Meme kanseri tedavisinde paklitaksel yüklü polikatyonik ve anyonik

MEME KANSERİ TEDAVİSİNDE PAKLİTAKSEL YÜKLÜ
POLİKATYONİK VE ANYONİK SİKLODEKSTRİN
NANOKÜRE FORMÜLASYONU VE IN VİTRO
DEĞERLENDİRİLMESİ
FORMULATION OF PACLITAXEL LOADED
POLYCATIONIC AND ANIONIC CYCLODEXTRIN
NANOSPHERE FOR BREAST CANCER TREATMENT AND
IN VITRO EVALUATION
GAMZE IŞIK
Hacettepe Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim – Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin
NANOTEKNOLOJİ ve NANOTIP Anabilim Dalı İçin Öngördüğü
YÜKSEK LİSANS TEZİ
olarak hazırlanmıştır.
2013
Annem’e
Meme Kanseri Tedavisinde Paklitaksel Yüklü Polikatyonik ve Anyonik
Siklodekstrin Nanoküre Formülasyonu ve In vitro Değerlendirilmesi
Gamze Işık
ÖZ
Paklitaksel (PCX), meme kanserinde kullanılan, suda çözünürlüğü çok düşük ve
stabilite sorunu olan bir antikanser ajandır. Bu nedenle ticari formülasyonlarında
Cremophor® EL kullanılmaktadır. Bu sistemin nörotoksisite ve nöropati gibi ciddi
yan etkileri vardır. Amfifilik siklodekstrinler kendiliğinden nanopartikül oluşturabilme
yeteneğine sahip moleküllerdir. Bu özelliklerinden dolayı nano ölçekte ilaç taşıyıcı
sistem olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı farklı yüzey yüküne sahip
amfifilik CD türevlerinden hazırlanan nanokürelerin in vitro özelliklerinin, hücresel
etkileşiminin ve ilaç taşıma potansiyellerinin yanısıra yeni sentezlenen polikatyonik
βCDC6’nın nanopartikül eksipiyanı olarak etkinliğinin ve güvenilirliğinin literatürde
ilk kez belirlenmesi ve PCX’in bu nanokürelerde stabil olarak enkapsüle
edilmesidir. Negatif yüklü 6-O-CAPRO-β-CD nanoküre, pozitif yüklü kitosan kaplı
6-O-CAPRO-β-CD nanoküre ve βCDC6 nanoküre hazırlanarak; partikül büyüklüğü
dağılımı, zeta potansiyel değeri, ilaç yükleme etkinliği ve in vitro salım profilleri
belirlenerek formülasyonlar birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Farklı parametrelerle
polikatyonik βCDC6 nanoküreler hazırlanmıştır. Uygun partikül büyüklüğü
(<200nm) ile farklı yüzey yüküne sahip nanoküreler elde edilmiştir. Boş
nanokürelerin 12 ay boyunca stabil kaldıkları gözlenmiştir. Pozitif yüklü
nanoküreler, daha yüksek ilaç yükleme etkinliği göstermiştir. PCX yüklü
nanoküreler 30 gün boyunca fiziksel stabilitelerini korudukları gözlenmiştir. Boş
nanokürelerin L-929 hücrelerinde toksik etki göstermedikleri belirtilmiştir. Bununla
birlikte PCX yüklü nanoküreler MCF-7 hücrelerinde PCX solüsyonuna göre daha
fazla antikanser etkinlik göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Paklitaksel, amfifilik siklodekstrin, polikatyonik, anyonik,
nanoküre, formülasyon geliştirme, stabilite, yükleme etkinliği, salım, antitümöral
etkinlik, meme kanseri
Danışman: Doç.Dr. Erem Bilensoy, Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi,
Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı
i
Formulation of Paclitaxel Loaded Polycationic and Anionic Cyclodextrin
Nanosphere for Breast Cancer Treatment and in vitro Evaluation
Gamze Işık
ABSTRACT
Paclitaxel (PCX) is a well-known anti-cancer agent that has poor water solubility
and poor stability displaying cytotoxic activity against breast cancer. The
commercial formulation contains Cremophor® EL. However this vehicle causes
severe side effects such as
neurotoxicity
and
neuropathy.
Amphiphilic
cyclodextrins have the ability to form self-organizing nanoparticles spontaneously.
Due to their properties they have been used for the development of drug delivery
systems in nanoscale. The aim of this study was to determine the effect of in vitro
properties of amphiphilic CD nanospheres with different surface charges on
cellular interaction
and drug loading capacity as novel polycationic βCDC6
nanoparticle excipient, safety and efficacy and encapsulation of PCX stable
physically. Negatively charged 6-O-CAPRO-β-CD, pozitively charged chitosan
coated 6-O-CAPRO-β-CD and polycationic βCDC6 nanospheres were formulated.
Mean particle diameter, zeta potential, drug loading and in vitro drug release
profiles were determined and compared with each other. According to different
parameters polycationic
β-CDC6 nanospheres were prepared and in vitro
characterization was performed. With the appropriate mean particle size(<200nm)
different surface charged nanospheres were observed. Blank nanoparticles
maintained their stability for 12 months. Positively charged nanoparticles displayed
higher drug loading capacity. PCX loaded nanospheres maintained their stability
for 30 days. Blank nanospheres have no cytotoxic effect against L-929 cells. In
addition, PCX loaded nanospheres have higher anticancer effect when compared
with the PCX solution against MCF-7 cells.
Keywords: Paclitaxel, amphiphilic cyclodextrin, polycationic, anionic, nanosphere,
formulation development, stability, loading, release, antitumoral efficacy,breast
cancer
Advisor: Assoc. Prof. Erem Bilensoy, Hacettepe University, Faculty of Pharmacy,
Department of Pharmaceutical Technology
ii
TEŞEKKÜR
Bu tez çalışması boyunca tüm bilgilerini ve imkânlarını bana cömertçe sunan ve
yol gösteren saygıdeğer hocam Doç. Dr. Erem Bilensoy’a,
Hücre kültürü çalışmalarındaki desteklerinden dolayı sayın Prof.Dr. İmran Vural ve
sayın Dr. Can Sarısözen’e
Yol gösterici tavsiyeleri ve yardımları için Ecz.(B.U.) Nazlı Erdoğar’a
Her anımda yanında dostlukları ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemedikleri için
Bio. Cem Varan ve Kim.Öğr. Hale Ünal’a
Eczacılık Teknolojisi Bölümü’ndeki değerli hocalarıma, idari personelimize ve
teknisyenlerimize
Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı başkanı sayın Prof. Dr. Süleyman Ali
Tuncel ve değerli hocam Prof. Dr. Emir Baki Denkbaş ile araştırma görevlilerine
değerli katkılarından dolayı teşekkürlerimi sunarım.
Son olarak hayatımın her aşamasında yanımda olan ve bana verdikleri sonsuz
manevi destek ve sevgileri için çok değerli anneme, babama ve kardeşlerime
teşekkürü bir borç bilirim.
iii
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
Sayfa
ÖZ ............................................................................................................................ i
ABSTRACT ............................................................................................................. ii
TEŞEKKÜR ............................................................................................................ iii
İÇİNDEKİLER DİZİNİ ............................................................................................. iv
ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................. viii
ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... x
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ .................................................................. xi
1. GİRİŞ ve AMAÇ ................................................................................................. 1
2.
GENEL BİLGİLER ........................................................................................... 3
2.1.
Meme Anatomisi ve Fizyolojisi ................................................................. 3
2.2.
Kanser...................................................................................................... 5
2.2.1.
Kanser Hücresinin Gelişimi .................................................................. 5
2.2.2.
Meme Kanseri ...................................................................................... 6
2.2.2.1. Epidemiyolojisi ...................................................................................... 7
2.2.2.2. Etiyolojisi .............................................................................................. 7
2.2.2.3. Sınıflandırma ........................................................................................ 9
2.2.2.4. Tanı Yöntemleri .................................................................................. 10
2.2.2.4.1. Görüntüleme Yöntemleri ................................................................. 10
2.2.2.4.2. Biyopsi Yöntemleri .......................................................................... 10
2.2.2.5. Tedavi Yöntemleri............................................................................... 11
2.2.2.5.1. Cerrahi Yöntem ............................................................................... 11
2.2.2.5.2. Radyoterapi .................................................................................... 11
2.2.2.5.3. Hormonoterapi ................................................................................ 11
2.2.2.5.4. Kemoterapi ..................................................................................... 12
2.3.
Paklitaksel .............................................................................................. 13
2.3.1.
Paklitakselin Tarihsel Gelişimi ............................................................ 13
2.3.2.
Fizikokimyasal Özellikleri .................................................................... 15
2.3.3.
Farmakokinetik Özellikleri ................................................................... 16
2.3.4.
Farmakolojik Özellikler ve Etki Mekanizması ...................................... 16
2.3.5.
Klinik Uygulamada Karşılaşılan Problemler ........................................ 18
2.3.6.
Alternatif Formülasyon Yaklaşımları ................................................... 20
2.4.
Siklodekstrin ........................................................................................... 24
2.4.1.
Siklodekstrinlerin Tarihsel Gelişimi ..................................................... 25
2.4.2.
Doğal Siklodekstrinler ......................................................................... 25
iv
2.4.3.
Siklodekstrin Türevleri ........................................................................ 27
2.4.4.
Amfifilik Siklodekstrinler ...................................................................... 30
2.4.4.1. Noniyonik Amfifilik Siklodekstrinler ..................................................... 31
2.4.4.2. Katyonik Amfifilik Siklodekstrinler ....................................................... 31
2.4.4.3. Anyonik Amfifilik Siklodekstrinler .......................................................... 32
2.4.5.
Siklodekstrin: İlaç İnklüzyon Kompleksi .............................................. 33
2.4.6. Siklodekstrinlerin Farmasötik Uygulama Alanları ................................... 34
2.4.7.
2.5.
Siklodekstrin İçeren Ticari Formülasyonlar ......................................... 38
Nanoteknoloji ......................................................................................... 39
2.5.1.
Nanoonkoloji ....................................................................................... 40
2.5.2.
Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemler ................................................ 43
2.5.2.1. Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Avantajları............................ 43
2.5.2.2. Hedeflendirme .................................................................................... 43
2.5.2.2.1. Pasif Hedeflendirme........................................................................ 44
2.5.2.2.2. Aktif Hedeflendirme......................................................................... 44
2.5.2.3. Nanokapsül ve Nanoküre ................................................................... 45
2.5.2.4. Nanopartikül Hazırlama Yöntemleri .................................................... 46
2.5.2.4.1. Önceden oluşturulmuş polimerin dispersiyonu ............................... 46
2.5.2.4.1.1.
Emülsiyon bazlı yöntemler ......................................................... 46
2.5.2.4.1.2.
Nanopresipitasyon ..................................................................... 48
2.5.2.4.1.3.
Koaservasyon ............................................................................ 49
2.5.2.4.1.4.
Püskürterek Kurutma/Püskürterek Dondurma ............................ 49
2.5.2.4.1.5.
Süperkritik Sıvı Teknolojisi ......................................................... 50
2.5.2.4.2. Monomerlerin Polimerizasyonuna Dayanan Yöntemler .................. 50
3.
2.5.2.4.2.1.
Emülsiyon polimerizasyon yöntemi ............................................ 50
2.5.2.4.2.2.
Dispersiyon Polimerizasyon ....................................................... 50
GEREÇ VE YÖNTEM .................................................................................... 51
3.1.
Araçlar ve Gereçler ................................................................................ 51
3.1.1. Kimyasal Maddeler................................................................................. 51
3.1.2.
Biyolojik Materyal................................................................................ 52
3.1.3.
Aletler ................................................................................................. 53
3.2.
Yöntemler ve Deneyler........................................................................... 54
3.2.1. Siklodekstrin Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ...................................... 54
3.2.2. Boş Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması ...................................... 57
3.2.3. Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu.......................... 58
3.2.3.1. Partikül Büyüklüğü Analizi .................................................................. 58
3.2.3.2. Zeta Potansiyel Ölçümü ..................................................................... 58
v
3.2.3.3. Uzun Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları ........................................... 59
3.2.3.4. Taramalı Elektron Mikroskopu (SEM) ................................................. 59
3.2.4. Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu .... 59
3.2.4.1. Analitik Yöntem Validasyonu .............................................................. 60
3.2.4.1.1. Kalibrasyon ..................................................................................... 60
3.2.4.1.2. Doğrusallık ...................................................................................... 60
3.2.4.1.3. Doğruluk ......................................................................................... 60
3.2.4.1.4. Kesinlik ........................................................................................... 61
3.2.4.1.5. Duyarlılık ......................................................................................... 61
3.2.4.1.6. Özgünlük ......................................................................................... 62
3.2.5. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması ................. 62
3.2.6. İlaç Yüklü Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu ......... 62
3.2.6.1. Partikül Büyüklüğü Analizi .................................................................. 62
3.2.6.2. Zeta Potansiyel Ölçümü ..................................................................... 63
3.2.6.3. Kısa Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları ............................................ 63
3.2.7. İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi .................................................... 63
3.2.8. Nanopartiküllerden Paklitakselin In Vitro Salım Profilinin Belirlenmesi... 64
3.2.9. Paklitakselin Dilüsyon Testi .................................................................... 64
4.
3.2.10.
Boş Nanopartiküllerin in vitro Güvenilirlik Testi ................................... 64
3.2.11.
Paklitaksel Yüklü Nanopartiküllerin in vitro Etkinlik Testi .................... 65
BULGULAR ................................................................................................... 66
4.1.
Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları ........ 66
4.2.
Siklodektrin Nanokürelerin Karakterizasyonu ......................................... 68
4.2.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı ................................................................... 68
4.2.2. Zeta Potansiyeli ..................................................................................... 69
4.2.3. Uzun Süreli Stabilite Testi ...................................................................... 69
4.2.4. SEM Görüntüleri .................................................................................... 72
4.3.
Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu .... 73
4.4.
Analitik Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular ........................................ 73
4.4.1. Kalibrasyon Denklemine Ait Bulgular ..................................................... 73
4.4.2. Doğrusallık ............................................................................................. 74
4.4.3. Doğruluk ................................................................................................. 74
4.4.4. Kesinlik ................................................................................................... 75
4.4.5. Duyarlılık ................................................................................................ 76
4.4.6. Özgünlük ................................................................................................ 77
4.5. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonuna Ait
Bulgular ............................................................................................................. 79
vi
4.5.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı ................................................................... 79
4.5.2. Zeta Potansiyeli ..................................................................................... 79
4.5.3. Kısa Süreli Stabilite Testi ....................................................................... 80
4.6.
İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi .................................................... 82
4.7.
Paklitaksel Dilüsyon Testi ...................................................................... 82
4.8.
İlaç Salım Profilinin Belirlenmesi ............................................................ 83
4.9. Boş Siklodekstrin Nanopartiküllerin Güvenilirlik Çalışması ........................ 84
4.10. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanopartiküllerin Etkinlik Çalışması ........ 84
5.TARTIŞMA ..................................................................................................... 85
5.1.
Amfifilik β-Siklodekstrin Türevleri ........................................................... 85
5.2.
Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları ........ 86
5.3.
Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu.......................... 88
5.3.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı ................................................................... 88
5.3.2. Zeta Potansiyel ...................................................................................... 89
5.3.3. SEM Görüntüleri .................................................................................... 90
5.3.4. Uzun Süreli Stabilite ............................................................................... 90
5.4.
Paklitaksel’in Analitik Yöntem Validasyonu ............................................ 91
5.5.
Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu ........... 92
5.5.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı ................................................................... 92
5.5.2. Zeta Potansiyeli ..................................................................................... 93
5.5.3. Kısa Dönemli Stabilite ............................................................................ 93
5.6.
İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi .................................................... 94
5.7.
İn-vitro Salım Çalışmaları ....................................................................... 95
5.8.
Paklitakselin Dilüsyon Çalışması............................................................ 96
5.9.
Boş Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin in vitro Güvenilirlik Çalışması 96
5.10. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Etkinlik Çalışması .......... 97
6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ............................................................................ 98
KAYNAKLAR DİZİNİ .......................................................................................... 100
EKLER ............................................................................................................... 120
ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………………..130
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1. Memenin anatomik yapısı ....................................................................... 3
Şekil 2.2. Memenin arterleri .................................................................................... 4
Şekil 2.3. Memenin lenfatik sistemi ........................................................................ 4
Şekil 2.4. Memenin gelişimi .................................................................................... 4
Şekil 2.5. Kanser hücrelerinin gelişimi .................................................................... 6
Şekil 2.6. Meme kanserinin kadınlarda görülme sıklığı ve mortalite oranı .............. 7
Şekil 2.7. Meme kanserinde ırka bağlı görülme sıklığı ve mortalite oranı ............... 8
Şekil 2.8. İnvaziv ve İn situ kanserleşme .............................................................. 10
Şekil 2.9. Aromataz inhibitörlerinin etki mekanizması........................................... 12
Şekil 2.10. Paklitakselin kimyasal yapısı .............................................................. 15
Şekil 2.11. Mikrotübüllerin oluşum mekanizması .................................................. 17
Şekil 2.12. Paklitaksele alternatif yaklaşımlar ....................................................... 20
Şekil 2.13. Doğal siklodekstrinler.......................................................................... 26
Şekil 2.14. β- Siklodekstrin türevleri ..................................................................... 28
Şekil 2.15. Amfifilik siklodekstrin türevleri ............................................................. 30
Şekil 2.16. Etek şeklinde (solda) ve Medusa benzeri (sağda) Polikatyonik Amfifilik
Siklodekstrinin (paCDs) şematik gösterimi ........................................................... 32
Şekil 2.17. Farklı ilaç: siklodekstrin inklüzyon kompleksi oranları ......................... 33
Şekil 2.18. Tümör damar yapısı ve EPR etkisi ..................................................... 44
Şekil 2.19. Nanotaşıyıcıların tümöre farklı ilaç taşıma stratejilerinin şematik
gösterimi…………. ............................................................................................... 45
Şekil 2.20. Nanokürelere ilaç yükleme modelleri: a) hapsetmek, b) çözmek veya
dağıtmak, c) adsorbe etmek ................................................................................. 46
Şekil 2.21. Emülsiyon bazlı yöntemler ile nanopresipitasyon yönteminin
karşılaştırılması .................................................................................................... 48
Şekil 3.1. 6-O-Capro βCD .................................................................................... 55
Şekil 3.2. Polikatyonik βCDC6 .............................................................................. 56
Şekil 3.3. Nanopresipitasyon yönteminin şematik gösterimi ................................. 58
Şekil 4.1. Farklı sürfaktan konsantrasyonlarının boş amfifilik siklodekstrin
nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü üzerine etkisi ..................................... 68
Şekil 4.2. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü değişimi
(± SS, n=3). .......................................................................................................... 70
Şekil 4.3. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi değerindeki
değişim (± SS, n=3) .............................................................................................. 70
viii
Şekil 4.4. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel değerindeki değişimi
(± SS, n=3)…………. ............................................................................................ 71
Şekil 4.5. 6-O-Capro β-CD nanokürelerine ait SEM görüntüleri ........................... 72
Şekil 4.6. CS-6-O-Capro β-CD ve β-CDC6 nanokürelerine ait SEM görüntüleri .. 72
Şekil 4.7. Paklitaksele ait HPLC kromotogramı .................................................... 73
Şekil 4.8. Paklitakselin farklı konsantrasyonlarına ait HPLC piklerin toplu
gösterimi………….. .............................................................................................. 73
Şekil4.9. Paklitaksele ait kalibrasyon eğrisi ve denklemi………….. ...................... 74
Şekil 4.10. Paklitaksel ve formülasyondaki diğer maddelerin HPLC
kromotogramının karşılaştırılması ………….. ....................................................... 78
Şekil 4.11. Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü
değişimi (± SS, n=3) ………….. ............................................................................ 80
Şekil 4.12. Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi
değerindeki değişim (± SS, n=3)………….. .......................................................... 81
Şekil 4.13. Boş ve ilaç yüksüz nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel
değerindeki değişim (± SS, n=3) ………….. ......................................................... 81
Şekil 4.14. Seyreltme faktörüne bağlı salınan Paklitaksel miktarı (±SS, n=3)….. . 83
Şekil 4.15. % Kümülatif salınan Paklitaksel miktarı(±SS, n=3) ………….. ............ 83
Şekil 4.16. Boş siklodekstrin nanokürelerin L929 hücre yaşayabilirliğine etkisi
(± SS,n=3) ………….. ........................................................................................... 84
Şekil 4.17. İlaç yüklü ve boş siklodekstrin nanokürelerin MCF-7 hücre
yaşayabilirliğine etkisi (± SS,n=3) ………….. ....................................................... 84
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 2.1. Memedeki fizyolojik ve yapısal değişikliğe neden olan hormonlar ...... 5
Çizelge 2.2. Paklitakselin tarihsel gelişimi ............................................................ 14
Çizelge 2.3. Paklitakselin organik çözücülerdeki çözünürlük değerleri ................. 15
Çizelge 2.4. Paklitakselin neden olduğu toksisite ................................................. 19
Çizelge 2.5. Doğal siklodekstrinlerin fizikokimyasal özellikleri .............................. 27
Çizelge 2.6. Siklodekstrinlerin oral uygulamasına
örnekler…………………………………………………………………………………...35
Çizelge 2.7. Siklodekstrinlerin rektal uygulamasına örnekler ............................... 38
Çizelge 2.8. Siklodekstrin içeren ticari preparatlara örnekler ................................ 38
Çizelge 2.9. Nanoteknolojik ilaç taşıyıcı sistemlerin ticari preparat örnekleri ........ 40
Çizelge 2.10. Nanopresipitasyon yönteminde parametrelerin partikül üzerindeki
etkisi…………. ................................................................................................. …..49
Çizelge 4.1. Ön formülasyon çalışmaları .............................................................. 67
Çizelge 4.2. Nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü dağılımı
(nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3) ........................................................ 68
Çizelge 4.3. Nanoküre formülasyonlarının Zeta potansiyel değerleri (mV)
(± SS, n=3). .......................................................................................................... 69
Çizelge 4.4. Paklitakselin geri kazanım yüzdeleri ve varyasyon katsayıları
(n=6)………………………………………………………………………………………75
Çizelge 4.5. Paklitaksele ait tekrar edilebilirlik değerleri ve varyasyon katsayıları
(n=6)………. ......................................................................................................... 75
Çizelge 4.6. Paklitaksele ait tekrar elde edilebilirlik değerleri ve varyasyon
katsayıları (n=6) ................................................................................................... 76
Çizelge 4.7. Paklitaksele ait günler arası farklılık değerleri ve varyasyon katsayıları
(n=3)……… .......................................................................................................... 76
Çizelge 4.8. Paklitaksel yüklü nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül
büyüklüğü (nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3) ....................................... 79
Çizelge 4.9. İlaç yüklü nanoküre formülasyonlarının zeta potansiyel değerleri
(mV) (± SS, n=3). ................................................................................................. 79
Çizelge 4.10. Yükleme etkinliği ve yükleme kapasitesi değerleri (±SS, n=3)........ 82
x
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
CD
Siklodekstrin
CS
Kitosan
DAD
Çoklu dalga boyu
DCM
Diklorometan
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimetil sülfoksit
EPR
Artmış geçirgenlik ve tutulma etkisi
FBS
Fetal sığır serumu
HPLC
Yüksek basınçlı sıvı kromotografisi
LOD
Gözlenebilirlik sınırı
LOQ
Alt tayin limiti
PCX
Paklitaksel
PEG
Polietilen glikol
RES
Retiküloendotelyal sistem
SS
Standart sapma
SEM
Taramalı elektron mikroskobu
VK
Varyasyon katsayısı
WST-1
Suda çözünür tetrazolyum tuzu
xi
1. GİRİŞ ve AMAÇ
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser türüdür. Meme kanseri, genetik,
endokrin, diyet gibi faktörlerin hastalığın başlama, gelişme ve yayılmasında kritik
rol oynadığı çok basamaklı bir hastalıktır. Günümüzde bu hastalığın tedavisinde
uygulanan başlıca yöntem diğer kanser türlerinde de olduğu gibi kemoterapidir.
Kemoterapi, kanser hücrelerini öldüren veya çoğalmalarını kontrol altında tutan
kemoterapötik ajanların kullanılması ile gerçekleştirilen bir tedavi yöntemidir.
Sıklıkla kullanılan bir tedavi yöntemi olmasına rağmen kemoterapide etkinlik ve
güvenilirlik anlamında istenilen başarı elde edilememektedir. Bunun başlıca nedeni
kemoterapide kullanılan antikanser ilaçların selektif olmayan toksisitesidir. Bunun
dışında bir başka sorun antikanser ajanların çoğunun suda çözünürlüklerinin çok
düşük olmasıdır. Çözünürlük sorununu ortadan kaldırmak için formülasyonlarda
yardımcı çözücüler kullanılmaktadır. Ancak bu yardımcı çözücülerin aşırı duyarlılık
reaksiyonları, nörotoksisite gibi ciddi yan etkileri bulunmaktadır. Bu yan etkileri
ortadan kaldırmak amacıyla suda çözünürlüğü düşük olan antikanser ilaçların
farklı taşıyıcı sistemlerle alternatif formülasyonları geliştirilmektedir.
Amfifilik β-siklodekstrinler, doğal β- siklodekstrinlerin primer veya sekonder
yüzeyinin uzun alifatik zincirler eklenmesiyle oluşturulan kimyasal türevleridir.
Amfifilik siklodekstrinlerin yapısında bulunan uzun alifatik zincirler sayesinde
hidrofobik ilaçlarla etkileşimleri artmaktadır. Amfifilik β-siklodekstrinlerin önemli bir
başka özelliği ara yüzeylerde kendiliğinden bir araya gelerek nanokapsül ve
nanoküre oluşturabilmeleridir. Bu özellikleri sayesinde özellikle son yıllarda nano
boyutta ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanılmaktadır. Nanopartiküler sistemler,
küçük boyutları, geniş yüzey alanları sayesinde ilaç taşıyıcı sistem olarak birçok
avantaj sunmaktadır.
Bu tez çalışması kapsamında belirtilen özelliklerinden dolayı Amfifilik βsiklodekstrin nanoküreler taşıyıcı sistem olarak seçilmiştir. Bu amaçla çalışmalar
kapsamında 6-O-Capro βCD, kitosan kaplı 6-O-Capro βCD ve polikatyonik βCDC6
siklodekstrin türevleri kullanılmıştır.
1
Bu çalışmada:
•
Farklı yüzey yüküne sahip amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanması
ve in vitro karakterizasyonunun yapılması
•
Yüzey yükünün amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hücresel etkileşimleri ile
ilaç taşıma potansiyelleri üzerine etkisinin belirlenmesi
•
Yeni bir amfifilik siklodekstrin türevi olan polikatyonik βCDC6’nın nanoküre
eksipiyanı olarak etkinliğinin ve güvenilirliğinin belirlenmesi
•
Bunların sonucu olarak da daha güvenilir ve daha etkili kemoterapi
sağlanması amaçlanmaktadır.
Bu amaçla çalışma kapsamında hazırlanan farklı yüzey yüklerine sahip amfifilik β
siklodekstrin nanokürelerin in vitro karakterizasyonu yapılacaktır. Boş ve
Paklitaksel
yüklü
amfifilik
siklodekstrin
nanoküreler
stabilite
açısından
değerlendirilmiştir. Yüzey yükünün ilaç yükleme etkinliği ve in vitro salım profili
üzerine etkisi araştırılmış, formülasyonların güvenilirlikleri ve etkinlikleri hücre
kültürü çalışmaları ile değerlendirilmiştir. Bulgular ışığında Paklitaksel için en
güvenilir ve etkin formülasyon belirlenmiştir.
2
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Meme Anatomisi ve Fizyolojisi
Meme, kadınlarda süt üretimi için düzenlenmiş farklılaşmış bir ter bezi,
tubuloalveolar bir bezdir. Memeler toraksın üzerinde ve sternumun iki yanında 2.
ile 7. kaburgalar arasına yerleşmiştir. Meme lobüller (süt bezleri) ve duktuslar (süt
kanalları) olmak üzere iki kısımdan oluşur. Lobüller, lob adı verilen gruplarda
toplanırlar ve her memede 15-20 adet lob vardır [1]. Meme yapısında kas
bulunmaz ancak göğüs duvarının en büyük kasları olan pektoral kas üzerine
tutunmuşlardır [2,3] (Şekil2.1.).
Şekil 2.1. Memenin anatomik yapısı [3]
Meme yapısında çok geniş bir kan ve lenf damar ağı mevcuttur. Memenin
kanlanması
lateral
torasik
arter,
arteria
mammoria
interna
ve
arteria
interkostalislerden olmaktadır (Şekil 2.2). Memenin lenf damarları çok önemlidir.
Meme kanseri hücreleri, lenf damarlarına girerek lenf nodlarına ulaşır ve burada
büyümeye başlayabilirler. (Şekil 2.3) [2] .
3
Şekil 2.2. Memenin arterleri [2]
Şekil 2.3. Memenin lenfatik sistemi [2]
Memeler yaşam boyunca insan vücudunda en fazla değişime uğrayan yapılardır.
(Şekil 2.4.) [4]. Doğumdan sonra, meme lobülleri ‘terminal duktus lobüler üniteler’
olarak bilinen Tip 1 yapısındadır. Doğum sonrası ise Tip 4 yapısındadırlar ve aktif
şekilde süt üretimini sağlarlar [5].
Şekil 2.4. Memenin gelişimi [5]
Doğumdan menopoza kadar olan süreçte, hormonların kandaki düzeyine bağlı
olarak meme yapısında değişiklikler görülür. Bu hormonlar arasında en çok rol
oynayan östrojen hormonudur. Asıl olarak yumurtalıklardan salgılanır. Meme
hücrelerinin bölünmesini arttırır. Damarlanmayı, çevre bağ dokusunun yapımını ve
yağ dokusu birikimini sağlar [4,6,7]. Meme yapısında değişikliğe neden olan diğer
hormonlar Çizelge 2.1.’de açıklanmaktadır.
4
Çizelge 2.1. Memedeki fizyolojik ve yapısal değişikliğe neden olan hormonlar [7]
Hormon
Büyüme Hormonu
Etki
Hücrelerinde boyutlarında ve bölünme oranında artışa yol
açar, aminoasitlerin membranlardan geçişini arttırır
Folikül Uyarıcı Hormon
Doğumdan sonra süt üretimini devamlılığını sağlar, süt
bezlerini döşeyen hücre tabakasını aktif süt salgılayan
salgı hücrelerine çevirir
Yumurtalıklarda yumurta içeren foliküllerin gelişiminden
sorumludur, östrojen salgılayan hücreleri uyarır
Lüteinize Edici Hormon
Cinsiyet hormonlarının salgılanmasından sorumludur,
kadınlarda her siklusta bir yumurta bırakılmasını sağlar
Oksitosin
Süt bezlerinin kasılmasını sağlar
Progesteron
Gebelikte üretimi artar, süt ve salgı üreten yapıların
farklılaşmasını sağlar
Prolaktin
2.2. Kanser
Kanser, genetik değişkenlik ve birden çok moleküler değişikliğin birleşmesi sonucu
oluşan kompleks bir hastalıktır. Kontrolsüz hücre bölünmesi ve bu anormal
hücrelerin yayılması ile karakterize edilir [8].
2.2.1. Kanser Hücresinin Gelişimi
Hücresel düzeyde kanserin gelişimi mutasyonları içeren çok aşamalı bir süreç
sonunda çoğalma, canlı kalma, invazyon ve metastaz yetenekleri artan hücrelerin
seçilmesi şeklinde ortaya çıkar. Kanser hücresinin gelişimi temelde üç aşamada
açıklanmaktadır (Şekil 2.5.).
Tümör başlangıcı: Kanserojen etkiye sahip kimyasal, fiziksel veya kalıtsal
etkenlerin etkisi ile hücrenin yapısında geri dönüşümsüz değişiklikler meydana
gelir.
Tümörün tetiklenmesi: Kanser oluşumu için hücrede sekonder değişiklikler oluşur.
Tümör ilerlemesi: Tümörün büyüme hızı artar, tümör gelişir ve yayılır [8].
5
Şekil 2.5. Kanser hücrelerinin gelişimi
Kanser hücresinin temel özelliklerinden birisi klonalite olması yani tek bir hücreden
çoğalmasıdır. Tümörler sınırsız çoğalma yeteneği kazanan bir hücrenin anormal
çoğalması ile meydana gelir. Ancak başlangıçtaki bu ilk hücre sonuçtaki kanserli
hücrenin tüm özelliklerini taşımaz, çünkü her bölünme sırasında kanser
hücresinde yeni değişiklikler meydana gelmektedir.
Sağlıklı hücreler ile çevrili tek bir kanser hücresi kendini daha fazla oranda replike
ederek ilk olarak küçük tümör kütlesi halini alır. Sağlıklı hücreler, bu tümör kütlesi
ile besin için yarışamaz hale gelir. Tümör hücresi besin yetersizliğini dikkate
almadan büyümeye devam eder ancak yetersiz besin varlığında birçok hücre
kaybı olur. Tümörlerde difüzyon sınırlı maksimum büyüme yaklaşık 2mm3’dür.
Hücre toplulukları bu büyüklüğe kadar difüzyonla beslenirken, bu büyüklüğün
üzerinde büyüyebilmesi için tümörün besini sağlayacak yeni kan damarlarını
toplamasına ihtiyacı vardır. Bu nedenle anjiyogenez yani yeni damar oluşumu
tümörler için çok önemlidir [9].
