toxoplasma gondıı`ye özgü aşı adayı antijenlerin kullanıldığı
advertisement
EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) TOXOPLASMA GONDII’YE ÖZGÜ AŞI ADAYI ANTİJENLERİN KULLANILDIĞI ADJUVANTE MULTİVALAN REKOMBİNANT PROTEİN AŞISININ OLUŞTURDUĞU İMMUN YANIT VE KORUNMANIN BELİRLENMESİ Esra ATALAY ŞAHAR Tez Danışmanı : Doç. Dr. Remziye DEVECİ İkinci Danışmanı : Prof. Dr. Adnan Yüksel GÜRÜZ Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu : 401.02.00 Sunuş Tarihi : 13.02.2015 Bornova-İZMİR 2015 ii iv v EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ETİK KURALLARA UYGUNLUK BEYANI E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliğinin ilgili hükümleri uyarınca Yüksek Lisans Tezi Tezi olarak sunduğum “Toxoplasma gondii’ye Özgü Aşı Adayı Antijenlerin Kullanıldığı Adjuvante Multivalan Rekombinant Protein Aşısının Oluşturduğu İmmun Yanıt ve Korunmanın Belirlenmesi” başlıklı bu tezin kendi çalışmam olduğunu, sunduğum tüm sonuç, doküman, bilgi ve belgeleri bizzat ve bu tez çalışması kapsamında elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara atıf yaptığımı ve bunları kaynaklar listesinde usulüne uygun olarak verdiğimi, tez çalışması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını, bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya diğer bir üniversitede başka bir tez çalışması içinde sunmadığımı, bu tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda bilimsel etik kurallarına uygun olarak davrandığımı ve aksinin ortaya çıkması durumunda her türlü yasal sonucu kabul edeceğimi beyan ederim. 13/02 /2015 Esra ATALAY ŞAHAR vi vii ÖZET TOXOPLASMA GONDII’YE ÖZGÜ AŞI ADAYI ANTİJENLERİN KULLANILDIĞI ADJUVANTE MULTİVALAN REKOMBİNANT PROTEİN AŞISININ OLUŞTURDUĞU İMMUN YANIT VE KORUNMANIN BELİRLENMESİ ATALAY ŞAHAR, Esra Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Doç. Dr. Remziye DEVECİ İkinci Danışmanı: Prof. Dr. Adnan Yüksel GÜRÜZ Şubat 2015, 128 sayfa Toxoplasma gondii, hemen hemen her sıcakkanlı hayvanı, kuş türlerini ve insanları enfekte edebilen bir zorunlu hücre içi parazitidir. Toksoplazmozis, immun sistemi sağlam kişilerde asemptomatik ilerlerken, immun sistemi baskılanmış ya da immun yetmezliği olan kişilerde ölüme neden olabilmektedir. Bu sebeplerden dolayı T. gondii’ye karşı geliştirilecek aşı enfeksiyondan korunmak için büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında T. gondii’ye karşı multivalan rekombinant protein aşısı geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla protein mikroarray taramasıyla belirlenen T. gondii’ye ait 49 aşı adayı antijenik protein; biyoinformatik yöntemler, küçük çaplı ekspresyon ve saflaştırma özelliklerine göre analiz edilmiştir. Analiz sonucunda aralarından altı protein aşı adayı olarak seçilmiş ve ilk kez 6-Valantlı adjuvante rekombinant protein aşı formülasyonu geliştirilmiştir [6-Valant (+) Montanide]. Fareler üç hafta arayla iki kez aşılanmış ve daha sonra uyarılan humoral immun yanıt Western blot ve Rec-ELISA ile, hücresel immun yanıt ise flow sitometri ve sitokin ELISA ile belirlenmiştir. Aşılanan fareler T. gondii Ankara suşu takizoiti ile intraperitoneal yoldan letal dozda enfekte edilerek oluşturulan korunma belirlenmiştir. Sonuçlara göre, aşılama sonrası 6-Valant (+) Montanide aşısı kontrollere göre kuvvetli total IgG yanıtı uyarmıştır (P<0,0001). IgG1 ve IgG2a yanıtı incelendiğinde polarizasyonun belirgin şekilde TH1 yönüne doğru olduğu belirlenmiştir (P<0,001). IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositleri ile IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfosit oranlarının kontrollere göre sırasıyla 1,45-2 viii ve 1,6-2 kat arasında arttığı saptanmıştır. Ayrıca lenfositlerin hücre dışına salgıladığı IFN-γ miktarları incelendiğinde 6-Valant (+) Montanide aşısının kontrollere göre belirgin şekilde daha fazla olduğu (P<0,001) saptanmıştır. Bu sonuçlar 6-Valant (+) Montanide aşısının güçlü koruyucu TH1 immun yanıt oluşturduğunu göstermektedir. Aşılanan farelerin yaşam süresininin 8,38±2,13 güne çıkartıldığı ve kontrollere göre belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P<0,01). Sonuçta bu çalışmada protein mikroarray taraması ile seçilen aşı adayı antijenlerin kuvvetli humoral ve hücresel immun yanıtı uyarılabildiği ve letal toksoplazmosize karşı kısmi korunma sağladığı gösterilmiştir. Ayrıca toksoplazmozise karşı altı ya da daha fazla antijenik protein içeren multivalan rekombinant protein aşısı geliştirilerek kullanılabilir. Böylece gelecek çalışmalarda daha fazla anjenik protein içeren multivalant rekombinant protein aşı formülasyonun geliştirilmesiyle toksoplazmozise karşı tam korunmanın sağlanabileceği öngörülmektedir. Anahtar sözcükler: Rekombinant protein, Adjuvant, Aşı, Altı-Valant, Toxoplasma gondii, Toksoplazmozis. ix ABSTRACT DETERMINATION OF IMMUNE RESPONSE AND PROTECTION ELICITED BY ADJUVANTED MULTIVALENT RECOMBINANT PROTEIN VACCINE USING TOXOPLASMA GONDII SPECIFIC VACCINE CANDIDATE ANTIGENS ATALAY ŞAHAR, Esra MSc in Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Remziye DEVECİ Co-Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Adnan Yüksel GÜRÜZ February 2015, 128 pages Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can infect almost all warm-blooded animals, avian species and humans. Toxoplasmosis is asymptomatic in healthy individuals, whereas may lead to death in immune suppressed or deficient patients. For these reasons, a vaccine against T. gondii is important to prevent consequences of the infection. The aim of this thesis is to generate a multivalent recombinant protein vaccine against T. gondii. For this purpose, 49 antigenic proteins of T gondii which were determined by protein microarray screening are analyzed by the bioinformatics approaches as well as expressed and purified in small scale. Among them, six vaccine candidate proteins were selected to generate a six-valent adjuvanted recombinant protein vaccine formulation for the first time [6-Valant (+) Montanide]. Mice were vaccinated two times at three week intervals and then humoral immune response was analyzed by Western blot and Rec-ELISA, cellular immune response was detected by flow cytometry and cytokine ELISA. Mice were infected intraperitoneally with a lethal dose of the T. gondii Ankara strain tachyzoites to determine protection conferred by vaccination. Results show that 6-Valant (+) Montanide vaccine induced strong total IgG response compared to controls (P<0,0001). Analysis of IgG1 and IgG2a responses displayed that polarization was significantly towards TH1 direction (P<0,001). IFN-γ secreting CD4 T-Helper and CD8 T-Cytotoxic lymphocyte ratios increased 1,45 to 2 and 1,6 to 2 times compared to the controls. In addition, 6-Valant (+) x Montanide induced significantly higher extracellular IFN-γ level secretion from lymphocytes compared to the controls (P<0,001). These results show that 6Valant (+) Montanide vaccine induced strong protective TH1 immune response. The survival time of the vaccinated mice was increased to 8,38 ± 2,13 days which was significantly higher than controls (P<0,01). Overall, this study showed that vaccine candidate antigens selected from a protein microarray screening data induced strong humoral and cellular immune response as well as conferred some protection against lethal toxoplasmosis. In addition, multivalent recombinant protein vaccines containing six or more antigenic proteins can be generated and used against toxoplasmosis. Thus, future studies can develop multivalent recombinant protein vaccines and use more antigenic proteins in their formulations to confer full protection against toxoplasmosis. Keywords: Recombinant protein, Toxoplasma gondii, Toxoplasmosis Adjuvant, Vaccine, Six-valent, xi TEŞEKKÜR Tez danışmanlığımı üstlenerek beni glikobiyoloji konusunda aydınlatan Sayın Doç. Dr. Remziye DEVECİ’ye, beni öğrencisi olarak kabul eden, laboratuvar olanakları ve her türlü desteği sağlayarak kendimi geliştirmeme olanak sağlayan Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı başkanı ikinci tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Adnan Yüksel GÜRÜZ’e teşekkürlerimi sunarım. Yüksek Lisans tez çalışmalarım süresince her türlü yardımı ve desteği vererek, deneyimleriyle bana yol gösteren Sayın Doç. Dr. Mert DÖŞKAYA’ya, Sayın Doç. Dr. Ayşe CANER’e, Sayın Doç. Dr. Aysu DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA’ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarımda yardımda bulunan ve dostluğunu esirgemeyen Sayın Dr. Hüseyin CAN’a ve değerli bilgilerini benimle paylaşan Sayın Yrd. Doç. Dr. Sultan GÜLÇE İZ’e çok teşekkür ederim. Sevgisi, sabrı, desteğiyle her an yanımda olduğunu hissettiğim ve bana varlığıyla güven veren sevgili eşim Umut ŞAHAR’a sonsuz sevgi ve teşekkürlerimi sunarım. Son olarak her anımda yanımda olan, bu günlere gelmemi sağlayan, yardımlarını, desteklerini, sevgilerini hiçbir zaman esirgemeyen, varlıklarıyla güç bulduğum Babama, Anneme ve Kardeşlerime sonsuz sevgi ve şükranlarımı sunarım. Esra ATALAY ŞAHAR xii xiii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ................................................................................................................... vii ABSTRACT ........................................................................................................ .ix TEŞEKKÜR ........................................................................................................ .xi ŞEKİLLER DİZİNİ ............................................................................................xvii ÇİZELGELER DİZİNİ ...................................................................................... .xix SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ........................................................ .xxi 1. GİRİŞ ............................................................................................................... ..1 2. LİTERATÜR ÖZETİ ....................................................................................... ..3 2.1 Aşının Gelişimi .............................................................................................. ..3 2.2 Aşı İmmunolojisi ........................................................................................... ..6 2.2.1 Patojenlere karşı gelişen immun yanıt ........................................................ ..7 2.3 Toxoplasma gondii Hakkında Genel Bilgi .................................................... 14 2.3.1 Morfolojisi ve yaşam döngüsü ................................................................... 15 2.3.2 Toksoplazmozis .......................................................................................... 17 2.3.3 T. gondii enfeksiyonuna karşı gelişen immun yanıt ................................... 18 2.3.4 T. gondii’ye ait antijenik proteinler ............................................................ 21 xiv İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 2.4 Aşı Adayı Antijenik Proteinlerin Belirlenmesi .............................................. 24 2.5 Toksoplazmozise Karşı Geliştirilen Aşı Çalışmaları ..................................... 25 2.5.1 T. gondii’ye karşı geliştirilen DNA aşıları .................................................. 26 2.5.2 T. gondii’ye karşı geliştirilen rekombinant protein aşıları .......................... 31 2.6 Aşı Çalışmalarında Kullanılan Adjuvantlar ................................................... 37 3. MATERYAL VE METOT .............................................................................. 39 3.1 Araştırmada Kullanılan Deney Hayvanları .................................................... 39 3.2 T. gondii’ye Ait Antijenik Proteinleri Kodlayan 49 Plazmitin E. coli BL21 Star (DE3) pLysS Hücrelere Klonlanması ...................................................... 39 3.3 Aşı Formülasyonunda Kullanılacak Rekombinant Proteinlerin Seçimi İçin 49 Antijenik Proteinin Ekspresyonlarının Belirlenmesi .................................. 41 3.4 Aşı Formülasyonunda Kullanılacak Rekombinant Proteinlerin Seçimi İçin 49 Antijenik Proteinin Biyoinformatik Yöntemlerle Analizi .......................... 42 3.5 T. gondii’ye Ait Altı Rekombinant Proteinin Büyük Ölçekli Ekspresyonu ... 43 3.6 Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması ...................................................... 54 3.7 Sodyum Dedosil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve Western Blot ..................................................................................................... 55 3.8 Saflaştırılmış Rekombinant Proteinlerde Endotoksin Seviyesinin Belirlenmesi ................................................................................................... 56 xv İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.9 Rekombinant Proteinlerin Miktarlarının Kantitatif Olarak Belirlenmesi ....... 57 3.10 Multivalan Rekombinant Protein Aşı Formülasyonunun Oluşturulması ve Uygulanması .................................................................................................. 57 3.11 Aşılama İle T. gondii Ankara Suşu Takizotilerine Karşı Oluşan Korunmanın Değerlendirilmesi .......................................................................................... 58 3.12 Humoral İmmun Yanıtın Belirlenmesi ......................................................... 58 3.12.1 Eriyik E. coli proteininin hazırlanması ...................................................... 59 3.13 Hücresel İmmun Yanıtın Belirlenmesi ......................................................... 59 3.13.1 Tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması ............................................... 60 3.13.2 Hücre dışına salgılanan sitokin miktarının sitokin ELISA ile belirlenmesi ............................................................................................... 61 3.13.3 Flow sitometri ile hücre içi sitokin salgılayan T lenfosit oranının belirlenmesi ............................................................................................... 62 3.14 İstatiksel Analiz ............................................................................................ 64 4. BULGULAR..................................................................................................... 65 4.1 T. gondii’ye ait 49 Aşı Adayı Olabilecek Rekombinant Proteini Kodlayan Plazmitlerinin Gösterilmesi ........................................................................... 65 4.2 Antijenik Rekombinant Proteinlerin Ekspresyon Seviyeleri .......................... 65 4.3 Biyoinformatik Analiz .................................................................................... 67 4.4 Aşı adayı rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 Proteinlerinin Saflaştırılması ....... 69 xvi İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 4.5 Humoral İmmun Yanıt .................................................................................... 69 4.5.1 Uyarılan total IgG antikor yanıtı .................................................................. 69 4.5.2 Uyarılan IgG1 ve IgG2a antikor yanıtı ........................................................ 70 4.6. Hücresel İmmun Yanıt ................................................................................... 71 4.6.1 IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositlerin oranı ................................. 72 4.6.2 IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfositlerin oranı ................................ 72 4.6.3 IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositlerin oranı ................................... 73 4.6.4 Lenfositlerin hücre dışına salgıladığı IFN-γ ve IL-4 miktarı ....................... 74 4.7 Letal Toksoplazmozise Karşı Korunma .......................................................... 75 5.TARTIŞMA ....................................................................................................... 77 6.KAYNAKLAR DİZİNİ ..................................................................................... 82 ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................104 xvii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 2.1 Antijenik peptidin MHC ile bağlandığı agretop, TCR ile bağlandığı epitop bölgeleri ve bu bölgelerdeki anchor rezidüleri ............................ ..9 2.2 T. gondii yaşam döngüsü ....................................................................... 16 2.3 T. gondii’ye karşı oluşan CD4 T lenfosit immun yanıtı ........................ 19 2.4 T. gondii’ye karşı oluşan CD8 T lenfosit immun yanıtı ........................ 20 2.5 T. gondii takizoiti.................................................................................... 21 2.6 T. gondii takizoitinin konak hücreye invazyonu ................................... 22 4.1 Aşı çalışmalarında kullanılabilecek 49 rekombinant proteini kodlayan plazmitlerin agaroz jel görüntüsü ........................................... 66 4.2 Aşı adayı 6 rekombinant proteinin optimizasyon amaçlı protein ekspresyonlarının Western blot ile gösterilmesi..................................... 66 4.3A Aşı adayı olabilecek antijenik 49 rekombinant proteinin B hücre epitoplarının biyoinformatik analiz sonuçları ........................................ 68 4.3B Aşı adayı olabilecek antijenik 49 rekombinant proteinin MHC-I epitoplarının biyoinformatik analiz sonuçları ........................................ 68 4.3C Aşı adayı olabilecek antijenik 49 rekombinant proteinin N-bağlı glikozilasyon bölgelerinin biyoinformatik analiz sonuçları ................... 68 4.3D Aşı adayı olabilecek antijenik 49 rekombinant proteinin O-bağlı glikozilasyon bölgelerinin biyoinformatik analiz sonuçları ................... 68 4.4A Aşı adayı 6 rekombinant proteinin saflaştırılma sonrası SDS-PAGE görüntüleri .............................................................................................. 69 xviii ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) Şekil Sayfa 4.4B Aşı adayı 6 rekombinant proteinin saflaştırılma sonrası Western blot görüntüleri ............................................................................................... 69 4.5 Aşı ve kontrol grubu farelerde oluşan total IgG yanıtı ........................... 70 4.6 Aşı ve kontrol grubu farelerde oluşan IgG1 ve IgG2a yanıtları ............. 71 4.7 Aşı ve kontrol grubu farelerde IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı Lenfositlerinin Oranı............................................................................... 72 4.8 Aşı ve kontrol grubu farelerde IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik Lenfositlerinin Oranı............................................................................... 73 4.9 Aşı ve kontrol grubu farelerde IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı Lenfositlerinin Oranı............................................................................... 74 4.10 Aşı ve kontrol grubu farelerde hücre dışına salgılanan IFN-γ miktarı ... 75 4.11 Aşı ve kontrol grubu farelerde hücre dışına salgılanan IL-4 miktarı ...... 75 4.12 Aşı ve kontrol grubu farelerin ikinci aşılamadan 3 hafta sonra T. gondii Ankara suşu ile enfekte edilmeleri sonrası gözlenen yaşam süreleri ...... 76 xix ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa 2.1 İnsan aşılarının kronolojisi ....................................................................... 5 2.2 Aşıların Sınıflandırılması ......................................................................... 6 2.3 T. gondii’ye karşı geliştirilen DNA aşıları ............................................ 28 2.4 T. gondii’ye karşı geliştirilen rekombinant protein aşıları .................... 34 2.5 Adjuvant çeşitleri.................................................................................... 38 3.1 T. gondii antijenik proteinlerini kodlayan plazmitler ............................ 40 3.2 Biyoreaktörde kullanılan besiyeri karışımı ........................................... 43 3.3A Rekombinant H2 proteinini kodlayan puET-H2 plazmitinin gen ve aminoasit sekansı .................................................................................... 44 3.3B Rekombinant A4 proteinini kodlayan puET-A4 plazmitinin gen ve aminoasit sekansı .................................................................................... 45 3.3C Rekombinant E4 proteinini kodlayan puET-E4 plazmitinin gen ve aminoasit sekansı .................................................................................... 46 3.3D Rekombinant D6 proteinini kodlayan puET-D6 plazmitinin gen ve aminoasit sekansı .................................................................................... 48 3.3E Rekombinant E6 proteinini kodlayan puET-E6 plazmitinin gen ve aminoasit sekansı .................................................................................... 50 3.3F Rekombinant H6 proteinini kodlayan puET-H6 plazmitinin gen ve aminoasit sekansı .................................................................................... 51 3.4 Multivalan rekombinant protein aşısı ve kontrol grupları ...................... 58 xx ÇİZELGELER DİZİNİ (devam) 3.5 CD4 ve CD8 reseptörlü T hücrelerin salgıladığı hücre içi sitokinlerin belirlenmesinde kullanılan antikorlar ..................................................... 63 4.1 Aşı adayı 6 proteinin biyoinformatik analiz sonuçları ............................ 68 xxi SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama Ab Antikor ADCC Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisite Ag Antijen AIDS Kazanılmış Bağışıklık Yetmezliği Sendromu APC Antijen Sunan Hücre BSA Sığır Serum Albümini Ca2+ Kalsiyum İyonu ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay GM-CSF Granülosit Monosit Koloni Stimüle Edici Faktör GRA Yoğun Granül Antijeni HSP Isı Şok Proteini IFN-γ İnterferon Gama Ig İmmunoglobulin IL İnterlökin INOS Uyarılabilir Nitrik Oksit Sentaz IPTG Isopropyl β-D-l-Thiogalactopyranoside LB Luria Bertani xxii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ (devam) Simgeler Açıklama MAC Membran Atak Kompleksi Mg2+ Magnezyum İyonu MHC Başlıca Doku Uygunluk Kompleksi MIC Mikronem Antijeni NK Doğal Öldürücü Hücre NO Nitrik Oksit PV Parazitor Vakuol ROP Roptri Proteini SAG Yüzey Antijeni SOC Katabolit Represyonlu Süper Optimal Besin Ortamı STAT Sinyal Dönüştürücü ve Transkripyon Aktivatörü TAE Tris Asetat EDTA TCR T Hücre Reseptörü TC T-Sitotoksik Lenfosit TH T-Yardımcı Lenfosit TNF-α Tümör Nekroz Faktörü-Alfa 1 1. GİRİŞ Toxoplasma gondii, toksoplazmozis enfeksiyonuna neden olan zorunlu hücre içi parazitidir. Kesin konağı kedi ve kedigiller olan T. gondii insanların da dahil olduğu hemen hemen her memeliyi içeren geniş bir ara konak yelpazesine sahiptir (Wang et al., 2014b). Toksoplazmozis enfeksiyonunun dünya nüfusunun üçte birini enfekte ettiği belirtilmektedir. İmmun sistemi sağlam kişilerde, genellikle asemptomatik hastalık oluşturmakta, immun sistemi baskılanmış kişilerde ise (organ transplantasyon, AIDS, kanser tedavisi gören hastalar) ciddi klinik tablolara hatta ölüme neden olabilmektedir. Hamilelik sırasında bulaşta ise yeni doğanlarda konjenital anomalilere veya düşüklere neden olabilmektedir (Verma and Khanna, 2013). Koyun, keçi ve domuz gibi çiftlik hayvanlarının da T. gondii enfeksiyonuna duyarlı oldukları gösterilmiştir. Bu durum önemli bir ekonomik kayıp oluşturmakta ve bunun yanında az pişmiş etlerin yenmesiyle enfeksiyonun insana bulaşmasında rol almaktadır (Garcia et al., 2014). Bu sebeplerle insanların ve hayvanların T. gondii enfeksiyonuna karşı korunması için güvenli ve koruyucu bir aşıya ihtiyaç bulunmaktadır (Wang et al., 2014b). Aşılama, bulaşıcı hastalıkları kontrol altında tutmakta kullanılan en etkili ve en önemli yöntemlerden biridir (Liljeqvist and Stahl, 1999). Genellikle aşılarda ölü ya da zayıflatılmış patojenin kendisi kullanılmaktadır. Ancak günümüz aşı çalışmalarında rekombinant protein teknolojisinin kullanılmasıyla daha güvenli ve etkili aşılar oluşturulabilmektedir (Hansson et al., 2000). Rekombinant protein aşılarının çalışma prensibinde patojene ait bir kısım antijenik proteinin ya da proteinlerin rekombinant teknoloji ile üretilerek uygulanması sonrası koruyucu immun yanıtın oluşturulmasıdır. Rekombinant protein aşılarının ana avantajı yan etkiler ve patojenik organizmaya ait diğer kısımların neden olduğu immun reaksiyonlar olmaksızın koruyucu bağışıklık sağlayabilmesidir (Hansson et al, 2000). Toksoplazmozis tedavisinde kullanılan ilaçlar yeteri kadar etkili değildir. Bunun yanında insanlarda ya da T. gondii’nin ana konağı olan kedi ve kedigillerde kullanılmak üzere geliştirilmiş herhangi bir aşı da bulunmamaktadır. Günümüzde yapılan aşı çalışmalarında parazitin takizoit formunun eksprese ettiği proteinler arasından rastgele seçilen proteinler aşı adayı olarak 2 kullanılmaktadır. Bu sebeple toksoplazmozise karşı denenen birçok aşı denemesi kısmi başarılar ile sonuçlanmış, klinik çalışmalarına geçilememiştir. Liang et al., (2011) ve Felgner et al. (2015), yaptıkları çalışmada toksoplazmozisli insanlara ait serum örnekleri yanında T. gondii sporozoit ve bradizoitleri ile enfekte hayvan modellerinden elde edilen serumları protein mikroarray taraması ile değerlendirerek T. gondii özgü aşı adayı antijenik proteinleri belirlemişlerdir. Bu tez çalışmasında Liang et al. (2011) ve Felgner et al. (2015) tarafından belirlenen T. gondii’ye ait antijenik proteinler arasından 49 tanesi aşı geliştirmek amaçlı seçilmiş ve Escherichia coli’de üretilmiştir. Bu 49 rekombinant protein içinden biyoinformatik, ekspresyon ve saflaştırma özelliklerine göre seçim yapılarak adjuvante multivalan rekombinant protein aşı formülasyonunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Oluşturulan aşı formülasyonu hayvan modellerine uygulanarak aşılama ile uyarılan immun yanıt ve korunmanın belirlenmesi hedeflenmiştir. 3 2. LİTERATÜR ÖZETİ 2.1 Aşının Gelişimi Tüm aşıların temel prensibi, patojenin (bakteriyel, paraziter, viral ve bazı toksinler) veya bu patojenin bir parçasının canlı vücuduna verilerek enfenksiyon anında vücudun patojenle daha etkin immun yanıt oluşturmasını sağlamak amacıyla immun sistem duyarlılığını arttırmaktır (Ilchmann et al.,2014). Bilim tarihinin en parlak bölümlerinden birisi, aşıların insan ömrünü ve sağlığını arttırdığı dönemlerdir (Plotkin, 2014). Aşılamanın ilk denemeleri VII. yy başlarında Hindistan’daki rahiplerin yılan zehri içerek kendi immun sistemlerini uyardıkları çalışmalara dayanmaktadır (Cha, 2012). İlk aşının keşfinden bu yana yaklaşık olarak 300 yılın geçtiği belirtilmektedir (Plotkin, 2014). XVI. yy’da Hindistan’da Brahman kastları tarafından çiçek virüsü ile enfekte olmuş hastaların derisinden alınan iltihabın, sağlıklı kişilerin burnundan verildiği belirtilmektedir. Bu yönteme çiçek aşısı yapmak anlamına gelen “variolizasyon” adının verildiğinden bahsedilmektedir. (Plotkin and Plotkin, 2008). 1670 yılında, İstanbul’daki Türk sultanlarının hareminde bulunan Kafkas kadınlarının güzelliklerine olan övgüden dolayı çocuklarına vücutlarının bir parçasını aşıladıkları ifade edilmektedir. Bu kadınların Osmanlı İmparatorluğu’na aşılamayı getirdikleri düşünülmektedir (Riedel, 2005). Aşılamanın XVIII. yy’ın başlarında ziyaretçiler tarafından İstanbul’dan Avrupa’ya taşındığı düşünülmektedir (Riedel, 2005). 1721 yılında İstanbul’a kendi oğlunu aşılatmak için geldiği kısa ziyareti sırasında aşılama tekniğinin nasıl uygulandığını öğrenen Lady Mary Wortley Montagu’nun, tekniği İngiltere’ye tanıttığı rapor edilmiştir (Plotkin and Plotkin, 2008). 1796 yılında ise Edward Jenner tarafından modern aşının temelleri olan çiçek aşısı geliştirilmiştir. Sığır çiçek hastalığıyla enfekte olan bir insana ait iltihaplı dokuyu bir başka insana vererek çiçek hastalığına karşı immun direnç oluştuğu ifade edilmektedir (Riedel, 2005). 4 İnek veya sığır kelimesi Latince’de “vacca”, sığır çiçek hastalığı ise “vaccinia” veya “vaksen” olarak adlandırılmaktadır. Jenner bu bilgilere dayanarak geliştirdiği yönteme “vaccination” yani “aşılama” (Riedel, 2005), aşıda kullandığı zayıflatılmış virüse ise “vaccine” yani “aşı” adını vermiştir (Owen et al., 2013). Çiçek aşısından yaklaşık olarak 80 yıl sonra Louis Pasteur tarafından zayıflatılmış virüsün kullanılmasıyla kuduz aşısı geliştirilmiştir. Daha sonra sırasıyla tifo, kolera, veba, kızamık, kabakulak gibi bir çok hastalığa karşı da aşılar geliştirilmiş ve Çizelge 2.1’de günümüze kadar geliştirilen insan aşılarının kronolojik sırası verilmiştir (Plotkin, 2014). 