Nedenleri Delil niteliği taşıyan bir biyolojik materyal aşağıda anlatılan durumlarda kontamine olabilir [42]. 1) Olay yerinde bulunan ve genomik DNA içeren delillerin toplanması sırasında ; a) Farklı biyolojik materyallerin usulune uygun toplanmaması nedeni ile birbirini kontamine etmesi. b) Olay yerinde bulunan kişilerin gerekli önlemleri almaması veya özeni göstermemesi nedeniyle kendi DNA’ları ile kontaminasyona sebep olmaları 2) Laboratuvarda biyolojik materyalin analize hazırlanması ve/veya analizi sırasında örneklerin birbirleriyle kontaminasyonu 3) Laboratuvar personelinin kendi DNA’sı ile biyolojik mateyali kontamine etmesi 4) Bir önceki PCR işlemi sırasında amplifiye olan DNA’nın, bir sonraki örneğe kontaminasyonu. Kontaminasyonun ilk kaynağı genellikle olay yeri ve inceleme ekibidir. Olay yerinde meydana gelen kontaminasyonun kontrolü ve engellenmesi zordur. Ancak, laboratuvar kaynaklı kontaminasyon, uygun laboratuvar prosedürleri uygulanır ve uygun çalışma alanları dizayn edilirse kontrol edilebilir. Bu amaçla, DNA’nın ekstraksiyonundan PCR işlemine kadar olan tüm aşamalarda, kullanılan tüplerin ve kimyasal malzemelerin test edilmesi amacı ile negatif kontroller kullanılmalıdır. Örneğin, PCR işleminde kullanılan negatif kontrol, DNA dışında diğer tüm içeriği içeren PCR tüpleridir. DNA yerine aynı miktarda saf su konulmalıdır. Eğer negatif kontrolde PCR sonucu herhangi bir DNA profiline rastlanırsa, kontaminasyonun kaynağı tespit edilmeli ve mümkünse kontaminasyon elimine edilmelidir. Bazı araştırmacılar, PCR işlemi sırasında oluşabilecek kontaminasyonun 4 genel nedenini incelemiştir. Bunlar, PCR amplifikasyon düzeneği, PCR ürünleri üzerinde yapılan çalışmalar, laboratuvar havalandırması ve DNA’nın saklanması şeklinde sıralanmaktadır. Araştırmalar, PCR kontaminasyonlarının, basit bir dikkatsizlik sonucu olmadığını ve kontaminasyonu engelleyen temel protokollerden toplu bir sapma sonucu oluştuğunu göstermektedir [43]. Laboratuvar laboratuvarda personelinden kullanılan kaynaklanan tüplerin neden kontaminasyonunun olduğu kontaminasyon yanında, (sporadik kontaminasyon) karşılaşılan bir diğer sorundur. Forensic Science Service (FSS)’in yaptığı bir araştırmada, amplifikasyonun gerçekleştirildiği PCR tüplerinin, DNA kontaminasyonuna neden olabileceği, kullanılan PCR tüplerine negatif kontrol ve kalite kontrol testleri yapılarak gösterilmiştir[44]. Kontaminasyon üzerine yapılan araştırmalar, personel kaynaklı kontaminasyonun tespit edilmesinde, laboratuvar personeli databazı oluşturulmasının oldukça etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Oluşturulan bu databazı, sıklıkla, PCR sonucu elde edilen DNA profilinin delilden mi yoksa laboratuvar personelinden mi elde edildiğinin anlaşılması sırasında kullanılır [44]. Bunun dışında çapraz kontaminasyonun belirlenebilmesine yardımcı olması amacı ile bilgisayar programları geliştirilmiştir. Bu programa, çalışılan tüm genotipler kaydedilerek karşılaştırma yapmak ve çapraz kontaminasyonu tespit etmek mümkün olmaktadır[45]. Ayrıca, otomatik robotik sistemlerin kullanılmaya başlaması ile laboratuvar personelinin örnekler ile direkt temasının azalmasından dolayı, kontaminasyon riski de azalmıştır[45]. 2.6.3.2 Kontaminasyonun Araştırma Sonuçlarına Etkisi Kontaminasyonun yapılan çalışmanın sonuçlarına etkileri Peter Gill ve Amanda Kirkham tarafından araştırılmış ve ‘‘STR çalışmalarında kontaminasyonun olay üzerinde olan etkisinin değerlendirilmesinde simulasyon modellerinin geliştirilmesi’’ adlı makalede sonuçları yayınlanmıştır[46]. Bu araştırmaya göre, laboratuvarda kontaminasyonun belirlenebilmesi için kullanılan tekniklerden birisi negatif kontroldür. Fakat, PCR kontaminasyonu, kullanılan tüpe spesifik olacağından, aynı parti numarasına sahip bir tüpte kontaminasyon varken diğerlerinde olmayabilir. Bu nedenle, PCR tüplerine uygulanan negatif kontrol testleri, aynı partide bulunan tüm tüpler için kontaminasyon içermez sonucuna varılmasını sağlayamaz[46]. Aynı çalışmada, kontaminasyona neden olan materyalin DNA’sı, delilden elde edilen orijinal materyalin DNA’sına göre çok az oranda amplifiye olduğu durumlarda, kontaminasyona neden olan DNA’nın dışlanabileceği sonucuna varılmıştır. Bu durumun tersine, kontaminasyona sebep olan DNA orijinal materyalin DNA’sına göre daha fazla oranda amplifiye olmuşsa , suçlunun DNA profilini maskeleyebilmekte ve suçluya ait DNA profilinin elde edilmesini engellemektedir. Günümüzde, kontaminasyon olasılığı, dikkatli çalışan laboratuvarlarda nadiren etkiye neden olmakla beraber, belirgin etkilerinin eski olgularda ortaya çıkması beklenmektedir. Bu amaçla Amerika Birleşik Devletlerinde, ‘suçsuzluk projesi’ adı altında bir proje başlatılmış ve hapiste bulunan insanların karıştığı suçluların delilleri tekrar incelenmiştir. DNA çalışmalarının ilk yıllarında kontaminasyonun önemi bilinmemekte ve olay yerinde delil toplanması sırasında eldiven kullanılmamaktaydı. Bunun sonucunda gerçek suçlunun DNA profili, delili toplayan görevlinin DNA profili tarafından maskelenebilmekte, yani, gerçek suçlu yerine, delili toplayan kişinin DNA’sı belirlenmekteydi. Başka bir delilin olmadığı durumlarda, olay yerinden gelen delilde gerçek suçlunun DNA’sı çıkmadığı için, cezaevine girmesi gereken bir kişi, yanlış olarak masum ilan edilmekte idi. Bu senaryo, DNA kanıtının araştırmanın bir parçası olduğunu, masum ya da suçlu ayırımında tek göstermektedir[45]. ve mutlak kanıt olmadığının düşünülmesi gerektiğini DNA delillerinin laboratuvar çalışmalarında kontaminasyon problemlerini minumuma indirmek için, PCR öncesi ve PCR sonrası tüm amplifikasyon işlemleri ayrı yerlerde yapılmalıdır. Ayrıca, negatif kontrollerin kullanılması ve çalışanlara ait databazı kullanımı gereklidir. Fakat, kontaminasyon alınan tüm önlemlere rağmen tamamen engellenebilecek bir sorun değildir. Orijinal DNA örneğinin kontamine olması durumunda, karışım DNA profili elde edilmekte ve çıkan sonucun ona göre yorumlanması gerekmektedir [46]. 2.7. KARIŞIM (MİX) DNA PROFİLLERİ DNA profillerinin karışımı, 2 veya daha fazla kişinin DNA içeriklerinin karışması sonucu ortaya çıkar. Karışım DNA profillerinin ortaya çıkarılması ve yorumlanması, gerekli tecrübe ve dikkat eksikliğinde oldukça zordur. Ancak, floresan ölçümleri ile duyarlılığı arttırılmış PCR kullanımı ile ufak miktarlarda bulunan karışım DNA profillerinin tespiti çok daha kolaylaşmıştır[47]. 2.7.1. Karışım DNA Profili İçeren Örnekleri Çözümlemede Yüksek Polimorfik İşaretlerin Önemi Karışım örneklerdeki DNA profillerini tespit etmek bazen çok kolay olmasına rağmen bazı durumlarda oldukça zordur. Bu durum her bir kaynağın karışıma sağlamış olduğu DNA miktarının oranı, genotiplerin spesifik kombinasyonları ve amplifiye olmuş toplam DNA miktarı ile ilgilidir. Ayrıca, karışım DNA profilini tespit edebilme olasılığı, yüksek heterozigot oranına sahip lokusların ve genetik işaretlerin kullanılması ile artar. Örneğin, yüksek polimorfizmli STR markırlarının kullanılması, karışımın komponentleri arasındaki farkları görme şansını arttırır. Şöyleki, D18S51 lokusu 51 olası alele sahipken, TPOX aleli sadece 15 bilinen alele sahiptir. Bu durum D18S51 lokusunu, karışımların tespiti için daha avantajlı hale getirmektedir. Ayrıca, multipleks STR amplifikasyonu ile daha fazla genetik işaretin incelenebilmesi, karışımlardaki çoğul profillerin tespit şansını arttırır. Karışım örneklerde, karışımı oluşturan DNA’ların miktarı, onların tespit edilebilme özelliğini direk belirlemektedir. Mesela, karışımı oluşturan iki farklı DNA’nın miktarları birbirine yakın ise, bunların tespiti oldukça kolaydır. Eğer, karışımı oluşturan DNA’lardan birinin miktarı diğerine göre oldukça az ise onun tespiti zorlaşmaktadır. Bir karışımda, toplam DNA miktarının %5’inden daha az miktarda DNA varsa, eser miktardaki bu DNA’nın kaynağı genellikle belirlenemez [48;49]. Kullanıma hazır amplifikason kiti AmpFlSTR ile karışımları oluşturan az miktardaki DNA kaynağının 35pg’ın üzerinde olduğu durumlarda güvenilir genotip sonuçları elde edilebileceği belirtilmektedir[49]. Karışım DNA profilleri belirlenirken ekstra (artefakt) piklere dikkat etmek gerekir. 2.7.2 Ekstra (artefakt) Pikler STR profilleri, izlenmesi beklenen alellerin yanında ekstra yani artefakt pikler de içerebilir. Artefakt pikler, STR’ların biyolojisine ve floresan ile işaretlenen amplifikasyon ürünlerinin teknolojisine bağlı olarak izlenebilir. Önemli olan örnekteki bu tür artefakt pikleri tanımak ve yanlış bir sonuca varmamaktır. 2.7.2.1 Biyolojik Artefakt Pikler Stutter Pikler ‘‘Stutter’’ ürünler, bir STR profilinde en fazla artefakt pike neden olan kaynaklardır. "Stutter", temel S T R pikinden bir tekrar birimi (n-4) daha az olan küçük bir piktir. Fazla miktarda DNA'dan ya da DNA sentezi sırasında iplik kaymasından dolayı meydana gelir. Bu pikler, gümüş boyamalı poliakrilamid jellerde koyu renkli ana bantın yakınlarında gölge bantlar olarak görülür. Stutter’ların varlığı, kısa tekrar birimlerinde daha aza indirgenmiştir. Bununla birlikte, bazı STR lokusları stutter’lara diğerlerinden daha fazla eğilimlidir ve yüksek sayıda tekrar içeren alellerde daha yüksek yüzdede stutter'lar görülür. Hatta fazla DNA miktarı ve seçilen analiz sınırı da stutter miktarını etkiler. Özellikle karışımlarda piklerin alel mi, yoksa sadece bir stutter mı olduğu kararının verilmesi çok önemlidir. Stutter oranı; stutter yüksekliğinin, esas alelin yüksekliğine bölünmesi ile belirlenir. Adli sistemlerde stutter için sınır, genellikle esas pikin %5-15 arası kadardır[39;50;51]. En yüksek oranda stutter görülen lokuslar; D18S51 (%17.0), FGA (%14.7) ve D19S433 (%13.3) iken, en düşük yüzdede stutter verenler TPOX (%4.8) ve THO1 (%5.1) lokuslarıdır[37]. Split Pikler Örneğe bağlı olmayan ("non-template directed") nükleotid eklenmesi sonucunda, ayrı pikler ("split peak") oluşabilir. Taq enzimi, uzama tamamlandıktan sonra her amplifıkasyon bölgesinin sonuna (3' ucuna) genellikle Adenin (A) olan tek bir nükleotid ekler. Bu, ipliği istenilen orijinal diziden bir baz çifti daha uzun yapar. Adenilasyon etkisi, yaratılan primere bağlı olduğu için, kite özgüdür. Identifiler kitinde de primer dizileri A bazı eklenmesini artıracak şekilde hazırlanmıştır. Ayrıca PCR döngüsü, enzimin her ipliğe son bir A bazı eklemesini sağlayan son uzama süresine sahiptir. Bu amaçla, 30-60 dakika boyunca 60°C sıcaklık uygulanır. Bu son eklenme aşaması tamamlanmazsa ya da PCR'da fazla miktarda DNA kullanılması ya da Taq polimerazın bir inhibitörünün varlığı gibi nükleotid eklenmesini önleyen koşullar ortaya çıkarsa, -A ürünler meydana gelir ve zayıf çözünürlükte iki bant ya da pik görülür[36;39;52]. Üç Alelin İzlenmesi Karışım olmadığı halde, bazı lokuslarda üç pik görülmesi de rastlanabilir bir durum olarak tespit edilmiştir. Bu üç pik, iki farklı şekilde meydana gelebilir. Bunlardan biri, D21S11 ve TPOX lokuslannda görülen üç eşit boyda ve oranda piklerdir. Bir diğeri ise, D18S51 lokusunda görülen iki pikin boy veya oran toplamının, üçüncü pikin boy veya oranına eşit olduğu piklerdir. Bu pikler trizomi gibi ekstra kromozom fragmanlarının varolması durumunda ya da herhangi bir kromozomdan bir tanesinin primer bağlanma bölgesinde duplikasyon olması durumunda izlenebilir[52]. Mikrovaryant aleller STR analizinde bir başka önemli konu da varyantların varlığıdır. Mikrovaryant aleller, temel tekrar biriminden farklı dizi içeren alellerdir. Bu farklılıklar insersiyon, delesyon ya da baz değişikliği şeklinde olabilir. Dizilerdeki değişiklikler tekrar birimlerinin içinde olabileceği gibi, primerlerin bağlandığı bölgede de görülebilir[52]. Primerler, çalışacakları bölgeye uygun özelliklerde oluşturulur. Popülasyonun çoğu, primerlerin bağlanacağı alanda aynı diziye sahiptir. Ancak bazı durumlarda, insanların çok küçük bir yüzdesi primerin bağlandığı bölgede mutasyona sahiptir. Eğer primer belli bir diziye tamamlayıcı ise, mutasyonu içeren alternatif bir diziye etkili bir şekilde bağlanamayabilir. Böylece istenilen STR bölgesi de çoğaltılamaz. Heterozigot bir kişide bir kromozom normal primer dizisine sahipken, homolog kromozomdaki primer bölgesi mutasyonlu ise, PCR ve analiz sonunda bu kişinin homozigot olarak görülmesi mümkündür[52]. Mikrovaryant alelleri tespit etmek için en uygun çözünürlük ve kesinlik ile metodlar geliştirilmelidir[53]. Daha çok örnek çalışıldıkça belirlenebilen ve doğrulanabilen mikrovaryantlardan dolayı, bu durum giderek önem kazanmaktadır[54]. 