2.2.2. Meme Kanseri
Meme kanseri kısaca süt bezleri ve kanalları döşeyen hücrelerin kontrol dışı olarak
çoğalmaları ve vücudun çeşitli yerlerine giderek çoğalmaya devam etmeleri olarak
tanımlanabilir [10].
6
2.2.2.1. Epidemiyolojisi
Meme kanseri dünyada kadınlar arasında en sık görülen malign tümör olup
kadınlarda görülen tüm kanserlerin yaklaşık % 30’unu oluşturmaktadır (Şekil 2.6).
1990 yılından bu yana meme kanseri görülme sıklığı yıllık %1.5 oranında genel bir
artış göstermiştir [11].
Şekil 2.6. Meme kanserinin kadınlarda görülme sıklığı ve mortalite oranı
Amerika Kanser Topluluğu’nun verilerine göre Amerika Birleşik Devletleri’nde 2011
yılında 230,480 yeni invasiv; 57,650 yeni In situ meme kanseri olgusu
saptanmıştır. 2012 yılında yaklaşık olarak 39.510 yeni meme kanseri kaynaklı
ölüm vakası beklenmektedir [11,13].
Ülkemizdeki duruma bakıldığında, Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Daire
Başkanlığı’nın 2005 istatistik verilerine göre meme kanseri % 35,47 oranı ile
Türkiye’de de kadınlarda en sık görülen kanser türüdür [12].
2.2.2.2. Etiyolojisi
Meme kanserinin nedeni tam olarak anlaşılmamasına rağmen bazı faktörler ile
ilişkili olduğu bilinmektedir. Meme kanserine neden olan faktörler, belirli başlıklar
altında toplanabilirler.
7
Cinsiyet: Meme kanseri nedenlerinin en başında cinsiyet gelmektedir. Tüm meme
kanserlerinin %99’u kadınlarda, %1’ i erkeklerde görülmektedir.
Yaş: Yaş meme kanserinde en önemli risk faktörlerindendir. Yaş ilerledikçe meme
kanseri insidansı artmaktadır. 40 yasın altında meme kanseri görülme sıklığı 1/235
oranında iken, 40-59 yaş arası 1/25 oranında, 60-79 yaş arasında 1/15
oranındadır [13].
Irk: Beyaz kadınlarda meme kanseri gelişme riski daha yüksek olmasına rağmen
Afrika kökenli Amerikalı kadınların bu hastalıktan ölme riski daha yüksektir.(Şekil
2.7.) [14].
Şekil 2.7.Meme kanserinde ırka bağlı görülme sıklığı ve mortalite oranı [15]
Genetik Etkenler: Meme kanserinde ailesel yatkınlık, ilk olarak 1866’da Paul Broca
tarafından ileri sürülmüştür. Kendi eşinin ailesinde dört nesil boyunca 24 kadının
10’unda meme kanserinin ortaya çıkması bu düşüncenin gelişmesine sebep
olmuştur [15]. Dünya Sağlık Örgütü’nün yaptığı açıklamaya göre aile öyküsü
meme kanseri riskini 2-3 kat arttırmaktadır. Meme kanser olgularının, %2030’unda aile öyküsü olmasına karşılık sadece %5-10 meme kanseri vakasında
genetik yatkınlık saptanmıştır. Bu yatkınlığa neden olan en önemli genetik
mutasyonlar başta BRCA1 ve BRCA 2 olmak üzere PTEN, TP53, MLH1, MLH2
veSTK11 gen mutasyonlarını içerir. Bunlardan mutasyona uğramış BRCA1 genini
taşıyan bir kadında 70 yıllık yaşam süresi boyunca meme kanserine yakalanma
riskinin % 85 olduğu belirtilmiştir. BRCA1 mutasyonuna sahip kadınlarda
puberteden sonra meme tümörlerinin gelişme riski %5-10 kat artar [16-20].
8
Endokrin Faktörler: Menarş, menopoz, doğum ve laktasyon gibi doğurganlıkla
ilişkili özelliklerle meme kanseri arasında ilişki vardır [21]. Erken menarşın meme
kanseri gelişiminde bir risk faktörü olduğu gösterilmiştir [22]. Genel olarak
menarşın her bir yıl gecikmesi ile meme kanseri riskinin % 20 azaldığı kabul
edilmektedir [23]. Meme kanseri riski ile menopoz yaşı arasında da bir ilişki
mevcuttur. Menopoza 45 yaşından önce giren kadınlarda meme kanseri riskinin
azaldığı bilinmektedir [24-25]. Meme kanserinde östrojenin önemli rolü olduğunu
bilinmektedir. Yapılan çalışmalarda dışarıdan verilen östrojenin meme kanseri
oluşumunu arttırdığı, overlerin çıkartılmasının veya dışarıdan antiöstrojenlerin
verilmesinin ise kanser oluşumunu azalttığı bildirilmiştir [7,26].
2.2.2.3. Sınıflandırma
Dünya Sağlık Örgütü meme kanserini histopatolojik açıdan aşağıdaki gibi
sınıflandırmıştır [27-29].
İnvaziv Olmayan(In situ) Kanser
Duktal Karsinoma In situ
Lobüler Karsinoma In situ
İnvaziv Kanser
İnvaziv Duktal Karsinoma
İnvaziv Lobüler Karsinoma
Müsinöz Karsinom
Medüller Karsinom
Papiller Karsinom
Tübüler Karsinom
Adenoid Kistik Karsinom
Sekretuvar (jüvenil) Karsinom
Apokrin Karsinom
Metaplastik Karsinom
İnflamatuvar Karsinom
9
Kanser hücreleri, çevresindeki bazal hücreleri aştığında invaziv, aşmadığında ise
In situ olarak adlandırılırlar. (Şekil 2.8)
Şekil 2.8. İnvaziv ve In situ kanserleşme
2.2.2.4. Tanı Yöntemleri
2.2.2.4.1. Görüntüleme Yöntemleri
Mamografi: Mamografi, meme dokusunun 2 plaka arasında sıkıştırılarak iki
pozisyonda filmleri alınması temeline dayanır. Mamografi, dünyada en yaygın
kullanılan meme kanseri erken tanı yöntemidir [30-32].
Ultrason: Mamografi ile birlikte en sık kullanılan yöntem ultrasondur. Mamografi
veya klinik muayene sırasında saptanmış şüpheli kitleleri değerlendirme de
kullanılır.
Duktografi: Duktografi (galaktografi) meme kanallarını görüntüleme için kullanılan
özel bir yöntemdir. İnce bir kanül yardımıyla meme kanalının iyotlu kontrast madde
ile doldurulmasının takiben özel mamografik görüntüler alınır [33].
2.2.2.4.2. Biyopsi Yöntemleri
Biyopsi temelde şüpheli kitleden örnek alınması sonucu histopatolojik incelenmesi
temeline dayanan bir yöntemdir. İnce iğne aspirasyon biyopsi ile cilt ince bir iğne
yardımıyla geçilerek şüpheli kitleye ulaşıldıktan sonra iğnenin içine dokudan kopan
hücrelerin alınması sonucu patolojik olarak incelenir [34]. Stereotaktik biyopside,
kitlenin koordinatları mamografi veya mamografi benzeri cihazlarla belirlenerek, bu
bölgeden doku örneği alınarak patolojik incelemeye gönderilmektedir [35].
10
2.2.2.5. Tedavi Yöntemleri
2.2.2.5.1. Cerrahi Yöntem
Cerrahi yöntem, mastektomi sonrası meme şeklinin geri kazanılmasında, koltuk
altı lenf nodlarına sıçrama olup olmadığını anlamak için veya ileri kanser
vakalarında belirtileri hafifletmek için uygulanabilir [36].
Mastektomi: Meme dokusunun tamamının, bazı durumlarda ise yakın diğer
dokularla uzaklaştırıldığı cerrahi yöntemdir. Bazı durumlarda ise meme dokusunun
tutunduğu Majör pektoralis kasının rezeksiyonu yapıldığı radikal mastektomi
uygulanır [37].
Meme Koruyucu Cerrahi: Lumpektomi olarak da adlandırılan bu cerrahi yöntemde
memenin bir kısmı uzaklaştırılır.
2.2.2.5.2. Radyoterapi
Radyoterapi, kanser hücrelerinin yüksek enerji ışınları ile öldürülmesidir. Cerrahi
sonrası yeniden tümör oluşumunu engellemek için veya meme kanserinin
metastazı durumunda kullanılan bir tedavi yöntemidir [30, 32, 37].
2.2.2.5.3. Hormonoterapi
Meme kanseri hücrelerinin %80’i östrojen pozitif ve östrojen pozitif meme
kanserlerinin %65’i progesteron pozitiftir [37]. Hormon tedavisinde amaç, hormon
reseptörü içeren kanser tiplerinde, hormonun etkisinin ortadan kaldırarak kanserin
gelişmesinin önlenmesidir. Bu amaçla kullanılan 4 farklı tedavi yöntemi vardır [40].
1)Aromataz inhibitörleri: En sık kullanılan hormonal tedavi yöntemidir. Aromataz
enzimi, sitokrom p450 enzim kompleksine ait 19 karbonlu androjenlerin 18
karbonlu östrojenlere dönüşümü sırasında birbirini izleyen üç hidroksilasyon
basamağını katalizleyen bir enzimdir. Tedavi sırasında vücuda verilen aromataz
inhibitiöleri, aromatazı inhibe ederek östrojen sentezini bloke ederler.(Şekil 2.9)
11
Şekil 2.9. Aromataz inhibitörlerinin etki mekanizması [39]
2)Seçici östrojen reseptör modülatörleri: Bu tedavide kullanılan ilaçlar, meme ve
bazı diğer dokulardaki östrojen reseptörlerine yerleşerek östrojenin reseptörler ile
buluşmasına engel olurlar. Bu amaçla klinikte en sıklıkla kullanılan ilaç Tamoksifen
(Nolvadex®)dir [40].
3)Östrojen reseptör kısıcıları: Östrojen reseptör kısıcıları (ERD),
östrojen
reseptörlerine zarar verirler. Hücrede reseptör olmadığında, östrojen hücre içine
giremez [40].
4)Yumurtalık işlevinin durdurulması: Pre-menopozal kadınlarda yumurtalıkların
östrojen üretimini durdurmasına dayanan tedavi yöntemidir. Yumurtalıkların
östrojen üretimi, enjeksiyon şeklinde ilaç verilerek, yumurtalıklar alınarak
(ooforektomi) veya düşük dozda radyasyon uygulanarak durdurabilir [40].
2.2.2.5.4. Kemoterapi
Kemoterapi, kanser hücrelerini öldüren veya çoğalmalarını kontrol eden
kemoterapötik
ajanların kullanılması ile gerçekleştirilen tedavi yöntemidir.
Kemoterapinin etkinliği kullanılan ilaçlar, hastanın durumu, dozaj formu ve
dozlama rejimi gibi birçok faktöre bağlıdır. Tümörü tamamen yok etmek ve hastayı
iyileştirmek için, tümörün yayılmasını engellemek veya gerilemesini sağlamak için,
tümörün sebep olduğu belirtileri yok etmek için kemoterapi uygulanır [40].
12
Kemoterapi tek başına, ya da başka tedavilerin yanı sıra verilebilir. Diğer
tedavilerin daha faydalı olmasına yardımcı olabilir. Uygulama amacına göre çeşitli
kemoterapi türleri vardır [41].
Adjuvan tedavi: Ameliyat veya radyoterapi sonrası kanser hücrelerinin yeniden
çoğalmasını engellemek için uygulanan kemoterapidir.
Neoadjuvan tedavi: Tümör dokusunun büyüklüğünü azaltmak için operasyon
öncesi uygulanan kemoterapidir.
Metastatik
tedavi:
Yayılmış
kanser
hücrelerini
öldürmek
için
uygulanan
kemoterapidir.
2.3. Paklitaksel
2.3.1. Paklitakselin Tarihsel Gelişimi
Paklitaksel, Taxus brevifolia’nın kabuklarından izole edilen doğal diterpendir [42].
Paklitaksel klinikte uygulanan ilk taksan türevidir. İlk olarak kemoterapiye dirençli
meme ve ovaryum kanserli hastalarda palyatif (hafifletici) olarak kullanılmıştır.
Ama günümüzde paklitaksel başlangıç tedavisi olarak kullanılmaktadır [43].
Paklitaksel, Ulusal Kanser Enstitüsü’nün binlerce farklı bitkinin antikanser etkisini
araştırdığı bir programda keşfedilmiştir. İlk olarak 1963 yılında Pasifik’in
kuzeybatısında, uzun yıllarda yetişen her zaman yeşil olan Taxus brevifolia isimli
Pasifik porsuk ağacının işlenmemiş özütü elde edilmiştir ve klinik öncesi
çalışmalarda çeşitli tümörlere karşı antitümöral etkisi olduğu gösterilmiştir. 1971
yılında bu özütteki aktif bileşen olan paklitaksel tanımlanmıştır [43].
Paklitakselin gelişimi, yeni bir kimyasal yapı olması ve klinik öncesi çalışmalarda o
dönemlerde araştırılan diğer etkin maddelere oranlara daha fazla antitümöral
etkinlik göstermemesi ve sudaki düşük çözünürlüğü nedeniyle formülasyon
probleminin olması nedeniyle uzun sürmüştür. Ancak yapılan tümör taraması
sırasında ortaya çıkan paklitakselin benzersiz etki mekanizması, onun yeniden
canlandırılmasını sağladı [43]. Paklitakselin tarihsel gelişimi Çizelge 2.2’de
açıklanmıştır.
13
Çizelge 2.2. Paklitakselin tarihsel gelişimi [44,45]
Tarih
Gelişim
1962-1968
Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI)’nün doğal ürünlerden antikanser ajanlar
taraması
1967
Antitümör Aktivitesinin keşfedilmesi
1969
Saf Paklitakselin izolasyonu
1971
Kimyasal yapısının aydınlatılması
1979
Kendine özgü etki mekanizmasının açıklanması
1983
Faz I çalışmalarının başlatılması
1986
Aşırı duyarlılık reaksiyonlarının gözlenmesi
1988
NCI tarafından premedikasyonunun önerilmesi
1989
Ovaryum kanserinde etkinliğinin saptanması
1991
Meme kanserinde etkinliğin saptanması
1992
Küçük hücreli akciğer kanserinde etkinliğinin saptanması
1992
Ovaryum kanserinde kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanması
1994
Meme kanserinde kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanması
1997
AIDS ile ilişkili Kaposi’s sarkoma tedavisinde kullanılmak üzere FDA
tarafından onaylanması
1998
Sisplatin ile kombine olarak ilerlemiş yumurtalık kanserinde kullanılmak
üzere FDA tarafından onaylanması
1999
Sisplatin ile kombine olarak küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin ilk
basamak tedavisi için FDA tarafından onaylanması
14
2.3.2. Fizikokimyasal Özellikleri
Paklitaksel, beyaz renkte kristal toz yapıdadır. Oldukça lipofilik yapıdadır. Erime
sıcaklığı 216-217°C’dir. Şekil 2.10. da kimyasal yapısı gösterilmektedir. Kimyasal
açık adı ‘5β, 20-epoksi-1,2α, 4, 7β, 10β, 13α-hekzahidroksitaks-11-en-9 on 4, 10diasetat 2-benzoat-13 ester (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilizoserin’dir. Molekül formülü
C47H51NO14, moleküler ağırlığı 853,9 dalton’dur [44].
Şekil 2.10. Paklitakselin kimyasal yapısı [43]
Paklitakselin sudaki çözünürlüğü 0,3 µg/ml’dir. Ancak çeşitli organik çözücülerde
nispeten daha fazla çözünürlük göstermektedir. Çizelge 2.3. te Paklitakselin çeşitli
organik çözücülerdeki çözünürlük değerleri verilmiştir [46].
Çizelge 2.3. Paklitakselin organik çözücülerdeki çözünürlük değerleri [46]
Organik Çözücü
Çözünürlük (µg/ml)
2-propanol
14
Asetonitril
20
Diklorometan
20
Etanol
46
Metanol
12
İzopropanol
12
Triasetin
75
Metilen klorür
19
15
2.3.3. Farmakokinetik Özellikleri
Paklitaksel
yüksek
oranda
plazma
proteinlerine
bağlanmaktadır.(%88-98).
Ortalama dağılım yarı-ömrü 0,34 saat; eliminasyon yarı-ömrü 5,8 saattir [47].
Plazmadan eliminasyonu bifazik olmaktadır. Başlangıçtaki hızlı düşüş merkezi
kompartmanlara dağılmasına, sonra gözlenen faz ise periferik kompartmanlara
sızıntı yapmasına bağlı olarak gerçekleşmektedir [43]. Paklitaksel oral yoldan
absorbe
olmamaktadır.
Yapılan
çalışmalarla
Paklitakselin’in
nonlineer
farmakokinetik özellik gösterdiği belirlenmiştir [48]. Paklitaksel büyük oranda P-450
aracılı hepatik metabolizmaya uğrar ve %10’undan daha azı değişmeden idrarla
atılır [43]. Paklitaksel’in metabolizasyon sonucu C6 ve C3 pozisyonları
hidroksilasyona uğrar ve 6α-hidroksi-paklitaksel, 3'-p-hidroksi-paklitaksel ve 6α,3'p-hidroksi-paklitaksel olmak üzere üç majör metabolit oluşur [48]. Yapılan bir
çalışmada, sıçanlarda 6 saatlik infüzyonu takiben en yüksek Paklitaksel
konsantrasyonu akciğer, karaciğer ve dalakta eser miktarda da beyin ve
testislerde biriktiği gösterilmiştir [43].
2.3.4. Farmakolojik Özellikler ve Etki Mekanizması
1979 yılında, Dr. Susan Band Horwitz yaptığı çalışmalarla Paklitakselin benzersiz
etki mekanizmasını keşfetti. Paklitakselin tubulinlere bağlanması, onun klinik
uygulamalar için öneminin artmasına neden olmuştur [43,47]. Paklitaksel antitümör
etkisini hücrede mikrotübüllerin toplanmasını arttırmak ve depolimerizasyonunu
önleyerek stabil mikrotübül toplulukları oluşturmak suretiyle göstermektedir [42].
Mikrotübüller, tüm ökaryot hücre sitoplazmasında bulunan içleri boş, silindirik
yapılardır. Mikrotübüller hücre iskeletini oluşturan temel üç lif tipinin en kalın
olanıdır. Çapları yaklaşık 25 nm, uzunlukları ise 25 µm ile 200 µm arasındadır. İçi
boş olan tübül duvarı, tubulin adı verilen globüler proteinlerin oluşturduğu
protofilamentlerden meydana gelmektedir. Her tubulin molekülü dimer yapıda olup,
bu dimerdeki polipeptid alt birimleri birbirinden çok az farklı olan α-tubulin ve βtubulindir [49]. Mikrotübüller, her iki uca tubulin alt birimlerinin eklenmesiyle uzarlar
(polimerizasyon) veya tersi olarak uçlardan tubulin ayrılmasıyla kısalırlar
(depolimerizasyon) ve hızlı büyüyen uca (+) son, yavaş büyüyen veya kısalmanın
olduğu uca (-) son denir. Hareket, besin alımı, hücre şeklinin kontrolü, hücreler
arası madde alışverişi ve hücresel sinyaller gibi çeşitli hücresel fonksiyondan
16
sorumludurlar [44,47]. Ancak temel görevleri hücre bölünmesi sırasında
kromozomların ayrılması sağlamalarıdır.
Şekil 2.11. Mikrotübüllerin oluşum mekanizması [50]
Mikrotübülleri birleşmesi ve ayrılması hücrede dinamik bir denge halindedir (Şekil
2.11). Mikrotübüllerde polimerizasyon GTP (Guanozin trifosfat )ye bağlıdır. Guanin
RNA sentezi sırasında rol oynayan pürin nükleotitlerindendir. GTP, hücrede
protein sentez, sırasında enerji kaynağı olarak kullanılır. GTP bağlı tübülün
monomerleri mikrotübülünün artı ucuna eklenirken GTP’nin hidroliz edilmesi ise
tubulin moleküllerinin komşu moleküllere olan bağlanma eğilimini zayıflatır ve daha
sonra GDP bağlı tubulin ayrışarak hızlı depolarizasyona ve mikrotübülün
kısalmasına yol açar [50].
Paklitaksel hücreler üzerindeki etkisini iki yolla yapmaktadır.
1)Hücre Döngüsünü Bloke Etmek: Paklitaksel, kanser tedavisinde kullanılan,
etkisini mikrotübüller üzerinde gösteren Vinca alkoloidleri olarak bilinen vinkristin
ve vinblastin’den farklı olarak tubulin proteinlerine bağlanarak mikrotübül
yapılanmasını
engellemek
yerine
stabilize
ederek
hücre
bölünmesini
17
durdurmaktadır. Paklitaksel β tubulinde N-terminal 31 amino asite bağlanarak (rao2) hücrelerin G2/M evresinde kalmasına neden olmaktadır. Hücre siklus sırasında
Mitotik faza geçemeyen hücreler bölünememekte ve G1 kontrol noktası tarafından
apoptozise yönlendirilmektedir.
2) Apoptozis: Paklitakselin apoptozis etki mekanizması ilk olarak 1993 yılında
insan lenfoit lösemi hücrelerinde gösterilmiştir. Ardından bu konuda farklı hücre
hatlarında ve çeşitli in vivo hayvan modelinde çok sayıda araştırma yapılmıştır.
Apoptozis programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanır. Hücre ve dokuların
mekanik bir etki ve hasar olmaksızın belirli moleküler işlemler ve sinyaller sonrası
hücrelerin
kendiliğinden
ölmesidir.
Paklitakselin
hücrelerin
mitotik
evreye
geçmelerini engellemesi sonucu hücreler bölünememektedir. Mitotik evrede kalan
hücre sayısındaki artış o hücreleri apoptozise yönlendirici sinyaller oluşmasına
neden olmaktadır. Aynı zamanda yapılan çeşitli çalışmalarla Paklitakselin blc-2 adı
verilen ve apoptozisi bloke eden proteine bağlanarak onu inhibe ettiğini
göstermektedir. Böylece apoptozisin devam etmesine izin vermektedir [51-55].
2.3.5. Klinik Uygulamada Karşılaşılan Problemler
Paklitaksel,
günümüzde
klinikte
sıklıkla
Taxol®
ticari
preparatı
olarak
kullanılmaktadır. Paklitaksel ticari preparatlarında, Cremophor EL: etanol (1:1)
karışımından oluşan taşıyıcı kullanılarak formüle edilmektedir. Paklitakselin
çözünme
probleminin
önüne
geçmek
için
kullanılan
Cremophor
EL
®
(polietoksillenmiş hint yağı) non-iyonik amfifilik bir sürfaktandır [56].
Paklitaksel terapötik indeksi dar bir ilaçtır. Genellikle 135-175mg/m2 kadar doz 3
veya 24 saatlik infüzyon şeklinde verilir. Maksimum tolere edilebilir doz 3 saatlik
infüzyon sonucu hastalarda 225-240 mg/m2 bulunmuştur [44]. Artan ilaç
konsantrasyonu ile birlikte plazma konsantrasyonunun artması ancak klirensin ve
dağılımın azalması paklitakselin lineer olmayan farmakokinetik özelliğe sahip
olduğunu göstermektedir.
Paklitakselin klinik uygulamadaki en büyük sorunu suda çözünürlüğünün düşük
olmasından kaynaklanmaktadır. Ticari preparatlarda vehikül olarak kullanılan
Cremophor EL un ciddi sitotoksik etkilerinin olduğu bilinmektedir (Çizelge 2.4) [57].
Cremophor EL aşırı duyarlılık reaksiyonları, nefrotoksisite ve nörotoksisiteye
18
neden olmaktadır. Bununla birlikte letarji, nefes almada güçlük ve vazodilatasyona
bağlı hipotansiyona neden olmaktadır. Preklinik ve klinik testler sonucunda
öldürücü aşırı duyarlılık reaksiyonlarına neden olduğu gösterilmiştir. Cremophor ve
yardımcı çözücü etanolün neden olduğu bir başka sorun ise infüzyon setleri ile
geçimsizlik göstermeleridir. Hem etanol, hem de Cremophor’un, polivinil klorür
infüzyon torbalarından dietilheksilftalatı (DEHP) açığa çıkardıkları belirtilmiştir [5860]. Bunu engellemek için cam, polipropilen veya poliolefin kaplarda saklama
önerilmektedir. Ancak; bu çeşit saklama kaplarının teminatı sınırlıdır. Karşılaşılan
en önemli problemlerden birisi de Cremophor EL ve etanolün hastaya uygulama
sırasında aynı kataterden Paklitaksel ile birlikte uygulanan diğer ilaçlar ve
eksipiyanları ile etkileşime girmeleri stabilitelerinde bozulmaya neden olmalarıdır
[44,61-64].
Çizelge 2.4. Paklitakselin neden olduğu toksisite [44]
a) Doz sınırlayıcı toksik etkiler
Nötropeni,
mukoza
iltihabı,
nörotoksisite,
aşırı
atriyoventriküler
blok,
duyarlılık
b) Farklı sistemlere toksik etkiler
Kardiyovasküler
Asemptomatik
bradikardi,
atriyal aritmi, ventriküler taşikardi, iskemi
Hematolojik
Nötropeni, trombositopeni
Aşırı duyarlılık
Dispne, hipotansiyon, ürtiker
Nörotoksisite
Periferal nöropati, miyalji,
Gastrointestinal sistem
Mukoza iltihabı, mide bulantısı, kusma, diyare
Hepatotoksisite
Karaciğer fonksiyonlarında artış
Diğerleri
Alopesi(saç dökülmesi), miyopati, pulmoner yağ
embolisi
19
2.3.6. Alternatif Formülasyon Yaklaşımları
Paklitakselin alternatif formülasyon yaklaşımlarındaki temel amaç, çözünürlüğünü
arttırarak günümüzde kullanılan Cremophor EL® nin neden olduğu sistemik
toksisitenin önüne geçmektir. Bununla birlikte Paklitakselin çözünürlüğüne bağlı
olarak etkinliğinde artış, uzun süreli stabilitesi ve büyük ölçekli üretim imkanı da
hedeflenmektedir [43]. Son yıllarda literatürde çok sayıda farklı formülasyon
geliştirme çalışmaları vardır (Şekil 2.12).
Şekil 2.12. Paklitaksele alternatif yaklaşımlar [43]
Yardımcı çözücü: Paklitaksel gibi non-polar ilaç molekülleri genellikle suda düşük
çözünürlüğe
sahip
moleküllerdir.
Bu
moleküllerin
çözünürlükleri,
ilacın
çözünebildiği ve su ile karışabilen iyi bir çözücü yardımıyla arttırılabilir [65]. Bu
nedenle suda çözünmeyen ilaçların intravenöz formülasyonlarında yardımcı
çözücü kullanılır. Bu yöntemle etkin madde yardımcı çözücü içerisinde çözünerek,
ortamdaki suyun etkin madde üzerindeki hidroliz
yapıcı etkisi en aza
indirilmektedir. Ancak bu yöntemde en sık karşılaşılan problem formülasyonların
intravenöz sıvı veya kanla karşılaşması sonucu çökelti oluşmasıdır [43]. Bununla
birlikte Cremophor EL da olduğu gibi yardımcı çözücülerin de istenmeyen yan
etkileri ile karşılaşmak mümkün olmaktadır. Paklitakselin yardımcı çözücü ile
formülasyonunda başka bir yaklaşım ise etanol, Polisorbat 80 ve Pluronic L64
(3:1:6) nın kullanıldığı çalışmadır [66]. Bu yaklaşım sonucu Paklitakselin
çözünürlüğü 5 mg/ml olarak bulunmuş ve yapısında herhangi bir değişiklik
olmadan üç ay stabil kaldığı gözlemlenmiştir. Ancak su ile dilüsyonu sonrası
20
sadece üç gün stabil kaldığı gösterilmiştir. Hidrofilik yapısından dolayı Paklitaksel
formülasyonlarında sıklıkla kullanılan bir diğer madde ise polietilen glikoldür.
Literatürde %75 PEG 400 içeren sulu çözeltide Paklitaksel çözünürlüğünün 16
mg/ml olduğu gösterilmiş ancak infüzyon için dilue edildiğinde çökelti oluşmuştur
[67]. Bununla birlikte PEG 400: Paklitaksel formülasyonunun, implante edilmiş B16
melanoma hücrelerinde intraperitonal uygulama sonrası etkinliğinin Paklitakselin
sulu süspansiyonu ve Cremophor EL içeren formülasyonundan daha az olduğu
belirtilmiştir.
Emülsiyon: Birbiri içinde çözünmeyen iki veya daha fazla sıvının sıvının emülgatör
varlığında oluşturduğu heterojen karışımlar emülsiyon olarak adlandırılmaktadır.
Yağ/ su emülsiyonları bazı antineoplastk ilaçların çözünürlüğünü ve stabilitesini
arttırmak için kullanılan uygun yaklaşımlardır. Ancak bazı emülsifiye edici ajanların
hemolitik reaksiyonlar gibi ciddi toksik etkileri bulunmaktadır. Tarr ve Yalkowsky
[66], yaptıkları bir çalışmada iç faz olarak triasetin kullandıkları yağ/su
emülsiyonunda Paklitakselin çözünürlüğü 10 mg/ml bulmuşlardır. Ancak, terapötik
doz için gerekli olan triasetinin tek başına farelere intravenöz uygulandığında
toksik etki yaptığı gözlenmiştir. Bu nedenle bu formülasyonda antitümör etkinlik
gözlenememiştir. Yapılan bir başka çalışmada,
PLGA (polilaktid- ko- glikolid)
içeren emülsiyon formülasyonlarında çözünürlüğünün arttığı ve kontrollü salımın
sağlandığı gösterilmiştir [45].
Ön İlaç: Paklitakselin çözünürlüğü arttırmak ve sentezini kolaylaştırmak için
üzerinde çok çalışılan alternatif formülasyon yaklaşımlarından biri de ön ilaçtır. Ön
ilaç, ana etken maddenin aktif olmayan türevidir. Aktif olmayan ön ilaç vücuda
girdiği zaman hidroliz veya enzimatik degradasyon nedeniyle aktif forma
dönüşerek etki göstermektedir [42]. Ancak ön ilaç hazırlanması zor ve pahalı bir
işlemdir. Aynı zamanda etkin maddenin yapısında meydana gelen değişiklikler
istenmeyen
farmakokinetik
ve
farmakodinamik
özelliklere
yol
açabilir.
Paklitakselin, suda düşük çözünürlüğü olması nedeniyle sulu formülasyonu ve
yapısında fonksiyonel grup olmaması nedeniyle tuz formu bulunmamaktadır.
Paklitakselin ön ilaç formülasyonları ile ilgili en temel çalışma Mellado ve
arkadaşları tarafından C-2’ hidroksil grubunun fonksiyonelleştirilebilmesi ile
yapılmıştır [68]. Bu pozisyondaki türevler hidrolizle, enzimatik veya kimyasal
21
reaksiyonlarla kolayca oluşturulabilmektedir. Bazı Paklitaksel C-2’ esterleri ile ön
ilaç çalışmalarında sıklıkla araştırmalar yapılmaktadır. Süksinat ve glutarat
türevleri, sülfonik asit türevleri, amino asit türevleri bunlar arasında en çok
çalışılanlarıdır. Bütün bu türevler Paklitaksel için yeterli olan suda çözünürlüğü
sağlamakta ve in vivo çalışmalarda başarılı sonuçlar vermektedir [69]. Ancak sulu
çözeltilerinde kimyasal stabil olmadıklarından ön ilaç formülasyonları için uygun
olmadıkları gözlenmiştir. Araştırılan esterler içerisinde en uygun olanının, 2’-[3(N,N-dietilamino)propionil] Paklitaksel olduğu bulunmuştur. Stabil yapısından
dolayı ön ilaç formülasyonu için uygun bir esterdir. Çalışmalar sonucu yarılanma
ömrünün 5 dakikadan fazla olmadığı, uzun süre stabil kaldığı ve B16 melanoma
hücre hattı üzerinde yapılan in vivo araştırmalarda Paklitaksel ile aynı antitümöral
etkinliğe sahip olduğu gösterilmiştir [70].
Lipozom: Lipozomlar, bir veya daha fazla lipid membrandan oluşan aralarında sulu
faz bulunan veziküllerdir. Bu veziküller, yağda çözünen ilaçları lipid membranları
arasında enkapsüle ederek intravenöz taşınımını sağlarlar [43,45]. Lipozom
formülasyonlarında
karşılaşılan
en
büyük
problem
stabil
olmamalarıdır.
Lipozomlar, enkapsüle ettikleri ilaçların farmakokinetik ve farmakodinamik
özelliklerini değiştirerek toksisitelerini azaltıp, etkinliklerini arttırmaktadırlar [71].
Straubinger ve arkadaşlarının [72] çalışmasında 300’ün üzerinde lipozom
formülasyonu
geliştirilmiş,
formülasyonlar
etkinlik
ve
stabilite
açısından
incelenmiştir. Taxol dirençli mürin tümörü Colon 26 tümörü ile yapılan in vivo
çalışmada Paklitaksel içeren lipozom formülasyonlarının tümörün gelişimini
durdurdukları görülmüştür [73]. Yapılan çalışmalar lipozom bazlı paklitaksel
taşıyıcı sistemlerin klinikte kullanım açısından umut vaad ettiğini göstermektedir.
