Flow Cytometry and Usage Areas

Flow Sitometri ve Kullanım Alanları
ÖZ
İlk çağlardan bu yana insanoğlu, bilinmeyeni keşfetme arzusu ile bilim ve teknoloji alanında hiç durmadan araştırma
yapmaktadır. Yapılan çalışmalar günümüze ışık tutmuş ve bilim insanlarını yönlendirerek sorunların çözümü noktasında
daha detaylı düşünmelerini sağlamıştır. Böylece, insanlık için önemli birçok sorun araştırılmakta ve çözümler üretilmeye
çalışılmaktadır. Bunun paralelinde gelişen bilim ve teknoloji sayesinde birçok, alet, cihaz ve teknik geliştirilmiştir.
Özellikle bilgisayarın icadı ve gelişmesi ile moleküler tekniklerin, biyoloji ile birleşmesi sonucu bilim insanlarının en
kısa sürede, en doğru sonuca ulaşmalarını sağlamaya başlamıştır. Hücrelerin biyokimyasal ve fiziksel özelliklerinin
senelerdir primer mikroskop özellikleri kullanılarak saptanmasına karşılık, günümüzde flow sitometri tekniği
kullanılmaya başlanmıştır. Flow sitometri, çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde bir akış kanalı boyunca tek tek
geçmesi ve bu sırada hücre büyüklüğü ve granülaritesine göre sınıflandırılması esasına dayanan bir teknik ve cihazdır.
1870 yılında Savart isimli bir araştırıcının hızla akan sıvının yüksek hızla vibrasyonu sonrası ayrışımı yani hücre toplama
prensibini bulması sonrasında, 1934 yılında Moldaven isimli araştırıcı fotoelektrik alıcıyı geliştirmiş ve akım boyunca
kan hücrelerinin sayımını sağlamıştır. 1949-1956 yılları arasında Coulter kan sayım cihazının geliştirilmesi, sonrasında
da 1969 yılında argon lazerin Van Dilla tarafından sisteme monte edilmesi ile yeni bir aşamaya gelmiş ve 1980 yılında
Becton Dickinson ile hücre toplayıcılar geliştirilmiştir. Flow sitometri hücrelerin fenotipik ve karakteristik özelliklerini
kalitatif ve kantitatif olarak inceleyen bir cihazdır. Bu cihaz ile hücrenin yüzey ve iç proteinleri, organelleri ve diğer
bileşenleri analiz ve ayrımı, lazer ve elektronik teknolojisi kullanılarak büyüklük, granülarite ve floresans emisyonu
esasına göre gerçekleştirilmektedir. Önceleri hematoloji laboratuvarlarında kullanılan bu cihaz ve sistem günümüzde
başta hematoloji, immünoloji, onkoloji olmak üzere; viroloji, bakteriyoloji, mikoloji, organ nakil birimleri, araştırma
laboratuvarları ile patoloji, histoloji, biyokimya gibi klinik laboratuvarlarında kullanılan önemli bir araştırma yöntemi
olarak yerini almıştır. Klinik laboratuvarların yanı sıra gıda, toksikoloji, veterinerlik ve hidrobiyoloji araştırmalarında da
bu cihazdan oldukça sık yararlanılmaktadır. Flow sitometri tekniğinin temelini iyi bilmemiz bu tekniği birçok patolojide
kullanmamızı sağlayarak sonuçlarının standardizasyonunu ve tanı koydurucu değerini de arttıracaktır.
Anahtar kelimeler: Flow sitometri, hücre analizi, hücre gruplama, kullanım alanları
Flow Cytometry and Usage Areas
ABSTRACT
Since the earliest times, mankind has never stopped making research in science and technology with the desire to explore
the unknown. Studies have provided more detailed thinking about the present and shed light on that point in the solution
of the problem by directing the scientists. So many important issues being investigated and solutions are being searched
for humanity. In line with this, many thanks to advances in science and technology, machinery, equipment and techniques
have been developed. In particular, the invention of computers and the development of molecular techniques, as soon as
the result of the merging of biology, scientists have started to provide the most accurate results. Response of cells to be
detected using biochemical and physical properties of the microscope for many years the primary specifications have
been used for flow cytometry techniques. Flow cytometry is a technique and apparatus based on a single pass along the
flow channel and the basis for classification based on cell size and granularity in this order as a suspension of various
cells. In 1870 Savarts named after the high-speed vibration rapidly flowing liquid of a searcher after finding the
decomposition that cell aggregation principle, in 1934 Moldava which is researchers have developed a photoelectric
receiver and current for led to the count of red blood cells. The development of Coulter cell counter between the years
1949-1956, after which the laser argon at 1969 Van Dilla with mounting by the system has reached a new stage and has
developed cell collectors with Becton Dickinson in 1980. Flow cytometry is a device for viewing and phenotypic
characteristics of the cells qualitatively and quantitatively. The surface and internal proteins of cells with this equipment,
organelles and other components analysis and separation, size using laser and electronic technology are performed by the
granularity and fluorescence emission as basis. These devices and systems used in today's first hematology laboratory
before, immunology, oncology, including; virology, bacteriology, mycology, organ transplant units, research laboratories
and pathology, histology, has taken its place as a major method that is used in biochemistry research, such as clinical
laboratory. Clinical laboratories as well as food, toxicology, veterinary and hydrobiology research are used quite often in
this device. Flow cytometry is the basis of technical know well this technique will increase the diagnostic value of
standardization and allowing us to use the results in many pathologies.
Keywords: Flow cytometry, cell analysis, cell sorting, usage areas
1.
FLOW SİTOMETRİ(FLOW CYTOMETRY)
Sitometri, hücrelerin veya biyolojik partiküllerin fiziksel ya da kimyasal karakterlerinin ölçülmesidir. Flow sitometri ise,
akan bir sıvının içerisindeki hücrelerin özelliklerinin incelenmesi olarak tanımlanabilir. Günümüzde flow sitometri ya da
akım sitometri terimleri kullanılmaktadır. Flow sitometrinin temel yaklaşımı; hücrelerin boyut, şekil, DNA ve RNA
içeriği, sitoplazmik granüleritesi açısında değerlendirilmesidir. Bu amaçla hedeflenen yapı ya da hücre önce fluoresan
madde ile işaretli bir antikor veya özel bir boya (nükleik asitlere özel propidium iodide) kullanılarak işaretlenir. Bazı
durumda ise klorofil gibi maddeler kendileri fluoresan özelliğe sahiptir [1]. Flow sitometrinin çalışma prensipleri 1870
yıllara kadar eski olsa da 1969 yıllında argon lazerinin kullanılmaya başlaması, 1980 yıllında ayırma işleminin bulunması
ve son 10 yıldır sürekli olarak geliştirmesiyle günümüze kadar gelişmiştir . Flow sitometrinin temel yaklaşımı; hücrelerin
boyut, şekil, DNA ve RNA içeriği, sitoplazmik granüleritesi açısında değerlendirilmesidir. Bu amaçla hedeflenen yapı ya
da hücre önce fluoresan madde ile işaretli bir antikor veya özel bir boya (nükleik asitlere özel propidium iodide)
kullanılarak işaretlenir. Bazı durumda ise klorofil gibi maddeler kendileri fluoresan özelliğe sahiptir [2].
1.1.
