Ökaryotlarda transkripsiyon

advertisement
Ökaryotlarda transkripsiyon
Dr. İSMAİL BEZIRGANOĞLU
Transkripsiyonal Düzenlemeye Genel
Bakış
• Ökaryotlarda mRNA ve protein sentezi iki farklı hücresel
organelde gerçekleşir.
• Transkripsiyon nukleusta translasyon ise sitoplazmada
gerçekleşir. Bu işlem saatler yada gelişime bağlı olarak aylar
sürer.
• Transkripsiyonun başlangıcı incelendiğinde hem prokaryot
hemde ökaryotlardaki çoğu genlerde düzenlemenin olduğu
görülmektedir.
• Bununla birlikte ökaryotlarda transkripsiyon ve translasyon
birbirinden ayrı olduğundan gen ekspresyonunun kontrolü bir
çok ilave seviyede yapılmaya çalışılmıştır.
•
•
•
•
RNA transkriptinin işlenmesini
RNA nın stoplazmaya geçişini
mRNA kararlılığını
mRNA nın proteine translasyonunu
içermektedir.
Kromozomal bölgeler ve transkripsiyon
merkezleri
• Tipik bir insan kromozomundaki kromatin iplikleri düğümler
halinde yoğunlaştırılmasına rağmen nukleusun etrafını birçok
defa dolayacak kadar uzundur. Kromozoma spesifik problarla
yapılan in situ hibridizasyonla gerçekleştirilen kromozom
boyaması, nukleusta her bir kromozomun kendisine ait ayrı bir
bölgede bulunduğunu göstermektedir.
• Genellikle spesifik genler üç boyutlu alanda her zaman aynı
pozisyonda bulunmazlar, bununla birlikte omurgalıların
çoğunluğunda nukleusun periferindeki en yoğunluğu düşük
iken nukleusun iç taraflarındaki gen yoğunluğu ise oldukça
yüksektir.
• Transkripsiyonun kromatin bölgelerinin dekondesyonuna
(açılmasına) neden olduğu bilinmektedir.
• Önerilen bir modele göre dekondense olmuş bölgelerde
oluşan DNA ilmekleri transkripsiyon merkezleri ile alakalıdır ve
bunlar çok sayıda aktif olarak transkribe edilen genleri, RNA
polimerazları ve ilgili faktörleri içermektedir.
• Her bir merkez ile yaklaşık 16 ilmeğin ilişkili olduğu tahmin
edilmektedir. Bu ilmeklerin merkezlerin etrafında bir bulut gibi
görünmektedir.
• Transkripsiyonal olarak aktif olan genlerin, nükleer zar üzerine
yayılmış olan nükleer por kompleksleri ile öncelikli olarak
ilişkide oldukları görülmektedir. Böylelikle öncü mRNA ların
işlenmesinde ve nukleustan çıkışında bu durumun direkt
olarak rol oynadığı düşünülmektedir.
• Bu merkezlerdeki ana moleküler makine, RNA zincirinin
oluşması için nükleotitler arasındaki bağlantıyı katalizleyen
RNA polimerazdır.
Ökaryotlarda farklı tiplerde RNA
polimeraz vardır
• E coli gibi bakterilerde bütün genlerinin transkripsiyonundan
sorumlu olan tek tip RNA polimeraz vardır.
• Buna karşılık ökaryotlarda çok sayıda nükleer DNA ya bağımlı
ve organellere spesifik olan RNA polimeraz vardır.
• RNA pol I nukleolus içerisinde bulunur ve ribozomal RNA ların
öncüllerinin sentezinden sorumludur.
• RNA pol III de nukleusda bulunur ve tRNA ların, 5S rRNA nın
ve bazı küçük RNA ların sentezinden sorumludur.
• Bitkiler ilave olarak RNA pol IV ve V olmak üzere iki adet daha
nükleer polimeraza sahiptir ve gen sessizleştirilmesi ve DNA
metilasyonunu yönlendiren siRNA ların sentezlenmesinden
sorumludur.
• Gen transkripsiyonu dikkate şayan kompleks bir
işlemdir.
• On binlerce farklı ökaryotik mRNA nın sentezi RNA
pol II tarafından meydana getirilir.
