PowerPoint Sunusu - Erzurum Teknik Üniversitesi

BÖLÜM 7
REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE
MOLEKÜLER KLONLAMA
1
Rekombinant DNA Teknolojisi ve Moleküler
Klonlama
1972-1975 yılları arasında lamda fajı üzerinde yapılan çalışmaların sonuçları
Rekombinant DNA teknolojisi başlığı altında birleştirilmiştir.
Değişik orjinlerden gelen iki DNA’ nın birleştirilmesiyle Rekombinant DNA
oluşur. Krossing over gibi genetik işlemlerde Rekombinat DNA ‘yı meydana
getirmesine rağmen bu tabir genel olarak iki farklı kaynaktan gelen DNA
moleküllerin birleştirilmesinde kullanılır.
Lambda fajı
1962 yılında Allan Campbell, bakteriyofaj λ ‘ nın liner olan genomunun
konak bakteri hücresine girdiğİnde dairesel hale geldiğini belirtmiştir.
Daha sonra ise kırılma ve yeniden ekleme olayı ile faj DNA konak
kromozomuna entegre olmaktadır.
2
Daha sonraki ileri düzeydeki çalışmalar gösterdiki lambda fajının liner genomunun her
iki ucunda kısa ve tek zincirli DNA bölgelerinin bulunduğunun ve bu bölgelerin baz
dizilerinin komplementer olduğunu göstermişitr. Tek zincirli olan bu bölgeler yapışkan (
cos ) bölgeler olarak adlandırılır.
Bu bölgeler komplementer baz eşleşmesi yapması liner faj genomunu konak
bakteride dairesel hale gelmesini sağlar.
Lizogenik replikasyon fazında faj DNA ‘ sı Att bölgelerinden konak genomuna
yerleşmekte ve Konak DNA nın bir parçası gibi replike olmaktadır. Konak
hücrenin mutajenik kimyasallara yada UV radyasyonuna maruz kalması gibi
belirili koşullar altında ise bu rekombinasyon olayının tersi gerçekleşmekte ve
faj DNA sı konak genomundan kesilerek çıkarılması esnasında enderde olsa
farklı bölgelerden gerçekleşen kesimler lamda fajının bakteriyel genleri
almasını sağlar. Yaşam döngüsünün Litik fazında ise lamda fajları hücreyi
parçalayıp ortama salınır.
Restriksiyon ve modifikasyon :
1962 yılında Werner Arber ve arkadaşları restriksiyon ve modifikasyonun
moleküler esasını ortaya koymuştur.
Arber ve arkadaşlarının yayınladığı makale de bir bakteri suşundan bir enzimin 3
ayrıştırılmasını ve enzimin viral DNA’yı, özgül nükleotit dizilerinden kesmek için
kullanıldığını tanımlar. Bu moleküllere de Restriksiyon endonükleazlar kısaca
restriksiyon enzimleri denir.
Böylece bu enzimlerin istilacı nükleik asitleri parçalayarak viral enfeksiyonu
sınırladıkları ve engelledikleri sonucu ortaya çıkmışıtır
Modifikasyon sistemi ; Arber ve arkadaşları modifikasyonun DNA üzerinde
bulunan ve rektriksiyon endonüklazlarının saldırısına duyarlı olan bölgelere metil
grubu eklenmesinden ibaret olduğunu göstermeyi başarmışlardır. E coli de
adenin metilasyonundan ziyade sitozin metilasyonu daha yaygındır. Metilleme
metilazlar tarafından yapılır. Yani metillenen zincir RE ler tarafından kırılmazken
metillenmemiş zincir kırılır.
4
Restriksiyon endonükleazların keşifi üzerine Herbert Boyer , Paul Berg ve
arkadaşları 1970 lerde Rekombinant DNA teknolojisinin çağını başlatmışlardır.
DNA ‘nın Kesilmesi Ve Eklenmesi
DNA izolasyonu ve Rekombinant DNA yapımında iki ana enzim oldukça önemli
rol oynarlar. Bu enzimler restriksiyon endonükleazlar ve DNA ligazlardır.
Restriksiyon endonükleazlar, çift zincirli DNA molekülü üzerinde oldukça kısa
ve özgül olan baz dizilerini tanırlar ve enzimin tipine bağlı olarak DNA yı
restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan bölgelerden kırarlar .