Temel Bileşenleri (The Basic Components)
Flow sitometri cihazı; akış (sıvı) sistemi, ışık kaynağı (lazer ışını), filtreler ve sinyal dedektörleri, bilgisayar ile yazılım
programları ve ayırma mekanizması (cell sorting) bileşenlerinden oluşmaktadır. Temel olarak bir flow sitometri cihazında
üç temel bileşen bulunmaktadır (Şekil 1). Hidrolik bileşen, akış sistemidir ve partüküllerin lazer önünden geçişi için
taşıyıcı sistem olarak görev almaktadır. Optik bileşen lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan floresan saçılımının
çapraz ve silindirik filtreler ile toplanarak düzgün bir şekilde fotodetektöre aktarılmasında görev almaktadır. Elektronik
bileşen ise elde edilen optik sinyalin photo multipler tubes(PMT) ile amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevriminden ve
analiz için bilgisayara aktarımından sorumludur [3].
Şekil 1 Flow sitomerinin temel bileşenleri (The basic components of flow cytometry)
Akıcı sistem bir merkezi kanaldan oluşur ve örnek buradan cihaza verilir. Merkezdeki örneği içeren sııvı (laminar akıntı)
ve çevreleyen sıvı (sheath fluid) birbirine karışmadan ilerlemektedir. Bu etkiyle partiküller tek bir sıra şeklinde dizilirler
ve bu hidrodinamik odaklanma olarak isimlendirilir. Böylece lazer ışını aynı anda tek hücreye düşer ve tek hücrenin
analiz yapılır. Işın öne doğru yayıldığında tipik olarak lazer ile aynı yönde 20˚ etrafa yayılan ışınlar forward scatter chanel
(FSC) denilen bir lens yardımıyla toplanırlar. FSC detektörü hücrenin boyutu hakkında bilgi verir. Eksitasyon çizgisine
yaklaşık 90˚ açıyla yayılan ışının ölçüllmesi ise side scatter olarak adlandırılır. SSC partiküllerin granüler içerikleri ve iç
yapısı hakkında bilgi verir [4].
1.2.
Çalışma prensibi (Working principle)
Flow sitometri floresan yoğunluğuna bağlı olarak süspansiyon halindeki hücrelerin büyüklüğüne ve granülaritesine göre
tek hücre seviyesinde kantitatif ölçüm yapan bir sistemdir (Şekil 2). Süspansiyon halindeki hücreler hava basıncı ile sıvı
içinden geçirilir. Sıvının çok hızlı akışı yüksek bir hidrostatik basınç oluşturur ve bu basınçla hücreler cam veya quartzdan
yapılmış (flow cell) akış kabinine gelirler. Bu kabinin geometrik şekli ve sıvının laminer akışı hücrelerin tek bir sıra
halinde lazer kaynağı önünden geçişini sağlar. Hücrelerin analizi için sistemde forward scatter(FS), side scatter(SS) ve
floresan(FL-1,FL-2,FL-3 vb.) dedektörler bulunur. Temel olarak bir flow sitometri cihazından ileri saçılma grafiği
(Forward scatter) ile yaklaşık büyüklüğü, yana saçılma grafiği (Side scatter) ile yaklaşık granülitesi, floresan grafiği (belli
dalga boyuna has parıldama eldesi) ile yaklaşık floresan miktarı hakkında bilgiler ediniriz [5,6].
Temel olarak bir flow sitometri cihazından:
1-İleri saçılma grafiği (Forward scatter) ile yaklaşık büyüklüğü
2-Yana saçılma grafiği (Side scatter) ile yaklaşık granülitesi
3-Floresans grafiği (belli dalga boyuna has parıldama eldesi) ile yaklaşık floresans miktarı hakkında bilgiler ediniriz [7].
Şekil 2 Flow sitometrinin çalışma prensibi (Working principle of flow cytometry)
1.3.
Analiz (Analysis)
Flow sitometri cihazı ve tekniği son derece hızlıdır, çok kısa bir sürede binlerce hücreyi analiz ederek, detaylı sonuç
raporları elde edilir. Heterojen bir örnek popülasyonunda, hücrelerin ve bileşenlerinin çok parametreli kantitatif özellikleri
çok kısa bir sürede analiz edilebilir. Flow sitometri’nin en güçlü ve kendisine özgü avantajı Tablo 1’de görüldüğü gibi
hücreleri fiziksel olarak birbirlerinden ayırt edebilmesidir. Böylece daha ileri analizler yapabilmek için, spesifik
hücrelerin saf örneklerini elde etmek mümkün olur [8]. Bu tür çalışmalar son dönemde kök hücre ve gen terapi
çalışmalarında kullanılmaktadır. Flow sitometri’de, hücrenin ve/veya bileşenlerinin kalitatif ve kantitatif analizleri kısaca
dört şekilde yapılabilmektedir [9,10,11,12].
Bunlar;
1-Hücrelerin büyüklük ve granül yapısına göre analiz;
2-Tek floresan boya kullanılarak işaretlenen monoklonal antikor kullanılarak yapılan analiz;
3-Çok renkli floresan boyalar (2-17 renk) ile işaretle-nen antikorlar kullanılarak gerçekleştirilen analiz;
4-Hücre içerisinde bulunan antijenlerin ve yapıların hücre zarının geçirgenliğinin artırılması sonucu eklenen floresan boya
ile işaretli monoklonal antikorlar ile yapılan analizi şeklinde sayılabilir [13,14].
Tablo 1. Flow sitometri ile ölçümü yapılabilecek hücresel özellikler (Cellular characteristics that can be measured by
flow cytometry)
Özellikler
Yapısal
Fonksiyonel
Hücre boyutu
İntrinsik
Hücre şekli
Redoks hali
Sitoplazmik granülite
Canlılık
Pigment içeriği
Yüzey antijenleri
Lektin bağlama
Total protein
Ekstrinsik
Sülfidril grupları
DNA içeriği
RNA içeriği
Kromatin yapısı
Membran devamlılığı
Yüzey elektrik yükü
İntrasellüler pH
Membran potansiyeli
Sitoplazmik yüzey reseptörü
Enzim aktivitesi
Sitoplazmik matriks yapısı
Membran viskozitesi
2.
KULLANIM ALANLARI (USAGE AREAS)
Akış sitometri cihazı ile analiz için hücre süspansiyonu hazırlamak amacıyla; kan, kemik iliği, beyin, omurilik sıvısı,
alveoler lavaj sıvısı, eklem sıvısı, plevral sıvı, doku biyopsi örnekleri, parafin bloktaki dokular, hücre kültürü örnekleri
kullanılabilir. Flow sitometri yöntemi sıklıkla hücre ölümü(apoptozis), hücresel özellikler (Tablo 2) ve proliferasyonun
belirlenmesi; mikroorganizma (hücre içi bakteri, virüs, bakteri ve alg) sayısı ve tür analizi yapılması; parazit ve mantar
belirlenmesi; hücre kültüründe virüs, bakteri ve hücre sayımı; nötral yağ içeriğinin belirlenmesi; bağıl klorofil içeriğine
bağlı alt popülasyonların, türlerin ve bireylerin belirlenmesi; alglerde toksik madde etkileri; LC50 değerlerinin
bulunmasında; alglerde sitotoksik çalışmalarda ve ekotoksikoloji çalışmalarında kullanılmaktadır [15,16,17,18].
İmmünfenotipleme (Immunophenotyping)
2.1.