• Transkripsiyon işlemi sırasında RNA pol II kısa süreli
olarak sadece DNA kalıbı ile değil aynı zamanda genel
transkripsiyon faktörlerini içeren birçok çeşit
proteinlede ilişkiye girer.
• Başlangıç basamağında düzinelerce faktör ön
başlangıç kompleksini oluşturmak için bir araya
gelirler.
• Transkripsiyonun meydana gelebilmesi için aşağıda
belirtilen faktörlerin birlikte çalışmasına ihtiyaç vardır.
• Bunlar, dizi spesifik olarak DNA ya bağlanabilen
transkripsiyon faktörleri ile
• kor RNA pol II transkripsiyonal elemanları,
• DNA bağlanma faktörlerini transkripsiyonal araçlara
bağlayan çeşitli koregülatörler,
• nukleozomları hareketlendirebilen belli sayıdaki
kromatin remodelling faktörleri ve
• histon
ve
diğer
proteinlerin
kovalent
modifikasyonlarını gerçekleştirebilen çeşitli enzimler.
Protein kodlayan genlerin düzenleyici
elementleri
• Protein kodlayan genlerin ekspresyonu, transkripsiyon faktörü
olarak adlandırılan binlerce dizi spesifik DNA bağlanma proteinin
yardımı ile gerçekleştirilir.
• Transkripsiyon faktörleri genlerin promotorları ile diğer düzenleyici
elementlerde var olan bilgiyi değerlendirir ve bunlara uygun olan
cevabı RNA pol II transkripsiyon elemanlarına iletir.
• Genetik olarak var olan bilgi düzenleyici DNA dizilerinin büyük
çeşitliliği ve kompleksliliği ile artırılmış olur.
• Bir organizmadaki birçok farklı gen ve birçok farklı tip hücre aynı
transkripsiyon faktörünü paylaşırlar.
• Belli bir hücrede bir genin açılması düzenleyici elementler ve onlara
bağlanan transkripsiyon faktörlerinin özgünlüğü ile sağlanır.
• Tipik olarak bir çok hücreli ökaryotik genomun çok az bir kısmı
protein kodlayan dizi içerir. Örneğin insan genomunda bu oran
%2 den daha azdır.
• Tipik bir protein kodlayan ökaryotik gen çok sayıda farklı
transkripsiyonal düzenleyici elemente sahiptir ve bu
elementler genin transkripsiyon başlangıç noktasının (+1) 5’
yönünde bulunmaktadır.
• Maya gibi tek hücreli ökaryotların düzenleyici bölgeleri
genellikle kor promotora komşu olan kısa dizilerden ibarettir.
• Buna karşılık çok hücreli ökaryotların düzenleyici elementleri
ortalama 10 kb’lik bir genomik DNA üzerine dağılmıştır. oysa
buda transkribe edilen DNA dizisi sadece 2-3 kb civarındadır.
• Genlerin uzunluğu çok küçük veya çok büyük olabilir.
• Örneğin hiçbir intron içermeyen histon geni sadece 500 bp
uzunluktadır.
• Gen düzenleyici elementler trans-acting transkripsiyon
faktörlerince tanınan spesifik cis-acting DNA dizileridir.
• Çok hücreli ökaryotlardaki cis düzenleyici elementler,
transkripsiyonun başlama noktasına olan yakınlığına göre iki
büyük kategoriye ayrılırlar. Bunlar promotor elementleri ve
uzun menzilli düzenleyici elementlerdir.
• Belli bir genin düzenleyici bölgelerini diğer bir çok hücreli
ökaryotla karşılaştırdığımızda şunları görebiliriz.
• herhangi bir özel elementin varlığı ya da yokluğu, farklı
elementlerin sayısı, elementlerin ilgili oldukları transkripsiyon
başlama bölgelerine göre oryantasyonu ve bunlara arasındaki
uzaklık açısından farklılıklar vardır.
Promotor elementlerin yapısı ve
fonksiyonu
• Gen promotoru transkripsiyonun başlaması için gerekli olan ve
sadece transkripsiyon başlangıç bölgesinin yanında
bulunduğunda başlama oranını artıran cis düzenleyici
elementlerin bir koleksiyonu olarak tanımlanır.