DNA ligazlar ise fosfodiester bağları oluşturarak iki DNA parçasını birbirine
ekler.
5
Restriksiyon endonüklezların ana sınıfları
Restriksiyon endonükleazların 3 büyük ana sınıfı vardır. Bu sınıflandırma
yapılırken tanıdıkları dizilerin türü, DNA’ yı kesme biçimleri ve Enzimlerin yapısı
dikkate alınır.
Tip I ve Tip III restriksiyon endonükleazlar DNA’ yı tanıdıkları bölgelerin dışından da
kesmeleri ve bunun sonucu tesadüfü kesme motifleri oluşturduklarından dolayı gen
klonlama çalışmaları için kullanışlı değillerdir.
Bunun aksine tip II restriksiyon endonükleazlar özgül dizileri sadece bu dizilerden
kesim yaptıkları için haritalama ve in vitro DNA inşasında kullanılır.
İsimlendirmede önce enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi, daha sonra
bakteri türünün ilk iki harfi ve son olarak da soya ait bir harf ile ilk izolasyondan
başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası belirtilir.
EcoR I
E = genus Escherichia
co = species coli
R = strain RY 13
I = first RE to be isolated from this species
6
Tip II restriksiyon endonükleazlar homodimer oluşturan 2 özdeş polipeptit alt
birimden meydana gelir. bu homodimerler 4-8 bp meydana gelen kısa ve
simetrik DNA dizilerini tanırlar.
Moleküler biyoloji araştırmalarında Tip II endonükleazların en çok kullanılanı 6
baz çifti kesenlerdir. Genelikle bir zincirin 5’  3’ yönündeki dizi okunması ile
komplementer zincirin 5’  3’ dizi okuması aynıdır her iki yönden de aynı
okunan diziler palindrom olarak adlandırılır.
EcoRI gibi bazı enzimler asimetrik ( zigzaglı) kesim yaparlar. Asimetrik kesimin
oluşturdukarı tek zincirli komplementer uçlar ise hidrojen bağı ile
bağlanabildikleri için yapışkan yada kohesif uç oluşturular
SmaI gibi diğer Tip II enzimler ise DNA nın her iki zincirinide aynı pozizyondan
keser. Bunun sonucunda DNA ‘ nın kesilen uçlarında eşleşmemiş nükleotitler
bulunmadığından Küt Uç oluşumuna yol açar
7
8
Bir restriksiyon endonükleazın tanıma bölgesindeki bir baz çifitinin değişimi
Enzimatik aktivitenin tamamını ortadan kaldırmaktadır.
RE ‘ NİN DNA BAĞLANMASI
RE, özgül olmayan bir şekilde DNA ‘ YA bağlanır. Daha sonra DNA üzerinde
kayma denilen bir işlemle doğrusal bir şekilde ilerler. Özgül olmayan bağlanma
genellikle bazlarla etkileşimi içermez sadece DNA nın şeker fosfat omurgası ile
etkileşimi içerir. RE gevşek bağlanırlar ve bu enzimlerin katalitik merkezleri
fosfodiester omurgadan güvenli bir mesafede tutulur. Özgül olmayan bağlanma
ise hedef bölgeye ulaşım verimliliği için bir ön şarttır.
Kayma DNA oluğu boyunca 50 bp ‘ den daha kısa mesafelerde sarmal bir
hareketle gerçekleşmektedir.
Hedef restriksiyon bölgesinin belirlendiği tanıma işlemi, enzimin ve DNA ‘ NIN
Konformasyonunda değişikliğe neden olur. Bu değişiklik katalitik merkezin
aktivasyonuna yol açar ve ürün salınır.
9
ÖZET OLARAK :
Özgül olmayan bağlanma >>> kayma hareketiyle özgül bağlanma >>>
Konformasyon değişikliği >>> kataliz etkisi >>> ürün salınımı
10
11
SINIF
YAYGINLĞI
TANIMA
BÖLGESİ
İÇERİĞİ
Rekombi
nant
DNA Arş.
Kul.
Tip I
Tip II den
daha az
yaygın
Tanıma bölgesinin 1000
bp uzağında özgül
olmayan bölgelerden her
2 zinciri keser
Üç alt birmli ,
Bireysel tanıma,
endonükleaz ve
metilaz aktivetelerine
sahip
Kullanışlı
Değildir
Tip II
En yaygını
Özgül tanıma
bölgesinden her 2 zinciri
keser
Tek alt birimli
endonükleaz ve
metilaz aktiveteleri
ayrıdır
Kullanışlı
dır.