5 Çizelge 2.1 İnsan aşılarının kronolojisi (Plotkin, 2014) Canlı, Atenüe Öldürülmüş Tüm Organizma Protein veya Polisakkarit Genetik Olarak Değiştirilmiş 18. yy Çiçek Hastalığı (1798) 19. yy Kuduz (1885) Tifo (1896) Kolera (1896) Veba (1897) Tüberküloz (1927) Boğmaca (1926) 20. yy (ilk yarısı) Difteri toksoid (1923) Sarı humma (1935) İnfluenza (1936) Tetanoz toksoid (1926) Tifüs (1938) Polio (oral) (1963) 20. yy (ikinci yarısı) Şarbon salgılanan Polio (enjeksiyon) (1955) proteinler (1970) Kızamık (1963) Kabakulak (1967) Kuduz (hücre kültürü) (1980) Kızamıkçık (1969) Japon ensafaliti (1992) Adenovirüs (1980) Kenelerle bulaşan ensefalit (1981) Tifoid (1989) Hepatit A (1996) Suçiçeği (1995) Kolera (WC-rBS) (1991) Rotavirüs (1999) Meningokokkal konjugat (1999) Kolera (1994) Menigokok polisakkarit (1974) Pnömokok polisakkarit (1977) Haemophilus influenza tip B polisakkariti (1985) Haemophilus influenza tip B konjugat (1987) Tifoid (Vi) polisakkarit (1994) Asellüler boğmaca (1996) Hepatit B (plazma türevli) (1981) Hepatit B rekombinant yüzey antijenleri (1986) Laym OspA (1998) Kolera rekombinant toksin B (1993) Soğuğa adapte edilmiş influenza (1999) Soğuğa adapte influenza (2003) Rotavirüs (2006) Zoster (2006) 21. yy Pnömokokkal Japon ensafaliti (2009) konjugatlar (heptavalent) (2000) Meningokokkal Kolera (sadece WC) konjugat (2009) (kuadrivalent) (2005) Pnömokokkal konjugatlar (13-valent) (2010) Rekombinant İnsan papillomavirüsü (kuadrivalent) (2006) Rekombinant İnsan papillomavirüsü (bivalent) (2009) Meningokokkal grup B proteinleri (2013) 6 Aşılar geliştirilirken kullanılan yöntemlerde bir takım farklılıklar oluşmuş ve bu da aşıların sınıflandırılmasına neden olmuştur. Bu sınıflandırma Çizelge 2.2’de verilmiştir (Liljeqvist and Stahl, 1999; Ilchmann et al., 2014). Çizelge 2.2 Aşıların Sınıflandırılması (Liljeqvist and Stahl, 1999; Ilchmann et al., 2014) Aşı grubu Aşılama yöntemleri 1. Jenerasyon Aşılar Canlı, Zayıflatılmış Aşı Zayıflatılmış canlı organizma kullanılır. İnaktif (Ölü) Aşı Ölü ya da çoğalamayan organizma kullanılır. Subunit Aşı Organizmanın antijenik özellikteki kısımları kullanılır. Toksoid Aşı Organizmaya ait toksinler inaktive edilerek kullanılır. Başka bir organizmanın antijenik kısımları ile patojen organizmaya ait antijenik özellikteki kısımları konjuge olarak kullanılır. Antijen özellikteki proteinleri üretmek için DNA’nın ilgili gen bölgesi kullanılır. Bağışıklık sistemini uyarıcı özellikteki antijenler, uygun vektörler kullanılarak rekombinant olarak elde edilir ve kullanılır. Antijenik özellikteki peptitler sentetik olarak sentezlenir ve kullanılır. 2. Jenerasyon Aşılar Konjuge Aşı DNA Aşısı 3. Jenerasyon Aşılar Rekombinant Protein Aşı Sentetik Peptit Aşı Açıklama 2.2 Aşı İmmunolojisi Aşılamada “immun bellek” ve “bağışık yanıt” geliştirilmesi amaçlanmaktadır (Pier et al., 2004). Aşılar, enfeksiyonları taklit ederek bağışıklık geliştirmeye yardımcı olmaktadırlar. Bu tür taklit enfeksiyonların hastalığa neden olmadıkları belirtilmiştir. Fakat immun sistem tarafından, T lensositlerin (hücresel immun yanıt) ve antikorların üretilmesine (humoral immun yanı) neden oldukları gösterilmiştir. Aşılama sonrası aşılanan bireyin enfeksiyonla karşılaşması durumunda, oluşan immun bellek sayesinde vücut mikroorganizma ile nasıl savaşacağını bilmektedir (CDC, 2013). Aşı immünolojisini ya da aşının nasıl çalıştığını anlayabilmek için vücudun, bir enfeksiyona yol açan patojenle nasıl savaştığını anlamak gerekmektedir (CDC, 2013). Aşağıda patojene karşı gelişen immun yanıttan, bu immun yanıtı oluşturan hücre ve hücre ürünlerinden bahsedilmiştir. 7 2.2.1 Patojenlere Karşı Gelişen İmmun Yanıt Patojenlerin saldırısına ve oluşturdukları enfeksiyonlarına karşı korunmak için konak organizmadaki immun sisteme ait çeşitli organların veya hücrelerin ve bu hücrelere ait ürünlerin, patojenle ve birbirleriyle olan etkileşimlerine “immun yanıt” denmektedir (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010). İmmun yanıt, doğal immun yanıt ve adaptif immun yanıt olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Doğal İmmun yanıt, bir patojenle daha önceden karşılaşmadan organizmada zaten bulunan hücrelerin ve ürünlerinin oluşturduğu immun yanıttır. Nötrofiller, makrofajlar, mast hücleri, bazofiller, dendritik hücreler doğal immuniteyi oluşturan hücreler arasında yer almaktadır (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010). Adaptif veya antijene özgü immun yanıt ise bir patojene ya da ürünlerine maruz kaldıktan sonra gelişen immun yanıta denmektedir (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010). Bu yanıt sırasında antijen sunan hücreler üzerinde bulunan patojene ait antijenlerin tanınması sonrası organizmaya ait hücrelerce enfekte hücrelerin öldürülmesi veya sınırlandırılmasına “Hücresel İmmun Yanıt” denilmektedir. Antikorların antijenleri nötralize etmesi veya parçalaması ise “Humoral İmmun Yanıt” olarak tarif edilmektedir (Madigan ve Martinko, 2010). 2.2.1.1 Hücresel İmmun Yanıt Vücuda giren patojenler, antijen sunan hücreler (APC, Antigen Presenting Cell) tarafından peptitlerine ayrılarak APC yüzeyinde bulunan başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC, Major Histocompatibility Complex) ile T hücrelerine sunulmaktadır. T hücrelerinin yüzeyinde bulunan T-hücre reseptörü (TCR, T-Cell Receptor) ve glikoprotein koreseptörleri (CD4 ve CD8) MHC-antijeni (MHCAg) tanıyarak immun yanıtı başlatmaktadır (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010; Owen et al., 2013). Antijen Sunan Hücreler (APC) Myeloid öncül hücrelerden gelişen monositler; dokularda, dalakta ve lenf nodüllerinde bulunan makrofajlar ve dendritik hücrelerin öncülleridir. Bu hücrelere antijen sunan hücreler de (APC) denmektedir. Bu hücrelerin endositoz, pinositoz, fagositoz ve lenfositlere antijen sunma gibi rolleri bulunmaktadır. 8 Makrofajlar, dendritik hücreler ve B hücreleri APC’ler arasındadır (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010; Owen et al., 2013). Başlıca Doku Uygunluk Kompleksi (MHC) APC’ler patojenleri belirli işlemlerden geçirerek peptitlerine ayırdıktan sonra, yüzeylerinde bulunan MHC’lerle T lenfositlerine sunmaktadırlar. MHC’ler adını, organ transplantasyonu sırasında iki kişi arasındaki doku uyumu ya da reddi için başlıca hedef molekül olmasından almaktadır (Madigan ve Martinko, 2010; Owen et al., 2013). İnsanda bu moleküle ilk kez lökositlerde rastlanmasından dolayı insan lökosit antijeni (HLA, Human Leukocyte Antigen) adı verilmiştir. Farelerde ise Histokompatibilite-2 antijeni (H-2, Histocompatibility-2) adını almaktadır (Owen et al., 2013). MHC moleküllerinin Sınıf-I MHC’ler (MHC-I) ve Sınıf-II MHC’ler (MHCII) olmak üzere iki ayrı tipi bulunmaktadır. İki tip arasındaki fark ise eksprese edildikleri hücrelerin ve antijen sundukları T hücrelerinin farklı olmasından kaynaklandığı belirtilmektedir (Owen et al., 2013). MHC-I molekülleri tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde bulunmakta ve hücre içi antijenleri CD8 T lenfositlerine sunmaktadır (Owen et al., 2013). MHCII molekülleri ise APC’ler olan B lenfositleri, makrofajlar ve dendritik hücrelerin yüzeyinde bulunurlar. Bu moleküller ise ekstrasellüler antijenleri CD4 T lenfositlerine sunarak immuniteyi uyarmaktadırlar (Madigan ve Martinko, 2010; Owen et al., 2013). CD8 T lenfositleri intrasellüler parazitlere karşı hücresel immun yanıtta önemli rol oynamaktadır. Bu nedenle CD8 T hücre yanıtı, ideal bir aşıda önem taşımaktadır (Tan et al., 2010). MHC-I molekülleri 8-10 aminoasit uzunluğa sahip kısa antijenik peptitleri yani epitopları CD8 T lenfositlerine sunarak immun yanıtı uyarmaktadırlar (Feliu et al., 2013; Owen et al., 2013). Peptitlerine ayrılmış olan antijenik proteinin iki yüzeyinden biri MHC molekülüne diğeri ise TCR molekülüne bağlanmaktadır. Antijenik peptidin MHC ile yüzleşen kısmına agretop, TCR ile yüzleşen kısmına ise epitop denmektedir. Ayrıca antijenik peptit üzerinde “anchor rezidüleri” denilen kısımlar bulunmaktadır. Bu rezidülere hem MHC molekülleri hem de TCR molekülleri bağlanmaktadırlar (Şekil 2.1.) (Pier et al., 2004). Anchor rezidüleri patojen 9 ökaryot ise antijenik peptidin glikozillenmesiyle oluşan oligosakkaritler ya da glikoproteinler de olabilmektedirler (Apostolopoulos et al., 2003). Şekil 2.1 Antijenik peptidin MHC ile bağlandığı agretop, TCR ile bağlandığı epitop bölgeleri ve bu bölgelerdeki anchor rezidüleri (Pier et al., 2004). Ökaryotik hücrelerde bir post-translasyonel modifikasyon olan protein glikozilasyonu ile proteine oligosakkaritler eklenmektedir. Başlıca N-bağlı ve Obağlı olmak üzere iki tip glikozilasyon bulunmaktadır. Her iki tip glikozilasyonda proteinlerin katlanmasında, aktivitesinde, hücre-hücre veya mikroorganizma konak hücre interaksiyonunda önemli rol oynamaktadır (Luk, 2011; Roth et al., 2012). N-bağlı glikozilasyon, asparajin aminoasidinin amid grubu ile GlcNAc (Nasetilglikozamin) arasında gerçekleşmektedir. Bu bağlantının gerçekleşebilmesi için asparajin-X-serin/treonin’den (N-X-S/T, X prolin dışında herhangi bir aminoasit olabilir.) oluşan korunmuş dizisinin bulunması gerekmektedir (Roth et al., 2012). O-bağlı glikozilasyon ise serin ya da treonin aminoasidinin hidroksil grubu ile GalNAc (N-asetilgalaktozamin) şekeri arasında gerçekleşmektedir. N-bağlı glikozilasyonun aksine O-bağlı glikozilasyon için herhangi bir korunmuş dizinin bulunması gerekmemektedir (Roth et al., 2012). Antijenik proteindeki farklı epitop bölgelerine farklı MHC molekülleri bağlanabilmektedir. Örneğin; farelerde 3 farklı MHC-I tipi bulunmaktadır. Bunlar K, D, L’dir ve H-2K, H-2D, H-2L genleri tarafından kodlanmaktadırlar. 10 İnsanlarda da HLA-A, HLA-B ve HLA-C olacak şekilde 3 farklı MHC-I geni bulunmaktadır (Pier et al., 2004). MHC genleri biri anneden gelen haplotip, biri babadan gelen haplotip olacak şekilde iki allel seti halinde bulunmaktadırlar. İnsanlar gibi outbred populasyonlarda MHC lokusunda farklı alleller bulunmasından dolayı heterozigotluk bulunmaktadır. İnbred populayonlardan farelerde ise anneden ve babadan gelen haplotiplerin identik olmasından kaynaklı H-2 lokuslarının homozigot olduğu belirtilmektedir (Owen et al., 2013). Bugün 1.500’den fazla HLA alleli bilinmektedir. Bu polimorfik HLA molekülleri sadece epitopları hücrelere sunarak hücre ölümlerine ya da sitokin salınımlarına neden olmamaktadırlar. Aynı zamanda kendinden olmayanı ayırt edebilen seçilmiş bir T-hücre repertuarı oluşturmaktadırlar. Kısa epitop dizileri aşı dizaynı için oldukça ilginç hedefler oluşturmaktadırlar. Bu yeni nesil yüksek verimli, düşük toksisiteli epitop kaynaklı aşılar günümüzde gelişimlerini sürdürmektedirler (Zhao et al., 2007). Sonuç olarak MHC molekülleri hakkında detaylı bilginin bulunması “epitop kaynaklı aşıların” önünü açmaktadır. Kısa bir epitop dizisi ile etkili bir immun yanıt oluşturulabilmektedir. Bu durum epitop kaynaklı aşıların daha spesifik, daha güvenli ve kolay üretilebilmesine yol açmaktadır (Zhao et al., 2007). T-Yardımcı Hücreler ile İmmun Sistemin Aktive Edilmesi APC’ler, yabancı antijenleri fagositoz yoluyla alarak fagozoma yapışan lizozomlar ile antijenleri peptitlerine parçalamaktadırlar. Ayrıca mikroorganizmalar tarafından dış ortama salınan ekskretuvar-sekretuvar antijenleri de endositoz ile makrofaj içine almaktadırlar. Bu antijenik peptitler, MHC-II molekülleri ile hücre içinde birleşerek (MHC-II-Ag) hücre yüzeyine sunulmaktadır (Pier et al., 2004; Weiss and Kim, 2007; Gürüz ve Delibaş, 2007; Madigan ve Martinko, 2010). Bu arada MHC-II-Ag içeren APC’yi saptayan TH0, hücre yüzeyinde bulunan CD3’ün gönderdiği bir sinyalle TH0 hücresi aktifleşerek TCR ile MHCII-Ag bağlanmaktadır [TCR-(MHC-II-Ag)]. Ayrıca TH0 lenfositlerinin uyarımını hem de T hücreleriyle APC’ler arasındaki bağlanma afinetesini arttırmak amacıyla T hücrelerinin yüzeyinde bulunan CD28 reseptörü, APC üzerinde bulunan 11 CD80/86 ile uyarılmaktadır. Bunun yanında APC üzerinde bulunan CD40 reseptörü ile T hücrelerinin yüzeyinde bulunan CD40L ligantı etkileşime girerek APC üzerindeki CD80/86 ekspresyonunu arttırmakta ve TH0 lenfositlerinin artarak farklılaşmasına yol açmaktadır. CD4 TH0 hücre populasyonunun farklılaşması TH1 ve TH2 hücreleri olmak üzere iki farklı grubun oluşmasına neden olmaktadır (Pier et al., 2004; Weiss and Kim 2007; Gürüz ve Delibaş, 2007). Bu iki grup farklı tipte sitokin salgılamakta ve her sitokinin oluşturduğu immun yanıtta da bir takım farklılıklar gözlemlenmektedir. TH1; IL-2, IFN-γ ve Lenfotoksin- (TNF-β) sitokinlerinin salgılanmasında ve T-Sitotoksik lenfositler, makrofajlar gibi hücrelerin aktifleşmesinde rol almaktadır. TH2 ise IL-4, IL-5, IL6, IL-9, IL-10, IL-13 gibi sitokinlerin salgılanmasında ve ayrıca B hücrelerinin aktifleşmesi ile farklılaşmasından sorumlu olduğu belirtilmiştir (Owen et al., 2013). CD4 TH1 Hücreleri - Makrofaj Yanıtı APC’den salgılanan IL-12, CD4 TH0 hücrelerinde STAT1 ve STAT4’ün (Signal Transducer and Activator of Transcription; DNA’ya bağlanarak sitokin salgılanmasından sorumlu genlerin ekspreyonunu değiştiren moleküllerdir. Bu sayede T-Yardımcı hücrelerinin farklılaşmasını sağlamaktadırlar) aktivitelerini uyarmaktadır. STAT1 ve STAT4’ün aktivitesiyle TH0 hücreleri, CD4 TH1’e dönüşmektedirler (Tamiya et al., 2011, O’Shea et al., 2011; Luckheeram et al., 2012). CD4 TH1 hücreleri, IFN-γ salgılayarak makrofajları uyarmaktadırlar. Uyarılan makrofajlar INOS (uyarılabilir nitrik oksit sentaz; Inducible Nitric Oxide Synthase) üreterek mikroorganizmaların ölümüne sebep olmaktadır. Ayrıca makrofajlar IL-12 salgılayarak daha fazla CD4 TH1 oluşmasına yol açıp immun yanıtı arttırmaktadırlar (Pier et al., 2004; Gürüz ve Delibaş, 2007). CD4 TH2 Hücreleri - B Hücre Yanıtı İmmun yanıtlarından bir diğeri ise; APC’den salgılanan IL-4, CD4 TH0 hücrelerinden STAT6’nın aktivetesini uyarmaktadır. STAT6 ise CD4 TH0 hücrelerinin TH2 hücrelerine dönüşmesini sağlamaktadır (Tamiya et al., 2011, O’Shea et al., 2011; Luckheeram et al., 2012). Dönüşen CD4 TH2 hücreleri başlıca IL-4, IL-5 ve IL-13 salgılamaktadır (Tamiya et al., 2011). CD4 TH2 hücreleri tarafından üretilen IL-4; B hücrelerinin farklılaşması ve antikor 12 üretiminde rol oynamaktadır. Ayrıca uyarılan B hücreleri insanlarda IgE ve IgG4 antikoru, farelerde ise IgG1 antikoru salgılamaktadır. Bu nedenle farelerde yapılan aşı çalışmalarında IgG1 artışı immun yanıtın CD4 TH2 yönünde olduğunun dolaylı göstergesi olarak kabul edilmektedir (Weiss and Kim, 2007; Pier et al., 2004; Owen et al., 2013). IL-4 ise mast hücrelerinin çoğalmasını uyararak immun yanıtı arttırmaktadır (Pier et al., 2004). IL-5 eozinofillerin gelişimini, farklılaşmasını kontrol ederek konağın helminth parazitlerle savaşabilmesini sağlamaktadır (Pier et al., 2004; Owen et al., 2013). IL-13 de IL-4 gibi B hücre aktivitesinde ve farklılaşmasında görev almaktadır. Ayrıca B hücrelerinden IgE antikor üretimini uyarmaktadır (Owen et al., 2013). T-Sitotoksik (TC) Hücreler ile İmmun Sistemin Aktive Edilmesi T-sitotoksik (TC) hücreler, Sitotoksik T lenfositleri (CTL; Cytotoxic T lymphocyte) olarak da bilinmektedirler. TC hücreleri MHC-I moleküllerinin sunduğu yabancı antijenleri tanımaktadırlar (Madigan ve Martinko, 2010). İntrasellüler bir patojene ait endojen antijenler APC’deki proteozomlarca peptitlerine parçalanarak MHC-I molekülü ile sunulmaktadır (Pier et al., 2004). T hücre yüzeyinde bulunan CD3, gönderdiği bir sinyalle TC hücrelerinin aktifleşmesini sağlayarak TCR’nin MHC-I-Ag kompleksiyle birleşmesini sağlamaktadır. Ayrıca TC hücresindeki CD8 koreseptörü MHC-I ile birleşerek güçlü bir kompleks oluşturmaktadır. T hücre yüzeyinde bulunan CD28 reseptörü uyarımı daha da arttırmak amacıyla APC üzerindeki CD80/86 ile birleşmektedir. Ayrıca CD8 TC hücresindeki FasL (Fas Ligandı), APC üzerindeki Fas reseptörü ile birleşerek APC’de apoptozisi (hücre ölümü) tetiklemektedir (Pier et al., 2004). Uyarılan CD8 TC hücrelerinden perforin (hedef hücrede porlar açarak hücrenin ozmotik yıkımına neden olan sitotoksik enzim), granzim (enfekte hedef hücrede kaspaz kaskadını uyararak apoptozisi başlatan serin proteaz enzimi; perforin etkisiyle oluşan porlardan hücre içine girmektedir) ve IFN-γ salgılanmaktadır. Artan IFN-γ APC’de INOS salgılanmasını sağlayarak mikroorganizmaların ölümüne sebep olmaktadır (Pier et al., 2004; Weiss and Kim, 2007; Gürüz ve Delibaş, 2007; Madigan ve Martinko, 2010). 13 Doğal Katil (Natural Killer, NK) Hücre Yanıtı Doğal Katil (NK, Natural Killer) hücreler intrasellüler patojenlere karşı savunmada özelleşmiş lenfositlerdir (Medzhitov, 2007). NK hücreler MHC-I-Ag uyarıcısı olmadan bir takım aktive edici reseptörlerle hedef hücreyi tanıyarak yok etmektedirler. Bu yüzden adları “Doğal Katil” hücrelerdir. MHC-I moleküllerinin normal seviyelerini gösteren hücreleri öldürmezler. Ancak MHC-I seviyesi azalan, artan ya da hiç olmayan hücreleri yok ederler. Hedef hücreyi yok ederken perforin, granzim salgılamaktadırlar. Böylece hedef hücre lizis ya da apoptozis ile yok edilmektedir (Madigan ve Martinko, 2010; Vivier et al., 2011) 2.2.1.2 Humoral İmmun Yanıt Humoral immun yanıtın primer efektör hücresi B lenfositleridir. B hücrelerinin aktivasyonu için iki farklı yol bulunmaktadır. Aktive olan B hücreleri ya plazma hücrelerine ya da bellekli B hücrelerine (memory B cells) farklılaşmaktadırlar (Pier et al., 2004). Bu yollardan ilkinde B hücreleri APC’ler gibi iş görmektedirler. Patojenlere ait antijenler B hücre yüzeyinde bulunan BCR’lere (B hücre reseptörü, B-cell receptor) bağlanıp endositozla içeri alınmakta ve ardından B hücre yüzeyindeki MHC-II ile TH2 hücrelerine sunulmaktadır. TH2 hücrelerinin aktive olarak ürettikleri sitokinler B hücrelerini uyararak, B hücrelerin antijene spesifik antikor üretimini yapan plazma hücrelerine dönüşerek IgM üretmelerini sağlamaktadır. Antijenle ikinci kez karşılaşmalarında ise IgM hariç diğer antikorları (IgG, IgA, IgD ve IgE) üreten bellekli B hücrelerine dönüştürmektedir (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010). Bu yollardan ikincisinde ise APC hücreleri CD4 TH hücrelerine bağlanıp B lenfositlerini uyararak bu hücrelerin plasma hücrelerine ve bellekli B hücrelerine dönüşmesini sağlamaktadır (Pier et al., 2004; Madigan ve Martinko, 2010). B hücreleri tarafından salgılanan ilk antikorlardan biri IgM’dir. IgM’nin primer immun yanıt için önemli olmasının sebebi ise IgG ile birlikte kompleman sistemi klasik yoldan aktive edip membran atak kompleksini (MAC, Membrane attack complex) oluşturmasıdır. MAC hedef hücrenin membranında büyük porlar açarak hücreyi lizise götürmektedir. Ayrıca IgM, antikor-patojen kompleksi 14 oluşturarak patojenin makrofajlar tarafından yutulmasını sağlamaktadır (Pier et al., 2004). B hücreleri tarafından üretilen, kompleman sistemi için önemli olan bir diğer immunoglobulin ise IgG’dir. IgG’nin insanlarda IgG1, IgG2, IgG3 ve IgG4, farelerde de IgG1, IgG2a, IgG2b ve IgG3 olacak şekilde 4 alt grubu bulunmaktadır. IgG antikorları virüslere ya da bakteriyel toksinlere direkt bağlanarak inaktive etmektedir (Pier et al., 2004; Owen et al., 2013). IgG alt gruplarının hepsi kompleman sistemi aktive edememektedir. İnsanlarda IgG1 ve IgG3 klasik komplemanı aktive edebilmek ve makrofajların bağlanabilmesini sağlayabilmek için birlikte çalışırken farelerde bunu sadece IgG2a yapabilmektedir. Ayrıca farelerde IgG1 ve IgE immun sistemde önemli rolü olan mast hücrelerinin patojene bağlanabilmesini sağlarken insanlarda bunu yalnızca IgE yapabilmektedir (Pier et al., 2004). Farelerde IgG1 antikor yanıtı TH2 immun yanıtını, IgG2a ise TH1 yanıtının uyarıldığını göstermektedir. TH1 immun yanıtı makrofaj aktivasyonunu, IgG2a üretimini ve IFN-γ, IL-12 ve TNF üretimini stimüle etmektedir. IgG2a ise diğer antikorlarla birlikte kompleman sistemini aktive etmektedir. TH2 immun yanıtı ise B hücrelerinden IgG1 antikorlarının üretimini stimüle etmekte, ayrıca IL-4, IL-5 ve IL-10’nun salınımını uyarmakta ve makrofaj aktivitesini azaltmaktadır (Petersen et al., 1998). 2.3 Toxoplasma gondii Hakkında Genel Bilgi 1980 yılında Levine et al. tarafından Toxoplasma sınıflandırılması yapılmıştır (Kuman ve Altıntaş, 1996). Phylum : Protozoa Subphylum : Apikomplexa Classis : Sporozoa Subclassis : Coccidia Ordo : Eucoccidiida Subordo : Eimeriina Familia : Sarcocystidae Genus : Toxoplasma Species : gondii gondii’nin 15 T. gondii ilk kez Nicolle ve Manceaux tarafından 1908 yılında tanımlanmıştır. Nicolle ve Manceaux bu paraziti ilk defa Ctenodactylus gundi adlı Kuzey Afrika kemirgeninde saptamışlardır. T. gondii adını morfolojik yapısı (toxo: yay; plasma: yaşam, görüntü) ve bulunduğu kaynağın adından (C. gundi) yola çıkarak almıştır (Weiss and Kim, 2007; Weiss and Dubey, 2009). İnsanlarda ilk kez 1923 yılında Prag’lı bir oftalmolog olan Janku tarafından bir bebeğin retinasında kistlerin bulunması ile saptanmıştır. Türkiye’deki ilk insan olgusu ise Unat, Alyanak ve Şahin tarafından 1953 yılında saptanmıştır (Kuman ve Altıntaş, 1996). 1972 yılında Ankara’daki bir vakada konjenital toxoplazmozisli bir hastanın Beyin-Omurilik sıvısından parazit izole edilmiş ve izole edilen suşa Ankara suşu adı verilmiştir (Döşkaya et al., 2013). 2.3.1 Morfolojisi ve Yaşam Döngüsü T. gondii tüm sıcakkanlı hayvanları ve kuşları enfenkte edebilen bir zorunlu hücre içi parazitidir (Nabi et al., 2014). T. gondii yaşam döngüsü (Şekil 2.2) boyunca 3 farklı enfektif form şeklinde bulunmaktadır. Bunlar; akut enfeksiyon boyunca görülen takizoit, kronik enfeksiyonda görülen bradizoit (doku kisti oluşturur) ve çevreye yayılmış halde bulunan içinde sporozoitleri barındıran ookist formudur. Takizoitler ve bradizoitler aseksüel üreme sonucu haploitken (n kromozom sayısı), sadece seksüel üreme sonucu oluşan diploit, ookistler (2n kromozom sayısı) mayoz geçirerek haploit sporozoitleri oluşturmaktadır (Sibley et al., 2009) Ookist; sadece kesin konak olan kedinin ince bağırsağında oluşan formdur. Eşeyli üreme ile 10-12 µm çapında oval ookistler oluşmaktadır. Kedi dışkısı ile dış ortama atılan bu ookistler enfektif değildirler. 1-21 gün içinde dış çevrenin ısı ve oksijen miktarına bağlı olarak sporule olarak enfektif hale gelmektedirler. Enfektif hale gelen ookistlerin içinde 6×8 µm boyutlarında iki tane sporokist bulunmaktadır. Her bir sporokist 4 adet sporozoit içermektedir. Sporozoitlerin ise takizoitlere farklılaştığı ve buradan çoğalarak diğer dokulara dağıldığı belirtilmektedir. Ookistlerin nemli toprakta 18 ay boyunca canlı kalabildiği ve akut enfeksiyon sırasında 7-21 gün süresince 10 milyon kist/gün atılabildiği belirtilmiştir. Bu sebeple ookistler, dolayısıyla kediler enfeksiyonun yayılmasında en önemli yerde bulunmaktadırlar (Montaya and Liesenfeld, 2004; Dubey, 2010). 16 Takizoit; genellikle hilal şeklinde ve 2×6 µm boyutlarında, parazitin hızlı çoğalan, ara konakların nükleuslu hücrelerinde görülen formdur. Takizoitler aktif penetrasyon, fagositoz ya da kimyasal etkileşim ile hücre içine girmektedir. Hücre içine girdikten sonra parazitofor vakuolu (PV) ile kendisini çevreleyerek konak immun sisteminden korunduğu belirtilmektedir. Daha sonra burada sürekli çoğalıp konak hücreyi patlatarak komşu hücreleri işgal ettikleri, bir kısmının ise fagosite edilerek kan ve lenf yoluyla sinir sistemi, göz, iskelet, kalp kası ve plasenta gibi dokulara yayıldığı belirtilmektedir. Bu dokulardaki takizoitler konak immun sisteminden korunabilmek için bradizoitlere dönüşerek aktif enfeksiyondan kronik enfeksiyonu başlatan doku kistlerine dönüşmektedirler (Dubey et al., 1998; Montaya and Liesenfeld, 2004). Bradizoit ve Doku kistleri; enfeksiyonun başlamasında ortalama 14 gün sonra hücre içinde bulunan takizoitlerin konak immun sisteminin baskısından dolayı daha yavaş bölünen bradizoitlere dönüşmesiyle oluşmaktadır. Doku kistlerinin çapı 5-20 µm aralığında ve içlerinde ortalama 1000-3000 kadar bradizoit bulundurabilmektedirler. Bradizoitler ara konaklarda konak immun sistemine bağlı olarak takizoitlere dönüşerek reaktivasyona neden olabilmektedir (Dubey et al., 1998). Şekil 2.2 T. gondii yaşam döngüsü (Ferguson, 2004) 17 T. gondii’nin kompleks bir yaşam döngüsü vardır. T. gondii’nin kedi veya kedigiller dışında sıcakkanlılar (ara konaklar) olmak üzere iki farklı yaşam döngüsü bulunmaktadır. Bu yaşam döngüleri arasında ise iki farklı geçiş bulunmaktadır (Şekil 2.2’deki kırmızı oklar parazitin konaklar arasındaki geçişini, siyah oklar ise konak içi gelişimini göstermektedir.). İlkinde kesin konak kedilerde oluşan ookistlerin yutulmasıyla, diğerinde ise kronik olarak enfekte olan ara konaklarda oluşan doku kistlerinin yutulmasıyla gerçekleşmektedir. Kesin konak olan kedilerdeki seksüel gelişim ile ince bağısak epitelinde ookist gelişmekte ve dış ortama atılmaktadırlar. Ookistler uygun çevre koşullarında sporule olarak su ve besinlerle (iyi yıkanmamış, pişmemiş ya da az pişmiş sebzeler) ara konak tarafından alınarak enfeksiyon gerçekleşmektedir. T. gondii ara konaklarda (fare, koyun, keçi, insan, kuş) sadece aseksüel olarak çoğalmaktadır. Takizoitlerin oluşturduğu akut enfeksiyonu, bradizoitlerin oluşturduğu kronik enfeksiyonu takip ederek ara konağın beyin ve kas dokusunda kist formuna dönüşmektedir. Bu doku kistlerinin yutulması enfeksiyonu diğer etobur ara konaklara veya kedilere bulaştırmaktadır. Ayrıca gebelik sırasında geçirilen akut enfeksiyon sırasında parazitin plasentayı geçerek fetüsu da enfekte edebildiği bildirilmiştir (Ferguson, 2004). 2.3.2 Toksoplazmozis T. gondii memelileri ve kuş türlerini enfekte edebilen bir zoonotik protozoondur. Oluşturduğu hastalığa “toksoplazmozis” adı verilmektedir. Hayvanlarda toksoplazmozis dünya çapında büyük ekonomik öneme sahiptir. Çünkü toksoplazmozis çiftlik hayvanlarında keçi ve koyunlarda düşüklere ya da ölü doğumlarına neden olmaktadır. Hayvanların etlerinde bulunan doku kistlerinin alınmasıyla (pişmemiş ya da az pişmiş etlerin yenmesiyle) insanları da enfekte etmektedirler (Beghetto et al., 2005). İnsanlarda bulaş, genelde kedi dışkısı ile atılan ookistlerle kontamine olmuş su veya besinlerin alımı, doku kisti içeren az pişmiş ya da çiğ etlerin yenmesi (domuz, koyun, keçi, geyik) ile gerçekleşmektedir (Aramini et al., 1999; Aspinall et al., 2002; Arisue and Hashimoto, 2014). Bir başka bulaş yolu ise organ transplantasyonlarında oluşmaktadır. Enfekte donörden alınan kalp, akciğer, böbrek, karaciğer, pankreas gibi organların nakilleri sırasında enfeksiyonun alıcıya bulaştığı bildirilmektedir. Konjenital toksoplazmozis ise, gebelik sırasında enfekte olan anneden plasenta yoluyla 18 bebeğe T. gondii’nin bulaşmasıdır. Erken dönemlerde oluşan enfeksiyonlar bebeklerin ölümüne ya da düşüklerin oluşmasına neden olmaktadır. Geç dönemlerde oluşan enfeksiyonlar ise hasarın daha az oluşmasına ya da %85 oranında erken doğum riski ile sonuçlanmaktadır (Montaya and Liesenfeld, 2004). Toksoplamozis immun sistemi sağlam kişilerde genellikle asemptomatik olarak ilerlemektedir. Bu kişilerde hafif ateş, baş ağrısı, halsizlik gibi belirtiler görülmektedir. Çok seyrek olarak hastalarda ağır tablolar gözlemlenmektedir (Montaya and Liesenfeld, 2004; Gürüz ve Delibaş, 2007). İmmun sistemi baskılanmış veya immun yetmezliği olan kişilerde (AIDS hastaları, Hiper IgM sendromu olan kişiler, kanser tedavisi gören kişiler, immun sistemi baskılayan ilaçlar kullanan transplant hastaları) hayatı tehdit eden, tedavi edilmeyen kişilerde ise ölümle sonuçlanan durumlara yol açmaktadır (Montaya and Liesenfeld, 2004; Dupont et al., 2012). Son zamanlarda yapılan araştırmalarda toksoplazmozisin kişilik bozuklukları ya da davranışların değişmesi gibi bir takım psikolojik bozukluklara/anomoliklere yol açtığı da rapor edilmektedir. Yapılan bir araştırmada enfekte farenin davranışlarını değiştirerek parazitin ana konağı olan kediye aktarılma olasılığını arttıran, av olmasına neden olacak davranışlar sergilediği gözlemlenmiştir. Toksoplamozisin yayılmasındaki kilit faktör kediler olarak görülmektedir. Kedilerin insanlarla olan yakın ilişkileri ve dışkılarında bulunan ookistler çevreyi ve insanları kontamine etmede önemli role sahip olduğu düşünülmektedir (Garcia et al., 2014). 