Miseller: Misel yapılar, hidrofilik ortamda hidrofobik ilaçların çözünmesini sağlayan,
ilacı içerisine fiziksel olarak hapseden polimerik ilaç taşıyıcı sistemlerdir. Misel
yapılar
partikül
büyüklüklerinin
küçük
olması
(20-100
nm)
nedeniyle
retiküloendoteliyal sisteme yakalanmadıkları ve dayanıklı yapıları sayesinde pasif
hedeflendirmede
kullanılmaya
uygundur
[75].
Miseller
biyolojik
olarak
parçalanabilen, toksik olmayan polimerlerden yapılabilirler.
22
Mikro/Nanopartikül: Paklitaksel için formülasyon geliştirme çalışmalarında en sık
kullanılan
taşıyıcılar
biyoparçalanabilir
mikro/nanopartiküler
polimerler
kullanılarak
sistemlerdir.
hazırlanan
Antikanser
mikropartikül
ilaçların
veya
nanopartiküllerle taşınması, ilacın kontrollü salımını sağladığı için hem etkinliği
arttırmakta hem de sistemik toksisitenin önüne geçmektedir [43]. Nanopartiküllerin
boyutları nedeniyle mikropartiküllere göre ilaç taşıyıcı sistem olarak çeşitli
üstünlükleri bulunmaktadır. Nanopartiküller olası iritasyonların önüne geçebilmek
için intravenöz uygulamanın yanı sıra intramüsküler ve subkütan enjeksiyonla da
uygulanabilirler. Uzun süre stabil kalmaları nanopartikülleri lipozomlardan ayıran
en önemli özellikleridir. Bununla birlikte lipozomlara göre daha dayanıklı yapıda
olmaları ve daha fazla etkin madde hapsedebilmeleri en büyük avantajlarındandır.
Değişik hazırlama yöntemi ve farklı polimerler kullanılarak çok geniş aralıkta
partikül büyüklüğü ve farklı yüzey yüküne sahip partiküller elde edilebilir. Bu
özellik, nanopartiküllerin pasif hedeflendirmede kullanılmalarında ve yüzey yüküne
bağlı olarak tümörlü bölgede toplanmalarında önemli rol oynar.
Nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlere alternatif bir diğer yöntem ise ilaç etkin
maddesinin uygun bir makromoleküle konjuge edilerek taşınmasıdır. Bu alanda
albümin, globülin gibi doğal veya sentetik polimerler kullanılmaktadır. Albumin
bağlı nanopartikül (nab) teknolojisi kullanılarak 2005 yılında meme kanserinde
kullanılmak için FDA tarafından onay alan Abraxane®, Paklitakselin insan serum
albümine konjuge edilmiş, 130 nm partikül büyüklüğüne sahip formülasyonudur
[76]. Albümin, insan ve diğer memeli hayvanların kan plazmasında bulunan en
yaygın proteindir. Kanda bulunan proteinlerin %60'ını oluşturur. Ayrıca, doku
sıvılarında, özellikle kas ve deride de bulunur. Yağ asitleri ve çeşitli başka
maddelerin kanda taşımasının yanı sıra en önemli işlevi, kan ile doku sıvıları
arasında suyun dengelenmesini sağlamaktır. Toksik olmaması, doğal bir polimer
olması, antijenik özellik taşımaması nedeniyle ilaç taşıyıcı sistemlerde tercih
sebebidir. Albümin 1972 yılında FDA tarafından ilaç taşınımında kullanılması
onaylanmıştır. Albüminin en önemli özelliği yapısında, suda çözünmeyen ilaçların
bağlanabileceği hidrofobik bölgelerin bulunmasıdır. Her bir ilacın albümine
bağlanma sayısı ilacın moleküler yapısına bağlıdır. Paklitakselin tek albümine yedi
farklı bölgeden bağlandığı bilinmektedir. Abraxane®’ın, Taxol® e göre çok sayıda
avantajı bulunmaktadır. Bunlardan en önemlisi Abraxane ® ın yapısında hiçbir
23
sürfaktan ve çözücü içermemesidir. Bu sayede Taxol® formülasyonunda bulunan
Cremophor EL nin neden olduğu toksisite ortadan kalkmaktadır. Bununla birlikte
ilacı plazmaya uzun sürede ve sürekli salarak depo etkisi sağlar ve bunun
sonucunda da infüzyon süresini kısaltır. Toksik etkisinin bulunmaması nedeniyle
haftalık tolere edilebilen maksimum doz miktarı Taxol ® e göre % 70-80 daha
fazladır [76-79].
Siklodekstrinler,
Siklodekstrin:
suda
çözünürlüğü
düşük
olan
ilaçların
çözünürlüklerini, biyoyararlanımlarını ve dissolüsyon oranlarını arttırmak için
kullanılan siklik oligosakkaritlerdir. Kararsız ilaçların stabilitelerini arttırarak
intravenöz uygulamada etkinliklerini güçlendirirler. Hidrofilik dış yapı ve lipofilik iç
kaviteden oluşurlar. Hidrofobik etkin maddeleri lipofilik iç kavitelerine hapsederek
çözünürlüklerini arttırırlar. Doğal siklodekstrinlerin yapılarından kaynaklanan
toksisitenin önüne geçebilmek için genellikle kimyasal olarak modifiye edilirler. Bu
modifikasyon
aynı
zamanda
çözünürlük,
stabilite,
siklodekstrinler,
biyoyararlanımı
gibi
enkapsüle
ettikleri
fizikokimyasal
ilaçların
özelliklerini
değiştirmelerine olanak sağlar [42,44]. Yapılan bir çalışmada, Paklitakselin
çözünürlüğünü arttırmak için hidroksipropil
β- CD (HPβCD) ile inklüzyon
kompleksi oluşturulmuştur. Çalışmanın sonucunda HPβCD ile kompleks oluşturan
ilacın, serbest ilaca göre daha hidrofilik olduğu gösterilmiştir [44]. Yapılan başka
bir çalışmada ise Paklitakselin α-CD ile kompleksi oluşturulmuş ancak
Paklitakselin
geniş
halkasal
yapısı
hesaba
katıldığında,
paklitaksel
için
formülasyonlarda daha geniş kaviteye sahip β-CD ve γ-CD’lerin daha uygun
olduğu düşünülmektedir [80]. Araştırmalar β-CD’in Paklitakselin çözünürlüğünü
950 kat arttırdığını ve klinikte kullanılan uygun konsantrasyonun kolayca elde
edilebildiğini göstermektedir [43].
2.4. Siklodekstrin
Siklodekstrinler (CD), nişastanın glukanotransferaz (CGTase) enzimi tarafından
parçalanması sonucu endüstriyel olarak üretilebilen doğal polimerlerdir [81].
Siklodekstrinler,
α-1,4-D(+)-glukozidik
bağlı
glukopiranoz
ünitelerinden
oluşmaktadırlar [82]. Siklodekstrinler, makrosiklik oligosakkarit bileşiklerdir [83].
Siklodekstrinler, halkasal moleküllerdir ancak glukopiranoz üniteleri arasındaki
bağlarda serbest rotasyon olmadığında toroidal veya huni şeklindedirler. Primer
24
hidroksil gruplar dar yüzeyde, sekonder hidroksil gruplar ise geniş yüzeylerde yer
alır. Halka yapısı tepesi kesilmiş koniğe benzemektedir. C6 karbon atomunun C2
ve C3 hidroksil gruplarına göre rotasyon yapabilmesinden dolayı siklodekstrin
boşluğu sona doğru daralmaktadır. Siklodekstrin moleküllerinin yapısında bulunan
iç kavite sekonder C-H bağları nedeniyle hidrofobik özellik gösterir. Dış yüzey ise
hidrofilik yapıdadır [84].
2.4.1. Siklodekstrinlerin Tarihsel Gelişimi
Siklodekstrinler ilk olarak 1891 yılında Fransız bilim adamı Villiers tarafından
keşfedilmiştir. Villers 1000 gram nişastadan yaklaşık olarak 3 gram kristal ürün
izole etmiştir ve ürünün kompozisyonunu (C6H10O5).3H2O olarak belirlemiştir. Elde
ettiği bu ürüne selüloz gibi asit hidrolizine dirençli olduğu için ‘selülozin’ adını
vermiştir. 1903 yılında Avusturyalı mikrobiyolog Franz Schardinger, yiyeceklerde
bozulmaya neden olan bakteriler üzerinde yaptığı bir çalışma sırasında, patates
nişastasının bakteriler tarafından parçalanması sonucu oluşan iki kristal bileşik
tanımlanmıştır. Bunları A ve B olarak isimlendirdi ve B bileşiğini A bileşiğine göre
çok daha fazla miktarda izole edebildi. 1903 yılında Schardinger tarafından
yayınlanan makalede bileşiğin ismi ‘kristalin dekstrin’ olarak değiştirilerek A ve B
bileşikleri α-dekstrin ve β- dekstrin olarak adlandırıldı. Ardından 8 yıl boyunca
yaptığı çalışmalarla patates, mısır ve buğday gibi farklı kaynaklardan, farklı bakteri
enzimleri ile bu bileşikleri izole edebilmeyi başardı. 1911 yılında yayınladığı bir
makalede siklodekstrinlerin kimyasal yapılarını açıklamıştır. O yıllarda bu konuda
fazla bilgi olmamasına rağmen bu çalışma siklodekstrin kimyasının temeli kabul
edilmektedir. 1935 yılında Freudenberg, γ siklodekstrini keşfetti ve 1938 yılında
siklodekstrinlerin α(1-4) bağlı glukoz ünitelerinden oluşan halkasal yapısını
gösterdi. Ardından Cramer yaptığı çalışmalarla, α,β ve γ-siklodekstrinlerin
yapılarını ve çözünürlükleri, kompleks oluşturabilme kabiliyetleri, iç kavite
büyüklükleri gibi fizikokimyasal özelliklerini tanımladı [85-89].
2.4.2. Doğal Siklodekstrinler
Doğal siklodekstrinler, yapılarında bulunan glukopiranoz ünitesinin sayısına göre
adlandırılırlar.
Bunlar
arasında
farmasötik
açıdan
önem
taşıyanlar
α –siklodekstrin (6 ünite), β-siklodekstrin (7 ünite) ve γ-siklodekstrin (8 ünite)dir.
25
Yapılarında bulunan glukopiranoz ünite sayılarına bağlı olarak hidrofobik kavite
hacmi ve çapları değişmektedir (Şekil 2.13).
Şekil 2.13. Doğal siklodekstrinler [88]
Yapısal faktörler ve gerilme nedeniyle 6 glukopiranoz ünitesinden daha az sayıda
ünite içeren siklodekstrin bulunmamaktadır ancak 9-13 arasında ünite içerenler
vardır ve bunlar ortak olarak δ-CD olarak adlandırılır. Çünkü bunlardan yapısı en
iyi aydınlatılmış olanı 9 üniteli olan δ-CD’dir [82].
Doğal siklodekstrinler kristal yapıda, homojen, higroskopik olmayan makrosiklik
yapılardır. Siklodekstrinler, 4C1 sandalye konformasyonuna sahiptir. Hidrofobik
kavitedeki H atomları ile glikozidik O köprülerinin eşleşmemiş elektron çiftleri
kavitenin içine doğru yöneldikleri için kavitede yüksek elektron yoğunluğu
gösterirler. Glukopiranoz ünitesindeki C-2 hidroksil grup komşu glukopiranoz
ünitesindeki C-3 hidroksil grup ile H bağı oluşturur. β-siklodekstrinin ikinci kemeri
bu hidrojen bağlarından oluşmaktadır. Bu nedenle β-siklodekstrin diğer doğal
siklodkstrinlere göre daha katı yapıdadır ve çözünürlüğü en azdır. α-siklodekstrinin
yapısındaki glukopiranoz ünitelerinden birisi bükük yapıda olduğu için hidrojen
kemerleri tam değildir. 6 hidrojen bağından sadece 4 tanesi biçimlenmiştir.
γ-siklodekstrinler ise doğal siklodekstrinler içerisinden yapısı en esnek ve suda
çözünürlüğü en fazla olandır [82,98].
Doğal siklodesktrinlerin en önemli fiziksel ve kimyasal özellikleri Çizelge 2.5.’te
gösterilmiştir.
26
Çizelge 2.5. Doğal siklodekstrinlerin fizikokimyasal özellikleri [88-90]
Özellik
α-CD
β-CD
γ-CD
Glukopiranoz ünite sayısı
6
7
8
Moleküler ağırlık (g/mol)
972
1135
1297
Suda çözünürlük(25oC,g/L)
145
18.5
232
Dış çap (Å)
14,6
15,4
17,5
Kavite çapı (Å)
4,7-5,3
6,0-6,5
7,5-8,3
Yükseklik (Å)
7,9
7,9
7,9
Kavite hacmi (Å3)
174
262
427
pKa değeri
12,3
12,2
12,1
Erime noktası (oC)
250-260
255-265
240-245
Yarılanma ömrü (1M HCL, 60
o
C,saat)
6,2
5,4
3,0
Doğal siklodekstrinlerin, oral uygulama sonrası ince bağırsakta hidroliz olmadıkları
ancak hidrolizin sadece kolonda meydana geldiği bilinmektedir. Siklodekstrinler,
sadece serbest son grupları degrede eden β-amilaza karşı dirençli oldukları için
nişastadan daha yavaş metabolize olurlar. Siklodekstrinler içinde α-CD en yavaş,
γ-CD ise en hızlı parçalanır. Oral uygulamalarında herhangi akut toksisiteye neden
olmazlar. Uzun süreli uygulama sonucunda organlarda ve biyolojik değerlerde
belirgin bir değişikliğe neden olmamaktadır [91]. Doğal siklodekstrinlerin parenteral
uygulamaları belirgin farklılıklar göstermektedir. β-siklodekstrinlerin intramüsküler
(kas içi) uygulaması ülser oluşumuna; intravenöz (damar içi) uygulaması ise
nefrotoksisiteye ve hemolize neden olmaktadır. γ-siklodekstrinde ise yüksek suda
çözünürlüğü nedeniyle α-CD ve β-CD’den daha az nefrotoksisite ve hemolize
neden olduğu bilinmektedir [89,91].
2.4.3. Siklodekstrin Türevleri
Doğal siklodekstrinlerin suda çözünürlükleri, yapılarındaki hidroksil grupları
arasında bulunan hidrojen bağları nedeniyle lineer dekstrinlere göre oldukça
27
düşüktür [83,85]. Aynı zamanda α- ve β-CD’in nefrotoksisiteye neden olduğu
bilinmektedir. Parenteral uygulama sonrası siklodektrinlerin, böbrek tübül hücreleri
tarafından alındığı ve bunun sonucunda hücre içi fonksiyonlarda bozulma
olmaktadır. Doğal siklodekstrinlerin kırmızı kan hücrelerinde hemolize neden
olmaları ve kolesterol ve fosfolipid gibi membran bileşenlerinde bozulmaya neden
olmaları diğer dezavantajlarıdır [90]. Doğal siklodekstrinlerin neden olduğu bu
durumların önüne geçebilmek için kimyasal yöntemlerle siklodestrinler modifiye
edilerek yeni türevleri elde edilmektedir.
Doğal siklodekstrinlerin modifikasyon nedenleri aşağıdaki gibi özetlenebilir:
•
Doğal siklodekstrinlerin (özellikle β-CD) suda çözünürlüğünü arttırmak
•
Doğal siklodekstrinlerin en önemli yan etkisi olan nefrotoksisiteyi ortadan
kaldırmak
•
Siklodekstrinlerin biyolojik membranlardan geçişini arttırmak
•
Siklodekstrinlerin inklüzyon kompleksi kapasitelerini arttırmak
•
Hemolizi önlemek
•
Siklodekstrinlere kendiliğinden organizasyon özelliği kazandırarak kolloidal
ilaç taşıyıcı sistem oluşturmak
Modifiye edilen doğal siklodekstrinler içerisinde farmasötik alanda en çok üç grup
kullanılmaktadır (Şekil 2.14):
•
metillenmiş siklodekstrin,
•
hidroksipropillenmiş siklodekstrin
•
sülfobütillenmiş siklodekstrin
28
Şekil 2.14. β- Siklodekstrin türevleri [99]
Metillenmiş siklodekstrin türevleri, her bir glukopiranöz ünitesine iki veya üç tane
hidroksil grubunun metilasyonu ile elde edilir. İki hidroksil grubunun metillenmesi
durumunda dimetil siklodekstrin (DM-CDs) oluşur ve metillenme bütün C6 primer
hidroksil ve bütün C2 sekonder hidroksil gruplarında seçici olarak gerçekleştirilir.
Üç hidroksil grubu metillendiği zaman ise trimetil siklodektrin (TM-CDs) oluşur ve
bu durumda DM-CDs sentezine ek olarak bütün C3 sekonder hidroksil grupları da
metillenir [83]. Metillenmiş siklodestrin türevlerinin, esas alınan siklodekstrinlere
göre
çözünürlükleri
daha
fazladır.
Örneğin;
β-siklodekstrinin
25oC’deki
çözünürlüğü 1,85 g/100 ml’dir. Bu değer DM-CDs’de 57 g/100 ml; TM-CDs’de
31g/100 ml’dir [91].
Hidroksipropillenmiş siklodekstrin türevlerinde, metillenmiş siklodekstrindeki gibi
seçici sübstitüsyon gerçekleşmez. Siklodekstrin içindeki hidroksillerin sayısı sabit
olmasına rağmen reaksiyon ilerledikçe hidroksil reaktivitesi değişir. Bu durum farklı
derecelerde sübstitüsyon içeren ürünler oluşmasına yol açar. Hidroksipropil
siklodekstrinler, amorf yapıları nedeniyle suda çok yüksek oranda çözünürler.
Çözünmeleri endotermiktir ve artan sıcaklığa bağlı olarak çözünürlüğünde azalma
gerçekleşmez. 25oC’de 50g/100ml’den fazla çözünürlüğe sahiptirler. Metillenmiş
siklodekstrinlerin aksine, gastro-intestinal amilaz ile hidrolize olmazlar. Parenteral
uygulamalarında, temel alınan siklodekstrine göre daha az hemolitik aktivite
gösterirler [91].
29
Sülfobütileter siklodekstrinler, anyonik ve suda çözünen siklodekstrin türevidir [92].
Diğer siklodekstrin türevlerinden üstün olmasını sağlayan özelliği sübstitüsyon
derecesi artışına bağlı olarak ilaca bağlanmada artış olmasıdır. İlaç stabilitesini
arttırır. Polianyonik yapıya bağlı olarak daha az hemolize neden olur [90].
2.4.4. Amfifilik Siklodekstrinler
Doğal siklodekstrinlerin çözünürlüğünü arttırmak için sentezlenen siklodestrin
türevlerinde meydana gelen en büyük sorun iç yüzeyinin olduğu kadar dış
yüzeyinin de hidrofilik özellikte olmasıdır. Çünkü bu durum biyolojik membranlarla
siklodekstrinlerin temasının azalmasına neden olmaktadır. İstenmeyen bu
sonucun önüne geçebilmek için son yıllarda farklı amfifilik siklodekstrin türevleri
sentezlenmektedir
[93].
Amfifilik
siklodekstrinlerin
sentezlenmesinin
diğer
nedenleri ise siklodekstrinlerin yapısına uzun alifatik zincirler eklenerek hidrofobik
ilaçlarla etkileşimini arttırmak ve fizyolojik pH’da ve sulu ortamda kendiliğinden
biraraya gelerek nanoküre ve nanokapsül oluşumuna imkan sağlamak olarak
sıralanabilir [90]. İlk amfifilik siklodextrin 1986 yılında Kawabata tarafından
sentezlenmiştir. β-CD’in primer yüzeyini çeşitli uzunluktaki alkilsülfinil gruplarıyla
hidrofobik yapmıştır [94].
Şekil 2.15. Amfifilik siklodekstrin türevleri [90]
30
2.4.4.1. Noniyonik Amfifilik Siklodekstrinler
Noniyonik amfifilik siklodekstrinler, siklodekstrinlerin glukopiranoz ünitelerinin
primer veya sekonder yüzeyine farklı uzunlukta alifatik zincirler eklenmesi sonucu
elde edilirler. Yapılarına göre farklı türevleri vardır (Şekil 2.15).
Lolipop siklodekstrinler 6-amino-β-siklodekstrinlerin yapısına sadece bir alifatik
zincir eklenmesiyle elde edilen amfifilik siklodekstrin türevleridir. Bu siklodestrin
türevinde, alifatik zincir siklodekstrinin kavitesine girerek molekülle inklüzyon
kompleks oluşumunu engelleyebilir. Bu durumu engellemek için alifatik zincirlerin
ucuna çok sayıda terbütil grubu eklenebilir. Bu şekilde elde edilen siklodekstrin
türevi kap ve top siklodekstrindir. Medusa benzeri siklodekstrin sentezi sırasında
β- siklodekstrinlerin primer hidroksil gruplara 10-16 karbon içeren uzun zincirler
eklenir. Etek şeklinde siklodekstrinlerde, α ve γ- siklodektrinlerin sekonder
yüzeylerine
2-14
karbon
içeren
alifatik
esterler
eklenir.
Buket
şeklinde
siklodekstrinler, 3-monometil-β-siklidekstrinlerin toplamda 14 olmak üzere her iki
yüzeyine de polimetilen zincirlerin eklenmesiyle sentezlenir.
2.4.4.2. Katyonik Amfifilik Siklodekstrinler
Katyonik amfifilik siklodekstrinler son yıllarda üzerinde yoğunlaşılan siklodekstrin
türeleridir. Katyonik amfifilik siklodekstrin türevlerinin hazırlanmasında iyonik grup
olarak amino grupları kullanılmaktadır. Katyonik amfifilik siklodekstrinlerin
oluşumunun, yapısındaki hidrofobik kuyruk (tiyoalkil zincirleri) ile hidrofilik
bileşenleri
(etilen
düşünülmektredir.
glikol
oligomerleri)
arasındaki
dengeye
bağlı
olduğu
Etilen glikol zincirlerinin varlığının, katyonik siklodekstrinler
tarafından meydana getirilen çok moleküllü agregatların kolloidal stabilitesini
artırdığına inanılmaktadır [90].
İlaç
ve
özellikle
gen
taşınımında
son
yıllarda
poliamino
(polikatyonik)
siklodekstrinler kullanılmaktadır (Şekil 2.16.). Katyonik polimerler, nükleik asitlere
ve nükleotitlere yüzey yüklerinden dolayı kolayca bağlanabilmektedir.
31
Şekil 2.16. Etek şeklinde (solda) ve Medusa benzeri (sağda) Polikatyonik
Amfifilik Siklodekstrinin (paCDs) şematik gösterimi [96]
Katyonik/Polikatyonik siklodekstrinlerin, en önemli avantajı gen taşınımında in vitro
ve in vivo çalışmalarda poli(amidin) gibi polimerlere karşı daha düşük sitotoksisite
göstermesidir
[95-97].
Katyonik
siklodekstrinler
de
nükleotidleri
bağlama/
nükleotidlere büyük bir bağlanma eğilimi gösterirler ve viral vektörler ile taşınımını
artırırlar. Polikatyonik CD lerin ve bunlardan hazırlanan nanopartiküllerinin en
büyük avantajı,
bu polimerlerin kendi organize olabilme özellikleri ile beraber
nükleik asitlerle etkileşime girebilme yeteneklerinin artmasıdır. Böylece gen
tedavisinde kullanılmaya yönelik polipleksler olarak öne çıkmaktadırlar [90].
2.4.4.3. Anyonik Amfifilik Siklodekstrinler
Anyonik amfifilik siklodekstrin türevlerinin hazırlanmasında anyonik özellikteki
sülfat
grupları
kullanılmaktadır.
Açil-sülfatlanmış-β-CD’lerin
eldesi
için,
siklodekstrinin primer yüzüne sülfat gruplarının, sekonder yüzüne ise yağ asidi
esterlerinin bağlandığı, etkin ve spesifik bir sentetik yol açıklanmıştır [98]. Bu
türevleri sulu ortamlarda agregat oluşturabilirler.
Yapılan çalışmada, Sul-β-siklodekstrinin ve SBE7-β-siklodekstrinin in vivo ve in
vitro insülin glarjinin çözünürlüğünü ve etkinliğini arttırdığı gösterilmiştir [100].
Florin içeren anyonik β-siklodekstrinler, ilk olarak Granger ve arkadaşları
tarafından 6 pozisyonuna triflorometilthio gruplarının bağlanması ile elde edilmiştir.
Hava-su ara yüzünde amfifilik bir davranış elde etmişler ve bunu yeni sınıf amfifilik
taşıyıcılar için iyi bir aday olarak düşünmüşlerdir [90].
32
2.4.5. Siklodekstrin: İlaç İnklüzyon Kompleksi
Siklodekstrin molekülünün merkezi kavitesi apolardır. İnklüzyon kompleksi
oluşturmak için sulu çözeltilerde uygun büyüklükteki molekülün tamamı veya bir
kısmı bu lipofilik kaviteye tersinir olarak hapsedilir [84]. Genellikle ilaç molekülü ile
siklodekstrin
arasında
1:1
stokiometrik
oran
beklenmektedir
ancak
bazı
bileşiklerde 1:2 veya 2:1 oranında kompleks oluşumu da gözlenebilir (Şekil 2.17).
1:1
1:2
2:1
Şekil 2.17. Farklı ilaç: siklodekstrin inklüzyon kompleksi oranları
İnklüzyon kompleksinin avantajları aşağıdaki şekilde sıralanabilir [101].
Çözünürlüğün
Arttırılması:
Siklodekstrinlerin
inklüzyon
kompleksleri,
suda
çözünürlüğü düşük olan ilaçların, yapılarında bulunan apolar molekül veya
fonksiyonel grupları yardımıyla çözünürlüğünü arttırmaktadır. Siklodekstrinlerin dış
yüzeyleri hidrofilik olduğu için, çevre ile temas halindedir ve ilacı hidrofobik
kavitesinde saklayarak sulu çevreden korur.
Biyoyararlanımın Arttırılması: Antikanser ilaçların genellikle sudaki çözünürlükleri
düşük oldukları için biyoyararlanımları da düşük olmaktadır. Bu etkin maddelerin
siklodekstrinlerle
formülasyonu
biyoyararlanımda
artış
sağlamaktadır.
Oral
uygulamada absorbsiyonun ilk koşulu etkin maddenin formülasyondan çözünmüş
halde salınmasıdır. İlaçlar vücuda siklodekstrin içinde verildiğinde çözünme oranı
ve buna bağlı olarak biyoyararlanımı artmaktadır. Aynı zamanda siklodekstrinlerin,
ilacın hidrofobik özelliğini azaltması rektal ve perkütan absorbsiyonunu da
arttırmaktadır.
33
Stabiliteyi arttırmak: Siklodekstrinler ilaçların kimyasal, fiziksel ve termal
stabilitelerini
arttırmaktadır.
Kavitesinde
taşıdığı
aktif
molekülü;
oksijen
degredasyonundan, kimyasal enzimlerden, su, radyasyon ve ısıdan koruduğu için
stabil kalmasını sağlar.
İrritasyonu Azaltmak: İlaçların, inklüzyon kompleksi oluşturularak uygulanması
serbest ilacın biyolojik membranlarda lokal konsantrasyonunu azaltacağı için
meydana gelecek irritasyonun da önüne geçilir.
Tat ve Koku Maskelemesi: İlaç molekülü siklodekstrinlerin fonksiyonel grupları
tarafından iç hidrofobik kavitede saklanacağı için uygulama sonrası sensör
reseptörlerinde uyarı oluşturmazlar. İstenmeyen tat ve koku maskelenmiş olur.
2.4.6. Siklodekstrinlerin Farmasötik Uygulama Alanları
İlaç etkin maddesinin, hücre membranına ulaşabilmesi için sudaki çözünürlüğünün
yeterli olması gerekmektedir. Ancak hücreye ulaştıktan sonra da hücre
membranından
geçebilmesi
için
yeterince
hidrofobik
özellikte
olması
gerekmektedir [89]. Siklodekstrinlerin en önemli özellikleri biyolojik membranlar
boyunca, ilaç taşınımını arttırmasıdır. Siklodekstrinler moleküler ağırlıkları 10001500 dalton arasında olan, hidrofilik dış yapıya sahip büyük moleküllerdir ve bu
şartlarda biyolojik membranlardan güçlükle geçerler [102]. Bu nedenle lipofilik
membranlar, hidrofilik siklodekstrin molekülüne düşük afinite gösterirler. Alkol ve
yağ asidi gibi konvansiyonal penetrasyon arttırıcılar, biyolojik bariyerlerin lipid
tabaka yapısını bozarlar. Ancak siklodekstriler, ilacın yapısında değişikliklere
neden olarak biyolojik membranlarla temasını arttırır.
Farmasötik aktif ajanların büyük çoğunluğu hidrofobik yapıdadır. Bu sorunun
önüne geçebilmek için konvansiyonel formülasyon sistemlerinde birden fazla
organik çözücünün kombinasyonu, sürfaktan veya aşırı pH değişiklikleri
kullanılmaktadır ve bunlar iritasyonla birlikte istenmeyen yan etkilere sebep
olmaktadırlar. Buna karşılık siklodekstrinler iritan etki göstermezler ve ilacın
stabilitesini arttırmak, kötü tat ve koku maskelemek gibi aktif ajan üzerinde çeşitli
avantajları vardır.
34
Siklodekstrinlerin
ilaç
etkin
maddesinin
çözünürlüğünü
arttırması,
ilacın
biyoyararlanımını arttırarak uygulanacak terapötik dozun ve doza bağlı istenmeyen
yan etkilerin azalmasını sağlayabilir [89].
Oral İlaç Taşınması: Oral uygulama bütün uygulama yolları arasında en popüler
olandır. Oral uygulama sırasında ilacın salımı, çözünürlük, difüzyon, osmotik,
yoğunluk ve pH gibi parametreler tarafından kontrol edilir. Siklodekstrinler oral
uygulamada özellikle ilaçın absorbe edileceği lipofilik gastrointestinal sistem
boyunca
geçişini
siklodekstrin
ve
kolaylaştırmada
β-siklodekstrinlerin
eksipiyan
tükürük
olarak
ile
kullanılırlar
hidroliz
[101].
olmamaları
αilaç:
siklodekstrin inklüzyon komplekslerinin oral uygulama için kullanılabilmesinin
mümkün
olduğunu
göstermektedir
(Çizelge
2.6).
Oral
uygulama
için
siklodekstrinlerin sahip olduğu en önemli avantajlardan birisi de kötü tat ve koku
maskelenmesidir. Doğal siklodekstrinler ve bunların türevleri (sülfatlanmış αsiklodekstrin, sülfatlanmış β-siklodekstrin, karboksimetil β-siklodekstrin) ağız içinde
kötü kokuya neden olan organik asit, amin ve amino asit gibi bileşiklerin
maskelenmesinde kullanılmaktadır [103]. Kötü tat maskelemede iki yöntem vardır:
•
Siklodekstrinlerin kötü tat oluşumuna neden olan molekül ile inklüzyon
kompleksi oluşturması sonucu molekül ile tat tomurcukları arasındaki
temasın azalması
•
Siklodekstrinlerin tat alma tomurcuklarında lokalize olmuş ‘bekçi’ olarak
adlandırılan proteinlerle etkileşimi sonucu proteinleri paralize etmesi
Çizelge 2.6. Siklodekstrinlerin oral uygulamasına örnekler
Siklodekstrin türevleri
Aktif Molekül
Referans
CM-β-CD
Laktik asit ve süksinik asit
[103]
β-CD
Flurbiprofen
[104]
β-CD; γ-CD; HP- β-CD; DM- β-CD
Cilostazol
[105]
β-CD; HP- β-CD
Efavirenz
[106]
HP- β-CD;
Paklitaksel
[107]
β-CD; HP- β-CD;NH- β-CD
Paklitaksel
[108]
HP- β-CD
Rifampisin
[109]
35
Çizelge 2.6. devam ediyor
β-CD; HP- β-CD
Gefitinib
[110]
Sülfobütileter- β-CD
Dosetaksel
[111]
Me-β-CD
Dosetaksel
[112]
Me-β-CD
Karmofur
[113]
Me-β-CD
Sakuinavir
[114]
Nazal İlaç Taşınması: Gastrointestinal bozulma ve yüksek hepatik ilk geçiş etkisi
nedeniyle düşük biyoyararlanım gösteren yüksek potensli ilaçların, sistemik salımı
için yeni bir uygulama alanı nazal yoldur [101]. Siklodekstrinler, biyolojik
bariyerlerin yapısını bozmadan ilaçların etkinliklerini arttırırlar. Bu özellikleri
siklodekstrinlerin nazal ilaç salım sistemi olarak uygulanmasında kullanılmasının
en önemli nedenleridir. Nazal preparatlar bakteri, toz gibi alerjenler üzerinde
solunum sisteminde koruyucu görev yapan mukosiliyallerin fonksiyonlarında olası
etkileri açısından ciddi anlamda değerlendirilmelidir. Bu açıdan serbest steroidlerin
aksine, siklodekstrin komplekslerinin kaviteleri, içerdikleri moleküllerin kendine
özgü toksisitesini gizledikleri için epitel membranlar üzerinde herhangi bir etki
göstermemişlerdir [115].