Tip III
Nadir
Tanıma bölgesinin 3’
ucunun yaklaşık 24-26
bp aşağısından
zincirlerden sadece birini
keser.
endonükleaz ve
metilaz aktiveteleri bir
alt birimi ortak olan 2
alt-birimli komplekstir.
Kullanışlı
Değildir
12
DNA Ligaz, lineer DNA parçalarını birleştirir. Bir DNA fragmentindeki bir
nükleotitin 5’ fosfat ucu ile ile diğer bir DNA fragmentinin 3’ hidroksi ucu
arasında fosfodiester bağlarının oluşumunu katalizler. Lineer DNA
fragmentlerinin bu şekilde kovalent bağlarla birbirine eklenmesi işlemine
ligasyon adı verilir.
DNA ligazlar kofaktör olarak ATP ye ihtiyaç duyarlar. Laboratuarlarda en yaygın
kullanılan DNA ligazın kaynağını bakteriyofaj T4 oluşturur.
Birbirine komplementer (tamamlayıcı) olan yapışkan uçlu DNA fragmentlerinin
ligasyonu kesik uçlu DNA fragmentlerinin ligasyonuna göre daha etkin şekilde
gerçekleştirilir. Bu yüzden verimliliği artırmak için araştırmacılar küt uçları
modifiye eden terminal deosinükleotidil transferaz kullanırlar. Örneğin DNA
fragmentlerine tek zincir Poli A kuyrugu eklenir ve Diğer bir kaynaktan elde
edilen DNA fragmentinede PoliT kuyruğu eklenirse komplementer olan bu
kuyruklar hidrojen bağı oluşturabilir. Daha sonra ise DNA ligazla muamele
edilerek kovalent olarak birbirine bağlanırlar.
13
MOLEKÜLER KLONLAMA
Moleküler klonlama bir seri basamaktan oluşur. Bu basamaklar :
1- RE’ ler kullanılarak klonlanacak DNA fragmenti üretilir
2-Üretilen fragment, vektör olarak işlev görecek diğer bir DNA molekülüne eklenir.
3- Rekombinant DNA molekülü konak bir hücreye transfer edilir. DNA replike
olarak düzinlerce özdeş kopya üretir. Konak hücreler çoğaldıkça rekombinant DNA
da yeni oluşan döllere geçer ve böylece klonlanmış dizileri taşıyan özdeş hücrelerin
meydana getirdiği bir populasyon oluşur.
4-Klonlanan DNA segmenti konak hücreden izole edilerek çeşitli yollarla analiz
edilebiir.
Vektör seçimi:
Klonlama vektörleri taşıyıcı DNA molekülleridir. Tüm klonlama vektörlerin sahip
olduğu dört önemli özellik vardır:
1- Kendilerini ve taşıdıkları yabancı DNA segmentleri bağımsız olarak replike
ederler.
2-Vektör üzerinde her birinden bir adet olan çeşitli sayıda restriksiyon
endonükleaz bölgeleri bulunur.
3- Genellikle konak hücrede bulunmayan markör ( seçilebilir belirteç ) taşırlar.
4- Vektörleri konak hücreden geri almak nispeten daha kolaydır.
14
Klasik kolanlama vektörleri plazmidtler, fajlar ve kozmidlerdir. Bunların
barındırabileceği insört boyutu sınırlıdır. Ve sırası ile 10, 20 ve 45 kb ‘ a
kadardır.
Yapay kromozomal vektörler ise bakteriyel yapay kromozomları (BAC) , maya
yapay kromozomları (YAC) ve memeli yapay kromozomları (MAC)
oluşturmaktadır.
Kozmidler; lambda fajının cos bölgesini taşıyan bir plazmittir. Fajlar gibi
konak bakteriyi enfekte ederler. Fakat plazmidler gibi replike olmakta ve
konağı lizize uğratmamaktadır.
Plazmid DNA; Plazmidler; bir replikasyon orjinine sahip, çift zincirli dairesel
yapıdaki ekstrakromozomal DNA molekülleridir. 1974 yılında pBR322 plazmit vektörü
ilk plazmidlerden birisi olarak kullanılmaya başlamıştır. İlk vektörler genellikle düşük
kopya sayısına sahiptirler. pUC 18 ise pBR322 türevi olup daha yüksek kopya sayılı
bir plazmidtir ve kopya sayısı 500 ‘ den fazladır.
Plazmidlerde özel bir antibiyotik geni ve MCS ( çoklu klonlama bölgesi )
bulunur MCS Bölgesinde restrksiyon enzimi için çok sayıda tanıma bölgesi
vardır. İnsört ( yabancı DNA molekülü) ile tanıma bölgesi aynı RE ile kesilir
ve ligasyon reaksiyonuyla vektöre eklenir.
15
16
Plazmid DNA ‘ nın bakteriyel bir konağa aktarımı :
Plazmid DNA ; transformasyon adı verilen bir prosedör ile bakteri hücresine
aktarılır.
Geleneksel yöntemde ise; bakteri hücresinin membran geçirgenliğinin sızıntı
oluşturması için yüksek kalsiyum tuz solüsyonunda inkübe edilir. Kalsiyum
iyonları ile fosfolipit membrandaki fosfatlar etkileşime girerek geçici porlar
oluşturulur. Böylece kompetent hücreler DNA ile karıştırılarak DNA‘ nın bakteri
içerisine girmesi sağlanır.
Alternatif olarak elektroporasyon yöntemi de kullanılabilir.
Bakteri türleri uygun bir motifde metillenmemiş olan plazmitlerde dahil olmak
üzere yabancı DNA ları parçalayan bir restriksiyon modifikasyon sistemi
kullandıklarından şu soru aklımıza gelir. Transforme bakteri yabancı DNA yı
neden parçalamaz.
Moleküler biyologlar yaygın laboratuvar suşu olan E. Coli DH5α gibi restriksiyon
hemde modifikasyon sistemi kusurlu olan bir mutant bakteri suşlarını
kullanarak, bu savunma sisteminin üstesinden akıllıca gelmişlerdir.
17
• Başarılı bir şekilde transforme olmuş bakteriler ya rekombinant ya da
rekombinant olmayan plazmit DNA taşıyacaklardır. Plazmit DNA ların
çoğalması ise transforme edilmiş her bakteride gerçekleşecektir.
• Aktarıldıktan sonra bakteri gerekli besinleri içeren agarlı besiyeri gibi
katı besiyerinde çoğalarak koloni oluşturur. Konak hücre bölündükçe
plazmit vektörde yeni oluşan oğul hücrelere geçmekte ve burada da
replikasyona devam etmektedirler.
• Transforme olmuş tek bakteri hücresinin bir çok kez bölünmesi
sonucunda tek ebeveynli üremiş hücre klonları oluşur. Bu hücre
klonları da agarlı besiyeri yüzeyinde görünür olan koloniyi meydana
getirir. Bu basamak klonlama işlemine adını veren aşamadır.
18
19
Rekombinat seçimi:
Rekombinat plazmidlerin taşıdığı direnç genleri sayesinde ayırt edilebilir.
Örneğin rekombinant plazmid taşıdığı direnç geni ( amfisilin gibi ) sayesinde
antbiyotik içeren agar besiyerinde büyüyebilirken, rekombinant olmayan
plazmidler büyüyemezler.
Mavi – beyaz taraması:
pUC18 gibi vektörler, amfisilin yada X-Gal olarak adlandırılan renksiz bir
kromojenik birleşen içeren seçici besiyerinde büyütülürler. X-gal, yabancı
DNA taşıyan plasmidleri bulunduran bakterilerin tanınmasını sağlar. X- gal’in
β-galaktozidaz ile hidrolizi sonucu mavi ürün meydana gelir. Bozulmamış βgalaktozidaz genlerini içeren plasmidleri taşıyan bakteriler mavi olur. Eğer
plasmid yabancı DNA’yı lacZ geni içerisine yerleştirmişse, β-galaktozidaz
üretemeyeceklerinden beyaz görülür. Kısaca, yabancı DNA’yı taşıyanlar
besiyerinde beyaz koloniler olarak gözlenir.
20
21
22
DNA’ NIN çoğaltılması ve saflaştırılması:
Rekombinant plazmid DNA’ yı içeren pozitif bir koloni aseptik koşullarda sıvı bir
besiyerine transfer edildiğinde hücreler çoğalmaya devam edeceklerdir.
Moleküler klonlamanın son basmağı ise DNA ‘ NIN tekrar elde edilmesi olayıdır.
Plazmid DNA; nükleik asitleri uygun koşullarda bağlayan fakat protein ve
karbonhidratların uzaklaştırılmasına izin veren silika jel veya değiş-tokuş
reçinesinin kullanıldığı kromatografik (sıvı kromatografisi) yöntemler ile ham
hücre lizatlarından saflaştırılabilir. Saflaştırılan plazmid kolondan elüe edilir ve
etanol çökeltmesi ile geri kazanılır .
Bakteriyofaj lambda vektörü:
1974 yılında ilk viral klonlama vektörü olarak tasarlanmıştır. Plazmid vektörlerin
aldığı DNA parçasından daha büyük parçayı alabildiklerinden dolayı genomik
kütüphanenin oluşturulmasında oldukça kullanışlıdırlar.
23
λ faj vektöründeki merkezi gen kümesi çıkarılabilir ve yabancı DNA bu
genler yerine kollar arasına yerleştirilebilir. Oluşan Rekombinant viral
partikül transdüksiyon ile agar besiyeri üzerindeki konak bakteri hücresine
enfekte edilebilir. Bakteri kısa bir süre içerisinde viriüs partikülleri ile dolar
ve hücre parçalanır. Virüs partikülleri agar üzerinde plaklar halinde görülür.
24
Yapay kromozom vektörleri :
BAC ( bakteriyel yapay kromozomları ) , YAC ( maya yapay kromozomları )
kromozomları , kompleks ökaryotik genomların haritalanması ve analizi için
kullanılan önemli araçlardır.
300 kb dan daha büyük yabancı DNA taşıyabilmeleri nedeniyle Genom projesi
ve diğer genom dizileme projelerinin çoğunda kullanılır.
BAC, F faktörünü kodlar. Tasarlanmış BAC vektörleri 7.4 kb boyutlarında olup
yapısında bir replikasyon orjini, klonlama bölgeleri, ve seçici belirteçler
bulunmaktadır. Böylece büyük bir yabancı insört DNA ‘ yı barındırabilirler.
MAC
(memeli yapay kromozomu), İlk prototip MAC 1997 yılında
tanımlanmıştır. MAC ların geliştirilmesi iki temel nedenden dolayı çok
önemlidir. Bu nedenler :
1- Büyük genlerin ifade sisteminde kullanmak
2- Memeli hücreler içerisinde otonom olarak replike olabilmeleri ve ayrı
tutunabilmelerinden dolayı önemlidir.
25
YAC, E. Coli de çoğalan küçük plazmidlerdir. YAC ‘ lar ökaryotik kromozomun
minyatür sürümleridir . Replikasyon orjini, seçilebilir markör, iki telomer, iki
hücreye ayrılmasını mümkün kılan bir sentromere sahiptir.
Kırmızı- Beyaz seçimi : Rekombinat YAC lar kırmızı beyaz seçimi ile
tarannmaktadır. Kırmızı olanlar YAC vektör DNA larınıı taşırken beyaz
koloniler rekombinat olmayan YAC vektör DNA larını taşırlar. Böyle
olmasının nedeni ise çoklu klonlama bölgesindeki SUP4 geninden
kaynaklanmaktadır.. Rekombinat olmayan YAC vektörleri SUP4’ ü muhafaza
ederken Rekombinat YAC ‘ lar muhafaza etmez.
26
27
Klonlanacak DNA kaynakları: klonlanacak DNA kaynağı araştırmacının
nihai amacına göre belirli bir geni veya genin bir kısmını temsil eden DNA
fragmeti veya bir organizmanın tüm sekansı olabilir. Tipik insörtler ise
genomik DNA , cDNA ve PCR ürünleridir
DNA Kütüphanelerinin oluşturulması:
Çeşitli organizmaların genomlarından izole edilen DNA fragmentlerinin
kütüphanelerini oluşturmak için vektörler kullanılır. DNA‘ LAR özgül
restriksiyon endonüleazlarla ( re ) kesilerek vektörlere eklenir ve
rekombinant molekül konak hücreler transfer edilir. Bütün DNA
moleküllerinin tamamı kütüphaneyi oluşturur.
Genomik DNA kütüphanesi : Bir organizmanın tüm genomunu temsil eden
DNA fragmentlerini içerir. genomik kütüphane oluşturmanın 3 adımı vardır:
1- RE ‘ larka kesim yaparak DNA’ yı uygun parçalara ayırmak
2-Santrifükasyon teknikleri yada jel elektroforezin de optimal büyüklükteki
fragmentlerin saflaştırılması
3-DNA fragmentlerinin uygun bir vektör içerisine yerleştirilmesidir.
28
cDNA kütüphanesi : Özgül bir doku, hücre tipi veya gelişim basamaklarından
(embriyonal ) mRNA popülasyonunun izole edilmesidir. mRNA izole edilebilirse
genomdaki bütün genlerin küçük bir takımı araştırılabilir. mRNA doğrudan
klonlanmadığından cDNA kopyası klonlanır. Kütüphanede sadece ifade edilen
genlerin bölgeleri bulunurken intronlar bulunmaz.
29
Kütüphanenin taranması ve problar
Klonlanmış özgül bir DNA dizisinin bir kütüphane içinde araştırılmasına
kütüphanenin taranması adı verilir. Kütüphane taranırken bir geni tanımlamak
için gereken anahtar elementlerden biri probtur. Prob terimi genellikler bir
nükleik asiti ( DNA ) işaret etmektedir. Pob DNA ; ilgilenilen gen veya dizisinin
komplementeri olup hibridizazyonu sağlar.
DNA Ve RNA prob tipleri:
Hibridizasyon DNA- DNA, DNA- RNA, RNA- RNA arasında meydana gelebilir.
Komplementer baz eşleşmesi prensibine bağlı olarak 3 ana tip prob
geliştirilmiştir.
1- Oligonükleotit problar: Kimyasal olarak sentezlenir
2- DNA Proplar : Klonlanmış DNA’ dan oluşurlar
3- RNA Problar: DNA kalıplarından in vitro transkripsiyonla üretilirler.
30
Bu 3 probun iki ana tipi bulunur bu ana tipler : heterolog ve homolog tipleridir.
Heterolog prop ; hedef nükleik asit dizisiyle benzer fakat tamamıyla aynı
olmayan bir diziye sahiptir.( yakın türler )
Homolog prop: hedef nükleotit dizisine birebir komplementer olan probtur.
Problar radyoaktif ( radyoizotoplarla ) veya radyoaktif olmayan (digoksigenin
ile) etiketlenme yöntemi ile etiketlenebilir. Digoksigenin nükleotitlere
konjuge olabilir. DNA, RNA ve Oligonükleotoit problarına yerleşebilir.
Digoksigenini tanıyan antikorlar kullanılarak belirlenebilir.
Kütüphanelerin taranması
31
Kolonilerin DNA bağlayıcı membrana transferi
İlk adımda tüm kütüphaneyi temsil eden insörtleri içeren rekombinant
vektörleri barındıran bakteriyel hücreler yüzlerce veya binlerce koloni
oluşturacak şekilde nutrient agarlı petri kaplarında büyütülür. Kolonilerin
üzerine yerleştirilen nitroselüloz veya naylon membrana nazikçe bastırarak
bazı hücrelerin membrana geçmesi sağlanır. Daha sonra membrana tutunmuş
bakteri hücreleri liziz edilir ve alkali ve proteazla muamele edilerek DNA
saflaştırılır. Saf DNA’ yı tek zincirli hale getirmek için denatüre edilir ve ısı
muamelesiyle yada UV le ile membrana sabitlenir. DNA nın membrana
kovalent bağlanması ise onun şeker-fosfat omurgası aracılığıyla gerçekleşir ve
DNA tek zincirdeki eşleşmemiş bazlar komplementer baz eşleşmesine maruz
bırakılır.
Koloni hibridizasyonu : Kütüphane taranmasının sonraki adımında radyoaktif
etiketli tek zincirli bir DNA probu kullanılır. hibridizasyon adımı probun baz
dizisine benzer dizileri içeren her kolona bağlanmasını garantiliyecek bir
sıcaklıkta gerçekleşir. Bazı özgül olmayan bağlanmalardaki probları ise bir seri
yıkama yapılarak uzaklaştırılır.
32
Hibrid dubleksin yada heterodubleks’ in kararlılığı; bazlar arasındaki hidrojen
bağlarının sayısı ve iki zinciri bir arada tutan hidrofobik etkileşimlerle oluşan
baz istiflerinden etkilenir.
Uygun hibridizasyon derecesi GC içeriğine ve hedef diziye olan homolojisinin
yüzdesine bağlıdır.
Pozitif kolonilerin belirlenmesi :Kütüphanenin taranmasının son fazında
mebranın üzerine bir X- ışını filmi konur ve bu film yıkama sonrası
komplementer dizilere özgül olarak bağlı halde membran üzerinde kalmış
probların ışımasını sağlar.
İfade (ekspresyon) kütüphaneleri: Gen ifadesi için gerekli olan düzenleyici
elementleri taşıyan klonlama vektörleriyle yapılır. Nükleik asit
hibiridizasyonuna benzer bir teknik kullanarak radyoaktif etiketli bir antikor
bağlanması esasına dayanır.
33
Restriksiyon haritalama ve RFLP analizi:
İlgilenilen klon izole edildikten sonra analizin ilk aşaması restriksiyon haritasının
çıkarılmasıdır. Bu haritalama RE kesim bölgelerinin sayısı, sırası, kesim bölgeleri
arası mesafe hakkında bilgi sağlar. Restriksiyon haritalama ve RFLP analizi, DNA
nın karakterize edilmesinde, genlerin haritalanması ve genetik hastalık
testlerinde önemli bir role sahiptir.
Restriksiyon haritalama: Klonlanmış DNA fragmenti RE lerle kesilir elektroforez
için agaroz jele yüklenir. DNA fragmetlerin uzunlukları; uzunluğu bilinen şahit
DNA ların uzunlukları ile karşılaştırılarak bulunur.
RFLP ANALİZİ: 1980 yılında insan genomunun restriksiyon fragment uzunluk
polimorfizm (RFLP) haritası oluşturuldu. Bir RFLP, birbirinden farklı
büyüklüklerdeki restriksiyon fragmentleriyle ilişkili olan alternatif allellerin
varlığı tarafından belirlenir.
RFLP analizi farklı bireylerden elde edilen DNA ların RE lerle kesilip ve
büyüklüklerine göre jel elektroforezinde ayrılmasından sonra Southern
blotlama yapılması ve incelenen lokusun belirlenebilmesi için işaretli problarla
hibridizasyonun gerçekleştirilmesi esasına dayanır.
34
RFLP LER genetik hastalıkların belirteci olarak
.
hizmet verebilir
• En basit RFLP’ler, tek-baz çifti değişiminin neden olduklarıdır.
• Bununla birlikte transpozıbl elementler gibi genetik materyalin
sokulmasıyla, yada ardışık duplikasyonlar, delesyonlar,
translokasyonlar
veya
diğer
kromozomal
yeniden
düzenlemelerlede üretilebilir.
• Bağlantı analizlerinde, bireyleri genetik hastalık taşıma riski
altında bulunan aileler belirlenir. Bu duruma uygun olarak,
belirli bir hastalıkla ilişkili otozomal resesif mutasyon
bakımından her iki ebeveynin de heterozigot olduğu bir aileyi
örnek olarak ele alalım. ailenin çeşitli üyelerinden alınan DNA
örnekleri hastalığa sebep olan mutant allellerin hangi
frekansta özgül RFLP belirteçleriyle beraber ayrıldığını bulmak
için analiz edilebilir. Bu frekans mutant olduğu belirlenen lokus
ile markörlerin arasındaki mesafenin bir ölçüsüdür.
35
• Genellikle fragmentlerdeki büyüklük farklılıkların meydana gelmesi
sadece hastalık durumunun kendisi tarafından yeni bir restriksiyon
bölgesinin oluşturulması veya var olan bir bölgenin bozulmasıyla
değil, daha çok genin yer aldığı bölgenin hemen yanıbaşında
meydana gelen nükleotit dizi farklılığı nedeniyledir.
• Hastalık oluşturan bir gene yakın bulunan belirli bir polimorfizm
formu mayozda gerçekleşen krosing over sırasında gene yakın durma
eğilimindedir. Krosing overde ise göreceli olarak kromozomların daha
büyük segmentleri rol almaktadır.
• Bu nedenlede belirli bir kromozomda birbirine yakın olan
belirteçlerin
birlikte
aktarılma
(rekombinasyon
sırasında
birbirlerinden ayrılmadan) ihtimali, birbirinden oldukça uzakta
bulunan belirteçlerin birlikte aktarılma ihtimalinden çok daha
yüksektir.