2.7.2.2 Teknolojiye Bağlı Artefakt Pikler Matriks Pikleri (Pull Up Pikler) Genetik Analizör cihazlarında, DNA parçalarını belirlemede kullanılan dört ya da beş floresan boya, spektral bir çakışma yaratır. Ancak bu durum, özel bilgisayar yazılımları ile telafi edilir. Bilgisayar, bu çakışmayı ortadan kaldırmak için bir algoritm uygular ve her renk için analiz sınırını normale indirger. Bazen bilgisayar spektral çakışmayı telafi etmede başarılı olamaz ve farklı renklerin aynı yerinde artifakt pikler ortaya çıkar. Bunlara "pull-up peak" adı verilir. Bu tip bir sorun fazla miktarda DNA’dan da meydana gelebilir. Küçük miktardaki pullup'lar, örnek sonuçlarının yorumlanmasında bir sorun oluşturmaz, ancak büyük miktarlardaki pull-up'lar, bilgisayarın spektral çakışma miktarını yanlış hesapladığı anlamına gelir. Bu durumda, yazılım kalibre edilmeli ve örneğin tekrar kullanılmasına gerek kalmadan, elektronik veriler tekrar analiz edilmelidir[55]. Çalışmaları sırasında pull-up peak'lerle karşılaştığını belirten araştırmacılar vardır[41;51;55]. Floresan Boya Artefaktları Primerlere bağlı olan floresan boyalar, ait oldukları primerlerden ayrılıp kapillerler içinde bağımsız olarak hareket etmeleri sonucu floresan boya artefektları oluşur. Bu artefaktlar STR profilinde ufak pikler olarak izlenir. Floresan boya artefaktlarından, PCR sonrası kullanılan filtrasyon kolonları ile kurtulmak mümkündür[55]. Hava kabarcıkları, üre kristalleri veya voltaj sapmaları Bu pikler genellikle keskin ve tüm 4 renk için aynı şiddette izlenir. Tekrar edilen pikler olmadıkları için, aynı örneğin tekrar çalışılması durumunda izlenmezler. Örnek’te Floresan Kirliliği Floresan spektrumun görünebilir bölgesinde (~ 500-600 nm) materyal içeren örnekler, STR profilinde pik olarak izlenir. ‘Forensic Science Servise’ (FSS) tarafından, birçok floresan madde poliakrilamid jel elektroforezi ile incelenmiştir[55]. Antibiyotikler, vitaminler, polycyclic aromatikler, floresan parlatıcılar ve tekstil boyaları gibi floresan kirliliğine neden olan maddeler, hücrelerden DNA’nın ekstraksiyonu için kullanılan fenol/kloroform izolasyon yöntemi ile ayrıştırılabilirken, Chelex yöntemi ile yapılan izolasyonlarda başarılı sonuçlar alınamamaktadır[55]. Floresan kirliliğine bağlı olan pikler, normal STR piklerine göre daha geniş izlenir. 2.7.3 Floresan Ölçümlerden Kuantitatif Bilgilerin Elde Edilmesi Gerek ABI 310, 377, 3100 ya da 3130 XL sekanslama cihazlarının gerekse FMBIO II floresan tarayıcılarının kullanıldığı durumlarda, elekroforez işlemi sonrası elde edilen piklerden kuantitatif bilgi elde edebilme özelliği, göreceli pik yüksekliklerinin ya da STR alel alanlarının ölçülebilmesine bağlıdır. Piklerden elde edilen bilgiler, karışım örneklerdeki farklı DNA kaynaklarının olası genotiplerini çözmede kullanılabilir. Pik şekillerindeki varyasyonlardan dolayı, pik alanları, pik yüksekliklerine göre üstündür[56]. Fakat, karışımı oluşturan DNA kaynaklarının tespitinde daha birçok laboratuvarda pik yükseklikleri başarıyla kullanılmaktadır. Şekil 2.1: a: Tek kaynaktan gelen STR profili b: Karışım örnekteki STR profili Şekil 2.1’de tek kaynaktan elde edilen DNA ile karışımdan elde edilen DNA’nın STR profillerinin farkları gösterilmektedir. Özellikle karışımlarda piklerin alel mi yoksa sadece bir ‘‘stutter’’ mı olduğu kararının verilmesi çok önemlidir. Genellikle, heterozigot örnekler için, STR alel piklerinin %15’inden daha ufak pikler ‘‘stutter’’ olarak değerlendirilir. Ayrıca, tek kaynaktan geldiği düşünülen STR profilinde, en alçak pik yüksekliğinin en yüksek pik yüksekliğine bölünmesi ile elde edilen oranın %70’den büyük olması gerekir. Sonuçta, bir STR lokusu için, en yüksek pikin %15 ile %70’lik kısmı arasında izlenen pikler varsa, iki veya daha fazla kaynağın kontaminasyonu düşünülebilir. Birden fazla STR lokusunda aynı durumla karşılaşılması bir karışım örneği ile karşı karşıya kalınmasının güçlü bir kanıtıdır. Ayrıca, iki farklı cinsiyet arasında olan karışım örneklerinde, Amelogenin lokusundaki aleller arasında farklı oranların izlenmesi karışımın göstergesidir[49;57]. 2.7.4. Karışım Örneklerinde Genotiplerin Tanımlanması Bir veya daha fazla STR lokusunda 3 veya daha fazla belirgin pikin izlenmesi karışım örneğin göstergesidir. İki kaynaktan oluşan bir karışım örnekte, bir STR lokusu için, olası genotip kombinasyonlarına göre 1, 2, 3 veya 4 pik izlenebilir (bkz şekil 2.2, şekil 2.3). 4 pik: • Heterozigot + Heterozigot , çakışan aleller mevcut değil (genotipler kişilere özgü). 3 pik: • Heterozigot + Heterozigot , bir çakışan alel. • Heterozigot + Homozigot , çakışan aleller mevcut değil (genotiler kişiye özgü). 2 pik: • Heterozigot + Heterozigot , iki çakışan alel (genotipler aynı). • Heterozigot + Homozigot , bir çakışan alel. • Homozigot + Homozigot , çakışan aleller mevcut değil (genotipler kişiye özgü). Tek pik: • Homozigot + Homozigot , çakışan aleller (genotipler aynı). Şekil 2.2: İki erkek şahısa ait karışım profili Şekil 2.3: Bir erkek bir kadın şahısa ait karışım profili Adli incelemelerde, iki veya daha fazla kişinin DNA’sından oluşan karışımlarla karşılaşma sıkça karşılaşılan bir durumdur ve elde edilen DNA profillerinin doğru yorumlanması gerekir. Kanıtın değerlendirilmesinde, analizi yapan kişi, araştırılan materyaldeki DNA’nın bir kişiden mi yoksa birden fazla kişiden mi geldiğine karar vermelidir. Bu durum, araştırılan her bir lokustaki alel sayısı ve pik yükseklik oranları ile belirlenir. Zaman zaman izlenen ekstra pikler (artifakt pikler) gerçek aleller ile karıştırılmamalıdır. 2.8. DNA ANALİZ LABORATUVARLARINDA KALİTE KONTROL Bir suç işlendiğinde suçlunun bulunması ve cezalandırılması veya suçsuz bir kişinin haksız yere suçlanmasının önlenmesinde delillerin doğru değerlendirilmesi önemlidir. Bu işlem sırasında olaya ve delilin niteliğine göre farklı inceleme teknikleri uygulanır. Günümüzde DNA tiplemesi bu amaçla kullanılan önemli bir bilimsel yöntemdir. DNA tiplemesi, çok basamaklı bir teknik işlem olmasından dolayı, her basamakta sonuçları doğru bir şekilde elde edecek ve yorumlayabilecek, kalifiye ve iyi yetişmiş teknik personel varlığını gerektirmektedir. Doğru bilimsel sonuçların elde edilebilmesi için 2 önemli faktör bulunmaktadır. Bunlar, kalite güvencesi ve kalite kontrolüdür. Kalite güvencesi, bir ürün ya da hizmetten beklenen toplam kalitenin elde edilebilmesi için gerekli olan planlı ya da sistematik çalışmalardır. Kalite kontrol ise, kalite güvencesini sağlamak için gerekli olan günlük teknik işlemler ve aktiviteler olarak tanımlanabilir. Bu yüzden, DNA çalışmaları yapan laboratuvarlar kalite güvencesi sistemi ve kalite kontrol yöntemleri geliştirmek zorundadır. İlk olarak, laboratuvarda uygulanan testler tüm dünya tarafından onaylanmış, yani, sağlıklı, güvenilir ve tekrar edilebilir özellikte olmalıdır. Başka bir deyişle, elde edilen sonuçlar doğru ve çalışılan örneğe ait olmalı, herhangi bir zamanda tekrar çalışılması durumunda da benzer veya aynı sonuçlar elde edilmelidir[58]. İkinci olarak, DNA analiz laboratuarında çalışan her personel, laboratuvarın uyguladığı kalite güvence sisteminine uygunluğunun belirlenmesi amacı ile yeterlilik testinden geçirilmelidir. Bu amaçla, önceden DNA profili belirlenmiş standart örnekler kulanılabilir. Laboratuvarın her çalışanı, standart protokolleri kullanarak, önceden belirlenmiş DNA profillerinde benzer ve uyumlu sonuçlar elde etmelidir. Ayrıca, laboratuvar akreditasyonunun gerçekleşmesi için, bir akreditasyon kurumunun yetkilileri tarafından tüm laboratuvar tetkik edilmelidir. Bu aşamada, laboratuardaki tüm cihazlar, olanaklar, teknik elemanlar, prosedürler, dökümanlar ve sonuç raporları akreditasyon kurumunun yetkilileri tarafından incelenmelidir[58]. 2.8.1 Kuzey Amerika’da Kalite Kontrol Organizasyonları ABD’de, DNA laboratuvarlarında kalite kontrolünün gerçekleştirilmesi amacı ile, FBI laboratuvarlarının sponsorluğu ile 1988 yılında DNA analiz yöntemlerinde teknik çalışma grubu (The Technical Working Group on DNA Analysis Methods: TWGDAM) kurulmuştur. Bu grubun ilk toplantısı, ABD ve Kanada’da faaliyet gösteren 16 adli tıp laboratuvarını ve araştırma enstitüsünü temsilen 31 laboratuvar çalışanının katılımı ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonra bu toplantılar FBI tarafından rutin olarak, Ocak ve Temmuz aylarında olmak üzere yılda 2 defa yapılmaya başlanmış ve grubun adı, DNA Analiz Yöntemlerinde Bilimsel Çalışma Grubu (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods: SWGDAM) olarak değiştirilmiştir. SWGDAM tarafından, RFLP, PCR, CODIS (Combined DNA Index System), mitokondrial DNA, STR, validasyon, Y kromozom ve kalite güvence alt grupları oluşturulmuştur. Alt grupların yaptığı çalışmalar sonucu, DNA analizinde kalite güvencesini sağlamak amacı ile 1989, 1991 ve 1995 yılında rehberler oluşturulmuş ve son olarak 2003 yılında güncelleştirilmiştir[58]. 1994 yılında, ABD kongresi tarafından çıkartılan bir kanunla kurulan DNA danışma kurulunun (The DNA Advisory Board: DAB) ilk toplantısı 12 Mayıs 1995 yılında yapılmıştır. DAB, adli tıp laboratuvarlarında görev yapan 13 üye, adli tıp laboratuarları ile herhangi bir bağlantısı olmayan moleküler genetikçi ve popülasyon genetikçisi, TWGDAM’ın başkanı ve bir yargıçtan oluşmaktadır. Bu kurul, DNA laboratuvarlarında standartları oluşturmak amacı ile 5 yıllık periyotlar için oluşturulmaktadır. Amerikan Suç Laboratuvarları Direktörleri Derneği (The American Society of Crime Laboratory Directors: ASCLD) ve ona bağlı laboratuvar akreditasyon kurulu (ASCLD / LAB), hem ABD’de hem de uluslararası anlamda, laboratuvarların akreditasyonu için önemli bir role sahiptir. Bu kurul tarafından oluşturulan suç laboratuvarı akreditasyon programı, laboratuvarların yönetim, çalışma, personel ve cihaz gibi kriterlerinin standardizasyonu için çalışmaktadır. Nisan 2004 itibarı ile 265 suç laboratuvarı ASCLD/LAB tarafından akredite edilmiştir[59]. ABD’de, Ulusal Adli Tıp Çalışma Merkezi (The National Forensic Science Training Center: NFSTC), laboratuvarların, SWGDAM ve DAB tarafından belirlenen kurallara uymasını sağlamak amacı ile akreditasyon programları geliştirmiştir[60]. Amerikan kan bankacılığı derneği (The American Association of Blood Banks: AABB), DNA nesep testinin yapılabilmesi için gerekli olan ulusal standartları belirler ve gerekli akreditasyon şartlarını oluşturur[61]. Amerikan patologlar birliği (The Collage of Amerikan Pathologists: CAP), adli tıp ve babalık testi laboratuvarları oluşturmaktadır[62]. ile Bir klinik DNA test laboratuvarlar için yeterlilik laboratuvarı olan Orchid testleri Cellmark, laboratuvarlara yeterlilik testi hizmeti sunmaktadır. Bu amaçla uluslararası kalite değerlendirme projesi (International Quality Assesment Scheme: IQAS) kapsamı altında, DNA yeterlilik test programı oluşturmuş ve DNA analizi yapan tüm laboratuarlara hizmet vermeye başlamıştır[63]. Ayrıca, Collaborative Testing Services, Inc. (CTS), Human Identity Trade Association (HITA), National Institute of Standards and Technology (NIST), Quality Forensic, Inc. ve Serological Research Institute (SERI ) gibi yeterlilik testi hizmeti sunan merkezler bulunmaktadır[64]. 2.8.2 Avrupa Birliğinde Kalite Kontrol Organizasyonları Uluslararası Adli Tıp Genetiği Derneği (International Society for Forensic Genetics: ISDG), adli tıp amaçlı kullanılan genetik işaretlerle ilgili bilimsel çalışmaların teşvik edilmesi için kurulan uluslararası bir organizasyondur ve 50 ülkeden 800’den fazla üyesi vardır. ISDG’nin düzenli toplantıları yılda 2 kez olmak üzere uluslararası düzeyde yapılmaktadır. Konferansla ilgili bilimsel yayınlar ‘’Adli tıp genetiğinde gelişmeler’’ başlığı altında yayınlanmaktadır. Ayrıca, ISDG bünyesinde kurulan DNA Komisyonu, STR lokuslarının kullanımı[65], mitokondrial DNA[66], ve Y kromozomu lokusları[67] ile ilgili önerilerde bulunmaktadır. 