2.3.3 T. gondii Enfeksiyonuna Karşı Gelişen İmmun Yanıt Konakta T. gondii’nin yol açtığı enfeksiyona karşı konağı parazitin patolojik etkilerinden koruyan hem hücresel hem de humoral immun yanıt uyarılmaktadır. Gelişen immun yanıttan dolayı takizoitler kendini korumak için bradizoite dönüşerek kist içinde saklanmaktadır (Denkers, 2003). Hem parazitik enfeksiyonu engellemek hem de ookistlerin oluşmasından kaynaklı re-enfeksiyonun önüne geçebilmek için yapılan aşı çalışmalarında oluşan immun yanıtın detayları çok büyük önem taşımaktadır. T. gondii enfeksiyonunun kontrolünde görevli en önemli immun yanıt elemanları CD4 TH hücreleri, CD8 TC hücreleri ve B hücrelerdir. T hücreleri hem 19 enfeksiyonun yayılmasının engellenmesi hem de immun yanıtın oluşması aşamalarında büyük önem taşımaktadır (Pier et al., 2004). Fagositoz ile APC içine alınan T. gondii antijenleri işlendikten sonra MHCII ile birleşerek hücre yüzeyinde sunulmaktadır (Şekil 2.3). T hücre yüzeyinde bulunan CD3 koreseptörü ile uyarılan CD4 TH0 hücreleri TCR-(MHC II-Ag) kompleksi oluşturmak için aktifleşmektedir. Aynı zamanda T hücre yüzeyinde bulunan CD28 reseptörü ile APC yüzeyinde bulunan CD80/86 ile bağlanarak T H0 uyarımını arttırmaktadır. Ayrıca APC üzerinde bulunan CD40 ile de T hücrelerinde bulunan CD40L reseptörü birleşerek bu uyarımı arttırmaktadır. APC’den salgılanan IL-12 TH0 hücrelerinin TH1 hücrelerine dönüşmesini sağlamaktadır. CD4, TH1 hücrelerinden salgılanan IFN-γ, makrofajları ve NK (Natural Killer, Doğal katil hücreler) hücrelerini uyararak hücresel immun yanıtı aktifleştirmektedir. Uyarılan makrofajlar ayrıca IL-12 salgılayarak daha fazla CD4 TH1 oluşmasını sağlayıp hücresel immun yanıtı güçlendirmektedir (Weiss and Kim, 2007). Şekil 2.3 T. gondii’ye karşı oluşan CD4 T lenfosit immun yanıtı (Weiss and Kim, 2007) 20 T. gondii’ye ait endojen antijenler ya da parazite ait yüzey proteinleri proteozomlar tarafından peptitlere parçalanarak MHC-I ile hücre yüzeyine sunulmaktadır (Şekil 2.4). T hücre yüzeyindeki CD3’ün gönderdiği sinyalle TC hücreleri aktifleşerek TCR-(MHC-I-Ag) kompleksini oluşturmaktadır. TC hücresinde bulunan CD8 koreseptörü MHC-I’e tutunarak güçlü bir kompleks oluşturmaktadır. T hücre yüzeyinde bulunan CD28 reseptörü uyarımı daha da arttırmak amacıyla APC’deki CD80/86 ile birleşmektedir. Uyarılan CD8 TC hücrelerden perforin ve granzim gibi APC için sitotoksik moleküller salgılamaktadır. Aynı zamanda CD8 TC hücrelerinden salgılanan IFN-γ, APC’den INOS salgılanmasını uyararak mikroorganizmaların ölümüne neden olmaktadır. CD8 TC hücresindeki FasL, APC üzerindeki Fas ile birleşerek APC’de apoptozisi tetiklemektedir (Pier et al., 2004; Filisetti and Candolfi, 2004; Weiss and Kim, 2007). Şekil 2.4 T. gondii’ye karşı oluşan CD8 T lenfosit immun yanıtı (Weiss and Kim, 2007) 21 T. gondii’ye karşı gelişen humoral immun yanıtta ise enfeksiyondan sonraki ilk haftada yani akut dönemde farklılaşan plazma hücreleri tarafından üretilen ilk antikor IgM’dir. Bu immunoglobülin kompleman sistem için en iyi aktivatördür. IgG ve alt grupları ise toksoplazmoziste görülen ikinci antikordur. Bu antikor da ya kompleman sistemin aktivasyonuyla hücreyi sitolizise ya da antikor-bağımlı sitotoksisiteye (ADCC, Antibody-dependent cell mediated cytotoxocity) neden olarak makrofajların veya polinüklear hücrelerin aktivasyonuna neden olmaktadır. Sonuç olarak antikor ekstrasellüler takizoitlerin lizisinde, kompleman sistemin aktifleşerek takizoitlerin çoğalmasının engellenmesinde, makrofajları aktive ederek fagositozun artmasında görev almaktadırlar (Filisetti and Candolfi, 2004). Tüm bu immun sistem yanıtları göz önüne alındığında, T. gondii’ye karşı geliştirilen koruma sağlayacak bir aşının CD4 TH1 ve özellikle IFN-γ salgılayan CD8 TC lenfositleri uyarması beklenmektedir (Gülçe İz et al., 2014). 2.3.4 T. gondii’ye Ait Antijenik Proteinler Bir aşının gelişimindeki en önemli aşama immun sistem uyarmada rol alan moleküllere odaklanmaktır (Liu et al., 2006). Genel olarak çalışmalarda bu moleküllerin/proteinlerin salınımından sorumlu 3 ana organele odaklanılmaktadır. Bunlar mikronem, roptri, yoğun granüllerdir (Şekil 2.5). Endoplasmik reticulum Yoğun Granül (GRA) Roptri (ROP) Mikronem (MIC) Nükleus Golgi cisimciği Mitokondri Şekil 2.5 T. gondii takizoiti (Ajioka et al., 2014) Bunların içinde mikronem proteinleri konak hücreye tutunmada, parazitin invazyonunun en erken aşamasında görev almaktadır. Roptri proteinleri invazyon boyunca salınmakta ve parazitofor vakuol (PV) oluşturarak konak hücrenin 22 endosom/lizozomlardan gelecek lizozomal enzimlerinden korunmasını sağlamaktadır. Yoğun-granül proteinleri ise PV ortamını modifiye ederek parazitin çoğalması ve intrasellüler yaşamı için PV’ün oluşumu sırasında ve sonrasında PV içine salgılanmaktadır (Şekil 2.6) (Weiss and Kim, 2004; Ajioka et al., 2014). T. gondii ROP Konak hücreye bağlanma sırasında mikronem (MIC) protein salınımı GRA Aktif penetrasyon ve roptri (ROP) protein salınımı sonucu invajinasyon çukuru oluşumu MIC Parazitofor vakuol (PV) oluşumu Mikronem proteinleri PV içine girmez M Parazit PV içine girer PV etrafında konak hücreye ait mitokondri (M) ve endoplazmik retikulum (ER) bulunur Yoğun granül (GRA) içeriği PV içine salgılanır ER Şekil 2.6 T. gondii takizoitinin konak hücreye invazyonu (Kim, 2004) Yapılan çalışmalarda, immun yanıtın oluşmasına neden olan genellikle 4 ana antijenik protein ailesi üzerine odaklanılmaktadır. Bunlardan bilinen/tanımlanan antijenler yüzey antijenleri (SAG, surface antigen), mikronem antijenleri (MIC, microneme antigen), roptri antijenleri (ROP, rhoptry antigens) ve yoğun granül ekskretuvar-sekretuvar antijenleri (GRA, dense granule excreted-secreted antigen) olarak gösterilmektedir (Beghetto et al., 2005). T. gondii üzerinde yer alan yüzey antijenleri (SAG), konak hücreye ilk tutunmayı gerçekleştiren proteinlerdir. Bu proteinler T. gondii’nin konak hücreye ait ligandlara tutunması ve invazyonun en erken aşamalarında rol almaktadır. T. gondii’ye ait yüzey antijenlerin (SAG) süperailesinde 5 adet protein rapor edilmektedir. Bunlar SAG1, SAG2 (22 kDa), p23, p35 ve SAG3 (45kDa) olarak gösterilmektedir (Liu et al., 2006). Bu proteinler içinde en iyi karakterize edilen SAG1 proteinidir. Tüm T. gondii suşlarında korunmuş, yüksek miktarda antikor 23 uyarabilen ve takizoitlerdeki ana yüzey antijeni olarak gösterilmektedir. Bu yüzden özellikle DNA aşı çalışmalarında, tanı çalışmalarında SAG1 geni veya SAG1 proteini tercih edilmektedir (Liu et al., 2006; Wang and Yin, 2014). Konak hücreye bağlanma, tutunmada görevli bir diğer protein grubu ise mikronem proteinleridir (MIC). Bu proteinlerin konak hücreyle teması sonrası bol miktarda salgılandığı belirtilmektedir. Bu proteinler genellikle transmembran proteinlerdir. Bu proteinlerden MIC2 konak hücreye tutunmada ve parazitin hareketinde görev almaktadır. MIC1, MIC6 ve MIC4 parazitin invazyonunda hücre içi virulanslığında rol oynamaktadır. MIC8 ve MIC3 parazitin kayma hareketinden ve invazyonun tamamlanmasından sorumlu proteinler olarak gösterilmektedir. AMA1 proteini ise konak hücreye tutunmada görev almaktadır. Yokluğunda parazitin konak hücreye tutunmasında, hareketinde ve roptri proteinlerin salgılanmasında eksiklikler görülmektedir (Sheiner et al., 2010). Tanımlanan ROP proteinlerinden ROP2, ROP3, ROP4 ve ROP7 antijenik proteinleri PV membranının konak hücre tarafında kalacak şekilde yerleşerek konak ve parazitin biyokimyasal etkileşiminde rol almaktadır. Takizoitin konak hücreye penetrasyonundan sonra PV form değiştirip yeni bir forma dönüşmektedir. Bu sırada takizoitten GRA1, GRA2, GRA3, GRA4, GRA5 ve GRA6 olmak üzere birçok GRA antijenik proteinleri salgılanmaktadır. GRA proteinlerinin salgılanması ve PV modifikasyonu konak hücre sitoplazması tarafından parazitin yabancı olarak görülmemesine ve bu durumda parazitin çoğalmasına neden olmaktadır (Dubey et al., 1998). Ookistler enfeksiyonun yayılmasında kilit rol oynamaktadır. T. gondii ookistlerinin uygulanan dezenfektanlara, UV ışınlarına diğer coccidian parazitlerine göre daha dayanıklı olduğu gösterilmektedir. Fakat bu dayanıklılığın sebebi bilinmemektedir. Ookist duvarı çok katmanlı olup, sporozoitlerin gelişmesi için gerekli gaz değişimlerine izin verecek yapıdadır. Ookistte tanımlanan antijenik proteinler ookist duvarında gözlenmektedir. Ookist duvarında sentezlenen proteinler TgOWP1, TgOWP2, TgOWP3, TgOWP4, TgOWP5, TgOWP6 ve TgOWP7 olarak bildirilmiştir (Posenti et al., 2010). Takizoitlerin bradizoite dönüşmesini sağlayan aynı zamanda mitokondriyal inhibitörler, makrofajlardan salınan Nitrik Oksit (NO) gibi paraziti stres unsurlarından koruyan HSP30 (Isı şok proteini, Heat shock protein,) olarak da bilinen BAG1 antijenik proteinin varlığı T. gondii için önem taşımaktadır. Ayrıca 24 iyi bir aşı adayı olarak da gösterilmektedir (Dubey et al., 1998). Bradizoite özgü MAG1, SAG2D, SAG2C, SAG4, BSR4, LDH2, ENO1 ve p-ATPaz proteinleri de aşı adayı olarak gösterilen proteinlerdir. Doku kisti formuna özgü tanımlanan CST1 ve MAG1 antijenik proteinleri de aşı adayı olarak gösterilmektedir (Lyons et al., 2002; Cristina et al., 2004). Şu ana kadar T. gondii’ye karşı koruyucu bir aşı geliştirlememiştir. Bunun nedenlerinden bir de yapılan aşı denemelerinin sadece tanımlanan antijenik proteinlerle sınırlı olmasından kaynaklanmaktadır (Leclerc, 2003). Aşı çalışmalarında kullanılacak olan yeni/farklı antijenik proteinlerin koruyucu bir aşının geliştirilmesine olanak sağlayabileceği düşünülmektedir. T. gondii’de toplam 43.010 ekzona ait 8.155 protein kodlanmaktadır (Liang et al., 2011). Rekombinant protein aşılarının ya da DNA aşılarının geliştirilmesinde karşılaşılan en büyük zorluk, antijenik proteinlerin seçimidir. T. gondii genomu düşünüldüğü zaman etkili bir immun yanıt oluşturabilecek antijen/lerin saptanmasında protein mikroarray taraması gibi ileri teknikler gerekmektedir (Davies et al., 2005). 2.4 Aşı Adayı Antijenik Proteinlerin Belirlenmesi Aşı geliştirmede en kritik nokta antijen keşfi ve doğru antijenin kullanılmasıdır (Leclerc, 2003). İlk aşı çalışmalarında T. gondii eriyik proteini ya da organizmanın ölü/zayıflatılmış olarak tamamı kullanılmıştır. Gelişen teknolojiyle yeni antijenik proteinler belirlenmektedir. Bu çalışmalar arasında başta rekombinant protein/DNA teknolojileri, biyoinformatik yöntemler, mikroarray teknolojileri gelmektedir (Henriquez et al., 2010; Liang et al., 2011; Correia et al., 2014; Garcia et al., 2014). Bu yöntemlerden geliştirilen “epitop tabanlı aşılar” biyoinformatik yöntemlerin kullanılarak patojenin genomunda bulunan antijenik proteinlerin üzerindeki epitop bölgelerinin seçimine dayanmaktadır (Correia et al., 2014). Bu yönteme benzer bir başka yaklaşım ise protein mikroarrray kullanılarak gerçekleştirilen high-throughput (yüksek işlem hacimli) antijen keşfi yöntemidir. Bu yöntemde de patojenin genomunda antijenik olabilecek proteinler seçilmektedir. Son yapılan çalışmalardan birinde T. gondii 43010 ekzonu biyoinformatik yöntemlerle incelenmiş ve aşı hedefi olarak 1387 gene ait 2870 ekzon seçilmiştir. Eksonların eksprese ettiği rekombinant proteinler mikroarray taramasında insan serumları ile karşılaştırılmış ve T. gondii’ye karşı aşı 25 çalışmalarında koruyucu olabilecek IgG ile bağlanan 186 ve IgM ile bağlanan 108 adet hedef antijen belirlenmiştir (Liang et al., 2011, Felgner et al., 2015). 2.5 Toksoplazmozise Karşı Geliştirilen Aşı Çalışmaları T. gondii’ye karşı yapılan ilk aşı çalışmaları 1980’li yılların başına dayanmaktadır (Dubey, 2008). T. gondii S48, TS-4 ve T-208 mutant suşları aşı adayı olarak tanımlanmıştır. S48 canlı suşundan elde edilen ToxovaxTM (Schering-Plough Animal Health Ltd, Yeni Zelanda) aşısı lisans alarak, ticari kullanıma sunulan tek toksoplamozis aşısıdır (Bhopale, 2003; HıszczyńskaSawicka et al., 2014). Bu canlı aşı mutasyona uğratılarak bradizoit olma özeliğini kaybetmiş suştur. Fakat yine de canlı olması ve re-enfeksiyona neden olabilmesinden dolayı insanlarda kullanılmamaktadır (Innes et al., 2009). Canlı aşı dışında aşı çalışmalarında immunojenik parazit ekstraktları, antijenik proteinleri kodlayan DNA’lar ve rekombinant proteinler kullanılmıştır. İmmunojenik protein ekstraktlarının kullanıldığı aşılarda parazitin takizoit formunun (Doğal enfeksiyonlarda parazitin konak hücreye girme anından itibaren immun sistemi en çok uyaran antijenlerin takizoit formunda bulunmasından dolayı takizoit formu tercih edilmiştir) ekstraktının kullanılmasıyla elde edilen bir aşı türüdür. Fakat canlı/zayıflatılmış aşılar kadar başarılı olunamamıştır (BrunaRomero et al., 2012; Hıszczyńska-Sawicka et al., 2014). Stanley et al. (2004) yaptığı çalışmada T. gondii takizoitlerini nanopartiküller içinde kapsülleyerek mukozal aşılama startejisiyle koyunlara vermişlerdir. Koyunlar intranasal yoldan aşılanmış ve ookistlerle enfekte edilmişlerdir. Sonuçta hem hücresel hem de güçlü mukozal IgA antikor yanıtları gözlenmiştir. Buna karşın korunma gözlenmemiştir (Hıszczyńska-Sawicka et al., 2014). Parazit ekstrakt aşılarında, verilen ekstrakt içinde immun sistem aktivatörlerini ortadan kaldıran ya da baskılayan farklı hücresel yapıların da veriliyor olunması bu aşıların yeteri kadar koruyucu olmamasının nedeni olarak düşünülmektedir (Bruna-Romero et al., 2012). Zayıflatılmış aşılar immun sistemi baskılanmış ya da immun sistem yetmezliği bulunan kişilerde virülant forma dönerek hastalığa neden 26 olabilmektedirler. İnaktive edilmiş patojenin tamamının kullanıldığı aşılar ise reaktojenik bileşenleri içerebileceği için istenmeyen yan etkiler yaratabilmektedir. Bu yüzden aşı çalışmalarında yeni yaklaşımlar denenmeye başlanmıştır. Bunlar rekombinant protein aşıları, DNA aşıları ve sentetik peptit aşı çalışmalarıdır (Singh and O’Hagan, 1999). Son 5 yıla ait deneysel aşı çalışmaları araştırıldığı zaman %52’sini DNA aşı çalışmalarının, %36’sının rekombinant protein aşı çalışmalarının, %9’unun zayıflatılmış aşı çalışmaları ve %3’ünü ise heterolog aşı çalışmalarının oluşturduğu görülmektedir (Lim and Othman, 2014). Bunun sebebi ise DNA aşılarının üretilmesinin uyarmasındandır. kolaylığı ve özellikle hücresel immun yanıtı 2.5.1 T. gondii’ye Karşı Geliştirilen DNA Aşıları Wolff et al. (1990) yılında ilk kez çıplak DNA’yı memeli kas hücrelerine enjekte ederek protein ekspresyonunu sağlamıştır (Crampton and Vanniasinkam, 2007). DNA aşıları, hedef olarak seçilen antijenik proteini kodlayan gen bölgesinin uygun bir vektöre yerleştirilerek konak hücreye verilmesiyle oluşturulmaktadır. DNA aşılarının en önemli avantajı verildiği hücrede TH1 veya TH2 immun yanıtları oluşturmasıdır (Hıszczyńska-Sawicka et al., 2014). Toksoplazmozise karşı yapılan DNA aşılarının enfeksiyonu sınırlayabilmek için IFN-γ ve IL-2 sitokinleri üreterek genelde TH1 yanıtı oluşturduğu gözlenmiştir (Lim and Othman, 2014). DNA aşılarının en büyük dezavantajı ise farelerde yeterli immun yanıt oluştururken primatlar ve insanlarda genellikle yeterli immun yanıt oluşturamamasıdır (Bruna-Romero et al., 2012; Lim and Othman, 2014). Bunun nedeni üretilen antijen miktarının azlığına, verilen plazmit DNA’nın hücrelere düzensiz dağılımına ve immun yanıtın yeterince uyarılamamasına bağlanmaktadır (Bruna-Romero et al., 2012). Bu sorunları ortadan kaldırmak için kodon optimizasyonu, sitokinlerin koekspresyonu, moleküler adjuvantların ya da adjuvant gibi immunomodülatör moleküllerin formüle edilerek mikropartikül/lipozom içinde verilmesi, çoklu antijenlerin kullanılarak aynı anda verilmesi gibi stratejiler test edilmektedir (Bruna-Romero et al., 2012; Lim and Othman, 2014). 27 T. gondii’ye karşı geliştirilen DNA aşı çalışmaları Çizelge 2.3’te özetlenmiştir. Vercammen et al. (2000) T. gondii’nin bradizoit ve takizoit formlarına özgü antijenleri kullanarak formla sınırlı korumayı ortadan kaldırmayı hedeflemiştir. Çalışma sonucunda ise immun yanıtta uyarılma ve korunma sürelerinde uzmala olduğunu rapor etmiştir. Hem hücresel hem de humoral yanıtı uyarabilmek için T. gondii’ye ait farklı formlara özgü 6 antijenik epitopun kullanıldığı multi-epitop DNA aşısında güçlü bir immun yanıtın uyarıldığı belirtilmiştir.(Liu et al., 2009). Khosroshahi et al. (2011) SAG1 ve ROP2 proteinlerini kodlayan plazmitleri kullanarak kokteyl bir DNA aşısı oluşturmuştur. Her forma özgü ayrı antijenik proteini kullanmaktansa, her formda salgılanan antijenlerin kullanıldığı kokteyl bir DNA aşısının korunmayı arttırdığını belirtmiştir. Yaptığı çalışmayla oluşan korunmanın oldukça yükseldiğini rapor etmiştir. Bradizoit formuna özgü antijenlerin kullanıldığı bir başka multivalan aşı çalışmasında, toksoplazmozis enfeksiyonu sırasında bradizoit formunun esas rol oynadığını düşünerek bu forma özgü SAG2C, -2D, -2X, -2Y antijenleri kullanılmıştır. Çalışma sonucunda immun yanıtta uyarılma ve kronik enfeksiyona karşı korunma gözlediği rapor edilmiştir (Zhang et al., 2013). İlgi çekici araştırmalardan bir tanesi ise T. gondii’nin takizoit formuna özgü SAG1, GRA1, ROP2, GRA4 ve ayrıca bradizoit formuna özgü SAG2C ve SAG2X proteinlerinin epitop bölgelerini içeren bir multi-epitop DNA aşı çalışmasıdır. Bu çalışmada güçlü immun uyarılma ve yüksek oranda korunma sağlandığı belirtilmiştir. (Cong et al., 2014). Son yıllarda toksoplazmozise karşı yapılan DNA aşı çalışmalarında kullanılmak üzere birçok farklı/yeni antijenlerle çalışılmaktadır. Bu çalışmalarda da immun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama ve beyin kistlerinde azalmalar saptanmıştır (Zhang et al., 2013; Chen et al., 2013a; Chen et al., 2013b; Gong et al., 2013; Zhang et al., 2014; Hassan et al., 2015). 28 Çizelge 2.3 T. gondii’ye karşı geliştirilen DNA aşıları Aşı adayları Adjuvant Aşılama Yolu Sonuçlar Yazar Yıl SAG1 kodlayan plazmit SAG1 kodlayan plazmit GRA1, GRA7, ROP2 kodlayan plazmitler - i.m. i.m. i.m. % 80–100 koruma Beyin kistlerinde % 71 azalma Değişik gruplarda fare yaşam oranı % 50–90 Nielsen et al. Angus et al. Vercammen et al. 1999 2000 2000 ROP2 kodlayan plazmit - i.m. 2 gün fazla korunma Leyva et al. 2001 SAG1 ve ROP2 kodlayan plazmitler - i.m. Kokteyl aşı uygulanan farelerde 9–12 gün yaşam süresi Fachado et al. 2003 GRA1kodlayan plazmit - i.m. RH suşuna karşı % 75–100 korunma Scorza et al. 2003 SAG1 kodlayan plazmit - i.m. Beyin kistleri azalırken, Materno-fötal bulaşı engellemede başarısız Couper et al. 2003 HSP70, HSP30 ve SAG1 kodlayan plazmitler - g.t./i.m./i.p. En iyi kısmi koruma HSP70 ile sağlanmıştır Mohamed et al. 2003 MIC3 kodlayan plazmit pGM-CSF i.m. Beyin kistlerinde % 67–74 azalma Ismael et al. 2003 SAG1/2 kodlayan plazmit Vet L-10 i.p. Enfeksiyon sonrası yaşam oranı % 73 Yang et al. 2004 BAG1 ve MAG1 kodlayan plazmit - i.m. Beyin kistlerinde % 62 azalma Nielsen et al. 2006 GRA1 kodlayan plazmit, rGRA1 proteini Provax i.m. rGRA1 protein aşısı GRA1 kodlayan DNA aşısına göre daha iyi Döşkaya et al. 2007 GRA1, GRA7 ve ROP2 kodlayan plazmit karışımı - i.m. Akut toxoplazmozise karşı % 89 koruma, beyin kistlerinde azalma Jongert et al. 2007 ROP2 kodlayan mikobakteriyel ekspresyon plazmiti s.c. Kontrol grubuna göre ölüm zamanında gecikme Wang et al. 2007 MIC2, M2AP, AMA1, BAG1 kodlayan plazmitler - g.t. Kısmi korunma (% 12,5-60 aralığında değişen koruma) Dautu et al. 2007 SAG1 ve ROP2 kodlayan plazmitler IL-12 i.m. RH suşuna karşı belirgin korunma Zhang et al. 2007 GRA1 ve GRA7 kodlayan plazmitler - i.d. Belirgin immun yanıt uyarılmış (humoral ve hücresel) Jongert et al. 2008 MIC6 kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama Peng et al. 2009 MIC3 kodlayan plazmit GRA1,GRA2,GRA4 ve SAG1 kodlayan plazmit SAG1 eksprese eden baculovirus CpG-ODN - i.m. i.m. i.m Korunma zamanında uzama İmmun yanıtta uyarılma, %40-100 korunma Korunma zamanında uzama Fang et al. Liu et al. Fang et al. 2009 2009 2010 GRA7 kodlayan plazmit Lipozom i.m. Belirgin immun yanıt uyarılmış Hiszczynska et al. 2010 MIC8 kodlayan plazmit - i.m. RH suşuna karşı korunmada uzama Liu et al. 2010 SAG1 kodlayan plazmit IL-18 i.m. RH suşuna karşı % 60 korunma Liu et al. 2010 SAG2 eksprese eden influenza ve adenovirüs - i.n. Beyin kistlerinde %85 azalma Machado et al. 2010 i.m.: İntramuskuler, kas içine; i.p.: İntraperitoneal, periton içine; s.c.: Subkutan, derialtına; i.n.: İntranazal, burun içine; i.o: İntraoral, ağız içine; i.d. İntradermal, deri içine; g.t.: Gen tabancası 29 Çizelge 2.3 T. gondii’ye karşı geliştirilen DNA aşıları (devam) Aşı adayları Adjuvant Aşılama Yolu Sonuçlar Yazar Yıl HSP70 kodlayan plazmit - g.t. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Kikumura et al. 2010 Rop16 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Yuan et al. 2011a ROP18 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Yuan et al. 2011b RON4 kodlayan plazmit ve rRON4 proteini Freund i.m. İmmun yanıtta uyarılma olmasına rağmen korunma sağlanamamış Rashid et al. 2011 SAG1 ve ROP2 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Khosroshahi et al. 2011 HSP70 kodlayan plazmit - g.t. İmmun yanıtta uyarılma ve kist sayısında azalma Makino et al. 2011 TgPLP1 kodlayan plazmit IL-18 i.m. Korunma zamanında uzama Yan et al. 2011 GRA6 kodlayan plazmit Levamisole i.m. Kısmi koruma ( %53,3) Sun et al. 2011 TgIMP1 kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama Cui et al. 2012 SAG1 ve MIC3 kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama Fang et al. 2012 GRA1 ve SAG1 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, RH suşuna karşı korunmada uzama Wu et al. 2012 GRA7 ve ROP1 kodlayan plazmit IL-12 i.m. İmmun yanıtta uyarılma, kist sayısında azalma ve korunma zamanında uzama Quan et al. 2012 ROP13 kodlayan plazmit IL-18 i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama, kistlerde azalma Wang et al. 2012 SAG1 ve 14-3-3 proteini kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama Meng et al. 2012 SAG1 ve GRA2 kodlayan plazmit pSPreS2 i.m. RH suşuna karşı kısmi koruma Zhou et al. 2012 TgAMA1 kodlayan plazmit ve adenovirüs vektörü - i.p. Beyin kistlerinde %23 azalma, %50 korunma Yu et al. 2012 TgROM1 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Li et al. 2012 TgPLP1 ve MIC6 kodlayan protein IL-18 i.m. İmmun yanıtta uyarılma, Beyin kistlerinde %65,43 azalma - i.m. Korunma zamanında uzama SAG1 Ve SAG3 kodlayan plazmit CTXA2/B i.m. İmmun yanıtta uyarılma, %40 korunma Yan et al. Parthasarathy et al. Cong et al. 2012 ROP8 kodlayan plazmit GRA4 kodlayan plazmit ve GRA4 sentetik peptit - i.m. %40 korunma Meng et al. 2013 MIC13 kodlyan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama, %57.14 beyin kistlerinde azalma Yuan et al. 2013 MIC11 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, RH suşuna karşı korunma zamanında belirgin uzama Tao et al. 2013 TgCDPK3 kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama, %50 beyin kistlerinde azalma Zhang et al. 2013 SAG2C, SAG2D ve SAG2X kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, beyin kistlerinde %77 azalma Zhang et al. 2013 i.m.: İntramuskuler, kas içine; i.p.: İntraperitoneal, periton içine; s.c.: Subkutan, derialtına; i.n.: İntranazal, burun içine; i.o: İntraoral, ağız içine; i.d. İntradermal, deri içine; g.t.: Gen tabancası 2013 2013 30 Çizelge 2.3 T. gondii’ye karşı geliştirilen DNA aşıları (devam) Aşı adayları Adjuvant Aşılama Yolu Sonuçlar Yazar Yıl eIF4A kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Chen et al. 2013a TgIF2 kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama, %44,1 beyin kistlerinde azalma Chen et al. 2013b TgCyP kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %37,5 uzama Gong et al. 2013 Katepsin B ve L benzeri proteini kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Zhao et al. 2013a Aspartik proteaz 1 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Zhao et al. 2013b MIC8 kodlayan plazmit IL-12 i.m. Korunma zamanında uzama Zhao et al. 2013c SporoSAG kodlayan plazmit Bcl-xL i.m. İmmun yanıtta uyarılma (humoral ve hücresel) Gülçe İz et al. 2014 ROP16 ve GRA7 kodlayan plazmit B7-2 İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Liu et al. 2014 ROP9 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Chen et al. 2014 MIC8 kodlayan plazmit mIL-21 mIL-15 i.m. İmmun yanıtta uyarılma, %63,8 beyin kistlerinde azalma Li et al. 2014 TgCDPK5 kodlayan plazmit - i.m. Korunma zamanında uzama, %40 beyin kistlerinde azalma Zhang et al. 2014 i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Lu et al. 2014 SAG5D kodlayan plazmit TgDPA kodlayan plazmit - i.p. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Hassan et al. 2014 SAG1, GRA1, ROP2, GRA4, SAG2C, SAG2X epitoplarını kodlayan plazmit - i.n/ i.p / i.o Her üç yolla aşılamada, immun yanıtta uyarılma ve korunma zamanında uzama (en fazla korunma zamanında uzama %60 ile intraoral yolla) Cong et al. 2014 ROP38 kodlayan plazmit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, %76,6 beyin kistlerinde azalma Xu et al. 2014 TgGST kodlayan plamit - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Hassan et al. 2015 i.m.: İntramuskuler, kas içine; i.p.: İntraperitoneal, periton içine; s.c.: Subkutan, derialtına; i.n.: İntranazal, burun içine; i.o: İntraoral, ağız içine; i.d. İntradermal, deri içine; g.t.: Gen tabancası 31 2.5.2 T. gondii’ye Karşı Geliştirilen Rekombinant Protein Aşıları Rekombinant protein aşıları, enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın bir kısmını kullanarak koruyucu bir immun yanıt oluşturmayı amaçlamaktadır (Hansson et al., 2000). İmunojenik özellikteki antijenleri kodlayan gen bölgelerinin izole edilerek patojenik olmayan vektör sistemlerinde (bakteri, maya, virüs, böcek ve memeli hücreleri) üretilmesi stratejisine dayanmaktadır (Andersson, 2000). Rekombinant protein teknolojisiyle üretilen ilk aşı Hepatit B virüsüne karşı yapılarak 1986 yılında lisanslanmıştır. Major yüzey antijeni (HBsAg) mayada (Saccharomyces cerevisiae) başarıyla üretilmiş ve aşı olarak kullanılmıştır (Andersson, 2000). Rekombinant protein aşılarının önemli avantajları bulunmaktadır. Bunların içinde en önemlisi patojenin toksik bileşiklerinden kaynaklanan risklerin olmamasıdır (Liljeqvist and Stahl, 1999). Enfeksiyonan neden olan patojenin sadece bir kısmının kullanılarak immun yanıtın oluşturulabilmesi, üretim ve saflaştırma aşamalarının değiştirilip tekrar düzenlenmesiyle yüksek verimle büyük ölçekli üretilebilmesi de rekombinant protein aşılarının avantajları arasındadır. Tüm bunların arasında en büyük dezavantajı ise immun sistemi uyaran antijenik rekombinant proteinin tek başına yeterli olmaması ve tekrarlayan dozların yanı sıra adjuvant kullanımına ihtiyaç duyulmasıdır (Andersson, 2000; Hansson et al., 2000). Rekombinant protein üretiminde önem taşıyan adımlardan biri hedeflenen antijenik proteini kodlayan gen bölgesinin düzenlenmesi aşamasıdır. Güçlü immun yanıt oluşturan minimum DNA parçasının seçilerek ekspresyon vektörüne yerleştirilmesi gerekmektedir. Bu parça içerisinde toksik peptitleri kodlayan kısımların olmamasına dikkat edilmelidir (Andersson, 2000). Düzenlemeler yapıldıktan sonra vektör ekspresyon sistemine aktarılmaktadır. Bu aşamada diğer aşamalar kadar önem taşımaktadır. Ekspresyon sistemi olarak bakteri, maya, virüs, böcek veya memeli hücreleri seçilebilmektedir. Ekspresyon sisteminin seçiminde hedef proteinin biyolojik ve biyokimyasal özellikleri, post-translasyonel modifikasyonlarının gerekliliği, ekspresyon seviyesi ve salgılama şekli, proteolitik stabilitisi, üretim maliyeti gibi faktörler önem taşımaktadır (Andersson, 2000; Hansson et al., 2000). 