İmmunfenotipleme 1970’li yıllarda monoklonal antikor teknolojilerinin geliştirilmesi sonrasında, tıbbın birçok alanında
yaygın olarak kullanılmaktadır. İmmünfenotipleme; floresan boyalarla görünür hale gelen hücre yüzeyi ve hücre içi
belirteçlerin saptanması yöntemidir. Özgül antikorlarla saptanmak istenen antijenik yapıların varlığı ya da yokluğu
saptanmaktadır [19]. 1970’li yıllarda mikroskopla immunfenotipleme yapılmakta iken; immunolojide ve akan hücre ölçer
(flow cytometry) sistemlerindeki gelişmeler ve yazılım programlarının hızla aşama kaydetmesi sayesinde günümüzde çok
renkli immünfenotipleme analizlerinin kısa sürede yapılabilmesi mümkündür. Hücre yüzey antijenlerinin
tanımlanmasında “Cluster of Differantiation-CD” terminolojisi kullanılır. Anormal bir hücre topluluğu görüldüğünde
bunun immunfenotipinin tanımlanması gerekir. Bunu ifade etmenin en kolay yolu antijen taşıyan hücrelerin oranlarını
(%) bildirmektir. Antijen yoğunluğunu göstermek için de ölçülen floresan sinyallerin şiddeti belirlenir (Mean Fluorescent
Intencity-MFI) ancak bu parametre hücre üzerindeki antijen sayısının yanı sıra kullanılan florokrom ile de yakından
ilgilidir [20]. Bu açıdan immünfenotipleme yapmanın avantajları:
1.
Büyüklük (FSC) ve granüler (SSC) yapılarına göre hücreler sınıflandırılabilir.
2.
Ölü hücreler çalışma dışı tutulabilir.
3.
Zayıf eksprese edilen yüzey antijenleri tespit edilebilir.
4.
Çok renkli (2,3,4,…) analizler ile hücrenin fenotipi, gelişiminin hangi evresinde bulunduğu belirlenebilir.
5.
Eş zamanlı bulunan birden çok hematolojik malinitenin, bifenotipik hücrelerin belirlenmesi mümkündür [19].
İmmünofenotiplemenin tıpta kullanım alanları ise lenfoma ve lösemi immünotiplemesi (KLL, ALL, AML, KML),
hematolojik hastalıkların belirlenmesi (ITP, nötrofil fonksiyon defektleri), immün yetmezliklerin teşhisi, kemoterapi
etkinliğinin izlenmesi, otoimmün hastalıkların tanısı, transplantasyon öncesi ve sonrası hasta durumunun gözlemlenmesi
ve allerjik hastalıklarda kullanılmaktadır [20,21,22,23]. Günümüzde en sık lösemi, lenfoma ve myeloma hastalarında
kullanılır. Lösemi immünofenotiplemesinde en sık kullanılan örnekler kan ve kemik iliğidir. Sağlıklı bir insanla lösemili
bir insanın kan örnekleri arasında dramatik farklılıklar mevcuttur. Sağlıklı insanlarda kan profili kesindir ve bilinir ancak
lösemili hastalarda profil çok değişkendir. Bu alanda kök hücre çalışmalarında özellikle flow sitometrik analizlerle
tedaviler yönlendirilebilmektedir [24,25].
2.2.
Hücre döngüsünün incelenmesi (Investigation of cell cycle)
DNA, çift sarmalla şelat yapabilen floresan boyalarla işaretlenebilir. Boyama sitokiyometriktir; yani boyanın miktarı
hücrede bulunan DNA miktarıyla doğru orantılıdır. Bu amaçla en sık kullanılan boyalar Propidyum İyodür (PI), DAPI,
Hoechst dür. Bu tür florokromların bir kısmı sadece DNA ya bağlanırken çoğu DNA ve RNA ya bağlanabilme
özelliğindedir. Bu durumun sonuçları etkilememesi için DNA’nın, hücre zarı geçirgen hale getirildikten ve RNAse ile
işlem gördükten sonra boyanması önerilmektedir [26]. Diploid bir hücredeki DNA miktarı 2n olarak tanımlanır (Şekil 5).
Bu durumda test edilen hücredeki DNA’nın normal hücrelerdeki DNA miktarlarına oranlanması ile elde edilen değer
DNA indeksi olup; hücrenin DNA içeriğini yansıtmaktadır. Normalde 1 +/- %10 olması beklenir; bundan farklı değerler
bulunduğunda anaploididen söz edilir. DNA indeksinin >1 olması hiperploidi, <1 olması hipoploidi olarak tanımlanır.
Anaploidinin bulunması malignite lehine bir bulgu olsa da bu her zaman doğru değildir; benzer şekilde anaploidi daima
kötü prognozun bir işareti olarak algılanmamalıdır [27].
Şekil 3 Flow sitometrede hücre döngüsü incelenmesi (Examination of the cell cycle with flow cytometer)
Akım Sitometresi ile hücrelerin hangi bölünme fazında ne miktarda hücre bulunduğunu tespit etmek de mümkündür. Bu
şekilde hücrelerin çoğalma hızları hakkında bilgi toplanır. Diploid hücreler, G0 /G1 fazında yer alırkan S (sentez)
fazındaki hücrelerin DNA içeriği diploid ile tetraploid hücreler arasında olacaktır. G2 ve Mitozdaki hücreler ise 4n
miktarında DNA taşıdıklarından tetraploid olarak izlenecektir. S+G2+M fazındaki hücreler S Fazı Fraksiyonu (SPF)
olarak tanımlanıp; SPF nin yüksek olması, proliferasyon hızının yüksek olduğunun bir göstergesidir [26]. Hücre döngüsü
analizlerinde: analiz edilecek hücrelerin seçimi ve kullanılacak yazılım programlarında seçilen modeller, karşılaştırılabilir
sonuçlar elde edilmesinde büyük önem taşır. Hücre döngüsü analizlerinde karşılaşılan bir problem malign olan ve
olmayan hücrelerin bir arada bulunabilmesidir. Bu durumda DNA’yı işlaretlemeden önce malin hücreleri ayırabilecek bir
antijeni(ör: epitelyal kökenli hücrelerde sitokeratin, B lenfoid tümörlerde CD19) işaretlemek yardımcı olabilir. Hücre
döngüsü analizlerini hücre döngüsüne eşlik eden proteinlerin ölçümü ile ile eş zamanlı değerlendirmek de mümkündür
[28].
Hücre canlılık analizi (Cell viability assay)
2.3.
Flow sitometre ile henüz nükleer değişiklikler oluşmadan membrandaki erken değişiklikler sırasında bile apoptozis
ölçülebilmektedir. Apoptozis geliştiğinde hücre membranının normalde iç kısmında bulunan fakat apoptozis ile hücre
yüzeyine çıkan fosfotidil serine bağlanma özelliği gösteren Annexin V ile hücrelerde apoptozis tayini yapılabilmektedir.
Ölü-canlı hücre ayrımı içinde ise hücrelerin eşzamanlı olarak propidium iodide ile boyanması sonuçları daha güvenilir
hale getirmektedir [29].
2.4.
Mikrobiyolojide flow sitometri (Flow cytometry in microbiology)
Flow sitometri son yıllarda mikrobiyolojide mikroorganizmaların canlılığını, sayısını, identifikasyonunu ve antibiyotik
duyarlılığını saptamada kullanılmaya başlanmıştır. Malarya türlerini ayırma ve su, toprak ve yiyeceklerde
mikroorganizma tayini bunlar arasında sayılabilmektedir. Flow sitometride virüs çalışmaları da son yıllarda hız
kazanmıştır. Hücresel makromolekül sentezindeki değişiklikler ve viral infeksiyonun ardından oluşan immünolojik
değişiklikler, viral antijen varlığı ve miktar tayini flow sitometri ile tespit edilebilmektedir [30].
İlaç alım ölçümleri (drug uptake measurements)
2.5.
Birçok kemoterapötik ajanın etki yeri DNA’dır. Tümör hücrelerinde multi-ilaç rezistansının değerlendirilmesinde de flow
sitometri rol almaktadır. Ayrıca flow sitometri ile ilaçların hücre içine girişini arttıran veya hücreden çıkışını bloke ederek
retansiyonu arttıran ajanların etkilerinin incelenmesi de mümkün olmaktadır [31].
3.