1995 yılında kurulan Avrupa Adli Tıp Enstitüleri Birliği (The European Network of Forensic Science Institutes: ENFSI), Avrupa Birliği ülkeleri arasında bilgi alışverişi ve laboratuvarların akreditasyonu amacı için kurulmuştur. ENFSI bünyesinde, DNA çalışma protokollerini tartışmak amacı için yılda iki kere toplanan DNA çalışma grubu bulunmaktadır. Avrupa DNA profili grubu (European DNA Profiling Group: EDNAP), STR markırları ile ilgili, aynı örneklerde fakat laboratuvarlar arası çalışmalar yapmakta ve bu sayede laboratuvarlar arası kalite kontrol ölçüleri oluşturmaktadır[64]. Bir diğer Avrupa Birliği kuruluşu olan DNA profilleme teknikleri standardizasyon organizasyonu (Standardization of DNA Profiling Techniques in the European Union: STADNAP), adli tıp DNA metodlarının standardizasyonu için kurulan bir organizasyonudur. STADNAP’ın amacı, Avrupa Birliği ülkeleri arasında DNA tipleme sistemlerinin kriterlerini belirleme, farklı metodlar arasında bilgi alışverişi ve değişimi sağlama ve Avrupa populasyonu arasında referansların ve alel frekans databazlarının kulanımını sağlamaktır[64]. 2.9. VALİDASYON Günümüzde, adli tıp amaçlı DNA tiplemesi yapan labotatuvarlar için validasyon çok önemli bir konu haline gelmiştir. Bu yüzden, laboratuvarlarda kullanılan prosedürlerin incelenen örneği doğru bir biçimde yansıtmasından emin olabilmek için, kullanılan tekniklerin ve teknolojilerin validasyonu gerekmektedir. Ayrıca, tüm laboratuvarlar örneklerin uygun bir şekilde çalışıldığının ispat edilebilmesi için kullandıkları teknik prosedürleri ve elde ettikleri sonuçları dokümante edebilmelidir. 2.9.1. STR Validasyonu Genellikle iki çeşit validasyondan bahsedilebilir. Bunlar, geliştirici validasyon ve internal validasyon. Geliştirici validasyon, STR alellerinin tespit edilebilmesi için, yeni STR lokusları ya da kitleri, primer setleri ve yeni teknolojilerin testlerini kapsamaktadır. İnternal validasyon ise daha önce geliştirici validasyon tarafından oluşturulan prosedürlerin bir diğer laboratuvarda düzgün bir şekilde çalışıp çalışmadığının tespiti olarak tanımlanabilir. Geliştirici validasyon, STR kiti üreticileri ya da FBI laboratuvarı gibi büyük laboratuvarlar tarafından yapılırken, internal validasyon ise daha ufak laboratuvarlar tarafından gerçekleştirilir[64]. 2.9.2. Geliştirici Validasyon Çalışmaları Bir STR kitinin, DNA Analiz Yöntemlerinde Bilimsel Çalışma Grubu (SWGDAM) tarafından onay alabilmesi için gereken standartlar 1995 yılında belirlenmiş ve Temmuz 2003’te revize edilmiştir[68]. Buna göre aşağıdaki testlerden olumlu sonuçlar elde edilmelidir[64;68]. 1) Standart Örnekler: Aynı kişiye ait farklı dokulardan ve vücut sıvılarından DNA izole edilmeli ve aynı sonuçlar elde edilmelidir. Çünkü, rutin bir çalışmada, suçlu kişiden alınan kan ile olay yerinden elde edilen semen ya da deri hücresi gibi örneklerin birbirine uyumlu sonuçlar vermesi gerekmektedir. 2) Tutarlılık: Kullanılan tekniklerin aynı ya da farklı laboratuvarlarda, değişik zamanlarda tekrar çalışılması sonucunda aynı sonuçlar elde edilmelidir. 3) Populasyon Çalışmaları: Adli tıp laboratuvarının görev bölgesindeki populasyonun alel frekanslarını belirlemek için, kimliği belirsiz kişilerden elde edilen örnekler çalışılır. Elde edilen alel frekansları daha sonra yapılacak olan populasyon istatistiği çalışmalarında kullanılır. 4) Benzerlik: Aynı kişilere ait kurumuş kan ve semen örneklerinden elde edilen DNA profilleri ile taze kan ve semenden elde edilen DNA profilleri karşılaştırılır. Aynı kaynaktan elde edilen sonuçların birbirleri ile uyumlu olması gerekmektedir. 5) Karışım Örnek Çalışmaları: DNA tipleme sisteminin, karışım örnekleri oluşturan farklı komponentleri ortaya çıkarma özelliği araştırılır. Bu amaçla, genotipi bilinen 2 farklı kaynağa ait genomik DNA örnekleri, 50:1’den 1:50’ye kadar farklı oranlarda karıştırılır. Bu sayede karışımın tespit edilebileceği minimum oran bulunabilir. Ayrıca, heterozigot alellerin pik yükseklik oranı ve her bir lokusa ait alelin stutter yüzdesi tespit edilebilir. Elde edilen göreli pik yükseklik oranları, karışım örneğin tek bir kaynağa ait stutter üründen ayrılabilmesi için yol gösterici olur. 6) Çevresel Faktörler: Genotipi bilinen örnekler güneş ışığı, nem ya da sıcaklık dalgalanmaları gibi çevresel faktörlere maruz bırakılır. Daha sonra aynı genotipin elde edilip edilmediği test edilir. 7) Matrik Çalışmaları: Genotipi bilinen kan ya da semen örneği, adli bir olayda karşılaşılabilecek, işlenmiş deri, kot, cam, metal, yün ya da pamuk gibi materyallere bulaştırılır ya da boya veya toprak ile karıştırılır. Daha sonra tekrar DNA profili elde edilir ve non-spesifik artifaktların varlığı ve herhangi bir lokusta olan amplifikasyon başarısızlığı araştırılır. 8) Daha önce çalışılmış ve sonuçlanmış olan gerçek bir adli vakada, yeni DNA tipleme sistemi çalışılır ve sonuçların uyumuna bakılır. 9) İnsan Dışı Çalışmalar: Test edilen DNA tipleme sistemi, farklı türlere ait DNA varlığının sonuçlara etkisini görmek için, insan dışı canlıların DNA örneği ile birlikte çalışılır. Bu amaçla goril ve şempanze gibi primatlar ile at, sığır, köpek ya da kedi gibi evcil hayvanlar kullanılır. Ayrıca, suç bölgesinde bulunabilecek ve sonuç almayı engelleyecek bakteri ya da mantarlarda kullanılır. 10) Minimum Örnek: Güvenilir bir sonuç elde etmek için gerekli olan minimum genomik DNA miktarını tespit edebilmek için, genotipi bilinen bir örnek farklı miktarlarda kullanılır. Örneğin, 10ng, 5ng, 2ng, 1 ng, 0.5ng, 0.25ng ve 0.1ng miktarda DNA değerlendirilebilir. Birçok protokol, PCR amplifkasyonu sırasında alelik drop-out’u engellemek veya düşük duyarlılıktan kaçınmak için en az 0.25-0.5ng genomik DNA gerekliliği bildirilmektedir. 2.9.3 Validasyon Çalışmalarının Sunumu Geliştirici validasyon çalışmalarının sonuçları gerek bilimsel toplantılarla gerekse bilimsel dergiler aracılığı ile ilgililere bildirilir. En önemli bilimsel dergiler ‘Journal of Forensic Sciences’, ‘International Journal of Legal Medicine’, ‘Forensic Science International’, ve ‘Legal Medicine’ dır. Bilimsel toplantılar ise her sonbaharda düzenlenen ‘International Symposium on Human Identification’, her şubatta düzenlenen American Academy of Forensic Sciences’, iki yılda bir düzenlenen ‘Congress of the International Society of Forensic Genetics’ ve üç yılda bir düzenlenen ‘International Association of Forensic Sciences’ toplantılarıdır[64]. 2.9.4 Laboratuvarlar Arası Testler Laboratuvarlar arası testler, farklı laboratuvarların sonuçlarını karşılaştırmasını ve bir laboratuvarda kullanılan metodun bir diğer laboratuvara uygun olup olmadığının test edilmesi amacı için kullanılır. Bu tür testler, özellikle farklı laboratuvarlar tarafından oluşturulan DNA databazlarının kullanıldığı durumlarda daha fazla önem kazanmaktadır[69]. DNA databazları, gerek suçluların tespiti gerekse kontaminasyonun belirlenmesi için en önemli bilgi kaynaklarıdır. 2.10. DNA VERİ BANKASI VE ÖNEMİ DNA veri tabanı, adli bir olay sonucu laboratuvara intikal eden tüm DNA profillerinin saklandığı, sürekli genişleyen ve profiller arasında karşılaştırmaya olanak sağlayan bir bilgi deposudur. DNA veri tabanındaki bilgiler, suç ve suçlulukla mücadele ve yargılama bakımından çok büyük bir önem taşımaktadır. Özellikle, öldürme, cinsel suçlar, aynı kişiler tarafından farklı zaman ve mekanlarda işlenen seri suçların soruşturma ve yargılama faaliyetlerinde çok başarılı sonuçlar elde edilmektedir. Bu özelliği nedeniyle suçların işlenmesinde bir caydırıcılık fonksiyonu da icra etmektedir. DNA veri tabanı, yargılama dışı amaçlarla da kullanılabilmektedir. Örneğin; deprem, sel, tsunami, maden göçmesi gibi doğal afetlerde çoğu zaman ölenlerin cesedi bozulduğundan bu kişilerin kimliklerinin tespitinde DNA bilgisinden yararlanılmaktadır. Türkiye’nin de bir deprem ülkesi olması gerçeği konuyu daha da önemli kılmaktadır. Türkiye’de gelişmekte olan turizm aktivitesi nedeniyle, bir çok ülke vatandaşlarının belirli merkezlerde birlikte bulunabilmeleri söz konusudur. Dolayısıyla, böyle bir ortamda meydana gelebilecek doğal afetlerde kimliklendirme açısından da oldukça önem taşımaktadır. Kayıp kişilerin aileleri, bunların hayatta olup olmadıklarını bilmediği durumlarda büyük sıkıntılar yaşamaktadırlar. DNA teknolojisi sayesinde bu kişilerin kimliklerinin daha önce verdikleri örneklerden veya kendilerine ait eşyalardan ya da anne babalarından elde edilen örneklerin eşleştirilmesi suretiyle tespit edilmesi mümkündür. Ayrıca sınırların açılması ve serbest dolaşım ile birlikte suçlar giderek uluslararası boyutlara ulaşmıştır. Gelecek yıllarda bunun daha da artacağı açıktır Uluslararası anlamda suçla mücadele, değişik ülkelerde gerçekleştirilen DNA çalışmalarının birbiriyle mukayese edilebilir olması gerekir. Bu nedenle Avrupa'nın ve giderek tüm dünyanın kriminal laboratuarlarının DNA’nın aynı bölgesini analiz etmeleri zorunlu olmuştur. Ancak bu şekilde farklı ülkelerde suç işlemiş kişilerin bulunması mümkün olacaktır. Nitekim Avrupa Topluluğu ülkeleri ile Amerika, Kanada, Avustralya, Yeni Zelanda ve Japonya aynı DNA lokuslarını analizi etmekte, gerek Europol ve Interpol gerekse FBI bünyelerinde bulunan DNA veri bankaları aracılığı ile bu bilgileri paylaşmaktadırlar. Alınan karar uyarınca üye ülkelerin tamamında aynı biçimde çalışması sağlanmaktadır. Bu amaçla ABD’de CODIS (Combined DNA Identifıcation System) sistemi oluşturulmuştur. Bu sistem çerçevesinde ABD’de incelenen bölge sayısı 13’tür. Elde edilen DNA profilleri Interpol bünyesindeki merkez DNA veri tabanına gönderilmektedir. ABD’de 50 eyaletten elde edilen DNA sonuçları Washington, DC dışındaki gizli bir yerdeki FBI’ın ulusal veri tabanında toplanmaktadır Gerek Avrupa ülkelerinin ulusal veri tabanlarında gerekse FBI"in DNA bankasında hem olay yerlerinden elde edilen biyolojik kalıntıların DNA profilleri, hem de belirli bazı suçlardan mahkum olanların DNA profilleri yer almaktadır. Avrupa ülkelerinin tamamında tecavüz, suçlularının DNA profilleri mutlaka bankalanmaktadır. Ulusal DNA veri bankası bulunan her ülkede yasalarla düzenlenmiş bir suçluluk listesi hazırlanmıştır. İngiltere hırsızlık dahil olmak üzere tüm suçluların DNA profillerini bankalamaktadır. Bu sayede İngiliz polisi yalnız DNA profiline dayanarak ülke genelinde haftada 300-500 olay aydınlatabilmiştir. İskoçya'da trafik suçlarında dahi DNA profili alınmaktadır. ABD de ise eyaletten eyalete değişen bir uygulama yürütülmektedir. Kaliforniya’da hemen her suçtan mahkum olanın, hatta umumi yerlerde açığa idrar yapanların bile DNA profilleri bankalanmaktadır. Öte yandan, kimliği meçhul cesetlerin DNA profilleriyle, kayıp kişilerin doğrudan ya da akrabalarının kanı incelenerek dolaylı biçimde belirlenen DNA profilleri de bu bankalarda tutulmaktadır[11;69]. 2.10.1. DNA Veri Bankasındaki Profillerin Karşılaştırılması DNA veri bankasında insan vücuduna ait doku ya da kan örnekleri veya bunlardan elde edilen izolatlar değil, bu izolatların değerlendirilmesi neticesi elde edilen DNA verileri elektronik ortamda saklanır. Ceza Muhakemesi Kanununun 79 uncu maddesine göre moleküler genetik incelemeler yapılmasına hâkim tarafından karar verileceği, yine incelenecek örneklerin bilirkişiye ilgilinin adı ve soyadı, adresi ve doğum tarihinin bildirilmeksizin verileceği öngörülmüştür. Türkiye’de henüz bir DNA veri bankası bulunmamaktadır. Ancak, hazırlanan DNA Veri Bankası Kanunu tasarısına göre, alınan örneklerin kişisel veri olma niteliğini göz önünde tutarak ve kötüye kullanılmasının önlenmesi bakımından bir suç soruşturması veya kovuşturması kapsamında DNA örnekleri alınan kişilere ait veriler banka bünyesinde oluşturulan sisteme kodlanarak girilmesi, bu kişilerin kimlik bilgileri ile tanınmalarını sağlayacak diğer bilgilerin hiçbirinin sistemde yer almaması ön görülmektedir. Laboratuvarlar tarafından elde edilen DNA profilleri ile adlî merciler tarafından sisteme kaydedilmesi istenen DNA profilleri, Cumhuriyet savcısının talebi ile banka tarafından sisteme kaydedilir. DNA veri tabanında tutulan profillerin karşılaştırılması veya eşleştirilmesi ile DNA verilerinin elde edilmesine ilişkin yapılan her türlü işlemler gizlidir. DNA veri bankası sistemi, adlî amaçlı ve diğerleri olmak üzere iki ana bölümden oluşur. Adlî amaçlı DNA profilleri, ancak adlî amaçlı ana dizinde yer alan DNA profilleri ile karşılaştırılabilir. Bunun dışındaki profiller de ancak diğerleri dizini içindeki verilerle karşılaştırılabilir. Örneğin, bir yakınının kimliğinin tespiti için örnek veren bir gönüllüden elde edilen profiller bir suç soruşturması veya bir babalık davasında kullanılamaz. Banka tarafından sistemdeki DNA profillerinin karşılaştırılması ve eşleştirilmesi sonucunda elde edilen DNA profillerinin anlaşılır yorumu, istemde bulunan mercie gizlilik kaydı içeren bir rapor olarak gönderilir. Yapılan karşılaştırma sonucunda bu profillerin yapılmakta olan soruşturma veya kovuşturmayla ilgisi olmayan, ancak başka bir suça ilişkin eşleşme çıkması halinde bu durum Cumhuriyet savcılığına bildirilir[70]. DNA veri tabanına eklenen yeni bir profil, kişi ve olay yerine ait DNA verileri ile farklı şekillerde uyum verebilir [11]. Bunlar; 1. Olay yeri-olay yeri arasında bir uyum bulunabilir. Aynı kişinin farklı yerlerdeki olayların suçlusu olduğu anlaşılır 2. Kişi-Kişi arasında bir uyum bulunabilir. Böylelikle farklı kimliklerle suç işleyen kişilerin aslında aynı kimse olduğu anlaşılır. 