32 Bakteriyel ekspresyon sistemleri daha fazla tercih edilmektedir. Bunun nedeni kolay ve yüksek seviyede ekspresyon sağlaması buna karşın ucuz olmasıdır. Escherichia coli (E. coli) en çok kullanılan genetik ve fizyolojik olarak iyi tanımlanmış olan hücrelerdendir (Andersson, 2000). Ökaryotik ekspresyon sistemeleri arasında ise Saccharomyces cerevisiae (S. Cerevisiae) adlı maya da sıklıkla kullanılmaktadır. Son yıllarda Pichia pastoris adlı mayanında kullanımı artmaktadır. Bu maya hücreleri fosforilasyon ve glikozilasyon gibi bazı ökaryotik sistemlerine benzer post-translasyonel modifikasyonları gerçekleştirmektedir. Bakteriyel sistemlerde olduğu gibi maya hücrelerinde de ekspresyonda verim yüksek ve maliyet düşüktür (Hansson et al., 2000). Böcek hücrelerinin kullanıldığı ekspresyon sistemlerinde, memeli ekspresyon sistemlerine göre üretilen protein miktarının daha fazla olması önemli bir avantajdır. Ancak maliyeti bakteri ve maya ekspresyon sistemlerine göre daha fazla olup, sonuçlar daha uzun sürede alınmaktadır. Memeli ekspresyon sistemlerinde ise glikozilasyon, fosforilasyon ve yağ asit zincirleri gibi posttranslasyonel modifikasyonlar yüksek performansla gerçekleşmektedir. Buna rağmen yüksek maliyet, zaman isteyen işlerden dolayı çok yaygınlaşmamışlardır (Andersson, 2000). Sonuçta rekombinant protein aşısının oluşturulup geliştirilmesini etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Aynı şekilde T. gondii’ye karşı geliştirilmeye çalışılan rekombinant protein aşılarında da benzer zorluklar bulunmaktadır. Bunlardan ilki T. gondii’nin ökaryotik bir organizma olmasından dolayı aşıda kullanılmaya aday birçok proteini, glikoproteini ve lipoproteini bulunması ve bu durumunda protein seçimini zorlaştırmasıdır. Ayrıca T. gondii’nin yaşam döngüsü boyunca immun sistemi uyaran farklı formları bulunmaktadır. Formlardan birinde bulunan antijen diğer bir formda etkili olmamakta ya da salgılanmamaktadır. Bu durumda aşının etkinliğini etkilemektedir. Karşılaşılan bir diğer zorluk ise doğada T. gondii’nin birçok suşunun bulunması ve her suşun patojenitesinin diğerlerinden farklılık göstermesidir. Aynı şekilde antijenik proteinlerin sekansları da birbirlerine göre değişkenlik göstermektedir. Bu durumda bir suşa karşı yapılan aşının diğer suşu da etkilemesi olasılığını azaltmaktadır (Nabi et al., 2014). 33 Tüm bu zorluklara rağmen T. gondii’nin moleküler ve hücre içi biyolojisinin anlaşılması, son yıllarda yapılan parazitin hücre içi bileşenlerine dayalı aşıların gelişmesine ivme kazandırmıştır (Lim and Othman, 2014). T. gondii’ye karşı yapılan rekombinant protein aşı çalışmaları Çizelge 2.4‘de özetlenmiştir. Golkar et al. (2007) parazitin yaşamsal faaliyetleri ve virulanslığı açısından önemli olan rGRA2 ve rGRA6 proteinleri kullanarak multivalan aşı geliştirmeyi amaçlamıştır. Aşı uygulaması sonrası immun yanıtta uyarılma ve beyin kistlerinde azalma saptanmıştır. T. gondii’ye karşı yapılan multi-antijenik rekombinant protein aşı çalışmalarından birisinde rROP2 (+) rGRA4 (+) rSAG1 protein karışımı ile rROP2 (+) rROP4 (+) rGRA4 ve rROP2 (+) rROP4 (+) rSAG1 protein karışımları kullanılmıştır. Bu proteinlerin parazitin üç enfektif (takizoit, bradizoit ve sporozoit) formunda da yer aldığı belirtilmiştir. Yapılan çalışmada beyin kistlerinde azalma olduğu belirtilmiştir (Dziadek et al., 2012). T. gondii’ye ait AMA1, RON2 ve RON4 antijenik proteinleriyle yapılan aşı çalışmasında, epitop bölgeleri seçilerek multi-epitop aşı oluşturulmuştur. T. gondii’nin konak hücreyi enfekte etme aşamasında ve parazitin kayma hareketinde görev alan proteinleri hedef aldıklarını belirtmişlerdir. Aşılama ile immun yanıtta uyarılma saptandığı rapor edilmiştir (Zhang et al., 2015). Gelişen teknoloji, hücre biyolojisi ve immunolojisinin daha iyi anlaşılması rekombinant protein ya da rekombinant alt ünite aşılarının gelişmesine yol açmaktadır. Böylece patojene ait küçük bir kısmın kullanılmasıyla tüm patojenin oluşturduğu immun yanıta yakın/benzer immun yanıt oluşturulabilmektedir. Patojenin küçük kısımlarının ya da antijenik kısımlarının kullanılması aşının güvenirliliğini de arttırmaktadır (Andersson, 2000). Son zamanlarda yapılan aşı çalışmalarında multi- antijenik protein formulasyonlarının kullanılması tek protein kullanılan çalışmalardan daha iyi korunma ve sonuç verdiği belirtilmektedir (Lim and Othman, 2014). 34 Çizelge 2.4 T. gondii’ye karşı geliştirilen rekombinant protein aşıları Aşı adayları Ekspresyon Sistemi Adjuvant Aşılama Yolu Sonuçlar Yazar Yılı rSAG1 proteini E. coli Alum i.p. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Petersen et al. 1998 rSAG1 proteini E. coli IL-12 i.p. İmmun yanıtta uyarılma, beyin kistlerinde % 40 azalma Letscher Bru et al. 1998 rGRA1 proteini M. bovis Freund i.p. İmmun yanıtta uyarılma, farelerde korunma zamanında uzama, koyunlarda ise kısmi korunma Supply et al. 1999 rSAG1 proteini rSAG1, rSAG2, rSAG3, rSRS1, rP54 proteinleri ve karışımı P. pastoris SBAS1 s.k. Konjenital bulaştan % 48 koruma Haumont et al. 2000 E. coli Freund i.p. Beyinde kist oluşmadı, korunma zamanında %17 uzama Mishima et al. 2001 rSAG1 proteini E. coli - s.k. İmmun yanıtta uyarılma, konjenital bulaşta %50 azalma Letscher Bru et al. 2003 rGRA4, rROP2 proteinleri ve karışımı E. coli Alum i.m. GRA4 ile beyin kistinde azalma Martin et al. 2004 rROP2-Hsp83 füzyon proteini E. coli - ayak tabanı İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Echeverria et al. 2006 E. coli MPL s.k. İmmun yanıtta uyarılma, GRA2 ile beyin kistinde %69,8 azalma, rGRA2 ve rGRA6 protein karışımı ile beyin kistinde %48,2 azalma Golkar et al. 2007 rSAG1-GRA2 füzyon proteini P. pastoris Freund s.k. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Zhou et al. 2007 rGRA1 proteini E. coli Provax i.p. İmmun yanıtta uyarılma, RH suşuna karşı korunmada uzama Döşkaya et al. 2007 rROP2 proteini M. bovis - s.k. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Wang et al. 2007 Serin proteaz inhibitorü-1 proteini E. coli Alum i.m. İmmun sistemde uyarılma, beyin kistlerinde %58 azalma, %40 korunma zamanında uzama Cuppari et al. 2008 rROP2, rGRA5, rGRA7 proteinleri karışımı E. coli Kolera toksini i.n. İmmun yanıtta uyarılma, beyin kistlerinde %58,3 azalma Igarashi et al. 2008 rSAG1, rGRA1, rMAG1 proteinleri ve karışımları E. coli Freund s.k. / i.p. İmmun yanıtta uyarılma, beyin kistlerinde %89 azalma Gatkowska et al. 2008 rGRA2, rGRA6 karışımları proteinleri ve epitop i.m.: İntramuskuler, kas içine; i.p.: İntraperitoneal, periton içine; s.k.: Subkutan, derialtına; i.n.: İntranazal, burun içine; i.o: İntraoral, ağız içine; i.d: İntradermal, deri içine; i.v.: İntravenöz, damar içine 35 Çizelge 2.4 T. gondii’ye karşı geliştirilen rekombinant protein aşıları (devam) Aşı adayları Ekspresyon Sistemi Adjuvant Aşılama Yolu Sonuçlar Yazar Yılı rROP2, rROP4 protein karışımı E. coli Freund s.k. İmmun yanıtta uyarılma, beyin kistlerinde %46 azalma Dziadek et al. 2009 rSAG1 proteini Bakülovirus Influenza ve Adenovirus Schneider böcek - i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %50 uzama Fang et al. 2010 - i.n. Beyin kistlerinde % 85 azalma Machado et al. 2010 Freund i.m. İmmun yanıtta uyarılma Rashid et al. 2011 Cpg-ODN i.m. Beyin kistlerinde %63-66 azalma Sanchez et al. 2011 Dziadek et al. 2011 Wang et al. 2011 Dziadek et al. 2012 rSAG2 proteini rRON4 proteini rROP2, rGRA4 proteinleri ve karışımı hücreleri E. coli rROP2, rROP4, rGRA4 karışımları rROP2, rROP4, rSAG1 karışımları E. coli Freund s.k. rROP2 + rROP4+ rGRA4 uygulandığında beyin kistlerinde %59 azalma rROP2 + rROP4 + rSAG1 uygulandığında %90 beyin kistlerinde azalma rSAG1, rGRA1, rGRA4 epitop peptitleri - Freund i.m. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında uzama Freund s.k. rROP2 + rROP4 + rGRA4 kistlerinde azalma rROP2 + rROP4 + rSAG1 kistlerinde azalma - i.o. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %59 uzama Del L Yacono et al. 2012 uygulandığında %84 beyin uygulandığında %77 beyin rROP2, rROP4, rGRA4 karışımları rROP2, rROP4, rSAG1 karışımları E. coli rGRA4 proteini Tütün hücreleri rGRA7 proteini E. coli Freund s.k. / i.m. DNA aşısı sonrası protein aşısı uygulandığında; immun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %60 uzama Min J. et al. 2012 rROP5, rSAG1 protein karışımı E. coli Freund s.k. İmmun yanıtta uyarılma, RH suşuna karşı korunmada uzama Zheng et al. 2013 rROP18 proteini E. coli Ginsenoside Re s.k. İmmun yanıtta uyarılma, RH suşuna karşı korunmada uzama Qu et al. 2013 rSiklofilin proteini M. bovis - i.o. / i.v. Yu et al. 2013 rDisülfit izomeraz proteini (TgPDI) E. coli - i.n. Wang et al. 2013 rAktin proteini (TgACT) E. coli - i.n. Yin et al. 2013 bitkisi İmmun yanıtta uyarılma, i.v. uygulama ile RH suşuna karşı korunmada %17 uzama İmmun yanıtta uyarılma, RH suşuna karşı korunmada %31 uzama Beyin kistlerinde %49,75, karaciğer kistlerinde %60,05 azalma, korunma zamanında %50 uzama i.m.: İntramuskuler, kas içine; i.p.: İntraperitoneal, periton içine; s.k.: Subkutan, derialtına; i.n.: İntranazal, burun içine; i.o: İntraoral, ağız içine; i.d: İntradermal, deri içine; i.v.: İntravenöz, damar içine 36 Çizelge 2.4 T. gondii’ye karşı geliştirilen rekombinant protein aşıları (devam) Aşı adayları Ekspresyon Sistemi Adjuvant Aşılama Yolu Sonuçlar Yazar Yılı rSAG1 proteini E. coli PLG mikropartikül / Vet L-10 i.p. PLG mkropartikülüyle yapılan aşıda immun yanıt uyarımı daha fazla, korunma zamanında %80 uzama Chuang et al. 2013a rSAG1/2 proteini E. coli PLG mikropartikül / Vet L-10 i.p. PLG mkropartikülüyle yapılan aşıda immun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %83 uzama Chuang et al. 2013b rSAG1 proteini Adenovirus - s.k. Modifiye edilmiş SAG1 kodlayan Ankara virüsüyle birlikte, rSAG1 aşısı verildiğinde korunma zamanında uzaman ve beyin kistlerinde azalma Mendes et al. 2013 rC kinaz 1’i aktifleştiren reseptör proteini (TgRACK-1) E. coli - i.n. İmmun uyanıtta uyarılma, korunma zamanında %45 uzama Wang et al. 2014a rROP17 proteini E. coli - i.n. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %50 artma Wang et al. 2014b rSAG2 proteini E. coli PLG mikropartikül / Vet L-10 i.p. PLG mkropartikülüyle yapılan aşıda immun yanıt uyarımı daha fazla, korunma zamanında %87 uzama Chuang and Yang 2014 rProfilin proteini (rTgPF) E. coli Oligomannoz lipozom (OML) s.k. İmmun yanıtta uyarılma, korunma zamanında %41,7 uzama Tanaka et al. 2014 rBAG1, rSRS4, rSRS9 proteinleri E. coli rMindin proteini Freund i.m. rMindin proteinin adjuvant olarak kullanıldığı aşılamalarda immun yanıtta daha fazla uyarılma ve korunma zamanında uzama Sun et al. 2014 AMA1, RON2, RON4 epitop peptitleri ve karışımları - - i.n. AMA1 + RON2 karışımı uygulandığında korunma zamanında %70 uzama Zhang et al. 2015 kaplı i.m.: İntramuskuler, kas içine; i.p.: İntraperitoneal, periton içine; s.k.: Subkutan, derialtına; i.n.: İntranazal, burun içine; i.o: İntraoral, ağız içine; i.d: İntradermal, deri içine; i.v.: İntravenöz, damar içine 37 2.6 Aşı Çalışmalarında Kullanılan Adjuvantlar Rekombinant protein aşılarının birçok avantajının olmasına rağmen tek başlarına immun sistemi zayıf uyarmaları önemli bir dezavantajdır. Bu sebepten dolayı yeni nesil aşılarda, DNA aşıları da dahil olmak üzere güçlü, uyumlu ve güvenilir immünolojik adjuvantlara ihtiyaç duyulmaktadır. Adjuvantlar antijen ile birleştiğinde antijenin tek başına sağladığı immünojenik özelliğin daha fazla olmasını sağlayan maddelerdir. Bu tanımlama ilk kez 1924 yılında Ramon tarafından yapılmıştır (Singh and O'Hagan, 1999). Adjuvantlar; immun yanıtın süresini uzatmak, hücre aracılı immun yanıtı stimüle etmek ya da arttırmak, antikor spesifitesini, izotipini ve altsınıf dağılımını ayarlayabilmek amacıyla kullanılmaktadırlar. Ayrıca antijen miktarını ya da aşılama sayısının azalmasını sağlayarak maliyeti azaltabilmek amacıyla da kullanılmaktadırlar (Andersson, 2000). Alüminyum bileşiklerin adjuvant olma özelliği 1926 yılında Glenny et al. tarafından keşfedilmiştir (Petrovsky and Aguilar, 2004). Alum da denilen bu adjuvantlar bir çok lisanslanmış insan aşılarında (Hepatit A, Haemophilus influenza B, Human papilloma virüsü) kullanılmaktadırlar (Reed et al., 2009). Adjuvantların lokal olarak ağrı, enflamasyon, şişlik, nekroz, apse, ülser ya da eosinofili, alerji, anafilaksi, organ spesifik toksisite, immunotoksisite gibi yan etkileri, insan ve hayvanlarda kullanılımını sınırlamıştır. Ancak alüminyum tuzlarının (alum) toksisite ve stabilite gibi yan etkilerinin çok daha az olması günümüzde de birçok aşıda kullanılmasına neden olmaktadır (Aguilar and Rodriguez, 2007). Freund 1936 yılında bilinen en kuvvetli adjuvantı; su, mineral yağları ve ölü mycobacteria bakterilerini içeren emülsiyon adjuvantını geliştirerek adına Freund’un tamamlanmış adjuvantı anlamına gelen “Freund’s complete adjuvant (FCA)” adını vermiştir. Fakat bu altın standart değerindeki adjuvant çok fazla lokal reaksiyona ve yan etkilere neden olarak insan için fazla toksik olduğu belirlenmiştir. Bu sebepten dolayı adjuvanttan Mycobacteria bakterilerini çıkararak Freund’un tamamlanmamış adjuvantı anlamına gelen “Freund’s incomplete adjuvant (FIA)” geliştirilmiştir. Böylece adjuvant daha az toksisite içeren ve aşı formülasyonlarında insanlar için kullanılabilir hale gelmiştir (Petrovsky and Aguilar, 2004). 38 Montanide FIA’a benzer yağ içinde su içeren bir başka adjuvant grubudur (Reed et al., 2009). Bu adjuvantlar enjeksiyon bölgesinde bir depo gibi davranarak antijenin yavaşça serbest bırakılmasını sağlamaktadırlar. Bu durumda antikor üreten plazma hücrelerinin daha uzun süre uyarılmasına neden olmaktadır (Petrovsky and Aguilar, 2004). Montanide fiziksel olarak FIA’larına benzemektedir. Ancak hayvan çalışmalarında FIA’nın oluşturduğu güvenlik kaygıları nedeniyle Montanide biyo-bozunur olarak geliştirilmiştir (Reed et al., 2009). Montanide doğal, rekombinant ve sentetik antijen çalışmalarında fare, sıçan, kedi ve köpeklerde kullanılmaktadır (Petrovsky and Aguilar, 2004). Montanide’nin avantajlarından biride güçlü hücresel ve humoral immun yanıt uyarmasıdır. Tüm bunların yanında en önemli dezavantajı, her bir antijen için ayrı ayrı uygulanması gereken yoğun ve masraflı bir emülsiyon prosedürü nedeniyle formüle edilmesinin zor olmasıdır (Reed et al., 2009). Aşı çalışmalarında kullanılan adjuvant çeşitleri Çizelge 2.5’de verilmiştir. Çizelge 2.5 Adjuvant çeşitleri (Ada, 1999) Adjuvant İçeriği Mineral tuz Mikroorganizma kaynaklı Partikül Çeşit Örnek Alüminyum hidroksit Alhydrogel(™); Rehydragel® Alüminyum fosfat Adju-Phos(™); Rehydraphos(™) Kalsiyum fosfat Kalsiyum fosfat adjuvant Muramil dipeptit (MDP) analogları Murabutide; Threonyl-MDP Bakteriyel ekzotoksinler Kolera toksin (CT) E. coli ısı değişken toksin (LT) Bakteriyel endotoksinler Monofosforil lipit A (MPL®) Bakteriyel DNA CpG oligonükleotitleri Flagella Flagellin komponenti FljB Mikoplazma türevli makrofaj aktive edici 2-kDa lipopeptit MALP-2 Biyobozunur polimer mikropartikülleri Poli laktit ko-glikolit partikülleri (PLG) İmmun stimule edici kompleksler (ISCOM) ISCOMATRIX® Lipozom, virozom, proteozom Yağ emülsiyon ve sürfaktan temelli adjuvantlar Sentetik Sitokinler Genetik Freund adjuvanı Montanide® ISA 51 Matabolize edilebilir emülsiyonlar MF59; SAF; Montanide® ISA 720 Saponinler QS-21 İyonik olmayan bloke kopolimerler L121 Polifosfazen PCPP LPS türevli sentetik bileşimler RC529; E5564 İmidazokuinolin benzeri moleküller Imiquimod; Resiquimod Sentetik polinükleotitler Poly A:U; Poly I:C IL-2, IL-12, GM-CSF, IFN- γ Sitokin genleri ve kostimüle edici molekülleri kodlayan genler IL-12, IL-2, IFN-γ, CD40L/124,125 39 3. MATERYAL VE METOT “Toxoplasma gondii’ye özgü aşı adayı antijenlerin kullanıldığı adjuvante multivalan rekombinant protein aşısının oluşturduğu immun yanıt ve korunmanın belirlenmesi” adlı tezimin tüm çalışmaları Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Parazitoloji Laboratuvarı’nda gerçekleştirilmiştir. Gerçekleştirilen hayvan çalışmaları için Ege Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulundan onay alınmıştır (Onay No: 2010-39). Bu tez çalışması ayrıca Tübitak tarafından 110S200 nolu proje ile desteklenmiştir. Yapılan tüm çalışmalar ayrıntılı olarak aşağıda belirtilmiştir. Çalışmalarda kullanılan kimyasallar aksi belirtilmedikçe “Applichem (Almanya)” adlı firmadan satın alınmıştır. 3.1 Araştırmada Kullanılan Deney Hayvanları Bu çalışmada 6-8 haftalık dişi Swiss webster out-bred fareler kullanılmıştır. Araştırma sırasında kullanılan fareler Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsü’nden temin edilmiştir. Fareler, etik kurallara uygun şartlarda Ege Üniversitesi İlaç Geliştirme ve Farmakokinetik Araştırma Uygulama Merkezi (ARGEFAR) Deney Hayvanları Laboratuvarı’nda bakılıp beslenmiştir. Araştırma sırasında kullanılan hayvan sayısı, istatistiksel olarak anlamlı sonuç elde etmek amacıyla daha önce yapılan T. gondii aşı denemeleri referans alınarak belirlenmiştir. 3.2 T. gondii’ye Ait Antijenik Proteinleri Kodlayan 49 Plazmitin E. coli BL21 Star (DE3) pLysS Hücrelere Klonlanması Daha önce Liang et al. (2011) ve Felgner et al. (2015) tarafından T. gondii antijenik proteinlerinin protein mikroarray ile belirlenmesi çalışması yapılmıştır. Antijenik olduğu belirlenen proteinlerin içinden 49 tanesi Doç. Dr. Mert Döşkaya tarafından tez çalışmasında kullanılmak üzere verilmiştir (Çizelge 3.1). İlgili Çizelgede ilk ve üçüncü sütunlarda plazmitlerin “Toxoplasma Genomic Resource” adlı veribankasındaki (http://www.toxodb.org/toxo/) gen numaraları verilmiştir. İkinci ve dördüncü sütunlarda ise plazmit adları verilmiştir. 40 Çizelge 3.1 T. gondii antijenik proteinlerini kodlayan plazmitler ToxoDB adı Plazmit adı ToxoDB adı Plazmit adı TGME49_047370_4 TGME49_026020_8 TGME49_053730_9 TGME49_061020_40 TGME49_047390_4 TGME49_024710_6 TGME49_104950_2 TGME49_086450_1 TGME49_021710_4 TGME49_121520_3 TGME49_037880_1 TGME49_093730_6 TGME49_015980_1 TGME49_001840_1 TGME49_039440_1 TGME49_019310_8 TGME49_027280_1 TGME49_003310_1 TGME49_048540_4 TGME49_100120_9 TGME49_095650_3 TGME49_051630_2 TGME49_054720_1 TGME49_005360_12 TGME49_058660_1 puET-A1 puET-B1 puET-C1 puET-D1 puET-E1 puET-F1 puET-G1 puET-H1 puET-A2 puET-B2 puET-C2 puET-D2 puET-E2 puET-F2 puET-G2 puET-H2 puET-A3 puET-B3 puET-C3 puET-D3 puET-E3 puET-F3 puET-G3 puET-H3 puET-A4 TGME49_034360_1 TGME49_113440_1 TGME49_013390_6 TGME49_073130_2 TGME49_075490_12 TGME49_114850_1 TGME49_047540_5 TGME49_110780_1 TGME49_026110_8 TGME49_093000_2 TGME49_078100_1 TGME49_092280_1 TGME49_026380_1 TGME49_090680_8 TGME49_005360_17 TGME49_109590_1 TGME49_114500_1 TGME49_055180_14 TGME49_055180_7 TGME49_025340_13 TGME49_022370_1 TGME49_026510_1 TGME49_013390_5 TGME49_095700_1 puET-B4 puET-C4 puET-D4 puET-E4 puET-F4 puET-G4 puET-H4 puET-A5 puET-B5 puET-C5 puET-D5 puET-E5 puET-F5 puET-G5 puET-H5 puET-A6 puET-B6 puET-C6 puET-D6 puET-E6 puET-F6 puET-G6 puET-H6 puET-A7 Plazmitlerin hepsi rekombinant protein ekspresyonu için E. coli BL21 Star (DE3) pLysS kompetent (Invitrogen, A.B.D.) hücrelerine transforme edilmiştir. Bunun için 10 ng plazmit 10 µL E. coli BL21 Star hücrelerine eklenmiş ve karışım buz üzerinde (+4oC) 35 dakika inkübe edilmiştir. Daha sonra 42oC’de 45 saniye termal şoka uğratılmış ve 2 dakika buz üzerinde bekletilmiştir. Karışım üzerine vakit kaybetmeden 90 µL S.O.C. (Super Optimal broth with Catabolite repression, Invitrogen, A.B.D.) besin ortamı ilave edilerek 225 rpm’de (Rounds Per Minute: Dakikadaki Devir Sayısı) 1 saat boyunca 37oC’de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası 100 µg/ml ampisilin içeren LB-agar [25 g/L Luria Bertani (LB) besin ortamı ve 15 g/L agar] petri plaklarına ekim yapılmış, 37oC’de bir gece boyunca koloni oluşumunu sağlamak amacıyla inkübe edilmiştir. Ertesi gün koloni oluşumu görülen petri plaklarından 3 tek koloni seçilmiş ve 100 µg/ml ampisilin içeren LB sıvı besi ortamına alınmış ve 1 gece boyunca 37oC’de 225 rpm’de çalkalanarak inkübe edilmiştir. Üreme olan tüplerden 600 µL alınmış ve 41 üzerine %30 gliserol 1:1 oranında ilave edilerek kriyo tüplerine aktarılmış ve -80 o C’de stoklanmıştır. Geriye kalan 2,4 ml’den plazmit saflaştırma kiti (Qiagen, Almanya) kullanılarak üretici firmanın protokolüne uygun olarak plazmitler izole edilmiştir. Daha sonra plazmitler %1’lik agaroz jelde (100 ml TAE [Tris-Asetat-EDTA] tampon içine 1 gram agaroz) 80V’ta yaklaşık olarak 45-50 dakika yürütülmüştür (Bio-Rad, A.B.D.). Plazmitlerin jele yüklenmesi sırasında 6x bromfenol mavisi içeren örnek tamponu (%30 gliserol, %0,25 bromfenol mavisi) kullanılmıştır. DNA merdiveni olarak Gene Ruler DNA Ladder Mix (Fermentas, A.B.D.) kullanılmıştır. Jel, Etidyum Bromür ile boyanmış ve UV ışık altında görüntülenmiştir (MiniBis Pro, İsrail). 3.3 Aşı Formülasyonunda Kullanılacak Rekombinant Proteinlerin Seçimi İçin 49 Antijenik Proteinin Ekspresyonlarının Belirlenmesi Transformasyon sonucu elde edilen hücrelerin protein ekspresyonlarının incelenmesi ve içlerinden aşıya uygun olan antijenik proteinleri belirlenmesi amacıyla küçük ölçekli deneme üretimleri yapılmıştır. Her plazmit için işlemler ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir. Bunun için öncelikle 100 µg/ml ampisilin içeren 30 ml LB sıvı besin ortamına aktarılan plazmitleri içeren E. coli hücreleri 16-24 saat boyunca 37oC’de 225 rpm’de çalkalanarak inkübe edilmiştir. Süre sonunda üzerlerine 70 ml 100 µg/ml ampisilin içeren LB sıvı besin ortamı eklenmiş ve toplamda 100 ml’ye tamamlanmıştır. Besiyerlerine OD600 (600 nm’de ölçülen Optik Dansite) takibi yapılmış ve OD600 değeri 0,4 ng/µL olduğunda, son konsantrasyon 0,5 mM olacak şekilde IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranoside) eklenmiştir. Daha sonra 37oC’de 225 rpm’de 4 saat boyunca çalkalanarak inkübe edilmiş ve sonrasında örnekler 5000×g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Üst sıvı atılarak pellet -20 o C’ye kaldırılmıştır. Ertesi gün pelletler % 0,1 Triton X-100 içeren 50 mM Tris-Cl ve 0,3 M NaCl (pH: 7,4) ile homojenize edilmiş ve -20oC’ye kaldırılarak 3 kez dondurulup çözdürülmüştür. Homejenatlar oda sıcaklığında 15 dakika karıştırıcıda inkübe edilildikten sonra 30.000×g’de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Elde edilen üstsıvı ile küçük ölçekli saflaştırmaya gidilmiştir. 42 Saflaştırma sırasında Ni2+ ile kaplanmış boncuklar kullanılmıştır (Ni-NTA, Qiagen). Bu boncuklardan 1 ml herbir üstsıvıya eklenmiş ve 30 dakika oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak inkübe edilmiştir. Süre sonunda 4000 rpm’de 1 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı atılmıştır. Boncukların üzerine 10 ml 50 mM Tris-Cl, 0,3 M NaCl ve 25 mM imidazol eklenmiş ve 30 dakika oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak inkübe edilmiştir. Yine 4000 rpm’de 1 dakika santrifüj edilerek üst sıvı atılmıştır. Bu işlemden sonra Ni2+ ile kaplı boncukların üzerine 1 ml 50 mM Tris-Cl, 0,3 M NaCl ve 0,5 M imidazol eklenmiş ve 30 dakika oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak inkübe edilmiştir. En son 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek üst sıvılar toplanmış ve örneklere Western Blot uygulanarak en iyi eksprese olan proteinler görsel olarak belirlenmiştir (Bkz. Bölüm 3.7.). 3.4 Aşı Formülasyonunda Kullanılacak Rekombinant Proteinlerin Seçimi İçin 49 Antijenik Proteinin Biyoinformatik Yöntemlerle Analizi Aşı antijenlerinin seçmine yardımcı olması açısından biyoinformatik yöntemler kullanılarak aşı adayı 49 antijenik proteinin CD8 Tc hücrelerinin bağlandığı MHC-I ve B hücre epitop bölgeleri ile N- ve O-bağlı glikozilasyon bölgeleri incelenmiştir. Antijenik proteinler, 8-10 aminoasitlik kısa peptitler halinde MHC-I molekülleri üzerinde CD8 Tc hücrelerine sunulmaktadırlar (Feliu et al., 2013). Bu yüzden MHC-I epitop analizi yapılırken MHC-I allel uzunluğu 9 olarak seçilmiş ve Immune Epitope Database and Analysis Resource (http://tools.immuneepitope.org/mhci/) programı ile analiz edilmiştir. Analiz sonunda çıkan yüzdelik oranlar içinden 1,0 ≤ olanlar seçilmiştir (Moutaftsi et al., 2006; Kotturi et al., 2007; Paul et al., 2013; Goodswen et al., 2014). B epitop analizinde SVMTriP (http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/prediction.php) adlı program kullanılmıştır. Yao et al. (2012) B hücrelerinin bağlanacağı en uygun epitop uzunluğunun 16 aminoasit olduğunun gösterilmesinden dolayı analiz sırasında 16 aminoasit uzunluğunda epitoplar seçilmiştir. Nve Obağlı glikozilasyonlar NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) ve NetOGlyc 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) adlı programlar kullanılarak analiz edilmiştir (Frank and Schloissnig, 2010). 43 3.5 T. gondii’ye Ait Altı Rekombinant Proteinin Büyük Ölçekli Ekspresyonu Küçük ölçekli optimizasyon çalışmaları sonucunda elde edilen ekspresyon verilerine ve biyoinformatik analiz sonuçlarına göre aşı formülasyonunda kullanılabilecek altı proteini kodlayan puET-H2, puET-A4, puET-E4, puET-D6, puET-E6, puET-H6 plazmitleri seçilmiş ve büyük ölçekli protein ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Altı proteinin büyük ölçekli ekspresyonu biyoreaktörde (BioFlo 110, New Brunswick, A.B.D.) gerçekleştirilmiştir. Bunun için plazmitleri içeren E. coli BL21 Star (DE3) pLysS stok hücreleri 100µg/ml ampisilin içeren 500 ml LB besin ortamına eklenmiş ve 37oC’de 225 rpm’de çalkalanarak bir gece boyunca inkübe edilmiştir. Ertesi gün 100µg/ml ampisilin içeren 7.5 litre besiyeri ortamına (Çizelge 3.2’de içeriği tarif edilmiştir) eklenmiştir. Daha sonra kültür ortamı; pH 6.82’de, 37oC’de, 2.5 LPM (liter per minute; dakikada verilen hava litresi) oksijen uygulayarak 400 rpm’de karıştırılarak inkübe edilmiştir. OD600 değeri 0.4 olduğunda, E. coli BL21 Star (DE3) hücreleri son konsantrasyon 0.5 mM olacak şekilde IPTG ile uyarılmış ve ortalama 5 saat inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda besiyeri, yer tipi soğutmalı santrifüjde 4oC’de, 5000×g’de 10 dakika santrifüj edilmiş, hücreler toplanarak üst sıvılar dökülmüş ve hücre pelletleri kullanılıncaya kadar -80 oC’de depolanmıştır. Çizelge 3.2 Biyoreaktörde kullanılan besiyeri karışımı Kimyasallar Son Konsantrasyon KH2PO4 2 g/L K2HPO4 3 g/L (NH4)2HPO4 (Merck) 5 g/l MgS04.7H2O 0.5 g/l Glukoz 25 g/L Maya ekstraktı 5 g/L Köpük kırıcı (Sigma) 0.35-0.4 ml/L Thiamine 1 mg/L İz Elementler Son Konsantrasyon FeCl3.6H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O MoNa2O4.2H20 BH3O3 6N Sülfürik asit MnCl2. 