FLOW SİTOMETRİNİN AVANTAJ VE DEZAVANTAJLARI (ADVANTAGES AND
DISADVANTAGES OF FLOW CYTOMETRY)
Güçlü yazılım programlarının bir bileşimi olan flow sitometriler, araştırıcılara geniş hücre toplulukları hakkındaki
verilerin hızlıca toplanmasını ve analizini sağlayan karmaşık metottur. Bu cihazlar ile saniyede 70.000 partikülden
fazlasını işlemek ve her partikül veya hücre başına dokuz floresan renk ve iki yöne saçılan ışık sinyallerini saptamak
mümkündür [32].
Avantajları (Advantages)
3.1.

Teknik hızlıdır, saniyede binlerce partikül sayımı yapabilir (tek hücreli fluoresan özelliği olan canlıların çok kısa
zamanda çok duyarlı olarak sayılmasına izin verir).

Yüksek duyarlılıkla analiz yapma imkanı vardır (her bir dalga boyunu yada her bir partikül boyunun ayrı ayrı
sayılması mümkündür).

Tek tip mikro küreciklerin ışık saçılımı ve fluorosen ölçümleri için varyasyon sabiti (CV=standart
sapma/ortalama) %1’den küçüktür.

Flow sitometrinin en güçlü ve kendisine özgü avantajı, herhangi bir optik karakteristiğe veya bunların
kombinasyonlarına bağlı olarak hücrelerin fiziksel olarak birbirlerinden ayırabilmesidir. Böylece daha ileri
analizler yapabilmek için, spesifik hücrelerin saf örneklerini elde etmek mümkün olur. Flow sitometri
cihazlarının kurulun maliyetleri yüksek olmasına karşın, kullanım bakım maliyetleri düşüktür [33].
Dezavantajları (Disadvantages)
3.2.

Flow sitometriler tipik olarak sadece ileri yapısal detayları değil de pik yapan veya entegre sinyalleri ölçebilir.
Bu sorun ölçüm yapılması istenen partikülere özel olarak bağlanan ya da incelenmesi istenen yapı dışında tüm
yapılara bağlanan optik olarak aktif kimyasallarla çözülebilir.

Birçok flow sitometri çok küçük hacimleri (<0.5 mm3) analiz eder. Oysa, hücreler en az yaklaşık 103/ml olarak
bulunurlar. Bu nedenle flow sitometri cihazının doğru şekilde kalibre ve ayarlanması gerekir [34].
KAYNAKÇA
[1] D. Demirel. (1995). Flow sitometrik DNA analizinin temel prensipleri. Türk Patoloji Dergisi. 11 (2). Available:
http://www.turkjpath.org/pdf/pdf_TPD_1086.pdf
[2] C.H. Dunphy. (2004). Applications of flow cytometry and immunohistochemistry to diagnostic hematopathology.
Archives
of
Pathology
&
Laboratory
Medicine.
128
(9),
pp.
1004-1022.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15335254
[3] P. Pozarowski, J. Grabarek, Z. Darzynkiewicz. (2004). Flow cytometry of apoptosis. Curr Protoc Cell Biol. 18 (18).
Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18228448
[4] F.E. Craig, K.A. Foon. (2008). Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), pp.
3941-67. Available: http://www.bloodjournal.org/content/111/8/3941?sso-checked=true
[5] U. Güner. (2012). Flow sitometrinin hidrobiyolojide kullanımı. Journal of Fisheriessciences.com. 6 (1), pp. 9-17.
Available: http://uguner.trakya.edu.tr/files/d8-_flow_sitometrinin_hidrobiyolojide_kullan%C4%B1m%C4%B1.pdf
[6] F. Taneli. (2007). Flow sitometri tekniği ve klinik laboratuvarlarda kullanımı. Türk Klinik Biyokimya Dergisi. 5 (2),
pp. 75-82. Available: http://tkb.dergisi.org/pdf/pdf_TKB_89.pdf
[7] Z. Youli, M. Shahjahan, C.C. Chang. (2009). Basic principles of flow cytometry. basic concepts of molecular
pathology.
Molecular
Pathology
Library.
2,
pp.
139-146.
Available:
http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-0-387-89626-7_15
[8] H. Daniel. A Review and Applications of Flow Cytometry. Department of Chemistry, University of Illinois at UrbanaChampaign.
2004.
Available:
http://www.researchgate.net/publication/267193958_A_Review_and_Applications_of_Flow_Cytometry
[9] M. Brown, C. Wittwer. (2000). Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin. Chem. 46,
pp.1221–1229. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10926916
[10] S.F. Ibrahim, G.V.D. Engh. (2007). Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Engin/Biotechnol. 106, pp. 19–
39. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17728993
[11] L.A. Herzenberg, D. Parks, B. Sahaf, O. Perez, M. Roederer. (2002). The history and future of the fluorescence
activated cell sorter and flow cytometry: a view from stanford. Clin. Chem. 48, pp. 1819–1827. Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12324512
[12] M. Rahman. Introduction to flow cytometry. Serotec Ltd. Oxford (UK). Published by Serotec Ltd. 2006. Available:
https://static.abdserotec.com/Lit-pdfs/Brochures1/flowcytometry.pdf
[13] B.H.
Villas.
(1998).
Flow
cytometry:
an
overview.
Cell
Vis.
5,
pp.
56-61.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9660728
[14] B. Wood. (2006). 9-color and 10-color flow cytometry in the clinical laboratory. Arch. Pathol. Lab. Med. 130, pp.
680-690. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16683886
[15] A.S. Rose, K.S. Knox. (2007). Bronchoalveolar lavage as a research tool. Semin Respir Crit Care Med. 28 (5), pp.
561-73. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17975783
[16] E. Matteucci, O. Giampietro. (2008). Flow cytometry study of leukocyte function: analytical comparison of methods
and
their
applicability
to
clinical
research.
Curr
Med
Chem.
15
(6),
pp.
596-603.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18336274
[17] R.A. Peterson, D.L. Krull, L. Butler. (2008). Applications of laser scanning cytometry in immunohistochemistry and
routine
histopathology.
Toxicol
Pathol.
36
(1),
pp.
117-32.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18337230
[18] H.R. Hulett, W.A. Bonner, R.G. Sweet, L.A. Herzenberg. (1973). Development and application of a rapid cell sorter.
Clin Chem. 19 (8), pp. 813-6. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4200173
[19] G. Yanıkkaya Demirel, G. Deniz, E. Ekşioğlu Demiralp. (2010). Lenfosit immünofenotiplemesi için kılavuz bilgiler.
Türk
İmmünoloji
Derneği
Akan
Hücre
Ölçer
Alt
Grubu.
pp.
1-19.
Available:
http://www.turkimmunoloji.org.tr/dokumanlar/Lenfosit_Imm%C3%BCnfenotiplemesi_Kilavuz_Bilgiler_TID_201
0.pdf
[20] E.G. van Lochem, V.H.J. van der Velden, H.K. Wind, J.G. te Marvelde, N.A.C. Westerdaal, J.J.M. van Dongen.
(2004). Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: reference
patterns for age-related changesand disease-ınduced shifts cytometry. Clinical Cytometry, 60B, pp. 1–13. Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15221864
[21] A.L. de Weck, M.L. Sanz, P.M. Gamboa, W. Aberer, J. Bienvenu, M. Blanca, P. Demoly, D.G. Ebo, L. Mayorga,
G. Monneret, J. Sainte-Laudy. (2008). Diagnostic Tests Based on Human Basophils: More Potentials and
Perspectives
than
Pitfalls.
Int
Arch
Allergy
Immunol.
11
(146),
pp.
177-89.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18564624
[22] A. Ocmant, Y. Peignois, S. Mulier, L. Hanssens, A. Michils, L. Schanden. (2007). Flow cytometry for basophil
activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of
cat allergy. J Immunol Methods. 30(320), pp. 40-8. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17275019
[23] D. Georgescu, S. Ferrari-Lacraz, J. Villard. (2007). Anti-HLA antibody detection and rejection in kidney
transplantation: impact of the new Technologies. Rev Med Suisse. 25(3), pp. 1064-9. Available:
http://europepmc.org/abstract/med/17552259
[24] J.Z. Appel, M.G. Hartwig, E. Cantu, S.M. Palmer, N.L. Reinsmoen, R.D. Davis. (2006). Role of flow cytometry to
define unacceptable HLA antigens in lung transplant recipients with HLA-specific antibodies. Transplantation.
81(7), pp. 1049-57. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16612283
[25] H. Walczak, T.L. Haas. (2008). Biochemical analysis of the native TRAIL death-inducing signaling complex.
Methods Mol Biol. 414: pp. 221-39. Available: http://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-59745-3394_16#page-1
[26] J.E. Martinez, J.R. Beck, W.C. Allsbrook, C.G. Pantazis. (1990). Flow cytometric DNA analysis. Clinical
Laboratory Science. 3, pp. 180-183. Available: http://europepmc.org/abstract/med/10149039
[27] B. Barlogie, W. Godhe, D.A. Johnston, L. Smallwood, J. Schumann, B. Drewinko. (1978). Determinaton of ploidy
and proliferative characteristics of human solid tumors by pulse cytophotometry. Cancer Res. 38, pp. 3333-3339.
Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/688223
[28] D. Diaz, A. Prieto, E. Reyes, H. Barcenilla, J. Monserrat, M. Alvarez-Mon. (2008). Flow cytometry enumeration of
apoptotic
cancer
cells
by
apoptotic
rate.
Methods
Mol
Biol.
414,
pp.
23-33.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18175809
[29] W. Knapp, H. Strobl, O. Mojdic. (1994). Flow cytometric analysis of the cell surface and intracellular antigens in
leukemia
diagnosis.
Cytometry.
18,
pp.
187.
Available:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.990180402/pdf
[30] M. Shapiro. (1990). Flow cytometric approaches to clinical microbiology. Labmedica. 4(20). Available:
https://books.google.com.tr/books?hl=tr&lr=&id=JhSyimPKuJwC&oi=fnd&pg=PR7&dq=Flow+cytometric+appro
aches+to+clinical+microbiology&ots=OQBXCPOOPH&sig=zfFNc6ODI5cDWQx8HybB2PtECME&redir_esc=y
#v=onepage&q=Flow%20cytometric%20approaches%20to%20clinical%20microbiology&f=false
[31] M. Macey. Flow cytometry clinical applications. Blackwell scientific publications, chapter 2, 1994. Available:
http://link.springer.com/book/10.1007/978-1-59745-451-3
[32] S. Langsrud, G. Sundheim. (2000). Flow cytometry for rapid assessment of bacterical viability. International
Biodeterioration
&
Biodegradation.
36(3),
pp.
467-467.
Available:
https://www.infona.pl/resource/bwmeta1.element.elsevier-54473fe6-2a96-3785-856c-d8060c23be6d
[33] A.K. Azkur, M.E. Aslan. (2012). Akış sitometri ve veteriner hekimlikteki uygulamaları. Atatürk Üniversitesi
Veteriner
Bilimleri
Dergisi.
7(1),
pp.
59-66.
Available:
http://e-
dergi.atauni.edu.tr/ataunivbd/article/view/1020007578
[34] K. Dalva, Z. Gülbaş. (2005). Akım sitometri uygulamaları. Türk Hematoloji Derneği Moleküler Hematoloji. pp. 4452. Available: http://www.thd.org.tr/thdData/userfiles/file/klaradalva.pdf
Hakemlere Yanıt
Flow Sitometri ve Kullanım Alanları
ÖZ
Işık mikroskobunun keşfedilmesi ile bu cihaz araştırmacıların ve özellikle patologların primer aleti olmuştur. Optikal ve
elektronik yeniliklerin mikroskoba uygulanmasına rağmen, mikroskobik görüntünün yorumu patolojik teşhisin temel
prensibi olarak kalmıştır. Işık mikroskobunun yorucu ve çok sayıdaki hücrenin hızlı tayini için uygun olmamasına karşılık
flow sitometri ile hücreler tek hücre seviyesinde incelenir ve hücrelerin fiziksel ve biyolojik özelliklerinin kantitatif
ölçümleri doğru olarak yapılır. Hücrelerin çoklu parametreleri arka arkaya ölçülebilir ve hücre populasyonları bir veya
birkaç parametrenin temelinde birbirinden ayırt edilebilir. Hücrelerin biyokimyasal ve fiziksel özelliklerinin senelerdir
primer mikroskop özellikleri kullanılarak saptanmasına karşılık, günümüzde flow sitometri tekniği kullanılmaya
başlanmıştır. Flow sitometri, karışımda bulunan hücrelerin bir akış kanalı doğrultusunda, tek hücre seviyesinde geçmesi
ve bu sırada fiziksel parametrelerine göre gruplandırıldığı bir yöntemdir. Bu yöntemde lazer kaynağından gelen ışınların
hücrenin fiziksel özelliklerine göre yana, ileriye veya floresan olarak yaptığı saçılımlar elektronik sistemler tarafından
algılanarak hücre hakkında bilgi sahibi olunmaktadır. 1870 yılında Savart isimli bir araştırıcının hızla akan sıvının yüksek
hızla vibrasyonu sonrası ayrışımı yani hücre toplama prensibini bulması sonrasında, 1934 yılında Moldaven isimli
araştırıcı fotoelektrik alıcıyı geliştirmiş ve akım boyunca kan hücrelerinin sayımını sağlamıştır. 1949-1956 yılları arasında
Coulter kan sayım cihazının geliştirilmesi, sonrasında da 1969 yılında argon lazerin Van Dilla tarafından sisteme monte
edilmesi ile yeni bir aşamaya gelmiş ve 1980 yılında Becton Dickinson ile hücre toplayıcılar geliştirilmiştir. Bu yöntem
üç ayrı komponentten oluşur. Bunlar; hidrodinamik sistem, optik bileşen ve verilerin kaydedilip analizin yapıldığı
elektronik sitemdir. Flow sitometrinin günümüzde en fazla kullanım amaçları; floresan boyalarına tutunmuş monoklonal
antikorları kullanarak hücrelerin fenotipik analizinin yapılması, hücrelerin taşıdıkları özelliklere göre ayırt edilmesi ve
DNA analizidir. İlk zamanlarda sadece klinik olguların patolojik durumlarının değerlendirilmesinde kullanılmakta iken
cihaz ve yöntemin gelişimine paralel olarak toksikoloji, hidrobiyoloji, mikrobiyoloji (viroloji, mikoloji, parazitoloji,
bakteriyoloji), immünoloji ve diğer klinik laboratuvar uygulamalarında kullanılmaya başlanmıştır. Bu hızlı ve etkin
araştırma yönteminin iyi bir şekilde bilinmesi gerek klinik kullanımda patolojik olguların saptanmasında gerekse tür tayini
amaçlı kullanımda sonuçların kalitesini ve doğruluğunu arttıracaktır.
Anahtar kelimeler: Flow sitometri, hücre analizi, hücre gruplama, kullanım alanları
FLOW CYTOMETRY AND USAGE AREAS
ABSTRACT
The discovery of this device with the light microscope researchers and in particular has been the primary instrument of a
pathologist. Optical and electronic innovation despite the implementation of microscope, microscopic image of the
interpretation of the basic principle has remained as a pathological diagnosis. Light microscopy is exhausting and the
large number of the cell in response to fast not appropriate for determination of flow cytometry with cells at the level of
single cells are examined and quantitative measurement of the physical and biological properties of the cell are made
correctly. Multiple cells can be measured in a row and cell parameters of the populations on the basis of one or more
parameters can be distinguished from each other. The cells are biochemical and physical properties of the year using the
microscope in response, primary detection has been used nowadays flow cytometry technique. Flow cytometry, in
accordance with a flow channel of the cell in the mix, at the level of single cells, and in the meantime is a method which,
according to the physical parameters. In this method, the physical properties of the cell, the rays from the laser source
based on their side, as did forward or fluorescent scattering are electronic systems detected by the owner of the information
about the cell. In 1870, the goal of investigating the fast flowing liquid named Savart high speed the decomposition of
vibrasyonu post so after to find the principle of cell collection, in 1934 he developed and named Moldaven during the
photoelectric receiver searching the current blood cells count. 1949-1956, the development of the blood count between
Coulter and then in 1969, argon laser are installed in the system by Van Dilla came a new stage and in 1980 with Becton
Dickinson with cell collector are developed. This method consists of three separate components. These are; hydrodynamic
system, optical component, and the data is saved and analysis was made of the electronic site. Flow cytometry Levantine
maximum intended uses; fluorescent paint clinging to their phenotypic analysis of cells using the monoclonal antibodies,
cells of the differentiation and DNA analysis, according to the features they carry. At first only clinical cases while the
device is being used in the evaluation of the pathologic status and method in parallel with the development of Toxicology,
Hydrobiology, Microbiology (virology, Mycology, parasitology, bacteriology), Immunology and other clinical laboratory
applications are introduced. It is a fast and effective research method is a good way both in detecting pathological clinical
use cases need to type-determination purposes in use will increase the quality and accuracy of the results.
Keywords: Flow cytometry, cell analysis, cell sorting, usage areas
1.
FLOW SİTOMETRİ(FLOW CYTOMETRY)
Sitometri, biyopartiküllerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinin belirlenmesine ilişkin bir tekniktir. Flow sitometri ise
çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde bir akış kanalı boyunca tek tek geçmesi ve bu sırada hücre büyüklüğü ve
granülaritesine göre sınıflandırılması esasına dayanan bir yöntem ve cihazdır. Günümüzde flow sitometri ve akım
sitometri terimleri kullanılmaktadır [1]. 1934 yılında Moldaven isimli araştırmacının “akım boyunca kan hücrelerinin
sayımı” tekniğini pekiştirmesi ile başlayan tarih süreci hızlı adımlarla gelişmiş ve günümüzde hücrelerin tek tek
araştırılması aşamalarına kadar geliştirilmiştir. Flow sitometri bu hızlı gelişimi sonrasında ışık mikroskobuna bile
üstünlük sağlamıştır. Işık mikroskobunda bir defada 102-103 hücre yaklaşık 5 dakikada incelenebilirken, flow sitometride
103-106 hücre bir dakika gibi kısa bir sürede incelenebilmektedir [2].
1.1.
Temel Bileşenleri (The Basic Components)
Flow sitometri cihazı; akış (sıvı) sistemi, ışık kaynağı (lazer ışını), filtreler ve sinyal dedektörleri, bilgisayar ile yazılım
programları ve ayırma mekanizması (cell sorting) bileşenlerinden oluşmaktadır. Temel olarak bir flow sitometri cihazında
üç temel bileşen bulunmaktadır (Şekil 1). Hidrolik bileşen, akış sistemidir ve partüküllerin lazer önünden geçişi için
taşıyıcı sistem olarak görev almaktadır. Optik bileşen lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan floresan saçılımının
çapraz ve silindirik filtreler ile toplanarak düzgün bir şekilde fotodetektöre aktarılmasında görev almaktadır. Elektronik
bileşen ise elde edilen optik sinyalin photo multipler tubes(PMT) ile amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevriminden ve
analiz için bilgisayara aktarımından sorumludur [3].
Şekil 4 Flow sitomerinin temel bileşenleri (The basic components of flow cytometry)
Akıcı sistem bir merkezi kanaldan oluşur ve örnek buradan cihaza verilir. Merkezdeki örneği içeren sııvı (laminar akıntı)
ve çevreleyen sıvı (sheath fluid) birbirine karışmadan ilerlemektedir. Bu etkiyle partiküller tek bir sıra şeklinde dizilirler
ve bu hidrodinamik odaklanma olarak isimlendirilir. Böylece lazer ışını aynı anda tek hücreye düşer ve tek hücrenin
analiz yapılır. Işın öne doğru yayıldığında tipik olarak lazer ile aynı yönde 20˚ etrafa yayılan ışınlar forward scatter chanel
(FSC) denilen bir lens yardımıyla toplanırlar. FSC detektörü hücrenin boyutu hakkında bilgi verir. Eksitasyon çizgisine
yaklaşık 90˚ açıyla yayılan ışının ölçüllmesi ise side scatter olarak adlandırılır. SSC partiküllerin granüler içerikleri ve iç
yapısı hakkında bilgi verir [4].
1.2.
Çalışma prensibi (Working principle)
Flow sitometri floresan yoğunluğuna bağlı olarak süspansiyon halindeki hücrelerin büyüklüğüne ve granülaritesine göre
tek hücre seviyesinde kantitatif ölçüm yapan bir sistemdir (Şekil 2). Süspansiyon halindeki hücreler hava basıncı ile sıvı
içinden geçirilir. Sıvının çok hızlı akışı yüksek bir hidrostatik basınç oluşturur ve bu basınçla hücreler cam veya quartzdan
yapılmış (flow cell) akış kabinine gelirler. Bu kabinin geometrik şekli ve sıvının laminer akışı hücrelerin tek bir sıra
halinde lazer kaynağı önünden geçişini sağlar. Hücrelerin analizi için sistemde forward scatter(FS), side scatter(SS) ve
floresan(FL-1,FL-2,FL-3 vb.) dedektörler bulunur. Flow sitometri cihazı ile ileri saçılma grafiği (Forward scatter) ile
yaklaşık büyüklüğü, yana saçılma grafiği (Side scatter) ile yaklaşık granülitesi, floresan grafiği (belli dalga boyuna has
parıldama eldesi) ile yaklaşık floresan miktarı hakkında bilgiler ediniriz [5,6].
Şekil 5 Flow sitometrinin çalışma prensibi (Working principle of flow cytometry)
1.3.
Analiz (Analysis)
Bir örneğin flow sitometri ile analizinde hücrelerin süspansiyon haline getirilmesi ve monoklonal antikor ile işaretlenmesi
ana kuraldır. Vücut sıvıları doğal olarak süspansiyon halinde olduğundan hemen kullanıma hazırdır, dolayısıyla bunlarla
çalışmak kolaydır. Solid dokuların ve parafine fikse edilmiş dokuların ise parçalanıp belirli büyüklükte filtrelerden
geçirilerek süspansiyon haline getirilmesi gerekir. Hücre izolasyonundan ve saf eldesinden sonra bir veya daha fazla
floresan bağlı monoklonal antikor veya diğer kromoforlar hücre ile konjuge edilir. Bu floresan bağlı monoklonal
antikorlara veya kromoforlara prob denilmektedir. Problar genellikle yüzey antijenine veya hücre içi elemanlarına
spesifiktirler [7,8].
Hücrelerin işaretlenmesinde direkt veya indirekt immünofloresan teknik kullanılır. Direkt metodda antikorla konjuge
olmuş florokrom madde kullanılır. İndirekt metodda ise süspansiyon halindeki hücrelere ilk olarak işaretsiz monoklonal
antikor bağlanır. İşaretsiz monoklonal antikorla birleşmiş bu hücrelerin analizi için ikinci bir işaretli monoklonal antikor
gerekmektedir. Bu ikinci antikor, hücre ile bağlı durumda olan birinci antikora bağlanır [9,10].
Süspansiyon halindeki hücreleri cihaza vermeden önce lazer, bilgisayar ve elektronik sistemler devreye sokulur. Lazer
sistemi ve örneğin kalibrasyonu yapıldıktan sonra çalışılacak popülasyon monitörde işaretlenir ve histogramların ayarı
yapılarak örnek cihaza verilir. Elde edilen sonuçlar nokta alan, kontur alan, histogram, yoğunluk alan veya izometrik
grafikler şeklinde elde edilir. Kapı alma işlemi ile de popülasyon ekranda rektilineer şekilde işaretlenir ve seçilen
popülasyondaki hücrelerin verdikleri floresan ile hücre sayısı arasındaki ilişkiye göre yorum yapılır [11,12]. Bu yöntem
ile Tablo 1’ de bahsedilen hücresel parametreler ile mikrobiyolojik ve hidrobiyolojik örneklerin tür tayini de
yapılabilmektedir.
Tablo 1. Flow sitometri ile ölçümü yapılabilecek hücresel özellikler (Cellular characteristics that can be measured by
flow cytometry)
Özellikler
Yapısal
Fonksiyonel
Hücre boyutu
İntrinsik
Hücre şekli
Redoks hali
Sitoplazmik granülite
Canlılık
Pigment içeriği
Yüzey antijenleri
Lektin bağlama
Total protein
Ekstrinsik
Sülfidril grupları
DNA içeriği
RNA içeriği
Kromatin yapısı
Membran devamlılığı
Yüzey elektrik yükü
İntrasellüler pH
Membran potansiyeli
Sitoplazmik yüzey reseptörü
Enzim aktivitesi
Sitoplazmik matriks yapısı
Membran viskozitesi
2.
KULLANIM ALANLARI (USAGE AREAS)
Günümüzde flow sitometri pek çok araştırma alanında kullanılmaktadır. Kullanım alanları arasında immünfenotipleme,
DNA analizi, hücre proliferasyonu ve ölümünün incelenmesi, RNA ve protein içerik analizi, membran permeabilite ve
potansiyellerinin değerlendirilmesi sayılabilir. Ayrıca ilaç alım ölçümleri ve mikroorganizma tayini yapılabilmekte, hücre
içi kalsiyum iyon tetkikleri, pH ölçümleri, glutatyon analizi ve virüs ile viral ürün tayinleri de son yıllarda flow
sitometrinin önem kazandığı başlıca alanlar olarak karşımıza çıkmaktadır [13,14,15,16].
2.1.
İmmünfenotipleme (Immunophenotyping)
Hücrelerin eksprese ettikleri antijenlere karşı geliştirilmiş immünfloresan işaretli monoklonal antikorlar kullanılarak
identifiye edilmesi ve bu yöntemle karışık bir popülasyonda belli bir hücrenin belirlenmesi ve ayrılması flow sitometrinin
en kapsamlı kullanım alanlarından birisidir. Hücrelerin özellikle birbirleri arasındaki etkileşimi, yapışma ve
metabolizmalarını düzenleyen fonksiyonel membran proteinleri olan antijenlerle bağlanma özelliği gösteren epitoplar
arasındaki bağlanmaya dayanan bu özellik genel anlamda flow sitometrinin kullanımında önemli bir yere sahiptir.
Özellikle periferik kanda lenfositlerin alt gruplarının tayini ve kemik iliğinde lösemi ve lenfoma tiplendirmesi de ana
kullanım alanları içine girmektedir [17,18].
2.2.
Hücre döngüsünün incelenmesi (Investigation of cell cycle)
Flow sitometrinin kullanım alanlarından biri de DNA analizidir. Hücre popülasyonlarında DNA analizi yapılırken ploidi
tayini ile eşzamanlı olarak hücre siklusunun her fazında bulunan hücre sayısının da tespit edilmesi mümkün
olabilmektedir. Bu yöntem iğne biyopsilerinde, kemik iliği aspiratlarında, taze fikse ve parafin bloklarda
kullanılabilmektedir. Bu sayede ek bir prognostik belirteç olarak kullanılmaktadır [19]. Özellikle solid organlarda yapılan
DNA tayini malign hücrelerin büyüme kinetiği hakkında bilgi vermesi sebebiyle bireyin tedaviye verdiği yanıtın
değerlendirilmesinde ve izlenimde faydalı olmaktadır. Ayrıca hücrelerin total protein içeriği, izole nükleusun protein
içeriği, kromatin yapısı ve miktarı hakkında da fikir vermektedir. Permeabilize hücrelerin acridine orange ile işaretlenmesi
sonrasında aynı anda DNA ve RNA içeriğinin ölçülebilmesi ve hücre siklusunun G1 fazındaki alt kompartmanların
ayrımının yapılabilmesi de mümkün olmaktadır [120] (Şekil 3).
Şekil 6 Flow sitometrede hücre döngüsü incelenmesi (Examination of the cell cycle with flow cytometer)
Hücre canlılık analizi (Cell viability assay)
2.3.
Flow sitometre ile henüz nükleer değişiklikler oluşmadan membrandaki erken değişiklikler sırasında bile apoptozis
ölçülebilmektedir. Apoptozis geliştiğinde hücre membranının normalde iç kısmında bulunan fakat apoptozis ile hücre
yüzeyine çıkan fosfotidil serine bağlanma özelliği gösteren Annexin V ile hücrelerde apoptozis tayini yapılabilmektedir.
Ölü-canlı hücre ayrımı içinde ise hücrelerin eşzamanlı olarak propidium iodide ile boyanması sonuçları daha güvenilir
hale getirmektedir [21].
2.4.
Mikrobiyolojide flow sitometri (Flow cytometry in microbiology)
Flow sitometri son yıllarda mikrobiyolojide mikroorganizmaların canlılığını, sayısını, identifikasyonunu ve antibiyotik
duyarlılığını saptamada kullanılmaya başlanmıştır. Malarya türlerini ayırma ve su, toprak ve yiyeceklerde
mikroorganizma tayini bunlar arasında sayılabilmektedir. Flow sitometride virüs çalışmaları da son yıllarda hız
kazanmıştır. Hücresel makromolekül sentezindeki değişiklikler ve viral infeksiyonun ardından oluşan immünolojik
değişiklikler, viral antijen varlığı ve miktar tayini flow sitometri ile tespit edilebilmektedir [22,23].
İlaç alım ölçümleri (drug uptake measurements)
2.5.
Birçok kemoterapötik ajanın etki yeri DNA’dır. Tümör hücrelerinde multi-ilaç rezistansının değerlendirilmesinde de flow
sitometri rol almaktadır. Ayrıca flow sitometri ile ilaçların hücre içine girişini arttıran veya hücreden çıkışını bloke ederek
retansiyonu arttıran ajanların etkilerinin incelenmesi de mümkün olmaktadır [24].
3.
FLOW SİTOMETRİNİN AVANTAJ VE DEZAVANTAJLARI (ADVANTAGES AND
DISADVANTAGES OF FLOW CYTOMETRY)
Güçlü yazılım programlarının bir bileşimi olan flow sitometriler, araştırıcılara geniş hücre toplulukları hakkındaki
verilerin hızlıca toplanmasını ve analizini sağlayan karmaşık metottur. Bu cihazlar ile saniyede 70.000 partikülden
fazlasını işlemek ve her partikül veya hücre başına dokuz floresan renk ve iki yöne saçılan ışık sinyallerini saptamak
mümkündür [25].
Avantajları (Advantages)
3.1.

Teknik, primer inceleme yöntemi olan ışık mikroskobuna göre daha hızlıdır.

Kullanılan problar yardımı ile ileri düzeyde analiz yapmak mümkündür.

Yapılan kalibrasyon ve standartizasyon sonrası hata oranı çok düşüktür.

Flow sitometrinin en önemli özelliği immünfenotipleme yardımı ile çeşitli kombinasyonlar yaparak hücreler
hakkında fiziksel özelliklerin ileri düzeyde tespit edilmesidir.

Cihazlar entegre edilmiş hücre ayırıcılar sayesinde daha ileri analizler için istenilen hücre gruplarının ayrımının
yapılmasıdır.

Çok az sayıdaki neoplastik hücreyi geniş bir hücre popülasyonu içinden saptama imkanı sağlar [26,27].
KAYNAKÇA
[1] D. Demirel. (1995). Flow sitometrik DNA analizinin temel prensipleri. Türk Patoloji Dergisi. 11 (2). Available:
http://www.turkjpath.org/pdf/pdf_TPD_1086.pdf
[2] C.H. Dunphy. (2004). Applications of flow cytometry and immunohistochemistry to diagnostic hematopathology.
Archives
of
Pathology
&
Laboratory
Medicine.
128
(9),
pp.
1004-1022.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15335254
[3] P. Pozarowski, J. Grabarek, Z. Darzynkiewicz. (2004). Flow cytometry of apoptosis. Curr Protoc Cell Biol. 18 (18).
Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18228448
[4] F.E. Craig, K.A. Foon. (2008). Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), pp.
3941-67. Available: http://www.bloodjournal.org/content/111/8/3941?sso-checked=true
[5] U. Güner. (2012). Flow sitometrinin hidrobiyolojide kullanımı. Journal of Fisheriessciences.com. 6 (1), pp. 9-17.
Available: http://uguner.trakya.edu.tr/files/d8-_flow_sitometrinin_hidrobiyolojide_kullan%C4%B1m%C4%B1.pdf
[6] F. Taneli. (2007). Flow sitometri tekniği ve klinik laboratuvarlarda kullanımı. Türk Klinik Biyokimya Dergisi. 5 (2),
pp. 75-82. Available: http://tkb.dergisi.org/pdf/pdf_TKB_89.pdf
[7] Z. Youli, M. Shahjahan, C.C. Chang. (2009). Basic principles of flow cytometry. basic concepts of molecular
pathology.
Molecular
Pathology
Library.
2,
pp.
139-146.
Available:
http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-0-387-89626-7_15
[8] H. Daniel. A Review and Applications of Flow Cytometry. Department of Chemistry, University of Illinois at UrbanaChampaign.
2004.
Available:
http://www.researchgate.net/publication/267193958_A_Review_and_Applications_of_Flow_Cytometry
[9] M. Brown, C. Wittwer. (2000). Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin. Chem. 46,
pp.1221–1229. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10926916
[10] S.F. Ibrahim, G.V.D. Engh. (2007). Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Engin/Biotechnol. 106, pp. 19–
39. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17728993
[11] L.A. Herzenberg, D. Parks, B. Sahaf, O. Perez, M. Roederer. (2002). The history and future of the fluorescence
activated cell sorter and flow cytometry: a view from stanford. Clin. Chem. 48, pp. 1819–1827. Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12324512
[12] M. Rahman. Introduction to flow cytometry. Serotec Ltd. Oxford (UK). Published by Serotec Ltd. 2006. Available:
https://static.abdserotec.com/Lit-pdfs/Brochures1/flowcytometry.pdf
[13] B.H.
Villas.
(1998).
Flow
cytometry:
an
overview.
Cell
Vis.
5,
pp.
56-61.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9660728
[14] A.S. Rose, K.S. Knox. (2007). Bronchoalveolar lavage as a research tool. Semin Respir Crit Care Med. 28 (5), pp.
561-73. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17975783
[15] E. Matteucci, O. Giampietro. (2008). Flow cytometry study of leukocyte function: analytical comparison of methods
and
their
applicability
to
clinical
research.
Curr
Med
Chem.
15
(6),
pp.
596-603.
Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18336274
[16] H.R. Hulett, W.A. Bonner, R.G. Sweet, L.A. Herzenberg. (1973). Development and application of a rapid cell sorter.
Clin Chem. 19 (8), pp. 813-6. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4200173
[17] G. Yanıkkaya Demirel, G. Deniz, E. Ekşioğlu Demiralp. (2010). Lenfosit immünofenotiplemesi için kılavuz bilgiler.
Türk
İmmünoloji
Derneği
Akan
Hücre
Ölçer
Alt
Grubu.
pp.
1-19.
Available:
http://www.turkimmunoloji.org.tr/dokumanlar/Lenfosit_Imm%C3%BCnfenotiplemesi_Kilavuz_Bilgiler_TID_201
0.pdf
[18] E.G. van Lochem, V.H.J. van der Velden, H.K. Wind, J.G. te Marvelde, N.A.C. Westerdaal, J.J.M. van Dongen.
(2004). Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: reference
patterns for age-related changesand disease-ınduced shifts cytometry. Clinical Cytometry, 60B, pp. 1–13. Available:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15221864
A. Ocmant, Y. Peignois, S. Mulier, L. Hanssens, A. Michils, L. Schanden. (2007). Flow cytometry for basophil
activation markers: the measurement of CD203c up-regulation is as reliable as CD63 expression in the diagnosis of
cat allergy. J Immunol Methods. 30(320), pp. 40-8. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17275019
[19] J.E. Martinez, J.R. Beck, W.C. Allsbrook, C.G. Pantazis. (1990). Flow cytometric DNA analysis. Clinical Laboratory
Science. 3, pp. 180-183. Available: http://europepmc.org/abstract/med/10149039
[20] G. Deniz, M.T. Yılmaz, G. Yıllar. Flow sitometri ve tıpta kullanımı. Bilmedya grup, 2004.
[21] B. Barlogie, W. Godhe, D.A. Johnston, L. Smallwood, J. Schumann, B. Drewinko. (1978). Determinaton of ploidy
and proliferative characteristics of human solid tumors by pulse cytophotometry. Cancer Res. 38, pp. 3333-3339.
Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/688223
[22] W. Knapp, H. Strobl, O. Mojdic. (1994). Flow cytometric analysis of the cell surface and intracellular antigens in
leukemia
diagnosis.
Cytometry.
18,
pp.
187.
Available:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.990180402/pdf
[23] M. Macey. Flow cytometry clinical applications. Blackwell scientific publications, chapter 2, 1994. Available:
http://link.springer.com/book/10.1007/978-1-59745-451-3
[24] G. Erten, G. Yanıkkaya Demirel, G. Deniz. Akan hücre ölçer ve uygulama alanları. Medya tower tanıtım ve
yayıncılık hizmetleri, 2009.
[25] S. Langsrud, G. Sundheim. (2000). Flow cytometry for rapid assessment of bacterical viability. International
Biodeterioration
&
Biodegradation.
36(3),
pp.
467-467.
Available:
https://www.infona.pl/resource/bwmeta1.element.elsevier-54473fe6-2a96-3785-856c-d8060c23be6d
[26] A.K. Azkur, M.E. Aslan. (2012). Akış sitometri ve veteriner hekimlikteki uygulamaları. Atatürk Üniversitesi
Veteriner
Bilimleri
Dergisi.
7(1),
pp.
59-66.
Available:
http://e-
dergi.atauni.edu.tr/ataunivbd/article/view/1020007578
[27] K. Dalva, Z. Gülbaş. (2005). Akım sitometri uygulamaları. Türk Hematoloji Derneği Moleküler Hematoloji. pp. 4452. Available: http://www.thd.org.tr/thdData/userfiles/file/klaradalva.pdf