• Genin promotor bölgesi kor promotor ve proksimal promotor
elementlerinden oluşur.
• Promotora yakın elementler bazen upstream promotor
elementleri veya upstream düzenleyici elementler olarak
tanımlanır.
Kor promotor elementleri
• Transkripsiyon başlama bölgesini içine alan yaklaşık olarak 60
bp lik DNA dizisidir. Burası RNA pol II ve genel transkripsiyon
faktörlerinin tanındığı yerdir.
• Promotor elementleri transkripsiyon başlangıcından kısa bir
mesafe
uzaklaştırıldığında
veya
oryantasyonları
değiştirildiğinde fonksiyonlarını kaybederler.
• Ismini ortak bir dizi olan TATAAA dan alan TATA kutusu
ökaryotik protein kodlayan genlerde tanımlanan ilk promotor
elementidir.
• TATA kutusu TFIID kompleksinin büyük alt birimi olan TATAbağlanma proteinin (TBP) bağlanma bölgesidir.
• TFIID genel transkripsiyon sisteminin bir bileşenidir ve tüm kor
promotor elementlerinin tanınmasından sorumludur.
• bunun tek bir istisnası bulunmakta olup bu durumda element
TFIIB tanıma elementi olarak adlandırılan TFIIB tarafından
tanınır.
Promotorun proksimal elementleri
• TFIID nin mayalarda kor promotor elementine bağlanmasının
düzenlenmesi upstream aktive edici dizilere (UAS) bağlıdır.
• Bu diziler promotorun birkaç yüz baz çifti yukarısında
bulunmaktadır.
• Bu UAS genellikle bir veya iki farklı transkripsiyon faktörünün
bağlanabileceği birbirine oldukça yakın olan iki ve üç
bağlanma bölgesinden ibarettir.
• Buna karşılık tipik bir çok hücreli ökaryotik geni çok sayıda
proksimal promotor elementi taşır.
• Promotorun proksimal elementleri kor promotorun 5’
tarafında bulunur ve genellikle transkripsiyon başlangıcından
70-200 bp yukarıda bulunmaktadır.
• transkripsiyon faktörlerinin tanıma bölgeleri genellikle belli
bir alanda küme oluşturma eğilimindedir.
• Bu bölgelere örnek olarak CAAT kutusu ve GC kutusu verilebilir.
CAAT kutusu CAAT bağlanma proteini (CBF) ve CAAT enhansır
bağlanma proteinin (C/ECP) bağlanma bölgesidir.
• GC kutusu ise Sp1 in bağlanma bölgesidir.
• Sp1 ilk önceleri SV40 virüsünün erken ve geç promotorlarının
transkripsiyonu için gerekli olan 3 bileşenlerinden biri olarak
karakterize edilmiştir.
• Promotorların proksimal elementleri transkripsiyonun başlama
verimliliğini artırırlar ancak bunu yapabilmeleri için transkripsiyonun
başlangıç bölgesinin yakınlarında bulunmaları gerekmektedir.
• Promotorların proksimal elementlerine bağlanan transkripsiyon
faktörleri her zaman direk olarak transkripsiyonu aktive etmez veya
baskılamaz.
• Bunun yerine bunlar sınırılayıcı (tethering) elementler olarak iş
görüyor olabilirler.
• Bunlar enhansır gibi uzun menzilli düzenleyici elementleri
kuvvetlendirebilirler.
•
Uzun menzilli düzenleyici elementlerin
yapısı ve fonksiyonu
• Çok hücreli ökaryotların protein kodlayan genleri tipik olarak ilave
düzenleyici DNA dizileri içerir.
• Bu diziler gen promotorundan 100 kb veya daha fazla uzakta olduklarında
bile iş görebilirler.
• Bu uzun menzilli düzenleyici elementler farklı hücre tiplerinin gelişimi
sırasında gen ekspresyonunun kompleks profilinin oluşumunda etkilidirler.
• Bu tip bir regulasyon mayalarda görülmemesine karşın birkaç genin
düzenleyici dizilerinin UAS den çok daha yukarıda olduğu görülmüştür.