4H2O NaCl 4.75 g/L 0.4 g/L 1 g/L 0,5 g/L 0.575 g/L 12,5 ml/L 4 g/L 5 g/L 44 Aşı formülasyonunda kullanılabilecek altı proteini kodlayan puET-H2, puET-A4, puET-E4, puET-D6, puET-E6, ve puET-H6 plazmitlerinin gen dizilimleri ve kodladıkları proteinlerin aminoasit dizilimleri Çizelge 3.3.A-F’de verilmiştir. Çizelge 3.3 A. Rekombinant H2 proteinine ait puET-H2 vektörü gen (a) ve protein (b) sekansları a) puET-H2 vektöründe H2 genini içeren ORF bölgesi (711 bp) CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA TGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAG ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAG CGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCG CCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGC GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGG TAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCG CGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA TACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGA TAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCG CAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGTCACCATCATCACCATCATGATG CCTGTCATGTATCCCTGCCGCCGGCGGCGGAGCCCCAGGAGATCCAGGTGTTCGTCCACT 45 TGAATTTTTTCGGTCTTCTTCGATTCGCGCGGGTGTGCGTGAAGCAGCGACGAGAAGAAG AGAAGACCGTAGAGGCTCCCGAGGTCGCGCAGGGCGGCGAGGAGACAGCCGGAGCAGAGA CGGCGCCTGAAGTGAGGAAACTGGTCAGAGTCGTGAAGGTCGATGTGCCGTACCAAGTCC AGGAGGCGCCGGGCCGGCCGACGACTCTGCAGCTCCGAGACTTCCGTGAGGACGAACTGA ACATGGACAACGAGGACCGCCTGACACGGGAGAAGATGGATCGTCTGAACGAGTTGGAGT CGTACCTCTACGCGCTGCGCGACGACATCTCCGGGAAGATGCGAGACTTCGCGACGCCCG AGGAGCGAGCAGAAATTGAGGCGCTTCTGGAGTCCTCGCAGCAGTGGGTAGACGACGCTC TGGTGGACATTTCCACCGTCGCCAAGAGTGCGGTCGTCGCGAAACTCGAGGAACTCCAGG CTGTCGGAGGAAAAGTCTCGCGCCGGTTCGAAGAGTACTCCGGCAGACAAGAAGCCCAGC AACTGCTGCATGCTGCAGTCGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGG CTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA GGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT Altı çizili kısım: Open reading frame; Kırmızı baz: Hedef gen bölgesi; Yeşil baz: Vektöre ait bölge b) puET-H2 vektöründe H2 genini içeren ORF bölgesinin kodladığı protein (236 aminoasit) MRHHHHHHDACHVSLPPAAEPQEIQVFVHLNFFGLLRFARVCVKQRREEEKTVEAPEVAQ GGEETAGAETAPEVRKLVRVVKVDVPYQVQEAPGRPTTLQLRDFREDELNMDNEDRLTRE KMDRLNELESYLYALRDDISGKMRDFATPEERAEIEALLESSQQWVDDALVDISTVAKSA VVAKLEELQAVGGKVSRRFEEYSGRQEAQQLLHAAVDPAANKARKEAELAAATAEQÇizelge 3.3 B Rekombinant A4 proteinine ait puET-A4 vektörü gen (a) ve protein (b) sekansları a) puET-A4 vektöründe A4 genini içeren ORF bölgesi (942 bp) CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA TGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAG ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAG CGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCG CCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGC GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGG TAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCG CGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA TACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC 46 GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGA TAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCG CAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGTCACCATCATCACCATCATATGA GGAGCTCAGTAGGGCAGTCTCGTCTGCCGCTCAAGTTTTTCCTTGCGCCGTTCTCGGTGA AAAATTCGGTTTTCGCCCTCTTTTTCGTGTTCGCTCTTGTCTGCGTCTCCGGTCTGTCTT GGGAAGATGCTGAGGACGGCGCAGCGTGGGACTCAGTCTCGAACGATTCGGACGACAGCT TCGCGAAAGGGTCTGACTTCGGGGAAGTCAAGTTGGGCAGCGCAGGCCAACGGCAGCTCC TCAGTCAGCTCCAGAACGAGTTGGGCGGTGAATTCGAGGACGCAGACGTGAGTATGCTCC AGAGGGATCACGGAATCCACGGAGAGGAAGCCGGTTTGTTCCGCAAGGCTGTTCCGGGCT TGGACGACCCAGCTGAAGACGATGAAGCCGACGGCGAAAGTGCCTCGGATGAGGCAGAAG CCGACTCTGACGTCTTGGCGGACGACGAAGAAGGGACATCCCTCATCGAAAATGCGAGTG AGGAAGACACAGACAACTCCGAGGCAGACAGTCAACAGGAGGATGACAGTGTGGGAGAGG ATTCCTTTCTCCAGCAGGAGGGCGAGGACTCCGAGGAAGAAAGAGCAGTCGAGGACCCGT ATGCTGCCGCCGAACCCTCTTATCTTGAAGAGGACAACACTGTTGACGACAGCGCGGCGG AGGATTATGCCCCTGCTTCGTTTGTCCAGATCGGCAGTGGAGAGAGAAAAATCCGGGCGC ACATGCATCTTGACAGCCGCCAAGTTGCCCCCGAAAGATTCGCGCATGCGTTCAACCAGG ATCATGTCAGACTTCTGGACCAGACCGCCGTCGAGGACGAACTTCTCGATGAGGCCGCCC CGGGCGGAGGCGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCA CCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTT TGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT Altı çizili kısım: Open reading frame; Kırmızı baz: Hedef gen bölgesi; Yeşil baz: Vektöre ait bölge b) puET-A4 vektöründe A4 genini içeren ORF bölgesinin kodladığı protein (313 aminoasit) MRHHHHHHMRSSVGQSRLPLKFFLAPFSVKNSVFALFFVFALVCVSGLSWEDAEDGAAWD SVSNDSDDSFAKGSDFGEVKLGSAGQRQLLSQLQNELGGEFEDADVSMLQRDHGIHGEEA GLFRKAVPGLDDPAEDDEADGESASDEAEADSDVLADDEEGTSLIENASEEDTDNSEADS QQEDDSVGEDSFLQQEGEDSEEERAVEDPYAAAEPSYLEEDNTVDDSAAEDYAPASFVQI GSGERKIRAHMHLDSRQVAPERFAHAFNQDHVRLLDQTAVEDELLDEAAPGGGDPAANKA RKEAELAAATAEQÇizelge 3.3 C. Rekombinant E4 proteinine ait puET-E4 vektörü gen (a) ve protein (b) sekansları a) puET-E4 vektöründe E4 genini içeren ORF bölgesi (1095 bp) CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA TGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAG ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAG CGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCG 47 CCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGC GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGG TAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCG CGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA TACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGA TAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCG CAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGTCACCATCATCACCATCATGTTG GTACCCCGGATGGCGGAGCGTCTGCCACTGACCCAAGCTGTCTCACCGAAGGGACTGAGA CCCAGTGCACTTGCCAAGACAAGAATGGTTCTGCGAAGGATCTCGTAGCGACCCTCTCAC AGAATCAAAATGGCTTGAACATAAGATGCAAAAAGACCGAACTGAAATTTGCGCCTGAAA GCTCAAATGGCAAAGCAGTCTGTCCGTCGACCACAACAGAGCTCAAGGACTGCAAACCAG CTTCGACGCGAAGCGTTCCAAACTCCGTTGAAATTGACACTCTTCTCAGCGGCTCTCCAA AAGACGTGTCTTGGAAGGATGATGGAGGAGACAATCAGTACACGTCTAAAAAGTTGGTCA TCCCTCAAGAGTACTTTCCCTCTGTCGACCAAAAGTTCATTGTCGGCTGCGTCACAAGCG ACTCCGCGACGCAGGCCACCGCAATGAAGGTGACAGTGACGCTTGAAGCAAAGGCAAGTG CAACTCAAGAGCAGACTGTCAACTGCGCCTACGGGGCGAATAGCAACAAGGCCCACCAAG CCATCACTCTGACTCCGGAAAATAACAAGTTCACTCTGGTGTGCGGAGATAAAGGACAGA TTCTGCCGACAAACTATCAAGAGACATATTGCGCTCATGAAGACGGAAAGGACGCAGCTG ACACGTGCAAGGACGCGTACAGTGGAATTTTCCCGAATTACGAAACAACTTGGTGGACGA AAGCCACAGAACCCCCCAGCAACGAGTACACGTTCAAGATTCCAGAGGGTCAGTTCCCGA CAGAGAAACAGACGTTCATGGTCGGGTGCCACCGACAGACACCAGTTCAAGATAATGCAC AGAAGAACGGAGTTGACAACACCGCCCAAGAAGCGAAGCCGACTGTGTGCACCGTTGATG TGACGGTTGCAGCCTCTGCACCTTCCTCTGCTGCTGAGTTGGCAAGTGGCATATCTCTCA TGTTGTTGTCCGTTGCATCGATTGCCTTCTCATTTGCCTTGTAGGATCCGGCTGCTAACA AAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCC TTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT Altı çizili kısım: Open reading frame; Kırmızı baz: Hedef gen bölgesi; Yeşil baz: Vektöre ait bölge b) puET-E4 vektöründe E4 genini içeren ORF bölgesinin kodladığı protein (364 aminoasit) MRHHHHHHVGTPDGGASATDPSCLTEGTETQCTCQDKNGSAKDLVATLSQNQNGLNIRCK KTELKFAPESSNGKAVCPSTTTELKDCKPASTRSVPNSVEIDTLLSGSPKDVSWKDDGGD NQYTSKKLVIPQEYFPSVDQKFIVGCVTSDSATQATAMKVTVTLEAKASATQEQTVNCAY GANSNKAHQAITLTPENNKFTLVCGDKGQILPTNYQETYCAHEDGKDAADTCKDAYSGIF 48 PNYETTWWTKATEPPSNEYTFKIPEGQFPTEKQTFMVGCHRQTPVQDNAQKNGVDNTAQE AKPTVCTVDVTVAASAPSSAAELASGISLMLLSVASIAFSFALDPAANKARKEAELAAATAEQÇizelge 3.3 D. Rekombinant D6 proteinine ait puET-D6 vektörü gen (a) ve protein (b) sekansları a) puET-D6 vektöründe D6 genini içeren ORF bölgesi (2184 bp) CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA TGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAG ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAG CGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCG CCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGC GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGG TAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCG CGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA TACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGA TAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCG CAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGTCACCATCATCACCATCATCTTG CGGCTTCCATCTCATGCTCGCCTGCCGCTGCCGGAACCGTGGTGTCGCCACAAGATGCCT TGGTCACATCCTCGCTTTCCATGCCTGCTCTTCCGTTAAACGCGTCCTCTTTCCACGAAG CACACCGGCCTTGGATCTTCAACTCCATCAGCGAACCAGATGAAGAGAAGCTGCTCGCAG AGCCGTCTTACCCCATCGAGAAGCTTTTGCGTGTCACGGATTTTTGTGGCGAGCGTGGAG TGGATCCTCTCTCGATTTGGACCGGGGAGGCGAAGGCTATTCCCACTGCGCTTTTCTCGG 49 ACCTCCTTGCGGCTTCGGCCCTTCGGCCTTCCATCCCGGATCCGTCGTTGCTTCCGAATC TCTGCAGCGTCTGCAGCGCGGCTCTCAGCGGCCTTGTTGACTTTTACTCTGAGCAACATC GCTCCATCGAAGCCATTCTCGAGGCGCTAAAGAGACAGAAAACGATTCCAACGGTCTGCG AGGAGACGCCGGTCTCTCCGGAGCTTGTCGAGTCCTCCTCTGCATGCGCGATTCCAAGTT CAACAGCGAATCTTTCAAGTCCGCCAAAAGAAGTGACTGTCTCATCTACGGCCAACGGCG AAGCAGATAGAGCCGAGGGTGTGCACCTGCAGTTCGTTCACGCTGGGGGGGACGGGGACA CTGCGCCTGCTCGTTCCGAGTCAAGTCAGGAAACGGAGAAGAACCAGGAAGAGACAATCC ATGCAGAGGTTCTGCCTTCTATCGTGGTGCCTTTACCGTCTCCTGACGACGTGCATCTGC GGTCTTCGTCTCAAGAACCTTCTGCCTCGTCTGTCGCGCCTGGCGACCAGCAGCAAGGTG GTGAGAAAGAGGAAACCCAAGGAGGCAGACAGATTAGCTGCGTTGCCAGCCCGTGTGGCG TAGGTGCTCTGTCGCCGATCGTCTGCGCAGGCGTCGACGAGGTTCCCGATTCTTCGAAGG TGGCGCCTGTCCAAGACGCGGAAGGAAACCGCCAAGTCTCTGTCTCTTCTTCCCAAAGCA GAGTTGAGGGGAGTGGTCCGGATAGCGGCGACAACCAGCGCCTGGAGACTGAGGAGCCTT TGTCTCCTCGGATTTTGAATGAACACGAGACGCCTGCGACGGATCTTCTAGGGTGCTGCA TTCCGTCTGCGTCTCTCTCTTCTTCGCCACGAGCCGCCGTCCCCGCCTTGAATCCGTGGG TTCTCGAACATACGGCGACGCTTCCAGAGTTTATTTACGTCTCGCGTCGGCCCCTTCAGA GGGCGTTTTCCCTGCACTCGTGTTTCCTCACACTCTGCACGCTTCCCACAGCCTCCTCAC CTGCGTCGATTCCTTTCTCGGCGTTGCTGCCTTCTTCGTCGAGTCCTCAGTCGCGAGAGT TGAAGGTGTTGCGGGCAAAAATGAAGCGAGAGGGAAAAGACAGCAGAGAGAAATATCTCT CTTGGCTTACCCTCAGCGACGTGCGTCGCGAAGTGACTCTCGGACGAAAGCTGCCACAGG GCGACTCCGATCCAAGCAGGGGAGTGAAGCCCCCGAAGAAGGACGCCAGGAAGGATGGCG ACTGGGAGCGGGCAGAGGAGGGAATCGAAGAGGGGGAAGCCAGCGATGGCGACGGGACAA ACGACGGAAGGAGAAGGCGAAGAAAGAAGGTCGAGGACGAGGAACAGGGCGAGGAACAGG TCTGCGGGGACGAAGACGTGGAGGATGTCAACATGGATGACGAAGGGGAGGAGTCGGCTT CTTTAGGGTCTTTGTTGCATGCAGAAGACGAGGGAAACGCGACGAAAAAAACGAGAGTCA CACGCGCAAGGAAAGCCGTGTCTTCTCCCCCTGGGGCGAATCGCAAGGCGGTGGCGCACA CACTGCATCGGGCGACAAGTCGGCCGCGCAGCGACCATAAGCAGGAAGAGAACGAAGACT TGGAGGAGGAAGAAGGAAACACAGAGGAGGGTCAGGGGAACAGTCAGGATGCGCACACCG GTCGCGACAATGTCTTCGACTTCGCCTCAGATCTCCTCTGCTGCCACCAAAAACTCCGTA TTCAAGGAGCCGTTGGAAAAAGCAACAAACTTCAGCGTTTCTTGGTAAATAAAGATCCGG CTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAG CATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTA TATCCGGAT Altı çizili kısım: Open reading frame; Kırmızı baz: Hedef gen bölgesi; Yeşil baz: Vektöre ait bölge b) puET-D6 vektöründe D6 genini içeren ORF bölgesinin kodladığı protein (727 aminoasit) MRHHHHHHLAASISCSPAAAGTVVSPQDALVTSSLSMPALPLNASSFHEAHRPWIFNSIS EPDEEKLLAEPSYPIEKLLRVTDFCGERGVDPLSIWTGEAKAIPTALFSDLLAASALRPS IPDPSLLPNLCSVCSAALSGLVDFYSEQHRSIEAILEALKRQKTIPTVCEETPVSPELVE SSSACAIPSSTANLSSPPKEVTVSSTANGEADRAEGVHLQFVHAGGDGDTAPARSESSQE TEKNQEETIHAEVLPSIVVPLPSPDDVHLRSSSQEPSASSVAPGDQQQGGEKEETQGGRQ ISCVASPCGVGALSPIVCAGVDEVPDSSKVAPVQDAEGNRQVSVSSSQSRVEGSGPDSGD NQRLETEEPLSPRILNEHETPATDLLGCCIPSASLSSSPRAAVPALNPWVLEHTATLPEF IYVSRRPLQRAFSLHSCFLTLCTLPTASSPASIPFSALLPSSSSPQSRELKVLRAKMKRE GKDSREKYLSWLTLSDVRREVTLGRKLPQGDSDPSRGVKPPKKDARKDGDWERAEEGIEE GEASDGDGTNDGRRRRRKKVEDEEQGEEQVCGDEDVEDVNMDDEGEESASLGSLLHAEDE GNATKKTRVTRARKAVSSPPGANRKAVAHTLHRATSRPRSDHKQEENEDLEEEEGNTEEG QGNSQDAHTGRDNVFDFASDLLCCHQKLRIQGAVGKSNKLQRFLVNKDPAANKARKEAEL AAATAEQ- 50 Çizelge 3.3 E. Rekombinant E6 proteinine ait puET-E6 vektörü gen (a) ve protein (b) sekansları a) puET-E6 vektöründe E6 genini içeren ORF bölgesi (2172 bp) CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA TGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAG ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAG CGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCG CCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGC GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGG TAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCG CGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA TACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGA TAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCG CAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGTCACCATCATCACCATCATTTCA AAACCAAGATCGAGAACCTGACGTCTCAGCTGGAGGAGCAGAAGGAGGCGAGGTGGAAGG CACGCGAGGCACAGGACCAAGCAGAGGTGGAGCGGAAACGTCACCTGGCTGAGCTGGAGC GACAGCTGCGTGTGGAGACTTTGGAGAAGGACGAACTGCGCGAGGCGTTGGAGCGGCAGA CCTCGCGGGCGGAGAGTCTCATGGAGGAACTCGGGACAGTGAGGCGGGAAGGAGGCTCTC CGAATATAGGGCGACTGGCGGATCGCGGGTGTCAGGTGGAGCCGACGGTGCGGAGCCGGG GAACGCAGGTCGAGGACACAGTTATGGAGTACATTCGCGAGTGCACAGAGATCTCTGAAG AGGCTATGCAGGGGGACGAGACGGGTCGGGTGCGCTCGAGAGTCAGGGACATGTTGGACG AGAGAAATGGGAACCTGCGGGGGAGGTGTCTTTTGCGCCACGAACCCACCTTTCTGTCTT CGCCTCCAGCTGAGGGTCTTTGCTCCAGAAAGGAGTCCGGAGAGAAGTCGAGAAAGGCGA 51 GCGTGCTTGAGGTTGAGGACGACGCTTCGATCGATGGAGCTGTTCAAGCAGTGGAAAATG GAGTTCTTAAAACCGCAAGCAAGGCTGGGACGACGACACCATCGGAGGGAAAGGGTCTGA AGATGCTTGGGACTCGCACGTCCATCGGGTGTGGAGTAGAAAAGGAAGACCAAGCCGGCA AGAAGGAGGCGGACCTGTTCAGCAAAGTCGCCGACGTCGCGTTTCGAGCAAAGGCAGGAA GTGTAGGTCCATTTCAACGCCGCGGCAGTGAGGCAGAACAGAAGGATCAGCAAGCGGACA CGAGTGGGCAATCCCGTGGCGAGAGAGGGGCTGAGATTTCGGAGAGAAACACAACGAGTG ACGGACTGGGTTCTAAGGACCCTTCTGGTCGAGACAAGTCCCCCGCTGTAACCGGTATGA AGCATTACCGGGACATAAAAGAAACACCTAGTATTGACAAAAAACTTCACGCGGACGAGG ACGAAGGGAGACAAGCTCGCGATTTGTCGCGCTCATCTTCTCGCGATGGACCTCGTTCAT CTTCTCGCGATTTCGATTCCTTCGCTGTAGTGAGGTCCAAAGCTCTCGAAGTTCTCCGGC GTCAGCGTGCAGACCCTTCAGACTGGGAAGGATGTGAGAATGTGGAAAAGGATCATTTCG GGAGTCGCGAGAGGCACTCGAATGGGGAAGAGTTCAAGACACAGGGAAACGTTGGTCGAG GTTCACTGAGGCAGGAACCCTTTACCGATGGAGTGTACCACGACAGGCAGCAGCGCTTCT CAGAGAAAGAACCTGCGAAGCCGATGTTCACTTCCCTCGCGGATCCGAGCGTGAGGAGAC ATTTTAAGGAGGAAGAAGAACGACGGAAATTCCAGGAAAAGGCAGAAGAGGAGATCTTGC GCCTTCTCAAACGCGCAGCTGAGTGCAGCGAGGAAGATTTGAAAAGGGAAGAACGCTCCG AAAAGGCTACCGAAAAGGGGTCCCGTCTCTTCTCTGGAGAGGAGGTGCGATTCTTTCCGG CATCTCTCGACTCCGAACTTGAAAGACTGAAGGAACGGCTGAGGCCGGGGAATTCGGTTC TCAAAGCAGTTCGAGACACAGGCGCTTTCTCGAAATTCGGAAGCGATGATAACTCTGCCA GATCGGATCGCTCTCGACACAACGAGCGCCGTTCGTCTTTGAGTGGGGCGGGTACTGGTG TGGATGACACTTTTGGGAACTCCAGAGCAGATAATCTTCGCGTGGAACCGGCGTCACGGC GACACACTGGAGAATATGCCCGAGGAACAAGTTTTCACGGGAACAGAAGACCAGAAACCG TGGAGAGACAGGAAAAATTGGTGGCAGGAAGATCGCTCCGGACCTCGCTCATTGAGACGC TTTCCGCCACCTCTCATCAAATTCACGTAGAGCGAAGTGCTGTCAAGTGTGGCCTGGACC ACATGCTGCAAAGGCAGGAACACAGCGGCTGGTTTCCTGGCCGCACGGAAAACTCCAAAG AATCCGGCGGCACGCAGGCGACCATTTCTGAACAGATGAGGGATCCGGCTGCTAACAAAG CCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT Altı çizili kısım: Open reading frame; Kırmızı baz: Hedef gen bölgesi; Yeşil baz: Vektöre ait bölge b) puET-D6 vektöründe D6 genini içeren ORF bölgesinin kodladığı protein (723 aminoasit) MRHHHHHHFKTKIENLTSQLEEQKEARWKAREAQDQAEVERKRHLAELERQLRVETLEKD ELREALERQTSRAESLMEELGTVRREGGSPNIGRLADRGCQVEPTVRSRGTQVEDTVMEY IRECTEISEEAMQGDETGRVRSRVRDMLDERNGNLRGRCLLRHEPTFLSSPPAEGLCSRK ESGEKSRKASVLEVEDDASIDGAVQAVENGVLKTASKAGTTTPSEGKGLKMLGTRTSIGC GVEKEDQAGKKEADLFSKVADVAFRAKAGSVGPFQRRGSEAEQKDQQADTSGQSRGERGA EISERNTTSDGLGSKDPSGRDKSPAVTGMKHYRDIKETPSIDKKLHADEDEGRQARDLSR SSSRDGPRSSSRDFDSFAVVRSKALEVLRRQRADPSDWEGCENVEKDHFGSRERHSNGEE FKTQGNVGRGSLRQEPFTDGVYHDRQQRFSEKEPAKPMFTSLADPSVRRHFKEEEERRKF QEKAEEEILRLLKRAAECSEEDLKREERSEKATEKGSRLFSGEEVRFFPASLDSELERLK ERLRPGNSVLKAVRDTGAFSKFGSDDNSARSDRSRHNERRSSLSGAGTGVDDTFGNSRAD NLRVEPASRRHTGEYARGTSFHGNRRPETVERQEKLVAGRSLRTSLIETLSATSHQIHVE RSAVKCGLDHMLQRQEHSGWFPGRTENSKESGGTQATISEQMRDPAANKARKEAELAAAT AEQÇizelge 3.3 F. Rekombinant H6 proteinine ait puET-H6 vektörü gen (a) ve protein (b) sekansları a) puET-H6 vektöründe H6 genini içeren ORF bölgesi (3232 bp) CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA TGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA CCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAG ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAA ACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT 52 AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAG CGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCG CCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT ATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGC GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGG TAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCG CGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGA TCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA TACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT ACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGA TAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCG CAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATA ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGTCACCATCATCACCATCATGGTC GAACCGCGAGGAGTCTGTACACGGCAACTCCCGGTTTGAGTGTGCGGCCGGCAGCGACGT CAACAGCAGCTTCTCTGCCGAAGCCGGCCTTCGTTCTGCCGCCGTTCGCAGCATCGAGAC TCGCTGTTTGTCCTCCTTCGCTTAGCCAGGAAGCCCAGGCTTCCTCTCTGCCGCCTGGCA CTTCAGAGGAGGACAGGGCAAACGCCCCGCCAGGATCCAGAGACAACGTCGGCGAACGGC TGGGCTTCGACGCAGCAGCGAAGGTCTGCGGAGATGCTGGCTCGACAGCAAAGACCGGTC AAGACAGCAGCCTGGGCGAGAGTGTCCTAAAGGGTGAGAATCTTTCGGAACAACAGACCC CGGATCCCTCACTCCCAGTCTTCTCCTCCTCTCCAGTGTCTGCGAGCGCTGGATTGTCTC AGGCGGCAGCTGCAGGAGGCGCCCGGAGCAGGAACCACAGTGGCCTCGACTTCGAGGGAG GAGGATCTTCAGATGGAGTCCATCTTGGAGGATCGACTGTCTCGCGTGAGCCTCGATCTC CCTGTCTTTCTGAAAGGAAAAGGACTCAGCCTTCTTGTTGCGAAGGACAGAGTGACGGGC AAGGCATCCACGTCGAAGGAAGTGGATCTTCGCCGTGTGTGGCGCCGGAGACGTCGATTG CCTCTCCCTTCGGTCTCCCGGGAGACCCGGCGTCCGTCTCTCTTTCTCCGCCTCTCCCTC AGTCTCTGTCGACGCCGGGACCTGCGCAGGCTCCTGCCGCGGCACTGATGCCGTCTTCTC CCCGTCTGAATGCCGACGCGTTTCCTGCTGATGGTGATCTTTCCTTCCCGACCGCCTTCG TTGCCTCGCAGCCAGCTGACGGGGCTGGTCAGGCGTCTTCGCGAGAGGAGACGTTCTCTC TGCATGCGTCTGGACGCCCGCGGGGCGGTCTGTCTGTCGCACTGGAGAGCAGCAGCGGGG ACGAAGAGGAGACGAGCAGCGTGACGCTGGACGACTCGAGCGAAGGGTCCCTGAGCTGGA GAGACACCTGGCGTCCTGCTGAGGAGGCAGTGGGTTACACGCACCGAAGAGTCTCCGGTG GCGAGACAGCAGATGCAGCCTCTCCACAGTTCGCCAGACGAGAGCTCGTCAGAGATCGAC AGCAGCGAACTCGCGGGGACGCAGCTCTCGAACGCCCGGACTGCAGCCGCGGCAGGCGAG 53 CCGGGTCTCCAGAAGCCGCAGGCATCCTGCAGACTCCCGCGTACGCTGCAGCTTTAAAGG AGTGGATGGAGGAACCCAGTTGCCCGAGAGAAGTCGACCTTGGGCACACACCGGAAGGCG AACAGACTCAACCGGATGGCGAAGGACGCCCTGAAGAATCCCGAAGCGTCGACGCGGGAC TCGCCGGCGCACGGTCCGAAGCGAAGGTGTCTGGACACCCTGGTGAGGTGTCTGGACACC CGAATGAGGAAATGTCGCAGTGGACGGAGGCGGCGATTCCGGAGACTGAATCGAACCGTA TTTCGTCTCCTCTTCATGCGCCAGTTCCAGCCGAATTGGCTGGCGGCCAGGGGTCCCAGC AGGTTCCTCCACCCGAGCCTCTGTGCAGTCAGCCGGTCCAGTGTCTCGACACCCCGGAAG TCATTGAGGAAGACCTCGTTCTCCAGGATCCTTGGAGCCCCGACCGCGTCGGGCCGCGTG AGGGGGGGAACGCGACGCGGGAGTCGGAGTTCCCCGAGGACTTCCGGGGCGTTTCTGAGC CTTTCAGCCCGTCTCCTGTCGAGGCAAGCTTGTCTGTGGCGGGTGCCGGTCTTTCTCAGA TCGCACCGTCTGCTTCGTCGTGTGCATCCGTCGCTTCTTTGGCACCTTCAGCTGCGTCGC CTCCCTCGCATTTCTACTCCACCGAGCTCGGTACCGAGGCGTCCCCGAAGCCGACTTCCC TTGGAGAAGAACCGGCTTTCCAGGGAACGGCTTTTCACGACGACCGCGGAACGCGATTCG GAGAAAGTCCTGTCGCGCGCGCGCCTGCAGTCGCTCTGCCGGCCGTGTCGATCCTCGGTC GACTTGACGGCTTTCGCGACGAGCCAAGTCCACTGGGTACGCACCGCACGCAGATTTTCC ATCTTGCAGACGCCGACGACGCGGGTGTGGGTGCGTCGAGCGTCCTTTCTCCAGGGGGTT TCGCTCTCGAGCCTCAGGACGAAGCCGGAGAGCAGAGCCGTCTTCGGGTGGAGGCGCAGG CCGCGCAGGGCGAGTTTGCGGGACAGTTGGGCTCCAGTCCTCCGGCGAACGCCCAGAGCA GCTGGGGAGACGAGAACGGGGAGGCGAAACCGCCGGCGCTGGACGGCGTCGATTGGTTCT ACCGCAGCGACGCGGCGGGAGAGAAGCACATGCAGGAGCAGGCTCTCGCGCAGGCGCAGC GGGCGGCGTTTTCGAGCGATTTCGAGGTAGCTGAGAGTGCAAGTGTCTTCTGTGAAGATG CAGGGCTCCAGAGAGAGGGCGTCATCGCGGCGTTCTCGGCGTCTGTCGAAGAGCTCGAAC GAACCAGTGGAACTGCGCTGGAGCAGCTGCAGGAGCAGCGGCGCTTGCGTCTCGAGCTGG AGCGTAAGAACACCCTGCTTCAGCGTCAACTGCATGCAGTCTTGGTTCTGCTCTCCCGCT TTTCGCTCTCGGGACAAGACCGGAGACGCCTCCTCCACCTCCTGCAGCCCGCTGCGTCGC CCAAGAGCGAGCTCATGCATGCGACATTGAATCCCAGCCAACGCGAGGAGACGCGCGAGG ACCCAGAAGACGCTGGAGACCGGCACCTCGAGGGCGCCGTCGCCGCGTGGACGGAGGCCA AAGGCGAGAAGGCGGTGAATTGCCTGGAATCCGAGGTGGCGGCGCTCGCAGGCTGGTCGA ACGGGAGAGGCGAGGACAGAGACTGGATGGTCACAAAGGACGTTTTAGACGAGGAGGGGA GACACCAAGCGGGGCGGTGCCTCTCGCAGCACACCATCGATGCAGCTCAGCTTTCGGGAG ATGAAGAAGACGCAGATTTCGACGCAGACCTCGTCGAGGCCGACGAGGTCAGGGAAGCGT TCAACACGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCG CTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGC TGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT Altı çizili kısım: Open reading frame; Kırmızı baz: Hedef gen bölgesi; Yeşil baz: Vektöre ait bölge b) puET-H6 vektöründe H6 genini içeren ORF bölgesinin kodladığı protein (1052 aminoasit) MRHHHHHHGRTARSLYTATPGLSVRPAATSTAASLPKPAFVLPPFAASRLAVCPPSLSQE AQASSLPPGTSEEDRANAPPGSRDNVGERLGFDAAAKVCGDAGSTAKTGQDSSLGESVLK GENLSEQQTPDPSLPVFSSSPVSASAGLSQAAAAGGARSRNHSGLDFEGGGSSDGVHLGG STVSREPRSPCLSERKRTQPSCCEGQSDGQGIHVEGSGSSPCVAPETSIASPFGLPGDPA SVSLSPPLPQSLSTPGPAQAPAAALMPSSPRLNADAFPADGDLSFPTAFVASQPADGAGQ ASSREETFSLHASGRPRGGLSVALESSSGDEEETSSVTLDDSSEGSLSWRDTWRPAEEAV GYTHRRVSGGETADAASPQFARRELVRDRQQRTRGDAALERPDCSRGRRAGSPEAAGILQ TPAYAAALKEWMEEPSCPREVDLGHTPEGEQTQPDGEGRPEESRSVDAGLAGARSEAKVS GHPGEVSGHPNEEMSQWTEAAIPETESNRISSPLHAPVPAELAGGQGSQQVPPPEPLCSQ PVQCLDTPEVIEEDLVLQDPWSPDRVGPREGGNATRESEFPEDFRGVSEPFSPSPVEASL SVAGAGLSQIAPSASSCASVASLAPSAASPPSHFYSTELGTEASPKPTSLGEEPAFQGTA FHDDRGTRFGESPVARAPAVALPAVSILGRLDGFRDEPSPLGTHRTQIFHLADADDAGVG ASSVLSPGGFALEPQDEAGEQSRLRVEAQAAQGEFAGQLGSSPPANAQSSWGDENGEAKP PALDGVDWFYRSDAAGEKHMQEQALAQAQRAAFSSDFEVAESASVFCEDAGLQREGVIAA FSASVEELERTSGTALEQLQEQRRLRLELERKNTLLQRQLHAVLVLLSRFSLSGQDRRRL LHLLQPAASPKSELMHATLNPSQREETREDPEDAGDRHLEGAVAAWTEAKGEKAVNCLES EVAALAGWSNGRGEDRDWMVTKDVLDEEGRHQAGRCLSQHTIDAAQLSGDEEDADFDADL VEADEVREAFNTDPAANKARKEAELAAATAEQ- 54 3.6 Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması Rekombinant proteinler iki basamakta tarif edildiği gibi saflaştırılmışlardır (Döşkaya et al., 2007; Gedik et al., 2013; Döşkaya et al., 2014). Bunun için öncelikle hücre pelletleri üzerine 300 ml resüspansiyon tamponu (50 mM Tris-Cl, 0,3 M NaCl, pH 7,5) eklenmiş ve homojenizatörde (blender) (Waring, A.B.D.) 30-40 saniye boyunca homojenize edilmiştir. Daha sora homojenize hücreler soğutmalı ortamda iki kere 18.000 psi basınç altından geçirilerek parçalanmıştır (Microfluidizer, Microfluidics M110 L Pneumatic, A.B.D.). Parçalanmış hücreleri içeren homojenat soğutmalı santrifüjde 30.000×g’de 4oC’de 30 dakika süreyle santrifüj edilmiştir. Berrak üst sıvı protein bağlama kapasitesi düşük ve delik çapı 0,45 µm selüloz asetat filtreden (Corning, A.B.D.) geçirilmiştir. Proteinlerin saflaştırılması ÄKTA Hızlı Protein Sıvı Kromotografi Cihazı (FPLC: Fast Protein Liquid Chromotography) ve UNICORNTM programı kullanılarak yapılmıştır (GE Health, A.B.D.). Saflaştırmanın ilk aşamasında 5 ml HiTrap Ni2+ şelasyon HP kolonu (Afinite kolonu, GE Health A.B.D.) kullanılmıştır. Bu işlem sırasında kolondan, filtre edilmiş ortalama 100 ml üst sıvı geçirilmiştir. Kolona protein yüklenmesi sırasında resüspansiyon tamponu (50 mM Tris-Cl, 0,3 M NaCl, pH 7,5) kullanılmıştır. Yükleme tamamlandıktan sonra kolon, rekombinant proteinleri serbestleştirmek amacıyla yıkama tamponundaki imidazol miktarı 50 mM’dan başlayarak 100 mM, 250 mM ve 500 mM’a kadar arttırılarak yıkanmıştır. Kolondan ayrışan proteinlerin yaptığı pikler UV 280 mAU ile görüntülenmiş ve fraksiyon toplayıcı ile toplanmıştır. Toplanan proteinler %12’lik SDS-PAGE ve Western Blot ile görüntülendikten sonra (Bkz. Bölüm 3.7) 10.000 Dalton (MWCO) delik çaplı polieetersülfon santrifüj filtreleri (Vivaspin 20, Sartorius, Almanya) kullanılarak 8000×g’de 4oC’de 1-2 ml’ye ulaşıncaya kadar konsantre edilmiştir. Saflaştırmanın ikinci aşamasında ise konsantre edilen rekombinant proteinler hem daha ileri saflaştırmanın sağlanması hem de endotoksin seviyelerinin azaltılması amacıyla Superdex 200/10-300 GL (100000-600000 MWCO) jel filtrasyon kolonuna yüklenmişlerdir. ayrışan proteinlerin yaptığı pikler UV 280 mAU ile görüntülenmiş ve fraksiyon toplayıcı ile toplanmıştır. Elde edilen saf proteinler %12’lik SDS-PAGE ve Western Blot ile görüntülendikten sonra (Bkz. Bölüm 3.7) 10.000 Dalton (MWCO) delik çaplı polieetersülfon santrifüj filtreleri (Vivaspin 20, Sartorius, Almanya) kullanılarak 55 8000×g’de 4oC’de 1-2 ml’ye ulaşıncaya kadar konsantre edilmiş ve -80 oC’ye depolanmıştır. 3.7 Sodyum Dedosil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve Western Blot Saflaştrılmış proteinler %12’lik SDS PAGE ile ayrılmışlardır. SDSPAGE uygulanırken ilk olarak alt (ayırıcı) jel daha sonra üst (yığıcı) jel hazırlanmış ve proteinler jellere yüklenerek moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılmışlardır. %12’lik alt jel; 2,8 ml distile su, 2 ml 0,45 µm’lik filtreden geçirilmiş 1,5 M Tris-Cl pH 8,8 ve %0,4 SDS (w/v)’den oluşan alt jel tamponu, 3,2 ml akrilamit (%30’luk solüsyon), 40 µl %10’luk Amonyum persülfat ve 8 µl TEMED (tetramethylethylenediamine) karışımından oluşturulmuştur. Hazırlanan karışım hızlıca, pipet yardımıyla üretici firmanın (Bio-Rad, A.B.D.) tarifine uygun olarak iki cam arasına aktarılmıştır. Alt jelin üzerine 200 µl distile su eklenerek oda sıcaklığında yaklaşık olarak 15-20 dakika beklenmiş ve jelin polimerizasyonu sağlanmıştır. Üst jel; 1,5 ml distile su, 0,625 ml 0,45 µm’lik filtreden geçirilmiş 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 ve %0,4 SDS (w/v)’den oluşan üst jel tamponu, 0,335 ml akrilamit (%30’luk solüsyon), 12,5 %10’luk Amonyum persülfat ve 2,5 µl TEMED kullanılarak hazırlanmış ve pipet ile alt jelin üzerine eklenmiştir. Sisteme ait taraklar yerleştirilmiş ve jelin donması için beklenmiştir. Jellerin polimerizasyonu gerçekleştikten sonra taraklar çıkartılmış ve jeller üretici firmanın tarifine uygun olarak plastik hazne içerisine yerleştirilmiştir. Jeller hazneye yerleştirildikten sonra içerisine yürütme tamponu (62,5 mM Tris, %0,05 SDS (w/v), 200 mM glisin) eklenmiştir. Rekombinant proteinler 2× örnek yükleme tamponuyla (125 mM Tris-Cl pH 6,8, %4’lük SDS, %10’luk bromfenol mavisi, %20’lik gliserol ve %10’luk beta-merkaptoetanol) 1:1 oranında karıştırılmışlardır. 95 oC’de 3 dakika bekletilmiş ve jeldeki kuyucuklara ortalam 25 µl yüklenmişlerdir. Her jelin bir kuyucuğuna ise 2 µl protein merdiveni (Pageruler Plus, Prestained, Fermentas, A.B.D.) yüklenmiştir. Proteinler ilk 20 dakika 60 V’ta daha sonra ise 100-110 V’ta yürütülmüşlerdir. 56 Proteinler ayrıştıktan sonra jeller boyama solüsyonu (%45 Metanol (v/v), %10 Glasial asetik asit (v/v), %0,1 Coomassie mavisi G-250 (w/v) ve distile su karışımıyla elde edilir) içeren kapalı kaplara alınmış çalkalayıcıda 1 gece boyunca oda sıcaklığında boyanmaları sağlanmıştır. Ertesi gün jel üzerindeki fazla boya alınmış ve üzerine boya uzaklaştırıcı solüsyon (%45 Metanol (v/v), %10 Glasial asetik asit (v/v) ve distile su karışımından oluşur) eklenerek çalkalayıcıda 1 gece boyunca oda sıcaklığında fazla boyanın çıkarılması sağlanmıştır. Western blot aşamasında %12 jelden PVDF (Polyvinylidene difluoride) transfer membranları (Immobilon-P, Millipore, A.B.D.) membrana proteinlerin geçişini sağlamak amacıyla 1 saat boyunca 100 V uygulanmıştır. Transfer tamamlandıktan sonra PVDF transfer membranlar dikkatlice alınmış ve bloklama tamponunda [%6,25 yağsız süt tozu içeren 1×TBS-T tamponu (20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl pH:7,8, %0,1 Tween 20)] 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edilmiştir. Bloklama sonrası membranlar 1/3333 oranında bloklama tamponuyla sulandırılmış monoklonal antpolihistidin antikor (Sigma-Aldrich, A.B.D) ile 1 buçuk saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanarak inkübe edilmiştir. Süre sonunda membranlar 1×TBS-T tamponu ile üç kere kısa ve üç kere 3’er dakika yıkanmıştır. 1×TBS-T tamponu ile 1/3333 oranında sulandırılmış alkalin fosfatazkonjuge edilmiş keçi kaynaklı anti-fare IgG (H+L) antikoru (Sigma-Aldrich, A.B.D.) ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanarak inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda membranlar 1×TBS-T tamponu ile üç kere kısa ve üç kere 3’er dakika yıkanmıştır. Daha sonra 1×TBS (20 mM Tris-Cl, 0,5 M NaCl pH:7,8) tamponu ile yine üç kere kısa süreli hızlı yıkamayla ve üç kere 3’er dakikalık yıkamalarla yıkanmıştır. Yıkamalar bittikten sonra bantların görüntülenebilmesi amacıyla 250:2:1 oranında dietanolamin tampon (%10 Dietanolamin, 4 M HCl pH9,8, 0,5 mM MgCl2·6H2O), %70 Dimetilformamid içinde çözdürülen %4,3 BCIP ile karıştırılarak boyama tamponu hazırlanmıştır. Boyama tamponu her bir PVDF membranı üzerine eklenmiş ve karanlık ortamda ortalama 15 dakika oda sıcaklığında çalkalanarak inkübe edilmiştir. Süre sonunda membran, distile su ile yıkanarak reaksiyon durdurulmuştur. 3.8 Saflaştırılmış Belirlenmesi Rekombinant Proteinlerde Endotoksin Seviyesinin Saflaştırılan rekombinant proteinlerdeki endotoksin seviyesi, Pyrotell Limulus Ameobocyte Lysate (LAL) Gel-Clot Endotoxcin Testi (Cape Cod Inc, A.B.D.) kullanılarak küçük test tüplerinde üretici firmanın protokolüne uygun 57 olarak ölçülmüştür. Endotoksin seviyesi 0,25 EU/ml hassasiyete sahip test kullanılmıştır. Pozitif kontrol olarak E. coli O113:H10 kontrol standart endotoksini (Cape Cod Inc, A.B.D.), negatif konrol olarak ise LAL reaktif suyu (LRW, Cape Cod Inc, A.B.D.) kullanılmıştır. 3.9 Rekombinant Proteinlerin Miktarlarının Kantitatif Olarak Belirlenmesi Elde edilen rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinlerin içerdiği ml’deki protein miktarlarını belirlemek amacıyla Bradford Protein Analiz Yöntemi kullanılmıştır. Ölçüm ticari kit (Coomassie Plus Protein Assay Reagent Kit, Pierce, A.B.D.) ve spektrofotometre (NanaDrop, A.B.D.) kullanılarak yapılmıştır. Analiz sırasında standart eğri sığır serum albüminin (BSA) sulandırılmasıyla elde edilmiştir. 3.10 Multivalan Rekombinant Protein Aşı Formülasyonunun Oluşturulması ve Uygulanması Saflaştırılmış rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinlerinin herbiri için bir karışım oluşturulmuş ve altı karışım en sonda birleştirilmiştir. Karışımlar tarif edildiği gibi oluşturulmuştur. Kısaca, rekombinant protein (20 µg) + rekombinant protein hacmi kadar Montanide ISA 50V (Seppic, Fransa) birbirine eklenmiş, 30 saniye hızla karıştırılmış ve insülin enjektörü ile 5 defa alınıp verilmiştir. Aşı denemesi için 6-8 haftalık, her biri 11’şer adet dişi Swiss outbred fare içeren birer aşı ve üçer kontrol grubu oluşturulmuştur (Çizelge 3.4). Kontrol gruplarında bir grup fareye intraperitoneal yoldan 100 µl PBS, diğer gruba 50 PBS (+) 50 µl Montanide ISA 50V karışımı uygulanmıştır. Bunun yanında montanide adjuvantı içermeyen altı rekombinant proteinden oluşan kontrol grubu oluşturulmuştur. Son gruba yukarıda anlatıldığı gibi hazılanan altı rekombinant protein (+) Montanide ISA 50V içeren multivalan rekombinant protein aşısı uygulanmıştır (Çizelge 3.4). Aşılar farelere üç hafta aralıklarla iki defa intraperitoneal yoldan uygulanmıştır. Fare kuyruk kanları her aşılamadan 3 hafta sonra anestezi altında [Anestezi için farelere finalde 100 mg/kg ketamine (Ketalar, Parke-Davis, A.B.D.) ve 3mg/kg xylazine (Alfazyne, Alfasan International BV, Hollanda) toplanmıştır. 