Protein Ekstraksiyonu - Erzurum Teknik Üniversitesi

Protein Ekstraksiyonu
Dr.Gaye Güler Tezel
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi
Patoloji Anabilim Dalı

Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli
makromoleküllerden biridir.

Bazıları yapısal komponentleri oluştururken, diğerleri
ise iletişim, savunma, hücre düzenlenmesi ve enzim
fonksiyonlarını gerçekleştirir.

Yaşamla ilgili hiçbir işlem protein olmaksızın
gerçekleşemez.

Proteinin şekli biyolojik aktivitesini belirler.
Tek bir protein değişik yapıda ve birden fazla
fonksiyona sahip olabilir.

İlgilenilen biyolojik molekül grubunun
izolasyonu amacıyla gerçekleştirilen
ekstraksiyon işlemleri parçalama (lizis) ve
ayırma (saflaştırma) aşamalarından oluşur.


Ekstrakte edilecek protein membrana bağlı
veya sitoplazmik bir proteinse önce hücre
çeperi aşılmalıdır
Bu aşamada kullanılabilecek uygun teknik
seçilmeli ve protein yapısının zarar görmesi
engellenmelidir

Membran proteinlerinin ekstraksiyonunda
(hücre membranı veya organellerin
membranlarında) farklı yöntemler mevcut

Özellikle organel membran proteinleri için
önce organel izolasyonu daha temiz ekstre
sağlar


Dokuya ve organele uygun izolasyon yapılarak
organelin zarar görmemesi ve proteinin membranda
kalması önemli
Diferansiyel santrifüj kullanımı yaygın
(düşük hızlarda önce nukleus, sonra artan hızlarda
mitokondri ve son olarak da ribozom gibi en küçük
moleküller çöktürülür)

Aşırı ısınma önlenmelidir

Parçalama sırasında ortaya çıkacak
proteazların etkisinden korunmalıdır

Parçalama sonunda elde edilen
homojenattaki çözünmeyen materyal
santrifüjlenerek uzaklaştırılır

Önemli olan istenilen proteinin hemen
tamamının sıvı faza (supernatant) geçmesidir

Sıvının bir kısmı çözünmeyen hücresel
artıklar ile kaybedilir

Karaciğer, kalp veya kas dokusu ile
çalışıldığında doku ağırlığının 1.5-2 katı
kadar ekstraksiyon (lizis) tamponu ile
başlanmalıdır
Total hücre liziti hazırlama (taze doku)

SDS lizis buffer
%2 SDS
25mM Tris-HCl (pH 6.8)
5mM EDTA
1mM PMSF (proteaz inhibitörü-en son ekle)

Protein ekstraksiyonu yapılacak doku alınır, buz
üzerinde 1gr doku başına yaklaşık 2-3 hacim buffer
ile homojenizasyon tüpünde ezilir
Pistonlu teflon homojenizatör

Temiz bir ependorfa aktarılır

Ultrasonikatörde homojenizasyona devam
edilir (bu sırada ısı artışı kontrol edilerek
işlem durdurularak tüp buz üzerine alınır)
Ultrasonikatör



15000rpm da 1-2 saat santrifüj yapılır
Supernatant dikkatlice temiz bir tübe alınır
Her bir 1 ml örnek için; 2μl bromfenol blue
50 μl DTT
50 μl Gliserol eklenir



100°C de kapaklar açık olarak 3-5 dakika
tutulur
Elektroforez için kullanılabilir
Hemen kullanılmayacaksa -20°C de hızla
dondurmak veya -80 °C de saklamak
uygundur

Dondurulmuş örneklerin kullanılacakları
zaman hızla çözünmeleri önemlidir, bu
amaçla su banyosunda (40-50 °C) sık sık
karıştırarak çözünme uygundur

Proteinler çok sayıda sekonder ve tersiyer yapılar
içerirler, ve her zaman negatif yüklü olmazlar.

Bu yapıların uzaklaştırılması ve proteinlerin
negatif yüklü olmaları için SDS (sodyum dodesil
sülfat) deterjanı ile muamele edilirler.




PMSF (fenilmetilsülfonilfluorid) serin proteaz
inhibitörü olarak eklenir
Suda çok az çözündüğünden aseton veya
etanol*de hazırlanır
Hızla hidrolize olduğundan hazırlandıktan
hemen sonra kullanılmalıdır
Son konsantrasyonu 1mM olacak şekilde
lizis buffera son anda eklenmelidir

Metalloproteinazlar aktiviteleri için iki
değerlikli metallere ihtiyaç duyar, EDTA
metal iyonlarıyla kompleks oluşturarak
proteinlerin stabilizasyonunu sağlar

Son konsantrasyonu 2-5mM olacak şekilde
lizis buffera eklenmelidir



Gliserol örneğe running bufferdan yüksek
dansite kazandırır, bu da kuyucuğun dibine
gömülmesine izin verir
Bromfenol blue düşük molekül ağırlıklı bir
boyadır, elektroforezin takibini kolaylaştırır
DTT indirgeyici ajandır, protein örneğindeki
disülfit bağlarını azaltır




Protein denatürasyonundan korunmak için
her aşamada pH ve ısı kontrol altında tutulur
İşlemler soğuk ortamda +4°C de buz üstünde
gerçekleştirilir
pH ise uygun tamponların kullanımı ile
kontrol edilir
Tris bu amaçla kullanılır

Protein boyanması
–
Protein Coomassie Blue (CB) ile boyanır.
Protein-CB kompleksi koyu mavidir ve normal
ışıkda görülebilir
Moleküler Ağırlık

Protein: Dalton ya da Da, veya sıklıkla
kiloDalton (1000Da), ya da kDa olarak ifade
edilirler.