Meme Kanseri Hücrelerine Aktarılmak üzere CRAM-A ve CRAM
advertisement
Meme Kanseri Hücrelerine Aktarılmak üzere CRAM-A ve CRAM-B Atipik Kemokin Reseptörlerinin Klonlanması ve Fonksiyonel Analizi Parisa Sarmadi, M.Sc. Hacettepe Üniversitesi Kanser Enstitüsü Temel Onkoloji Anabilim Dalı Atipik Kemokin Reseptörleri • Diğer kemokin reseptörleri gibi G-proteinine bağlanamaz ve sinyal iletmez. • Özgül kemokinlere bağlanır ve internalize ederler. • Hücre migrasyonunu engellerler. Kemokin Atipik kemokin reseptörü Tuzak Mantovani et al. (2006) Nature Reviews Immunology Atipik Kemokin Reseptörleri • D6 (İlk Tanımlanmış Atipik Kemokin Reseptörü, 1997) • DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines) • CCRL1 (Chemokine CC-motif Receptor-Like 1) (CCX-CKR, ChemoCentryX Chemokine Receptor, CCR11) • CCRL2 (Chemokine CC-motif Receptor-Like 2) (CRAM, Chemokine Receptor on Activated Macrophages) CCRL2 • Pek çok hematopoetik hücrede bulunur. • CCRL2 ekspresyonu inflamatuvar koşullarda artar. • CCL5, CCL19 ve Chemerin’e bağlanır. • Lenfosit ve dendritik hücrelerin trafiğini düzenler. CCRL2 varyantları: CRAM-A ve CRAM-B CRAM-A CRAM-B N-terminali N-terminali Hücre membranı G-proteini bağlanma motifi yok. C-terminali G-proteini bağlanma motifi yok. C-terminali Çalışmanın amacı • İnsan CCRL2 varyantlarının klonlanması ve kemokin gradyanı üzerinde etkilerinin karşılaştırılması. CCRL2 varyantlarının klonlanması Ökaryotik ekspresyon vektörü CRAM-A/B Promotor EGFP IRES CRAM-A/B Poly A Hücre dışı ortam Hücre membranı Sitoplazma EGFP RT-PCR Ürünleri: RNA izolasyonu CRAM-A Pfu DNA polimeraz ile PCR M CRAM-B Agaroz jelden izolasyon NheI-XmaI çift restriksyon kesimi 1106 bp 1070 bp DNA saflaştırılması M : 1 kb DNA boyut belirteci Insert ve vektör DNA’nın T4 DNA Ligasyonu E.coli hücrelerine ısı şoku transformasyonu Koloni seçimi ve plazmid izolasyonu Rekombinant CCRL2 genlerini taşıyan kanamisin dirençli E.coli kolonileri. M++ M + + ++ + + + Rekombinant DNA ürünlerinin PCR ile doğrulanması + ++ 5300 bp 5300 bp 1106 bp 1070 bp + : CRAM-A/B insertleri içeren rekombinant klonlar M : 1 kb DNA boyut belirteci M Rekombinant DNA ürünlerinin NheI ve XmaI Restriksyon kesimi ile doğrulanması CRAM-A CRAM-B Vektör 5300 bp 1106 bp 1070 bp DNA dizi analizi ATG Rekombinant DNA ürünleri sekanslama yöntemi ile kontrol edildi ve BLAST yazılımı kullanılarak analiz edildi. TAA Transfeksyon koşulu: 500,000 Hücre/kuyucuk 3 μg Plazmid : 5 μl Lipofektamin 48 saat 37°C’de inkübasyon. HEK293T hücrelerine Lipozomal Transfeksyon Yeşil: GFP (Yeşil Floresan Proteini) eksprese eden HEK293T hücreler. Mavi: DAPI boyanması, genomik DNA. Kontrol HEK293T Akım sitometri ile CCRL2 ekspresyonu analizi Otofloresan pIRES2-EGFP transfekte HEK293T pCRAM-A/-B-IRES2-EGFP transfekte HEK293T CCRL2’nin kemokin bağlanması ve internalizasyonu Deneyler 0°C’de yapıldı. MFI: Mean Fluorescence Intensity n= 2 Ligandsız kontrol CCL5 CCL19 Chemerin 10 Ca2+ mobilizasyonu ve Sinyal iletimi analizi pIRES2-EGFP transfekte HEK293T pCRAM-A-IRES2-EGFP transfekte HEK293T FuraRed II MFI pIRES2-EGFP pCRAM-A-IRES2-EGFP pCRAM-B-IRES2-EGFP pCRAM-B-IRES2-EGFP transfekte HEK293T 3 dk. 4 dk. 3 dk. Kontrol Chemerin CCL5 CCL19 Ionomycin