Moleküler Biyoloji Teknikleri ve Biyomedikal Müh
advertisement
Doç. Dr. Metin Aytekin metin.aytekin@gmail.com www.metinaytekin.com Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı 10 Mayıs 2016 Hücre Kültürleri Bu tekniğin temeli; değişik dokulardan alınan hücrelerin belirli ortamlarda saklanması ve bu ortamlarda çoğaltılmasına dayanır. Bunun için çoğaltılacak hücrelere uygun çeşitli ortamlar geliştirilmiştir. Bu ortamlarda çoğunlukla kompleks karbohidrat karışımları, amino asitler, tuzlar, vitaminler, hormonlar ve çeşitli büyüme faktörleri bulunur. Hücre Kültürleri Ortamda bulunan tuz konsantrasyonun osmotik bir dengesizlik oluşturmaması için, ortam izotonik olarak hazırlanır. Bu nedenle ortama bikarkobanat, CO2 ile birlikte tampon olarak eklenir ve pH’nın 7.4 kalması sağlanır. Ayrıca ortama renk değiştiren pH indikatörü ilave edilir ve bu indikatör renk değişimi sayesinde ortamın pH’sı ve bakteri kontaminasyonu ile ilgili bilgi verir. Vitaminler ve hormonlar hücrelerin büyümesinde bir kofaktör olarak rol oynar. Hücre Kültürleri • Yapılan hücre kültürleri sayesinde, ökaryotların gelişmesi, farklılaşması ile ilgili bilgi edinilir. • Hayvan kültür hücreleri olarak, hızlı çoğalmaları nedeni ile çoğunlukla embriyonik hücreler veya tümör hücreleri kullanılır. • Hayvan ya da insan kültür hücreleri; bir parça dokuyu ayırıp hücrelerin besiyer içeren kültür kaplarına konması ile başlatılır. Hücre Kültürleri Fibroblast ve epitel hücreleri gibi birçok hücreler kültür kabının yüzeyine tutunarak çoğalır. Adherent hücreler Adherent olmayan hücreler (Suspension) Hücre Kültürleri Bir dokudan hücreler alınarak kültür ortamına konur ve bu kültür sonrası elde edilen hücreler birincil kültür veya pasajlama denir. Bu hücreler seyreltilerek ikincil kültür hücreleri elde edilmek üzere başka kültür kaplarına konur. HÜCRE BİLEŞENLERİNİN ANALİZİ İÇİN KULLANILAN TEKNİKLER Hücreyi Kısımlarına Ayırma Tekniği Homojenizasyon teknikleri: Hücreyi parçalamak için hızlı dönen blender benzer mekanik teknikler veya homojenizatörler kullanılır. Hücrelerin parçalara ayrılmasına homojenizasyon denir. Hücreyi Kısımlarına Ayırma Tekniği Homojenizasyon olayı bir tampon çözeltisi içerisinde yapılır. Homojenizasyon işlemi plazma zarlarını ve endoplazmik retikulumu küçük parçalara ayırır. Bu şekilde parçalanmış hücre süspansiyonuna homojenat veya lizat denir. Santrifüjleme teknikleri Santrifüjleme yöntemi ile farklı büyüklük ve yoğunluktaki organel veya partiküller farklı çökelme hızına sahip oldukları için ayrı ayrı elde edilebilir. Bu nedenle homojenize edilen hücreler öncelikle ayırıcı (differential) santrifüjleme tabi tutulurlar. Sonra ya kütlelerine göre ayıran Rote-Zonal santrifüjleme ya da yoğunluklarına göre ayıran Equilibrium-density Gradient santrifüjleme tekniği kullanılır. Ayırıcı (differential) santrifüjleme: Kısımlarına ayrılması istenen homojenat gittikçe artan santrifüj kuvvetine tabi tutulur. Bunun için yüksek hızda dönen ultrasantrifüjler kullanılır. Santrifüjleme en yoğun ve en büyük olan kısmın en hızlı şekilde tüpün dibine çökecek şekilde yapılır. Ayırıcı santrifüjleme tekniği ile farklı kütle ve yoğunluğa sahip olan organelleri ve molekülleri ayırt ederken yoğunlukları