58 Çizelge 3.4 Multivalan rekombinant protein aşısı ve kontrol grupları Aşı adı Formülasyon Aşı tipi İçerik PBS PBS Kontrol 100 µl PBS Montanide Montanide ISA 50V Kontrol 100 µl Montanide (+) 100 µl PBS 6-Valant rH2 (+) rA4 (+) rE4 (+) rD6 (+) rE6 (+) rH6 Kontrol Altı farklı rekombinant protein (her biri 20 µg; toplam hacim PBS ile 200 µl yapılmıştır) 6-Valant (+) Montanide rH2 (+) rA4 (+) rE4 (+) rD6 (+) rE6 (+) rH6 (+) Montanide ISA 50V Aşı 100 µl içinde altı farklı rekombinant protein (her biri 20 µg) (+) 100 µl Montanide 3.11 Aşılama ile T. gondii Ankara Suşu Takizotilerine Karşı Oluşan Korunmanın Değerlendirilmesi Multivalan rekombinant protein aşısının koruyuculuğunu belirlemek amacıyla her gruptan 8 farenin her biri 1×105 T. gondii Ankara suşu takizoiti ile ilk aşılamadan 9 hafta sonra intraperitoneal yoldan enfekte edilmişlerdir (Döşkaya et al., 2007). Daha sonra fareler hergün gözlemlenmiş ve yaşam zamanları kayıt edilmiştir. 3.12 Humoral İmmun Yanıtın Belirlenmesi Aşılamadan sonra farelerde rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinlerine karşı oluşan total IgG, IgG1 ve IgG2a antikor yanıtlarını belirlemek amacıyla Rekombinant ELISA (Recombinant Enzyme Linked Immunosorbent Assay; RecELISA) yöntemi tarif edildiği gibi uygulanmıştır (Döşkaya et al., 2014). Öncelikle 96 gözlü mikroplaklarının (Nunc, A.B.D.) kuyucukları 3 kez 300 µl PBS-T (%0,05 Tween-20 içeren PBS, pH:7,4) ile yıkanmıştır. Daha sonra kuyucuklara, son konsantrasyonu 5 µg/ml olacak şekilde 1×PBS tamponu ile sulandırılan rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımından 100 µl eklenmiş ve gece boyunca 4oC’de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda her kuyucuk 300 µl PBS-T ile 3 kere yıkanmıştır. Yıkama sonrasında her kuyucuğa 200 µl bloklama tamponu (%5’lik yağsız süt tozu içeren %0,05 PBS-T) eklenmiş ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalayıcıda inkübe edilmiştir. Süre sonunda plaklar 300 µl PBS-T ile 3 kez yıkanmıştır. Bu sırada fare serumları 10 mg/ml E. coli eriyiğini içeren bloklama tamponu ile 1/100 oranında sulandırılarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmiş ve sonrasında kuyucuklara 100 µl eklenmiştir. Serum örnekleri çift kuyucukta çalışılmıştır. Plaklar oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalayıcıda 59 inkübe edildikten sonra 3 kez 300 µl PBS-T ile yıkanmıştır. Yıkama sonunda kuyucuklara %0,05 PBS-T ile sırasıyla 1/2000, 1/1000 ve 1/1500 oranlarında sulandırılan peroksidaz işaretli anti-fare IgG (γ-bağına spesifik) (Sigma-Aldrich, A.B.D.), peroksidaz işaretli anti-fare IgG1 (Jackson Immunoresearch, A.B.D.) ve peroksidaz işaretli anti-fare IgG2a (Jackson Immunoresearch, A.B.D.) antikorundan 100 µl eklenmiştir. Plaklar oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalayıcıda inkübe edilmiştir. Süre sonunda plaklar 3 kez 300 µl PBS-T ile yıkanmış ve renk oluşturucu substrat olarak her kuyucuğa 10:1 oranında hazırlanan TMB tampon [(70,4 mM Na2HPO4, 36,4 mM sitrik asit, %7 (v/v) dimetilasetamid, %0,016 (v/v) H2O2 distile suya eklenerek hazırlanır) ve TMB stok (0,1 mM 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin, %4 (v/v) dimetilasetamid distile suya eklenerek hazırlanır. pH: 2,0 4 M HCl ile ayarlanır)] solüsyonundan 100 µl eklenmiştir. Plaklar karanlık ortamda yaklaşık olarak 10 dakika bekletildikten sonra 75 µl durdurma solüsyonu [2 N H2SO4 (Merck, A.B.D.)] eklenerek reaksiyon durdurulmuştur. Absorbans değeri (AD) 450 nm dalga boyunda mikroplak okuyucusunda (Bio-Tek EL×808, A.B.D.) belirlenmiştir. Serum örneklerinden elde edilen absorbans değeri (AD) negatif kontrollere ait ortalama AD (+) 2× standart sapma üzerine çıktığında, değer pozitif kabul edilmiştir. 3.12.1 Eriyik E. coli proteininin hazırlanması Farelerde aşılama ile uyarılan antikor yanıtının araştırılmasında kullanılan Rec-ELISA testinde eriyik E. coli proteini tarif edildiği gibi hazırlanmıştır (Liang et al., 2011; Döşkaya et al., 2014). E. coli eriyiği özellikle E. coli’ye karşı oluşmuş antikorların çapraz reaksiyon vermemesi için serum örneklerine eklenmekte ve inkübe edilmektedir. Bunun için E. coli BL21 Star (DE3) pLysS hücreleri antibiyotik içermeyen 250 ml LB besin ortamında gece boyunca inkübe edilmiş ve sonrasında 5000×g’de 10 dakika santrifüj edilerek, üst sıvı atılmıştır. Tartılan pellet 10 ml TBS tamponu ile homojenize edilmiş, 18.000 psi basınç altında soğutmalı ortamda 2 kere yüksek basınçlı homojenizatörden geçirilmiştir. Sonrasında eriyik protein miktarı 100 mg/ml olacak şekilde TBS ile sulandırılmış, % 0,05 oranında Twenn 20 eklenmiş, karıştırılmış ve -80°C’de kullanıma kadar saklanmıştır. 3.13 Hücresel İmmun Yanıtın Belirlenmesi İlk aşılamadan 6 hafta sonra dört gruptan 3’er adet Swiss webster outbred farenin dalakları steril olarak çıkarılmıştır. Dalak hücrelerinden hazırlanan tek 60 hücre süspansiyonları rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinleri ile uyarılmıştır. %5 CO2 ve 37 oC’de inkübe edilen hücrelerden salgılanan sitokin miktarı ELISA ile belirlenmiştir (Döşkaya et al., 2007). Ayrıca IFN-γ ve IL-4 salgılayan CD4 T lenfositlerinin oranı, IFN-γ salgılayan CD8 T lenfositlerinin oranı flow sitometri ile araştırılmıştır (Gülce İz et al., 2013; Polat et al., 2013; Gülce İz et al., 2014). IFN-γ aktifleşmiş doğal katil (NK) hücreleri ve T hücreleri tarafından salgılanıp viral, bazı bakteriyel ve protozoon enfenksiyonlarında etkili olmaktadır. IFN-γ, antijene özgü immun yanıt geliştiği zaman CD4 TH ve CD8 Tc hücreleri tarafından da üretilmektedir (BioLegend, 2014). IL-4 aktifleşmiş T hücreleri, mast hücreleri ve bazofiller tarafından üretilen pleitropik (bir sitokinin birden çok hücre tipi üzerine etkili olması) sitokindir. IL-4 birden fazla biyolojik yanıtta rol oynar fakat iki ana fonksiyonu vardır: 1) CD4 T hücrelerinin TH2 hücrelerine dönüşmesini sağlamak 2) TH1 hücreleri tarafından oluşturulan hücre aracılı immun yanıtın bastırıldığı sırada TH2 hücreleri tarafından IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 üretilmesi humoral immun yanıt oluşumunu sağlamaktadır. Bunun yanında farelerde B hücrelerinin ürettiği IgE ve IgG1 üretimini regüle etmektedir (BioLegend, 2014). 3.13.1 Tek Hücre Süspansiyonlarının Hazırlanması Steril şartlar altında alınan fare dalakları, steril edilmiş iki buzlu mikroskop lamı arasında Ca2+ ve Mg2+ ile fenol kırmızısı içermeyen Hank’ın dengeli tuz solüsyonunda (HBSS, Biochrom, Almanya) ezilerek homojenize edilmiştir. Dalak hücreleri 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edildikten sonra üst sıvı atılmış ve hücreler 1 ml kırmızı kan hücre yıkıcı solüsyon (15 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH:7,4) ile tekrar süspanse edilerek 3 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Ardından 5 ml HBSS eklenerek izotonik ortam oluşturularak 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı atılmıştır. Daha sonra hücreler 10 ml geliştirme besiyeri [1×RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, A.B.D.), %10 yeni doğan buzağı serumu (NBCS, HyClone, Thermo Fisher Scientific, A.B.D.), 2 mM L-glutamin (Gibco, Invitrogen, A.B.D.), 1×penisilin– streptomisin solüsyonu (100 U/ml penisilin, 100 µg/ml streptomisin) (SigmaAldrich, A.B.D.), 0,1 mM esansiyel olmayan aminoasitler (Gibco, Invitrogen, A.B.D.) 1,0 mM sodyum piruvat (Gibco, Invitrogen, A.B.D.), 55 µM 2merkaptoetanol] ile süspanse edilmiştir. Hücrelerin canlılığı ve miktarı %0,4 tripan mavisi ve hemositometre ile saptanmıştır. Her bir fareye ait süspansiyon 61 5×106 hücre/ml içerecek şekilde geliştirme besiyeriyle sulandırılmış ve yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu hücre kültürü plaklarına 100 µl çift çukur olacak şekilde eklenmiştir. Dalak hücre süspansiyonları son konsantrasyonları 200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml ve 25 µg/ml olan rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımı ile uyarılmıştır. Protein karışımı hücrelere eklenmeden önce son konsantrasyonu 50 µg/ml olan polymyxin B ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmiştir. Pozitif kontrol olarak her çeşit aşılamadan ve kontrol gruplarına ait dalak hücre süspansiyonları son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde Concavalin A (Sigma-Aldrich, Almanya) ile inkübe edilmiştir. Negatif kontrol olarak ise geliştirme besiyeri kullanılmıştır. Her bir çukurda bulunan hücreler %5 CO2 ve 37oC’de 72 saat inkübe edilmiştir. Flow sitometri uygulanacak plaklardaki kuyucuklara inkübasyonun son 4 saatinde Monensin, son konsantrasyonu 0,66 µl/ml olacak şekilde üretici firmanın protokolüne (BD Biosciences, A.B.D.) uygun olarak eklenmiştir. Monensin; Golgi cisimciğinden intrasellüler protein taşınımını bloklayarak Golgi içindeki sitokinin birikimine veya dağılmamasına neden olur. Böylece hücre içinde boyanan sitokinlerin doğru sinyaller vermesine neden olmaktadır. 3.13.2 Hücre Dışına Salgılanan Sitokin Miktarının Sitokin ELISA ile Belirlenmesi Hücre dışına salgılanan sitokin miktarının belirlenmesi amacıyla hazırlanan plaklar 4oC’de 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı ayrı plaklara alınmıştır. Üstsıvıda IFN-γ ve IL-4 miktarının ölçülmesi için ELISA üretici firmanın protokolüne göre uygulanmıştır (BioLegend, A.B.D.). Öncelikle ELISA plağı 4 kez 300 µl yıkama tamponuyla yıkanmıştır. Bu sırada kit ile gelen IFN-γ ve IL-4 standartlar üretici firmanın protokolüne uygun olarak reaktif solüsyon kullanılarak sulandırılmıştır (IFN-γ için 2000 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,2 pg/ml ve 0 pg/ml) (IL-4 için 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml, 15,6 pg/ml, 7,8 pg/ml, 3,9 pg/ml, 2 pg/ml ve 0 pg/ml). Daha sonra ELISA plağının her bir kuyucuğuna 50 µl plak reaktif tamponu ve 50 µl hücre kültürü üst sıvısı veya kontroller çift çukur eklenmiş, çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası kuyucuklar 4 kez yıkama tamponuyla yıkanıp kit içinde bulunan antikor solüsyonundan her 62 kuyucuğa 100 µl ilave edilmiş oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalayıcıda inkübe edilmiştir. Kuyucuklar 4 kez yıkama tamponuyla yıkanmış ve kit içinde bulunan Avidin-HRP A solüsyonundan 100 µl eklenerek oda sıcaklığında, çalkalayıcıda 30 dakika inkübe edilmiştir. Daha sonra kuyucuklar 5 kez yıkama tamponuyla yıkanmıştır. Yıkama sonrası kite ait substrat solüsyonundan 100 µl kuyucuklara eklenip oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edilmiştir. Süre sonunda 100 µl durdurma solüsyonuyla reaksiyon durdurulmuş ve absorbans değeri 450 nm mikroplak okuyucu ile ölçülmüştür. Üretici firma tarafından belirlenenen ELISA IFN-γ testinin duyarlılık sınırı 8 pg/ml, test aralığı ise 2000 pg/ml-31,3 pg/ml’dir. ELISA IL-4 testinin duyarlılık sınırı 0,5 pg/ml, test aralığı ise 125 pg/ml-2 pg/ml’dir. 3.13.3 Flow sitometri ile Hücre İçi Sitokin Salgılayan T Lenfosit Oranının Belirlenmesi Öncelikle T lenfosit kümesinin belirlenmesi amacıyla CD3 yüzey antijeni boyalı hücreler belirlenmiştir. Sonrasında IFN-γ ve IL-4 salgılayan CD4 TH lenfositler ile IFN-γ salgılayan CD8 Tc lenfositlerinin oranı flow sitometri ile değerlendirilmiştir. 3.13.3.1 Yüzey Antijeni CD3’ün Belirlenmesi Kontrol ve aşı grubu fare dalak hücrelerinin lenfosit miktarını belirlemek amacıyla; T lenfosit yüzey antijeni olan CD3 reseptörü Alexa flour 647-A işaretli anti-fare CD3 antikoru ile boyanmıştır. Boyama Cytofix/Cytoperm Plus Fiksasyon/Permeabilizasyon kiti (BD Biosciences, A.B.D.) üretici firmanın protokolüne uygun olarak yapılmıştır. Bölüm 3.13.1’de anlatıldığı gibi hazırlanan tek hücre süspansiyon plakları inkübasyon sonunda 4oC’de 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı dökülmüştür. CD3 reseptör içeren T lenfositlerinin miktarını belirlemek amacıyla her gruba ait 3’er kuyucuk (her kuyucuk ortalama 1×106 hücre içerir) 50 µl boyama tamponu içerisinde 0,5 µg anti-fare CD3 antikoru (0,5 µg/106 hücre oranında olacak şekilde) eklenip karanlıkta, 4oC’de 30 dakika inkübe edilmiştir. Süre sonunda hücrelere 250 µl boyama tamponu eklenmiş ve 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek üst sıvı dökülmüştür. Bu işlem iki kere daha tekrarlanmıştır. Hücreler 100 µl Cytofix/Cytoperm Plus (BD Biosciences, A.B.D.) 63 fiksasyon/permeabilizasyon solüsyonunda süspanse edilmiş ve karanlıkta 4oC’de 20 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrasında hücrelere 250 µl permeabilizasyon yıkama tamponu (Perm/Wash, BD, A.B.D.) eklenerek 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı atılmıştır. Bu işlem iki kez tekrarlanmıştır. Yıkama sonrası hücreler 500 µl boyama tamponunda süspanse edilmiş ve flow sitometriye geçilmiştir. Yüzey antijenlerinin flow sitometri (BD FACSAria, BD Biosciences, A.B.D.) ile belirlenebilmesi için cihazın floresan ışık algılayan kanallarında 10 4 dalak hücresi geçirilerek CD3 reseptör içeren T hücreleri belirlenmiştir. Elde edilen veriler, BD FACSDiva programı (BD Biosciences, A.B.D.) kullanarak analiz edilmiştir. 3.13.3.2 CD4 ve CD8 reseptörlü T Lenfositlere Ait Hücre İçi Sitokinlerin Belirlenmesi Kontrol ve aşılanmış fare gruplarına ait CD4 reseptörlü TH ve CD8 Tc lenfositlerinin ürettiği hücre içi sitokinlerin (IFN-γ ve IL-4) belirlenebilmesi için aynı gruba ait 3 ayrı fareye ait hücrelerin bulunduğu 3’er kuyucuk Çizelge 3.5’te belirtilen antikorlar ile boyanmıştır. Boyama Cytofix/Cytoperm Plus Fiksasyon/Permeabilizasyon kiti ile üretici Biosciences, A.B.D.) uygun olarak yapılmıştır. firmanın protokolüne (BD Çizelge 3.5 CD4 ve CD8 reseptörlü T hücrelerin salgıladığı hücre içi sitokinlerin belirlenmesinde kullanılan antikorlar Grup Yüzey reseptör bağlayan antikor Hücre için sitokin bağlayan antikor CD4 ve IFN-γ FITC işaretli anti-fare CD4 PE işaretli anti-fare IFN-γ CD4 ve IL-4 FITC işaretli anti-fare CD4 PE işaretli anti-fare IL-4 CD8 ve IFN-γ FITC işaretli anti-fare CD8 PE işaretli anti-fare IFN-γ FITC: Floresan izosiyanat; PE: R-phycoerythin, fikoeritrin Bölüm 3.13.1’de anlatıldığı gibi hazırlanan tek hücre süspansiyon plakları inkübasyon sonunda 4oC’de 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı dökülmüştür. Her gruba ait 3’er kuyucuk (her kuyucuk ortalama 1×106 hücre içerir) 50 µl boyama tamponu içinde 0,5 µg FITC işaretli anti-fare CD4 (iki kuyucuk) ve 0,5 µg FITC işaretli anti-fare CD8a (bir kuyucuk) antikorları eklenerek karanlıkta 4oC’de, 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası 64 hücreler 250 µl boyama tamponu eklenerek 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş üst sıvı atılmıştır. Bu işlem iki kere daha tekrar edilmiştir. Hücreler 100 µl Cytofix/Cytoperm fiksasyon/permeabilizasyon solüsyonuyla (BD, A.B.D.) süspanse edilmiş ve karanlıkta 40C’de 20 dakika inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda hücrelere 250 µl permeabilizasyon yıkama tamponu eklenerek 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı dökülmüştür. Bu işlem iki kere tekrarlanmıştır. Daha sonra 50 µl permeabilizasyon yıkama tamponu içinde 0,5 µg/106 hücre olacak şekilde sulandırılan PE işaretli anti-fare IFN-γ (CD4+ ve CD8+ boyalı hücrelerin bulunduğu iki kuyucuğa) ve 0,5 µg/106 hücre olacak şekilde sulandırılan PE işaretli anti-fare IL-4 (CD4+ boyalı hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğa) antikorları eklenerek karanlıkta 4oC’de 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası hücrelere 250 µl permeabilizasyon yıkama tamponu eklenerek 1500 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı atılmıştır. Bu işlem iki kere tekrarlanmıştır. Hücreler 500 µl boyama tamponunda süspanse edilmiştir. Hücre içi sitokinlerin flow sitometri ile belirlenebilmesi için, BD FACSAria cihazının floresan ışın algılayan kanallarında 104 dalak hücresi geçirilerek CD4+ ve CD8+ T lenfositlerinin salgıladığı IFN-γ ve IL-4 oranları belirlenmiştir. Elde edilen veriler BD FACSDiva programı (BD Biosciences, A.B.D.) kullanılarak analiz edilmiştir. 3.14 İstatiksel Analiz Çalışma sırasında elde edilen veriler Microsoft Excel 2010 programı ile işlemden geçirilmiş ve istatiksel analiz Prism 3.03 programı (GraphPad, San Diego, CA) ile gerçekleştirilmiştir. Aşılama grupları arasındaki farkı değerlendirmek için çift kuyruklu t testi ve tek yönlü varyans analizinden yararlanılmıştır. Aşının letal toxoplasmozise karşı oluşturğu korumayı göstermek için Kaplan-Meier yaşam eğrilerinden yararlanılmıştır. Humoral ve hücresel immun yanıt sonuçları ve yaşam süreleri, aritmetik ortalama ± standart sapma olarak verilmiş, aksi belirtilmediği takdirde, 0,05 ve daha küçük P değerleri anlamlı olarak yorumlanmıştır. 65 4. BULGULAR 4.1 T. gondii’ye ait 49 Aşı Adayı Olabilecek Rekombinant Proteini Kodlayan Plazmitlerinin Gösterilmesi Bu çalışmada öncelikle aşı adayı olabilecek 49 tane antijenik proteini kodlayan plazmitlerin protein ekspresyonunun yapılacağı E. coli BL21 Star (DE3) pLysS hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Seçilen kolonilerde plazmitlerin varlığını göstermek amacıyla kolonilerden plazmit saflaştırma kiti ile izole edilen plazmitler %1 agaroz jelde yürütülmüştür (Şekil 4.1). 4.2 Antijenik Rekombinant Proteinlerin Ekspresyon Seviyeleri Bu çalışmada 49 ayrı antijenik proteinin üretimini sağlamak ve hangilerinin aşıda kullanılacağını belirleyebilmek amacıyla E. coli BL21 Star (DE3) pLysS hücrelerinde küçük ölçekli rekombinant protein ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Eksprese olan rekombinant proteinler Ni2+ ile kaplanmış boncuklar kullanılarak saflaştırılmış ve Western Blot ile görüntülenmiştir (Şekil 4.2). Elde edilen sonuçlara göre 49 antijenik protein kodlayan plazmit arasında 6 tanesinin (rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6) aşı geliştirmeye uygun şekilde eksprese olduğu saptanmıştır. Western blot görüntülerinde 6 rekombinant proteinin ortalama moleküler ağırlıkları rH2: 26,7 kDa, rA4: 33,9 kDa, rE4: 38,8 kDa, rD6: 78,1 kDa, rE6: 81,2 kDa, rH6: 110,2 kDa’dur. 66 Şekil 4.1 Aşı çalışmalarında kullanılabilecek 49 rekombinant proteini kodlayan plazmitlerin agaroz jel görüntüsü; (A) 1-17; sütun: puET-A1; puET-B1; puET-C1; puET-D1; puET-E1; puET-F1; puET-G1; puET-H1; puET-A2; puET-B2; puET-C2; puET-D2; puET-E2; puET-F2; puET-G2; puET-H2; puET-A3 (B) 18-35; sütun: puET-B3; puET-C3; puET-D3; puET-E3; puET-F3; puET-G3; puET-H3; puET-A4; puET-B4; puET-C4; puET-D4; puET-E4; puET-F4; puET-G4; puET-H4; puET-A5; puET-B5; puET-C5 (C) 36-49; sütun: puET-D5; puET-E5; puET-F5; puET-G5; puET-H5; puET-A6; puET-B6; puET-C6; puET-D6; puET-E6; puET-F6; puET-G6; puET-H6; puET-A7 Şekil 4.2 Aşı adayı 6 rekombinant proteinin optimizasyon amaçlı protein ekspresyonlarının Western blot ile gösterilmesi. 1. sütun: protein merdiveni; 2. sütun: rH2; 3. sütun: rA4; 4. sütun: rE4; 4. sütun: rD6; 5. sütun: rE6; 6. sütun: rH6 67 4.3 Biyoinformatik analiz Western blot analizi ile ekspresyon seviyeleri incelenen aşı adayı olabilecek 49 rekombinant proteinin MHC-I ve B hücre epitop bölgeleri biyoinformatik yöntemlerle incelenmiştir (Şekil 4.3). Biyoinformatik analiz sonucunda iyi eksprese olmuş ve saflaştırılmış aşı adayı 6 proteinin (rH2, rA4, rE4, rD6, rE6, rH6) hem B epitop bölgeleri ve hemde CD8 T-Sitotoksik lenfositlerinin bağlandığı MHC-I epitop bölgeleri bulunduğu saptanmıştır (Şekil 4.3 A-B). Aşı adayı rD6, rE6, rH6, rE4, rA4 ve rH2 proteinlerinde sırasıyla 10 (%1,38), 10 (%1,38), 10 (%0,95), 8 (%2,2), 5 (%1,6) ve 4 (%1,69) adet B lenfosit epitopu bulunmaktadır. MHC I epitopları ise rD6, rH6, rA4, rE4, rH2 ve rE6 proteinlerinde sırasıyla 13 (%1,79), 12 (%1,14), 10 (%3,19), 10 (%2,75), 9 (%3,81) ve 8 (%1,11) adet bulunmaktadır (Çizelge 4.1). Aşı adayı olabilecek antijenik 49 rekombinant proteinin N- ve O-bağlı glikozilasyon miktarı Şekil 4.3 C ve D’de verilmiştir. Aşı adayı rD6, rA4, rE6 ve rH6 proteinlerinde sırasıyla 3 (%0,41), 2 (%0,64), 2 (%0,28), 2 (%0,19) adet Nbağlı Glikozilasyon bölgesi bulunmaktadır. rH2 ve rE4 proteinlerinde N-bağlı Glikozilasyon bölgesi bulunmamaktadır. O-bağlı Glikozilasyon bölgeleri ise rH6, rE6, rD6, rE4, rA4 ve rH2 proteinlerinde sırasıyla 81 (%7,7), 69 (%9,54), 53 (%7,29), 21 (%5,77), 6 (%1,92) ve 4 (%1,69) adet bulunmaktadır (Çizelge 4.1). Aşı adayı 6 proteinin epitop bölgelerindeki glikozilasyon miktarı incelendiğinde B epitop bölgesinde N-bağlı Glikozilasyon bölgesi bulunmadığı, O-bağlı Glikozilasyonun ise rD6, rE6, rH6, rE4, rA4 proteinlerinde sırasıyla 18, 18, 10, 9 ve 2 adet olduğu saptanmıştır. MHC I epitop bölgesinde N-bağlı Glikozilasyon bölgesi rD6 ve rH6 proteinlerinde sadece birer adet bulunduğu, Obağlı Glikozilasyonun ise rE4, rD6, rH6 ve rE6 proteinlerinde sırasıyla 7, 7, 5 ve 4 adet olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.1). 68 Şekil 4.3 Aşı adayı olabilecek antijenik 49 rekombinant proteinin (A) B hücre ve (B) MHC-I epitopları ile (C) N- ve (D) O-bağlı Glikozilasyon bölgelerinin biyoinformatik analiz sonuçları Çizelge 4.1 Aşı adayı 6 proteinin biyoinformatik analiz sonuçları Protein H2 A4 E4 D6 E6 H6 Tüm Proteinde B Tüm Proteinde MHC I Tüm Proteinde NMHC I Epitopta N- Tüm Proteinde O-bağlı B Epitopta O-bağlı MHC I Epitopta OAminoasit B Epitopta N-bağlı epitop Bölgesi Sayısı/ Epitop Bölgesi Sayısı/ bağlı Glikozilasyon bağlı Glikozilasyon Glikozilasyon Sayısı / Glikozilasyon bağlı Glikozilasyon sayısı Glikozilasyon Sayısı Yüzdesi (%) Yüzdesi (%) Sayısı / Yüzdesi (%) Sayısı Yüzdesi (%) Sayısı Sayısı 236 4 (1,69) 9 (3,81) 0 (0,00) 0 0 4 (1,69) 0 0 313 5 (1,60) 10 (3,19) 2 (0,64) 0 0 6 (1,92) 2 0 364 8 (2,20) 10 (2,75) 0 (0,00) 0 0 21 (5,77) 9 7 727 10 (1,38) 13 (1,79) 3 (0,41) 0 1 53 (7,29) 18 7 723 10 (1,38) 8 (1,11) 2 (0,28) 0 0 69 (9,54) 18 4 1052 10 (0,95) 12 (1,14) 2 (0,19) 0 1 81 (7,70) 10 5 69 4.4 Aşı adayı rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 Proteinlerinin Saflaştırılması Büyük ölçekli ekspresyon sonrası elde edilen E. coli BL21 Star (DE3) pLysS hücreleri yüksek basınç altında parçalanmıştır. rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinleri Ni2+ şelasyon Afinite Kolonu ve sonrasında jel filtrasyon kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Proteinlerin saflığı SDS-PAGE (Şekil 4.4.A) ve Western blot (Şekil 4.4.B) yöntemleriyle belirlenmiştir. Aşı adayı 6 rekombinant proteinin ortalama moleküler ağırlıkları rH2: 26,7 kDa, rA4: 33,9 kDa, rE4: 38,8 kDa, rD6: 78,1 kDa, rE6: 81,2 kDa, rH6: 110,2 kDa’dur. Şekil 4.4 Aşı adayı 6 rekombinant proteinin saflaştırılma sonrası (A) SDS-PAGE ve (B) Western blot görüntüleri. 1. sütun: rH2 proteini; 2. Sütun: rA4 proteini; 3. sütun: rE4 proteini; 4. sütun: rD6 proteini; 5. sütun: rE6 proteini; 6. sütun: rH6 proteini 4.5 Humoral İmmun Yanıt Aşılama ile farelerde uyarılan total IgG yanıtı ve bu yanıtın IgG1 veya IgG2a yönüne kutuplanması rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinlerinin kullanıldığı rec-ELISA yöntemiyle araştırılmıştır. 4.5.1 Uyarılan Total IgG Antikor Yanıtı Rec-ELISA yöntemiyle aşılama öncesi ve sonrasında farelerden alınan serum örneklerinde rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinlerine karşı oluşan total IgG antikor yanıtı araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre PBS ve Montanide kontrol gruplarında 42. gün sonunda total IgG seviyesinde aşılama öncesine göre 70 anlamlı bir artış saptanmamıştır. 6-Valant kontrol grubunda total IgG yanıtının 42. günde aşılama öncesine göre belirgin bir artış göstermiştir (P<0,0001; ***). 6Valant (+) Montanide aşı grubunda ise 42. günde aşılama öncesine göre belirgin artış sağlanmıştır (P<0,0001; ***). 6-Valant (+) Montanide aşı grubunun total IgG yanıtının 6-Valant kontrol grubuna göre belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P=0,002; **) (Şekil 4.5). Şekil 4.5 Aşı ve kontrol grubu farelerde oluşan total IgG yanıtı 4.5.2 Uyarılan IgG1 ve IgG2a Antikor Yanıtı Rec-ELISA yöntemiyle aşılama öncesi ve sonrasında farelerden alınan serum örneklerinde rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinlerine karşı oluşan IgG1 ve IgG2a antikor yanıtları araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre PBS ve Montanide kontrol gruplarında 42. gün sonunda IgG1 seviyesinde aşılama öncesine göre anlamlı bir artış saptanmamıştır. 6-Valant kontrol grubunda IgG1 yanıtının 42. günde aşılama öncesine göre belirgin bir artış göstermiştir (P<0,0001; ***). 6-Valant (+) Montanide aşı grubunda ise 42. günde aşılama öncesine göre belirgin artış sağlanmıştır (P<0,0001; ***). 6-Valant (+) Montanide aşı grubunun IgG1 yanıtının 6-Valant kontrol grubuna göre belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P=0,0218; *) (Şekil 4.6). 71 IgG2a sonuçları incelendiğinde PBS ve Montanide kontrol gruplarında 42. gün sonunda aşılama öncesine göre anlamlı bir artış saptanmamıştır. 6-Valant kontrol grubunda IgG2a yanıtının 42. günde aşılama öncesine göre belirgin bir artış göstermiştir (P<0,0001; ***). 6-Valant (+) Montanide aşı grubunda ise 42. günde aşılama öncesine göre belirgin artış sağlanmıştır (P<0,0001; ***). 6-Valant (+) Montanide aşı grubunun IgG2a yanıtının 6-Valant kontrol grubuna göre belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P=0,0113; *) (Şekil 4.6). 6-Valant (+) Montanide aşı grubunun IgG1 ve IgG2a antikor yanıtları karşılaştırıldığında 42. günde IgG2a yanıtının IgG1 yanıtına göre belirgin şekilde daha fazla olduğu saptanmıştır (P= 0,0067; **) (Şekil 4.6). Şekil 4.6 Aşı ve kontrol grubu farelerde oluşan IgG1 ve IgG2a yanıtları 4.6 Hücresel İmmun Yanıt İlk aşılamadan sonra dört gruba ait farelerin dalak hücrelerinden hazırlanan tek hücre süspansiyonları rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 proteinleri ile uyarılmıştır. Uyarım sonrası IFN-γ ve IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı ve IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfositlerin oranı flow sitometri ile incelenmiştir. Ayrıca lenfositlerce hücre dışına salgılanan IFN-γ ve IL-4 miktarı sitokin ELISA ile belirlenmiştir. 72 Dalak hücrelerini uyaracak protein karışımı konsantrasyonunu belirlemek amacıyla optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Aşı grubuna ait fare dalak hücreleri, hücre kültürü ortamında son konsantrasyonları 200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml ve 25 µg/ml olan rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımı ile uyarılmıştır. Veriler sonucunda dalak hücrelerinin 25 µg/ml konsantrasyonda protein karışımı ile uyarılmasının optimum etkinliği gösterdiği saptanmıştır. Hücresel immun yanıtın saptanmasında PBS kontrol grubuna ait fare dalak hücreleri anti-CD3 ile işaretlenerek CD3 reseptörlü T lenfosit popülasyonları belirlenmiştir. 4.6.1 IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı Lenfositlerin Oranı Kontrol ve aşı gruplarına ait farelerin dalak hücrelerinin rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımı ile uyarımı sonrası IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositlerin oranı Şekil 4.7’de verilmiştir. Elde edilen verilere göre, 6-Valant (+) Montanide uygulanan aşı grubunda IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfosit oranı PBS, Montanide ve 6-Valant kontrol gruplarına göre sırasıyla 2, 1,6 ve 1,45 kat artmıştır. Şekil 4.7 Aşı ve kontrol grubu farelerde IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı Lenfositlerini Oranı 4.6.2 IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik Lenfositlerin Oranı Kontrol ve aşı gruplarına ait farelerin dalak hücrelerinin rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımı ile uyarımı sonrası IFN-γ salgılayan CD8 T- 73 Sitotoksik lenfositlerin oranı Şekil 4.8’de verilmiştir. Elde edilen verilere göre, 6Valant (+) Montanide uygulanan aşı grubunda IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfosit oranı PBS, Montanide ve 6-Valant kontrol gruplarına göre sırasıyla 2, 2 ve 1,6 kat artmıştır. Şekil 4.8 Aşı ve kontrol grubu farelerde IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik Lenfositlerini Oranı 4.6.3 IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı Lenfositlerin Oranı Kontrol ve aşı gruplarına ait farelerin dalak hücrelerinin rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımı ile uyarımı sonrası IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositlerin oranı Şekil 4.9’da verilmiştir. Elde edilen verilere göre, 6-Valant (+) Montanide uygulanan aşı grubunda IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfosit oranı PBS, Montanide ve 6-Valant kontrol gruplarına göre sırasıyla ortalama 3,07, 2,88 ve 1,1 kat artmıştır. 