3. Kişi-olay yeri arasında bir uyum bulunabilir. Bu durum, olay yerindeki biyolojik delili şüphelinin bıraktığını veya farklı olaylarda aynı DNA profilinin tespiti olayların aynı kişi tarafından gerçekleştirildiğini gösterir. 2.10.2. DNA Veri Bankasında Yer Alması Gereken Bilgiler DNA verileri ve milli DNA veri bankası kanunu tasarısında da belirtildiği üzere, Ulusal DNA Veri Bankasında yer alacak bilgiler şu şekilde sınıflanabilir[11;70]: 1. 04/12/2004 tarihli ve 5271 sayılı Ceza Muhakemesi Kanununda belirlenen esas ve usûller çerçevesinde gönüllü kişilerin ve belirli suçlardan mahkum olmuş olanların DNA profilleri 2. Bir suç sebebiyle olay yerinden elde edilen ve faile ait olduğu düşünülen delillere ait DNA profilleri 3. Mağdurların üzerinden ve vücut boşluklarından elde edilen ve saldırgana ait olduğu düşünülen biyolojik materyalin DNA profili 4. Hukukî ve fiilî sebeplerle kimliği tespit edilemeyen kişilerin DNA profili 5. Kimliği tespit edilemeyen cesetler ile vücut parçalarına ait DNA profilleri 6. Görevleri sebebiyle hayati risk taşıyanların DNA profilleri 2.10.3 Türkiye’de DNA Profillemesi ve Bankacılığı Türkiye’de Emniyet Genel Müdürlüğü Kriminal Polis Laboratuvarı, Adli Tıp Kurumu, Jandarma Genel Komutanlığı Kriminal Laboratuvarı, İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü ve bazı üniversitelerin tıp fakültelerinin adli tıp ana bilim dallarında DNA analizleri yapılmaktadır. Her kriminal laboratuvar DNA üzerinde kendi tercih ettiği bölgeleri çalışmakta olduğundan, ve bu bilgiler hiç bir merkez bilgisayara girilmediğinden ülke içinde dahi bilgi paylaşımı olmamakta ve pek çok olay bu nedenle aydınlatılamamaktadır. Türkiye'de öncelikle usulüne uygun, insan hakları ve genetik bilginin gizliliğine saygılı ve farklı kurumlar arasında koordinasyonu sağlayacak DNA veri bankasının kurulması gereklidir. DNA veri bankası tamamen bağımsız, bilimsel, idarî ve malî özerkliğe sahip, hesap verebilir ve şeffaf bir organ tarafından yönetilmesi ve denetlenmesi gerekir. Bu amaçla DNA verileri ve Türkiye milli DNA Veri Bankası kanunu tasarısı hazırlanmıştır. Tasarı, sekiz bölümden oluşmaktadır. Birinci bölümde, tasarının getiriliş amacı, kapsamı ve tasarıda kullanılan bazı terimlerin tanımlarına yer verilmiştir. Tasarının ikinci bölümünde ise, DNA analizi sonucu elde edilen verilerin nitelikleri ve bu işlemlerin yapılış amacı göz önünde tutulmak suretiyle temel ilkeler sayılmıştır. Tasarının üçüncü bölümünde ise DNA analizi yapma yetkisi başta olmak üzere hakkında DNA analizi yapılanların hak ve yetkileri, yükümlülükler ve DNA verilerinin aktarılmasına ilişkin hükümler düzenlenmiştir. Tasarının dördüncü bölümünde, bu tasarı bakımından en önemli sayılabilecek bir konuya yer verilerek DNA veri tabanının oluşum şekline ve bu veri tabanında tutulan profillerin karşılaştırılmasına ilişkin ayrıntılı düzenlemelere yer verilmiştir. Tasarıda getirilen en önemli yenilik, Türkiye Millî DNA Veri Bankası’nın kurulmasının öngörülmesidir. Bu amaçla, Tasarının beşinci bölümünde Türkiye Millî DNA Veri Bankası’nın kuruluş ve görevlerine ilişkin hükümler düzenlenmiştir, Altıncı bölümünde ise bankanın tasarıyla verilen görevleri gerektiği gibi yerine getirilmesini sağlamak amacıyla öngörülen malî hükümler düzenlenmiştir. Tasarının yedinci bölümünde ceza ve usül hükümlerine, sekizinci bölümünde ise tasarıyla ilgili çeşitli hükümlere yer verilmiştir. Kurulması öngörülen banka ile, DNA profillerinin saklanması ve işleme tabi tutulmasında uygulama birliği sağlanması ve halen Adli Tıp Kurumu, Emniyet ve Jandarma Kriminal Daireleri bünyesinde tutulan profillerin bankada birleştirilerek ortak bir veri tabanının oluşturulması amaçlanmıştır. Ortak bir veri tabanı kurulması ve bankada saklama ve işleme tabi tutma esaslarının belirlenmesiyle de DNA profillerinin uluslararası standartlara uygun olarak korunması da gerçekleşmiş olacaktır[70]. 3. MATERYAL ve METOD Bu çalışmada, İstanbul Kriminal Polis Laboratuarı bünyesinde çalışan tüm personelden alınan ağız içi sürüntü örneklerinden (buccal swab) elde edilen DNA profilleri bilgisayar ortamında laboratuar arşivine kaydedilip, personel kaynaklı kontaminasyonun tespiti için personel veri tabanı oluşturuldu. 2005-2006 ve 2007’nin ilk altı ayında Marmara bölgesinden, İstanbul Emniyet Müdürlüğü, Kriminal Polis Laboratuvarı, Biyolojik İncelemeler Şube Müdürlüğü’ne intikal eden 13365 olaya ait 50449 numune incelendi. Bunlar içerisinde kontamine olabileceği düşünülen ve bu yüzden ekspertiz raporlarına verilememiş tüm zayıf ve mix genotip özellikler, DNA veri arşivinden retrospektif taranarak, kontaminasyon oranları ve sebepleri araştırıldı. Ayrıca, 2000 yılından itibaren çalışılan ve rapor edilen tüm numunelere ait genotip bulgulara laboratuarın DNA veri arşivinden ulaşıldı. Biyoloji Şubesinde çalışanlara ait genotip bulgular, bilgisayar ortamındaki veri arşivinden elde edildi. Buna karşın, diğer şube çalışanlarına ait genotip bulgular bilgisayar ortamındaki veri arşivinde bulunmaması nedeniyle, bu çalışma sayesinde 2007 yılının başında oluşturuldu. Dolayısıyla, her bir personele ait genotip bulgu bilgisayar ortamına kaydedildikten sonra, rapor edilen tüm genotip bulgular ile de aralarında herhangi bir irtibat olup olmadığı bilgisayar ortamında otomatik olarak tarandı. Çalışmaya katılan tüm personelden ağız içi sürüntü örnekleri steril pamuklu çubuk ile alındı. DNA çekitleme yöntemi olarak QIAGEN Mini Kit kullanıldı. PCR yönteminde, Multiplex AmpF/STR Identifıler PCR Amplifıkasyon kiti ve Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystem amplifikasyon cihazı kullanıldı. Tek bir AmpF/STR Identifiler PCR Amplifikasyon kiti ile, 2., 3., 4., 5., 7., 8., 11., 12., 13., 16., 18., 19., 21., X ve Y kromozomları üzerindeki 15 tetranükleotid tekrar lokusu ve cinsiyet tanımlayıcı işaret olan Amelogenin lokusu çoğaltıldı. Bu lokuslar sırasıyla, D2S1338, TPOX, D3S1358, FGA, D5S818, CSFİPO, D7S820, D8S1179, THO1, vWA, D13S3317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11 ve Amelogenin dir. Elektroforez işleminde, 16 kapillerli AB Applied Biosystem HITACHI 3130 XL Genetik Analizör cihazı kullanıldı. “GeneMapper ID V3.2” programında örnekler tiplendirildi. Daha sonra, tüm laboratuar personeline ait genotip bulgular, laboratuarın DNA veri arşivine girildi. Yöntemlere ait ayrıntılı basamaklar Ek-1’de verildi. Çalışmaya katılan personelin görev yeri ve sayısı bulgularda belirtilmiş olup, personele imzalatılan bilgilendirilmiş onay formu Ek-2’de sunuldu. İstatistiksel analizde ki- kare testi uygulandı, P<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bu analizlerin hesaplanmasında SPSS 11.5 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL) kullanıldı. Ayrıca özellik gösteren dört adet olgu seçilerek sunulmuş ve tartışılmıştır. 4. BULGULAR Çalışmaya katılan toplam 110 personelin görev yeri ve sayısı aşağıda belirtildiği gibidir (Tablo 4.1). Tablo 4.1 Genotip bulguları karşılaştırılan personelin görev yerlerine göre dağılımı. Görev yeri Sayı Laboratuvar Müdürü 1 Özel Kalem Büro Amirliği 3 İdari Büro Amirliği 3 Bilgi İşlem Büro Amirliği 2 Teknik Fotografi Büro Amirliği 1 Balistik İnceleme Şube Müdürlüğü 25 Belge İnceleme Şube Müdürlüğü 15 İz İnceleme Şube Müdürlüğü 8 Kimyasal İnceleme Şube Müdürlüğü 19 Biyolojik İnceleme Şube Müdürlüğü 22 Personel ve Eğitim Şube Müdürlüğü 3 Araştırma-Geliştirme ve Destek Şube Müdürlüğü 4 Diğer Hizmetler -Temizlik görevlileri 4 İstanbul Emniyet Müdürlüğü; Kriminal Polis Laboratuvarında 2005, 2006 ve 2007 yılının ilk 6 ayında çalışılan 13.365 olaya ait 50.449 numunede, toplam 671 adet kontamine olduğu düşünülen numune saptandı (Tablo 4.2). Kontaminasyon sayıları açısından yıllar arasındaki farka bakıldığında; 2005 yılında 4600 olaya ait 17943 numunede 225 kontaminasyon (% 1,25), 2006 yılında 5609 olaya ait 20266 numunede 289 kontaminasyon (%1, 42) saptanmıştır. 2005 ve 2006 yılları arasında kontaminasyon oranları açısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır (kikare test p= 0,159). 2007 yılının ilk 6 ayında 3156 olaya ait 12240 numunede 157 kontaminasyon (% 1,28) saptanmış olup; 2006 yılı ile arasında kontaminasyon oranları açısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamış (ki-kare test p= 0,306) olmakla birlikte, 2007 yılı sonundaki değerler kullanılarak hesaplama tekrarlandığında bu sonucun değişme ihtimali muhtemeldir. Tablo 4.2 Yıllara göre olay, toplam numune ve kontaminasyon sayılarının dağılımı. Kontaminasyon Çalışılan Olay Sayısı *TNS *KNS KNS/*TNS 2005 4.600 17.943 225 % 1,25 2006 5.609 20.266 289 % 1, 42 2007 ilk 6 ay 3.156 12.240 157 % 1,28 Toplam 13.365 50.449 671 *KNS: Kontamine olduğu düşünülen numune sayısı,*TNS: Toplam numune sayısı, *KNS/TNS: Kontamine olduğu düşünülen numune sayısının incelenen toplam numune sayısına oranı Tablo 4.2’de İstanbul Emniyet Müdürlüğü, Kriminal Polis Laboratuvarında, 2005, 2006 ve 2007 yılının ilk 6 ayında incelenen ve kontamine olduğu düşünülen toplam 671 numune sayısının (*KNS) yıllara göre dağılımı ve yüzde oranları görülmektedir. Tablo 4.3 Toplam kontaminasyon sayısının yıllara göre dağılımı. Yıl Kontaminasyon P Sayısı Yüzde 2005 225 33,5 2005-2006 2006 289 43,1 p: 0,159 2007 ilk 6 ay 157 23,4 2006-2007 Toplam 671 100 p: 0,306 Tablo 4.4’te, toplam kontaminasyon sayısının numune türüne göre dağılımı incelendiğinde, kontaminasyon oranı en fazla tükürük (%37.9), ter (%35.9)’de belirlenmiş olup, bunu kan (%17.1) ve diğer numuneler takip etmektedir. Tablo 4.4 Toplam kontaminasyon sayısının numune türüne göre dağılımı. Numune Türü Kontaminasyon Sayısı Yüzde Kan 115 17,1 Tükürük 254 37,9 Ter 241 35,9 Kepek 52 7,7 Meni 9 1,3 Toplam 671 100 Çalışılan numunelerdeki toplam 671 kontaminasyonun kaynakları incelendiğinde laboratuvar çalışanı (kişinin kendi genomu) kaynaklı 17 (% 2,5) adet, diğer olay (olaylar arası cross kontaminasyon) kaynaklı 20 (% 3) adet ve kaynağı belli olmayan 634 (% 94,5) adet kontaminasyon olduğu saptandı. Bunların kontaminasyon türüne ve yıllara göre dağılımı tablo 4.5’ de verilmiştir. Tablo 4.5 Olguların kontaminasyon kaynağı ve yıllara göre dağılımı. YIL 2005 2006 2007 İlk 6 ay Toplam Sayı Kontaminasyon Kaynağı Kaynağı Laboratuvar *Diğer Olay Belli Çalışanı (OAÇK) Olmayan 3 7 215 Toplam 225 % 1,3 3,1 95,6 100,0 Sayı 8 3 278 289 % 2,8 1,0 96,2 100,0 Sayı 6 10 141 157 % 3,8 6,4 89,8 100,0 Sayı 17 20 634 671 % 2,5 3,0 94,5 100,0 *Diğer Olay: Olaylar arası çapraz kontaminasyon (OAÇK) Tablo 4.6’da, diğer olay (OAÇK) kaynaklı kontaminasyon türünün, laboratuarda yürütülen analizler aşamasında, laboratuar çalışanları tarafından oluşturulduğu düşünülerek, tüm kontaminasyon kaynakları, kaynağı bilinen ve kaynağı belli olmayan şeklinde 2 temel gruba ayrıldı. Buna göre, kontaminasyonların % 5.5’inin kaynağının belli olduğu, %94.5’inin ise kaynağının belli olmadığı belirlendi. Numune türüne göre kaynağı bilinenler arasında, kepek ve kanda kontaminasyon oranın daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Tablo 4.6 İki temel kontaminasyon kaynağının, numune türlerine göre dağılımı Kontaminasyon Kaynağı Numune Türü Kan Tükürük Ter Kepek Meni Toplam Sayı % Sayı % Sayı % Sayı % Sayı % Sayı % Kaynağı Bilinen 12 10,4 11 4,3 7 2,9 7 13,5 37 5,5 Kaynağı Belli Olmayan 103 89,6 243 95,7 234 97,1 45 86,5 9 100 634 94,5 Toplam 115 100,0 254 100,0 241 100,0 52 100,0 9 100 671 100,0 Tablo 4.7’de, kaynağı bilinen kontaminasyon oranları açısından, numune türleri arasında fark olup olmadığına bakıldığında; 115 kan kontaminasyonun 12 tanesinin (% 10,4) ve 254 tükürük kontaminasyonunun 11 tanesinin (% 4,3) personel kaynaklı oluştuğu saptandı. Buna göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde personel tarafından; kan numuneleri tükürük numunelerine göre daha fazla kontamine edilmiştir (ki-kare test p= 0,044). 