ve kütleleri birbirine yakın olanları ayırt edemez. Fraksiyonları kütlelerine göre ayıran Rote-Zonal santrifüjleme tekniği: Hücre süspansiyonu içerisinde yoğunluk oluşturacak özel bir solüsyon bulunduran santrifüj tüpüne konur. Çoğunlukla sukroz kullanılıır, yoğunluk gradienti oluşturur. Parçalanmış hücre süspansiyonu sukroz içerisine yavaşça yayılır. Santrifüj sırasındaki farklı büyüklükteki partiküller gradient içerisinden geçerken farklı hızda geçer ve çökerler. Fraksiyonları kütlelerine göre ayıran Rote-Zonal santrifüjleme tekniği: En yoğun olan en dipte olacak şekilde santrifüj sonunda tüpte bantlar oluşur. Sukroz kütlelerine göre birbirinden ayrılmış olan hücre fragmanlarının santrifüjün hızlanması veya yavaşlaması sırasında birbirine karışmasını engeller. Sonuçta, peroksizom, lizozom, mitokondriler gibi benzer büyüklükte olan organellerin birbirinden ayrılması sağlanır. Fragmanları yoğunluklarına göre ayıran Equilibrium-Density-Gradient Santrifüjleme Santrifüjleme tüpünde gradient oluşturacak solusyon olarak sezyum-klorid (CsCl) kullanılır. Sezyum iyonları çok yoğundur, santrifüjleme sonucu tüpün dibine çöker , dolayısıyla tüpün dip kısmı üst kısma göre daha yoğundur. Bu yöntemle DNA, RNA ve protein kolaylıkla birbirinden ayrılır. CsCl içinde bulunan Cs iyonları protein, DNA ve RNA’ya değişik oranlarda bağlanarak yoğunluklarını artırırlar. Sezyum iyonları proteine çok az bağlanır, DNA’ya fosfodiester gruplarından, RNA’ya hem fosfat hem de ribozun hidroksil grubundan bağlanır. Dolayısıyla tüpün en dip kısmında RNA, onun üzerinde DNA ve en üste proteinler olacak şekilde hücre süspansiyonunda ayrılırlar. Rekombinant DNA Teknolojisi Bu teknolojinin gelişmesi ile genler, genlerin yapı ve fonksiyonları ile ilgili ayrıntılı bilgi edinilmesi mümkün olmuştur. Böylece DNA dizi analizi gen haritalarının yapılmasına olanak sağlamıştır. Rekombinant DNA teknolojisi ile binlerce genden sadece bir genin izole edilmesi, tanımlanması, yapı ve fonksiyonu hakkında bilgi edinilmektedir. Rekombinant DNA teknolojisi (rDNA) kısaca, genlerin bir organizmadan alınarak çoğaltılması (klonlanması) ve klonlanan genlerin çeşitli amaçlar için kullanılması olarak tanımlanır. Rekombinant DNA nedir? Farklı kaynaklı olan iki DNA molekülünün birleştirilmesiyle oluşan melez DNA’ya rekombinant DNA denir Rekombinant DNA’nın oluşmasında iki önemli faktör vardır. • Restriksiyon endonükleaz enzimleri (RES) • DNA ligaz enzimi Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri (RES) RES’lar bakterilerden saflaştırılmış olan izole enzimlerdir. Bu enzimler bakterilerde savunma amaçlı bulunan enzimlerdir. İçinde bulunduğu bakteri DNA’sını bakteri içine giren herhangi bir yabancı DNA molekülüne karşı koruyan enzimlerdir. Bu enzimler yabancı DNA molekülünü keserek, parçalara ayırır böylece yabancı DNA molekülü bakteri içerisinde çoğalamaz. Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri (RES) Farklı bakteri türleri farklı RES içerirler. Bu nedenle DNA’ları yüzden fazla farklı tanıma bölgesinden tanıyıp kesebilen çok sayıda RES vardır. RES’ların her biri DNA üzerinde 4-8 bazlık DNA dizilerini tanır ve keserler. Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri (RES) RES’lar DNA’yı 5’ucunda P, 3’ ucunda OH olacak şekilde keserler. DNA ligaz enzimi de DNA’yı 3’OH ve 5’P olduğu zaman bağlayabilir. RES’lar DNA’yı iki şekilde keseler • DNA çift zincirini yapışkan uçlar oluşturacak şekilde keserler. Oluşan tek zincirli uçlar komplementeri olan başka bir tek zincirli DNA parçası ile baz eşleşmesi yaparak birleşir. Aynı RES’la kesilmiş farklı kaynaklı DNA parçaları bu yapışkan uçlar sayesinde baz eşleşmesi yaparak birleşir ve rekombinant DNA’lar oluşur. • RES’ların bazıları DNA zincirini küt uçlu DNA parçaları oluşturacak şekilde keserler. Küt uçlu 5’ Yapışkan Uç 3’ Yapışkan Uç Rekombinat DNA teknolojisinin önemi • Bazı hastalıkların tedavisinde kullanılan hormonların veya moleküllerin sentezlenmesi (İnsulin) • Rekombinant aşı üretimi • Gen tedavisi • İstenilen özelliklere sahip canlıların klonlanması • Hastalığa neden olan bazı genlerin susturulması rekombinant DNA teknolojisi ile sağlanır Rekobinant DNA teknolojisi ile neler klonlanır? • Genomik DNA lar klonlanır • cDNA lar klonlanır Genomik DNA’nın klonlanması Genomik DNA izole edilir hedef gen bölgesi RES’la kesilir ve vektör DNA’sına aktarılır. Oluşan rDNA konakçı hücreye aktarılır ve istediğimiz gen bölgesinde bu hücre ile birlikte çoğalır ve klonlanan rDNA konakçı hücreden izole edilir. cDNA’nın klonlanması cDNA vektör DNA sına entegre edilir ve rDNA oluşur. Bu da konakçı hücreye aktarılarak klonlanması sağlanır. cDNA klonlanması ile ökaryot DNA’ların aktif gen bölgelerinin klonlanması sağlanır. DNA kitaplığı Klonlanmış genomik rDNA topluluğuna veya cDNA topluluğuna DNA kitaplığı denir. DNA kitaplığı bir genomun tamamından oluştuğu gibi, genomun sadece belli bir kısmından da oluşabilir yani tek bir kromozoma da özgü olabilir. rDNA taşıyan vektörler konakçıya aktarılır ve kültür ortamında çoğalarak koloni oluştururlar. Hedef gen bölgesini taşıyan bakterilerin bu koloniler içinden seçilmesi için hedef gene özgü problar kullanılır. Rekombinant DNA Teknolojisi rDNA teknolojisinde kullanılan teknikler başlıca üç başlık altında toplanabilir. • Klasik uygulamalar; • Hibridizasyon yöntemleri • Polimeraz zincir reaksiyonu Klasik uygulama beş aşamada gerçekleşir 1. Restriksiyon endonükleazlarla istenilen DNA bölgesinin kesilip çıkartılması 2. Aynı restriksiyon endonükleazla vektör DNA’sının kesilmesi 3. Vektör DNA sı ile hücresel DNA’nın birleştirilmesi (rekombinant DNA) 4. Hücresel DNA+vektör DNA’sının konakçı organizmaya aktarılarak çoğaltılması 5. Organizmadan özel DNA parçalarını içeren klonların seçilmesi Neden Rekombinant DNA molekülleri oluşturulur? RES’larla kesilen DNA parçalarını moleküler ağırlıklarına göre ayırmak için jel eletroforezi kullanılır. Bu teknik moleküllerin elektriksel bir alanda bir kutuptan diğer kutba koşturulmasına dayanır. Jel elekroforezinde mutlaka molekül ağırlığı bilenen DNA’lar marker olarak kullanılır. Bu DNA’lara göre araştırılan DNA’ların büyüklükleri tespit edilir. Poliakrilamid jel 100-200 bazlık DNA’ların ayırt edilmesinde, agoroz jel ise daha büyük DNA’ların elde edilmesinde kullanılır. Neden Rekombinant DNA molekülleri oluşturulur? Herhangi bir RES’la DNA kesilir ve oluşan DNA parçacıkları jel elektroforezinde büyüklüklerine göre ayırt