74 Şekil 4.9 Aşı ve kontrol grubu farelerde IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı Lenfositlerinin Oranı 4.6.4 Lenfositlerin Hücre Dışına Salgıladığı IFN-γ ve IL-4 Miktarı Kontrol ve aşı gruplarına ait farelerin dalak hücrelerinin rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6 protein karışımı ile uyarımı sonrası lenfositlerce hücre dışına salgılanan IFN-γ ve IL-4 miktarları Şekil 4.10 ve Şekil 4.11’de verilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre 6-Valant (+) Montanide aşı grubu IFN-γ miktarı PBS ve Montanide ile aşılanan kontrol gruplarına göre belirgin şekilde artmıştır (P=0,0007; P=0,001; ***). 6-Valant (+) Montanide aşı grubu IFN-γ miktarının 6Valant kontrol grubundan daha fazla olduğu saptanmıştır (Şekil 4.10). IL-4 ölçüm sonuçlarıan göre 6-Valant (+) Montanide aşı grubu IL-4 miktarı PBS ve Montanide ile aşılanan kontrol gruplarına göre belirgin şekilde artmıştır (P=0,0133; P=0,0183; *). 6-Valant (+) Montanide aşı grubu IL-4 miktarının 6Valant kontrol grubundan daha fazla olduğu saptanmıştır (Şekil 4.11). 75 Şekil 4.10 Aşı ve kontrol grubu farelerde hücre dışına salgılanan IFN-γ miktarı Şekil 4.11 Aşı ve kontrol grubu farelerde hücre dışına salgılanan IL-4 miktarı 4.7 Letal Toksoplazmozise Karşı Korunma Aşı ve Kontrol grubu fareler, ikinci aşılamadan 3 hafta sonra, 1×105 T. gondii Ankara suşu takizoitleri ile enfekte edilmiştir. Ortalama yaşam süresi PBS ve Montanide uygulanan kontrol gruplarında sırasıyla 5,5 ± 0,53 ve 5.38±0,52 gün olarak saptanmıştır. 6-Valant (+) Montanide ve 6-Valant aşısı uygulanan farelerde ortalama yaşam süresi sırasıyla 8,38±2,13 ve 7,13±0,83 olup kontrollerden belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P<0,01; **). Sonuçlar 6-Valant (+) 76 Montanide aşısının T. gondii Ankara suşu takizoitleri ile oluşturulan letal toksoplazmozise karşı en uzun korunmanın sağlandığını göstermektedir (Şekil 4.12). 100 6-Valant+Montanide 6-Valant % Yasam 75 Montanide PBS 50 25 0 0 5 10 15 Gün Şekil 4.12 Aşı ve kontrol grubu farelerin ikinci aşılamadan 3 hafta sonra T. gondii Ankara suşu ile enfekte edilmeleri sonrası gözlenen yaşam süreleri 77 5. TARTIŞMA Son yıllarda Toxoplasma gondii’ye yönelik rekombinant protein aşı çalışmalarında birden fazla rekombinant proteinin kullanıldığı multivalant aşılar geliştirilmektedir. Liang et al. (2011) ve Felgner et al. (2015) yaptıkları çalışmalarda T. gondii’ye özgü aşı adayı olabilecek 200 üzerinde antijenin keşfini gerçekleştirmiştir. Bu antijenler içinden aşı adayı olabilecek 49 protein seçilmiş ve küçük ölçekli ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen veriler 6 proteinin (rH2, rA4, rE4, rD6, rE6 ve rH6) aşı formülasyonunda kullanılmaya uygun şekilde eksprese olduğunu göstermiştir (Bkz. Çizelge 3.1; Şekil 4.2). Toxoplasma gondii’ye karşı korunmada özellikle CD8 T-Sitotoksik lenfositler görev aldığından aşı adayı proteinlerin B hücre ve MHC-I epitop bölgeleri biyoinformatik yöntemlerle incelenmiştir (Moutaftsi et al., 2006; Kotturi et al., 2007; Paul et al., 2013; Yao et al., 2012). Elde edilen veriler aşı adayı 6 proteinin B hücre ve MHC-I epitopları içerdiğini göstermiştir (Bkz. Şekil 4.3 AB; Çizelge 4.1). Bunun yanında proteinlerin glikozilasyonu proteinin stabilitesi, üç boyutlu yapısı, yüzey ekspresyonu ve antijenitesi açısından büyük önem taşımaktadır (Hounsell and Davies, 1993). Lektin blotlama ile 11 tane T. gondii proteininin Nbağlı glikozilasyon ve 15 tane proteinin ise O-bağlı glikozilasyon içerdiği saptanmıştır (Luk, 2011). T. gondii’nin N-bağlı glikozilasyonun bulunduğu proteinlerin yaşamsal faaliyetleri için önemli olduğu, O-bağlı glikozilasyonların ise ekskretuvar-sekretuvar antijenik proteinlerde bulunduğu rapor edilmektedir (Magdalena et al., 2004). Bu sebeplerle aşı adayı olabilecek 49 antijenik proteinin N- ve O-bağlı glikozilasyon bölgeleri biyoinformatik yöntemlerle incelenmiştir (Frank and Schloissnig, 2010). Elde edilen sonuçlara göre rH2 ve rE4 proteinleri dışında bütün proteinlerde N-bağlı glikozilasyon bölgesi bulunmaktadır. O-bağlı glikozilasyon bölgesi ise bütün proteinlerde bulunmaktadır (Bkz. Şekil 4.3 C-D). Bu aşamada daha ileri bir analiz yapılarak B hücre ve MHC-I epitoplarında bulunan N- ve O-bağlı glikozilasyon bölgeleri biyoinformatik yöntemlerle incelenmiştir. Elde edilen veriler B epitop bölgesinde N-bağlı glikozilasyon bölgesi bulunmayıp O-bağlı glikozilasyonun ise rD6, rE6, rH6, rE4, rA4 proteinlerinde bulunduğunu göstermiştir. MHC-I epitop bölgesinde N-bağlı glikozilasyon bölgesi sadece rD6 ve rH6 proteinlerinde bulunup O-bağlı glikozilasyon ise rE4, rD6, rH6 ve rE6 proteinlerinde saptanmıştır (Bkz Çizelge 78 4.1). Bu veriler aşı adayı 6 proteinin ve epitoplarının çeşitli oranlarda glikozile olduğunu ve antijenikliğinin yüksek olduğunu göstermektedir. Multivalant rekombinant protein aşı formülasyonu oluşturmak için aşı adayı 6 protein büyük ölçekli eksprese edilmiş ve sonrasında affinite ve jel filtrasyon kolonları ile ileri derecede saflaştırılmış ve endotoksini eksiltilmiştir. Daha sonra aşı adayı proteinler Montanide ISA 50V adjuvantı ile birleştirilerek T. gondii’ye karşı ilk defa 6 rekombinant protein kullanılan aşı formülasyonu (6-Valant (+) Montanide) geliştirilmiştir. Geliştirilen aşı formülasyonu ve kontrol grubu aşılar outbred Swiss webster farelere uygulanmıştır. Aşılama ile 6-Valant (+) Montanide aşı grubunda uyarılan total IgG ikinci aşılamadan 21 gün sonra aşılama öncesine göre belirgin artış sağlamıştır (P<0,0001). 6-Valant (+) Montanide aşısı ile uyarılan total IgG yanıtının 6-Valant kontrol grubuna göre belirgin şekilde yüksek olduğu da saptanmıştır (P=0,002) (Bkz. Şekil 4.5). IgG1 ve IgG2a altgrup antikor yanıtı incelendğinde ise 6-Valant (+) Montanide aşı grubunun IgG2a yanıtının IgG1 yanıtına göre belirgin şekilde daha fazla olduğu saptanmıştır (P<0,001) (Bkz. Şekil 4.6). Bu sonuçlar adjuvante multivalant rekombinant protein aşısının (6Valant (+) Montanide) immun yanıtı TH1 yönüne polarize olduğunu göstermektedir. Hücresel immun yanıt incelendiğinde 6-Valant (+) Montanide uygulanan aşı grubunda IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfosit oranının kontrollere göre 1,6-2 kat arasında arttığı gösterilmiştir (Bkz. Şekil 4.8). Bunun yanında IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfosit oranının da kontrollere göre 1,45-2 kat arasında arttığı saptanmıştır (Bkz. Şekil 4.7). Lenfositlerin hücre dışına salgıladığı IFN-γ miktarları incelendiğinde 6-Valant (+) Montanide aşının PBS ve Montanide kontrol gruplarına göre belirgin şekilde daha fazla IFN-γ oluşturduğu (P<0,001) 6-Valant kontrol grubundan ise daha fazla olduğu saptanmıştır (Bkz. Şekil 4.10). Ayrıca IL-4 salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositlerin oranı incelendiğinde kontrollere göre ortalama 1,1-3 kat arasında arttığı saptanmıştır (Bkz. Şekil 4.9). Lenfositlerin hücre dışına salgıladığı IL-4 miktarları incelendiğinde 6-Valant (+) Montanide aşının PBS ve Montanide kontrol gruplarına göre belirgin şekilde daha fazla IL-4 üretimi sağladığı (P<0,05) 6-Valant kontrol grubundan daha fazla olduğu saptanmıştır (Bkz. Şekil 4.11). Bu sonuçlar adjuvante multivalant rekombinant protein aşısının (6-Valant (+) Montanide) immun yanıtı TH1 yönüne daha fazla kutuplandırdığını göstermektedir. Ayrıca T. gondii’ye karşı korunmada 79 başlıca önemli olan IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfositlerin aşılama ile artış göstermesi aşının istenilen koruyucu immun yanıtı uyardığını götermektedir. Aşılama ile oluşturulan korunmanın belirlenmesinde farelere intraperitoneal yoldan 100.000 T. gondii Ankara suşu takizoiti uygulanmıştır. Adjuvante multivalant rekombinant protein aşısının farelerde ortalama yaşam süresini ortalama 5 günden 8,38±2,13 güne çıkarttığı ve kontrollerden belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P<0,01). Literatürde bu çalışmaya benzer multivalant protein eksprese eden DNA aşısı çalışmasında GRA1, GRA2, GRA4 ve SAG1’e ait 6 antijenik epitopun eksprese edildiği multi-epitop DNA aşısı geliştirilmiştir. Bu aşı ile güçlü humoral ve TH1 tipi hücresel immun yanıtın uyarıldığı belirtilmiştir. Bu aşamada aşılama ile oluşturulan korunmanın belirlenmesi için BALB/c ve C57BL/6 farelere intraperitoneal yoldan 500 T. gondii RH suşu takizoiti uygulandığı rapor edilmiştir. Elde edilen sonuçlar BALB/c farelerde aşılanmayan kontrol grubu farelerin %60’ının ve aşılanan farelerin ise %100’ünün yaşadığı gösterilmiştir. C57BL/6 farelerde ise aşılanmayan farelerin en çok 7. güne kadar yaşadıklarını ve aşılanan farelerin %40’ının yaşadığı gösterilmiştir (Liu et al., 2009). Bu çalışmada aşılanmayan farelerin yaşamasının T. gondii RH suşunun farelerde öldürücü dozda verilmemesinden kaynaklandığı sonucuna varılmıştır. Bu şekilde düşük dozda verilen T. gondii takizoitlerine karşı farelerde korunma yaşam eğrisi ile belirlenmesi yerine dokularda bulunan T. gondii formlarının araştırılmasının daha doğru olacağı düşünülmektedir. İlgi çekici araştırmalardan bir diğerinde ise T. gondii’nin takizoit formuna özgü SAG1, GRA1, ROP2, GRA4 ve ayrıca bradizoit formuna özgü SAG2C ve SAG2X proteinlerinin epitop bölgelerini içeren bir multi-epitop DNA aşı geliştirilmiştir. Bu aşı çalışmasında aşılama intramuskuler, intraoral, intranazal olacak şekilde üç farklı yolla uygulanmıştır. Bu aşamada aşılama ile oluşturulan korunmanın belirlenmesi için BALB/c farelere intraperitoneal yoldan 1000 T. gondii RH suşu takizoiti uygulanmıştır. Çalışma sonucunda intranazal yolla aşılama ile yüksek derece IgA, CD8 T-Sitotoksik lenfositlerinde %1,78 oranında artış ve korunma zamanında %40 uzama saptandığı rapor edilmiştir. İntraoral uygulama sonucunda ise, IgA antikor yanıtında artış, CD8 T-Sitotoksik lenfositlerinde %0,70 oranında artış ve korunma zamanında %60 uzama olduğu belirtilmiştir. İntramuskuler uygulama sonrasında yüksek derece IgG antikor yanıtı, CD8 T-Sitotoksik lenfositlerinde %0,92 oranında artış ve korunma 80 zamanında %20 uzama olduğu rapor edilmiştir. Bu çalışmada aşı uygulanmayan kontrol farelerinin ortalama 3. günde ölmeye başladıkları ve tamamının 5. günde öldüğü bildirilmiştir (Cong et al., 2014). Bu çalışmada aşılanmayan farelerin düşük dozda T. gondii RH suşu takizoiti uygulanmasına rağmen 3. günde ölmeye başlaması ilginç olarak değerlendirilmiştir çünkü T. gondii ile lethal toksoplazmosiz oluşturulmasında her fareye ortalama 100.000 takizoit verilmesi sonrası ölümlerin genelde 4. günde başlaması beklenmektedir (Fachado et al., 2003; Döşkaya et al., 2007). T. gondii rGRA2 ve rGRA6 proteinleri monofosforil lipid A (MPL) adjuvantı ile birleştirilerek farelere intraperitoneal olarak verildiği çalışmada, aşılama ile total IgG ve IgG2a yanıtlarının arttırdığı belirlenmiştir. Farelere doku kisti oluşturan T. gondii PRU suşu intraperitoneal yoldan uygulanmış ve doku kistlerinin rGRA2 proteinin verildiği grupta %69,8, rGRA2 ve rGRA6 protein karışımının verildiği grupta ise %48,2 azaldığı bildirilmiştir (Golkar et al., 2007). T. gondii’ye karşı geliştirilen üç farklı multi-antijenik rekombinant protein aşı çalışmasında rROP2 (+) rGRA4 (+) rSAG1 protein karışımı ile rROP2 (+) rROP4 (+) rGRA4 ve rROP2 (+) rROP4 (+) rSAG1 protein karışımları Freund adjuvantı ile birleştirilerek oluşturulan immun yanıt ve korunma karşılaştırılmıştır. Her üç aşı grubunda da IgG1 antikor seviyesinde yükselme gözlemlemiştir. Fareler doku kisti oluşturan T. gondii DX suşu intraperitoneal yoldan uygulanmış ve rROP2 (+) rGRA4 (+) rSAG1 uygulanan grupta %46 azalma, rROP2 (+) rROP4 (+) rGRA4 uygulanan grupta %77, rROP2 (+) rROP4 (+) rSAG1 uygulanan grupta ise %84 azalma olduğu belirtilmiştir (Dziadek et al., 2012). T. gondii’ye ait AMA1, RON2 ve RON4 antijenik proteinleriyle yapılan aşı çalışmasında, bu proteinlerin epitop bölgeleri seçilerek multivalant rekombinant protein aşısı oluşturulmuştur. rRON2 uygulanan grupta yüksek miktarda IgA antikor yanıtı, rAMA1 (+) rRON2 uygulanan grupta ise yüksek miktarda total IgG antikor yanıtı saptandığı bildirilmiştir. rAMA1 (+) rRON2 uygulanan aşı grubunda yüksek miktarda IFN-γ üretimi olduğu rapor edilmiştir. Bu aşamada aşılama ile oluşturulan korunmanın belirlenmesi için BALB/c farelere oral yoldan 40.000 T. gondii RH suşu takizoiti uygulandığı belirtilmiştir. Aşı uygulanmayan grupta farelerin 13. güne kadar yaşadıkları bildirilmiş, rAMA1 (+) rRON2 uygulanan grupta farelerin %70, rAMA1 uygulanan grupta %60, rAMA1 (+) rRON2 (+) rRON4 uygulanan grupta %50 ve rRON2 uygulanan grupta %40’ının yaşadığı rapor edilmiştir (Zhang et al., 2015). T. gondii ile doğal yoldan 81 enfeksiyon oral yoldan doku kisti veya ookistlerin alınması ile başlamaktadır. Bu çalışmada ilginç şekilde mide asidine dirençsiz T. gondii takizoiti oral yoldan uygulanmıştır. Sonuç olarak; doğru antijenik proteinlerin kullanıldığı multivalant rekombinant protein aşı formülasyonlarının kuvvetli humoral ve hücresel immun yanıt uyardığı bilinmektedir. Daha önceki çalışmalarda multivalant proteinlerin içeriğinde kullanılan proteinler rastgele seçilmekteydi. Bu çalışmada ise protein mikroarray tarama ile T. gondii genomundan seçilmiş 49 aşı adayı olabilecek antijenik protein içinden 6 tanesi seçilmiş ve ilk defa 6-Valantlı rekombinant protein aşısı geliştirilmiştir. Adjuvante 6-Valantlı rekombinant protein aşısının kuvvetli humoral ve hücresel immun yanıt uyardığı ve lethal toksoplazmosize karşı korunma zamanını uzattığı belirlenmiştir. İleride daha fazla rekombinant protein içeren adjuvente multivalant rekombinant protein aşılarının geliştirilmesi ile toksoplazmozise karşı tam korunmanın sağlanabileceği öngörülmektedir. Bu çalışmada da gösterildiği gibi T. gondii antijenik proteinlerin epitoplarının çoğunda glikozilasyon bölgeleri bulunmaktadır ve etkin bir immun yanıt için antijenik epitop bölgeleriyle MHC moleküllerinin tam uyuşması gerekmektedir. Bu sebeplerle aşılamada kullanılacak T. gondii rekombinant proteinlerinin post translasyonel modifikasyon yapabilen ekspresyon sistemlerinde üretilmesinin toksoplazmosize karşı korunmada büyük ilerleme sağlayacağı düşünülmektedir. 82 KAYNAKLAR DİZİNİ Ada, G., 1999, The immunology of vaccination, 28-39, Vaccines, Plotkin S.A. and Orenstein W.A. (Eds), WB Saunders, Philadelphia, 1230p. Aguilar, J.C. and Rodriguez, E.G., 2007, Vaccine adjuvants revisited, Vaccine, 25, 3752-3762pp. Ajioka, J.W., Fitzpatrick, J.M. and Reitter, C.P., “Toxoplasma gondii genomics: shedding light on pathogenesis and chemotherapy”, Expert Reviews in Molecular Medicine http://www.path.cam.ac.uk/~toxo/Publications/PDF%20Files/expert%20rev %202001.pdf (Erişim tarihi: 23 Aralık 2014). Andersson, C., 2000, Production and delivery of recombinant subunit vaccines, Department of Biotechnology Royal Institute of Technology (KTH), Sweden, 92 p. Angus, C.W., Klivington, Evans, D., Dubey, J.P. and Kovacs, J.A., 2000, Immunization with a DNA plasmid encoding the SAG1 (P30) protein of Toxoplasma gondii is immunogenic and protective in rodents, The Journal of Infectious Diseases, 181(1), 317-324pp. Apostolopoulos, V., Yuriev, E., Ramsland, P.A., Halton, J., Osinski, C., Li, W., Plebanski, M., Paulsen, H. and McKenzie, I.F., 2003, A glycopeptide in complex with MHC class I uses the GalNAc residue as an anchor, PNAS, 100(25):15029-15034pp. Aramini, J.J., Stephen, C., Dubey, J.P., Engelstoft, C., Schwantje, H. and Ribble, C.S., 1999, Potential contamination of drinking water with Toxoplasma gondii oocysts, Epidemiology and Infection, 122(2):305-315pp. Arisue, N. and Hashimoto, T., 2014, Phylogeny and evolution of apicoplasts and apicomplexan parasites, Parasitology International (in press). Aspinall, T.V., Marlee, D., Hyde, J.E. and Sims, P.F., 2002, Prevalence of Toxoplasma gondii in commercial meat products as monitored by polymerase chain reaction--food for thought?, International Journal for Parasitology, 32:1193-1199pp. 83 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Beghetto, E., Nielsen, H.V., Del Porto, P., Buffolano, W., Guglietta, S., Felici, F., Petersen, E. and Gargano, N., A combination of antigenic regions of Toxoplasma gondii microneme proteins induces protective immunity against oral infection with parasite cysts, 2005, The Journal of Infectious Diseases, 191:637-645pp. Bhopale, .GM., 2003, Development of a vaccine for toxoplasmosis: current status, Microbes and Infection, 5:457-462pp. BioLegend, LEGEND MAX™ Mouse IFN-γ ELISA Kit with Pre-coated Plates, http://www.biolegend.com/legend-max-mouse-ifn-gamma-elisa-kit5815.html, (Erişim Tarihi: 19.11.2014). BioLegend, LEGEND MAX™ Mouse IL-4 ELISA Kit with Pre-coated Plates, http://www.biolegend.com/legend-max-mouse-il-4-elisa-kit-5857.html, (Erişim Tarihi: 18.11.2014). Bruna-Romero, O., Oliveira, D.M and Andrade-Neto, V.F., 2012, Toxoplasmosis: Advances and Vaccine Perspectives, 169-184, Current Topics in Tropical Medicine, Rodriguez-Morales, A.(Ed.), InTech Europe, 564p. CDC, 2013, Understanding how vaccines work, Atlanta-USA, 2p. Cha, S., 2012, The history of vaccination and current vaccination policies in Korea, Clinical and Experimental Vaccine Research, 1:3-8pp. Chen, J., Huang, S.Y., Li, Z.Y., Yuan, Z.G., Zhou, D.H., Petersen, E., Zhang, N.Z. and Zhu, X.Q., 2013a, Protective immunity induced by a DNA vaccine expressing eIF4A of Toxoplasma gondii against acute toxoplasmosis in mice, Vaccine, 31(13):1734-1739pp. Chen, J., Huang, S.Y., Zhou, D.H., Li, Z.Y., Petersen, E., Song, H.Q. and Zhu, X.Q., 2013b, DNA immunization with eukaryotic initiation factor-2α of Toxoplasma gondii induces protective immunity against acute and chronic toxoplasmosis in mice, Vaccine, 31(52):6225-6231pp. Chen, J., Zhou, D.H., Li, Z.Y., Petersen, E., Huang, S.Y., Song, H.Q. and Zhu, X.Q., 2014, Toxoplasma gondii: protective immunity induced by rhoptry protein 9 (TgROP9) against acute toxoplasmosis, Experimental Parasitology, 139, 42-48pp. 84 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Chuang, S.C. and Yang, C.D., 2014, Sustained release of recombinant surface antigen 2 (rSAG2) from poly(lactide-co-glycolide) microparticles extends protective cell-mediated immunity against Toxoplasma gondii in mice, Parasitology, 141, 1657-1666pp. Chuang, S.C., Ko, J.C., Chen, C.P., Du, J.T. and Yang, C.D., 2013a, Induction of long-lasting protective immunity against Toxoplasma gondii in BALB/c mice by recombinant surface antigen 1 protein encapsulated in poly (lactideco-glycolide) microparticles, Parasites & Vectors, 6:34, 1-12pp. Chuang, S.C., Ko, J.C., Chen, C.P., Du, J.T. and Yang, CD., 2013b, Encapsulation of chimeric protein rSAG1/2 into poly(lactide-co-glycolide) microparticles induces long-term protective immunity against Toxoplasma gondii in mice, Experimental Parasitology, 134(4):430-437pp. Cong, H., Yuan, Q., Zhao, Q., Zhao, L., Yin, H., Zhou, H., He, S. and Wang, Z., 2014, Comparative efficacy of a multi-epitope DNA vaccine via intranasal, peroral, and intramuscular delivery against lethal Toxoplasma gondii infection in mice, Parasites & Vectors, 7:145, 1-8pp. Cong, H., Zhang, M., Xin, Q., Wang, Z., Li, Y., Zhao, Q., Zhou, H. and He, S., 2013, Compound DNA vaccine encoding SAG1/SAG3 with A2/B subunit of cholera toxin as a genetic adjuvant protects BALB/c mice against Toxoplasma gondii, Parasit & Vectors, 6: 63, 2-8pp. Correia, B.E., Bates, J.T., Loomis, R.J., Baneyx, G., Carrico, C., Jardine, J.G., Rupert, P., Correnti, C., Kalyuzhniy, O., Vittal, V., Connell, M.J., Stevens, E., Schroeter, A., Chen, M., Macpherson, S., Serra, A.M., Adachi, Y., Holmes M.A., Li, Y., Klevit, R.E., Graham, B.S., Wyatt, R.T., Baker, D., Strong, R.K., Crowe JE, J., Johnson, P.R. and Schief, W.R., 2014, Proof of principle for epitope-focused vaccine design, Nature, 507(7491):201-206pp. Couper, K.N., Nielsen, H.V., Petersen, E., Roberts, F., Roberts, C.W. and Alaexander, J., 2003, DNA Vaccination with immunodominant tacyzoite surface antigen (SAG1) protects against adult acquired Toxoplasma gondii infection but does not prevent maternofoetal transmission, Vaccine, 21, 2813-2820pp. Crampton, A., Vanniasinkam, T., 2007, Parasite vaccines: the new generation, Infection, Genetics and Evolution, 7, 664-673pp. 85 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Cui, X., Lei, T., Yang, D., Hao, P., Li, B. and Liu, Q., 2012, Toxoplasma gondii immune mapped protein-1 (TgIMP1) is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis, Vaccine, 30(13), 2282-2287pp. Cuppari, A.F., Sanchez, V., Ledesma, B., Frank, F.M., Goldman, A., Angel, S.O., Martin, V., 2008, Toxoplasma gondii protease inhibitor-1 (TgPI-1) is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis, Vaccine, 26(39):50405045pp. Dautu, G., Munyaka, B., Carmen, G., Zhang, G., Omata, Y., Xuenan, X. and Igarashi, M., 2007, Toxoplasma gondii: DNA vaccination with genes encoding antigens MIC2, M2AP, AMA1 and BAG1 and evaluation of their immunogenic potential, Experimental Parasitology, 116, 273-282pp. Davies, D.H., Liang, X., Hernandez, J.E., Randall, A., Hirst, S., Mu, Y., Romero, K.M., Nguyen, T.T., Kalantari-Dehaghi, M., Crotty, S., Baldi, P., Villarreal, L.P. and Felgner, P.L., 2005, Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery, PNAS, 102(3):547-552pp. Del L. Yácono, M., Farran, I., Becher, M.L., Sander, V., Sánchez, V.R., Martín, V., Veramendi, J. and Clemente, M., 2012, A chloroplast-derived Toxoplasma gondii GRA4 antigen used as an oral vaccine protects against toxoplasmosis in mice, Plant Biotechnology Journal, 10, 1136-1144pp. Denkers, E. Y., 2003, From cells to signaling cascades: manipulation of innate immunity by Toxoplasma gondii, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 39: 193–203pp. Di Cristina, M., Del Porto, P., Buffolano, W., Beghetto, E., Spadoni, A., Guglietta, S., Piccolella, E., Felici, F., Gargano, N., 2004, The Toxoplasma gondii bradyzoite antigens BAG1 and MAG1 induce early humoral and cell-mediated immune responses upon human infection, Microbes and Infection, 6:164-171pp. Döşkaya, M., Caner, A., Ajzenberg, D., Değirmenci, A., Dardé, M.L., Can, H., Erdoğan, D.D., Korkmaz, M., Uner, A., Güngör, C., Altıntaş, K. and Gürüz, Y., 2013, Isolation of Toxoplasma gondii strains similar to Africa 1 genotype in Turkey, Parasitology International, 62:471-474pp. 86 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Döşkaya, M., Caner, A., Can, H., Gülçe İz, S., Gedik, Y., Döşkaya, A.D., Kalantari-Dehaghi, M. and Gürüz, Y., 2014, Diagnostic value of a RecELISA using Toxoplasma gondii recombinant SporoSAG, BAG1, and GRA1 proteins in murine models infected orally with tissue cysts and oocysts, PLoS One, 9(9):e108329. Döşkaya, M., Kalantari-Dehaghi, M., Walsh, C.M., Hiszczyńska-Sawicka, E., Davies, D.H., Felgner, P.L., Larsen, L.S., Lathrop, R.H., Hatfield, G.W., Schulz, J.R., Gürüz, Y. and Jurnak, F., 2007, GRA1 protein vaccine confers better immune response compared to codon-optimized GRA1 DNA vaccine, Vaccine, 25 (10):1824-1837pp. Dubey, J.P., 2008, The history of Toxoplasma gondii—the first 100 years, Journal Eukaryot Microbiology, 55(6):467-475pp. Dubey, J.P., 2010, Toxoplasmosis of Animals and Humans, Second Edition, CRP Press, 313pp. Dubey, J.P., Lindsay, D.S. and Speer, C.A., 1998, Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts, Clinical Microbiology Reviews, 11(2), 26799pp. Dupont, C.D., Christian, D.A. and Hunter, C.A., 2012, Immune response and immunopathology during toxoplasmosis, Seminars in Immunopathology, 34(6):793-813pp. Dziadek, B., Gatkowska, J., Brzostek, A., Dziadek, J. and Dzitko, K., Dlugonska, H., 2009, Toxoplasma gondii: the immunogenic and protective efficacy of recombinant ROP2 and ROP4 rhoptry proteins in murine experimental toxoplasmosis, Experimental Parasitology, 123(1):81-89pp. Dziadek, B., Gatkowska, J., Brzostek, A., Dziadek, J., Dzitko, K., Grzybowski, M. and Dlugonska, H., 2011, Evaluation of three recombinant multi-antigenic vaccines composed of surface and secretory antigens of Toxoplasma gondii in murine models of experimental toxoplasmosis, Vaccine, 29(4):821-830pp. 87 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Dziadek, B., Gatkowska, J., Grzybowski, M., Dziadek, J., Dzitko, K. and Dlugonska, H., 2012, Toxoplasma gondii: the vaccine potential of three trivalent antigen-cocktails composed of recombinant ROP2, ROP4, GRA4 and SAG1 proteins against chronic toxoplasmosis in BALB/c mice, Experimental Parasitology, 131(1), 133-138pp. Echeverria, P., Miguel, N., Costas, M. and Angel, S., 2006, Potent antigenspecific immunity to Toxoplasma gondii in adjuvant-free vaccination system using Rop2-Leishmania infantum Hsp83 fusion protein, Vaccine, 24, 4102-4110pp. Fachado A., Rodriguez A. and Angel S.O., 2003, Protective effect of a naked DNA vaccine cocktail against lethal toxoplasmosis in mice, Vaccine 21, 1327-1335 pp. Fachado, A., Rodriguez, A. and Angel, S.O., 2003, Protective effect of a naked DNA vaccine cocktail against lethal toxoplasmosis in mice, Vaccine, 21, 1327-1335pp. Fang, R., Feng, H., Hu, M., Khan, M., Wang, L., Zhou, Y. and Zhao, J., 2012, Evaluation of immune responses induced by SAG1 and MIC3 vaccine cocktails against Toxoplasma gondii, Veterinary Parasitology, 187:140146pp. Fang, R., Feng, H., Nie, H., Wang, L., Tu, P., Song, Q., Zhou, Y. and Zhao, J., 2010, Construction and immunogenicity of pseudotype baculovirus expressing Toxoplasma gondii SAG1 protein in BALB/c mice model, Vaccine, 28(7):1803-1807pp. Fang, R., Nie, H., Wang, Z., Tu, P., Zhou, D., Wang, L., He, L., Zhou, Y. and Zhao, J., 2009, Protective immune response in BALB/c mice induced by a suicidal DNA vaccine of the MIC3 gene of Toxoplasma gondii, Veterinary Parasitology, 164(2-4), 134-140pp. Felgner, J., Juarez, S., Hung, C., Liang, L., Jain, A., Döşkaya, M., Felgner P.L., Caner, A., Gürüz, Y. and Davies, D.H., 2015, Identification of Toxoplasma gondii antigens associated with different types of infection by serum antibody profiling, Parasitology, 14:1-12pp. 88 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Feliu, V., Vasseur, V., Grover, H.S., Chu, H.H., Brown, M.J., Wang, J., Boyle, J.P., Robey, E.A., Shastri, N. and Blanchard, N., 2013, Location of the CD8 T cell epitope within the antigenic precursor determines immunogenicity and protection against the Toxoplasma gondii parasite, PLoS Pathogens, 9(6):e1003449. Ferguson, D.J., 2004, Use of molecular and ultrastructural markers to evaluate stage conversion of Toxoplasma gondii in both the intermediate and definitive host, International Journal for Parasitology, 9;34(3), 347-60pp Filisetti, D. and Candolfi, E., 2004, Immune response to Toxoplasma gondii, Ann. Ist. Super. Sanità, 40(1):71-80pp. Frank, M. and Schloissnig, S., 2010, Bioinformatics and molecular modeling in glycobiology, Cellular and Molecular Life Sciences, 16):2749-2772pp. Garcia, J., Innes, E. and Katzer, F., 2014, Current progress toward vaccines against Toxoplasma gondii, Vaccine: Development and Therapy, 4:23-27pp. Gatkowska, J., Gasior, A., Kur, J. and Dlugonska, H., 2008, Toxoplasma gondii: chimeric Dr fimbriae as a recombinant vaccine against toxoplasmosis, Experimental Parasitology, 118(2):266-270pp. Gedik, Y., 2013, Toxoplasma gondii bradizoit ve takizoit formlarına özgü adjuvante multivalan rekombinant protein aşısının oluşturduğu immun yanıt ve korunmanın saptanması, Yüksek lisans tezi, Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü. Golkar, M., Shokrgozar, M.A., Rafati, S., Musset, K., Assmar, M., Sadaie, R., Cesbron-Delauw, M.F. and Mercier, C., 2007, Evaluation of protective effect of recombinant dense granule antigens GRA2 and GRA6 formulated in monophosphoryl lipid A (MPL) adjuvant against Toxoplasma chronic infection in mice, Vaccine, 25(21):4301-4311pp. Gong, P., Huang, X., Yu, Q., Li, Y., Huang, J., Li, J., Yang, J., Li, H., Zhang, G., Ren, W. and Zhang, X., 2013, The protective effect of a DNA vaccine encoding the Toxoplasma gondii cyclophilin gene in BALB/c mice, Parasite Immunology, 35, 140-146pp. 89 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Goodswen, S.J., Kennedy PJ and Ellis, J.T., 2014, Enhancing In Silico ProteinBased Vaccine Discovery for Eukaryotic Pathogens Using Predicted Peptide-MHC Binding and Peptide Conservation Scores, PLoS One, 9(12):e115745. Gülçe İz, S., Döşkaya, M., Borrego, B., Rodriguez, F., Gürüz, Y. and Gürhan, I.D., 2013, Co-expression of the Bcl-xL antiapoptotic protein enhances the induction of Th1-like immune responses in mice immunized with DNA vaccines encoding FMDV B and T cell epitopes, Veterinary Research Communications, 37(3):187-196pp. Gülçe İz, S., Döşkaya, M., Caner, A., Değirmenci Döşkaya, A., Rodriguez, F., Gürüz, Y. and Deliloğlu Gürhan, S.