• Birçok uzun menzilli düzenleyici elementin fonksiyonları transgenik
hayvanlardaki gen ekspresyonundaki etkileri dikkate alınarak
doğrulanmıştır.
• Bu elementler integrasyon bölgesindeki kromatince meydana getirilen
negatif ve pozitif etkilerden transgeni korumaya yardımcı olur.
• Çok hücreli ökaryotlardaki uzun menzilli düzenleyici elementler
enhansırları, silensirleri (susturucuları), izolatörleri (izole edicileri), lokus
kontrol bölgeleri ve matriks bağlanma bölgelerini içermektedir.
Enhansır ve silensırlar
• Tipik protein kodlayan genler belli bir mesafede aktif olabilen çok sayıda
enhansır içerir. Bunlara benzer olup gen aktivitesini baskılayan elementler
ise silensır olarak adlandırılır.
• Bu elementler transkripsiyonun başlangıç noktasından 700-1000 bp veya
daha fazla uzakta bulunurlar.
• Enhansırların ayırıcı özelliği promotor elementlerinden farklı olarak
promotordan yukarıda aşağıda veya bir intronun içinde bulunabilmeleri ve
promotora göre herhangi oryantasyonda olduklarında fonksiyon
gösterebilmeleridir.
• Tipik bir enhansır 500 bp uzunluktadır ve birkaç farklı transkripsiyon
faktörü için 10 adet bağlanma bölgesi içerebilir.
• enhansırlar genin promotor aktivitesini ya bütün dokularda yada doku
spesifik olarak veya gelişme seviyesinde spesifik olarak bazı durumlarda
artırırlar.
• silensırlar ise genin promotor aktivitesini azaltırlar. Enhansırlar ve
silensırlar gen promotorundan epeyce uzakta fonksiyonel olabildiklerinden
yakınlarındaki uygun olmayan diğer gen promotorları üzerindede
potansiyel aktifleştirici veya susturucu olabilirler. Fakat bu problemi
izolatör olarak adlandırılan diğer bir uzun menzilli element çözmektedir.
izolatörler
• Ökaryotik genomlar genlerce zengin ökromatin ve genlerce fakir
oldukça yoğunlaşmış heterokromatin olmak üzere iki bölgeye
ayrılırlar.
• Heterokromatin bölge komşusu DNA nın tarafınada uzama eğilimi
gösterdiğinden aktif genlerin hemen yakında olması durumunda
uzamanın önlenmesi için doğal bariyerlerin olması önemlidir.
• DNA izi elementi olan izolatör, tipik olarak 300-2000 bp
uzunluğundadır ve iki farklı fonksiyonu bulunmaktadır.
• 1. kromatin sınırlandırıcı: izolatörler heterokromatin ve ökromatin
bölgeleri arasındaki sınırları işaretler.
• 2.Enhansır ve silensırları bloklama aktivitesi: izolatörler enhansır
silensır aktivitelerini bloklayarak komşu genin uygun olmayan
şekilde aktive olmasına veya baskılanmasına mani olur.
• Tipik olarak izolatörler dizi spesifik DNA bağlanma proteinleri
için kümelenmiş bağlanma bölgelerini içerir.
• Enhansırları ve silensırları bloklayan mekanizma helen
bilinmiyor.
• Önerilen modele göre izolatörler DNA yı subnükleer bölgeye
bağlarlar. Bir ilmek oluşturarak bir genin promotorunu
diğerinin enhansırından ayırır.
• Omurgalıların Beta globin lokusu izolatör elementleri ve
kromatin yapısındaki arasındaki etkileşimleri incelemek için
harika bir modeldir.
• Araştırıcılar beta globin lokuslarında beta globin genlerine çok
yakın olan heterokromatini bu genlerden ayıran bir kromatin
sınırını karakterize ettiler.
• Bu sınır DNAazI e hipersensitif bölgede bulunan HS4 tür. Dnaz
I ‘e hipersensitif bölgeler, aktif genlerin ve düzenleyici
elementlerin ayırıcı bir özelliğidir.