Oküler İlaç Taşınması:
Oftalmik ilaç taşınmasında en büyük problem gözün drenaj ve gözyaşı nedeniyle
hızla ilaç kaybıdır [83]. İlaç göz içinden konjuktiva, kornea ve sklera membranları
(lipofilik) boyunca penetre olmak durumundadır. Bu membranlar gözyaşı sıvısı ve
müsin tabakası ile çevrilidir. Bu nedenle oftalmik ilaçlar gözün dış kısmından
(gözyaşı sıvısı ve müsin tabakası) içeri girebilmek için hidrofilik olmak zorundadır,
ancak aynı zamanda oküler bariyerlerden gözün iç kısmına penetre olabilmek için
yeterli oranda lipofilik özellik de göstermek zorundadırlar [116].
Bu bağlamda siklodekstrinler ilaçların çözünürlüğünü ve korneal permeabilitelerini
artırmak açısından alternatif bir yaklaşım sunabilirler. Yapılan çalışmalarla oftalmik
ilaçların siklodekstrinlerler ile inklüzyon komplekslerinin, ilaçların kimyasal
36
yapılarını
ve
aktivitelerini
değiştirmeden
suda
çözünürlüklerini
artırdığı
bulunmuştur [117-119].
Dermal İlaç Taşınması: Transdermal ilaç taşınması ve ilacın salımı, bu yolla
uygulanan birçok bileşik için bir bariyer görevi gören stratum korneum tabakası
yüzünden sınırlanmaktadır. Bu nedenle, ilacın absorbsiyonunu artırmak için birçok
metot test edilmektedir. Deri üzerinden ilaç taşınmasını artırmak için 4 farklı
yaklaşım öne sürülmektedir [83]:
•
Transdermal preparatlardan ilacın salımını artırmak
•
İlacın deride tutulmasını veya deri boyunca akışını geliştirmek
•
Dokuya hedeflendirilebilmesini artırmak (lokalize ilaç taşınması)
•
İlk dört maddenin kombinasyonunu sağlamak
Bu kriterleri sağlamak için çeşitli sürfaktanlar, lipozomlar, geçirgenlik artırıcılar,
iyon çiftleri kullanılmıştır. Son yıllarda ise kimyasal olarak modifiye edilmiş CD’lerin
çeşitli türevleri, hem sistemik hem lokal olarak ilaçların dermal yoldan
taşınmasında hazırlanmıştır [120].
Siklodekstrinlerin, dermal ilaç taşınımında kullanılabilmesi için terapötik açıdan
inert olmaları, derinin ısıdan, radyasyondan koruma gibi doğal fonksiyonlarına
engel olmamaları, deri pH’ını değiştirmemeleri, iritasyona neden olmamaları ve
derinin bileşenleri ile etkileşime girmemeleri gerekir [100].
Rektal İlaç Taşınması: Rektal mukoza ilk geçiş etkisi yüksek olan, gastrointestinal
pH’dan etkilenen, kötü tat ve kokulu ilaç moleküllerinin taşınması için alternatif bi
yoldur. Çocuklar, bebekler, mide bulantısı görülen hastalar ve yaşlılar için rektal
yol çok önemli bir ilaç taşınım sistemidir. Ancak, ilaçların rektal yolla
uygulanmasında şu zorluklarla karşı karşıya gelinmektedir:
•
İlaçların çoğu rektal mukozadan güçlükle absorbe olur
•
Rektal mukozada absorbiyon yüzey alanı sınırlıdır
37
•
Rektumdaki az miktardaki sıvı varlığından dolayı etkin olmayan çözünme
gerçekleşir.
Bu dezavantajların üstesinden gelebilmek için absorbsiyon artırıcılar, misel
karışımları ve polimerler, sürfaktanların yanısıra siklodekstrinler kullanılarak çok
sayıda çalışmalar yapılmıştır (Çizelge 2.7).
Çizelge 2.7. Siklodekstrinlerin rektal uygulamasına örnekler
Özellik
Etken madde
Referans
İlaç salımının arttırılması
İnsülin
[121]
Rektal absorbsiyonun arttırılması
Morfin
[122]
Rektal iritasyonun azaltılması
Prednizolon
[123]
Biyoyararlanımın arttırılması
Morfin
[124]
2.4.7. Siklodekstrin İçeren Ticari Formülasyonlar
Siklodekstrin veya siklodekstrin türevleri ile çeşitli ilaç gruplarının oluşturduğu
inklüzyon
kompleksleri,
Türkiye’de
ve
Dünya’da
ticari
formülasyonlarda
kullanılmaktadır. Siklodekstrinlerin çözünürleştirici madde olarak kullanıldığı oral
ve injektabl ticari formülasyonlardan bazıları Çizelge 2.8’de gösterilmiştir.
Çizelge 2.8. Siklodekstrin içeren ticari preparatlara örnekler [84,85,125]
İlaç/ Siklodekstrin
Ticari İsim / Firma
Formülasyon
Endikasyon
α- Siklodekstrin içeren ürünler
OP-1206
Opalmon
Tablet
Buerger hastalığı
Sefotiam heksetil (HCl)
Pansporin T
Tablet
Antibiyotik
β-siklodekstrin içeren ürünler
Beneksat HCl
Ulgut
Kapsül
Antiülser
Sefalosporin (ME 1207)
Meiact
Tablet
Antibiyotik
Deksametazon
Glymesason
Merhem
Analjezik, Antienflamatuar
Difenhidramin HCl
Stada-Travel
Çiğneme Tableti
Antihistaminik
Nikotin
Nicorette
Dil altı tableti
Sigara bağımlılığı
Nimesulid
Nimedex
Tablet
Analjezik, Antipiretik
Nitrogliserin
Nitropen
Dil altı tableti
Koroner dilatör
Omeprazol
Omebeta
Tablet
Protein pompası inhibitörü
38
Çizelge 2.8.devam ediyor
Piroksikam
Brexin
Tablet, Supotizuvar
Analjezik, antifilojistik
2-Hidroksipropil-β-siklodekstrin içeren ürünler
Itrakonazol
Sporanox
Oral ve i.v. solüsyon
Antifungal
Mitomisin
Mitozytrex
i.v. infüzyon
Antineoplastik
Indometazin
Indocid
Göz damlası
Antienflamatuar
Hidrokortizon
Dexocort
Dilaltı
Hormon
Metillenmiş β-siklodekstrin içeren ürünler
Kloramfenikol
Clorocil
Göz damlası
Antimikrobiyal
17β-Estradiol
Aerodiol
Burun spreyi
Menapoz semptonları
Sülfobütileter β-siklodekstrin içeren ürünler
Vorikonazol
Vfend
i.v. solüsyon
Antifungal
Aripiprazol
Abilify
i.m. solüsyon
Şizofreni
Maropitant
Cerenia
Parenteral solüsyon
Antiemetik
Ziprasidon mesilat
Geodon
IM solüsyon
Antipsikotik
Göz damlası
Antienflamatuar
2-Hidroksipropil-γ-siklodekstrin içeren ürünler
Diklofenak sodyum
Voltaren
2.5. Nanoteknoloji
Nanoteknoloji, kısaca maddeyi moleküler ve atomik seviyede kontrol edebilen bir
bilimdir. Yunanca ‘cüce’ anlamına karşılık gelen nano kelimesinden türetilmiştir.
Nanoteknoloji kelimesi ilk olarak 1974 yılında Norio Taniguchi tarafından
yayınlanan bir makalede kullanılmıştır. Taniguchi, nanoteknolojiyi ‘genel olarak
malzemelerinnin atom ya da molekül işlenmesi, ayrılması, birleştirilmesi ve
bozulması’ olarak tanımlamıştır [126]. Günümüzde nanoteknolojinin NNI ( National
Nanotechnology Initiative) tarafından yapılan ve US EPA (United States
Environmental Protection Agency) tarafından da kabul edilen temelde aşağıdaki 3
unsuru içeren tanımı kullanılmaktadır:
•
En az 1 boyutu 1-100 nm arasında olan, atomik, moleküler ve
makromoleküler seviyede araştırmalar ve teknolojik gelişmelerin yapılması
•
Üretilen ve kullanılan bu cihaz, sistem ve yapıların küçük boyutları
sayesinde yeni özellik ve fonksiyonlara sahip olmaları
•
Yapılan bu sistemlerin atomik boyutta kontrol edilebilmesi [126,127]
39
2.5.1. Nanoonkoloji
Nanoonkoloji, kanser tanı, teşhisinde ve tedavisinde nano ölçekte yapılan tüm
uygulamalardır. Nanoonkoloji çalışmaları tanıya yönelik çalışmalar (diagnostik) ve
tedaviye yönelik çalışmalar (terapötik) olmak üzere temelde ikiye ayrılır. Bununla
birlikte nanoteknolojideki gelişmeler sayesinde tanı ve tedavinin birlikte yapıldığı
sistemlerin de oluşturulması planlanmakta ve bu konuda çeşitli çalışmalar
yapılmaktadır [128,129].
Günümüzde farklı nanotaşıyıcı sistemler kullanılarak formüle edilmiş ticari
preparatlar mevcuttur (Çizelge 2.9.).
Çizelge. 2.9. Nanoteknolojik ilaç taşıyıcı sistemlerin ticari preparat örnekleri [130]
Etken Madde
Ticari İsim
Nanotaşıyıcı
Endikasyon
Neokarzinestotin
Zinostatin
Polimer-protein konjugatı
Hepatoselüler karsinoma
PEG-L-asparajinaz
Oncaspar
Polimer-protein konjugat
Akut lenfoblastik lösemi
PEG-granülosit
Neulasta
Polimer- protein konjugat
Kemoterapi
koloni
stimüle edici faktör
IL2 difteri toksini
nedenli
nötropeniyi önlemek
Ontak
Kemo-immüno konjugat
KütanözT-hücresi lenfoma
Mylotarg
Radyo-immüno konjugat
Akut miyelgenöz lösemi
Anti-CD20- İodine-131
Bexxar
Radyo-immüno konjugat
Non-Hodgin lenfoma
Daunarubisin
DaonuXome
Lipozom
Kaposi sarkomu
Doksorubisin
Mycoset
Lipozom
Meme
Anti
CD33
antikor-
kalikamisin
kanseri,
ovaryum
kanseri, Kaposi sarkomu
Doksorubisin
Doxil
PEG-lipozom
Meme
kanseri,
ovaryum
kanseri
Vinkristin
Onco TCS
Lipozom
Non-Hodgin lenfoma
Paklitaksel
Abraxane
Albümin
Metastatik meme kanser
40
Kemoterapi
ilaçları
hastalara
genellikle
intravenöz
veya
oral
yolla
uygulanmaktadır. Her iki yolla da vücuda verilen ilacın kanser ücresi üzerinde
terapötik
etki
gösterebilmesi
için
çeşitli
biyolojik
bariyerlerden
geçmesi
gerekmektedir [131]. İlacın vücuda girdikten sonra karşılaştığı bariyerler aşağıda
belirtildiği gibi sınıflandırılabilir [31]:
•
Fiziksel bariyerler (örn: gastrointestinal kanaldan ve deriden absorbsiyon)
•
Fizyolojik bariyerler (örn: retiküloendotelyal sistem, p-glikoprotein pompası
gibi hücresel ilaç atım mekanizmaları)
•
Biyofiziksel bariyerler (örn: tümörün damar yapısı, interstisyel basınç, tümör
yüzeyindeki reseptörlerin çeşidi ve yoğunluğu)
Farklı yollarla vücuda verilen ilacın terapötik etki gösterebilmesi için bu
bariyerlerden
yapısında
bir
değişiklik
olmadan
geçtikten
sonra
istenilen
konsantrasyonda tümörlü bölgede toplanması gerekmektedir. Kanser hücrelerinin
sahip olduğu çeşitli özellikler nedeniyle ilacın tümörlü bölgede toplanması her
zaman kolay olmamaktadır. Nanoonkoloji alanında yapılan çalışmaların temel
amacı, ilacı çeşitli partiküler taşıyıcı sistemler ile vücuda verilip bu mekanizmaları
atlatarak tümörlü bölgeye ulaştırılmasını sağlamaktır [31].
Antineoplastik ajanların vücut içinde karşılaştığı bazı engelleyici mekanizmalar
aşağıdaki gibidir:
Terapötiklerin dolaşımdan uzaklaştırılması: Damar içi yolla uygulanan terapötik
moleküllerin hedefleme bölgesine ulaşabilmek ve terapötik etkilerini göstermek için
sistemde yeterince uzun süre dolaşmaları gerekmektedir. Ancak retiküloendotelyal
sistem (RES) olarak adlandırılan karaciğer, dalak, kemik iliği kan ve lenf sistemi
elemanlarından oluşan çoklu savunma sistemi, dolaşımda bulunan yabancı
maddeleri çok kısa sürede dolaşımdan uzaklaştırmaktır. Tek bir ilacın dolaşım
yarılanma ömrü ortalama 5 dakika ile sınırlıyken, aynı ya da daha fazla dozda ilaç
içeren partiküler formülasyonlar sistemik dolaşıma uygulandığında bu süre birkaç
saate kadar çıkmaktadır [31]. Bu amaçla kullanılan polietilen glikol (PEG),
nanopartikül sistemlerinin yüzeylerini zırh gibi örterek RES tarafından tanınmasını
engeller ve dolaşımda daha uzun süre kalmalarını sağlar. İlaç yeterli süre
dolaşımda kaldıktan sonra kılcal damarlarla etki göstereceği dokuya ulaşmalıdır.
41
Kılcal damarların ortalama çapı 5-10 µm’dir. Bu sebeple 5 μm den büyük çaplı
partiküller vasküler embolizasyona neden olabilirler [132]. Ancak 20-30 nm’den
küçük partiküller ise dokuya ulaşmadan, sistemik dolaşımda bulunan fenestra adı
verilen boşluklardan damar dışına çıkma eğilimi gösterirler. Bütün bu engelleri
aşabilmek için, taşıyıcı partiküller hedef dokuya ulaşıncaya kadar dolaşımda
kalabilmeli ve boyutları kapilerlerden geçebilecek kadar küçük ancak fenestradan
geçemeyecek kadar da büyük olmalıdırlar [31].
Terapötik ajanın hücresel alımı: Biyoaktif bileşiklerin ve terapötik ajanların çoğu, ya
tümör yüzeyindeki reseptörle ve sitoplazma ile ya da çekirdeğe ait bileşenlerle
etkileşime girer. Terapötik etkilerini hücre yüzeyi veya ekstraselüler bileşenler
arasından gösteren bileşiklerin aksine, birçok kemoterapötik ajan (doksorubisin,
paklitaksel, etoposid…), etkilerini göstermek için hücre içine girmek zorundadırlar.
Ancak, hücre zarı düzenleyici olarak görev yapar ve hücre devamlılığını sağlayan
maddelerin hücreye giriş ve çıkışını düzenleyerek hücreyi dışardan korur.
Bununla birlikte membranlar ilaç taşıyıcı sistemler için de bariyer görevi
görebilirler. Hücrenin endositik yolaklarına bağlı olarak nanopartiküller farklı giriş
yolları izleyerek etkin maddeyi hücre içine taşıyabilirler [31].
Tümör heterojenitesi: Meme kanseri tedavisinde en büyük problemlerden birisi de
onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin umulanın dışında oluşumunu ve
mutasyonunu kapsayan tümör heterojenitesidir. Bunların dışında apaptoz, hücre
döngüsü kontrolü, onarım mekanizması, ilaç direnci ve metastaz gibi çok sayıda
hücre mekanizmalarında da değişime neden olur [133]. Tümör heterojenitesi
sorununu ortadan kaldırmak amacıyla kişiye özel çoklu kemoterapi için
nanoteknoloji bazlı ilaç taşıcıyı sistemler kullanılması öngörülmektedir [134].
Tümör iç/interstisyel basıncı: İnterstisyel sıvı basıncı meme, melanoma, kolon
kanseri gibi çoğu katı tümörlerde artış göstermektedir [135]. Artan interstisyel sıvı
basıncı (IFP), tümörlerde transkapiler taşınımında ve ilaç tutulma süresinde
azalmaya neden olur. Yüksek IFP, sadece terapötik ajanın tümörden içeriye
alınmasını engellemekle kalmaz alınan molekülün tümörden dolaşıma geri
atılmasına neden olur [31]. Birçok normal dokuda IFP yaklaşık 0 mmHg iken, farklı
türden karsinomalarda basınç 14 den 30 mmHg’a değişiklik göstermektedir.
İnvaziv duktal karsinoma hastalarında IFP değeri 29±3
mm Hg iken, normal
42
meme parenkimasında −0.3±0.1 mm Hg, iyi huylu tümörlerde 3.6±0.8 mm Hg, non
invaziv karsinomalarda −0.3±0.2 mm Hg dır. Yapılan bazı çalışmalar paklitaksel
uygulanmasının ortalama IFP değerini %36 düşürdüğünü göstermektedir [135].
2.5.2. Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemler
2.5.2.1. Nanopartiküler İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Avantajları
Nanopartiküller boyutları 10-1000 nm olan kolloidal, submikronik yapılardır. İlaçlar
nanopartiküllerin içine çeşitli metotlarla yüklenebilirler; enkapsüle edilebilirler,
yüzeye adsorbe olabilirler veya tutunabilirler [136]. Nanopartiküller küçük
boyutlarından dolayı ince kapilerlerden membranları aşarak hücrelere ulaşıp hedef
bölgede birikme yapabilirler. Bu sebeple, istenmeyen yan etki ve terapötik
maddenin toksisitesi azaltılmış ve terapötik etki de artırılmış olur [137]. Bununla
birlikte terapötik ajanlar için konvansiyonel yöntemlerin sunamadığı ilaç stabilitesi
ve yüksek biyoyararlanım gibi yeni terapötik fırsatlar sunmaktadırlar [138].
Nanopartiküllerin avantajlarından bir tanesi büyüklüklerinin ayarlanabilir olmasıdır
[139].
İlaç
taşıyıcı
sistemlerin
partikül
büyüklükleri
dolaşım
süresini
ve
biyoyararlanımı etkiler. İlaç taşıyıcı sistemlerdeki nanopartiküllerin büyüklükleri kan
damarlarından
sızmayacak
kadar
küçük,
ancak
retiküloendotelyal
sistem
tarafından makrofaja uğramayacak kadar da büyük olmalıdır. Tümörlü bölgedeki
damarların kavşak aralıkların büyüklüğü 100 ile 600 nm arasında değişmektedir.
Bu nedenle nanopartiküllerin çift damarlı yapıyı aşarak tümörlü bölgeye
ulaşabilmesi için büyüklüğü ortalama 200 nm kadar olmalıdır [140].
Nanopartiküller ideal olarak makrofaj alımından kaçmak için hidrofilik bir yüzeye
sahip olmalıdırlar.
Bu iki yolla başarılır; nanopartikülün yüzeyini PEG gibi bir
polimerle
proteinleri
plazma
tarafından
opsonizasyonunu
engellemek
için
kaplamak veya alternatif olarak nanopartikülleri hidrofilik ve hidrofobik kısımları
olan blok kopolimerlerden hazırlamak olarak açıklanabilir [141, 142].
2.5.2.2. Hedeflendirme
Antikanser ilaçların çoğu normal ve kanserli hücreler arasında bir seçicilik
gösteremediği için
sistemik
toksisite ve yan etkilere neden olmaktadır.
Nanoteknoloji, bu alanda ilaçları hedeflendirilmiş tedavi ile uygulama imkânı
43
sunmaktadır. Kanser nanoteknolojisinde, nanopartiküler sistemlerin ilaçların
taşınması ve hedeflendirilmesinde kullanılması klinikte en heyecan verici yeni
yaklaşım haline gelmiştir [143].
2.5.2.2.1. Pasif Hedeflendirme
Hızlı büyüyen kanserli dokularda hızlı damarlanma, sızdırgan, kusurlu yapıya ve
bozulan lenfatik drenaja neden olmaktadır. Bu yapı, ‘artan geçirgenlik ve tutulma
etkisi (EPR) olarak adlandırılmaktadır [143, 144]. EPR etkisi, nanopartiküllerin
tümör bölgesinde akümüle olmasına neden olmaktadır (Şekil 2.18) [145]. Bu
şekildeki bir pasif hedeflendirme mekanizmasının işleyişi için, ilaç taşıyıcı
nanopartiküler sistemlerin büyüklük ve yüzey özellikleri, RES organları tarafından
alınmasına engel olmak için, kontrol edilmelidir.
Şekil 2.18. Tümör damar yapısı ve EPR etkisi [145]
2.5.2.2.2. Aktif Hedeflendirme
Aktif hedeflendirme, nanopartiküle hedefleyici bir bileşenin (tercihen tümöre sahip
organa, tümörün kendisine, özel kanser hücrelerine veya kanser hücreleri içindeki
intraselüler organellere birikecek şekilde) konjuge edilmesiyle sağlanır [143]. Bu
yaklaşım spesifik etkileşimlere dayanmaktadır, örneğin lektin-karbonhidrat, ligandreseptör ve antijen-antikor gibi. (Şekil 2.19) [130]. Birçok insan kanser türlerinde
44
antijen ya da reseptörün fazla miktarda bulunması, reseptör aracılı endositoz ile
etkili bir ilaç alımını sağlar.
Şekil 2.19. Nanotaşıyıcıların tümöre farklı ilaç taşıma stratejilerinin şematik
gösterimi [130]
2.5.2.3. Nanokapsül ve Nanoküre
Nanopartiküller boyutları 10-1000 nm arasında değişen submikronik kolloidal
sistemlerdir. Hazırlanma yöntemlerine göre nanoküre ya da nanokapsül
oluştururlar.
Nanokapsüller etken maddenin sıvı iç çekirdeğe hapsedildiği polimerik bir duvarla
çevrili veziküler sistemlerdir [146]. Nanokapsüller yağlı çekirdekleri nedeniyle
hidrofobik yapıda ilaçlar için polimerzomlar ise sulu çekirdekleri nedeniyle hidrofilik
ilaçların taşınması için uygun sistemlerdir [147].
Nanoküreler, matriks tipi katı kolloidal partiküllerdir. Nanokapsüllerin aksine
yapılarında yağlı veya sulu çekirdek bulundurmazlar. İlaç ve taşıyıcının
fizikokimyasal özelliklerine ve hazırlama yöntemine bağlı olarak, ilaç taşıyıcı
içerisine alınır ve/veya yüzeye adsorpsiyon ile hapsedilir. İlacın ve taşıyıcının
elektriksel yükleri de yükleme kapasitesini etkileyebilmektedir. Gözenekli olmayan
45
nanokürelere
ilacın
hapsedilebilmesi
ilacın
adsorpsiyonu
yolu
ile
gerçekleşmektedir (Şekil 2.20) [148].
Şekil 2.20. Nanokürelere ilaç yükleme modelleri: a) hapsetmek,
b) çözmek veya dağıtmak, c) adsorbe etmek [148]
İlacın kolloidal taşıyıcılardan salımı, taşıyıcının cinsine ve yükleme mekanizmasına
bağlı olarak gerçekleşmektedir. Bu sistemlerin spesifik yüzey alanları çok geniş
olduğu için, mikroküre ve mikrokapsül gibi sistemlere oranla ilaç salımı çok daha
hızlı olmaktadır [45].
2.5.2.4. Nanopartikül Hazırlama Yöntemleri
Nanopartiküllerin hazırlanmasında çok farklı yöntemler kullanılabilir. Kullanılacak
yöntemin şeçimi ilaçın, polimerin ve formülasyonda bulunan diğer kimyasalların
yapısal özelliklerine göre yapılır.
2.5.2.4.1. Önceden oluşturulmuş polimerin dispersiyonu
2.5.2.4.1.1. Emülsiyon bazlı yöntemler
Emülsiyon bazlı yöntemlerle partiküller, emülsiyonun oluşturulması ve çözücünün
uzaklaştırılması olmak üzere iki basamakta oluşur. Partiküller tekli, çift veya çoklu
emülsiyon
şeklinde
oluşturulabilirler.
Bütün
emülsiyon
bazlı
yöntemlerde
oluşturulan emülsiyon, hazırlanacak partikülün nihai özelliklerini belirler. Örneğin;
organik ve sulu fazın fizikokimyasal özellikleri, emülsiyonun damlacık büyüklüğü
ve
karıştırma
hızı
gibi
değişiklikler
oluşacak
nanopartikülün
özellikleri
etkilemektedir [82, 149].
46
Çözücü buharlaştırma/ ekstraksiyon yöntemi
Çözücü buharlaştırma/ ekstraksiyon yöntemi tekli emülsiyon ve çoklu emülsiyon
olmak üzere iki kategoriye ayrılır.
Tekli emülsiyon yönteminde polimer ve ilaç, suyla çok az karışabilen, uçucu bir
organik çözücü içinde çözündürüldükten sonra hacimce daha fazla olan ve
emülgatör içeren sulu faz içine emülsifiye edilir. Emülsiyon damlacıklarının
sertleşmesi için formülasyonda bulunan organik çözücü uçurulur. Sertleşen
partiküller filtrasyon veya santrifüjleme ile toplandıktan sonra su ile birkaç kez
yıkanır.
Çift emülsiyon yöntemi tekli emülsiyon yönteminin değiştirilmiş halidir. Hidrofilik
ilaçlar için uygun bir hazırlama yöntemidir. ilaç ve emülgatörün bulunduğu sulu faz
daha fazla hacimdeki organik faza eklenir. Oluşan su/yağ emülsiyonu daha fazla
hacimdeki sulu faza eklenir. Ardından saflaştırma işlemi uygulanır.
Spontan emülsifikasyon çözücü difüzyon
Bu yöntem çözücü buharlaştırma yönteminin değiştirilmiş halidir. Bu yöntemde
yağ fazı suda çözünen (aseton, metanol, etanol…) ve suda çözünmeyen
(diklorometan, kloroform…) iki farklı organik çözücüden oluşmaktadır. İlaç ve
polimer bu organik faz içinde çözüldükten sonra hacimce daha fazla ve emülgatör
içeren sulu fazla eklenir. Suda çözünen organik çözücünün su içinde difüzyonu iki
faz arasında yüzeylerarası türbülans oluşturur ve partiküller oluşur [82].
Tuzla Çöktürme
Tuzla çöktürme yöntemi normal şartlarda su ile karışabilen bir organik çözücünün
uygun tuz konsantrasyonu varlığında suda çözünmemesi temeline dayanır.
Organik faz elektrolit ve kolloidal stabilizan içeren sulu faza emülsifiye edilir. Sulu
faz içinde bulunan tuz iki fazın birbirine karışmasını engellemektedir. Bu yöntemin
en büyük avantajı formülasyon hazırlama sırasında sıcaklık uygulanmadığı için
ısıya duyarlı ilaç ve polimerler için uygun olmasıdır. Ancak, formülasyonda
kullanılan elektrolitlerin uzaklaştırılması çok zordur.
47
Emülsifikasyon çapraz bağlama ve bağlantılı teknikler
Bu yöntem ile partiküller oluşturulurken ilk önce ilaç, polimer ve emülgatör içeren
emülsiyon oluşturulur. Ardından emülsiyona çapraz ağlayıcı ajan eklenerek
partiküllerin oluşumu sağlanır. En sık kullanılan çapraz bağlayıcı ajan glutaraldehit,
kitosan ve jelatindir.
2.5.2.4.1.2. Nanopresipitasyon
Nanopresipitasyon yönteminde partiküllerin oluşması yüzeyler arası birikme
(çökelti oluşma) prensibine dayanır. Emülsiyon bazlı yöntemlerin aksine
nanopresipitasyonda emülsiyon oluşturmaya gerek yoktur (Şekil 2.21).
Şekil 2.21. Emülsiyon bazlı yöntemler ile nanopresipitasyon yönteminin
karşılaştırılması [150]
Nanopresipitasyon
yöntemi
ilk
olarak
Fessi
ve
arkadaşları
tarafından
tanımlanmıştır. Nanopresipitasyon yöntemiyle partikül hazırlanırken, polimer ve
ilaç suyla karışabilen organik çözücüde çözülür. Ardından organik faz sulu faza
eklenir. Organik çözücünün sulu faz içinde difüzyonu difüze olması sonucu
nanopartiküller oluşur. Nanopresipitasyon yönteminde polimer sulu faz içerisinde
48
çökelti oluşturduğu için nanopartiküller spontane olarak oluşur. Bu olay Marangoni
etkisi olarak bilinir.
Nanopresipitasyon yöntemi kolay ve ekonomik bir yöntemdir, özel koşul
gerektirmez. Ancak hidrofilik ilaçlarda, polimerin presipitasyonu sırasında ilacın
sulu faza difüze olması nedeniyle düşük enkapsülasyon etkinliği gösterir. Bu
yöntemde en sık kulanılan organik çözücüler aseton, asetonitril, diklorometan ve
kloroformdur. Sürfaktan olarak ise poloksamerler, Pluronic®, polisorbat ve Span
kullanılır [82].
Nanopresipitasyon yönteminde formülasyon bileşenleri oluşacak
partiküllerin karakterizasyonunda etkilidir (Çizelge 2.10).
Çizelge 2.10. Nanopresipitasyon yönteminde parametrelerin partikül üzerindeki
etkisi [82]
Değişken
Polimer
Organik Çözücü
Sulu Faz
Sürfaktan
Etki
Polimer konsantrasyonu arttıkça partikül büyüklüğü artar
Polimerin molekül ağırlığı arttıkça partikül büyüklüğü azalır
Organik fazın suda difüzyonu arttıkça partikül büyüklüğü küçülür
Organik fazın vizkositesi artarsa partikül büyüklüğü artar
Sulu fazın hacminin artması partikül büyüklüğünü değiştirmez
Sulu fazın hacminin artması enkapsülasyon etkinliğini düşürür
Sürfaktan miktarı arttıkça partikül büyüklüğü azalır
2.5.2.4.1.3. Koaservasyon
Koaservasyon yöntemi, polimerin partikül hazırlama sırasında çözünürlüğünün
azalması temeline dayanır. Basit ve kompleks koaservasyon olmak üzere iki farklı
türü vardır. Basit koaservasyonda formülasyona çözücü olmayan bir sıvının
eklenmesi veya sıcaklık, pH parametrelerinden birisinin değiştirilmesi sonucu
polimerin çözünürlüğü azaltılır. Kompleks koaservasyonda ise zıt yüklere sahip
makromoleküller kullanılır. Koaservasyon yöntemi hem hidrofilik hem de lipofilik
ilaçlar için uygun bir yöntemdir.
2.5.2.4.1.4. Püskürterek Kurutma/Püskürterek Dondurma
Püskürterek kurutma yöntemi sıcak kuru ortamda sıvı halden katı partiküler hale
geçmesi temeline dayanır. Partiküller damlacıklar halinde oluşur. Püskürterek
49
dondurma da ise, ilk olarak ilaç ve polimer erime derecesinin üzerinde atomize
edilir. Ardından damlacıklar soğuk hava ile sertleştirilir.
2.5.2.4.1.5. Süperkritik Sıvı Teknolojisi
İki farklı yöntem verdır. Süperkritik çözeltinin hızla genleşmesi yönteminde, ilaç ve
polimer istenilen basınca ve sıcaklığa getirilen süperkritik çözücüde (genellikle
CO2) çözündürülür. Süperkritik antisolvan yönteminde ise ilaç ve polimer organik
çözücü içinde dağıtıldıktan sonra oluşan bu organik faz, süperkritik sıvı ile temasta
bırakılır. Organik çözücünün süperkritik sıvı içinde hızla çözünmesinin ardından
oluşan partiküller filtrasyon ile toplanır [151].
2.5.2.4.2. Monomerlerin Polimerizasyonuna Dayanan Yöntemler
2.5.2.4.2.1. Emülsiyon polimerizasyon yöntemi
Bu yöntemde partikül oluşumu sırasında disperse edilmiş monomerler polimerize
olurlar.
Polimerizasyon
iki
karışmayan
fazın
arafazında
gerçekleşir.
Polimerizasyon sırasında emülsiyon devamlı karıştırılmaldır. Yüksek sıcaklık,
gama ve UV ışınları polimerizasyonu başlatmak için kullanılabilir.
2.5.2.4.2.2. Dispersiyon Polimerizasyon
Bu yöntemde monomer, stabilize edici ve başlatıcı çözücü içinde çözündürülür.
Monomerlerin polimerizasyonu çözücü içinde çözünmeyen partiküllerin oluşumuna
neden olur.
