27.04.2016 Neden moleküler genetik tanı? Nursel Kıratlı Yılmazçoban Mikrobiyal organizmalarda ribozomal DNA’ ya dayalı teşhis Carl Woese (1928-2012) • Farklı türler arasındaki lateral/horizontal gen geçişi filogenetikte önemli bir sorundur. • Genomlarda cok iyi korunmuş olan 16S rRNA dizileri kullanılarak yapılan taksonomi bu sorunu çözmede önemli bir gelişmedir. 1 27.04.2016 İsaret dizileri (signature sequences) PCR’ da primer dizileri • Bakterilerde 16S, 23S rRNA, ökaryotlarda 18S rRNA • Genoma rastgele bağlanan primerler (RAPD/SCAR) • Ozel genlerin primerleri • Genler arası tekrarlı dizilere özgül primerler rRNA Analizi 1.DNA Ekstraksiyonu 2.16S rRNA PZR 3.Pürifikasyon 4.Sekans döngüsü 5.Pürifikasyon 6.Sekans analizi 7.Elektroferogramların değerlendirilmesi 8.Verilerin yorumlanması Klinik örnekten, çevreden, saflaştırılmış numuneden izolasyon 2 27.04.2016 3 27.04.2016 Mikrobiyal Toplulukların Moleküler (Kültürden Bağımsız) Analizleri Mikrobiyal Toplulukların Möleküler (Kültürden Bağımsız) Analizleri Boyanma teknikleri (Sayım ve Canlılık Testleri, Floresan Antikorlar, Mikroarray ve Mikrobiyal Çeşitlilik: Filoçip (Phylochips) Genetik boyamalar (FISH, in situ ters transkripsiyon (ISRT) FISH) Nükleik asit sequens analizleri (Sanger Dideoksi Metodu, Otomatik sequensing, 454 Pirosequensing) Yeşil Floresan Proteini kodlayan reportör genler) Nükleik asit probları PCR (RT-PCR, RAPD-PCR) rRNA analizi Metagenomiks DNA fragmentinin elektroforetik analizi (DGGE, T-RFLP, ARISA) 4 27.04.2016 Sayım Testi (boyanma teknikleri) • DAPI (4’,6-diamido-2-fenilindol), 400 nm (canlı, ölü hc. ayırt edilmez) • Acridine orange, 500 nm (canlı, ölü hc. ayırt edilmez) • SYBR Green I, 497 nm (aguatik virus pop. sayma) Canlılık Testi (boyanma teknikleri) • Yeşil, tüm hücrelere penetre olur. • Kırmızı (propidiyum ioydid içerir), sitoplama memranını koruyamayan ve ölen hücreleri boyar. Spesifik olmayan floresan boyalar ile boyanmış numuneler a) DAPİ b) Akridin turuncusu (Yeşil olan boyanma düşük rRNA düzeyindendir) c) SYBR Green I LIVE/DEAD Bac Light TM Bacterial Viability Stain ile boyanmış Micrococcus luteus (koklar) ve Bacillus cereus’ un (çubuklar) canlı (yeşil) ve ölü (kırmızı) hücreleri. Floresan Antikorlar (boyanma teknikleri) Floresan Antikorlar (boyanma teknikleri) • Direkt yöntemde yüzey antijenine yöneltilmiş antikor, floresan boya ile kovalent bağlıdır. • İndirekt yöntemde, bir hc.nin yüzeyindeki floresan olmayan antikorun mevcudiyeti, bu floresan olmayan antikora karşı yöneltilmiş floresan bir antikorun kullanılmasıyla saptanır. Mikrobiyal yüzey antijenlerinin floresan antikor metodu ile belirlenmesi. Yeşil Floresan Protein (boyanma teknikleri) Southern Blot Green flourescen protein (GFP), protein lokalizasyonunu in vivo etiketlemek için kullanılır. Bu örnekte, S. cerevisiae mayasında bir DNA-bağlanma proteini olan Pho2’ yi kodlayan geni, GFP yi kodlayan gen ile birleştirilmiştir. Oluşturulan rekombinant gen tomurcuklanan maya hc. nde transform edilmekte ve çekirdekte lokalize olan floresan füzyon proteini ifade olabilmektedir. 