edilir. Ancak RES tek başına büyük DNA’ların analizi için yeterli bir yöntem değildir. Çünkü büyük bir DNA parçası tek bir RES kesildiği zaman çok sayıda DNA parçaları oluşur. Bu parçalarda jel elektroforezinde koşturulduğunda bir sürüntü şeklinde görüntü oluşur. Neden Rekombinant DNA molekülleri oluşturulur? Dolayısıyla, tek başına RES kesimle daha ileri analizlerde kullanılmak üzere homojen DNA parçalarının elde edilmesi için uygun bir yöntem değildir. Bu nedenle rekombinant DNA’ların oluşumuna ihtiyaç duyulmuştur. Klonlama nedir? İstenilen DNA parçasının konakçı bir hücrede bağımsız olarak çoğalabilme kapasitesine sahip DNA molekülüne eklenmesine moleküler klonlama denir. Yani bu şekilde rekombinant DNA elde edilir ve rDNA uygun bir konakçıya yerleştirildiği zaman istediğimiz gen bölgesinin klonlanması sağlanır. Klonlama nedir? r D N A t e k niği ile sa d e ce DNA par çalar ı klonlanmaz, mRNA’larda klonlanabilir. mRNA’nın klonlanması için revers-transkriptaz enzimine ihtiyaç vardır. Bu enzim aracılığı ile mRNA’dan DNA sentezlenir sentezlenen bu DNA’ya da cDNA denir. cDNA vektör DNA’sı ile birleştirilir ve konakçı hücrede klonlanması sağlanır. Vektörler Rekombinant DNA vektörleri Klonlanacak DNA parçasını taşıyan Taşıyıcı DNA parçasına vektör adı verilir. Vektörler konakçı hücrede konakçı DNA’sından bağımsız olarak çoğalırlar. Vektörler klonlanacak olan hedef DNA bölgesinin büyüklüğüne uygun olarak seçilirler. Vektör DNA’sı sadece bir RES özgü tanıma bölgesi içermelidir. Klonlama için Kullanılan Vektörler Plazmid vektörleri Plazmidler antibiyotiğe karşı dirençli genleri içerirler. Bakteriler antibiyotik içeren kültür ortamına ekildikleri zaman, bu ortamda plazmid taşıyan bakteriler koloni oluştururken diğer bakteriler çoğalamazlar. Rekonbinant DNA taşıyan plazmidler bakterilerden kolaylıkla izole edilirler. Çünkü plazmid DNA’ları bakteri DNA’sından bağımsız olarak çoğalırlar. Klonlama için Kullanılan Vektörler Bakteriyofaj lamda vektörleri Hem genomik hem de cDNA klonlaması için kullanılan vektörledir. Hedef DNA lamda faj DNA’sına (virüs DNA’sı) eklenir ve rDNA’lar elde edilir. Lamda faj vektörleri daha sonra bakteri içerisine aktarılır. Bakteri içerisinde bir faj plağı oluşturacak şekilde çoğalırlar. Lamda faj vektörleri plazmidlere göre oldukça büyük 15 kb’a kadar olan DNA parçalarını taşırlar. Klonlama için Kullanılan Vektörler Kozmitler; Lamda faj DNA2sı ile plazmid DNA’sının birleşmesinden oluşan melez vektörlerdir. Kozmitler bakteri içerisinde plazmidler gibi çoğalırlar. 40-45 kb’a kadar olan büyük DNA parçalarının klonlanması için kullanılırlar. Bakteri yapay kromozomları; Büyük DNA parçalarının klonlanması için kullanılır. Bakterilerden oluşturulan vektörlerdir. Plazmidler gibi bakteri içerisinde çoğalırlar. Maya yapay kromozomları; Oldukça büyük DNA parçalarının klonlanması için kullanılır. Özellikle gen düzenlenmesi ve gen ifadelerinin incelenmesi için kullanılır. DNA klonlanmasında kullanılan konakçı hücreler 1. Bakteri içerisine rekombinant DNA’nın aktarılması: Eğer bakteri içerisine bakteri kökenli DNA parçası veya plazmidler aktarılıyorsa bu işleme tranformasyon, eğer viral DNA’lar aktarılıyorsa transfeksiyon denir. Fajların bakteri içerisine