2. DERS_Hucre inceleme Tek.pptx
advertisement
Doç. Dr. Metin Aytekin metin.aytekin@gmail.com www.metinaytekin.com Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı • Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) Hücre (cellula) terimi 1650’li yıllarda Robert Hooke tarafından mantar kesitinden tanımlanmıştır. Hücrenin yapısını ve fonksiyonlarını inceleyen bilim dalının adı sitoloji’dir. Hücre yaşamın en basit yapıtaşıdır. Robert Hooke’un mikroskopunun kendi çizimi Robert Hooke canlı bitki dokularındada kesitler alıp incelemiş, hücre çeperinin iç kısmının sıvı ile dolu olduğunu gözlemlemiş ancak önemini kavrayamamıştır. R. Hooke’un ortaya attığı hücre teorisi basit de olsa çok önemlidir. Kendisinden sonra gelen bilim insanlarının katkısı ile daha ayrıntılı bilgiler ortaya çıkarılmıştır: 1831-Robert Brown-İngiliz Botanikçi: nükleusun keşfi 1839-Purkinje-Alman Fizyolog-çeperin iç kısmını oluşturan sıvıya protoplazma adını verir. (Jan Evangelista Purkyně) 1852’de Remak & 1880’de Fleming: hücre bölünmesini (amitoz & mitoz) incelemişlerdir. 1862-Kolliker-İsviçreli Biyolognükleusun etrafını çeviren protoplazma kısmına sitoplazma adını vermiştir. 1887 - Boveri- sentrozom 1897 - Benda- mitokondri 1898 - Golgi- Golgi Kompleksi 1899 - Garnier-Endoplazmik retikulum (E.R.) 1905 - Farmer & Moore- mayoz bölünme 1944 – Avery & McCarty, Griffts – Genetik etkileşim DNA tarafından olur 1953- Watson & Crick: DNA’nın çift sarmal yapısı Canlıların en küçük yapısal birimi olan hücre, tüm biyokimyasal ve fizyolojik faaliyetlerin gerçekleştiği yerdir. Hücreler, kendi kendilerine çoğalabilirler, dışarıdan uyarılar alabilir ve bu uyarılara cevap verebilirler. Tüm karmaşık faaliyetler hücrede gerçekleşir. Hücre, canlıların - yapısal birimidir - fonksiyonel birimidir - büyüme (çoğalma) ve - kalıtsal birimidir. 1. Hücreyi bir bütün olarak inceleyen teknikler 2. Hücreyi alt bileşenlerine ayırarak inceleyen teknikler Hücreleri tüm bir bütün olarak inceleyen teknikler üç başlık halinde toplanmaktadır; 1. Tespit (fiksasyonla) ederek inceleme 2. Canlı (vital) inceleme 3. Hücre kültürleri Tespit (fiksasyonla) ederek inceleme Işık mikroskobu: Işık mikroskoplarında ışık kaynağı olarak görünür dalga boyundaki ışınlar kullanılmaktadır. Görünür ışığın dalga boyu 400nm-700nm arasındadır. Işık mikroskobunda genellikle 500nm dalga boyu kullanılmaktadır. Mekanik kısım; mikroskop ayağı, mikroskop gövdesi, mikro ve makro ayar düzeyi, ve tabla kısmından oluşur. Optik kısım; mekanik kısım üzerine monte edilmiş, görüntünün alınıp incelenmesini sağlayan kısımdır. Oküler, tüp (mono, di, trinoküler), objektif, kondansatör ve ışık kaynağından oluşur. Işık kaynağından gelen ışınlar kondansatör sayesinde, obje tablası üzerinde bulunan cisme ışık konisi şeklinde gelir. Cisimden yine bir ışık konisi şeklinde yayılan ışınlar objektife toplanarak oküler yardımı ile göze ulaşır. Bir mikroskobun en önemli özelliği ayırma gücüdür (resonans, resolution). Bir obje ne kadar büyütülürse büyüsün bu büyütmeler hücrelerin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini sağlamaz. Bu nedenle ayırma gücü önemlidir. Ayırma gücü: Yana yana duran iki nesneyi net olarak seçebilme yeteneğidir. Işınların oluşturduğu koninin tepe açısı θ ile gösterildiğinde ayırma gücü şu formülle hesaplanır. d= 0.61 λ n Sinθ d= ayırma gücü, λ= kullanılan ışığın dalga boyu, θ= tepe açısı, n= objektif ile cisim arasında bulunan ortamın kırma indisi. Objektifin cisme yaklaştırılması tepe açısının büyümesine, dolayısıyla ayırma gücünün azalmasına, diğer bir deyimle görüntünün büyümesine neden olur. Kırma indisi hava için=1, immersiyon yağı için=1.5 olarak kabul edilir dolayısıyla görüntünün netliği 1.5 kat artar fakat ayırma gücü de 1.5 kat azalır. Normal ışık mikroskopları ile birbirine 0.2 µm’den daha yakın olan ya da boyu 0.2 µm’den küçük olan cisimler ayırt edilemezler. Günümüz ışık mikroskopları hücreleri ancak 1000 kez büyütme kapasitesine sahiptir. Işık mikroskobu ile hücrelerin belirli bölgeleri ayırt edilebilir, hücrelerin detaylı yapısı incelenemez. Floresan maddeler belirli dalga boyundaki ışığı absorbe ederler ve uyarıldıkları zamanda daha uzun dalga boyunda absorbe ettikleri ışığı tekrar yayarlar. Bu özellikten yararlanılarak çeşitli floresan boyalarla boyanmış cisimleri incelemek için floresan mikroskoplar geliştirilmiştir. Floresan mikroskopta 0.1 µm’ye kadar olan cisimler incelenebilmektedir. Floresan mikroskopta ışık mikroskobu ile aynı yapıda olup, ışık kaynağı ve bazı optik parçaları ışık mikroskobundan farklıdır. • Işın kaynağı olarak UV (mor ötesi) ışınlar kullanılır. • UV dalga boyunda ışın veren civa buharlı ampüller kullanılır. • Mikroskobun optik kısımları UV’yi absorbe etmeyen quartz’dan yapılmıştır. • Floresan mikroskoplarda kullanılan ışığın dalga boyunu seçmeye yarayan özel filtreler olan 2 filtre bulunur. Bu filtrelerden 1.’si kaynaktan gelen ışığı tutar ve sadece cismin boyandığı floresan boyanın absorbe edebileceği ışınları geçirebilir. 2. filtre ise cisimden yansıyan ışınların çevreye yayılmasını engeller ve cisimden gelen daha yüksek dalga boyundaki ışınları geçirir. Floresan mikroskoplar, moleküllerin hücre içindeki dağılımlarını tespit etmek için kullanılırlar. Spesifik gen bölgeleri, RNA transkriptlerinin ve hedef proteinin yerini saptamak için kullanılır. RNA ve Gen bölgelerini saptamak için floresanla işaretlenmiş problar, proteinleri saptamak için işaretlenmiş antikorlar kullanılır. Normal ışık mikroskoplarına ışığı polarize edici iki levha veya prizma yerleştirilmesiyle elde oluşturulmuş bir mikroskoptur. Bu levhalardan biri polarlayıcı olup, ışın kaynağından gelen ışığı polarize ederek cisme yollar. Diğer levha ise çözümleyici olup, objektif veya okülerin hemen üzerine konur. Çözümleyici kendi etrafında 360 derece çevrildiğinde mikroskop alanı her 180 derecede bir bir karanlık bir aydınlık olarak görünür. Polarizasyon mikroskobu, mikroskobun ayırma gücünü artırmaz sadece kontrastı artırarak belirli cisimlerin daha iyi görünmesini sağlar. X-ışınları Mikroskobu • 1nm’den daha küçük atom ve moleküllerin yapılarının incelenmesi için kullanılan bir mikroskoptur. • Bu mikroskobun mekanizması, küçük moleküllere Xışınlarının yol değiştirmesi prensibine dayanır. • Bu sistemde elde edilen cismin görüntüsü değil, o cismin yapısal özelliğini gösteren çeşitli konsantrik noktalar veya çizgilerdir. X-ışınları Mikroskobu • Elektronik mercekler sayesinde, bir kaynaktan çıkan X ışınları cismin üzerine düşürülür. • Cisimden çıkan X ışınları bir fotoğraf plağına veya floresan bir ekran üzerine düşürülür. Sonuçta X ışınları kırınım mikrografları elde edilir. • B u m i g r o g r a f l a r d a o r t a y a ç ı k a n konsantrik noktalar veya çizgiler değerlendirilerek o molekülün yapısı ortaya çıkar. Elektron Mikroskobu • Elektronlar kullanılarak ayırma gücünün azaltılabileceği, yine elektronların hızları artırılarak dalga boylarının kısaltılabileceği prensibine dayalı olarak geliştirilmiştir. • Elektronların dalga boyları 0.004 nm’ye kadar indirilebilmektedir. • Işık mikroskobu ile hücrelerin detaylı olarak incelenmesi mümkün değildir. Elektron Mikroskobu • Bu sebeplerden dolayı elektron mikroskobu geliştirilmiştir. • Elektron mikroskobunda kullanılan elektronlar ışık dalga boyuna göre çok kısa olduğu için elektron mikroskobu hücrelerin detaylı olarak incelenmesini sağlamaktadır. İki tip elektron mikroskobu vardır. 1- Scanning (Tarama) elektron mikroskobu (SEM) 2- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) Transmission elektron mikroskobu (TEM) • Elektron kaynağı silindir şeklindeki bir kolona yerleştirilmiştir. • Silindirin havası boşaltılarak bir vakum oluşturulur. • Hızlandırılmış elektronlar bir elektron demeti halinde vakumlu silindirden geçerler. • Silindir içerisine belirli aralıklarla yerleştirilmiş olan metal bobinler, tıpkı cam mercekler gibi elektron demetini odaklar. Transmission elektron mikroskobu (TEM) • İncelenecek cisimlerde elektron demetine denk gelecek şekilde vakumlu silindir içerisine yerleştirilir. • Örnekten gelen elektronların bir kısmı cismin yoğunluğuna bağlı olarak dağılırken, geride kalan elektronların bir ekran veya fotoğraf plağı üzerine odaklanması sağlanarak görüntü oluşturmaları sağlanır. • TEM ile incelenen doku veya hücrelerin iki boyutlu görüntüleri elde edilir ve hücrelerin ayrıntılı incelenmesine olanak sağlar. Scanning (Tarama) elektron mikroskobu (SEM) • İncelen hücre veya dokunun üç boyutlu görüntüsü elde edilir, fakat ayrıntılı olarak incelenmesini sağlamaz. • Görüntü için elektronlar kullanılır. • Fakat bu elektronlar örneğin içerisinden geçmez, örneğin yüzeyinden dağılırlar. Bu nedenle bu incelemede, fiksasyon işleminden sonra örnek çok ince bir şekilde ağır bir metalle kaplanır. • Sonuçta inceleme sırasında ağır metalden yansıyan elektronlar cismin dış yapısının üç boyutlu yapısını gösterir. Canlı (vital) İnceleme Faz-Kontrast Mikroskop Işık mikroskobuna bazı optik parçalar ilave edilerek hücrenin çeşitli kısımlarından geçen ışık şiddetleri arasındaki fark artırılabilir. Bu şekilde oluşturulan mikroskoplara faz-kontrast mikroskop denir. Faz-Kontrast Mikroskop Bu mikroskoplar, mikroskobun ayırma gücünü artırmaz, sadece hücrenin çeşitli kısımları arasındaki kontrastı artırır. Bu yöntemin avantajı, canlı hücrelerin iç yapılarının hücreye zarar vermeden ve herhangi bir boyama işlemi yapılmadan incelenmesini sağlamasıdır. İnterferans Mikroskobu Bu mikroskobun prensibi de faz-kontrast mikroskobu ile aynıdır. Sadece bu mikroskopta kondansatör önüne çift kırma özelliğine sahip kalsit veya quartz levhalar yerleştirilir. Bu levhalardan ışın iki ışık demeti halinde çıkar. Bu ışınlardan biri incelenen cisimden diğeri cismin etrafından geçer. Bu iki ışın birbirine düşürüldüğünde cisimden geçen ışın biraz geciktirilmiş olduğundan ışınlar arasında faz farkı olur. Sonuçta bu preparatlarda kabartma şeklinde görüntü oluşur. Karanlık Alan Mikroskobu Işık mikroskobuna özel bir kondansatörün takılması ile oluşturulmuştur. Bu kondansatör tüm ışınların cisme yandan gelmesini ve yansıyarak göze ulaşmasını sağlar. Cismi aydınlatıcı ışınlar yan taftan yöneldiği için karanlık bir alanda ışığın dağılmış olduğu farklı fazlar arasındaki sınır parlak görülür. Karanlık alan Işık mikroskobu Faz kontrast The Cell: A Molecular Approach, (5th Ed), Cooper & Hausman, Sinauer, 2009. Molecular Biology of the Cell (5th Ed), Alberts et al., Garland, 2007. Molecular Cell Biology , (6th Ed), Lodish et al.,Freeman, 2007. Tıbbi Biyoloji ve Genetik, H. Kasap (Ed), Nobel Yayınevi, 2010. Moleküler Hücre Biyolojisi, H.V. Güneş, Kaan Kitabevi, 2006. Hücre, Moleküler Yaklaşım. Cooper & Hausman. 3. Baskının Çevirisi (Sakızlı & Atabey), İzmir Tıp Kitabevi, 2006. Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ders Notları, Demirtaş H. Erciyes Üniv. Yayınları, 1996. Tıbbi Biyoloji ve Genetik, Fulya Teksen, Ankara Univ. Yayınları, 2006. Hücrenin Moleküler Biyolojisi, Alberts ve ark., 4. Baskı çevirisi, TUBA, 2008. Online kaynaklar (konu içinde kaynaklara gerekli atıflar yapılır) Ve diğer kaynaklar.