50
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Araçlar ve Gereçler
3.1.1. Kimyasal Maddeler
Etken Madde
Paklitaksel
Sigma & Aldrich, ABD
Nanoküre Materyali
Anyonik Amfifilik Siklodekstrin
6-O-Capro βCD
Polikatyonik Amfifilik Siklodektrin
βCDC6
Sevilla Üniversitesi,
İspanya
Sevilla Üniversitesi,
İspanya
Aseton Extra pure
Sigma & Aldrich, ABD
Asetonitril HPLC Grade
Sigma & Aldrich, ABD
Dikloromethan HPLC Grade
Sigma & Aldrich, ABD
Etanol Analysis Grade
Sigma & Aldrich, ABD
Kitosan (Protasan™)
Novamatrix, Norveç
Mw< 200 kDa, DD. %75–90
Metanol HPLC Grade
Sigma & Aldrich, ABD
Pluronik® F-68
Sigma & Aldrich, ABD
51
HPLC Analizinde Kullanılan Kimyasallar
Asetonitril
Ultrasaf su
Sigma & Aldrich, ABD
Milipore,ABD
Hücre Kültüründe Kullanılan Kimyasallar
75 cm² ‘lik flask
Greiner, Almanya
96 kuyucuklu hücre kültür kabı
Greiner, Almanya
Dulbecco’nun minimum esansiyal ortamı
Biochrom, Almanya
Tripsin-EDTA (%0.25/%0.02 a/h)
Biochrom, Almanya
Fetal sığır serumu (FBS)
Biochrom, Almanya
Heparin (5000 U/mL)
Biochrom, Almanya
Kollajen A (1 mg/mL)
Biochrom, Almanya
L-Glutamin (200 mM)
Biochrom, Almanya
Penisilin-Streptomisin
(10.000 U/10.000μg/mL)
Biochrom, Almanya
WST-1
Biochrom, Almanya
Cell Counting Kit
Sigma & Aldrich, ABD
3.1.2. Biyolojik Materyal
L929 fare akciğer fibroblast hücre hattı
HÜKÜK,ŞapEnstitüsü,
MCF-7 insan meme kanseri hücre hattı
ATTC
52
3.1.3. Aletler
Çalkalamalı Su Banyosu
Memmert WNE22,
Almanya
Filtre
Scheicher&Schvell,
Almanya
Hassas Terazi
Mettler Toledo XS 105
Dualrange, ABD
Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı
IKA RCT Basic, Almanya
Liyofilizatör
Heto PowerDry PL 3000,
Danimarka
Çok Noktalı Manyetik Karıştırıcı
Variomag Multipoint HP,
Almanya
Mikropipet
Eppendorf, Almanya
Partikül Boyutu Cihazı
Malvern Zetasizer Nano
ZS,İngiltere
Zeta Potansiyel Ölçüm Cihazı
Malvern Zetasizer Nano
ZS,İngiltere
pH metre
Sartorius PP-20, Almanya
Rotavapor
IKA RV06-ML, Almanya
Rotavapor
IKA RV10 Basic,
Almanya
Santrifüj Aleti
Hettich EBA21, Almanya
Şırınga
Gilson DITRITIPS®,
Fransa
53
Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
FEI Nova™ NanoSEM
430, ABD
Ultra Saf Su Sistemi
Simplicity 185-Milipore,
ABD
Ultrasonik banyo
Advantage-Lab ALO4-12,
İsviçre
HPLC
Agilent 1100 Series,
Almanya
HPLC Kolonu
Hichrom 5 C18
(250X4,6 mm), U.K
3.2. Yöntemler ve Deneyler
3.2.1. Siklodekstrin Nanopartiküllerin Sentezlenmesi
Bu tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan amfifilik siklodekstrin türevleri
(6-O-Capro β-CD ve polikatyonik β-CDC6) İspanya Sevilla Üniversitesi’nde
bilimsel işbirliği içinde olunan Dr. Juan M. Benito tarafından sentezlenmiş ve
saflandırılmıştır. Anyonik siklodekstrinlerin sentez ve saflaştırılması daha önce
Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı’nda
gerçekleştirilen sentez temel alınarak yapılmıştır [152].
Heptakis (6-O-heksanoil) siklomaltoheptoz β-CD (6-O-CAPRO-β-CD), makrosiklik
halkasının 6. pozisyonuna ester bağı ile bağlanmış 6C’lu yağ asiti zinciri içeren,
primer yüz modifiye amfifilik CD türevidir. 6-O-CAPRO-β-CD sentezi 3 basamakta
gerçekleştirilmiştir. Birinci basamak olarak Sezyum Hekzanoat sentezlenmiştir.
Ardından ikinci basamakta 6-I-β-CD üzerinden Heksanoil zincirlerinin eklenmesi ile
açilleme yapılmış ve son basamakta da yıkama ve saflaştırma işlemleri
gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla ilk basamakta Sezyum karbonat ve hekzanoik asit
başlangıç maddelerinden hareketle sezyum hekzanoat sentezi gerçekleştirilmiştir.
Sentezin temelini oluşturan kimyasal reaksiyon şu şekildedir;
54
Cs2CO3 + 2R-COOH
2R-COOCs + H2O + CO2
R=C5H11
Hekzanoik anhidrit üzerine distile su ilave edilerek, 1 saat karıştırma sonucunda
hekzanoik asit elde edilmiştir. Hekzanoik asit içerisine sezyum karbonat ve
metanol eklenerek manyetik karıştırıcıda 1 saat karıştırma sonucunda oluşan
beyaz berrak çözeltideki çözücü rotavaporda uçurulmuştur. Metanolün hepsi
uçtuktan sonra benzen ilavesi ile beyaz kristalize halde çöken sezyum hekzanoat,
süzgeç kâğıdından süzülerek ayrılmış, oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır.
İkinci basamaktaki açilleme için 6-I-β-CD üzerinden nükleofilik sübstitüsyon
gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, sezyum hekzanoat ve 6-I-β-CD üzerine dimetil
formamid eklenmesi ile elde edilen koyu kahve çözelti, 50⁰C’de geri çeviren
soğutuculu yağ banyosuna konularak, manyetik karıştırıcıda karışmak üzere
bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda, rotavaporda Dimetil formamid’in tamamı
uçurulmadan, çözelti buzlu suyun içerisine boşaltılarak sentezlenen maddenin
beyaz kristaller halinde çökmesi sağlanmıştır. Süzgeç kâğıdından süzme işlemi
sonrası çökelti, süzgeç kâğıdı üzerinde oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır.
Son basamak olan yıkama ve saflaştırma da ise tam olarak kurumuş olan toz
halindeki çökelti kloroformda çözündürüldükten sonra sırasıyla; distile su, %5
NaHCO3 ve tekrar distile su ile yıkanmıştır. Son olarak, rotavaporda uçurma işlemi
uygulanmıştır. Katı halde elde edilen maddenin saflaştırılma işlemi, kolon
kromatografisi ile gerçekleştirilmiştir [45,152]. Anyonik 6-O-Capro βCD’in yapısı
Şekil 3.1’de gösterilmiştir.
Şekil 3.1. 6-O-Capro βCD
55
Katyonik amfifilik siklodekstrin türevi olan β-CDC6’nın sentezi temel olarak 4
basamaktan oluşmaktadır. İlk basamakta βCD, tert-bütoksikarbonil ile tepkimeye
girerek siklodekstrinin yapısında bulunan 7 tane primer hidroksil grubunun her biri
Boc-sisteamin grubuyla yer değiştirir. Bu basamakta ilk önce ticari ürün olan
siklooligosakkaritin
(heptakis
(6-bromo-6-deoksi)
siklomaltoheptoz)
N-
bromosüksinimid (NBS) / trifenilfosfin (TPP) sistemi ile hepta brominasyonu
yapılmaktadır. Bunu takiben sezyum karbonatın N-Boc-sisteamin tarafından
bromin ile nükleofilik yer değiştirmesi gerçekleşmektedir. Sentezin ikinci
basamağında oligosakkaritin her bir sekonder hidroksil grubunun asetilasyonu
gerçekleşmektedir. Bunun için N,N-dimetilformamid ve N,N-dimetilaminopridin
varlığında yağ asidi anhidritleri kullanılmıştır. Sentezin üçüncü basamağında
karbamat gruplarının hidrolizi gerçekleştikten sonra son basamakta katyonik
uçların tiyoüre ileri modifikasyonu gerçekleştirilmiştir [153,154]. Polikatyonik
βCDC6’nın yapısı Şekil 3.2’de gösterilmiştir.
Şekil 3.2. Polikatyonik βCDC6
56
3.2.2. Boş Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması
Amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanmasında Bölüm 2.5.2.4.’te açıklanan
nanopresipitasyon
yöntemi
kullanılmıştır.
Literatürde
amfifilik
siklodekstrin
nanoküre ve nanokapsül hazırlanmasında sıklıkla kullanıldığı ve kolay ve
ekonomik
bir
yöntem
olduğu
için
deneyler
sırasında
nanopresipitasyon
kullanılmıştır [155,156]. İlaç taşıyıcı sistem olarak üç farklı amfifilik β- siklodekstrin
türevi kullanılmıştır:
•
6-O-Capro β-CD,
•
Kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD
•
Polikatyonik β-CDC6
Nanoküre
formülasyonu
geliştirme
çalışmalarında
her
üç
siklodekstrin
formülasyonu için farklı konsantrasyonlarda sürfaktan (PF68), farklı organik
çözücüler (aseton, etanol, diklorometan, metanol) kullanılmıştır. Bu amaçla herbir
formülasyon için 1 mg siklodekstrin, 1 ml organik çözücüde 550 rpm’de manyetik
karıştırıcıda 30 dakika çözündürülür. Hazırlanan organik faz sürfaktan içeren ve
içermeyen 2 ml ultrasaf su içine ependorf enjektörü yardımıyla manyetik
karıştırıcıda 550 rpm’de eklenerek 30 dakika karıştırılır. Bu işlem sonucunda
nanopartiküller kendiliğinden oluşmaktadır. Formülasyon içinde bulunan organik
çözücünün rotavapor kullanılarak vakum altında 40-50oC’de uçurulması sonucu 2
ml sulu nanoküre dispersiyonu elde edilmiştir. Kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD
nanokürelerin hazırlanması sırasında diğer iki formülasyondan farklı olarak sulu
faz içerisinde kitosanın suda çözünen türevi olan Protosan® çözündürülmüştür.
Nanopresipitasyon
yöntemine
göre,
amfifilik
siklodekstrin
nanokürelerin
hazırlanması Şekil 3.3.‘de şematize edilmektedir.
57
Amfifilik siklodekstrin (1 mg)
Organik çözücü (1 ml)
içinde çözündürülür
Organik faz sulu faza(2 ml)
eklenir
Organik çözücü vakum
altında uçurulur
Manyetik karıştırıcıda
sürekli karıştırma
Şekil 3.3. Nanopresipitasyon yönteminin şematik gösterimi
Farklı organik çözücüler ve sürfaktan varlığında hazırlanan ön formülasyon
çalışmaları sonrası siklodekstrin nanopartiküllerden herbir siklodekstrin türevi için
en uygun bir formülasyon seçilmiş ve ileri deneysel basamaklar bu formülasyonlar
üzerinden yürütülmüştür.
3.2.3. Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu
3.2.3.1. Partikül Büyüklüğü Analizi
Siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite
indeksi değerleri, Brown hareketlerinin ölçümüne dayanan dinamik ışık saçılması
(foton korelasyon spektroskopisi) yöntemi kullanılarak 173o açı ve 25oC sıcaklıkta
Malvern Zetasizer cihazı ile tanımlanmıştır. Partikül büyüklüğü ölçümleri herbir
formülasyon için 3’er kez tekrarlanmıştır.
3.2.3.2. Zeta Potansiyel Ölçümü
Siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer aleti ile
12o açı ve 25oC sıcaklıkta ve herbir formülasyon için 3’er kez olmak üzere
gerçekleştirilmiştir.
58
3.2.3.3. Uzun Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları
Siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı ile 12
aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca
örnekler, +4oC’de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 2., 4., 8. ve 12. aylarda
partikül
büyüklüğü,
polidispersite
indeksi
ve
zeta
potansiyel
ölçümleri
tekrarlanmıştır ve sonuçlar değerlendirilmiştir.
3.2.3.4. Taramalı Elektron Mikroskopu (SEM)
SEM ile görüntüleme, Orta Doğu Teknik Üniversitesi Metalurji ve Malzeme
Mühendisliği Bölümü'nde yapılmıştır. Örnek metal levhalar üzerine tesbit edilmiştir
ve yüzey yükünü en aza indirmek için altın-palladyum alaşımı ile 100oA
kalınlığında kaplanmıştır.
3.2.4. Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu
Paklitaksel için kullanılan ters faz HPLC yöntemi kullanılmıştır. Yöntemin özellikleri
şu şekildedir [155]:
• Sabit faz: C-18 Oktadesil silika (ODS) kolon
• Mobil faz: Asetonitril: Su (70:30 h/h)
• Mobil faz akış hızı: 1 ml/dak.
• Enjeksiyon hacmi: 50 μl
• Dedektör: Diodearray (DAD) detektör
• Dalga boyu: 227,4 nm
• Bitiş Zamanı: 6 dakika
• Maksimum basınç: 300 bar
• Kolon sıcakliğı: 250C
59
3.2.4.1. Analitik Yöntem Validasyonu
Validasyon bir metot veya ölçüm prosedürünün belirlenen amaçlara uygunluğunun
objektif olarak test edilmesidir [157].
Paklitaksel için analitik yöntem validasyonun saptanması için doğrusallık,
doğruluk, kesinlik (tekrar edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik, günler arası farklılık),
duyarlılık (alt tayin sınırı, tanıma değeri), özgünlük, stabilite parametreleri
incelenmiştir.
3.2.4.1.1. Kalibrasyon
Paklitakselin kalibrasyon denkleminin belirlenmesi için 200μg/ml’lik 10 ml stok
çözeltisi hazırlandı. Bunun için 2 mg Paklitaksel 10 ml asetonitril içinde
çözündürüldü. Bu stok çözeltiden hareketle 200, 150, 100, 50, 25, 10, 5, 2 ve 1
μg/ml lik olacak şekilde asetonitril ile 9 dilüsyon yapılmıştır. Yukarıda belirtilen
HPLC yöntemine göre farklı konsantrasyondaki Paklitaksel çözeltilerinin analizi
yapılmış ve elde edilen veriler sonucunda kalibrasyon doğrusu çizilerek
kalibrasyon denklemi bulunmuş ve korelasyon katsayısı hesaplanmıştır.
3.2.4.1.2. Doğrusallık
Doğrusallık, örnek çözeltilerinin analit cevabının konsantrasyonla doğrusal orantılı
olduğu, konsantrasyon aralığında bulunup bulunmadığını belirler. Analitik
validasyonda
doğrusallık
parametresini
göstermek
üzere,
Paklitakselin
asetonitrilde hazırlanmış olan 200 μg/ml konsantrasyondaki ana stok çözeltisinden
hareketle, 1-200 μg/ml konsantrasyonlar elde edecek şekilde 9 adet dilüsyon
yapılmıştır. HPLC analizi ile çözeltilerin konsantrasyon değerlerine karşı okunan
alan değerleri kullanılarak kalibrasyon doğrusunun denklemi oluşturulmuş ve
korelasyon katsayısı hesaplanmıştır.
3.2.4.1.3. Doğruluk
Doğruluk parametresi gerçek değere yakınlığı ifade eder ve geri kazanım
çalışmaları ile doğruluk değerlendirilebilir [157]. Kullanılan analitik yöntemin
doğruluğunu göstermek amacıyla, kalibrasyon sınırları içerisinde bulunan, düşük,
orta ve yüksek konsantrasyonda olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda (1, 25 ve
200 μg/mL) 6 seri çözelti hazırlanarak HPLC analizi yapılmıştır. Analiz sonucu
60
bulunan ve hazırlanan konsantrasyonlardan geri kazanımlar hesaplanmış ve geri
kazanımların ortalaması (X), standart sapması (SS) ve % varyasyon katsayısı
(VK) hesaplanmıştır.
3.2.4.1.4. Kesinlik
Kesinlik parametresi, bir yöntemin birbirini takip eden ölçümleri arasındaki
yakınlığın derecesini ifade etmektedir. Sayısal değeri yoktur ve standart sapma
(SS), varyasyon katsayısı (VK) ile ifade edilir [158]. Bir analitik yöntemin kesinliği,
art arda istatistiksel açıdan anlamlı sayıda, aynı konsantrasyonda örneğin analitik
yöntem kullanılarak ölçülen konsantrasyonlarının ortalama (X), SS ve VK’nın
hesaplanması ile değerlendirilmektedir. Bu nedenle; tekrar edilebilirlik, tekrar elde
edilebilirlik ve günler arası farklılık incelenmiştir.
Tekrar edilebilirlik: Tekrar edilebilirlik parametresi için kalibrasyon çalışmaları için
hazırlanmış farklı Paklitaksel konsantrasyonlarından bir tanesi (50µg/ml) seçilerek
6 kez art arda HPLC analizi yapılmıştır. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon
değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplanmıştır.
Tekrar elde edilebilirlik: Tekrar elde edilebilirlik parametresinin değerlendirilmesi
amacıyla, stoktan (200 μg/mL) hareketle seyreltme ile elde edilen 6 adet aynı
konsantrasyonda
(50
μg/mL)
hazırlanan
çözeltinin
HPLC
analizi
gerçekleştirilmiştir. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon değerlerinin
ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır.
Günler arası farklılık: Günler arası farklılık parametresinin değerlendirilmesi için
aynı konsantrasyondan (50µg/ml) 3 gün ardı ardına hazırlanan Paklitaksel
çözeltilerinin HPLC analizi yapılarak, elde edilen konsantrasyon değerlerinin
ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır.
3.2.4.1.5. Duyarlılık
Analiz yönteminin duyarlılığının belirlenmesi için gözlenebilirlik sınırı (LOD) ve alt
tayin sınırı (LOQ) değerleri saptanmıştır. Gözlenebilirlik sınırı, analitik yöntemde
kullanılan cihazın saptayabildiği en düşük konsantrasyonu ifade eder. Alt tayin
sınırı ise doğru ve tekrar edilebilen en düşük derişimdir.
61
LOD
ve
LOQ
değerlerinin
hesaplanmasında,
kalibrasyondaki
minimum
konsantrasyon değerlerinden biri (1 μg/mL) seçilmiştir. Bu konsantrasyondaki
HPLC spektrumunda, Paklitaksel pikinden önce ve sonra düzgün çıkan bölgeler
tespit edilmiştir. Sinyal/Gürültü (S/G-Signal/Noise) oranına göre LOD ve LOQ
değerleri saptanmıştır. S/G oranı 3 olan konsantrasyon gözlenebilirlik sınırını, S/G
oranı 10 olan konsantrasyon ise alt tayin sınırını vermektedir.
3.2.4.1.6. Özgünlük
Kullanılan analitik yöntemin paklitaksele özgün olduğunu kanıtlamak, formülasyon
veya çözücülerdeki bileşenlerin ölçüm yapılan koşullarda Paklitaksel ile girişim
yapan bir pik vermediğini göstermek amacıyla formülasyona giren her bir
maddenin HPLC analizi yapılmıştır.
3.2.5.
Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Hazırlanması
Paklitaksel
yüklü
siklodekstrin
nanoküreler,
boş
nanoküreler
gibi
nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Siklodekstrin nanokürelere ilaç
yüklerken konvansiyonel yükleme yöntemi uygulanmıştır. Her bir siklodekstrin
formülasyonu için polimerin %1’i kadar Paklitaksel formülasyona ilave edilmiştir.
Bunun için, Paklitakselin (2 mg), etanolde (10 ml) stok çözeltisi hazırlanmıştır. İlaç
yüklü nanoküreleri hazırlamak için 1 mg siklodekstrin, 0,5 ml Paklitaksel stok
çözeltisi içeren 0,5 ml saf etanol içinde çözündürülmüştür. Hazırlanan organik faz
2 ml ultra saf su içine ependorf pipeti kullanılarak manyetik karıştırıcıda 550
rpm’de eklenerek 30 dakika karıştırılır. Bu işlem sonucunda nanopartiküller
kendiliğinden oluşmaktadır. Formülasyon içinde bulunan organik çözücünün
rotavapor kullanılarak vakum altında 40-50oC’de uçurulması sonucu 2 ml sulu
Paklitaksel yüklü nanoküre dispersiyonu elde edilmiştir.
Kitosan kaplı siklodekstrin formülasyonu hazırlanırken yukarıda anlatılan yöntem
kullanılmıştır ancak sulu faz %0,25 (a/h) ProtosanTM içermektedir.
3.2.6.
İlaç Yüklü Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu
3.2.6.1. Partikül Büyüklüğü Analizi
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve
polidispersite indeksi değerleri, Brown hareketlerinin ölçümüne dayanan dinamik
62
ışık saçılması (foton korelasyon spektroskopisi) yöntemi kullanılarak 173o açı ve
25oC sıcaklıkta Malvern Zetasizer cihazı ile tanımlanmıştır. Partikül büyüklüğü
ölçümleri her bir formülasyon için 3’er kez tekrarlanmıştır.
3.2.6.2. Zeta Potansiyel Ölçümü
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer
ile 12o açı ve 25oC sıcaklıkta ve her bir formülasyon için 3’er kez olmak üzere
gerçekleştirilmiştir.
3.2.6.3. Kısa Süreli Fiziksel Stabilite Çalışmaları
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı
ile 1 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca
örnekler, +4oC’de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 1., 7. ve 30. günlerde
partikül
büyüklüğü,
polidispersite
indeksi
ve
zeta
potansiyel
ölçümleri
tekrarlanmıştır ve sonuçlar değerlendirilmiştir.
3.2.7.
İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi
İlaç yükleme etkinliğinin belirlenmesi için Bölüm 3.2.5.’te açıklandığı şekilde ilaç
yüklü siklodekstrin nanoküreler hazırlanmıştır. Nanopresipitasyon sonrası elde
edilen dispersiyondaki serbest ilaç 3500 rpm de 15 dakika santrifüj sonrası
uzaklaştırılmıştır. Süpernatant alınarak 48 saat dondurulduktan sonra 24 saat
boyunca liyofilize edilmiştir. Liyofilizasyon sonrası elde edilen kuru toz 2 ml
asetonitril: su (70:30) karışımında çözüldükten sonra Bölüm 3.2.4.’te açıklanan
HPLC yöntemi ile analiz yapılmıştır. Her bir formülasyon için hapsolan ilaç miktarı,
yükleme kapasitesi ve yükleme etkinliği bulunmuştur. Hapsolan ilaç miktarı,
santrifüj ile serbest ilacın uzaklaştırılması sonrası HPLC analizi ile tayin edilen ilaç
miktarıdır. Yükleme etkinliği ve Yükleme kapasitesinin belirlenmesinde ise aşağıda
bulunan eşitlik kullanılmıştır:
% Yükleme Etkinliği =
% Yükleme Kapasitesi =
Hapsolan İlaç Miktarı(µg)
× 100
Toplam İlaç Miktarı (µg)
Hapsolan İlaç Miktarı (µmol)
× 100
Nanopartikül Ağırlığı(µmol)
63
3.2.8. Nanopartiküllerden Paklitakselin In Vitro Salım Profilinin Belirlenmesi
Paklitaksel yüklü nanopartiküllerin in vitro salım profilinin belirlenmesi için tüp
yöntemi kullanılmıştır. Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan 2 ml ilaç yüklü
nanokürelerden 3500 rpm’de 15 dakika santrifüj sonrası serbest Paklitaksel
uzaklaştırılmıştır. Süpernatant alınarak %0,1 Tween 80 içeren 50 ml pH 7,4 fosfat
tampon çözeltisi içine eklenerek 37oC’de yatay çalkalayıcı su banyosunda inkübe
edilmiştir. Belirli zaman aralıklarında her bir formülasyondan 0,5 ml örnek alınarak
yerine aynı sıcaklıkta taze fosfat tampon çözeltisi eklenmiştir. Alınan örnekler
HPLC ile analiz edilerek alınan sonuçlar varlığında zamana karşı % kümülatif ilaç
salım grafiği çizilmiştir.
3.2.9. Paklitakselin Dilüsyon Testi
Seyreltme faktörünün Paklitaksel salımı üzerindeki etkisini görmek için dilüsyon
testi yapılmıştır. Bu amaçla, Bölüm 3.2.5’ te açıklandığı gibi nanopresipitasyon
yöntemiyle hazırlanan ilaç yüklü nanopartiküller, serbest paklitakseli ortamdan
uzaklaştırmak için 3500 rpm’ de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Ardından pH 7,4
fosfat tampon çözeltisi ile farklı oranlarda seyreltilmiştir. Salınan ilaç miktarını tayin
etmek için Bölüm 3.2.4 ‘te tanımlanan HPLC yöntemi kullanılmıştır. Her bir
formülasyon için seyrelme faktörüne karşılık salınan % ilaç miktarı hesaplanmıştır.
3.2.10. Boş Nanopartiküllerin in vitro Güvenilirlik Testi
İlaç yüklü olmayan nanopartiküllerin güvenilirlik testi L929 fibroblast hücre hattı
üzerinde hücre kültürü çalışmaları ile belirlenmiştir. L929 hücreleri üremeleri için
25 cm2lik flasklar içinde DMEM besiyeri varlığında 37oC’de % 5 CO2’li etüvde
inkübasyona bırakılmıştır. Yeterli sayıda hücre ürediğinde flask içindeki besiyeri
ortamdan uzaklaştırılarak tripsinizasyon işlemi uygulanmıştır. Flask içine 1,5 ml
tripsin ilave edildikten sonra hücreler 2-3 dakika inkübe edilmiştir. Ardından
yüzeyden ayrılan hücrelere 9 ml besiyeri ilave edilerek 2000 rpm’de 3 dakika
santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası besiyeri ortamdan uzaklaştırılmıştır ve 4 ml
yeni besiyeri eklendikten sonra hücrelerin tripan blue ile sayımı gerçekleştirilmiştir.
L929 hücrelerinin, 96 kuyulu doku kültür plaklarına her bir kuyuya 5x103 hücre/ml
olacak şekilde ekimi yapılmış ve 48 saat inkübe edilmiştir. Hazırlanan nanoküre
formülasyonları besiyeri ile 6 farklı konsantrasyonda dilüe edilmiş ve her bir
konsantrasyon için n=4 olacak şekilde çalışılmıştır. Aynı şartlarda sadece kültür
64
ortamı ile inkübe edilen fibroblast hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır. 48 saatlik
inkübasyon sonrası her bir kuyucuğa 10 µl WST-1(water soluble tetrazolium salt)
eklenmiştir. WST-1 (4-(3-(4-lodofenil )-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzen
disülfonat) hücre canlılığını kontrol etmekte kullanılan bir boyadır. Bu boyama
yöntemi,
boya
ile
canlı
hücrelerin
mitokondrileri
aracılığıyla
oluşturduğu
reaksiyonda, boyada bulunan tetrazolium halkası hücre mitokondrilerinde bulunan
dehidrogenaz enzimlerince parçalanarak renkli formazan kristalleri oluşması
temeline dayanmaktadır. Boyama işlemi sonrası hücreler yaklaşık 2 saat
inkübasyona bırakıldıktan sonra Eliza okuyucu ile kolorimetrik olarak 440 nm’de
absorbans değerleri okunmuş ve % hücre yaşayabilirlikleri hesaplanmıştır.
3.2.11. Paklitaksel Yüklü Nanopartiküllerin in vitro Etkinlik Testi
Paklitaksel yüklü nanopartiküllerin in vitro etkinlik testi MCF-7 insan meme kanseri
hücre hattı üzerinde hücre kültürü çalışmaları ile belirlenmiştir. MCF-7 hücreleri
üremeleri için 25 cm2lik flasklar içinde DMEM besiyeri varlığında 37oC’de % 5
CO2’li etüvde inkübasyona bırakılmıştır. Yeterli sayıda hücre ürediğinde flask
içindeki besiyeri ortamdan uzaklaştırılarak tripsinizasyon işlemi uygulanmıştır.
Flask içine 1 ml tripsin ilave edildikten sonra hücreler 2-3 dakika inkübe edilmiştir.
Ardından yüzeyden ayrılan hücrelere besiyeri ilave edilerek 2000 rpm’de 3 dakika
santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası besiyeri ortamdan uzaklaştırılmıştır ve
hücrelerin tripan blue ile sayımı gerçekleştirilmiştir. MCF-7 hücrelerinin, 96 kuyulu
doku kültür plaklarına her bir kuyuya 5x103 hücre/ml olacak şekilde ekimi yapılmış
ve 48 saat inkübe edilmiştir. Hazırlanan nanoküre formülasyonları besiyeri ile 6
farklı konsantrasyonda dilüe edilmiş ve her bir konsantrasyon için n=4 olacak
şekilde çalışılmıştır. Aynı şartlarda sadece kültür ortamı ile ve %1 DMSO içeren
kültür ortamı ile inkübe edilen MCF-7 hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır. 48
saatlik inkübasyon sonrası her bir kuyucuğa 10 µl WST-1 eklenmiştir Boyama
işlemi sonrası hücreler yaklaşık 2 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra Elıza
okuyucu ile kolorimetrik olarak 440 nm’de absorbans değerleri okunmuş ve %
hücre yaşayabilirlikleri hesaplanmıştır. L-929 fare fibroblast hücrelerine karşı
sitotoksisitenin ve MCF-7 meme kanseri hücrelerine karşı antikanser aktivitenin
değerlendirilmesi amacı ile gerçekleştirilen hücre kültürü çalışmaları, Hacettepe
Üniversitesi
Eczacılık
Fakültesi
Farmasötik
Teknoloji
Anabilim
Dalı’nda
gerçekleştirilmiştir.
65
4. BULGULAR
Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları
4.1.
Uygun partikül büyüklü ve zeta potansiyeline sahip, stabil amfifilik siklodekstrin
nanokürelerin hazırlanması için ön formülasyon çalışmaları sırasında farklı organik
çözücüler kullanılmıştır:
6-O-Capro βCD nanoküreler için;
•
Aseton
•
Etanol
•
Metanol
CS-6-O-Capro βCD nanoküreler için;
•
Aseton
•
Etanol
Polikatyonik βCDC6 nanoküreler için;
•
Aseton
•
Etanol
•
Asetonitril
•
Diklorometan
Farklı organik çözücüler kullanılarak, sürfaktanlı ve sürfaktansız hazırlanan
formülasyonlara ait karakterizasyon parametreleri Çizelge 4.1. de belirtilmiştir.
66
Çizelge 4.1. Ön formülasyon çalışmaları
Organik çözücü
PF68 konsantrasyonu
Partikül büyüklüğü
(nm)
Zeta Potansiyel
(mV)
Polidispersite
İndeksi
Anyonik 6-O-Capro β-CD
Aseton
-
163,6
-26.2
0.625
Aseton
0,1
140.9
-23.5
0.304
Aseton
0,5
247.0
-23,7
0.465
Etanol
-
134.3
-21.3
0.086
Etanol
0,1
190.2
-27.6
0.175
Etanol
0,5
200,7
-31.3
0.23
Metanol
-
367.3
-26.4
0.156
Metanol
0,1
291.4
-28,1
0.269
Metanol
0,5
220,2
-30,2
0,31
Katyonik Kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD
Aseton
-
284.6
+57,2
0.341
Aseton
0,1
197.2
+58,8
0.232
Aseton
0,5
291.2
+47,1
0.347
Etanol
-
163.4
+69.1
0.038
Etanol
0,1
167.9
+60,7
0,155
Etanol
0,5
185.3
+55,4
0,33
Aseton
-
178.5
+73,1
0.189
Aseton
0,1
284,9
+41,3
0.294
Aseton
0,5
178.8
+46,5
0.353
Etanol
-
82.9
+88
0.164
Etanol
0,1
205.3
+77,5
0.535
Etanol
0,5
381.9
+70,4
0.777
Asetonitril
-
178,8
+59,5
0.353
Diklorometan
-
182
+76
0,545
Asetonitril: DCM
-
205,3
+77,5
0,775
Polikatyonik β-CDC6
67
Şekil 4.1. Farklı sürfaktan konsantrasyonlarının boş amfifilik siklodekstrin
nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü üzerine etkisi (n=3)
4.2.
Siklodektrin Nanokürelerin Karakterizasyonu
4.2.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı
Siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite
indeksi değerleri, 173o açı ve 25oC sıcaklıkta Malvern Zetasizer aleti ile
ölçülmüştür. Ölçümler, her bir formülasyon için 3’er kez tekrarlanmıştır.
Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan siklodekstrin nanokürelere ait ortalama
partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksleri Çizelge 4.2’ de verilmiştir.
Çizelge 4.2. Nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül büyüklüğü dağılımı
(nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3)
Formülasyon
Ortalama Partikül Büyüklüğü (nm) ±
SS
Polidispersite indeksi ±
SS
6-O-CAPRO β-CD
103 ± 3,7
0,13 ± 0,01
CS-6-O-CAPRO
β-CD
125 ± 2,3
0,22 ± 0,01
Polikatyonik β-CDC6
74 ± 1,8
0,16 ± 0,02
68
4.2.2. Zeta Potansiyeli
Siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer aleti ile
12o açı ve 25oC sıcaklıkta ve her bir formülasyon için 3’er kez olmak üzere
gerçekleştirilmiştir (Çizelge 4.3.).
Çizelge 4.3. Nanoküre formülasyonlarının Zeta potansiyel değerleri (mV) (± SS,
n=3)
Formülasyon
Zeta Potansiyel (mV) ± SS
6-O-CAPRO β-CD
-29 ± 2,4
CS-6-O-CAPRO
β-CD
+44 ± 3,02
Polikatyonik β-CDC6
+61 ± 1,19
4.2.3. Uzun Süreli Stabilite Testi
İlaç yüklenmemiş siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi
amacı ile 12 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre
boyunca örnekler, +4oC’de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 2., 4., 8. ve 12.
aylarda partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel ölçümleri
tekrarlanmıştır. Elde edilen bulgular Şekil 4.2. - 4.4.’te gösterilmiştir.