girmesi; faj DNA’ları protein kılıfını dışarıda bırakarak bakteri içerisine girer ve bakteri genomuna entegre olarak çoğalır. Çoğaldıktan sonra bakteri parçalanır ve fajlar serbest kalır. Bu olay transfeksiyondur. Plazmidlerin bakteri içerisine girişi Bakteri yüzeyinde reseptörler vardır. Reseptörler aracılığı ile ortamda bulunan yabancı DNA bakteri içerisine alınır ve bakteri DNA’sından bağımsız olarak çoğalır. Bu olay transformasyondur. Diğer bir gen aktarım yöntemi de transdüksiyondur. Virüsler aracılığı ile bir bakteri DNA’sının başka bir bakteriye aktarılmasıdır. 2. Kültürdeki hayvan hücrelerine DNA aktarımı 1. Mikroenjeksiyon yöntemi: Kültürde çoğalan ökaryotik hücrelere rekombinant DNA mikroenjeksiyonla transfer edilir ve hücre çekirdeğine kadar ulaşır. rDNA hücre çekirdeğinde birkaç gün transkribe olur. Buna geçici transkripsiyon denir. DNA sonra konakçı DNA’ya entegre olur ve onunla birlikte çoğalarak yavru hücrelere aktarılır. Ca-Fosfotaz veya CaCl2 : Bunlar DNA partikülleri oluştururlar ve bu partiküler kültürde çoğalan hücrelerin içerisine girerler ve konakçı hücrenin DNA’sına entegre olarak çoğalır ve yavru hücrelere aktarılır. Lipzomla hücre içerisine alınması: Rekombinant DNA’nın plazma membranı ile kaynaşan lipid veziküller aracılığı ile konakçı hücreye alınmasıdır. Elektroporasyon yöntemi: Kısa süreli elektrik akımı uygulanarak hücre zarında porlar oluşturulur ve bu porlardan rDNA hücre içerisine geçer. 2. Canlı hayvan hücrelerine DNA aktarımı Konakçı hücre hayvanın uterusu veya germ hücresidir. Vektör DNA’sı fareye enjekte edilir ve farenin DNA’sına entegre olması sağlanır ve fare genomu ile birlikte çoğalır. İster kültürdeki hayvan hücrelerine, ister canlı hayvan hücrelerine aktarılan rDNA mutlaka konakçı genomuna entegre olmalıdır ve kalıcı transformasyona yol açmalıdır. Böylece oluşan yavrulara ve ya yavru hücreler rekombinant DNA aktarılmış olur. Sonuçta transgenik bir canlı oluşur. Gen aktarımı Ökaryotik hücre içerisine yeni DNA aktarılmasına gen aktarımı veya gen transferi denir. Bu sayede yeni genlere sahip hücreler veya canlılar elde edilir. Bu yeni özelliklere sahip canlılara transgenik canlı denir. Transgenik canlı oluşumunda temel işlem 1. Hedef gen veya istenilen doğrultuda düzeltilmiş gen izole edilir ve uygun olan retrovirüs veya plazmid DNA sı ile birleştirilerek rDNA elde edilir. 2. rDNA klonlanmak üzere konak hücreye veya canlıya transfer edilir. 3. rDNA konakçı DNA sına entegre olur ve kalıcı transformasyona neden olur. 4. Belli bir süre sonra aktarılan genin konakçı hücrede ifade olması sağlanır. B- Hibridizasyon yöntemleri Bir hücrede istenilen hedef gen bölgesinin olup olmadığını tespit etmek için kullanılan yöntemlere hibridizasyon yöntemleri denir. Hibridizasyon, hedef gen bölgesi ile probun birleştirilmesi olayına hibridizasyon denir. Yaygın hibridizasyon teknikleri: Western Blot: Protein ölçümleri için Northern Blot: RNA ölçümleri için Southern Blot: DNA ölçümleri için Southern Blot DNA analizini içeren bir tekniktir. Hücreden izole edilen DNA örneği uygun RES kesilerek fragmanlara ayrılır. Fragmanlar ayrılmış DNA moleküler ağırlıklarına göre ayrılması için jel elektroforezine tutulur. Sonra çift iplikli