241 ter kontaminasyonunun 7 tanesinin (% 2,9) personel kaynaklı olduğu ve kan (% 10,4) ile kıyaslandığında; istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde kanın tere göre personel tarafından daha fazla oranda kontamine edildiği belirlenmiştir (ki-kare test p= 0,006). 52 kepek kontaminasyonun 7 tanesinin (% 13,5) personel kaynaklı olduğu ve tükürük (% 4,3) ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde kepeğin tükrüğe göre personel tarafından daha fazla kontamine edildiği belirlendi (ki-kare test p= 0,019). Ter (% 2,9) ile kepek (% 13,5) kıyaslandığında ise, istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde kepeğin tere göre personel tarafından daha fazla kontamine edildiği belirlendi (ki-kara test p= 0,004). Personel kaynaklı meni kontaminasyonuna saptanmadı. Sonuç olarak kan ve kepeğin kaynağı bilinen kontaminasyon grubu tarafından, diğer numune türlerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde daha fazla kontamine edildiği saptandı. Kan ve kepek arasında ise kaynağı bilinen kontaminasyon açısından istatistiksel anlamlı fark bulunmadı (ki-kare test p= 0,758). Tablo 4.7 Kaynağı bilinen kontaminasyonlu olguların ki-kare ile karşılaştırması. Kaynağı Bilinen Numune Grupları Kontaminasyonun Ki-Kare Test P Değeri Yüzde Değerleri Kan – Tükürük (% 10,4) - (% 4,3) 0,044 Kan – Ter (% 10,4) - (% 2,9) 0,006 Kepek – Tükürük (% 13,5) - (% 4,3) 0,019 Kepek – Ter (% 13,5) - (% 2,9) 0,004 Kan – Kepek (% 10,4) - (% 13,5) 0,758 (% 4,3) - (% 2,9) 0,475 Tükürük – Ter Tablo 4.8’de, kaynağı bilinen kontaminasyonların (laboratuvar çalışanı ve diğer olay (OAÇK) kaynaklı) numune türlerine göre sayı ve oranlarına bakıldı. Toplam 12 personel kaynaklı kan kontaminasyonun kendi içinde dağılımına bakıldığında, 3 tanesinin laboratuvar çalışanı kaynaklı olduğu, 9 tanesinin diğer olay kaynaklı olduğu görüldü. Kepek numunelerinde ise; toplam 7 personel kaynaklı kepek kontaminasyonunun 6 tanesinin laboratuvar çalışanı kaynaklı olduğu, 1 tanesinin diğer olay kaynaklı olduğu görüldü. Kan numunelerinin kontaminasyonunda diğer olay kaynaklı kontaminasyonun, kepek numunelerinin kontaminasyonunda ise laboratuvar çalışanlarının ön planda sorumlu olduğu saptanmıştır. Tablo 4.8 Kaynağı bilinen kontaminasyonlu olguların, numune türüne göre dağılımı Laboratuvar Diğer Olay *K.B.K.O Çalışanı (OAÇK) 12 3 9 Sayı Kan 2,6 7,8 % 11 4 7 Sayı Tükürük 1,6 2,8 % 7 4 3 Sayı Ter 1,7 1,2 % 7 6 1 Sayı Kepek 11,5 1,9 % Sayı Meni % 37 17 20 Sayı Toplam 2,5 3,0 % *K.B.K.O: Kaynağı bilinen kontaminasyonlu olgu sayısı Numune Türü Toplam 115 100,0 254 100,0 241 100,0 52 100,0 9 100,0 671 100,0 Tablo 4.9’de, kontamine numune türlerinin yıllara göre dağılımına bakıldı. 115 kan numunesinden 39 tanesinin (% 33,9) 2005 yılına, 47 tanesinin (% 40,9) 2006 yılına ve 29 tanesinin (% 25,2) 2007 yılının ilk 6 ayına ait olduğu saptandı. 254 tükürük numunesinden 96 tanesinin (% 37,8) 2005 yılına, 109 tanesinin (% 42,9) 2006 yılına, 49 tanesinin (% 19,3) 2007 yılının ilk 6 ayına ait olduğu saptandı. 241 ter numunesinden 72 tanesinin (% 29,9) 2005 yılına, 106 tanesinin (% 44) 2006 yılına ve 63 tanesinin (% 26,1) 2007 yılının ilk 6 ayına ait olduğu saptandı. 52 kepek numunesinden 14 tanesinin (% 26,9) 2005 yılına , 24 tanesinin (% 46,2) 2006 yılına ve 14 tanesinin (% 26,9) ) 2007 yılının ilk 6 ayına ait olduğu saptandı. 9 meni numunesinden 4 tanesinin (% 44,4) 2005 yılına, 3 tanesinin (% 33,3) 2006 yılına ve 2 tanesinin (% 22,2) 2007 yılının ilk 6 ayına ait olduğu saptandı. Tablo 4.9 Kontamine numune türlerinin yıllara göre dağılımı Numune Türü Kan Tükürük Ter Kepek Meni Toplam Yıl Toplam 2005 2006 2007 ilk 6 ay Sayı 39 47 29 115 % 33,9 40,9 25,2 100,0 Sayı 96 109 49 254 % 37,8 42,9 19,3 100,0 Sayı 72 106 63 241 % 29,9 44,0 26,1 100,0 Sayı 14 24 14 52 % 26,9 46,2 26,9 100,0 Sayı 4 3 2 9 % 44,4 33,3 22,2 100,0 Sayı 225 289 157 671 % 33,5 43,1 23,4 100,0 5. ÖRNEK OLGULAR Örnek Olgu-1 İstanbul Kriminal Polis Laboratuarına incelenmek üzere gönderilen, işyerinde kesici aletle yaralama ve fiili livata iddiası olayı ile ilgili olarak, olay yerinden elde edildiği belirtilen 1 ve 3 delil numaralı kıl numuneleri, 2 delil numaralı maket bıçağı, 4 ve 5 delil numaralı sigara izmaritleri olay yeri inceleme ekibi tarafından ayrı ayrı paketler içerisine toplanmış, mağdur şahsa ait kan örneği ile birlikte CMK 127/3 maddesi gereğince el koyma kararı alınarak laboratuara gönderilmiştir. Olay yerinden elde edildiği belirtilen maket bıçağının namlu kısmı üzerindeki kan lekesine ait genotip bulguların, mağdur şahsın genotip bulguları ile aynı olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuca göre, bıçağın sap kısmı üzerinde şüpheli şahsa ait genotip bulgu elde edebilmek için defaten yapılan analizler sonucunda, elde edilen genotip bulguların laboratuvarımızın Balistik Şubesinin iş kabulünde çalışan bir personel ile uyumlu olduğu, DNA veri arşivinden tespit edilmiştir. Tablo 5.1 ve Şekil 5.1’e mukayeseli olarak bakıldığında; olayda kullanılan bıçağın sap kısmı üzerinden elde edilen bir kısım genotip özelliklerin, kontaminasyonu gerçekleştiren şahsın genotip özellikleri ile aynı olduğu tablo ve elektroforeogram görüntüsünde görülmektedir. _________________________________________________________________ Tablo 5.1 Örnek olgu-1’deki kontaminasyona neden olan personel ve kontamine olan delile ait genotip bulgular LOKUSLAR PERSONEL DELİL D8S1179 10 - 13 10 – 13 – 15 D21S11 30 - 31.2 30 – 31.2 D7S820 8 - 12 8 – 12 CSF1PO 12 - 12 12 – 12 D3S1358 17 - 18 15 - 17 – 18 THO1 7 - 9..3 6 – 7 – 9.3 D13S317 12 - 13 9 – 12 – 13 D16S539 9 - 10 9 – 10 – 11 – 13 D2S1338 17 - 23 17 – 19 – 23 D19S433 15 - 15 13 – 15 – 16 VWA 16 - 18 16 – 17 – 18 – 19 TPOX 10 - 11 8 – 10 – 11 D18S51 13 - 17 12 – 13 – 15 – 17 AMELOGENİN - - D5S818 12 - 12 11 – 12 23 - 24 21 – 23 – 24 FGA ____________________________________________________________________ Olayda kullanılan bıçağın sap kısmı üzerinden elde edilen genotip bulgulara ait elektroforeogram görüntüsü Şekil 5.1’de verildi. Şekil 5.1 Olayda kullanılan bıçağın sap kısmı üzerinden elde edilen genotip bulgulara ait elektroforeogram görüntüsü Örnek Olgu-2 İstanbul Kriminal Polis Laboratuarına incelenmek üzere gönderilen, bıçakla öldürme olayı ile ilgili olarak, olay yerinden transfer edildiği belirtilen 2,3,4,5,6,7a delil numaralı kan lekeleri olay yeri inceleme ekibi tarafından toplanmış, şüpheli iki şahısa ait mukayese kan numunesi CMK’nın 78 ve 79 madde uyarınca moleküler genetik incelemenin yapılmasına izin verir hakim kararı ile birlikte laboratuara gönderilmiştir. Olay yerinden elde edilen 2 delil nolu kan lekesi üzerinden elde edilen genotip bulguların bir kısmının PCR işlemini yürüten personelin genotip bulguları ile uyumlu olduğu DNA veri arşivinden tespit edilmiştir. ____________________________________________________________________ Tablo 5.2 Örnek olgu-2’deki kontaminasyona sebeb olan personel ve kontamine delile ait genotip bulgular LOKUSLAR PERSONEL DELİL D8S1179 12 – 15 10 – 12 – 13 – 15 D21S11 29 – 30 29 – 30 D7S820 9 – 13 9 – 10 – 11 – 13 CSF1PO 10 – 12 10 – 12 – 13 D3S1358 17 – 18 16 – 17 – 18 THO1 6–9 6 – 7 – 9 – 9.3 D13S317 8 – 11 8 – 9 – 11 – 12 D16S539 12 – 12 8 – 12 D2S1338 18 – 19 18 – 19 – 20 – 24 D19S433 12 – 15 12 – 14.2 – 15 – 15.2 VWA 15 – 17 15 – 17 TPOX 9 – 10 8 – 9 – 10 D18S51 12 – 14 12 – 13 – 14 – 15 AMELOGENİN - - D5S818 12 – 13 11 – 12 – 13 FGA 21 – 24 20 – 21 – 22 – 24 ____________________________________________________________________ Olay yerinden transfer edildiği belirtilen kan lekesine ait genotip bulguları gösterir elektroforeogram görüntüsü Şekil 5.2’de verildi. Tablo 5.2 ve Şekil 5.2’ye mukayeseli olarak bakıldığında; olay yerinden transfer edildiği belirtilen kan lekesine ait bir kısım genotip özelliklerin, kontaminasyonu görülmektedir. gerçekleştiren şahsın genotip özellikleri ile aynı olduğu Şekil 5.2 Olay yerinden transfer edildiği belirtilen kan lekesine ait genotip bulguları gösterir elektroforeogram görüntüsü. Örnek olgu-3 İstanbul Kriminal Polis Laboratuarına incelenmek üzere gönderilen, müştekiye ait otomobilin kimliği belirsiz kişi veya kişilerce çalınması ve aracın terk halde bulunması olayı ile ilgili olarak, araçta yapılan incelemede üç adet eldiven, bir adet kar maskesi olay yeri inceleme ekibi tarafından elde edilmiş, CMK 127 madde uyarınca el koyma ve inceleme kararı alınarak laboratuara gönderilmiştir.Söz konusu otodan elde edildiği belirtilen bir adet siyah renkli kar maskesi üzerinden tarafımızca toplanan kepek hücrelerine ait genotip bulguların bir kısmının, kar maskesini inceleyen personelin genotip bulguları ile uyumlu olduğu DNA veri arşivinden tespit edilmiştir. ____________________________________________________________________ Tablo 5.3 Örnek olgu-3’deki personele ait genotip bulgular LOKUSLAR PERSONEL DELİL D8S1179 13 – 13 12 – 13 D21S11 31.2 – 32.2 28 – 29 – 31.2 – 32.2 D7S820 8 – 11 8 – 11 – 12 CSF1PO 12 – 13 11 – 12 – 13 D3S1358 18 – 18 16 – 17 – 18 THO1 6–8 6–8 D13S317 12 – 12 10 – 11 – 12 D16S539 12 – 12 10 – 12 – 13 D2S1338 17 – 21 17 – 19 – 20 – 21 D19S433 12 – 15 12 – 13 – 15 VWA 16 – 18 15 – 16 – 18 – 19 TPOX 8–8 8–9 D18S51 15 – 19 12 – 14 – 15 – 19 AMELOGENİN - - D5S818 11 – 11 11 – 11 FGA 21 – 24 21 – 23 – 24 ____________________________________________________________________ Olay yerinden elde edildiği belirtilen kan maskesinde bulunan kepek numunesine ait genotip bulguları gösterir elektroforeogram görüntüsü Şekil 5.3’de verildi. Tablo 5.3 ve Şekil 5.3’ye mukayeseli olarak bakıldığında; olay yerinden elde edilen kar maskesinde bulunan kepek numunesine ait bir kısım genotip özelliklerin, kontaminasyonu görülmektedir. gerçekleştiren şahsın genotip özellikleri ile aynı olduğu Şekil 5.3 Olay yerinden elde edildiği belirtilen kar maskesinde bulunan kepek numunesine ait genotip bulguları gösterir elektroforeogram görüntüsü Örnek olgu-4 İstanbul Kriminal Polis Laboratuarına incelenmek üzere gönderilen ateşli silahla kavga olayı ile ilgili olarak, olay yerinden, olay yeri inceleme ekibi tarafından usulüne uygun olarak dört adet kan lekesi transfer edilerek laboratuara gönderilmiştir. Yapılan incelemeler sonucunda 1 delil numaralı kan lekesi üzerinden elde edilen genotip bulguların bir kısmının, söz konusu olay ile yakın tarihlerde laboratuara intikal eden başka bir olayın delillerine ait genotip bulgular ile uyumlu olduğu arşiv araştırması sonunda belirlendi. Olay yeri deliline tekrar dönülüp, ikinci kez çalışıldığında ise karışıklığa rastlanmayıp, olaydaki diğer delillere ait genotip bulguları desteleyen genotip özellikler elde edilmiştir. Bu durum bize olaylar arası çapraz kontaminasyon olduğunu göstermektedir. _________________________________________________________________ Tablo 5.4 Örnek olgu-4’te kontaminasyona neden olan bir başka olaya ait genotip bulgular LOKUSLAR İlk Çalışma İkinci Çalışma Kontaminasyon Kaynağı D8S1179 12 – 13 – 14 12 – 13 14 – 14 D21S11 28 – 29 – 30.2 – 31.2 29 – 31.2 28 – 30.2 D7S820 8 – 10 – 11 8 – 11 10 – 11 CSF1PO 10 – 11 – 12 10 – 12 11 – 11 D3S1358 14 – 15 – 16 – 18 15 – 16 14 – 18 THO1 6 – 9 – 9.3 6–9 9 – 9.3 D13S317 11 – 12 – 14 11 – 12 12 – 14 D16S539 9 – 11 – 12 9–9 11 – 12 D2S1338 18 – 19 – 22 18 – 22 18 – 19 D19S433 14 – 15 14 – 14 14 – 15 VWA 13 – 17 – 18 13 – 17 17 – 18 TPOX 8 – 11 8 – 11 11 – 11 D18S51 12 – 16 – 18 12 – 16 12 – 18 AMELOGENİN XX – XY XY XX D5S818 11 – 12 11 – 12 12 – 12 FGA 19 – 21 – 22 21 – 21 19 – 22 Olay yerinden transfer edildiği belirtilen kan lekesine ait genotip bulguları gösterir elektroforeogram görüntüsü Şekil 5.4’te verildi. Tablo 5.4 ve Şekil 5.4’e mukayeseli olarak bakıldığında; olay yerinden transfer edildiği belirtilen kan lekesine ait bir kısım genotip özelliklerin, kontaminasyona neden olan bir başka olaya ait genotip özellikler ile aynı olduğu görülmektedir. Şekil 5.4: Olay yerinden transfer edildiği belirtilen kan lekesine ait genotip bulguları gösterir elektroforeogram görüntüsü 6. TARTIŞMA VE SONUÇ Deliller; olayla ilgili, olayı anlamaya ve çözmeye yarayacak önemli bulgulardır. Bir