69
Partikül Büyüklüğü (nm)
250
200
150
6-O-CAPRO β-CD
100
CS-6-O-CAPRO β-CD
β-CDC6
50
0
0
1 Ay
2 Ay
4 Ay
8 Ay
12 Ay
6-O-CAPRO β-CD
103.3
115.3
133.2
204.3
224.3
204.3
CS-6-O-CAPRO β-CD
125.2
138.0
138.0
198.0
201.3
198.0
β-CDC6
73.1
79.4
96.1
174.0
155.7
174.0
Şekil 4.2. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü değişimi
(± SS, n=3)
Polidispersite indeksi
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
6-O-CAPRO β-CD
0.15
CS 6-O-CAPRO β-CD
0.10
β-CDC6
0.05
0.00
0
1 Ay
2 Ay
4 Ay
8 Ay
12 Ay
6-O-CAPRO β-CD
0.13
0.20
0.15
0.10
0.18
0.20
CS 6-O-CAPRO β-CD
0.23
0.31
0.30
0.34
0.31
0.22
β-CDC6
0.17
0.19
0.20
0.3
0.22
0.21
Şekil 4.3. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi değerindeki
değişim (± SS, n=3)
70
80
Zeta Potensiyel (mV)
60
40
20
6-O-CAPRO β-CD
CS 6-O-CAPRO β-CD
0
β-CDC6
-20
-40
0
1 Ay
2 Ay
4 Ay
8 Ay
12
Ay
6-O-CAPRO β-CD
-29.2
-31.4
-32.4
-26.1
-24.9
-26.1
CS 6-O-CAPRO β-CD
44.8
51.4
50.1
50.1
50.1
47.7
β-CDC6
61.2
60.8
66.5
61.8
63.1
65.1
Şekil 4.4. Boş nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel değerindeki değişimi
(± SS, n=3)
71
4.2.4. SEM Görüntüleri
Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan boş nanokürelerin taramalı elektron
mikroskop görüntüleri Şekil 4.5 ve Şekil 4.6 ‘da gösterilmiştir.
Şekil 4.5. 6-O-Capro β-CD nanokürelerine ait SEM görüntüleri
Şekil 4.6. CS-6-O-Capro β-CD ve β-CDC6 nanokürelerine ait SEM görüntüleri
72
4.3.
Paklitakselin HPLC Yöntemi ile in vitro Miktar Tayini ve Validasyonu
Paklitakselin analizi için, sabit faz olarak C-18 Oktadesil silika, hareketli faz olarak
ise polar özellikli asetonitril:su (70:30) karışımının kullanıldığı ters faz HPLC
yöntemi kullanılmıştır. Hazırlanan bu yöntemle 227,4 nm’de DAD dedektörü ile
gerçekleştirilen deteksiyon sonucu, paklitaksele ait pik 4,57. dakikada saf olarak
elde edilmiştir (Şekil 4.7).
Şekil 4.7. Paklitaksele ait HPLC kromotogramı
4.4. Analitik Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular
4.4.1. Kalibrasyon Denklemine Ait Bulgular
Paklitakselin kalibrasyonu için 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150 ve 200 μg/mL olmak
üzere 9 farklı konsantrasyon kullanılmıştır. Sonuçta, elde edilen kalibrasyon
doğrusu (konsantrasyona karşı alan grafiği) ve Paklitakselin seçilmiş olan farklı
konsantrasyonları için gözlenen pikler (zamana karşı mAU grafiği) Şekil 4.8 ve
4.9’da belirtilmektedir.
Şekil 4.8. Paklitakselin farklı konsantrasyonlarına ait HPLC piklerin toplu gösterimi
73
20,000
18,000
16,000
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
0
Pik Alanı
y = 88,665x + 36,086
r² = 0,9999
0
100
200
300
Konsantrasyon(µg)
0
1
2
5
10
25
50
100
150
200
Alan
0
104,8
196,2
466,1
916,1
2268,9
4494,5
8999
13380,2
17680,4
Konsantrasyon (μg/ml)
Şekil4.9. Paklitaksele ait kalibrasyon eğrisi ve denklemi
4.4.2.
Doğrusallık
Paklitakselin asetonitrilde hazırlanan farklı konsantrayondaki çözeltilerinden
hareketle hazırlanan kalibrasyon doğrusuna ait korelasyon katsayısı (r2) 0,9999
olarak saptanmıştır (Bkz. Şekil 4.9). Korelasyon katsayısı değerinin 1’e çok yakın
çıkması, Paklitaksel kalibrasyon doğrusunu oluşturan noktaların doğrusallığını
ispatlamaktadır.
4.4.3. Doğruluk
Paklitakselin validasyonunda doğruluk parametresini araştırmak için düşük, orta ve
yüksek olmak üzere üç farklı konsantrasyon (1, 25 ve 200 μg/mL) belirlenerek art
arda 3 gün analizi yapılmıştır. Geri kazanım yüzdeleri hesaplanarak ortalama,
standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplanmıştır (Çizelge 4.4). Varyasyon
katsayısı her bir konsantrasyon için %2’den küçük çıkmıştır. Bu sonuç analitik
yöntemin doğruluğunu göstermiştir.
74
Çizelge 4.4. Paklitakselin geri kazanım yüzdeleri ve varyasyon katsayıları (n=6)
Örnek
1 µg/ml
% geri kazanım
25µg/ml
% geri kazanım
200 µg/ml
% geri kazanım
1
2
3
4
5
6
Ortalama
Standart sapma
Varyasyon katsayısı
98,4
101,5
98,65
99,74
98,23
98,83
99,23
1,23
1,24
96,98
98,41
96,12
98,91
96,17
99,88
97,74
1,55
1,59
100,06
97,68
101,83
99,45
99,12
99,48
99,6
1,35
1,36
4.4.4.
Kesinlik
Paklitakselin analitik yöntem validasyonunda kesinlik parametresi için tekrar
edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik ve günler arası farklılık incelenmiştir.
Tekrar edilebilirlik: Tekrar edilebilirlik parametresi için kalibrasyon çalışmaları için
hazırlanmış farklı Paklitaksel konsantrasyonlarından bir tanesi (50µg/ml) seçilerek
6 kez art arda HPLC analizi yapılmıştır. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon
değerlerinin ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplanmıştır.
Varyasyon
katsayısı
%2’den
küçük
bulunmuştur.
Veriler
Çizelge
4.5.’te
gösterilmiştir. Bu sonuç analitik yöntemin tekrar edilebileceğini göstermektedir.
Çizelge 4.5. Paklitaksele ait tekrar edilebilirlik değerleri ve varyasyon katsayıları
(n=6)
Örnek
1
2
3
4
5
6
Konsantrasyon
(µg/ml)
49,8
49,7
49,7
49,8
49,6
49,5
Ortalama
Standart
Sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
49,7
0,13
0,02
Tekrar elde edilebilirlik: Tekrar elde edilebilirlik parametresinin değerlendirilmesi
amacıyla, stoktan (200 μg/mL) hareketle seyreltme ile elde edilen 6 adet aynı
konsantrasyonda
(50
μg/mL)
hazırlanan
çözeltinin
HPLC
analizi
gerçekleştirilmiştir. HPLC analizi ile elde edilen konsantrasyon değerlerinin
75
ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır.
Varyasyon
katsayısı
%2’den
küçük
bulunmuştur.
Veriler
Çizelge
4.6.’da
gösterilmiştir.
Çizelge 4.6. Paklitaksele ait tekrar elde edilebilirlik değerleri ve varyasyon
katsayıları (n=6)
Örnek
1
2
3
4
5
6
Konsantrasyon
(µg/ml)
49,8
50,9
50,9
49,7
51,0
51,1
Ortalama
Standart
Sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
50,6
0,6
0,4
Günler arası farklılık: Günler arası farklılık parametresinin değerlendirilmesi için
aynı konsantrasyondan (50µg/ml) 3 gün ardı ardına hazırlanan Paklitaksel
çözeltilerinin HPLC analizi yapılarak, elde edilen konsantrasyon değerlerinin
ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı değerleri hesaplanmıştır. Veriler
Çizelge 4.7.’de gösterilmiştir.
Çizelge 4.7. Paklitaksele ait günler arası farklılık değerleri ve varyasyon katsayıları
(n=3)
Örnek
1
2
3
4.4.5.
Konsantrasyon
(µg/ml)
49,8
49,7
50,7
Ortalama
Standart
Sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
50,1
0,6
0,3
Duyarlılık
Paklitakselin HPLC ile miktar tayininde kullanılan yöntemin duyarlılığı Bölüm
3.2.4.1.5’ te belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiş olup gözlenebilirlik sınırı 0,056
µg/ml (S/N=3) ve alt tayin sınırı 0,18 µg/ml (S/N=10) olarak tespit edilmiştir.
76
4.4.6.
Özgünlük
Kullanılan analitik yöntemin paklitaksele özgün olduğunu kanıtlamak için her bir
formülasyon hazırlama sırasında kullanılan maddelerin HPLC ile analizi
yapılmıştır. HPLC analizinde belirlenen koşullarda 4,57. dakikada Paklitakselin
verdiği pik ile çakışan başka bir pik olmadığı gösterilmiş ve yöntemin özgünlüğü
test edilmiştir. Paklitaksele ve diğer formülasyon bileşenlerine ait pikler Şekil 4.10’
da gösterilmiştir.
77
78
Kitosan
Asetonitril
6-O-Capro βCD
Polikatyonik βCDC6
Şekil 4.10. Paklitaksel ve formülasyondaki diğer maddelerin HPLC kromotogramının karşılaştırılması
Paklitaksel
4.5. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonuna Ait
Bulgular
4.5.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve
polidispersite indeksi değerleri, 173o açı ve 25oC sıcaklıkta Malvern Zetasizer aleti
ile ölçülmüştür. Ölçümler, her bir formülasyon için 3’er kez tekrarlanmıştır.
Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan siklodekstrin nanokürelere ait ortalama
partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksleri Çizelge 4.8’ de verilmiştir.
Çizelge 4.8. Paklitaksel yüklü nanoküre formülasyonlarının ortalama partikül
büyüklüğü (nm) ve polidispersite indeksleri (± SS, n=3)
Formülasyon
Ortalama Partikül Büyüklüğü (nm) ±
SS
Polidispersite indeksi ±
SS
6-O-CAPRO β-CD
165 ± 7,0
0,19 ± 0,02
CS-6-O-CAPRO
β-CD
176 ± 5,6
0,28 ± 0,01
Polikatyonik β-CDC6
92 ± 4
0,2 ± 0,01
4.5.2. Zeta Potansiyeli
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel ölçümleri, Malvern Zetasizer
aleti ile 12o açı ve 25oC sıcaklıkta ve her bir formülasyon için 3’er kez olmak üzere
gerçekleştirilmiştir. Veriler Çizelge 4.9 ‘da gösterilmektedir.
Çizelge 4.9. İlaç yüklü nanoküre formülasyonlarının zeta potansiyel değerleri (mV)
(± SS, n=3)
Formülasyon
Zeta Potansiyel (mV) ± SS
6-O-CAPRO β-CD
-35 ± 2,6
CS-6-O-CAPRO
β-CD
+56 ± 0,23
Polikatyonik β-CDC6
+67 ± 1,3
79
4.5.3. Kısa Süreli Stabilite Testi
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin fiziksel stabilitelerinin belirlenebilmesi amacı
ile 1 aylık süre boyunca stabilite çalışmaları yapılmıştır. Takip edilen süre boyunca
örnekler, +4oC’de sulu dispersiyon halinde tutularak; 0., 1., 7., ve 30. günlerde
partikül
büyüklüğü,
polidispersite
indeksi
ve
zeta
potansiyel
ölçümleri
tekrarlanmıştır. Elde edilen bulgular Şekil 4.10. - 4.12.’de gösterilmiştir.
Ortalama Partikül
Büyüklüğü Dağılımı(nm)
300
250
200
150
0.Gün
100
1.Gün
7.Gün
50
0
30.Gün
6-O-CAPRO
β-CD
PCX- 6-OCS-6-OPCX-CS 6-OCAPRO β-CD CAPRO β-CD CAPRO β-CD
β-CDC6
PCX β-CDC6
0.Gün
173.3
165.8
138.6
179.3
72.8
92.1
1.Gün
185.7
177.2
171.3
179.4
86.1
94.7
7.Gün
221.6
191.3
168.0
210.7
86.1
94.7
30.Gün
231.0
219.8
168.0
216.0
104.0
124.3
Şekil 4.11. Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı partikül büyüklüğü
değişimi (± SS, n=3)
80
Polidispersite İndeksi
0.4
0.3
0.2
0.Gün
0.1
1.Gün
7.Gün
0.0
6-O-CAPRO
β-CD
PCX 6-OCAPRO βCD
CS 6-OCAPRO βCD
PCX CS 6-OCAPRO βCD
β-CDC6
PCX β-CDC6
0.Gün
0.12
0.20
0.33
0.29
0.26
0.21
1.Gün
0.20
0.21
0.30
0.30
0.20
0.21
7.Gün
0.15
0.15
0.31
0.22
0.21
0.21
30.Gün
0.19
0.27
0.31
0.32
0.29
0.25
30.Gün
Şekil 4.12. Boş ve ilaç yüklü nanopartiküllerin zamana bağlı polidispersite indeksi
değerindeki değişim (± SS, n=3)
Zeta Potansiyel (mV)
80
60
0. Gün
40
20
1. Gün
0
7.Gün
-20
-40
6-OCAPRO βCD
PCX 6-OCAPRO βCD
CS 6-OCAPRO βCD
PCX CS 6O-CAPRO
β-CD
β-CDC6
PCX βCDC6
0. Gün
-30.2
-35.7
46.5
56.7
60.2
67.8
1. Gün
-32.4
-34.4
50.1
51.7
67.8
69.1
7.Gün
-32.4
-35.4
50.1
51.7
66.5
60.5
30.Gün
-26.1
-29.9
50.1
51.7
61.8
53.5
30.Gün
Şekil 4.13. Boş ve ilaç yüksüz nanopartiküllerin zamana bağlı zeta potansiyel
değerindeki değişim (± SS, n=3)
81
4.6.
İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi
Siklodekstrinlere yüklenen Paklitaksel miktarı HPLC yöntemi ile tayin edilmiştir.
Her bir formülasyon için gerekli hesaplamalar aşağıda belirtilen formüller
üzerinden hesaplanmıştır.
% Yükleme Etkinliği =
% Yükleme Kapasitesi =
Hapsolan İlaç Miktarı (µg)
× 100
Toplam İlaç Miktarı (µg)
Hapsolan İlaç Miktarı(µmol)
× 100
Nanopartikül Ağırlığı(µmol)
Hesaplamalar sonrası elde edilen yükleme etkinlikleri ve yükleme kapasiteleri
değerleri Çizelge 4.10’da verilmiştir.
Çizelge 4.10. Yükleme etkinliği ve yükleme kapasitesi değerleri (±SS, n=3)
%Yükleme Etkinliği ± SS
% Yükleme Kapasitesi ± SS
6-O-Capro β-CD
40,5±2,4
4,05±0,4
CS-6-O-Capro β-CD
62,33±4,6
4,16±1,3
Polikatyonik β-CDC6
63,9±2,1
6,39±0,7
4.7.
Paklitaksel Dilüsyon Testi
Amfifilik siklodekstrin nanoküreler içinde ve yüzeyinde bulunan Paklitakselin
seyreltme faktörüne bağlı olarak değişimini incelemek amacıyla, nanoküreler farklı
oranlarda pH 7,4 fosfat tampon çözeltisi ile seyreltilmişlerdir. Elde edilen
nanopartiküller HPLC ile analiz edilmiştir. Veriler Şekil 4,14’te gösterilmiştir.
82
% Paklitaksel Miktarı
100
80
60
40
20
0
5
10
25
50
100
250
500
1000
Seyreltme Katsayısı
6-0-CAPRO
CS-6-O-CAPRO
PBO 234
Şekil 4.14. Seyreltme faktörüne bağlı salınan Paklitaksel miktarı (±SS, n=3)
4.8.
İlaç Salım Profilinin Belirlenmesi
Siklodekstrinlerden salınan Paklitaksel miktarı tüp yöntemi ile tayin edilmiştir.
Bunun için belirli zaman aralıklarında pH 7,4 fosfat tampon çözeltisi içindeki ilaç
yüklü nanokürelerden 0,5 ml örnek vial içine alınmış ve yerine eşit hacimde yeni
FTÇ eklenmiştir. HPLC yöntemi ile yapılan analiz sonucu Paklitakselin % kümülatif
salım sonucu Şekil 4.15’te gösterilmiştir.
% Kümülatif Salınan
Paklitaksel Miktarı
120
100
80
60
6-O-Capro β-CD
40
CS-6-O-Capro β-CD
β-CDC6
20
0
0
10
20
30
Zaman (dakika)
40
50
60
Şekil 4.15. % Kümülatif salınan Paklitaksel miktarı(±SS, n=3)
83
4.9. Boş Siklodekstrin Nanopartiküllerin Güvenilirlik Çalışması
Boş
siklodekstrin
nanopartiküllerin
L929
hücreleri
üzerindeki
hücre
yaşayabilirliğine etkisi Şekil 4.16’da gösterilmiştir.
% Hücre Yaşayabilirliği
160
140
120
100
80
250 nM
60
500 nM
40
20
0
kontrol
6-o-Capro
CS
β-CDC6
Şekil 4.16. Boş siklodekstrin nanokürelerin L929 hücre yaşayabilirliğine etkisi
(± SS,n=3)
4.10. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanopartiküllerin Etkinlik Çalışması
İlaç yüklü amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerin MCF-7 hücreleri üzerindeki hücre
yaşayabilirliğine etkisi Şekil 4.17’de gösterilmiştir.
% Hücre Canlılığı
120
100
80
60
40
20
250 nM
500nM
0
Şekil 4.17. İlaç yüklü ve boş siklodekstrin nanokürelerin MCF-7 hücre
yaşayabilirliğine etkisi (± SS,n=3)
84
5.TARTIŞMA
5.1.
Amfifilik β-Siklodekstrin Türevleri
Amfifilik siklodekstrinler, ilaç taşıma sistemlerinde çok sayıda araştırmanın
yapıldığı, doğal siklodekstrinlerden hareketle farklı yöntemlerle sentezlenen
siklodekstrin türevleridir [159]. Son yıllarda ilaç ve gen taşıyıcı sistemler olarak
amfifilik siklodekstrinler sıklıkla çalıılmaktadır. Bu türevlerin farmasötik alanda ilgi
görmesinin başlıca sebebi, sulu ortamda ara yüzeylerde amfifilik siklodekstrinlerin
kendiliğinden düzenlenebilme (self-organization) özelliğine sahip olmalarıdır [160].
Bu özellik nedeniyle amfifilik siklodekstrin türevleri spontan olarak nano ölçekte
taşıyıcı sistemler oluşturabilmektedirler. Amfifilik siklodekstrinler genellikle doğal βCD’lerden sentezlenir [159] ve sentez sırasında farklı yöntemler kullanılabilir
[159,161].
Tez çalışması kapsamında, nanoküre oluşturmak için kullanılan Heptakis (6-Oheksanoil) siklomaltoheptoz β-CD olan 6-O Capro β-CD, primer yüz modifiye
amfifilik β-CD türevidir. Sentezi, makrosiklik halkasının 6. Pozisyonuna, 6C’lu yağ
asiti zincirinin bağlanması ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, nanopartikül
oluşturan model amfifilik β-CD molekülü olarak 6-O-CAPRO-β-CD şeçilmesinin
başlıca nedeni Memişoğlu ve ark. [152] tarafından önceki yıllarda yapılan
çalışmada, β-CDlerin primer yüzeyinde 6 karbonlu düz alifatik zincirlerle
gerçekleştirilen modifikasyon sonucu oluşan amfifilik siklodekstrin türevlerinin,
uygun nanopartikül oluşturabilen moleküller olduklarının belirtilmesidir.
Negatif yüzey yüküne sahip 6-O-CAPRO-β-CD’ in yüzey yükünü pozitif hale
getirebilmek için, çalışmalar sırasında kitosanın suda çözünen türevi olan
Protasan® kullanılmıştır. Kitosan, böcek ve kabukluların çoğunlukla dış iskelet
sistemini oluşturan kitinin N-deasetilasyonu sonucu elde edilen doğal bir polimerdir
[162]. Nanopartiküllerin yüzey yüklerini değiştirmek amacıyla poli-L-lizin, poli- Ɛkaprolakton gibi farklı katyonik polimerle ile modifikasyonu söz konusudur [163].
Ancak poli-L-lizin ve polietilen imin gibi katyonik hidrofilik polimerlerin toksik etkisi
bilinmektedir [164-166] . Çalışmalarımız sırasında yüzey modifiye edici polimer
olarak kitosanın seçilmesinin nedenleri arasında kitosanın toksik olamaması ve
biyoparçalabilir bir doğal polimer olmasıdır. Kitosan mukoadezif etkiye sahiptir. Bu
85
etkiyi hem biyoadheziv etkisi ile hem de epitel hücreleri arasındaki sıkı bağlantıları
geçici olarak açması ile sağlamaktadır [167]. Ayrıca Kitosan süspansiyonları ve
mikropartikülleri immün tetikleyici etki yaparak makrofaj ve polimorf nukleer
hücrelerin sayısını ve aktivasyonunu artırdığı bilinmektedir [168].
Çalışmalar sırasında kullanılan diğer amfifilik siklodekstrin türevi ise yine β- CD’in
modifikasyonu ile elde edilmiş polikatyonik β-CDC6’ dır. İspanya’da Sevilla
Üniversitesi’nde Dr. J. Benito tarafından sentezlenen amfifilik siklodekstrini yine
Benito ve ark. tarafından [154], gen taşınım sistemi olarak polipleks formunda
kullanılmıştır. Aynı grup tarafından yapılan çalışmalarda DNA ile polipleks
oluşturularak gen taşınımında etkinliği, saflığı ve toksisitesi gösterilmiştir.
Sentezlenen polikatyonik βCDC6’nın DNA ile polipleks oluşturabildiği, BLN-CL2
murin karaciğer hücre hattı ve COS-7 maymun böbrek fibroblast hücre hattı
üzerinde yapılan çalışmalar sonucu toksik olmadığı, hücre yaşayabilirliğinin %95
ve üzerinde olduğu gösterilmiştir.
5.2.
Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Ön Formülasyon Çalışmaları
Amfifilik siklodekstrin nanokürelerin hazırlanmasında kullanılan nanopresipitasyon
yöntemi, nanopartikül oluşturmak için kolay ve ekonomik bir yöntemdir.
Formülasyon geliştirme çalışmaları sırasında, siklodekstrinleri çözmek için aseton,
etanol ve metanol organik faz çözücüsü olarak kullanılmıştır.
Formülasyonlarda etkisi incelenen bir başka parametre sürfaktan ve sürfaktan
konsantrasyonudur. Çalışmalar sırasında bütün formülasyonlarda sıcaklık, organik
çözücünün hacmi, siklodekstrin miktarı, karıştırma süresi ve hızı sabit tutularak,
formülasyonlar ortalama partikül büyüklüğü dağılımı, zeta potansiyeli ve
polidispersite açısından karşılaştırılmıştır.
6-O-Capro β-CD için aseton ile hazırlanan sürfaktan içermeyen partiküllerin
ortalama partikül büyüklüğü 163,6 nm, polidispersite indeksi 0,62 ölçülürken %0,1
(a/h) Pluronic®F68 içeren formülasyon için partikül büyüklüğü dağılımı 140,9 nm,
polidispersite indeksi ise 0,30 ölçülmüştür. İki formülasyonda partiküllerin zeta
potansiyelleri sırasıyla -26,2 ve -23,5 mV ölçülmüştür. Sürfaktan kullanılarak
hazırlanan formülasyonda ortalama partikül büyüklüğü ve polidispersite indeksinde
istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir azalma görülmektedir. Bu durum
86
sürfaktanın formülasyonu stabilize ettiği ve daha homojen nanopartiküllerin
oluşmasına neden olmasıyla açıklanabilir. Yapılan bir çalışmada hidrofilik
sürfaktan olan Pluronic F 68 kullanıldığında, elde edilen nanopartiküllerin daha
küresel olduğu ve monodispers bir partikül büyüklüğü dağılımı elde edildiği
bildirilmiştir [169].
Çözücü olarak etanolün kullanıldığı formülasyonda ise yukarıda açıklanan
sonuçların tam tersi durum söz konusu olmuştur. Sonuçlara göre, sürfaktansız
hazırlanan formülasyonların partikül büyüklüğü 134,3 nm ölçülürken; sürfaktan
olarak %0,1 (a/h) Pluronic®F68 içeren formülasyonlarda partikül büyüklüğü
dağılımı 190,2 nm ye yükselmiştir. Oluşan nanopartiküller stabil ve homojen
(PI= 0,08) olduğu için kullanılan sürfaktan, oluşan nanopartiküllerin yüzeyinde bir
tabaka oluşturarak partikül büyüklüğünde istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir
artışa neden olmuştur. Amfifilik siklodekstrinlerin sürfaktan gerektirmeden
kendiliğinden nanopartikül oluşturma özellikleri bilinmektedir [170-172].
Kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD nanokürelerin aseton ile hazırlanan sürfaktansız
formülasyonlarında partikül büyüklüğü 284,6 nm (PI= 0,34) ölçülmüştür. Aynı
formülasyonun %0,1 (a/h) sürfaktan ile hazırlanması partikül büyüklüğünde
anlamlı (p<0,05) bir azalmaya ve daha homojen partiküllerin oluşmasına neden
olmuştur (197,2 nm; PI=0,23). Organik çözücü olarak etanolün kullanıldığı
formülasyonlarda
sürfaktan
içermeyen
büyüklüğü dağılımı 163,4 nm
nanopartiküllerin
ortalama
partikül
(PI=0,04); sürfaktanın kullanıldığı formülasyonda
167,9 nm (PI= 0,15) ölçülmüştür.
Diğer bir amfifilik siklodekstrin türevi olan β-CDC6 formülasyonlarında ise organik
çözücü olarak asetonun kullanıldığı sürfaktansız hazırlanan ve %0,1(a/h) sürfaktan
kullanılarak hazırlanan formülasyonlarda ortalama partikül büyüklüğü sırasıyla
179,5 nm ve 284,9 nm’dir. Sürfaktan içermeyen formülasyonun etanol ile
hazırlanması sonucu partikül büyüklüğü 82,9 nm olmuştur ve bu farklar istatistiksel
olarak anlamlıdır (p<0,05).
Formülasyon geliştirme sırasında kullanılan organik solvanın polaritesinin ve su ile
karışabilirliğinin nanopartikül çapı üzerinde doğrudan etkisi vardır. Çünkü
nanopartikül oluşumu Marangoni etkisi ve dolayısıyla organik fazın sulu faz içine
87
difüze olurken yaratılan türbülansın derecesine bağlıdır. Bu nedenle farklı
sürfaktan varlığı ve yokluğunda birbiriyle çelişen sonuçlar elde edilebiliyor. Bu
çalışmada tüm formülasyonlarda sürfaktana gerek kalmadan en uygun sonuçları
veren organik çözücü olan etanol tercih edilmiştir. Ortalama partikül büyüklüğü
dağılımı sonuçları iki siklodekstrin türevi için de etanolün iyi bir çözücü olduğu
göstermektedir. Yine sonuçlar değerlendirildiğinde sürfaktan olarak kullanılan
Pluronic®F68’in etanol ile hazırlanan formülasyonlarda partikül büyüklüğü
üzerinde arttırıcı etkisi olduğu görülmüştür. İleri çalışmalarda daha sağlıklı
karşılaştırma yapmak amacıyla üç formülasyon arasındaki farklılıklar en az
seviyede tutulmaya çalışılmıştır. Bu amaçla, Kitosan kaplı amfifilik β-CD
formülasyonlarında sürfaktan kullanılarak hazırlanan aseton formülasyonları
etanole göre daha düşük partikül büyüklüğü ve daha düşük polidispersite indeksi
vermesine rağmen, çalışmaların devamında etanol ile hazırlanan formülasyonların
kullanılmasına karar verilmiştir.
5.3.
Amfifilik Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu
Nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliğinde rol oynayan en önemli
özelliklerinden birisi oluşan partiküllerin büyüklüğü ve dağılımıdır. Kullanılan
polimerin moleküler ağırlığı ve konsantrasyonu; organik çözücü/polimer oranı;
organik faz/ sulu faz oranı, formülasyonda kullanılan sürfaktanın özellikler ve
konsantrasyonu, hazırlama sırasındaki parametreler (sıcaklık, karıştırma hızı ve
süresi) oluşan nanopartiküllerin büyüklüğünü doğrudan etkilemektedir [82].
Bu çalışmada kullanılan amfifilik siklodekstrin nanokürelerin tümü Bilensoy ve ark.
[155,156] tarafından yapılan çalışmalar temel alınarak polimer/ organik faz oranı
1/1; organik faz/ sulu faz oranı 1/2 olacak şekilde hazırlanmıştır.
5.3.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı
Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan amfifilik siklodekstrin nanokürelerin
ortalama partikül büyüklüğü dağılımı Malvern Zetasizer ile yapılan ölçümler
sonucunda değerlendirilmiştir. Nanopartikül hazırlamada kullanılan amfifilik
siklodekstrinler
içerisinde
en
küçük
partikül
büyüklüğü
dağılımına
sahip
siklodekstrin türevi polikatyonik β-CDC6’dır ve ortalama partikül büyüklüğü 74
nm’dir.
88
Kitosanla kaplı 6-O-Capro β-CD nanokürelerin partikül büyüklüğünde (125 nm),
6-O Capro β-CD nanokürelerin partikül büyüklüğüne (103 nm) göre anlamlı
(p<0,05) bir artış görülmektedir. Kitosan hazırlanan nanokürelerin dış yüzeyini
kapladığı için partikül büyüklüğündeki bu artış beklenen bir sonuçtur. Formülasyon
sırasında kullanılan kitosan miktarının seçiminde, partikül büyüklüğü dağılımındaki
değişimler temel alınan parametre olmuştur.
Her üç formülasyonda hazırlanan nanokürelerin partikül büyüklüğü dağılımlarının
200 nm’den küçük olması, hazırlanan nanopartiküllerin tümörlü bölgede EPR etkisi
olarak bilinen özellikten yararlanarak, tümör içinde birikmesine neden olabilir.
Literatürde nanopartiküllerin EPR etkisi ile tümörlü bölgede birikebilmeleri için
gerekli partikül büyüklüğünün 200 nm’den az olması gerektiği belirtilmektedir
[143,144].
Özellikle 100 nm’nin altına inildiğinde RES tarafından tanınması
engellendiği için hem kanda dolaşım süresi artabilmekte hem de lenf nodlarında
tutulma ve hücre içine giriş özellikleri artmaktadır.
5.3.2. Zeta Potansiyel
Zeta potansiyel değeri, partikülün sahip olduğu yüzey yükünü belirten bir değerdir
[173] ve hazırlanan nanopartiküllerin stabilitesi ve biyolojik membranlarla etkileşimi
açısından oldukça önemlidir. Hazırlanan nanokürelerin zeta potansiyel değerleri
Malvern Zetasizer ile ölçülmüştür.
Nanoküre hazırlamada kullanılan amfifilik 6-O-Capro β CD nanokürelerin zeta
potansiyel değerleri -29 mV ölçülmüştür. Bu değer literatürde 6-O-Capro β CD ile
hazırlanan nanokürelerin zeta potansiyel değeri ile örtüşmektedir [45]. 6-O-Capro
β CD nanokürelerin yüzeylerinin kitosan ile kaplanması zeta potansiyel değerini
+45 mV’a yükseltmiştir. Kitosanın pozitif yüzey yüküne sahip olduğu ve bu nedenle
mukoadheziv özellik gösterdiği literatürde çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir [174].
Bu sonuç çalışmamız sırasında hazırladığımız nanokürelerin yüzeyinin kitosan ile
kaplanması
sonucu
zeta
potansiyelinin
artması
ile
de
doğrulanmıştır.
Formülasyonlarda kullanılan β-CDC6 polikatyonik özelliktedir ve daha önceki
çalışmalarda DNA ile polipleks oluşturulmuştur. Yapılan zeta potansiyel ölçüm
sonuçları β-CDC6 için +61 mV bulunmuştur. Bu sonuç literatürle örtüşmektedir
89
[153,154]. Pozitif yük hücresel etkileşim açısından avantajlıdır. Ancak kan
dolaşımında proteinlerce tanınarak opsonize edilme açısından dezavantajlıdır.
5.3.3. SEM Görüntüleri
Siklodekstrin nanokürelerin görüntülenmesinde taramalı elektron mikroskobu
kullanılmıştır. Metal levha üzerine sabitlenen örnek altın-palladyum karışımı ile
kaplanmıştır. Her üç siklodekstrin türevi için de SEM görüntülerinde yüzeyi
düzgün, küresel yapılar görülmüştür. Ancak siklodekstrinler ve kitosan şeker türevi
olmaları nedeniyle elektron bombardımanına hassas oldukları için görüntüleme
sırasında kısmi bozuklukların oluşmasına neden olmuştur. SEM görüntüleri,
partikül büyüklüğü sonuçlarını doğrulayıcı niteliktedir. Görüntüleme sonucu en
küçük partikül büyüklüğü polikatyonik β-CDC6 nanokürelerde, en büyük partikül
büyüklüğü kitosan kaplı siklodekstrin nanokürelerde görülmüştür.