Lokus kontrol bölgeleri (LCR)
• aktif kromatinin fonksiyonel domainini organize eden ve
devamlılığını sağlayan DNA dizileridir. Ayrıca aşağısındaki
genlerin transkripsiyonunu artıran bölgelerdir.
• Bazen LCL ler transkripsiyon artırıcılar olarak tanımlansalarda
klasik enhansır elementlerinden oryantasyona bağlı olarak
çalışmaları yönüyle ayrılırlar.
Matriks tutunma bölgeleri
• Gen ekspresyonunun temel moleküler mekanizmalarının
aydınlatılması için gerçekleştirilen çalışmaların çoğunluğu basit
test tüplerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte hücre
nukleusundaki
kromatinin
üç
boyutlu
yapısının
transkripsiyonal kontrolde önmeli rol oynadığı görülmektedir.
Yapılan araştırmalardan elde edilen sonuçlar ökaryotik
kromatinin birbirinden bağımsız looplar halinde organize
olduğunu gösteren delillerin sayısı artmaktadır.
• Histon ekstrasyonunun ardından bu looplar yoğun boyanmış
matrikse veya kromozom iskeletine demirlenmiş DNA halesi
olarak görülebilirler. Looplar genomda 5-200 kb lik aralıklarla
bulunabilen spesifik DNA dizilerinin olmasına bağlı olarak
oluşurlar.
• Bu DNA dizileri metafaz hücrelerinde yapılan boyamalarda
görüldüğünde iskelet tutunma bölgeleri olarak adlandırılırken
interfaz hücrelerinde görüldüklerinde ise matriks tutunma bölgeleri
olarak adlandırılırlar. MAR ların genomu herbirinin ortalama
büyüklüğü 70 kb olan yaklaşık 60.000 kromatin loopu halinde
organize ettiği düşünülmektedir.
• Loop içerisindeki aktif gen domainlerinin 4 kb kadar küçük olabildiği
inaktif kromatin bölgelerinin ise 200 kb a kadar büyüklükte
domainler olabildiği bilinmektedir.
• MAR olarak tanımlanmış olan dizilerin %70 den fazlası AT zenginidir.
MAR-matriks etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalar bağlanmanın
DNA nın primer dizisi ile ilişkili olmadığını göstermektedir.
• Bunun yerine AT zengini bölgelerde açılma eğilimi olan DNA nın
sekonder yapı oluşturma potansiyelinin daha fazla önemi vardır.
Ayrıca MAR ların bazıları GC zengindir ve potansiyel olarak Z
formunda DNA meydana getirirler.
• Genellikle MAR lar 5’ ve 3’ flanking diziler içindeki enhansırların
yakınlarında bulunurlar.
• Gen ekspresyonunun doku spesifik ve gelişim evresine göre
meydana
gelmesinde
bunların
etkilerinin
olduğu
düşünülmektedir.
• Bunlar bu fonksiyonunu yerine getirirken transkripsiyon
faktörlerini bölgeye getirdikleri ve birçok kromatini yeniden
modelleyici için bağlanma platformu oluşturdukları
düşünülmektedir.
• MAR ların bazıları topizomeraz II nin tanıma bölgelerini
içerirler.
• looplarda iki tip nükleer matriks bağlanma bölgesinin olduğu
önerilmektedir.
• Bunlar fakültatif özellikte olan fonksiyonel MAR ile sürekli olan
yapısal MAR lardır.
• Yapısal MAR lar bağlanmada görev yaparken fonksiyonel MAR
lar ise daha dinamiktir ve genlerin nükleer matrikse
getirilmesine yardım ederler.
• Fonksiyonel MAR lar geri dönüşümlü olarak nükleer matriks
bileşenleri ile temas ederler. Bu temas doku spesifik
proteinlerle olan spesifik etkileşimlerle değiştirlebilir.
• Örneğin SATB 1 özel AT zengin bölgeye bağlanma proteini en
iyi tanımlanmış olan MAR bağlanma proteinlerinden birisidir.
• SATB 1 tercihen immün sistemindeki T hücrelerinin öncüsü
olan timositlerde ekspre edilir.
• Protein Kromatin loopunun tabanına bağlanır ve T hücresine
spesifik olan gen regülasyonunda anahtar bir rol oynar.
Download