başka deyişle, adli bir olgunun 3 temel unsuru olan mağdur, şüpheli ve olay yeri arasındaki bağlantı deliller sayesinde kurulur. Çağdaş ceza yargılama sisteminde, suçun ispatı her türlü delil bilimsel yöntemlerle incelendikten sonra yapılmaktadır. Bu nedenle, mahkemelerin verdikleri kararların doğruluğu açısından delillerin güvenilirliğinin büyük önemi vardır. Olay yeri incelemesinden, laboratuvardaki analiz aşamasına kadar, delillerin değerlendirilmesinde yapılacak her türlü hata doğrudan sonucu etkiler. Adli bilimlerde, kesin, doğru ve güvenilir bir ekspertiz raporu verilebilmesi için, etkisi en az olan faktörden, en fazla olan faktöre kadar geniş bir çerçevede düşünerek her aşamada gereken tüm önlemlerin alınması gerekir. Bu faktörlerden en önemlisi kontaminasyondur. Daha öncede tanımlandığı gibi kontaminasyon, farklı bir bireye ait DNA içeren fizyolojik bir materyalin ya da DNA’nın, delile yanlışlıkla bulaşması olarak tanımlanabilir. Kimliklendirme amacı ile biyolojik materyallerden DNA analizinin çok güçlü bir araç olmasından ve PCR işleminin duyarlılığı çok yüksek olduğundan, çok az miktarlarda ve degrede olmuş biyolojik örneklerden DNA profili elde edilebilmektedir. Dolayısıyla delillerin eldesi, toplanması ve taşınması yanında analiz aşamasında da kontaminasyonun engellenmesi gerekmektedir. Analiz aşamasındaki en büyük tehlikelerden biri, personele ait DNA kalıntılarının delile bulaşması ve doğru olmayan DNA profilinin elde edilmesidir. Bunu engellemek için delil ile teması olan tüm personelin genotipi belirlenmeli ve laboratuvar çalışanları databazı oluşturulmalıdır. Bu çalışmanın amacı, personelin kendi DNA’sı ile biyolojik delilleri kontaminasyona uğratma ve olaylar arası çapraz kontaminasyon oluşturma risklerinin belirlenip, önleme yöntemlerinin araştırılmasıdır. Bu sayede bundan sonraki çalışmalarda oluşabilecek laboratuvar kaynaklı kontaminasyonun tespiti ve önlenmesi sağlanmış olacaktır. Yapılan çalışmada aşağıdaki bulgular elde edilmiştir; Tablo 4.2’de, çalışılan toplam numune sayısının, kontamine olabileceği düşünülen numune sayısına oranının yıllara göre dağılımı gösterilmiş ve 2005 yılında % 1,25, 2006 yılında % 1,42 ve 2007 yılının ilk 6 ayında %1,28 oranında olduğu saptanmıştır. 2007 yılının ikinci altı aylık periodu da düşünülecek olursa, tüm yılda kontaminasyon oranının yaklaşık %2.5 olacağı tahmin edilmektedir. Tablo 4.3’de, 671 kontamine olabileceği düşünülen numunenin yıllara göre dağılıma bakıldığında,. 2005 yılında 225 adet (%33.5), 2006 yılında 289 adet (%43.1), 2007 yılının ilk 6 ayında 157 adet (%23.4) olduğu görülmüştür. Tablo 4.2 ve Tablo 4.3’deki sonuçlara göre kontaminasyon oranı yıllara göre giderek artmaktadır. Bu artışın nedenlerinin; yıllara göre artan iş yükü, personel sayısının yetersizliği, hizmet içi eğitimin gerekli düzeyde olmaması, laboratuvarın alt yapısından kaynaklanan optimal çalışma alanlarının sağlanamaması, A.B.D ve Avrupa Birliği tarafından kabul görmüş kalite kontrol organizasyonlarının şartlarına sahip laboratuvar akreditasyonunun sağlanamaması ve uygun kalite kontrol politikalarının izlenmemesi olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, DNA tiplemesi, çok basamaklı bir teknik işlem olmasından dolayı, her basamakta sonuçları doğru bir şekilde elde edecek ve yorumlayabilecek, kalifiye ve iyi yetişmiş teknik personel varlığını gerektirmektedir. Atasoy’ un makalesinde belirttiği gibi laboratuarın kalite güvencesi ancak akreditasyon ve dış kalite kontrolu ile sağlanabilir. Çalışan personelin bağımsız bir organ tarfından sertifikalandırılması şarttır[11]. Tablo 4.4’de toplam kontaminasyon sayısının numune türüne göre dağılımı gösterilmiş ve en fazla kontaminasyonun tükürük ve ter numunelerinde en az kontaminasyonun ise meni numunelerinde izlendiği tespit edilmiştir. Tükürük ve ter numunelerinin diğer numune türlerine göre daha fazla oranda kontamine edilmesinin nedeni, ter ve tükürüğün en fazla kontamine olma potansiyeline sahip numune türü olmasına bağlanabilir. Numuneler üzerindeki kan lekelerini renkten dolayı fark etmek çoğu zaman mümkünken, ter ve tükürükte ise zordur. Bu nedenle deliller toplandığı sırada ya da laboratuvarda inceleme aşamasında, delil üzerine doğru öksürülür ya da aksırılırsa, ayrıca kişi elini ağzına ya da burnuna götürdükten sonra veya eldiven kullanmadan delile dokunursa bu kontaminasyon gerçekleşir. Tablo 4.5’te kontaminasyon kaynakları ve yıllara göre dağılımı incelenmiştir. Çalışılan numunelerdeki toplam 671 kontaminasyonun kaynakları incelendiğinde, laboratuvar çalışanı (kişinin kendi genomu) kaynaklı 17 (% 2,5) adet, olaylar arası çapraz kontaminasyon (OAÇK) kaynaklı 20 (% 3) adet ve kaynağı belli olmayan 634 (% 94,5) adet kontaminasyon olduğu saptandı. Buna göre, 2005 yılında 225 kontaminasyonun 3 tanesi (% 1,3) laboratuvar çalışanı, 7 tanesi (% 3,1) olaylar arası çapraz kontaminasyon kaynaklı, 215 tanesi (% 95,6) kaynağı belli olmayan kontaminasyon olduğu, 2006 yılına ait 289 kontaminasyonun 8 tanesi (% 2,8) laboratuvar çalışanı, 3 tanesi (% 1) olaylar arası çapraz kontaminasyon kaynaklı, 278 tanesi (%96,2) kaynağı belli olmayan kontaminasyon olduğu, 2007 yılının ilk 6 ayında 157 kontaminasyonun 6 tanesi (%3,8) laboratuvar çalışanı, 10 tanesinin (% 6,4) olaylar arası çapraz kontaminasyon kaynaklı, 141 tanesinin (% 89,8) kaynağı belli olmayan kontaminasyon olduğu saptandı. Laboratuvar çalışanı kaynaklı kontaminasyonun oranı yıllara göre giderek artmaktadır (%1,3 %2,8 %3,8). Bu durumu engellemek için, öncelikle, analiz aşamasında tüm laboratuvar çalışanları, mutlaka uygun kıyafetler giymeli, eldiven, maske ve bone takmalıdır. Örnek olgu1’de görüldüğü üzere, kriminal laboratuvarına gelen delillerin biyoloji şubesi ile birlikte, balistik, kimya, belge ve iz inceleme gibi farklı şubelerce de değerlendirilmesi gerekliliği varsa, öncelik biyoloji şubesine tanınmalı ve bu sayede, delillerin diğer şube çalışanları tarafından kontamine edilme olasılığı ortadan kaldırılmalıdır. Ayrıca, bir olayla ilgili delillerin, analizin ilk aşamasından sonlandırılmasına kadar tüm işlemlerin (ön inceleme ile numune alma, DNA izolasyonu, ve PCR) her aşamasında, mümkünse, aynı personel tarafından çalışılması sağlanmalıdır. Örnek olgu-2’ye bakıldıgında; söz konusu olaydaki kontaminasyon, ön inceleme ve izolasyon aşamalarını yürüten kişilerden farklı olarak, PCR işlemlerinden sorumlu personel tarafından gerçekleştirilmiştir. Örnek olgu-4’de görüldüğü üzere olaylar arası çapraz kontaminasyon içeren numunelerden elde edilen karışım genotip bulgular, laboratuvarın DNA veri arşivindeki kayıtlarla mukayese edildiğinde, farklı olayların numuneleri ile uyum sağladığı görülmüştür. Ayrıca, delilin aynı bölgesinden tekrar örnek alındığında, sonuç ilk çalışmadan farklı olmuş; söz konusu delil üzerinde karışım genotip özelliğine rastlanmamış olduğundan olaylar arası çapraz kontaminasyon olduğu kanaatine varılmıştır. Tablo 4.6’te, olaylar arası çapraz kontaminasyonun laboratuvarda yürütülen analizler aşamasında, laboratuvar çalışanları tarafından oluşturulduğu düşünülerek, tüm kontaminasyonlar, kaynağı bilinen ve kaynağı belli olmayan şekilde iki temel gruba ayrıldı. Numune türlerinin, bu iki temel kontaminasyon kaynağı ayırımına göre dağılımı ise şöyledir; 115 kan kontaminasyonun 12 tanesi (% 10,4) kaynağı belli , 103 tanesinin (% 89,6) kaynağı belli değildir. 254 tükürük kontaminasyonunun 11 tanesi (% 4,3) kaynağı belli, 243 tanesinin (% 95,7) kaynağı belli değildir. 241 ter kontaminasyonunun 7 tanesi (% 2,9) kaynağı belli, 234 tanesinin (% 97,1) kaynağı belli değildir. 52 kepek kontaminasyonun 7 tanesi (% 13,5) kaynağı belli, 45 tanesinin (% 86,5) kaynağı belli değildir. Meni lekelerinin analizinde 9 kontaminasyon rastlanmıştır ve hepsinin de kaynağı belli değildir. Tablo 4.5 ve 4.6’da görüldüğü üzere, kaynağı belli olmayan kontaminasyonun yıllara ve numune türüne göre oranının, kaynağı bilinen kontaminasyon oranına göre çok daha fazla olduğu anlaşılmaktadır. Kaynağı belli olmayan kontaminasyonun sebeplerinin ortaya çıkartılıp oranının azaltılması açısından, ilk olarak olay yeri inceleme ekibinde görev alan emniyet personelinin DNA profilleri çıkarılıp, DNA veri arşivine eklenmelidir. Howitt ve arkadaşlarına göre de, delilden elde edilen DNA profilinin olay ile ilgili mi yoksa personel kaynaklı mı olduğunun ayrımında DNA veri bankasında, personel DNA veri arşivinin oluşturulmasının önemi belirtilmiştir[44;45]. Ayrıca, adli bilimlerin olay yerinden başladığını düşünürsek, kontaminasyonu önlemek için, biyolojik delillerin toplanması sırasında bazı hususlara dikkat edilmesi gerekmektedir[8-10]. İlk olarak, her delile özgü ayrı eldiven, makas ve pens gibi aletler kullanılmalıdır. Bone ve özel giysiler kontaminasyonu engellemede etkindir. Deliller toplanırken aksırıp öksürme veya konuşma nedeni ile meydana gelebilecek kontaminasyonu etkili bir şekilde önleyebilmek için mutlaka maske takılmalıdır. Deliller toplanırken el ağıza, buruna götürülmemeli, hiçbir şey yiyip içilmemelidir. Deliller ayrı ayrı toplanmalı ve uygun şekilde paket edilip laboratuvara gönderilmelidir. Paketin üstüne, delilin nereden ve kimden alındığı kaydedilmelidir. Olay yerinden toplanan örnekler ile mağdur ve sanığa ait örnekler ayrı ayrı paketlenmeli ve birbiri ile teması önlenmelidir. Cinayet olaylarında maktulün defin işlemi gerçekleşmeden mukayese kan, kıl ya da doku örnekleri temin edilmelidir. Kişiye kan nakli yapılmış ise laboratuvar bilgilendirilmeli ve hastaneden nakledilen kanın özellikleri belirlenmelidir. Her türlü delil için karşılaştırma örneği olarak sanık ya da mağdurdan kan ya da buccal swab (yanak içi sürüntü), bunların alınamadığı durumlarda kılıflı saç örneği alınıp laboratuvara gönderilmelidir. Bu konularda olay yeri inceleme ekibine gerekli eğitim verilmelidir. Poy ve arkadaşları[71] yaptıkları bir çalışmada, laboratuvarda buzdolabı, analiz cihazların kapak ve düğmeleri, bilgisayar ve klavye tuşları, UV ışık kaynağı gibi cihazların yüzeylerinde temas sıklığına bağlı olarak zaman içerisinde DNA içeren materyallerin birikmesine ve dolayısıyla kaynağı belli olmayan kontaminasyona neden olduğunu göstermişlerdir. Bu araştırmada, ışık kaynağından alınan swaptan elde edilen DNA profilinin laboratuvar data bazına girildiğinde, üç ay önce delil olarak incelenen bir ceketten elde edilen DNA profili ile aynı olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuç, laboratuvarda tezgah, cihaz v.b. yüzeylerin düzenli olarak belirli aralıklarla temizliğinin sağlanmasının, kontaminasyonun önlenmesi açısından ne denli önemli olduğunu göstermektedir. Kullanılan sarf malzemelerinin de kaynağı belli olmayan kontaminasyona neden olduğu gösterilmiştir. Howitt ve arkadaşlarına göre[44] PCR işleminde kullanılan tüplerin neden olduğu kontaminasyon (sporadik kontaminasyon) karşılaşılan bir diğer sorundur. ‘Forensic Science Service’ (FSS) , son zamanlarda DNA testinde kullanılan sarf malzemelerinden kaynaklananan kontaminasyonu rapor etmiştir. Ayrıca, amplifikasyonun gerçekleştirildiği PCR tüplerinin, DNA kontaminasyonuna neden olabileceği gösterilmiştir. 3 yıllık periyotta çalışılan, 1 milyondan fazla örneğin 11’inde, kullanılan sarf malzemesine bağlı kontaminasyon olduğu FSS tarafından rapor edilmiştir. Kontaminasyonun varlığı kullanılan PCR tüplerine negatif kontrol ve kalite kontrol testleri yapılarak tespit edilmiştir. Tüp üreticisi firmanın 300 çalışanının DNA profili incelenmiş ve bu yolla 11 olgunun 10’unda, kontaminasyonun kaynağının çalışanlar olduğu tespit edilmiştir[44]. Üretici firma ile yapılan görüşmeler sonucu kontaminasyonu engelleyici yeni önlemlerin alınması sağlanmış ve bu sayede firma çalışanlarının neden olduğu kontaminasyon olaylarının sayısı belirgin olarak azaltılmıştır. Ayrıca, PCR öncesi ve sonrası örneklerin çalışıldığı alanlar birbirlerinden ayrı tutulmalı ve PCR amplifikasyon reaksiyonu için ayrı bir mekan ya da çalışma kabini dizayn edilmelidir. PCR için kullanılan ekipmanlar ve solusyonlar, diğer laboratuvar malzemelerinden, özellikle de PCR sonrası analizlerde kullanılan ekipman ya da solusyonlardan ayrı tutulmalıdır. Kullanılan pipet uçları filtreli olmalı ve her kullanımdan önce değiştirilmelidir. PCR işleminin gerçekleştirildiği mekanlar kullanılmadıkları zamanlarda ultraviyole ışığa maruz bırakılmalı ve isopropanol, zefirol, %5’lik çamaşır suyu vb. ile temizlenmelidir. Bu sayede yabancı DNA artıkları yok edilebilir [72;73]. DNA izolasyonundan başlayarak PCR işlemine kadar tüm aşamalarda kullanılan tüplerin ve kimyasal malzemelerin test edilmesi amacı ile negatif kontroller kullanılmalıdır. PCR aşamasındaki negatif kontrol, DNA dışında PCR için gerekli tüm malzemeyi içeren karışımın bulunduğu çalışma anlamına gelmektedir. DNA yerine aynı miktarda saf su konulmalıdır. Eğer PCR sonunda negatif kontrolde herhangi bir DNA profiline rastlanırsa, çalışmada bir kontaminasyon sorunu yaşandığı sonucuna varılır. Bu durumda mutlaka kontaminasyonun kaynağı tespit edilmeli ve mümkünse kontaminasyon elimine edilmelidir. Meni kontaminasyonunun, kaynağı belli olmayan gurupta yer almasının nedeni ise, delilin olay yerinde DNA içeren farklı materyallerle teması ya da uzun süre beklemesine bağlı olarak gerçekleşmiş olabilir[36]. Tablo 4.7’de, kaynağı bilinen kontaminasyon oranları açısından numune türleri arasında fark olup olmadığına bakıldığında; kanın-tükrüğe, kanın-tere, kepeğin-tükrüğe, kepeğin-tere göre p<0.05 olduğu görüldü. Sonuç olarak kan ve kepeğin, kaynağı bilinen etkenler tarafından diğer numune türlerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde daha fazla kontamine edildiği saptandı. Kan ve kepek arasında ise kaynağı bilinen etkenlerin kontaminasyonu açısından istatistiksel anlamlı fark saptanmadı (ki-kare test : p>0.05). Tablo 4.8’de, toplam 12 kaynağı bilinen kan kontaminasyonun kendi içinde dağılımına bakıldığında, 3 tanesinin laboratuvar çalışanı kaynaklı olduğu, 9 tanesinin diğer olay kaynaklı olduğu görüldü. Kepek numunelerinde ise; toplam 7 kaynağı bilinen kepek kontaminasyonunun 6 tanesinin laboratuvar çalışanı kaynaklı olduğu, 1 tanesinin diğer olay kaynaklı olduğu görüldü. Sonuç olarak kan numunelerinin kontaminasyonunda, olaylar arası çapraz kontaminasyon daha ön planda iken, kepek numunelerinin kontaminasyonunda ise laboratuvar çalışanlarının ön planda sorumlu olduğu belirlenmiştir. Poy ve arkadaşları[71] yaptıkları çalışmada; kontaminasyonun azaltılması açısından, delile direkt temas eden ve yüksek risk grubu olarak tanımlanan; makas, pens ve çalışma tezgahlarının sterilizasyon şartlarını sağlaması gerektiğini belirtmiştir. Ayrıca kullanılan eldivenlerin düzenli olarak değiştirilmesini, bu konunun özellikle eser miktarda DNA içeren delillerle çalışılırken daha fazla önem kazandığına dikkat çekmiştir. Bu araştırmada, Tablo 4.7 ve 4.8’deki sonuçlarda, kan numunelerinin çalışılması sırasında ön planda olan olaylar arası çapraz kontaminasyonun önlenmesi açısından, kullanılan eldiven, makas, pens gibi aletlerin steril ve numuneye özgü olması, işlemlerin yapıldığı tezgah üzerlerinin uygun bir şekilde temizlenmesi ve numune altı kağıtlarının aynı olaya ait farklı delillerin incelenmesi esnasında bile düzenli olarak değiştirilmesi gerektiğini göstermektedir. Şapka ve bere gibi materyallerden kepek toplama işlemi sırasında poşet içerisinden çıkartılan delil, siyah bir zemin üzerine konup, iyice silkelendikten sonra mikroskop altında kepekler toplanır. Yapılan bu çalışmada, kepek numunelerinin kontaminasyonunda laboratuvar çalışanları (kişinin kendi genomu) ön planda sorumlu bulunmuştur. Örnek olgu-3’de görüldüğü üzere, kepek kontaminasyonunu engellemek için laboratuvar çalışanı işlem sırasında mutlak suretle bone kullanmalıdır. Ayrıca, delildeki kepekleri toplayan laboratuvar personeli, izole bir yerde ve diğer kişilerin neden olabileceği kontaminasyonu engelleyecek şartlarda bu işlemi yapmalıdır. Torres ve arkadaşlarına göre[74] karışım genotipler iki şekilde meydana gelebilir. Birincisi, karışımdan, olayla ilgisi olan en az iki kişinin sorumlu olabileceği ve karışımın suçun işlenmesinden önce ya da suçun işlenmesi sırasında oluşmuş olabileceği, ikincisi ise, karışımın, delillerin toplanması ya da laboratuvarda çalışılması sırasında meydana gelmiş olabileceğidir. Bu noktada, karışım örnek ve kontamine olmuş örneği birbirinden ayırmak önemlidir. Pek çok karışım genotip, laboratuvarda çözüme ulaşmasına rağmen, nadirende olsa yorumlanması pek çok faktöre bağlı olarak komplike olabilir ve olayın çözümünde önemli hale gelebilir. Karışım genotipler değerlendirilirken; bir lokusda görülen alel sayısı, heterozigot pik oranlarındaki dengesizlik ve artefakt piklere dikkat edilmelidir. Kontaminasyonun belirlenmesinde ise DNA veri arşivinin ve uzman görüşünün büyük önemi vardır. İstanbul Emniyet Müdürlürlüğü Kriminal Laboratuvarında çalışan uzman personel de karışım genotiplerinin değerlendirilmesinde büyük hassasiyet ve özen göstermektedir. Bu sayede, kontaminasyon olabileceği düşünülen tüm genotip bulguların rapor edilmesi önlenmiştir. Bu araştırmanın sonuçları kaynağı bilinen ve kaynağı bilinmeyen kontaminasyonlar şeklinde iki bölümde değerlendirildiğinde: A) Kaynağı bilinen kontaminasyonlar incelemeyi yapan kuruluşlar tarafından alınacak önlemler ile büyük oranda önlenebilir veya kontaminasyon kaynağı belirlenerek tekrarlanmaması için gerekli önlemlerin alınması sağlanabilir. Bu önlemler aşağıda maddeler halinde sıralanmıştır. 1) Uluslararası geçerliliğe sahip akreditasyon sağlanmalıdır. 2) Gerekli kalite kontrol ve kalite güvencesi protokolleri belirlenmelidir. 3) Laboratuvar, DNA çalışmaları için gerekli teknik altyapıya sahip olmalıdır. 4) Laboratuvar personeli için hizmet içi eğitim programları oluşturulmalıdır.. 5) Tüm laboratuvar personelinin DNA veri arşivi oluşturulmalıdir. 6) Çapraz kontaminasyonun belirlenebilmesi için tüm numunelere ait DNA veri arşivi oluşturulmalı ve sonuçlar rapor edilmeden önce karşılaştırma yapılmalıdır. 7) Laboratuvar çalışmalarının tüm aşamalarında negatif kontroller kullanılmalıdır. 8) Laboratuvar personelinin örnekler ile direkt temasının azaltılmasını sağlamak için otomatik robotik sistemler kullanılmalıdır. B) Kaynağı bilinmeyen kontaminasyonların kaynağı bilinenlerden çok daha fazla olması oldukça dikkat çekicidir. Bu tür kontaminasyonun bir bölümü çevresel şartlar nedeniyle olay yeri ekibinin inceleme yapmasından önce, bir bölümünün ise olay yeri incelemesi ve delil transfer zinciri esnasında gerçekleşmiş olabilir. Olay yeri incelemesi ve delil teslim zinciri aşamalarının bu konuda özel eğitim almış uzman kişilerce, usulune uygun yapılması ve olay yeri inceleme personelinin DNA veri arşivinin oluşturulması, bu bölümdeki kontaminasyonun önlenmesinde etkili olacaktır. KAYNAKLAR (1) James H.H, Nordby J.J. An introduction to scientific and investigative tecniques. CRC press, Florida: 2003: 115-134. (2) Saferstein R. Criminalistics: An introduction to forensic science, 8th edition. Pearson Prentice Hall, New Jersey: 2004: 34-50. (3) Atasoy S. DNA delilleri hakkında her polisin bilmesi gerekenler. Suç ve Delil 2000; 1(1): 1-5. (4) Kalfaoğlu E.A, Yükseloğlu H. Insan Genomu, Suç ve Suçun Önlenmesi. DEU Tip Fakültesi Dergisi, 2002; 71-81. (5) Henry C.L, Howard AH. Physical evidence in forensic science. Lawyers&Judges Publishing Co.İnc, Tucson: 2000: 3-15. (6) Weedn VW. Forensic DNA tests. Clin Lab Med 1996; 16(1): 187-196. (7) SweettHaven Publishing Services. Crime Scene İnvestigation. 2006. Ref Type: Internet Communication (8) Fisher B.A.J. Technques of crime scene Investigation, 7th edition. CRC Press LLC, Florida: 2003. (9) Schiro G. Collection and Preservation of Blood Evidence from Crime Scenes. 15-1-2008. Ref Type: Internet Communication (10) Schiro G. Colection and Preservation of Evidence. 15-1-2008. Ref Type: Internet Communication (11) Atasoy S. DNA idantifikasyonu ve Etik. Suç ve Delil 2000; 1(5):1-9. (12) Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature 1985; 314(6006): 67-73. (13) Edwards A, Civitello A, Hammond HA, Caskey CT. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am J Hum Genet 1991; 49(4): 746-756. (14) Wallin JM, Holt CL, Lazaruk KD, Nguyen TH, Walsh PS. Constructing universal multiplex PCR systems for comparative genotyping. J Forensic Sci 2002; 47(1): 52-65. (15) Altunçul H. Kemik Dokudan DNA Çekitleme ve Tipleme Yöntemleri. T.C. İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü Fen Bilimleri Anabilim Dalı. 2001. (16) Çümen Y. 2004-2005 yıllarında İstanbul Kriminal Polis Laboratuvarına İntikal Eden Hırszılık, Adam Öldürme, Yaralama Olaylarının Geriye Dönük İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü Fen Bilimleri Enstitüsü, İstanbul. 2007. (17) NIJ(2000). Crime Scene Investigation: A Guide for law Enforcement. Htpp://www.ncjrs.gov/pdffiles1/nij/178280.pdf. 17-1-2008. Ref Type: Internet Communication (18) Saferstein R. Criminalistics An Intoroduction to Forensic Science Prentice Hall upper Saddle River NJ. 07458 USA 1998; 402-420. (19) Wyman AR, White R. A highly polymorphic locus in human DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1980; 77(11): 6754-6758. (20) Yavuz İ. Türk Populasyonunda 15 farklı Dörtlü tekrarlayan Dizi Lokusunun (STR) Alel Frekans dağılımının Araştırılması.Yüksek Lisans Tezi, İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Istanbul. 2003. (21) Urquhart A, Kimpton CP, Gill P. Sequence variability of the tetranucleotide repeat of the human beta-actin related pseudogene Hbeta-Ac-psi-2 (ACTBP2) locus. Hum Genet 1993; 92(6): 637-638. (22) Deforce DL, Millecamps RE, Van Hoofstat D, Van den Eeckhout EG. Comparison of slab gel electrophoresis and capillary electrophoresis for the detection of the fluorescently labeled polymerase chain reaction products of short tandem repeat fragments. J Chromatogr A 1998; 806(1): 149-155. (23) Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet 2004; 5(6): 435-445. (24) Chakraborty R, Stivers DN, Su B, Zhong Y, Budowle B. The utility of short tandem repeat loci beyond human identification: implications for development of new DNA typing systems. Electrophoresis 1999; 20(8): 1682-1696. (25) Carey L, Mitnik L. Trends in DNA forensic analysis. Electrophoresis 2002; 23(10): 1386-1397. (26) Martin PD, Schmitter H, Schneider PM. A brief history of the formation of DNA databases in forensic science within Europe. Forensic Sci Int 2001; 119(2): 225-231. (27) Mullis KB. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Clin (Paris) 1990; 48(8): 579-582. (28) Schumm J.W. New Approches to DNA Fingerprint Analysis. Promega Notes Magazine 58, 12. 1996. Ref Type: Magazine Article (29) Krenke BE, Tereba A, Anderson SJ, Buel E, Culhane S, Finis CJ, Tomsey CS, Zachetti JM, Masibay A, Rabbach DR, Amiott EA, Sprecher CJ. Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J Forensic Sci 2002; 47(4): 773-785. (30) Gill P, Whitaker J, Flaxman C, Brown N, Buckleton J. An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA. Forensic Sci Int 2000; 112(1): 17-40. (31) Sjerps M, van der GN, Pieron C, Gajadhar M, Kloosterman A. A Dutch population study of the STR Loci HUMTHO1, HUMFES/FPS, HUMVWA31/1 and HUMF13A1, conducted for forensic purposes. Int J Legal Med 1995; 108(3): 127-134. (32) Bruford MW, Wayne RK. Microsatellites and their application to population genetic studies. Curr Opin Genet Dev 1993; 3(6): 939-943. (33) Lareu MV, Pestoni C, Schurenkamp M, Rand S, Brinkmann B, Carracedo A. A highly variable STR at the D12S391 locus. Int J Legal Med 1996; 109(3): 134-138. (34) Kimpton C, Fisher D, Watson S, Adams M, Urquhart A, Lygo J, Gill P. Evaluation of an automated DNA profiling system employing multiplex amplification of four tetrameric STR loci. Int J Legal Med 1994; 106(6): 302-311. (35) Applied Biosystems. AmpFISTR Identifiler PCR Amplifıcation Kit, User'sManual. 2001. Ref Type: Catalog (36) Rudin N, Inman K. Interpretation of DNA Typing Results. Forensic DNA Analysis. 2002: 97-131. (37) Applied Biosystems. AmpFISTR Identifiler PCR Amplifıcation Kit, User'sManual. 