İ., 2014, A novel dual promoter DNA vaccine induces CD8+ response against Toxoplasma gondii sporozoite specific surface protein “SporoSAG” through non-apoptotic cells, Trials in Vaccinology, 3:81-88pp. Gürüz, A.Y. and Delibaş, S.B., 2007, Toksoplazmozis ve İmmunolojisi, 167194, Tıbbi ve Veteriner İmmunoparazitoloji, Özcel, M.A., İnci, A., Turgay, N. Ve Köroğlu, E. (Derl.), Türkiye Parazitoloji Derneği Yayınları 21, İzmir, 732s. Hansson, M., Nygren, P., and Stahl, S., 2000, Design and production of recombinant subunit vaccines, Biotechnology and Applied Biochemistry, 32:95-107pp. Hansson, M., Nygren, P.A. and Ståhl, S., 2000, Design and production of recombinant subunit vaccines, Biotechnology Applied Biochemistry, 32:95107pp. Hassan, I.A., Wang, S., Xu, L., Yan, R., Song, X. and Li, X., 2014, DNA vaccination with a gene encoding Toxoplasma gondii Deoxyribose Phosphate Aldolase (TgDPA) induces partial protective immunity against lethal challenge in mice, Parasites & Vectors, 7:431, 1-11pp. Hassan, I.A., Wang, S., Xu, L.X., Yan, R., Song, X. And Li, X., 2015, Immunological changes induced by Toxoplasma gondii Glutathione-S Transferase (TgGST) delivered as a DNA vaccine, Research in Veterinary Science, (in press). 90 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Haumont, M., Delhaye, L., Garcia, L., Margarita, J., Pasqualina, M., Véronique, D., Vincent, V., Alex, B., Ralph, B. and Alain, J., 2000, Protective immunity against congenital toxoplasmosis with recombinant SAG1 protein in a guinea pig model, Infection and Immunity, 68(9):49484953pp. Henriquez, F.L., Woods, S., Cong, H., McLeod, R., Roberts, C.W., 2010, Immunogenetics of Toxoplasma gondii informs vaccine design, Trends in Parasitology, 29(11):550-555pp. Hiszczyńska-Sawicka, E., Gatkowska, J. M., Grzybowski, M.M., and Długońska H., 2014, Veterinary vaccines against toxoplasmosis, Parasitology, 141, 1365-1378pp. Hiszczyńska-Sawicka, E., Li, H., Xu, J.B., Olędzka, G., Kur, J., Bickerstaffe, R. and Stankiewicz, M., 2010, Comparison of immune response in sheep immunized with DNA vaccine encoding Toxoplasma gondii GRA7 antigen in different adjuvant formulations, Experimental Parasitology, 124(4):365372 pp. Hounsell, E.F. and Davies, M.J., 1993, Role of protein glycosylation in immune regulation, Annals of the Rheumatics Diseases, 52, 22-29pp. Igarashi, M., Kano, F., Tamekuni, K., Machado, R.Z., Navarro, I.T., Vidotto, O., Vidotto, M.C. and Garcia, J.L., 2008, Toxoplasma gondii: evaluation of an intranasal vaccine using recombinant proteins against brain cyst formation in BALB/c mice, Experimental Parasitology, 118(3):386-392pp. Ilchmann, K., Revill, J., McLeish, C. and Nightingale, P., “Vaccine Development & the BWC” S&T Reviews, http://www.unog.ch/80256EDD006B8954/(httpAssets)/1820F9EAAC22FD E9C125787600385C25/$file/Iichmann+et+al++Vaccines+and+the+BWC.pdf, (Erişim tarihi: 02 Ekim 2014). Innes, E.A., Bartley, P.M., Maley, S., Katzer, F. and Buxton, D., 2009, Veterinary vaccines against Toxoplasma gondii, Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 104(2):246-251pp. Ismael, A.B., Sekkai, D., Collin, C., Bout, D. and Mevelec, M.N., 2003, The MIC3 gene of Toxoplasma gondii is a novel potent vaccine candidate against toxoplasmosis, Infection and Immunity, 71, 6222-6228pp. 91 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Jongert, E., Craeye, S., Dewit, J. and Huygen, K., 2007, GRA7 provides protective immunity in coctail DNA vaccines against Toxoplasma gondii, Parasite Immunology, 29 (9):445-453pp. Jongert, E., Melkebeek, V., De Craeye, S., Dewit, J., Verhelst, D. and Cox, E., 2008, An enhanced GRA1—GRA7 cocktail DNA vaccine primes antiToxoplasma immune responses in pigs, Vaccine, 26, 1025-1031pp. Khosroshahi, K., Ghaffarifar, F., D’Souza, S., Sharifi, Z. and Dalimi, A., 2011, Evaluation of the immune response induced by DNA vaccine cocktail expressing complete SAG1 and ROP2 genes against toxoplasmosis, Vaccine, 29:778-783pp. Kikumura, A., Fang, H., Mun, H.S., Uemura, N., Makino, M., Sayama, Y., Norose, K. and Aosai, F., 2010, Protective immunity against lethal anaphylactic reaction in Toxoplasma gondii-infected mice by DNA vaccination with T. gondii-derived heat shock protein 70 gene, Parasitology International, 59 (2), 105-111pp. Kim, K., 2004, Role of proteases in host cell invasion by Toxoplasma gondii and other Apicomplexa, Acta Tropica, 91, 69–81pp. Kotturi, M.F., Peters, B., Buendia-Laysa, F.J., Sidney. J., Oseroff, C., Botten, J., Grey, H., Buchmeier, M.J. and Sette, A., 2007, The CD8+ T-cell response to lymphocytic choriomeningitis virus involves the L antigen: uncovering new tricks for an old virus, Journal of Virology ,81(10):49284940pp. Kuman, H.A. ve Altıntaş N., 1996, Protozoon Hastalıkları, Bornova-İzmir, 216p. Leclerc, C., 2003, New approaches in vaccine development, Comparative Immunology Microbiology & Infectious Diseases, 26:329-341pp. Letscher Bru V., Villard O., Risse B., Zauke M., Klein J.P. and Kien T.T., 1998, Protective effect of vaccination with a combination of recombinant surface antigen 1 and interleukin 12 against toxoplasmosis in mice, Infectionand Immunity, 66, 4503-4506 pp. 92 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Letscher Bru, V., Pfaff, A.W., Abou-Bacar, A., Filisetti, D., Antoni, E., Villard, O., Klein, J.P. and Candolfi, E., 2003, Vaccination with Toxoplasma gondii SAG-1 protein is protective against congenital toxoplasmosis in BALB/c mice but not in CBA/J mice, Infection and Immunity, 71, 6615-6619pp. Leyva R., Herion P. and Saavedra R., 2001, Genetic immunization with plasmid DNA coding for the ROP2 protein of Toxoplasma gondii, Parasitology Research, 87, 70-79pp. Li, J., Han, Q., Gong, P., Yang, T., Ren, B., Li, S., Zhang, X., 2012, Toxoplasma gondii rhomboid protein 1 (TgROM1) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis, Veterinary Parasitology, l184(2-4):15416pp. Li, Z.Y., Chen, J., Petersen, E., Zhou, D.H., Huang, S.Y., Song, H.Q. and Zhu, X.Q., 2014, Synergy of mIL-21 and mIL-15 in enhancing DNA vaccine efficacy against acute and chronic Toxoplasma gondii infection in mice, Vaccine; 32, 3058-3065pp. Liang, L., Döşkaya, M., Juarez, S., Caner, A., Jasinskas, A., Tan, X., Hajagos, B., Bradley, P., Korkmaz, M., Gürüz, Y., Felgner, P. and Davies, H., 2011, Identification of potential serodiagnostic and subunit vaccines antigens by antibody profiling of toxoplasmosis cases in Turkey, Moleculer and Cellular Proteomics, 10(7):M110.006916, 1-17pp. Liljeqvist, S. and Stahl, S., 1999, Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines, Journal of Biotechnology, 73:1-33pp. Lim, S.S. and Othman, R.Y., 2014, Recent Advances in Toxoplasma gondii Immunotherapeutics, The Korean Journal of Parasitology, 52(6):581593pp. Liu, K.Y., Zhang, D.B., Wei, Q.K., Li, J., Li, G.P. and Yu, J.Z., 2006, Biological role of surface Toxoplasma gondii antigen in development of vaccine, World Journal of Gastroenterology, 12(15):2363-2368pp. Liu, M.M., Yuan, Z.G., Peng, G.H., Zhou, D.H., He, X.H., Yan, C., Yin, C.C., He, Y., Lin, R.Q., Song, H.Q. and Zhu, X.Q, 2010, Toxoplasma gondii microneme protein 8 (MIC8) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis, Parasitology Research, 106(5):1079-1084pp. 93 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Liu, Q., Shang, L., Jin, H., Wei, F., Zhu, X. and Gao, H., 2010, The protective effect of a Toxoplasma gondii SAG1 plasmid DNA vaccine in mice is enhanced with IL-18, Research in Veterinary Science, 89:93–97pp. Liu, Q., Wang, F., Wang, G., Zhao, Q., Min, J., Wang, S., Cong, H., Li, Y., He, S. and Zhou, H., 2014, Toxoplasma gondii: immune response and protective efficacy induced by ROP16/GRA7 multicomponent DNA vaccine with a genetic adjuvant B7-2, Human Vaccines & Immunotherapeutics, 10(1):184-191pp. Liu, S., Shi, L., Cheng, Y.B., Fan, G.X., Ren, H.X., Yuan, Y.K., 2009, Evaluation of protective effect of multi-epitope DNA vaccine encoding six antigen segments of Toxoplasma gondii in mice, Parasitology Research, 105:267-274pp. Lu, G., Zhou, A., Meng, M.,Wang, L., Han, Y., Guo, J., Zhou, H., Cong, H., Zhao, Q., Zhu, X. and He, S., 2014, Alpha-galactosylceramide enhances protective immunity induced by DNA vaccine of the SAG5D gene of Toxoplasma gondii, BMC Infectious Diseases, 14:706, 1-21pp. Luckheeram, R.V., Zhou, R., Verma, A.D. and Xia, B., 2012, CD4⁺T cells: differentiation and functions, Clinical and Developmental Immunology, 925135, 1-13pp. Luk, F.C., 2011, Role of Post Translational Modifications: Glycosylation and Palmitoylation in Toxoplasma gondii, Doctorate Thesis, University of North Caroline, Department of Cell and Developmental Biology, 203p. Lyons, R.E., McLeod, R. and Roberts, C.W., 2002, Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion, Trends in Parasitology, 18(5):198201pp. Machado, A., Caetanoa, B., Barbosa, R., Salgado, A.P., Rabelo, R., Garcia, C., Bruna-Romero, O., Escriou, N. and Gazzinelli, R., 2010, Prime and boost immunization with influenza and adenovirus encoding the Toxoplasma gondii surface antigen 2 (SAG2) induces strong protective immunity, Vaccine, 28:3247-3256pp. 94 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Machado, A., Caetanoa, B., Barbosa, R., Salgado, A.P., Rabelo, R., Garcia, C., Bruna-Romero, O., Escriou, N. and Gazzinelli, R., 2010, Prime and boost immunization with influenza and adenovirus encoding the Toxoplasma gondii surface antigen 2 (SAG2) induces strong protective immunity, Vaccine, 28, 3247-3256pp. Madigan M.T. and Martinko J.M., 2010, Brock Mikroorganizmaların Biyolojisi, Palme Yayıncılık, Ankara, 969s. Makino, M., Uemura, N., Moroda, M., Kikumura, A. and Piao, L., 2011, Innate immunity in DNA vaccine with Toxoplasma gondii-heat shock protein 70 gene that induces DC activation and Th1 polarization, Vaccine, 29, 1899-1905pp. Martin, V., Supanitsky, A., Echeverria, P, Litwin, S, Tanos, T, Roodt, A., Guarnera, A. and Angel, S., 2004, Recombinant GRA4 or ROP2 protein combined with alum or the GRA4 gene provides partial protection in chronic murine models of toxoplasmosis, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 11(4), 704-710pp. Medzhitov, R., 2007, Recognition of microorganisms and activation of the immune response, Nature, 449:819-826pp. Mendes, É.A., Fonseca, F.G., Casério, B.M., Colina, J.P., Gazzinelli, R.T. and Caetano, B.C., 2013, Recombinant vaccines against T. gondii: comparison between homologous and heterologous vaccination protocols using two viral vectors expressing SAG1, PLoS One, 8(5):e63201. Meng, M., He, S., Zhao, G., Bai, Y., Zhou, H., Cong, H., Lu, G., Zhao, Q. and Zhu, X.Q., 2012, Evaluation of protective immune responses induced by DNA vaccines encoding Toxoplasma gondii surface antigen 1 (SAG1) and 14-3-3 protein in BALB/c mice, Parasites & Vectors, 5:273,1-10pp. Meng, M., Zhou, A., Lu G., Wang, L., Zhao G., Han, Y., Zhou, H., Cong, H., Zhao, Q., Zhu, X. and He, S., 2013, DNA prime and peptide boost immunization protocol encoding the Toxoplasma gondii GRA4 induces strong protective immunity in BALB/c mice, BMC Infectious Diseases, 13:494, 1-10pp. 95 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Min, J., Qu, D., Li, C., Song, X., Zhao, Q., Li, X.A., Yang, Y., Liu, Q., He, S. and Zhou, H., 2012, Enhancement of protective immune responses induced by Toxoplasma gondii dense granule antigen 7 (GRA7) against toxoplasmosis in mice using a prime-boost vaccination strategy, Vaccine, 30(38), 5631-5636pp. Mishima, M., Xuan, X., Shioda, A., Omata, Y., Fujisaki, K., Nagasawa, H. and Mikami, T., 2001, Modified protection against Toxoplasma gondii lethal infection and brain cyst formation by vaccination with SAG2 and SRS1, The Journalof Veterinary Medical Science, 63(4):433-438 pp. Mohamed, R., Aosai, F., Chen, M., Mun, H., Norose, K., Belal, U., Piao, L. and Yano, A., 2003, Induction of protective immunity by DNA vaccination with Toxoplasma gondii HSP70, HSP30 and SAG1 genes, Vaccine, 21, 2852–2861pp. Montoya, J. G. and Liesenfeld, O., 2004, Toxoplasmosis, Lancet, 363: 1965– 1976pp. Moutaftsi, M., Peters, B., Pasquetto, V., Tscharke, D.C., Sidney, J., Bui, H.H., Grey, H. and Sette, A., 2006, A consensus epitope prediction approach identifies the breadth of murine T(CD8+)-cell responses to vaccinia virus, Nature Biotechnology, 24(7):817-819pp. Nabi, H., Rashid, M.I., Akbar, H. and Gul, R., Toxoplasma gondii: Anextract of its experimental trials of vaccination using potential vaccine candidates against toxoplasmosis, 2014, Science International, 26(1)287-292pp. Nielsen H.V., Di Cristina M., Beghetto E., Spadoni A., Petersen E. and Gargano N., 2006,Toxoplasma gondii: DNA vaccination with bradyzoite antigens induces protective immunity in mice against oral infection with parasite cysts, Experimental Parasitology, 112(4):274-279pp. Nielsen, H.V., Lauemoller, S.L., Christiansen, L., Buus, S., Fomsgaard, A. and Petersen, E., 1999, Complete protection against lethal Toxoplasma gondii infection in mice immunized with a plasmid encoding the SAG1 gene, Infection and Immunity, 67, 6358-6363pp. O’Shea, J.J., Lahesmaa, R., Vahedi, G., Laurence, A. and Kanno, Y., 2011, Genomic views of STAT function in CD4+ T helper cell differentiation: new technology brings new insights and new questions, Nature Reviews Immunology, 11(4):239-250pp. 96 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Owen, J.A., Punt, J., Stranford S.A. and Jones P.P., 2013, Kuby Immunology, The Journal of Experimental Medicine, New York, 691pp. Parthasarathy, S., Fong, M.Y., Ramaswamy, K. and Lau, Y.L., 2013, Protective immune response in BALB/c mice induced by DNA vaccine of the ROP8 gene of Toxoplasma gondii, The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 88(5):883-887pp. Paul, S., Kolla, R.V., Sidney, J., Weiskopf, D., Fleri, W., Kim, Y., Peters, B. and Sette, A., 2013, Evaluating the immunogenicity of protein drugs by applying in vitro MHC binding data and the immune epitope database and analysis resource, Clinical and Developmental Immunology, ID 467852, 17pp. Peng, G.H., Yuan, Z.G., Zhou, D.H., He, X.H., Liu, M.M., Yan, C., Yin, C.C., He, Y., Lin, R.Q. and Zhu, X.Q., 2009, Toxoplasma gondii microneme protein 6 (MIC6) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis in mice, Vaccine, 5:27(47), 6570-6574pp. Petersen, E., Nielsen, H.V., Christiansen, L. and Spenter, J., 1998, Immunization with E. coli produced recombinant T. gondii SAG1 with alum as adjuvant protect mice against lethal infection with Toxoplasma gondii, Vaccine, 16:13, 1283-1289pp. Petrovsky, N. and Aguilar, J.C., 2004, Vaccine adjuvants: current state and future trends, Immunology & Cell Biology - Nature, 82(5):488-496pp. Pier, G.B., Lyczak, J.B. and Wetzler L.M., 2004, Immunology, Infection and Immunity, American Society for Microbiology, Washington D.C., 697pp. Plotkin S., 2014, History of vaccination, PNAS, 111(34):12283-12287pp. Plotkin, S.L., and Plotkin, S.A., 2008, A short history of vaccination, 1-17, Vaccines, Plotkin, S.A., Orenstein, W.A. and Offit, P.A. (Eds.), SaundersElsevier, Philadelphia, 1691pp. Polat, C., Gülçe İz, S., Döşkaya, M., Can, H., Caner, A., Değirmenci, A., Balcan, E. and Gürüz, Y., 2013, Comparison of immune responses elicited by adjuvanted tachyzoite lysate vaccines developed from two different Toxoplasma gondii strains isolated in Turkey, Mikrobiyoloji Bülteni, 47(1), 122-134 pp. 97 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Possenti, A., Cherchi, S., Bertuccini, L., Pozio, E., Dubey, J.P. and Spano, F., 2010, Molecular characterisation of a novel family of cysteine-rich proteins of Toxoplasma gondii and ultrastructural evidence of oocyst wall localisation, International Journal for Parasitology, 40:1639-1649pp. Qu, D., Han, J. and Du, A., 2013, Enhancement of protective immune response to recombinant Toxoplasma gondii ROP18 antigen by ginsenoside Re, Experimental Parasitology, 135: 234-239pp. Quan, J.H., Chu, J.Q., Ismail, H.A., Zhou, W., Jo, E.K., Cha, G.H. and Lee, Y.H., 2012, Induction of protective immune responses by a multiantigenic DNA vaccine encoding GRA7 and ROP1 of Toxoplasma gondii, Clinical and Vaccine Immunology, 19(5), 666-674pp. Rashid, I., Hedli, D., Moire, N., Pierre, J., Debierre-Grockiego, F., DimierPoisson, I. and Mevelec, M., 2011, Immunological responses induced by a DNA vaccine expressing RON4 and by immunogenic recombinant protein RON4 failed to protect mice against chronic toxoplasmosis, Vaccine, 29, 8838-8846pp. Reed, S.G., Bertholet, S., Coler, R.N. and Friede, M., 2009, New horizons in adjuvants for vaccine development, Trends in Immunology, 30(1):23-32p. Riedel S., 2005, Edward Jenner and the history of smallpox and vaccination, Proc (Baylor University Medical Center), 18:21-25pp. Roth, Z., Yehezkel, G. and Khalaila, I., 2012, Identification and Quantification of Protein Glycosylation, International Journal of Carbohydrate Chemistry, 640923, 1-10pp. Sánchez, V.R., Pitkowski, M.N., Fernández Cuppari, A.V., Rodríguez, F.M., Fenoy, I.M., Frank, F.M., Goldman, A.,Corral, R.S. and Martin, V., 2011, Combination of CpG-oligodeoxynucleotides with recombinant ROP2 or GRA4 proteins induces protective immunity against Toxoplasma gondii infection, Experimental Parasitology, 128(4):448-453pp. Scorza, T., D'Souza, S., Laloup, M, Dewit, J, De Braekeleer, J., Verschueren, H., Vercammen, M., Huygen, K. and Jongert, E., 2003, A GRA1 DNA vaccine primes cytolytic CD8 T cells to control acute Toxoplasma gondii, Infection and Immunity, 71(1):309-316pp. 98 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Sheiner, L., Santos, J.M., Klages, N., Parussini, F., Jemmely, N., Friedrich, N., Ward, G.E. and Soldati-Favre, D., 2010, Toxoplasma gondii transmembrane microneme proteins and their modular design, Molecular Microbiology, 77(4): 92-929pp. Sibley, L.D., Khan, A., Ajioka, J.W. and Rosenthal, B.M., 2009, Genetic diversity of Toxoplasma gondii in animals and humans, Philosophical Transactions of the Royal Society B, 364:2749-2761pp. Singh, M. and O'Hagan, D., 1999, Advances in vaccine adjuvants, Nature Biotechnology, 17, 1075-1081pp. Stanley, A. C., Buxton, D., Innes, E. A. and Huntley, J. F., 2004, Intranasal immunisation with Toxoplasma gondii tachyzoite antigen encapsulated into PLG microspheres induces humoral and cell-mediated immunity in sheep, Vaccine, 22, 3929-3941pp. Sun, X., Mei, M., Zhang, X., Han, F., Jia, B., Wei, X., Chang, Z., Lu, H., Yin, J., Chen, Q. ve Jiang, N., 2014, The extracellular matrix protein mindin as a novel adjuvant elicits stronger immune responses for rBAG1, rSRS4and rSRS9 antigens of Toxoplasma gondii in BALB/c mice, BMC Infectious Diseases, 14:429, 1-7pp. Sun, X.M., Zou, J., AA, E.S., Yan, W.C., Liu, X.Y., Suo, X., Wang, H. and Chen, Q.J., 2011, DNA vaccination with a gene encoding Toxoplasma gondii GRA6 induces partial protection against toxoplasmosis in BALB/c mice, Parasites & Vectors, 4:213, 1-8pp. Supply, P., Sutton, P., Coughlan, S.N., Bilo, K., Saman, E., Trees, A.J., Cesbron Delauw, M.F. and Locht, C., 1999, Immunogenicity of recombinant BCG producing the GRA1 antigen from Toxoplasma gondii, Vaccine, 17, 705- 714pp. Tamiya, T., Kashiwagi, I., Takahashi, R., Yasukawa, H. and Yoshimura, A., 2011, Suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins and JAK/STAT pathways: regulation of T-cell inflammation by SOCS1 and SOCS3, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 31:980-985pp. Tan, T.G., Mui E., Cong, H., Witola, W., Montpetit, A., Muench S.P., Sidney J., Alexander J., Sette, A., Grigg, M., Maewal, A. and McLeod R., 2010, Identification of T. gondii epitopes, adjuvants, and host genetic factors that influence protection of mice and humans, Vaccine, 28(23): 3977-3989pp. 99 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Tanaka, S., Kuroda, Y., Ihara, F., Nishimura, M., Hiasa, J., Kojima, N., Nishikawa, Y., 2014, Vaccination with profilin encapsulated in oligomannose-coated liposomes induces significant protective immunity against Toxoplasma gondii, Vaccine, 32(16):1781-1785pp. Tao, Q., Fang, R., Zhang, W., Wang, Y., Cheng, J., Li, Y., Fang, K., Khan, M.K., Hu, M., Zhou, Y. and Zhao, J., 2013, Protective immunity induced by a DNA vaccine-encoding Toxoplasma gondii microneme protein 11 against acute toxoplasmosis in BALB/c mice, Parasitology Research, 112(8):2871-2877pp. Vercammen, M., Scorza, T., Huygen, K., De Braekeleer, J., Diet, R., Jacobs, D., Saman, E. and Verschueren, H., 2000, DNA vaccination with genes encoding Toxoplasma gondii antigens GRA1, GRA7, and ROP2 induces partially protective ımmunity against lethal challenge in mice, Infection and Immunity, 68(1), 38-45 pp. Verma, R. and Khanna, P., 2013, Development of Toxoplasma gondii vaccine: A global challenge, Human Vaccine & Immunotherapeutics, 9:2, 291293pp. Vivier, E., Raulet, D.H., Moretta, A., Caligiuri, M.A., Zitvogel, L., Lanier, L.L., Yokoyama, W.M., Ugolini, S., 2011, Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells, Science, 331:44-49pp. Wang H.L., Liu Q., Liu K., Zhong W., Gao S., Jiang L. and An N., 2007, Immune response induced by recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing ROP2 gene of Toxoplasma gondii, Parasitology International, 56(4):263-268 pp. Wang, H.L., Li, Y.Q., Yin, L.T., Meng, X.L., Guo, M., Zhang, J.H., Liu, H.L., Liu, J.J. and Yin, G.R., 2013, Toxoplasma gondii Protein Disulfide Isomerase (TgPDI) is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis, PLoS ONE; 8: e70884. Wang, H.L., Pang, M., Yin, L.T., Zhang, J.H., Meng, X.L., Yu, B.F., Guo, R., Bai, J.Z., Zheng, G.P., Yin, G.R., 2014a, Intranasal immunisation of the recombinant Toxoplasma gondii receptor for activated C kinase 1 partly protects mice against T. gondii infection, Acta Tropica, 137:58:66pp. 100 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Wang, H.L., Zhang, T., Yin, L., Pang, M., Guan, L., Liu, H., Zhang, J., Meng, X., Bai, J., Zheng, G. and Yin, G., 2014b, Partial protective effect of intranasal immunization with recombinant Toxoplasma gondii Rhoptry Protein 17 against toxoplasmosis in mice, PLoS ONE, 9 (9), e108377. Wang, P.Y., Yuan, Z.G., Petersen, E., Li, J., Zhang, X.X., Li, X.Z., Li, H.X., Lv, Z.C., Cheng, T., Ren, D., Yang, G.L., Lin, R.Q. and Zhu, X.Q., 2012, Protective efficacy of a Toxoplasma gondii rhoptry protein 13 plasmid DNA vaccine in mice, Clinical And Vaccine Immunology, 19(12):19161920pp. Wang, Y. and Yin, H., 2014, Research progress on surface antigen 1 (SAG1) of Toxoplasma gondii, Parasites & Vectors, 7:180,1-9pp. Wang, Y., Wang, M., Wang, G., Pang, A., Fu, B., Yin, H. and Zhang, D., 2011, Increased survival time in mice vaccinated with a branched lysine multiple antigenic peptide containing B- and T-cell epitopes from T. gondii antigens, Vaccine, 29(47):8619-8623pp. Weiss, L.M. and Dubey, J.P., 2009, Toxoplasmosis: A history of clinical observations, International Journal for Parasitology, 39: 895–901pp. Weiss, L.M. and Kim K., 2007, Toxoplasma gondii, The Model Apicomplexan: Perspectives and Methods, Elsevier Ltd., Great Britain, 800pp. Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., Felgner, P.L., 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, 247, 1465–1468pp. Wu, X.N., Lin, J., Lin, X., Chen, J., Chen, Z.L. and Lin, J.Y., 2012, Multicomponent DNA vaccine-encoding Toxoplasma gondii GRA1 and SAG1 primes: anti-Toxoplasma immune response in mice, Parasitology Research, 111(5), 2001-2009 pp Xu, Y., Zhang, N.Z., Tan, Q.D., Chen, J., Lu, J., Xu, Q.M and Zhu, X.Q., 2014, Evaluation of immuno-efficacy of a novel DNA vaccine encoding Toxoplasma gondii rhoptry protein 38 (TgROP38) against chronic toxoplasmosis in a murine model, BMC Infectious Diseases, 14:525, 1-8pp. 101 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Yan, H.K., Yuan, Z.G., Petersen, E., Zhang, X.X., Zhou, D.H., Liu, Q., He, Y., Lin, R.Q., Xu, M.J., Chen, X.L., Zhong, X.L. and Zhu, X.Q., 2011, Toxoplasma gondii: protective immunity against experimental toxoplasmosis induced by a DNA vaccine encoding the perforin-like protein 1, Experimental Parasitology, 128: 38-43pp. Yan, H.K., Yuan, Z.G., Song, H.Q., Petersen, E., Zhou, Y., Ren, D., Zhou, D.H., Li, H.X., Lin, R.Q., Yang, G.L. and Zhu, X.Q., 2012, Vaccination with a DNA vaccine coding for perforin-like protein 1 and MIC6 induces significant protective immunity against Toxoplasma gondii, Clinical Vaccine Immunology, 19(5):684-689pp. Yang, C.D., Chang, G.N. and Chao, D., 2004, Protective immunity against Toxoplasma gondii in mice induced by a chimeric protein rSAG1/2, Parasitology Research, 92, 58-64pp. Yao, B., Zhang, L., Liang, S. and Zhang, C., 2012, SVMTriP: a method to predict antigenic epitopes using support vector machine to integrate tripeptide similarity and propensity, PLoS One, 7(9):e45152. Yin, L.T., Hao, H.X., Wang, H.L., Zhang, J.H., Meng, X.L. and Yin, G.R., 2013, Intranasal immunisation with recombinant Toxoplasma gondii actin partly protects mice against Toxoplasmosis, PLoS ONE; 8: e82765. Yu, L., Yamagishi, J., Zhang, S., Jin, C., Aboge, G.O., Zhang, H., Zhang, G., Tanaka, T., Fujisaki, K., Nishikawa, Y. and Xuan, X., 2012, Protective effect of a prime-boost strategy with plasmid DNA followed by recombinant adenovirus expressing TgAMA1 as vaccines against Toxoplasma gondii infection in mice, Parasitology International, 61, 481486pp. Yu, Q., Huang, X., Gong, P., Zhang, Q., Li, J., Zhang, G., Yang, J., Li, H., Wang, N. and Zhang, X., 2013, Protective immunity induced by a recombinant BCG vaccine encoding the cyclophilin gene of Toxoplasma gondii, Vaccine, 31(51):6065-6071pp. Yuan, Z.G., Ren, D., Zhou, D.H., Zhang, X.X., Petersen, E., Li, X.Z., Zhou, Y., Yang, G.L. and Zhu, X.Q., 2013, Evaluation of protective effect of pVAX-TgMIC13 plasmid against acute and chronic Toxoplasma gondii infection in a murine model, Vaccine, 31(31):3135-3139pp. 102 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Yuan, Z.G., Zhang, X.X., He, X.H., Petersen, E., Zhou, D.H., He, Y., Lin, R.Q., Li, X.Z., Chen, X.L., Shi, X.R., Zhong, X.L., Zhang, B. and Zhu, X.Q., 2011a, Protective immunity induced by Toxoplasma gondii rhoptry protein 16 against toxoplasmosis in mice, Clinical And Vaccine Immunology, 18:1,119-124pp. Yuan, Z.G., Zhang, X.X., Lin, R.Q., Petersen, E., He, S., Yu, M., He, X.H., Zhou, D.H., He, Y., Li, H.X., Liao, M. and Zhu, X.Q., 2011b, Protective effect against toxoplasmosis in mice induced by DNA immunization with gene encoding Toxoplasma gondii ROP18, Vaccine, 29, 6614-6619pp. Zhang, J., He, S., Jiang, H., Yang, T., Cong, H., Zhou, H., Zhang, J., Gu, Q., Li, Y. and Zhao, Q., 2007, Evaluation of the immune response induced by multiantigenic DNA vaccine encoding SAG1 and ROP2 of Toxoplasma gondii and the adjuvant properties of murine interleukin-12 plasmid in BALB/c mice, Parasitology Research, 101(2):331-338pp. Zhang, M., Zhao, L., Song, J., Li, Y., Zhao, Q., He, S. and Cong, H., 2013, DNA vaccine encoding the Toxoplasma gondii bradyzoite-specific surface antigens SAG2CDX protect BALB/c mice against type II parasite infection, Vaccine, 31: 4536-4540pp. Zhang, N.Z., Huang, S.Y., Xu, Y., Chen, J., Wang, J.L., Tian, W.P. and Zhu, X.Q., 2014, Evaluation of immune responses in mice after DNA immunization with putative Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 5, Clinical and Vaccine Immunology, 21(7), 924-929pp. Zhang, N.Z., