BK XVIII. Ulusal Kimya Kongresi, Kars, 2004 KALIN BAĞIRSAKTAN SİTOZOLİK KARBONİK ANHİDRAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU 1 2 Fatma Coşkun , Yaşar Demir , Nazan Demir 1 1 Atatürk Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, Erzurum 2 Atatürk Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Kimya Bölümü, Erzurum +2 Karbonik anhidraz (CA), (E.C:4.2.1.1. karbonat hidroliyaz) Zn iyonu ihtiva eden metalo enzimlerden ilk bulunanı olup, hücrelerde CO2 hidrasyonu veya HCO3 ’ın dehidrasyonu reaksiyonunu katalizlemektedir. Sindirim sisteminde görev alan mide, ince bağırsak ve kalın bağırsakta CA’nın varlığı ve dağılımı Hansson’un histokimyasal metodu ile belirlenmiştir1. İmmunohistokimyasal yöntemlerle karbonik anhidrazın distal ince ve kalın bağırsağın epitel plazma membranlarının apikal yüzeylerde yerleştiği bulunmuştur. Bağırsak epitelinde CA-IV’ün bölgesel ve hücresel yerleşimi, sindirim sistemi CA’sı için önerilen fizyolojik roller ile uyum göstermektedir. Aktif CA, kalın bağırsak ve ileum’da su ve iyon transferine katılmaktadır. İnce bağırsağın duodenum ve jejunum mukozası daha az yoğunlukta CA içeriyorken, ince bağırsağın cecum ve kalın bağırsağın kolon’undaki bezlerin üst kısımlarında ve epitel hücre yüzeylerinde çok miktarda sitoplazmik karbonik anhidraz bulunmuştur1,2. Bu çalışmada sığır kalın bağırsağından sitozolik CA enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla fizyolojik serum içerisine alınmış olan kalın bağırsaklar izotonik çözelti ile iyice yıkandı. Yıkanmış ve eritrositlerden tamamen arındırılmış olan kalın bağırsak dokusu bıçakla küçük parçalara ayrıldıktan sonra, 1 M KCl çözeltisi içerisine alınıp, vortex’te karıştırıldı. Ardından soğutmalı santrifüjde santrifüj edildi. Süzgeç kağıdından süzülerek süpernatant ile çökelek ayrıldı. Buradan elde edilen çökelek 0.05 M Tris-SO4 (pH:7.4) tamponu içerisine alındı ve ultrasonik dismembratörde ultrasonik ses dalgalarına maruz bırakıldı. Santrifüj edildikten sonra süzülerek süpernatant ve çökelek ayrıldı. Sitozolik karbonik anhidraz eldesi için hazırlanan homojenat afinite kolonuna tatbik edilerek enzim saflaştırıldı. Kalın bağırsağın doğal ortamında mevcut yağlar kromatoğrafi öncesi CCl4 ile ekstrakte edildi. Enzimin saflığının kontrolü %3-10 SDS-PAGE ile yapıldı. Enzimin aktif olduğu pH aralığı ve optimum pH’sı belirlendi. Ayrıca enzimin aktivite o gösterdiği sıcaklık aralığı 5-65 C olarak ölçüldü ve maksimum aktivite gösterdiği sıcaklıkta belirlendi. Enzimin Vmax ve KM değerleri, molekül ağırlığı belirlendi ve karbonik anhidrazın bilinen inhibitörlerine karşı davranışları araştırıldı. Sonuç olarak sığır kalın bağırsağından sitozolik karbonik anhidraz enzimi saflaştırılıp karakterize edildi. Elde edilen sonuçlar diğer CA izoenzimleriyle karşılaştırılarak tartışıldı. Kaynaklar 1. Hansson, H.P.J. (1967), Histochemie. 11, 112-128. 2. Sugai, N., Ito, S. (1980), J. Histochem. Cytochem. 28:511-525. 458 KimyaKongreleri.org