5 27.04.2016 Northern Blot Floresan in situ hibridizasyon (FISH) • Fluoresan işaretleme, in situ hibridizasyon prensibine göre, prob ve örnek arasında melez bir yapı meydana gelmesiyle sinyale dönüşen bir işlemdir. • FISH, Southern blot tekniğinin analoğudur. • FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen, tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerleşimini görebilmek için hibridizasyona uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA (prob) kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir. FISH Floresan in situ hibridizasyon (FISH) Floresan in situ hibridizasyon (FISH) FISH • Fluoresan işaretleme, in situ hibridizasyon prensibine göre, prob ve örnek arasında melez bir yapı meydana gelmesiyle sinyale dönüşen bir işlemdir. • FISH, Southern blot tekniğinin analoğudur. • FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen, tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerleşimini görebilmek için hibridizasyona uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA (prob) kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir. Arıtma çamurun FISH analizleri. a) Nitrifikasyon bakterileri. Kırmızı olanlar amonyak okside edin bakteriler, yeşil renktekiler nitrit oksitleyen bakterilerdir. b) Konfokal Lazer Mikroskobu ile görüntülenen aktif çamur örneği 6 27.04.2016 CARD (Catalyzed reporter deposition) FISH CARD FISH Catalyzed reporter deposition CARD FISH ile Archaea analizleri. DAPİ (mavi) ile boyanan türlere göre yeşil renk oldukça belirgindir. Mikrobiyel topluluktaki tek gen çeşitliğinin analiz adımları Denatüre Edici Gradient Jel Elektroforezi (DGGE): Benzer Genlerin Ayrılması Terminal Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (T-RFLP) PZR ve DGGE analizleri 7 27.04.2016 T-RFLP ARDRA: Amplified ribosomal DNA restriction analysis • 16S rRNA geninin son bolge parca uzunluklarının gruplar arasındaki farklılığına dayanır. • 5’ primer floresan boya ile etiketlenir, 16S parçalarının kesiminden sonra hibridize edilir, bu parçaların uzunluklarındaki baz farkları kapiler elektroforez ile saptanabilir. Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA). (a) Structure of rRNA operon spanning the 16S rRNA gene (positions 1–1540), an internal transcribed spacer (ITS) region of variable length, and the 23S rRNA gene (positions 1–2900). The PCR primers, one labeled with a fluorescent dye, are complementary to conserved sequences near the ITS region. (b) Amplified DNA fragments of different lengths, each corresponding to a community member. Mikroarray ve Mikrobiyal Çeşitlilik: PhyloChips Neden bu teknolojiye ihtiyaç duyuldu? Bir organizmada bulunan binlerce gen ve bu genlerin ürünleri olan RNA ve proteinlerin ortaklaşa fonksiyon görmeleri hayatın gizemini oluşturmaktadır. Berkeley Lab’ ın PhyloChip adında geliştirdiği, DNA Mikroarray teknolojisi kullanılarak mikrobiyal populasyonun hızlı profilini çıkarmak için kullanılan teknoloji 8 27.04.2016 Milyonlarca DNA bazının dizilişini bilmek, genlerin; ne yaptıklarını, nasıl çalıştıklarını, hücreden organizmaya giden aşamaları, hastalıkla hangi mekanizmaların değiştiğini, yaşlanmanın nedenlerini vs. öğrenmek anlamına gelmez. • Bu bilgiler metabolik yollara ait şemalar ile birleştirildiğinde, değişen şartlar altında bu yolların nasıl etkilendiği öğrenilebilmektedir. • Fakat tüm genleri eş zamanlı çalışmak oldukça karmaşık bir olaydır ve geniş kapsamlı teknolojilere ihtiyaç vardır. Affymetrix Gen Çipleri GeneChip Prob Array’i Hibridize edilmiş prob Tek zincirli hedef RNA Oligonükleotit prob * * * * * 24µm Spesifik bir oligonukleotidin Milyonlarca kopyası 1.28cm >200,000 farklı tamamlayıcı prob Hibridize edilmiş prob dizilimi Bir hücrenin tipi veya içinde bulunduğu evre, o hücrede eksprese olan gen profili yani sahip olduğu genlerin mRNA düzeyindeki değişiklikleri ile