2001. Ref Type: Catalog (38) Filoğlu G. 7 Tetramerik STR Lokusunun Kriminal İdantifikasyondaki Önemi. İsatnbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü Fen Bilimleri Anabilim Dalı. Doktara Tezi. 1999. (39) Moretti TR, Baumstark AL, Defenbaugh DA, Keys KM, Smerick JB, Budowle B. Validation of short tandem repeats (STRs) for forensic usage: performance testing of fluorescent multiplex STR systems and analysis of authentic and simulated forensic samples. J Forensic Sci 2001; 46(3): 647-660. (40) Capelli C, Tschentscher F, Pascali VL. "Ancient" protocols for the crime scene? Similarities and differences between forensic genetics and ancient DNA analysis. Forensic Sci Int 2003; 131(1): 59-64. (41) Bender K, Farfan MJ, Schneider PM. Preparation of degraded human DNA under controlled conditions. Forensic Sci Int 2004; 139(2-3): 135140. (42) Lygo JE, Johnson PE, Holdaway DJ, Woodroffe S, Whitaker JP, Clayton TM, Kimpton CP, Gill P. The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework. Int J Legal Med 1994; 107(2): 77-89. (43) Scherczinger CA, Ladd C, Bourke MT, Adamowicz MS, Johannes PM, Scherczinger R, Beesley T, Lee HC. A systematic analysis of PCR contamination. J Forensic Sci 1999; 44(5): 1042-1045. (44) Howitt T, Johnson P, Cartton L, Rowlands D, Sullivan K. Prooceeding of the 14. İnternational syphosium on human identification. Madison, Wisconsin: Promega Corpation. Availabele at : http://www.promega.com/geneticidprooc/ussymp14proc/oralpresentati ons/howitt.pdf. 2003. Ref Type: Internet Communication (45) Butler J.M. Forensic Issues: Degrade DNA, PCR Inhibition, Cobtamination, Mixed Samples and Low Copy Number. 2005: 145-179. (46) Gill P, Kirkham A. Development of a simulation model to assess the impact of contamination in casework using STRs. J Forensic Sci 2004; 49(3): 485-491. (47) Curran JM, Triggs CM, Buckleton J, Weir BS. Interpreting DNA mixtures in structured populations. J Forensic Sci 1999; 44(5): 987-995. (48) Proceending from the sixth international syposium on human indentification, Madison, Wisconsion: Promega Corporation: 1995. (49) AmpFISTR Profiler Plus PCR Amplifıcation Kit, User'sManual: 1998. (50) Frank WE, Llewellyn BE, Fish PA, Riech AK, Marcacci TL, Gandor DW, Parker D, Carter RR, Thibault SM. Validation of the AmpFlSTR Profiler Plus PCR amplification kit for use in forensic casework. J Forensic Sci 2001; 46(3): 642-646. (51) Moretti TR, Baumstark AL, Defenbaugh DA, Keys KM, Brown AL, Budowle B. Validation of STR typing by capillary electrophoresis. J Forensic Sci 2001; 46(3): 661-676. (52) Butler J.M. Biology of STRs: Stutter Producs, Non-Template Addition, Microvariant, Null Alleles and Mutation Rates. Forensic DNA Typing. 2005. (53) Nock T, Dove J, McCord B, Mao D. Temperature and pH studies of short tandem repeat systems using capillary electrophoresis at elevated pH. Electrophoresis 2001; 22(4): 755-762. (54) Ruitberg CM, Reeder DJ, Butler JM. STRBase: a short tandem repeat DNA database for the human identity testing community. Nucleic Acids Res 2001; 29(1): 320-322. (55) Butler J.M. STR Genotyping Issues. Forensic DNA Typing. 2005: 373386. (56) Gill P, Sparkes R, Pinchin R, Clayton T, Whitaker J, Buckleton J. Interpreting simple STR mixtures using allele peak areas. Forensic Sci Int 1998; 91(1): 41-53. (57) Gill P, Sparkes R, Kimpton C. Development of guidelines to designate alleles using an STR multiplex system. Forensic Sci Int 1997; 89(3): 185-197. (58) Butler J.M. DNA advisory board quality assurance standards. Appendix 4. 2005: 593-611. (59) American Society of Crime Laboratory Directors / Laboratory Accreditation Board. http://www.ascld-lab.org/. 24-1-2008. Ref Type: Internet Communication (60) National Forensic Science Technology Center. http://www.nfstc.org/. 24-1-2008. Ref Type: Internet Communication (61) American Association of Blood Banks.http://www.aabb.org. 24-1-2008. Ref Type: Internet Communication (62) College of American Pathologists - CAP Home. http://www.cap.org/apps/cap.portal. 24-1-2008. Ref Type: Internet Communication (63) Orchid Cellmark. http://www.orchidcellmark.com/. 24-1-2008. Ref Type: Internet Communication (64) Butler J.M. Laboratory Validation. Forensic DNA Typing. 2005: 389412. (65) Bar W, Brinkmann B, Budowle B, Carracedo A, Gill P, Lincoln P, Mayr W, Olaisen B. DNA recommendations. Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems. International Society for Forensic Haemogenetics. Int J Legal Med 1997; 110(4): 175-176. (66) Carracedo A, Bar W, Lincoln P, Mayr W, Morling N, Olaisen B, Schneider P, Budowle B, Brinkmann B, Gill P, Holland M, Tully G, Wilson M. DNA commission of the international society for forensic genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing. Forensic Sci Int 2000; 110(2): 79-85. (67) Gill P, Brenner C, Brinkmann B, Budowle B, Carracedo A, Jobling MA, de Knijff P, Kayser M, Krawczak M, Mayr WR, Morling N, Olaisen B, Pascali V, Prinz M, Roewer L, Schneider PM, Sajantila A, Tyler-Smith C. DNA commission of the International Society of Forensic Genetics: recommendations on forensic analysis using Ychromosome STRs. Int J Legal Med 2001; 114(6): 305-309. (68) TWGDAM. Crime Laboratory Digest. 22, 21-43. 1995. Ref Type: Report (69) Butler J.M. Combined DNA İndex System (CODİS) and The Use of DNA Databases. Forensic DNA Typing. 2005: 435-452. (70) DNA Verileri ve Milli DNA Veri Bankası Kanunu Tasarısı. http://www.kgm.adalet.gov.tr/dna.htm. 24-1-2008. Ref Type: Internet Communication (71) Poy A, R.A.H.van Oorschot. Beware; gloves and equipment used during the examination of exhibits are potential vectors for transfer of DNA- containing material. international Coungress Series 2006; 1228: 556-558. (72) Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature 1989; 339(6221): 237-238. (73) Prince AM, Andrus L. PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques 1992; 12(3): 358-360. (74) Torres Y, Flores I, Prieto V, Lopez-Soto M, Farfan MJ, Carracedo A, Sanz P. DNA mixtures in forensic casework: a 4-year retrospective study. Forensic Sci Int 2003; 134(2-3): 180-186. EK-1: ÇEKİTLEME YÖNTEMİ QIAGEN Mini Kit ile Ağız İçi Epitel Sürüntüsünden DNA Çekitlemesi 1- 1.5ml’lik bir tüpe sürüntü (swab) örneği ile 400 mikrolitre PBS eklenir. Kısa bir vortekste yapılır, sonra kısa santrifüj yapılır. 2- Üzerlerine 20 mikrolitte Proteinaz K eklenir. Kısa bir vorteks yapılır. 3- 56 oC su banyosunda 10 dakika bekletilir. Kısa bir santrifüj yapılır. 4- Buffer AL’den 400 mikrolitre eklenir. Hızlı vorteks ve kısa bir santrifüj yapılır. 5- Etanolden (%96-100) 400 mikrolitre eklenir. Kısa bir vorteks ve santrifüj yapılır. 6- Karışım dikkatlice QIAamp Spin Kolon'a kolonların kapakları ıslatılmadan aktarılır. 7- 8000 rpm de 1 dakika santrifüj yapılır ve kolonlar yeni toplama kaplarına yerleştirilir. 8- Kolonların kapakları ıslatılmadan 500 mikrolitre buffer AW1 eklenir ve 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj yapılır ve yeni toplama kaplarına yerleştirilir. 9- Kolonların kapakları ıslatılmadan 500 mikrolitre buffer AW2 eklenir. 14000 rpm’de 3 dakika santrifüj yapılır. . . 10- Kolonlar, önceden hazırlanarak üzerlerine numaraları yazılmış eppendorf tüplerin içerisine yerleştirilir. 11- Kolonların içine 200 mikrolitre buffer AE eklenir, 5 dakika oda sıcaklığında bekletilir ve 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edilir. Kolonlar eppendorf tüplerden çıkarılarak atılır. Böylece izolasyon aşaması tamamlanır. PCR YÖNTEMİ Bu çalışmada, hedef bölgelerin çoğaltılması için Applied Biosystems tarafından üretilen ve standardize edilerek kullanıma sunulan Multiplex AmpF/STR Identifıler PCR Amplifıkasyon kiti ve Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystem amplifikasyon cihazı kullanıldı. PCR Karışımının Hazırlanması Amplifiye edilecek örneklerle birlikte, biri pozitif diğeri negatif iki kontrol örnek de göz önüne alınarak, PCR karışımı şu şekilde hazırlandı: 1. PCR Reaksiyon karışımı, Primer Seti ve Taq Gold DNA Polimeraz 5'er saniye vortekslendi. 2. Kapakta kalabilecek miktarları indirmek için, tüpler kısaca santrifüjlendi. 3. Steril bir ependorf içine; Örnek sayısı x 5.5µ l PCR Reaksiyon Karışımı Örnek sayısı x 2.75µ l primer seti Örnek sayısı x 0.25uL Taq Gold DNA Polimeraz (5U/µ l) konuldu. 4. Karışım orta hızda 5 saniye vortekslendi. 5. Her bir tüpe karışımdan 8.5µ l dağıtıldı. 6. Üzerlerine 5µl örnek DNA eklendi. Pozitif kontrol için (kit içindeki Kontrol DNA 9947A ), negatif kontrol (TE tamponu) kullanıldı. PCR Döngü Parametreleri PCR döngü parametreleri şu şekilde ayarlandı: - 95°C 11 dakika çift sarmal DNA’nın denatürasyonu - Denaturasyon 94°C 1 dakika - Bağlanma 59°C 1 dakika - Uzama 72°C 1 dakika PCR bitiminde son uzama için 60°C’de 45 dakika PCR ürünleri +4 oC’de bekletilmektedir. 28 döngü PCR Ürü n leri ni n Den at u ra syo nu 1 - Yürütülecek örneklerle birlikte, biri pozitif diğeri negatif iki kontrol örnek ve tipleme yapmak için gerekli olan Ladder da göz önüne alınarak, yeterli sayıda tüp alındı. 2- 4°C de saklanan Liz ve daha önceden alikotlanarak derin dondurucuda saklanan Hi-Di Formamid, oda sıcaklığına geldikten sonra 5 saniye vortekslenip, kısa bir satrifüj yapıldı. 3- Her örnek için tüp içine şu karışım hazırlandı: 10µL Formamid 0.5µL Liz 1µ L DNA örneği (PCR ürünü) 4- Karışım ABI Prism 3130 XL cihazına uygun platelere pipetlendi. 5- Tüpler PCR aletin de 95°C'de 5 dakika denatürasyon yapıldı. 6- Denatürasvon sonunda en az 3 dakika buzda bekletildi. K APİLLER ELEK TRO FOREZ Yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanan örnekler, 16 kapilerli AB Applied Biosystem HITACHI 3130 XL Genetik Analizör aletinin örnek tablasına yerleştirildi. Kapiller olarak 3100 Capillary array (36 cm) Applied Biosystem kullanıldı. DNA molekullerini kapillere almak için 5 saniye 15 kV voltaj uygulanarak 60 oC’de elektroforez işlemi gerçekleştirildi. ANALİZİ TAM AM LANAN ÖRNEKLERİN S O NUÇLARININ G Ö RÜNTÜLENM ES İ Elektroforez bittikten sonra; “GeneMapper ID V3.2” programında örnekler tiplendirildi. Daha sonra, tüm laboratuar personeline ait genotip bulgular, laboratuarın DNA veri arşivine girildi EK-2: GÖNÜLLÜLERE VERİLECEK BİLGİLENDİRİLMİŞ ONAM FORMU Araştırmanın yürütüldüğü kuruluş: İstanbul Üniversitesi, Adli Tıp Enstitüsü, Fen Bilimleri Anabilim Dalı ve İstanbul Emniyet Müdürlüğü Kriminal Polis Laboratuvarı Araştırmanın Adı:DNA Analizinde, Laboratuvar Kaynaklı Kontaminasyonun Tespiti ve Adli Bilimler Açısından Değerlendirilmesi Amaç: DNA içeren tüm fiziksel deliller kriminal incelemede önemli hale gelmiştir. Çünkü şüpheli, mağdur ve olay yeri arasındaki bağlantıyı kurup yüksek ayrım gücü ile kim sorusunun cevabını verebilmektedir. İdantifikasyon amacı ile biyolojik materyallerden DNA analizi çok güçlü bir araç olmasına karşın PCR işlemi örnekte hangi DNA’lar mevcut ise onları kopyalayıp delil kaynaklı DNA ile başka kaynaktan karışan DNA’yı ayırt edemez. Bu sebepten ötürü analiz aşamasında doğabilecek tüm kontaminasyon riskine karşı önlem alınmalıdır. Bu çalışmada tüm laboratuar personelinin biyolojik delillerin kontaminasyona uğratma riskleri ve önleme yöntemlerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla tüm çalışanların kendi onamları ile verdikleri ağız içi svab örneklerinden DNA izole edilerek hiç bir hastalıkla ilişkisi bulunmayan ve bireyler arasında farklılık gösteren DNA üzerindeki 16 STR lokusu incelenerek önlenmesi laboratuar kaynaklı kontaminasyon araştırması ve planlanmıştır. Elde edilen verilerin kullanımında kişisel gizlilik esas alınacaktır. Bu araştırmaya katılmak kişiye hiçbir mali yük getirmiyecektir. Kişi istediğinde araştırmadan ayrılabilir. Araştırmaya hiçbir baskı olmaksızın kendi arzumla katıldığımı beyan ederim. Adı ve Soyadı: İmza: Cinsiyeti: Doğum Tarihi: Doğum Yeri: Herhangi bir hastalığı var mı ? Evet Hayır Varsa nedir? Sorumlu Araştırıcı : Özge Usal Dönmez İmza: Tanıklık eden kurum yetkilisi : İmza: ÖZGEÇMİŞ 1973 yılında Ankara’da doğdum. İlk öğrenimimi Tınaztepe ilk öğretim okulunda, orta ve lise öğrenimimi Kocatepe Mimar Kemal Lisesinde tamamladım. 1997 yılında Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji bölümünden mezun oldum. 1997 ve1999 tarihleri arasında Hacettepe Üniversitesi Çocuk Hastanesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Laboratuvarında biyolog olarak çalıştım.1998 Aralık ayında Ankara Kriminal Polis Laboratuvarında biyolog olarak göreve başladım. 2001 yılından itibaren de İstanbul Kriminal Polis Laboratuvarında çalışmaktayım. 2005-2006 güz döneminde İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü Fen Bilimleri Ana Bilim Dalında Yüksek Lisans öğrenimime başladım ve halen çalışmalarımı sürdürmekteyim.
![[The arson] Kundakçılık - Celal Bayar University, Department of](http://s1.studylibtr.com/store/data/003368817_1-1810ea17294d46264d336c5e701f7234-300x300.png)