olan DNA fragmanları kuvvetli bir bazla muamele edilerek tek iplik haline gelmesi sağlanır. Jelde oluşan DNA fragmanları naylon membran veya flitre kağıdına emdirilir ve DNA parçaları naylon membrana aktarılmış olur. Southern Blot Prob naylon membranla muamele edilerek kendisine komplementar olan DNA dizisi ile hibridize olması sağlanır. Probla hibridize olmayan DNA parçaları yıkama işlemi sırasında naylon membrandan uzaklaşır. Probla hibridize olan DNA parçalarına görüntülemek amacıyla röntgen filmine bir gece bırakılır ve aranan bandın görüntülenmesi sağlanır. Nourthern Blot Tekniği mRNA analizini içeren bir tekniktir. Prob RNA veya cDNA dır. Değerlendirme için RNA-RNA ya da RNA-DNA hibridizasyonu esas alınarak yapılır. Western Blot Tekniği Protein analizi için kullanılan bir tekniktir. Bu teknikte radyoaktif işaretli problar yerine antikorlar kullanılır. Western Blot Tekniği Western Blot Tekniği Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) İstenilen DNA veya RNA bölgesinin in vitro olarak çoğaltılmasına denir. PCR; termel cycler olarak bilinen PCR cihazında yapılır. PCR için • Hedef DNA bölgesine, • Pirimerlere, • dNTP, • DNA polimeraz İhtiyaç vardır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) PCR tekniğinde çoğaltılması istenilen DNA dizisinin ilgilenilen mutasyon noktasının arada kalması koşuluyla kullanılan pirimerler hedef DNA dizisine karşılık gelecek şekilde dizayn edilmesidir. PCR üç aşamadan oluşur: • DNA’nın denatürasyonu • Pirimerin bağlanması (anneling) • Sentezin uzaması Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Bu üç aşama bir döngüye karşılık gelir. Her döngüde oluşan DNA bir önceki döngünün iki katıdır. Böylece yaklaşık 20 döngü sonunda yaklaşık 1 milyon DNA kopyası elde edilir. REAL-TIME PCR Son yıllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, real-time PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR, geleneksel PCR’ın uygulama alanlarını arttırırken PCR’la ilişkili pek çok laboratuvar sorununa da çözüm getirmiştir. Bu yöntem sayesinde DNA ve RNA örnekleri kalitatif ve kantitatif olarak kısa sürede analiz edilebilmekte, çok sayıda örnek son derece az kontaminasyon riskiyle güvenle çalışılabilmektedir. REAL-TIME PCR Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır. Böylece sonuçlar anında alınmakta, kontaminasyon riski azalarak tüm işlemler sıcaklık döngüleri başlayınca otomatik olarak devam etmektedir. The Cell: A Molecular Approach, (5th Ed), Cooper & Hausman, Sinauer, 2009. Molecular Biology of the Cell (5th Ed), Alberts et al., Garland, 2007. Molecular Cell Biology , (6th Ed), Lodish et al.,Freeman, 2007. Tıbbi Biyoloji ve Genetik, H. Kasap (Ed), Nobel Yayınevi, 2010. Moleküler Hücre Biyolojisi, H.V. Güneş, Kaan Kitabevi, 2006. Hücre, Moleküler Yaklaşım. Cooper & Hausman. 3. Baskının Çevirisi (Sakızlı & Atabey), İzmir Tıp Kitabevi, 2006. Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ders Notları, Demirtaş H. Erciyes Üniv. Yayınları, 1996. Tıbbi Biyoloji ve Genetik, Fulya Teksen, Ankara Univ. Yayınları, 2006. Hücrenin Moleküler Biyolojisi, Alberts ve ark., 4. Baskı çevirisi, TUBA, 2008. Online kaynaklar (konu içinde kaynaklara gerekli atıflar yapılır) Ve diğer kaynaklar.