belirlenir. Daha önce tanımlanmamış birçok genin ekspresyon profili incelenerek ve diğer bilinen gen profilleri ile karşılaştırarak o genlerin olası fonksiyonları hakkında ipuçları elde edilmektedir. • Bir array, nükleik asit örneklerinin düzgün bir şekilde sıralanması ile oluşmaktadır. • Bilinen ve bilinmeyen DNA örneklerinin baz eşleşmesi özelliğine göre hibridizasyonu için uygun bir ortam sağlayarak bilinmeyen DNA ların tanımlanabilmesi için kullanılır. Şekil-1: DNA Mikroarray çip yapımı. PCR ürünleri; geni veya genin bir bölümünü temsil eder. Cam slayt üzerine yerleştirilip sabitlenirler. Sonuçta tek zincirli DNA fragmentleri, komplementleri (karşı zincirleri) ile bağlanabilir ve işaretlenebilirler. 53 9 27.04.2016 Şekil-2: Gen ekspresyonları arasındaki farkın, iki RNA örneği kullanılarak mikroarrayda belirlenmesi: (a)1 nolu ortamdaçoğalan hücrelerden izole edilen RNA, oligo-dT primerler kullanılarak cDNA ya dönüştürülmüş ve yeşil floresan boya ile işaretlenmiştir (Cy3). Benzer şekilde; 2 nolu ortamda çoğalan hücrelerden izole edilen RNA, oligodT primerler kullanılarak cDNA ya dönüştürülmüş ve kırmızı floresan boya ile işaretlenmiştir (Cy5). cDNA örnekleri eşit oranlarda karıştırılarak mikroarray ile hibridize edilmiştir. Mikroarrayın floresan mikroskop görüntüsü renkli noktacıklardan oluşur.Yeşil renkli noktacık ilgili genin sadece 1 nolu büyüme ortamında ekspresyonunun olduğunu; kırmızı renkli noktacık ise genin sadece 2 nolu büyüme ortamında ekspresyonunun olduğunu gösterir. 1 ve 2 nolu ortamlardan eşit miktarda cDNA , mikroarrayın tek zincir DNA sına bağlanırsa eşit miktarlardaki kırmızı ve yeşilin karışımını ifade eden sarı renkli ışınım ortaya çıkar. (b) Fare gen dizilerinden türetilmiş gen ekspresyonlarını ifade eden farklı RNA örneklerinin bir mikroarray görüntüsü Örneğin; Şekil-2’de görüldüğü gibi eğer 1 nolu ortamdaki hücrelerde bir genin ekspresyonu yapılıyor, 2 nolu ortamda yapılmıyorsa karıştırılan cDNA’da sadece Cy3 işaretli cDNA’nın tamamlayıcısı olan, mikroarrayda yeşil ışınım yapan noktacıktaki cDNA ile hibridize olacaktır. Benzer şekilde, bir gen sadece 2 nolu ortamda ifade ediliyorsa mikroarrada kırmızı renkte ışınım yapacaktır. Genler her iki ortamda da eşit şekilde ifade ediliyorsa ışınım, renklerin karışımı olan sarı renkte olacaktır. Mikroarrayın, her bir örneğin mRNA düzeylerine göre kesin kalibrasyonu önemlidir. Yeşil ve kırmızı floresan sinyaller arasındaki oran, genomik DNA içeren değişik noktacıklarda (spot) hesaplanmalıdır. Floresan dedektörü, bileşenlerin ölçülen bağıl yoğunluk yüzdesi 1.0 olacak şekilde kalibre edilebilir. Yeşil ve kırmızı sinyallerin relatif yoğunluğu, her bir örnekteki spesifik mRNA ‘nın relatif yoğunluğu ile kıyaslanarak hesaplanır. Bu durum gelecekte, DNA mikroarrayla tüm genomu kapsayacak şekilde gen ekspresyonunu analiz edebileceğimiz (Transkript Profili) anlamına gelmektedir. • Microarray yüksek hızda çalışan robotlar tarafından imal edilmektedir. • Genellikle cam, bazen de naylon yüzeyler üzerine DNA dizisi bilinen problar dizilir. Dizileme İçin Gerekli Olan Teknikler • Restriksiyon Enzimleri – DNA’yı parçalara ayırmada • Klonlama – DNA’yı 2-200kb’lık diziler halinde çoğaltma • Dizileme – Kısa DNA dizisinin okunması. – fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi kullanılarak. • Dizilerin Birleştirilmesi – parçaların bir araya getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı aşama. Fikse edilen örneğe ait noktanın büyüklüğüne göre makroarray ve microarray olmak üzere ikiye ayrılırlar. 300 mikron ve daha büyük noktacıklardan oluşan makroarray,jelde ve blot tarayıcılarda kolayca görülür. Mikroarrayde ise örnek çapı 200 mikrondan küçüktür. Bu nedenle bir array üzerinde binlerce örnek bulunabilir. Microarray çalışmalarında özel robotlara ve görüntüleme donanımlarına ihtiyaç vardır. DNA Dizilemesi DNA dizilemesi, bir DNA molekülündeki nükleotit bazlarının (adenin, guanin, sitozin ve timin) sırasının belirlenmesidir. • İki temel dizileme stratejisi - Düzenli klon dizilemesi * fiziksel bir haritayı oluşturan klonlardan yapılan birleştirme * pozisyonların bilinmesinden dolayı tekrarlı diziler için uygun yerleştirilme 10 27.04.2016 Dizi analiz cihazı: ABI 3700 • Tüm genom shot-gun dizilemesi rastgele birleştirilmesi dizilenen klonların * küçük (ör:bakteri) genomlar için uygun boşluklar primer yürüme ile doldurulur Otomatik Jel Okuyucu Kapiler elektroforez cihazı 11 27.04.2016 DNA Dizilemesi • Çoğunlukla dideoksi metodu (zincir sonlandırma metodu) ile yapılır. • Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin birçok kopyası aşağıdaki bileşikler ile karıştırılır. – Primer • DNA tek zincirine bağlanan kısa dizi (~20bp) – Normal (deoksi) nükleotidler • dNTP – dATP, dGTP, dCTP, dGTP – dideoksi nükleotidler • ddNTP – – DNA polimeraz I • Enzim ddATP, ddGTP, ddCTP, ddGTP DNA Dizilemesinde Zincir Sonlandırma Metodu Hibridizasyon ile DNA Dizilemesi Bu strateji, bilinmeyen etiketli DNA parçasının tüm kısa oligonükleotidlere bağlanmasını (ör: 8-merlik 65,336 kombinasyon ) ve bilinmeyen dizinin bağlanma kalıbından görüntülenmesini içerir. 12 27.04.2016 Basamak 1 Pirodizilemenin Temeli Bir dizileme primeri tek zincirli, PCR ile çoğaltılmış, DNA kalıbına, hibridize edilir ve DNA polimeraz, ATP sulfurilaz, lusiferaz ve apiraz, enzimleri, adenozin 5´ fosfosülfat (APS) ve lusiferin substratları ile inkübasyona bırakılır. Basamak 2 Basamak 3 ATP sülfürilaz, adenozin 5´ fosfosülfat varlığında kantitatif olarak PPi’yi ATP’ye dönüştürür. Bu ATP molekülü, lusiferaz temelli reaksiyon lusiferinin oksilusiferine dönüşümünü sağlarken, ATP miktarı ile orantılı olarak görünür ışık oluşumu gerçekleşir. Lusiferaz katalizli reaksiyon sonucunda üretilen ışık CCD kamera (charge coupled device) ile belirlenir bir pirogramda pikler halinde görüntülenebilir. Her bir ışık sinyali yapıya katılan nükleotid sayısı ile orantılıdır. İlk önce dört adet deoksinükleotidtrifosfat (dNTP) reaksiyona ilave edilir. DNA polimeraz deoksinükleotid trifosfatların, DNA zincire katılmalarını kataliz eder. Yapıya katılan dNTP ile orantılı olarak PPi (pirofosfat) açığa çıkmaktadır. Basamak 4 Bir nükleotid parçalayıcı enzim apiraz, sürekli olarak; yapıya girmeyen dNTPleri ve fazla ATP’yi parçalar. Parçalama bittiğinde, diğer dNTP eklenir. Pirodizilemenin Özeti Pirodizileme, DNA’nın enzimatik DNA sentezi ile dizilenmesidir, DNA dizisi sentezi sırasında açığa çıkan fotonların oluşturduğu sinyallerin şiddetine göre belirlenir . Basamak 5 Her bir işlem için dNTPlerin eklenmesi bir kez gerçekleştirilir. Doğal deoksiadenozin trifosfat (dATP) DNA polimeraz tarafından etkin bir şekilde kullanılmasına rağmen, lusiferaz tarafından tanınmadığından deoksiadenozin alfa-tiyo trifosfat (dATPaS) kullanılmaktadır. Süreç devam ederken, kalıp DNA zinciri yapılır ve nükleotid dizisi pirogramdaki piklerin oluşturduğu sinyaller ile belirlenir. 13 27.04.2016 TEŞEKKÜRLER… 14