• Böylelikle bağlanma mayoz aracılığıyla bir belirtecin diğeriyle birlikte
aktarılma ihtimalini ifade etmektedir.
• Sıkça birlikte aktarılan belirteçlerin ise yakından bağlı oldukları
söylenir.
• böylelikle RFLP ler hastalık geninin içinde olmasalar dahi hastalıkların
belirteçleri olarak görev yaparlar.
• RFLP ler kistik fibrozis, huntington hastalığı ve hemofili gibi genetik
hastalıkların tanısında kullanışlıdırlar.
36
• PCR ın keşfine kadar DNA varyasyonlarının belirlenmesi
amacıyla gerçekleştirilen bağlantı analizlerinde RFLP ler yaygın
olarak kullanılmıştır.
• PCR temelli protokollere göre RFLP nin en önemli avantajı ise
sekans bilgisine ilişkin bir ön bilgiye veya oligonükleotit
sentezine ihtiyaç duymamasıdır.
• Bununla birlikte belirli bir lokusun tiplendirilmesi için bir PCR
protokolü geliştirildiğinde genellikle RFLP analizine tercih edilir.
• Bazı durumlarda analiz için PCR ve RFLP kombinasyonu
kullanılır.
37
RESTRİKSİYON HARİTALAMA
38
39
RFLP ANALİZİ İLE HASTALIK TEŞHİSİ
40
DNA DİZİLEME
1977 yılında DNA ‘ daki bazların dizisini belirlemek oldukça emek isteyen bir
işti ve t-RNA ‘ nın kalıp bölgesi gibi çok kısa dizilere uygulanabiliyordu. DNA
sekanslama tekniklerinin gelişmesiyle DNA bazlarının sıraları sıradan bir iş
haline geldi. DNA Dizileme :
1- Genlerin tanımlanmasında
2- Promotör dizilerin ve genlerin ifadesi kontrol eden düzenleyici DNA
elementlerinin belirlenmesinde
3- cDNA nın PCR ürünlerinin doğrulanmasında
4- bir genin veya cDNA amino asit diziliminin DNA dizisinden çıkarılmasında
kullanılır.
DNA dizileme tekniklerinin gelişmesiyle birlikte genomun evrimi hakkında
bilgilerin çoğalması genetik hastalıklara sebep olan mutasyonların
tanımlanması gibi önemli veriler sunmuştur.
41
Sanger ‘ dideoksi ‘ DNA Metodu ile manuel DNA Dizileme
DNA dizileme de en çok kullanılan metoddur. Bu metodda tek zincirli DNA ,
DNA polimerazın DNA sentezinin başlatabilmesi için gerekli olan primerle
karıştırılır. Daha sonra 4 eşit parçaya bölünerek ; içerisinde yüksek derişimde
dNTP ve DNA polimeraz ve düşük derişimde zincir sonlandırıcı ( replikasyon
terminatörü) bulunan tüplere aktarılır. Sekanslama karışımı denatüre edici
poliakrilamid jelde ayrı kuyucuklara yüklenir ve DNA fragmentleri ayrılır.
Radyoaktif primer her bir DNA molekülünün 5’ ucundadır. En alttan en üste
doğru okunduğunda 5’- 3’ yönünde DNA molekülünün sekansını verir.
Bu teknik çok zahmetidir ve dizinin elle okunması gerekir. Bu teknikteki DNA
polimeraz ise faj T7 polimerazıdır.
42
43
OTOMATİK DNA DİZİLEME
1986 yılında Leroy HOOD ; Sanger metodunu otomatize etmiştir. Bu teknikte
radyoaktif etiketinin yerine flororesans etiketler kullanılmıştır. Poliakrilamid jel
ve jelin sonunu doğru bir lazer ( boya moleküllerin uyarılması için ) ve bir de
bilgisayar kullanılır. Günde 4.800 baz okuyabiliyordu.
44
YENİ NESİL DNA DİZİLEME
Yeni nesil DNA dizilerinden birisi 454 pirodizilemdir. DNA zincirine eklenen
nükleotitirin tanınması için ışık üreten lusiferaz enzimi kullanılır. Boncuk ve
Adaptörler DNA Fragmentlerine eklenir yapılır. Enülsiyon PCR yapılır . Daha sonra
dizileme makinasının kuyucuklarında depolanır .lusiferaz yardımıyla okunur.
45