5.3.4. Uzun Süreli Stabilite
Tez çalışması sırasında hazırlanan boş siklodekstrin nanokürelerin uzun süreli
stabilite çalışmaları yapılmış ve bu kapsamda 12 ay süreyle zamana karşı partikül
büyüklüğü dağılımı, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel değerleri ölçülmüştür.
Bu ölçümlere bağlı olarak şu sonuçlar elde edilmiştir:
• 6-O-Capro β-CD nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğünde 4. Aya
kadar belirgin bir artış olmamıştır. Ancak 4,8 ve 12. aylarda partikül
büyüklüğü ortalama 220 nm olmuştur. Hazırlanan 6-O-Capro β-CD
nanokürelerin 12 ay boyunca istenilen büyüklük sınırları içerisinde olduğu
gözlenmiştir. Partikül büyüklüğü dağılımına bağlı olarak polidispersite indeksi
değerlerinin 0,13 ve 0,20 arasında değişmektedir. Zeta potansiyel değerleri 24 mV ile -32 mV arasında değişmiştir.
• Kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD nanokürelerin 12 aylık stabilite çalışmaları
süresince ortalama partikül büyüklüğü değerlerindeki artışın en fazla 8. ayda
olduğu görülmektedir ve 200 nm olarak ölçülmüştür. Ön formülasyon
çalışmaları
sırasında
uygun
kitosan
konsantrasyonunun
belirlenerek
formülasyonlarda uygulanmasıyla, kitosan kaplı nanopartiküllerin partikül
90
büyüklüğünde çok büyük bir değişim olmasının önüne geçilmiştir. Aynı
zamanda 6-O-Capro β-CD anyonik bir siklodekstrin türevidir. Bu nedenle
yüzeyini kaplayan pozitif yüklü kitosan ile elektriksel etkileşimi sayesinde
stabil kalmıştır. Nanopartiküllerin polidispersite indeksi değerlerinde 12 aylık
süre boyunca 0,23’ten 0,33 e artış görülmüştür. Literatürde nanopartiküllerin
stabil kalması için en uygun zeta potansiyel değerlerinin -35mV ile +35 mV
arasında
olması
gerektiği
belirtilmektedir
[175].
Kitosan
kaplı
nanopartiküllerin zeta potansiyel değerleri 12 ay boyunca +44 mV ile +51 mV
arasında
değişmektedir.
Polidispersite
indeksindeki
meydana
gelen
değişikliğin nedeninin kitosan kaplı nanopartiküllerin yüksek pozitif zeta
potansiyeli olduğu düşünülmektedir.
• β-CDC6 amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü
dağılımının 4. aya kadar ortalama 80 nm iken 4-12 aylar arası ortalama 170
nm ölçülmüştür.
Zeta potansiyel değerinde anlamlı bir artış (p>0,05)
olmamakla beraber 12 ay boyunca zeta potansiyel değeri 61mV-66mV
arasında ölçülmüştür. Çeşitli kaynaklarda +35 mV zeta potansiyeline sahip
nanopartiküllerin
stabilite
sorunu
olduğu
belirtilmiştir.
β-CDC6
nanokürelerindeki partikül büyüklüğündeki artışın kuvvetli yüzey yüküne bağlı
olduğu düşünülmektedir.
Her üç siklodekstrin nanoküre formülasyonunda sulu dispersiyon halinde
saklandığında partikül büyüklüğünde ve zeta potansiyelinde değişimler olmasına
rağmen 12 ay boyunca partikül büyüklüğü dağılımları ve zeta potansiyel değerleri
istenilen aralıkta ölçülmüştür.
5.4.
Paklitaksel’in Analitik Yöntem Validasyonu
Paklitaksel’in
analitik
gerçekleştirilmiştir.
yöntem
Paklitaksel’e
validasyonu
ait
çalışmaları
kromatogram
HPLC
Şekil
4.7’de
kullanılarak
verilmiştir.
Kromatogramdan da görüldüğü gibi Paklitaksel’e ait pik düzgün bir şekilde elde
edilmiş olup, alıkonma zamanı 4,57 dakika olarak bulunmuştur.
Hazırlanan kalibrasyon doğrusu 1-200 μg/mL aralığında çalışılmıştır. Deney
bulguları incelendiğinde, belirtilen konsantrasyon aralığında, HPLC ile analiz
91
sonucu elde edilen pik alanı arasında doğrusal ilişki saptanmıştır. Elde edilen
kalibrasyon doğrusunun r2 değeri 0,9999 olarak bulunmuştur.
Kullanılan analiz yönteminin doğruluğunun saptanması için seçilen üç farklı
konsantrasyonda (1-25-200 μg/mL) geri kazanımları ve bu geri kazanımların
ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayıları hesaplanmıştır. Literatürde
benzerlik ve farklılıklarının incelendiği çalışmalarda varyasyon katsayısının %2’den
daha küçük olması gerektiği bildirilmiştir [176] . Bizim çalışmamızda elde edilen
varyasyon katsayıları sırasıyla %0,7; %1,16 ve %0,88 bulunmuştur ve %2’nin
altında olduğu için kriterlere uygun bulunmuştur.
Analiz yönteminin kesinliğinin tayini için tekrar edilebilirlik, tekrar elde edilebilirlik
ve günler arası farklılık değerleri tayin edilmiş ve elde edilen sonuçların ortalama
değerleri ile standart sapma ve varyasyon katsayıları hesaplanmıştır. Her üç
değerlendirme sonucunda da seçilen konsantrasyon değeri olan 50 μg/mL için
ortalama konsantrasyon sırasıyla 49,7 µg/ml, 50,6 µg/ml ve 50,1 µg/ml
hesaplanmıştır. Bu ortalamalar üzerinden hesaplanan varyasyon katsayıları
sırasıyla 0,02, 0,4 ve 0,3 olarak hesaplanmış ve %2’nin altında bulunmuştur.
Yöntemin duyarlılığı için gözlenebilirlik sınırı 0,056 μg/mL ve alt tayin sınırı 0,18
μg/mL olarak tayin edilmiştir. Bu veriler seçilen analitik yöntemin çalışmamızın
amacına uygun duyarlılığa sahip olduğunu göstermiştir.
Paklitaksel için kullanılan analitik yöntemin özgünlüğü için yapılan çalışmalarda
nanopartikül
formülasyonlarında
kullanılan
yardımcı
maddelerin
ve
salım
ortamlarının Paklitaksel ile aynı şartlarda ve aynı alıkonma zamanında pik verip
vermediği değerlendirilmiş ve herhangi bir girişime rastlanmamıştır.
5.5.
Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Karakterizasyonu
5.5.1. Partikül Büyüklüğü Dağılımı
Paklitaksel
yüklü
amfifilik
siklodekstrin
nanokürelerin
hazırlanması
ve
karakterizasyonunda boş nanoküreler için uygulanan metotlar uygulanmış ve
sonuçlar değerlendirilmiştir.
92
Paklitaksel yüklü 6-O-Capro β-CD, kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD ve β-CDC6
nanoküreler için ortalama partikül büyüklüğü dağılımı sırasıyla 165 nm, 176 nm ve
92 nm bulunmuştur. İlaç yüklü nanokürelerin partikül büyüklüklerinin, ilaç yüklü
olmayan nanokürelerin partikül büyüklüğünden fazla olmasının nedeni olarak
Paklitakselin ekseriyetle siklodekstrin nanokürelerin yüzeyine adsorbsiyonu
düşünülmektedir. Literatürde konvansiyonel yükleme tekniğinde, ilacın matriks
enkapsülasyonundan
çok,
nanokürelerin
geniş
yüzeyinde
adsorbe
halde
bulunduğunun açıklanması sonucumuzu desteklemektedir [177].
5.5.2. Zeta Potansiyeli
Paklitaksel yüklü amfifilik siklodekstrin nanokürelerin zeta potansiyel değerleri
ölçülmüştür ve her üç siklodekstrin türevi için de istenilen yüzey yüküne sahip
partiküller elde edilmiştir.
5.5.3. Kısa Dönemli Stabilite
Paklitakselin konvansiyonel uygulamada karşılaşılan en büyük problem uygun
şekilde dilüe edildikten sonra kısa süreli fiziksel ve kimyasal stabilitesi
bulunmaktadır. Seyreltme ile bazı konsantrasyonlarda aşırı doymuş çözeltiler elde
edilmektedir
ve
bunun
sonucunda
Paklitaksel
kristaller
halinde
çökelti
oluşturmaktadır. Bu nedenle Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin stabilite
çalışmaları için hazırlanan partiküller sulu dispersiyon halinde saklanmışlardır.
Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin 30 gün süreyle partikül büyüklüğü
değerleri,
polidispersite
indeksleri
ve
zeta
potansiyel
değerleri
ölçülerek
yorumlanmıştır.
Stabilite çalışmaları sonucunda Paklitaksel yüklü nanokürelerin ortalama partikül
büyüklüğü 6-O-Capro β-CD için 165-219nm, kitosan kaplı 6-O-Capro β-CD için
179-216nm ve βCDC6 için 92-120 nm arasında değişmektedir.
Her üç
siklodekstrin formülasyonunun 1 aylık süre içindeki polidispersite indeksi ≤ 0,3
olarak bulunmuştur. Bu sonuç oluşan ilaç yüklü nanopatiküllerin homojen
olduğunu göstermektedir.
Zeta potansiyel değerlerine bakıldığında, ilaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin 1
ay boyunca zeta potansiyel değerlerinde çok az artış olduğu bununla birlikte boş
93
nanokürelerin zeta potansiyel değerleri ile aynı değerlere sahip oldukları
görülmüştür. Bütün bu değerlendirmeler sonucu Paklitaksel yüklü siklodekstrin
nanokürelerin 1 aylık süre içerisinde sulu dispersiyon halinde rekristalize
olmadıkları sonucuna varılabilir.
5.6.
İlaç Yükleme Etkinliğinin Belirlenmesi
Amfifilik
siklodekstrin
nanokürelere
Paklitaksel
konvansiyonel
yöntemle
nanopartikül hazırlama sırasında yüklenmiştir. Yükleme etkinliği değerleri Bölüm
3.2.7.’de belirtilen % yükleme etkinliği ve % yükleme kapasitesi formüllerine göre
hesaplanmıştır. Her iki formül için de ilk olarak formülasyon hazırlama aşaması
sonrası serbest ilaç ortamdan uzaklaştırılarak siklodekstrin nanokürelere yüklenen
Paklitaksel miktarı üzerinden hesaplamalar yapılmıştır. Siklodekstrin nanokürelere
yüklenen ilaç miktarı HPLC yöntemi ile tayin edilmiş elde edilen veriler formüllere
uygulanarak yükleme değerleri bulunmuştur. Santrifüj ile serbest Paklitakselin
uzaklaştırılması sonucu HPLC analizi ile elde edilen Paklitaksel miktarının, toplam
ilaç miktarına bölünmesi ile yükleme etkinliği; toplam siklodekstrin miktarına
bölünmesi ile de yükleme kapasitesi değerleri elde edilmiştir.
Yapılan hesaplamalar sonucu yükleme etkinliği 6-O-Capro βCD, kitosan kaplı 6-OCapro βCD ve βCDC6 için sırasıyla % 40,5, %62,3 ve % 63,9 olarak
hesaplanmıştır. Bununla birlikte yükleme kapasitesi yine aynı sıra ile % 4,05,
%4,16 ve %6,4 bulunmuştur. Bu sonuçlar doğrultusunda en yüksek yükleme
etkinliği βCDC6 siklodekstrin nanokürelere aittir. Nanopartikülleri hazırlama
sırasında formülasyonlarda siklodekstrin/ Paklitaksel oranı 10/1 olacak şekilde
Paklitaksel
konulmuştur.
Yükleme
kapasiteleri
sonucunda
βCDC6
formülasyonunda % 10 ilacın % 6 sının, diğer iki formülasyonda ise %4’ünün
siklodekstrinlerce hapsedildiği görülmüştür. Her iki hesaplama sonucu en etkili
formülasyonun βCDC6 siklodekstrin nanokürelere ait olmasının nedeni, bu
siklodekstrin türevinin yüzey yükü ile ilişkili olmasına bağlanmaktadır. βCDC6
literatürde DNA ile polipleks oluşturmak için kullanılmıştır ve bu çalışmalarda DNA
gibi negatif yüklü moleküllerle kompleks yeteneğinin güçlü olduğu belirtilmektedir
[154]. Buna ek olarak bizim çalışmalarımız sırasında da Paklitakselin zeta
potansiyel değeri -12mV bulunmuştur. Daha önce de belirtildiği gibi Paklitakselin
94
nanokürelerin yüzeyinde adsorbe olduğu düşünülürse yükleme etkinliğindeki farkın
siklodekstrinlerin yüzey yüklerinden kaynaklandığı söylenebilir.
5.7.
İn-vitro Salım Çalışmaları
Amfifilik siklodekstrin nanopartiküler sistemlerden Paklitaksel salım çalışmalarında
%0,1 Tween 80 içeren pH 7,4 fosfat tampon çözeltisi kullanılarak salım yatay
çalkalayıcı su banyosunda gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem seçilirken literatürde yer
alan nanopartiküllerden Paklitaksel çalışmaları dikkate alınmıştır [178-180]. Salım
ortamının Tween 80 içermesinin nedenleri ise; sink salım koşullarını sağlamak ve
Paklitakselin yapılan tüpe yapışmamasıdır [181].
İn vitro salım çalışmaları sırasında belirli zaman aralıklarla nanopartikül örneğinin
eşit hacimde fosfat tampon çözeltisi ile yer değiştirilerek HPLC ile analizi
yapılmıştır. Her bir siklodekstrin formülasyonu için yükleme etkinliği ve HPLC
sonucu elde edilen konsantrasyon değerlendirilerek Paklitaksel’in kümülatif salım
grafiği çıkarılmıştır.
nanokürelerden
Bu grafiğe göre ilk 15 dakikada ilacın 6-O-Capro βCD
%82’si,
kitosanla
kaplı
nanokürlerden
%
80’i,
βCDC6
nanokürelerden ise %86’sı salınmıştır.
Paklitakselin nanokürelerden kısa sürede salınmasının iki temel nedeni olabilir.
Bunlardan birincisi nanopartiküllerin küçük boyutları nedeniyle yüzey alanlarının
geniş olmasıdır. Nanopartiküllerin geniş yüzey alanı ilacın kısa sürede salım
ortamına geçmesine neden olmuştur [146,182]. Salım sonuçları ortalama partikül
büyüklüğü dağılımı ile birlikte incelendiğinde en hızlı salımın en küçük partikül
büyüklüğü dağılımına (92 nm) sahip βCDC6 nanokürelerde, en yavaş salımın en
büyük partikül büyüklüğü dağılımına (176 nm) sahip kitosan kaplı 6-O-Capro βCD
nanokürelerde
olduğu
görülmektedir.
Paklitakselin
nanokürelerden
hızlı
salınmasının ikinci bir nedeni ise daha önce de açıklandığı gibi Paklitakselin
nanokürelerin yüzeyine adsorbe olmasıdır. Yüzeyde bulunan Paklitaksel salım
ortamına kısa sürede geçebilmektedir. 60 dakikanın sonunda polikatyonik amfifilik
siklodekstrinlerden Paklitakselin %92’si, kitosan kaplı siklodekstrinden % 86’sı,
anyonik siklodekstrin nanokürelerden ise % 84’i salınmıştır.
95
5.8.
Paklitakselin Dilüsyon Çalışması
İlaçlar vücuda verildiğinde yüksek bir seyreltme hacmine maruz kalmaktadır.
Ortalama olarak 70 kg ağırlığındaki bir insan için bu değer 3,5 litredir. Bu durumda
1 ml’lik CD formülasyonu uygulandığında seyreltme faktörü 1:3.500 olacaktır [182].
Bu durumda sink koşul altında yapılan salım çalışmasından çok dilüsyon çalışması
daha gerçekçi olmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda hazırlanan siklodekstrin
nanokürelerin farklı konsantrasyonlarda pH 7,4 fosfat tampon çözeltisi ile
seyreltilmiştir. Her konsantrasyon için alınan örnekte bulunan Paklitaksel analizi
için HPLC yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen seyreltme faktörüne karşı Paklitaksel
konsantrasyonu grafiği çizilerek yorumlanmıştır. 2:1000 oranında seyreltme
sonucuna göre, nanokürede bulunan Paklitaksel miktarının seyreltme ile azaldığı
söylenebilir. Kullanılan üç farklı siklodekstrin formülasyonunda ilacın neredeyse
tamamı pH 7,4 fosfat tampon çözeltisinde 1000 kez seyreltildiğinde salınmıştır.
5.9. Boş
Çalışması
Amfifilik
Siklodekstrin
Nanokürelerin
in
vitro
Güvenilirlik
Paklitakselin suda çözünürlüğü çok düşük olduğu için ticari preparatlarında taşıyıcı
olarak çözünürlüğünü arttırmak amacıyla Cremophor®EL:
etanol (1:1h/h)
kullanılmaktadır. Ancak Cremophor®EL’un ciddi toksisiteye neden olduğu
bülünmektedir [44,57-60]. Bu çalışmadaki amaç Cremophor®EL içermeyen bu
nedenle daha güvenilir taşıyıcı sistem geliştirmektedir. Bu nedenle hazırlanan boş
amfifilik siklodekstrin nanokürelerin güvenilirlik çalışması L-929 fare akciğer
fibroblast hücre hattında WST-1 yöntemi ile çalışılmıştır.
Boş siklodekstrin nanoküre içeren formülasyonlarının L-929 hücre hattı üzerinde
yapılan çalışmalarda, 48 saat sonunda hücre canlılığı değerleri kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında anlamlı (p>0,05) bir farkın olmadığı görülmüştür. ile aynı ve
kontrole yakın sonuçlar bulunmuştur. L929 hücrelerindeki yüksek yaşayabilirlik
oranı siklodekstrinlerin taşıyıcı olarak güvenilir olduklarını göstermektedir. Kitosan
kaplı siklodekstrin nanokürelerde, hücre canlılığının kontrole göre daha fazla
olmasının kitosandan kaynaklandığı düşünülmektedir. Literatürde kitosanın,
konsantrasyonuna ve deasetilasyon derecesine bağlı olarak L929 fibroblast hücre
hattı üzerinde proliferatif etkisinin gösterildiği çalışmalar mevcuttur [183,184].
96
5.10. Paklitaksel Yüklü Siklodekstrin Nanokürelerin Etkinlik Çalışması
Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin etkinlik testi MCF-7 insan meme
kanseri hücre hattında yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. 48 saat sonucu elde
edilen veriler doğrultusunda % hücre yaşayabilirliği hesaplanmıştır. Kontrol grubu
olarak sadece besiyeri içeren grup seçilmiştir. 48 saatin sonunda, Paklitakselin
DMSO içindeki çözeltisinin uygulandığı grupta hücre yaşayabilirliği %72
hesaplanmıştır. Paklitaksel içeren 6-O-Capro β-CD için hücre yaşayabilirlik değeri
%53 bulunurken bu değer kitosan kaplı nanokürelerde % 47 bulunmuştur. En
düşük hücre yaşayabilirliğinin β-CDC6 amfifilik siklodekstrin nanokürelerde olduğu
görülmüştür (%31). Tüm nanopartikül formülasyonları ve Paklitaksel çözeltisi
arasında istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir fark bulunmuştur. Sonuçların
siklodekstrin türevlerinin yüzey yükü ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Çünkü bütün
tümör hücreleri gibi MCF-7 hücrelerinin yüzeyi negatif yüklüdür Literatürde MCF-7
hücrelerinin yüzey yüklerinin -20 mV olduğu belirtilmiştir [185]. Bu nedenle pozitif
yüzey yüküne sahip polikatyonik βCDC6 amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerinin
hücreler ile etkileşiminin daha fazla olduğu düşünülmektedir.
MCF- 7 hücre hattı üzerinde yapılan çalışmada, Paklitaksel yüklü siklodekstrin
nanoküreler ile birlikte boş siklodekstrin nanokürelerin sitotoksik etkisi de
değerlendirilmiştir.
Boş
nanopartiküllerden
βCDC6
MCF-7
hücre
hattında
Paklitaksel solüsyonunu ile aynı toksik etkiyi gösterirken; kitosan kaplı ve düz 6-OCapro βCD nanokürelerin MCF-7 hücre hattında Paklitaksel solüsyonundan
anlamlı (p<0,05) bir şekilde daha az hücre yaşayabilirliğine neden olduğu
görülmüştür. Boş siklodekstrin nanokürelerin L929 hücre hattında herhangi bir
toksik etkisi olmamasına rağmen, MCF-7 hücre hattında paklitaksele eş ve ya
daha az hücre yaşayabilirliğine neden olması, siklodekstrinlerin kendilerinin
antikanserojen etkisinin olabileceği düşüncesine neden olmuştur. Literatürde
MeβCD’lerin, metillenme derecesine bağlı olarak hücre membranlarının biyolojik
yapısını bozduğu bu nedenle proliferasyonda azalmaya neden olduğu belirtilmiştir
[186].
97
6.SONUÇLAR VE ÖNERİLER
Bu tez kapsamında başlangıçta belirlenen amaçlar doğrultusunda 6-O-Capro βCD,
kitosan kaplı 6-O-Capro βCD ve polikatyonik βCDC6 olmak üzere üç farklı yüzey
yüküne
sahip
amfifilik
siklodekstrin
nanoküreler
taşıyıcı
sistem
olarak
kullanılmıştır.
Nanopresipitasyon yöntemi ile hazırlanan amfifilik siklodekstrin nanokürelerin in
vitro karakterizasyonu yapılmıştır. Bu amaçla formülasyonların ortalama partikül
büyüklüğü dağılımı ve zeta potansiyel değerleri ölçülmüştür. Hazırlanan boş
amfifilik siklodekstrin nanokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımı her üç
formülasyon içinde istenilen aralıktadır (<200 nm) ve her biri homojen dağılım
göstermektedir.6-O-Capro βCD nanokürelerin yüzey yükü negatif (-30mV),
kitosanla kaplı 6-O-Capro βCD ve βCDC6 nanokürelerin yüzey yükü pozitif
(+44mV,+60mV) bulunmuştur. Bununla birlikte karakterizasyon için taramalı
elektron mikroskobu görüntülemeleri yapılmıştır. Her üç formülasyonun küresel ve
düzgün bir yüzeye sahip oldukları görülmüştür.
Boş siklodekstrin nanokürelerin uzun dönem stabilitelerinin değerlendirilmesi
amacıyla 12 ay boyunca in vitro karakterizasyonları yapılmış, nanoküreler
ortalama partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi ve zeta potansiyel değişimleri
açısından karşılaştırılmıştır. Her üç formülasyonun da 12 ay süreyle stabil oldukları
gözlemlenmiştir.
Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin in vitro karakterizasyonu sonucu,
hazırlanan her üç formülasyonun da istenilen ortalama partikül büyüklüğü
dağılımına (<200 nm) sahip olduğu görülmüştür.
Paklitaksel
yüklü
amfifilik
siklodekstrin
nanokürelerin
fiziksel
stabilitesini
değerlendirmek amacıyla 30 gün boyunca nanokürelerin in vitro karakterizasyonu
yapılmıştır. Ortalama partikül büyüklüğü dağılımı ve polidispersite indeksi
sonuçlarına göre Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanokürelerin stabil oldukları
belirtilmiştir.
İlaç yükleme etkinliği sonuçlarına göre formülasyonların yükleme etkinlikleri %40%64 arasındadır. İlaç yükleme kapasitesi sonuçlarına göre de, formülasyona
98
eklenen %10 Paklitakselin %4-6’sının siklodekstrin nanoküreler tarafından
hapsedildiği gözlemlenmiştir.
İlaç salım profilinin değerlendirilmesi amacıyla tüp yöntemi kullanılmıştır. Her
formülasyon için 1 saatlik salım % kümülatif salım profili çıkartılmıştır. Buna göre
Paklitakselin %80-90’ının ilk 30 dakikada salındığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca her
bir formülasyon için dilüsyon testi uygulanmıştır. Paklitaksel yüklü siklodekstrin
nanoküreler farklı konsantrasyonda fosfat tampon çözeltisi ile seyreltilmiştir. 1000
kat
seyreltme
sonucunda
siklodekstrinlerdeki
ilacın
%
90’ının
salındığı
görülmüştür.
L929 fare fibroblast hücre hattı üzerinde yapılan güvenilirlik çalışmaları sonucu
boş amfifilik siklodekstrin nanokürelerin toksik etkisinin olmadığı görülmüştür.
İlaç yüklü siklodekstrin nanokürelerin antikanser etkinlik değerlendirme çalışmaları
MCF-7 insan meme kanseri hücre hattında çalışılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda
aynı konsantrasyonda Paklitaksel içeren siklodekstrin nanokürelerin, Paklitaksel
solüsyonuna göre daha fazla antitümöral etkinlik göstermiştir.
İlaç taşıma sistemi olarak ilk kez çalışmamızda kullanılan polikatyonik βCDC6
amfifilik siklodekstrinlerden istenilen partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeline sahip
nanoküreler elde edilmiştir. βCDC6 nanokürelerin ilaç yükleme ve salım
çalışmalarında etkili sonuç verdiği ve ilaç taşıma sistemi olarak güvenilir oldukları
çalışmalarımız sonucunda gösterilmiştir.
Gelecekte bu konu ile ilgili yapılacak çalışmalarda her üç amfifilik siklodekstrin
türevinin nanokapsül formülasyonları hazırlanarak ilaç yükleme etkinlikleri ve ilaç
salım profilleri belirlenerek nanoküre formülasyonları ile karşılaştırılabilir. Bununla
birlikte hazırlanan amfifilik siklodekstrin nanoküre formülasyonlarının in vivo
antitümöral etkinliklerinin ve biyodağılımlarının belirlenebilmesi için hayvan
deneyleri yapılmalıdır. Ayrıca doz belirleme ve toksisite çalışmaları yürütülmelidir.
99
KAYNAKLAR DİZİNİ
1.
NCI, 2012. What You Need To Know About: Breast Cancer, NIH Publication
No. 12-1556, U.S.
2.
Yalav, O., 2009, Erken Evre Meme Kanserli Hastalarda Sentinel Lenf Nodu
Biyopsisinin Yeri, Uzmanlık Tezi, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel
Cerrahi Anabilim Dalı, Adana, s. 3-5.
3.
Netter,F. H., 2003. Atlas of Human Anatomy 3th Edition. ISBN: 1-929007-116. 177p.
4.
Russo, J. and Russo, I., 2004, Development of Human Breast. Maturitas 49,
pp. 2-15
5.
Lanfranchi, A. and Brind J.,2005, Breast Cancer: Risks and Prevention,
Breast Cancer Prevention Instıtute, USA.
http://members.iinet.net.au/~sambrod/Breast_Cancer_Risks_and_Prevention
_Booklet.html
6.
Tot, T. 2011, Breast Cancer A Lobar Disease. Springer, London. pp. 19-39.
7.
Shier, D., Butler, J., Lewis, R.,2012. Hole’s Essentials of Human Anatomy &
Physiology 11th Edition. McGraw-Hill ISBN :978–0–07–337815–2. 301p
8.
Ruddon, W. R., 2007. Cancer Bıology. Oxford University Press ISBN-13:
978-0-19-517543-1. p. 4, 67.
9.
Peppas, L. and Blanchette, J., 2004. Nanoparticle and Targeted Systems for
Cancer Therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 56. pp. 1649– 1659
10. Roses,
F.D.,
2005.
Breast
Cancer.
Elsevier
ISBN
0-443-06634-5.
Philadelphia. pp.3-29
100
11. Alteri, R. et.al., 2011. Breast Cancer Facts & Figures, American Cancer
Society, Atlanta. 1 p.
12. Özmen, V. 2008. Dünya’da ve Türkiye’de Meme Kanseri. Meme Sağlığı
Dergisi 4:2.
13. National Cancer Instıtute, Surveillance Epidemiology and End Results,
http://seer.cancer.gov/statfacts/html/breast.html
14. DeSantis, C., Siegel, R., Bandi, P., Jemal, A., 2011, Breast Cancer Statistics.
CA Cancer J. Clin. 61 pp. 409-418
15. MMWR, 2012, Vital Signs: Racial Disparities in Breast Cancer Severity —
United States, 2005–2009. Centers for Disease Control and Prevention,
Morbidity and Mortality Weekly Report, 3p
16. Groep, P., Wall, E., Diest, P., 2011. Pathology of Hereditary Breast Cancer.
Cell Oncol. 34:71–88.
17. Öztürk, M., 2006, Meme Kanserinin Genetiği ve Risk Faktörleri. İ. Ü.
Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri Meme Kanseri
Sempozyum Dizisi No: 54, s. 15-26.
18. Couch, F., DeShano, M., Blackwood, M., 1997, BRCA1 mutations in women
attending clinics that evaluate the risk of breast cancer. N Engl J Med 336.
pp. 1409-1415.
19. Berry, D., Parmigiani, G., Sanchez, J., 1997, Probability of carrying a
mutation of breast ovarian cancer gene BRCA1 based on family history. J
Natl Cancer Ins 89. pp. 227-238
20. Phillips, K.A., Andrulis, I.L., Goodwin P.J., 2001, Current Perspectives on
BRCA1- and BRCA2-Associated Breast Cancers. Intern Med J 31. 349p.
101
21. King, M.C., Marks, J.H., Mandell, J.B., 2003, Breast and Ovarian Cancer
Risks Due to Inherited Mutations in BRCA1 and BRCA2. Science 302.
pp.643-646.
22. Kelsey,J., Gammon, M.D., 1993. Reproductive Factors and Breast Cancer.
Epidemiol Rev. 15. pp. 36-47.
23. Pike, M.C., Henderson, B.E., Casagrande, J.T., 1981. Oral Contraceptives
Use and Early Abortion as Risk Factors For Breast Cancer in Young Women.
Br J Cancer 43. pp. 72-76.
24. Trichopoulos, D., Mac, M. B., Cute, P. 1972. The menapause and breast
cancer risk. JNCI 48. pp. 605-609.
25. Ekbom, A., Hsieh, C.C., Lipworth, L., Adami, H.Q.,1997. Trichopoulos D.
Intrauterine Environment and Breast Cancer Risk in Women: A PopulationBased Study. J Natl Cancer Inst. 89: 71-6.
26. Miler, W.R., 1990. Oestrogens and Breast Cancer. Biological considerations.
Br Med Bull 47. pp. 470-478.
27. American Joint Committee on Cancer, Breast Cancer Staging. 7th Edition
http://www.cancerstaging.org/staging/index.html
28. Singletary, S.E., Allred, C, Ashley, P. 2002. Revision of the American Joint
Committee on Cancer Staging System for Breast Cancer. J Clin Oncol 20
(17): 3628-36.
29. Edge, S.B., Byrd, D.R., Compton, C.C., 2010. AJCC Cancer Staging Manual.
7th ed. New York, NY: Springer. pp. 347
30. Aydıner, A., Topuz, E., 2007. Meme Kanseri Tanı-Tedavi-Takip, İstanbul
Konsensusu 2006. Nobel Tıp Kitapevleri ISBN: 975-420-527-2.
102
31. Tanaka, T., Decuzzi, P., Cristofanilli, M., Sakamoto, J., Tasciotti, E.,
Robertson, F., Ferrari, M., 2009. Nanotechnology for Breast Cancer Therapy.
Biomed Microdevices 11:49–63
32. Utkan, Z., Esen, G., Yavuz, E., 2007. Meme Kanserinde Tanı. Meme Sağlığı
Dergisi 2007 Cilt: 3 Sayı: 2
33. Yoshimoto, M., Kasumi, F., Iwase, T., Takahashi, K., Tada, T., Uchida, Y.
1997. Magnetic resonance galactography for a patient with nipple discharge.
Breast Cancer Research and Treatment 42: 87–90.
34. Bayol, Ü. , 2005. Meme Kanseri Tanısında İnce İğne Aspirasyon Biyopsisi
(İİAB)’nin Yeri. Türkiye Ekopatoloji Dergisi 1 (1-2): 9-12.
35. Burbank, F., 1997. Stereotactic Breast Biopsy of Atypical Ductal Hyperplasia
and Ductal Carcinoma In situ Lesions: Improved Accuracy With Directional,
Vacuum-Assisted Biopsy. Radiology 202:3 843-847.
36. Fentiman, I. S., 1999, Breast Cancer. Blackwell Science ISBN: 0-63205242:2 p. 107-252.
37. Akdeniz, A., 2010, Triple Negatif Meme Kanserlerinin Demografik Klinik ve
Patolojik Karakteristikleri. Uzmanlık Tezi. Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi
İç Hastalıkları Anabilim Dalı s. 33-35
38. Smith, I. E., Dowsett, M. 2003. Aromatase Inhibitors in Breast Cancer. N
Engl J Med ; 348:2431-42.
39. Smith, J. 2008. The Third-Generation Aromatase Inhibitors. U.S. Pharm. ;
33(4):20-30
40. University of Maryland Medical Center.
http://www.umm.edu/patiented/articles/what_chemotherapy_treatments_brea
st_cancer_000006_11.htm
103
41. EMRO Tehnical Publication Series 31. 2006. Guidelines for Management of
Breast Cancer. World Health Organization ISBN: 978-92-9021-405-2.
42. Terwogt, J.M.M., Nuijen, B., Huinink , T., Beijnen, J. H., 1997. Alternative
Formulation of Paclitaxel. Cancer Treatment Reviews 23, 87-95.
43. Singla, A., K., Garg, A., Aggarwal, D. 2001. Paclitaxel and Its Formulatins.
International Journal of Pharmaceutics 235, 179-192.
44. Panchagnula, R. 1998. Pharmaceutical Aspects of Paclitaxel. . International
Journal of Pharmaceutics 172, 1-15.
45. Gürkaynak,
O.
2006.
Paklitakselin
Siklodekstrin
Bazlı
Sistemlerle
Formülasyon Geliştirme Ve Değerlendirilmesi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık
Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi
46. Adams, J. D., Flora, K., Goldspiel, B. R., Wilson, J. W., Finley, R., 1993.
Taxol:a History of Pharmaceutical Development and Current Pharmaceutical
Concerns, J. Nat. Cancer Inst. Monogr., 15, 141-147
47. Lee, W. L., Shiau, J.Y., Shyur, L. F. 2012. Taxol, Camptothecin and Beyond
for Cancer Therapy. Advances in Botanical Research, 62.
48. Erdemoğlu N., Şener, B. 2000. Taksan Sınıfı Bileşiklerin Antitümör Etkileri.
Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi 29 (1) 77-90.
49. Campbell, N., Reece, J., 2006. Biyoloji. Palme Yayınları ISBN: 975-8982-850 s. 127-130
50. Akhmanova, A., Steinmetz, O. 2008. Microtubule Structure and Dynamic
Instability. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 309-322.
104
51. Horwitz, S. B. 1994. Taxol (Paclitaxel): Mechanism of Action. Annals of
Oncology : Official Journal of the European Society for Medical Oncology /
ESMO 5, 6:S3-6
52. Belotti, D., Vergani, V., Drudis, T. 1996. The Microtubule-Affecting Drug
Paclitaxel Has Antiangiogenic Activity. Clin cancer Res 2: 1843:1849.
53. Mastropaolo, D., Camerman, A., Luo, Y., Brayer,G.D., Camermantt, N. 1995.
Crystal and molecular structure of paclitaxel (taxol). Proc Natl Acad Sci 92,
pp. 6920-6924
54. Soy, N. 2006. Doku Kültüründe Paklitaksel’in Apoptotik ve Antiproliferatif
Etkileri. İatanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi. s.
18-22.
55. Blagosklonny, M., Fojo, T. 1999. Moleculer Effects of Paclitaxel: Myths and
Reality. Int J Cancer: 83, 151-156
56. Gelderblom, H., Verweij, J., Nooter, K., Sparreboom, A. 2001. Cremophor
EL: The Drawbacks And Advantages Of Vehicle Selection For Drug
Formulation. Eur J Cancer. 37(13): 1590-8
57. Dorr, R. T., 1994. Pharmacology and Toxicology of Cremophor EL Diluent.
Ann. Pharmacother. 28, 511-514.
58. Pfeifer, R.W., Hale, K.N., 1993. Precipitation of Paclitaxel During Infusion by
Pump. Am. J. Hosp. Pharm. 50, 2518–2521.
59.
Song, D., Hsu, L.F., Au, J.L.S., 1996. Binding of Taxol to Plastic Glass
Containers and Protein Under in vitro Conditions. J. Pharm. Sci. 85, 29–31.
105
60. Venkataraman, R., Hurckart, G.J., Ptachcinski, R.J., Bhahe, R., Logue, L.W.,
Bahnson, A., Gian, C., Brady, J.E., 1986. Leaching of Diethylhexaphathalate
from Polyvinylchloride Bags Into Intravenous Cyclosporin Solution. Am. J.
Hosp. Pharm. 43, 2800–2802.
61. Rowinsky, E., Donehower, C. 1995. Paclitaxel (Taxol). The New England
Journal of Medicine 332:15.
62. Dombernowsky, P., Gehl, J., Boesgaard, M., Paaske, T., Jensen, BV. 1996.
Doxorubicin and Paclitaxel, a Highly Active Combination in The Treatment of
Metastatic Breast Cancer. Semin Oncol. 23: 23-7.
63. Rowinsky, E.K., Eisenhauer, E.A., Chaudhry, V., Arbuck, S.G., Donehower,
R.C. 1993. Clinical Toxicities Encountered with Paclitaxel (Taxol). Seminars
in Oncology 20:1-15
64. Tamura, T., Sasaki, Y., Nishiwaki, Y., Saijo, N., 1995. Phase I Study of
Paclitaxel by Three Hour Infusion: Hypotension Just After Infusion Is One of
The Major Dose Limiting Toxicities. Jpn. J. Cancer Res. 12, 1203–1209.
65. Boylan, J.C., 1987. Liquids. In: Lachman, L., Lieberman, H.A., Kanig, J.L.
(Eds.), The Theory and Practice of Industrial Pharmacy. Varghese Publishing
House, Bombay, pp. 460–461
66. Tarr, B.D., Yalkowsky, S.H., 1987. A New Parenteral Vehicle for The
Administration of Some Poorly Soluble Anti-Cancer Drugs. J. Parentral Sci.
Technol. 41, 31.
67. Adams, J. D., Flora, K. P., Goldspiel, B. R. 1993. Taxol: A History of
Pharmaceutical Development and Current Pharmaceutical Concerns. J. Natl.
Cancer lnst. 15: 141-147.
68. Mellado, W., Magri, N. F., Kingston, D. G. I. et al. 1984. Preparation and
Biological of Taxol Acetates. Biochem. Siophys. Res. Corn. 124: 329-336.
106
69. Skwarczynskia, M., Noguchia, M., Hirotab, S., Sohmaa, Y., Kimuraa, T.
2006. Development of First Photoresponsive Prodrug of Paclitaxel.
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 16:17, pp 4492–4496.
70. Vyas, D. M. (1995) Paclitaxel (Taxol) Formulation and Prodrugs. In: Farina,
V. ed., The Chemistry and Pharmacology of Taxol and ıts Derivatives.
Amsterdam: Elsevier Science SK pp. 103-130.
71. Surapaneni, M.S., Das, S.K., Das, N. G. 2012. Designing Paclitaxel Drug
Delivery Systems Aimed at Improved Patient Outcomes: Current Status and
Challenges. ISRN Pharmacology, 15.
72. Sharma, A., Mayhew, E. & Straubinger, R. M. 1993. Antitumour Effect of
Taxol-containing Liposomes in a Taxol-Resistant Murine Tumor Model.
Cancer Res. 53: 5877-5881.
73. Straubinger, R. M., Sharma, A., Murray, M. 1993. Novel Taxol Formulations:
Taxol Containing Liposomes. J. Nat. Cancer Inst. Mon. 15: 69-78.
74. Yokoyama, M., Miyauchi, M., Yamada, N., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka,
K., Inoue, S., 1990. Characterization and Anticancer Activity of The MicelleForming
Polymeric
Anticancer
Drug
Adriamycin
Conjugated
Poly
(ethyleneglycol)-Poly (aspartic acid) Block Copolymer. Cancer Res. 50,
1693–1700.
75. Miele, E., Spinelli, G., Miele, E., Tomao, F., Tomao, S. 2009. Albumin-bound
Forulation of Paclitaxel (Abraxane®ABI-007) in The Treatment of Breast
Cancer. International Journel of Nanomedicine.,4, 99-104.
76. Kragh, H.U. 1990. Structure and Ligand Binding Properties of Human Serum
Albumin. Danish Medical Bulletin 37(1):57-84.
107
77. Sudlow, G., Birkett D.J., Wade, D. N., 1976, Further Characterization of
Specific Drug Binding Sites on Human Serum Albumin. Molecular
Pharmacology November. 12: 6, 1052-1061.
78. Paál, K., Müller, J., Hegedûs L., 2001. High Affinity Binding Of Paclitaxel To
Human Serum Albumin. 268:7, 2187-2191.
79. Cserhati, T., Forgacs, E., Hollo, J., 1995. Interaction of Taxol and Other
Anticancer Drugs With alpha-cyclodextrin. J.Pharm. Biomed. Anal. 13, 533–
541.
80. Hirayama, F., Uekama, K. 1999. Cyclodextrin-based Controlled Drug
Release System. Advanced Drug Delivery Reviews 36:125–141
81. Kumar, M.N.V.R. 2008. Cyclodextrin Nanoparticle for Drug Delivery.
Handbook of Particulate Drug Delivery. American Scientific Publishers.
187-204.
82.
Knoerr, A.L.L., Gref, R., Couvreur, P. 2010. Cyclodextrins for Drug Delivery.
Journal of Drug Targeting; 18(9): 645-656.
83. Bilensoy, E. 2011. Cyclodextrins in Pharmaceutics, Cosmetics, and
Biomedicine: Current and Future Industrial Applications. New Jersey, ABD.s.
3-6, 159-164.
84. Loftsoon, T., Duchene, D., 2007. Cyclodextrin and Their Pharmaceutical
Applications. International Journal of Pharmaceutics 329:1-11.
85. Szejtli, J. 2004. Past, Present, and Future of Cyclodextrin Research. Pure
Appl. Chem., Vol. 76:10. pp. 1825–1845.
86. Szejtli, J. 1998. Introduction and General Overview of Cyclodextrin
Chemistry. Chem. Rev. 98. pp. 1743-1753.
108
87. Cserhati, T., Forgacs, E. 2003. Cyclodextrin in Chromatography. The Royal
Society of Chemistry. ISBN: 0-85404-540-6, Cambridge.
88. Valle, E. M. M., 2004. Cyclodextrins and Their Uses: A Review. Process
Biochemistry 39: 1033-1046.
89. Bilensoy, E., Hıncal, A.A., 2008. Cyclodextrin-Based Nanomaterials in
Pharmaceutical Field. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production
and Process. Gad. S. C. (ed). Wiley-Interscience. USA. 1225-1247.
90. Duchene,
D.,
Wouessidjewe,
D.,
1990.
Pharmaceutical
Uses
of
Cyclodextrins and Derivatives. Drug Development and Industrial Pharmacy.
16(17) :2487-2499
91. Loftsson, T., Brewster, M. E., 1996. Pharmaceutical Application of
Cyclodextrins.
1.
Drug
Solubilization
and
Stabilization.
Journel
of
pharmaceutical Sciences. 85:10
92. Duchene, D., Ponchel, G., Wouessidjewe, D. 1999. Cyclodextrin in Targeting
Application to Nanoparticles. Advanced Drug Delivery. 36: 29-40
93. Sallas, F., Darcy, R. 2008. Amphiphilic Cyclodextrins – Advances in
Synthesis and Supramolecular Chemistry. Eur. J. Org. Chem. 957–969.
94. Pun, S., Bellocq, N., Liu, A., Jensen, G., Machemer, T., Quijano, E., Davis,
M. E. 2004. Cyclodextrin-Modified Polyethylenimine Polymers for Gene
Delivery. Bioconjugate Chem. 15, 831-840.
95. Moscoso, A., Gourrierec, M., Garcia, G., Benito,M.J., Balbuena, P.,
Caballero,F., Guilloteau, N., Giorgio, C., Vierling,P., Defaye, J., Mellet, C.O.,
Fernandez, J. 2009. Polycationic Amphiphilic Cyclodextrins for Gene
Delivery: Synthesis and Effect of Structural Modifications on Plasmid DNA
Complex Stability,Cytotoxicity, and Gene Expression. Chem. Eur. J.15,
12871 – 12888.
109
96. Moscoso ,A., Balbuena, P., Garcia, M., Mellet, C.O., Benito, J., Fernandez,
G. 2008. Rational Design of Cationic Cyclooligosaccharides as Efficient
Gene Delivery Systems, Chem.,Commun.,2001-2003.
97. Dubes, A., Bouchu, D., Lamartine, R., Parrot-Lopez, H.2001. An Efficient
Regio-Specific Synthetic Route to Multiply Substituted Acyl-Sulphated βCyclodextrins, Tetrahedron Lett., 42, 9147-9151.
98. Loftsson,
T.,
Brewster,
M.
2010.
Pharmaceutical
Applications
of
Cyclodextrins: Basic Science and Product Development. Journal of
Pharmacy and Pharmacology. 62: 1607–1621
99. Uehata, K., Anno, T., Hayashida, K.,Motoyama, K., Arima,H. 2011. Effects of
Selected Anionic β-Cyclodextrins on Persistence of Blood Glucose Lowering
by Insulin Glargine After Subcutaneous Injection to Rats. Journal of Drug
Delivery.195146, s 9.
100. Tiwari, G., Tiwari, R., Rai, A. 2010. Cyclodextrin in Delivery Systems:
Applications. J Oharm Bioallied Sci. 2(2): 72-79.
101. Rajewski,
R.A.,
Stella,
V.J.
1996.
Pharmaceutical
applications
of
cyclodextrins. 2. In vivo drug delivery. J Pharm Sci;85: 1142–68.
102. Lantz, A.W., Rodriguez, M.A., Wetterer, S.M., Armstrong, D.W. 2006.
Estimation of Association Constants Between Oral Malodor Components and
Various Native and Derivatized Cyclodextrins. Anal Chim Acta, 557, 184–
190.
103. Tokumura, T., Muraoka, A., Machida, Y. 2009. Improvement of Oral
Bioavailability of Flurbiprofen From Flurbiprofen/beta-cyclodextrin Inclusion
Complex by Action of Cinnarizine. Arch Pharm Res, 32,155–156.
110
104. Patel, S.G., Rajput, S.J. 2009. Enhancement of Oral Biavailability of
Cilostazol by Forming Its Inclusion Complexes. Eur J Pharm Biopharm, 73,
202–20.
105. Sathigari, S., Chadha, G., Lee, Y.H. 2009. Physicochemical Characterization
of Efavirenz-Cyclodextrin Inclusion Complexes. AAPS PharmSciTech, 10,
81–87.
106. Agüeros, M., Ruiz-Gatón, L., Vauthier, C. 2009. Combined Hydroxypropylbeta-Cyclodextrin and Poly(anhydride) Nanoparticles Improve The Oral
Permeability of Paclitaxel. Eur J Pharm Sci, 38,405–413.
107. Agüeros, M., Zabaleta, V., Espuelas, S., Campanero, M.A., Irache, J.M.
2010. Increased Oral Bioavailability of Paclitaxel by Its Encapsulation
Through
Complex
Formation
With
Cyclodextrins
in
Poly(anhydride)
Nanoparticles.145-1:2-8.
108. Hea,D., Denga,P., Yangb, L., Tanc, Q., Liua, J., Yanga, M., Zhanga, J. 2012.
Molecular Encapsulation of Rifampicin As An Inclusion Complex of
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin:
Design;
Characterization
And
in
vitro
Dissolution. 103: 580-585.
109. Phillip, Y.H., Sathigari, S., Jean Lin, Y.J. 2009. Gefitinib Cyclodextrin
Inclusion Complexes: Physico-Chemical Characterization and Dissolution
Studies. Drug Dev Ind Pharm, 35,1113–1120.,
110. Wu, J., Shen, Q., Fang, L. 2012. Sulfobutylether-β-Cyclodextrin/Chitosan
Nanoparticles Enhance The Oral Permeability and Bioavailability of
Docetaxel.
111. Mazzaferro, S., Bouchemal, K., Skanji, R., Gueutin, C., Chacun, H., Ponchel,
G. 2012. Intestinal Permeation Enhancement of Docetaxel Encapsulated into
Methyl-β-cyclodextrin/poly(isobutylcyanoacrylate) Nanoparticles Coated With
Thiolated Chitosan. Journal of Controlled Release 162 :568–574
111
112. Masahiko, K., Fumitoshi, H., Kaneto, U. 1987. Improvement of Oral and
Rectal
Bioavailabilities
of
Carmofur
by
Methylated
β-cyclodextrin
Complexations. International Journal of Pharmaceutics. 38, 1–3: 191–198
113. Pathak, S. M., Musmade, P., Dengle, S., Karthik, A., Bhat, K., Udupa, N.
2010.
Enhanced
Oral
Absorption
of
Saquinavir
With
Methyl-Beta-
Cyclodextrin—Preparation and in vitro and in vivo Evaluation. European
Journal of Pharmaceutical Sciences 41, 3–4: 440–451
114. Koizumi, K., Okada, Y., Kubota, Y., Utamuta, T. 1987. Inclusion Complexes
of Poorly Water-Soluble Drugs With Glucosyl-Cyclodextrins. Chem Pharm
Bull, 35, 3416.
115. Lang, J.C. 1995. Ocular Drug Delivery Conventional Ocular Formulations.
Adv Drug Deliv Rev, 16, 39–43.
116. Loftsson, T., Järvinen, T. 1999. Cyclodextrins in Ophthalmic Drug Delivery.
Adv Drug Deliv Rev, 36, 59–79.
117. Loftsson, T., Stefánsson, E. 2002. Cyclodextrins in Eye Drop Formulations:
Enhanced Topical Delivery of Corticosteroids To The Eye. Acta Ophthalmol
Scand, 80, 144–150.
118. Palma, S.D., Tartara, L.I., Quinteros, D., Allemandi, D.A., Longhi, M.R.,
Granero, G.E. 2009. An Efficient Ternary Complex of Acetazolamide with
HP-ss-CD and TEA for Topical Ocular Administration. J Control Release,
138, 24–31.
119. Matsuda, H., Arima, H. 1999. Cyclodextrins in Transdermal and Rectal
Delivery. Adv Drug Deliv Rev, 36, 81–99.
120. Uekama, K., Hirayama F., Irie T. 1998. Cyclodextrin Drug Carrier Systems.
Chem. Rev. 1998, 98, 2045-2076
112
121. Watanabe, Y., Matsumoto, Y., Seki, M., Takase, M., Matsumoto, M. 1992.
Absorption Enhancement of Polypeptide Drugs by Cyclodextrins. I.
Enhanced Rectal Absorption of Insulin from Hollow-Type Suppositories
Containing Insulin and Cyclodextrins in Rabbits. Chemical & Pharmaceutical
Bulletin 40(11):3042-3047.
122. Uekama, K., Kondo, T., Nakamura, K., Irie, T., Arakawa, K., Shibuya, M.,
Tanaka, J. 2006. Modification of Rectal Absorption of Morphine From Followtype Suppositories with a Combination of α-cyclodextrin and ViscosityEnhancing Polysaccharide. Journal of Pharmaceutical Sciences. 84,1:15–20.
123. Alexanian, C., Papademou, H., Vertzoni, M., Archontaki, H., Valsami, G.
2008. Effect of pH and Water-Soluble Polymers on The Aqueous Solubility of
Nimesulide in the Absence and Presence of Betacyclodextrin Derivatives. J
Pharm Pharmacol, 60, 1433–1439.
124. Matsudaa, H., Arimab, H. 1999. Cyclodextrins in Transdermal and Rectal
Delivery. Advenced Drug Delivery Reviews. 36: 81-99.
125. Brewster, M.,E., Loftsson, T. 2007. Cyclodextrins as Pharmaceutical
Solubilizers. Advanced Drug Delivery Reviews. 59: 645-666.
126. Roco, M.C. 2007. National Nanotechnology Initiative- Past, Present, Future.
Handbook of Nanoscience, Engineering and Technology.1-34.
127. EPA, United States Environmental Protection Agency. Nanotechnology.
http://epa.gov/ncer/nano/questions/index.html
128. Jain, K.K. 2010. Advances in The Field of Nanooncology. Jain BMC
Medicine. 8:83
129. Sattler, K.D. 2011. Handbook of Nanophysics, Nanomedicine and
Nanorobotics. CRC Press, USA
113
130. Peer, D., Karp, M.J., Hong, S., Farokhzad, O., Margalit, R., Langer, R. 2007.
Nanocarriers as an Emerging Platform for Cancer Therapy. Nature
Nanotechnology. 2. 751 - 760
131. Rastogi, A. 2011. Nanooncology: The Breast Cancer Story. UTMJ. 88:3
132. Martin, F.J., Melnik, K., West, T. J., Cohen, M. S. et al. 2005. Acute Toxicity
of Intravenously Administered Microfabricated Silicon Dioxide Drug Delivery
Particles in Mice: Preliminary Findings Drugs. 6, 71–81
133.
Sharifi-Salamatian,
V.,
Pesquet-Popescu,
B.,
Simony-Lafontaine,J.,
Rigaut,J.P.2004. Index For Spatial Heterogeneity in Breast Cancer J.
Microsc. 216, 110–122
134. Marusyk, A., Polyak, K. 2010. Tumor Heterogeneity: Causes and
Consequences. Biochim Biophys Acta. 1805(1): 105.
135. Nathanson, S.D., Nelson, L. 1994. Interstitial Fluid Pressure in Breast
Cancer, Benign Breast Conditions, and Breast Parenchyma Ann. Surg.
Oncol.1, 333–338.
136. Parveen, S., Misra, R., Sahoo, S.,K. 2012. Nanoparticles: a Boon to Drug
Delivery,
Therapeutics,
Diagnostics
and
Imaging.
Nanomedicine:
Nanotechnology, Biology, and Medicine. 8: 147–166
137. Nie, S., Xing, Y., Kim, G.J., Simons, J.W. 2007. Nanotechnology Applications
in Cancer. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9:257-288.
138. Portney, N., Özkan, M. 2006. Nano-oncology: Drug Delivery, Imaging and
Sensing. Anal Bioanal Chem. 384: 620–630.
139. Singh, R., Lillard, J.,W. 2009. Nanoparticle- based Targeted Drug Delivery.
Experimental and Molecular Pathology. 86 :215–223
140.
Parboosing,
R.,
Maguire,
M.,
Govender,
P.,
Kruger,
H.G.
2012.
Nanotechnology and the Treatment of HIV Infection. Viruses. 4, 488-520
141. Cho, K., Wang, X., Nie, S. 2008. Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery
in Cancer. Clin Cancer Res. 14:1310-1316.
114
142. Heath, J., Davis, M. E. 2008. Nanotechnology and Cancer. Annu. Rev.
Med.59:251-265
143. Peppas, L.B., Blanchette, J. 2004. Nanoparticle and Targeted Systems for
Cancer Therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 56: 1649– 1659.
144. Maeda, H. 2001.The Enhanced Permeability and Retention ( E P R ) Effect in
Tumor Vasculature: The Key Role Of Tumor-Selective Macromolecular Drug
Targeting. Advan. Enzyme Regul. 41: 189–207.
145. Prakash, S. , Malhotra, M., Shao, W., Tomaro-Duchesneau, C., Abbasi, S.
2011. Polymeric Nanohybrids and Functionalized Carbon Nanotubes as Drug
Delivery Carriers for Cancer Therapy. Advanced Drug Delivery Reviews.
63:14–15, 1340–1351.
146. Mora-Huertasa, C.E., Fessi, H., Elaissari, A. 2010. Polymer-based
Nanocapsules for Drug Delivery. International Journal of Pharmaceutics
385:113–142
147. Letchford, K., Burt, H. 2007. A Review of The Formation and Classification of
Amphiphilic
Block
Copolymer
Nanoparticulate
Structures:
Micelles,
Nanospheres, Nanocapsules And Polymersomes. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65: 259–269.
148. Guterres, S. S., Alves, M.P., Pohlmann, A.R. 2007. Polymeric Nanoparticles,
Nanospheres and Nanocapsules, for Cutaneous Applications. Drug Target
Insights. 2 :147–157.
149. Elaissari, A.
2005. Colloidal Biomolecules, Bomaterials and Biomedical
Applications. Mercel Dekker, İsviçre.
150. Lassalle, V., Ferreira, M. L. 2007. PLA Nano- and Microparticles for Drug
Delivery: An Overview of the Methods of Preparation. Macromol. Biosci.
7: 767–783
151. Gürsoy, A.Z. 2002. Kontrollü Salım Sistemleri. Kontrollü Salım Sistemleri
Derneği Yayını. 975-97725-0-7. İstanbul 65-86 s.71.
115
152. Memisoglu, E., Bochot, A., S¸ en, M., Charon, D., Duchene, D., Hıncal, A.A.,
2002. Amphiphilic β-cyclodextrins Modified on The Primary Face: Synthesis,
Characterization and Evaluation of Their Potential as Novel Excipients in The
Preparation of Nanocapsules. J. Pharm. Sci. 91 (5), 1214–1224.
153. Caballero, F., Mellet, C.O., Gourrierec, L., Guilloteau, N., Giorgio, C.,
Fernandez, G. 2008. Tailoring β-cyclodextrin for DNA Complexation and
Delivery by Homogeneous Functionalization at the Secondary Face, Org.
Lett. 10: 22.
154. Moscoso, A., Balbuena, P., Garcia, M., Mellet, C.O., Benito, J., Fernandez,
G. 2008.Rational Design of Cationic Cyclooligosaccharides as Efficient Gene
Delivery Systems, Chem.,Commun.,2001-2003.
155. Bilensoy, E., Gürkaynak, O., Doğan, A.L., Hıncal, A.A. 2008. Safety and
Efficacy of Amphiphilic β-cyclodextrin Nanoparticles for Paclitaxel Delivery.
International Journal of Pharmaceutics 347: 163–170.
156. Bilensoy, E., Gürkaynak, O., Ertan, M., Şen, M., Hıncal, A.A. 2007.
Development of Nonsurfactant Cyclodextrin Nanoparticles Loaded With
Anticancer Drug Paclitaxel. Journal of Pharmaceutıcal Scıences. 97:4.
157. İnal, B. B., Topkaya, Ç. 2010. Klinik Biyokimya Labotaruvarlarında
Akreditasyona Geçiş. İstanbul Tıp Dergisi.74-76.
158. Ertaş, Ö. S., Kayalı, A. 2005. Analitik Yöntem Geçerliliğine Genel Bir Bakış.
Ankara Ecz. Fak. Derg. J. Fac. Pharm, Ankara. 34 (1) 41 – 57
159. Sallas, F., Darcy, R. 2008. Amphiphilic Cyclodextrins – Advances in
Synthesis and Supramolecular Chemistry. Eur. J. Org. Chem. 957–969.
160. Peroche, S., Parrot-Lopez, H. 2003. Novel Fluorinated Amphiphilic
Cyclodextrin Derivatives: Synthesis of mono-, di- and heptakis- (6-deoxy-6perfluoroalkylthio)-β-Cyclodextrins. Tetrahedron Letters 44. 241-245.
116
161. Dubes, A., Degobert, G., Fessi, H., Parrot-Lopez, H. 2003. Synthesis and
Characterisation of Sulfated Amphiphilic α-, β- and γ-cyclodextrins:
Application to The Complexation of Acyclovir. Carbonhydrate Research 338.
2185-2193.
162. Kumar, M.N.V.R. 2000. A Review of Chitin and Chitosan Applications.
Reactive & Functional Polymers 46. 1–27.
163. Calvo, P., Vila-Jato, J.L., Alonso. 1997. Evaluation of Cationic PolymerCoated Nanocapsules as Ocular Drug Carriers. International Journal of
Pharmaceutics 153. 41-50.
164. Kafil, V., Omidi, Y. 2011. Cytotoxic Impacts of Linear and Branched
Polyethylenimine Nanostructures in A431 Cells. BioImpacts 1(1), 23-30.
165.Isaksson, K., Åkerberg, D., Said, K., Tingstedt, B. 2011. Cationic Polypeptides
in a Concept of Oppositely Charged Polypeptides as Prevention of
Postsurgical
Intraabdominal
Adhesions.
J.
Biomedical
Science
and
Engineering, 4, 200-206.
166. Florea, B., Meaney, C., Junginger, H.,Borchard, G. 2002. Transfection
Efficiency and Toxicity of Polyethylenimine in Differentiated Calu-3 and
Nondifferentiated COS-1 Cell Cultures. AAPS PharmSci. 4 (3) :12.
167. Agnihotri, S.A., Mallikarjuna, N.N., Aminabhavi, T.M., 2004, Recent Advances
on Chitosan-based Micro- and Nanoparticles in Drug Delivery, Journal of
Controlled Release, 100, 5 -28.
168. Seferian, P.G., Martinez, M.L., 2000, Immune Stimulating Activity of Two New
Chitosan Containing Adjuvant Formulations. Vaccine, 19 (6), 661-668.
169. Duchene,D., Wouessidjewe, D., Ponchel, G. 1999. Cyclodextrins and Carrier
Systems. Journal of Controlled Release 62. 263–268.
170. Wouessidjewe, D., Skiba, M., Leroy-Lechat, F., Lemos-Senna, E., Puisieux,
F., Duchene, D. 1996. A New Concept in Drug Delivery Based on SkirtShaped Cyclodextrin Aggregates: Present State and Future Prospects,
S.T.P. Pharma Sci., 6, 21-28.
117
171.Memişoğlu, E., Bochot, A., Şen, M., Duchêne, D., Hıncal, A.A. 2003.
Nonsurfactant Nanospheres of Progesterone Inclusion Complexes With
Amphiphilic β-cyclodextrins, Int. J. Pharm., 251. 143-153.
172. Memişoğlu-Bilensoy, E., Vural, İmran, Bochot, A., Renoir, J. M., Dominique,
D., Hıncal, A. A. 2005. Tamoxifen Citrate Loaded Amphiphilic β- cyclodextrin
Nanoparticles: In vitro Characterization and Cytotoxicity, J.Controlled
Release, 104, 489-496.
173. Xu, R. 2008. Progress in Nanoparticles Characterization: Sizing and Zeta
Potential Measurement. Particuology 6. 112–115.
174. Rinaudo, M. 2006. Chitin and Chitosan: Properties and Applications.
Progress in Polymer Science. 31-7: 603-632.
175. Muller, R.H., Jacobs, C.,Kayser, O. (2001) Nanosuspensions as Particulate
Drug Formulations in therapy. Rationale for development and what we can
expect for the future. Advanced Drug Delivery Reviews, 47 (1), 3-19.
176. Shabir, G.A. 2003. Validation of High-Performance Liquid Chromatography
Methods for Pharmaceutical Analysis. Understanding the Differences and
Similarities Between Validation Requirements of The US Food and Drug
Administration, The US Pharmacopeia and The International Conference on
Harmonization. Journal of Chromatography. A, 987 (1-2), 57-66.
177. Lemos-Senna, E., Wouessidjewe, D., Lesieur, S., Duchêne, D.1998.
Preparation
of
Amphiphilic
Cyclodextrin
Nanospheres
Using
The
Emulsification Solvent Evaporation Method: Influence of The Surfactant on
Preparation and Hydrophobic Drug Loading, Int. J. Pharm., 170, 119-128.
178. Singh, R., Lillard, J.W., Jr. 2009. Nanoparticle-Based Targeted Drug Delivery.
Experimental and Molecular Pathology, 86:3, 215-223.
179. Fonseca, C., Simões, S., Gaspar, R. 2002. Paclitaxel-loaded PLGA
Nanoparticles: Preparation, Physicochemical Characterization and in vitro
Anti-Tumoral Activity, J. Controlled Release, 83, 273-28.
118
180. Dong, Y., Feng, S. S. 2004. Methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactide)
(MPEG-PLA) Nanoparticles for Controlled Delivery of Anticancer Drugs,
Biomaterials, 25, 2843-2849.
181. Yang, T., Cui, F., Choi, M., Choc, J., Chungb, J., Shimb, C., Kimb, D. 2007.
Enhanced Solubility and Stability of PEGylated Liposomal Paclitaxel: In vitro
and in vivo Evaluation. International Journal of Pharmaceutics 338: 317–326.
182. Chorny, M., Fishbein, I., Danenberg, H., Golomb, G. 2002. Lipophilic Drug
Loaded Nanospheres Prepared by Nanoprecipitation: Effect of Formulation
Variables on Size, Drug Recovery and Release Kinetics. Journal of
Controlled Release. 83-3:389–400.
183. Prasitsilp, M., Jenwıthısuk, R., Kongsuwan, K., Damrongchai, N. 2000.
Cellular Responses to Chitosan in vitro: The Importance of Deacetylation.
Journel of Material Science: Materials in Medicine. 11: 773-778.
184. Tangsadthakun, C., Kanokpanont, S., Sanchavanakıt, N., Banaprasert, T.,
Damrongsakkul, S. 2006. Properties of Collagen/Chitosan Scaffolds for Skin
Tissue Engineering. Journal of Metals, Materials and Minerals. 16-1: 37-44.
185. Zhang, Y., Yang,M., Portney, N.G., Cui, D., Budak, G., Ozbay, E., Ozkan,
M., Ozkan, C. 2008. Zeta potential: A Surface Electrical Characteristic to
Probe The Interaction of Nanoparticles with Normal and Cancer Human
Breast Epithelial Cells. Biomed Microdevices 10: 321–328.
186. Grosse, P.Y., Bressolle, F., Rouanet, P., Joulia, M., Pinguet, F. 1999. Methylβ-Cyclodextrin
and
Doxorubicin
Pharmacokinetics
and
Tissue
Concentrations Following Bolus Injection of These Drugs Alone or Together
in the Rabbit. International Journal of Pharmaceutics 180: 215–223.
119
EKLER
120
EK-1: Poster Tebliğleri
121
122
123
124
125
126
127
128
129
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı
:
Gamze Işık
Doğum Yeri :
Ankara
Doğum Yılı :
1987
Medeni Hali :
Bekâr
Eğitim ve Akademik Durumu
Lise : 2001-2005
Başkent Y.D.A. Liaesi
Lisans 2005-2010 Hacettepe Üniversitesi Biyoloji Bölümü
Yabancı Dil: İngilizce
130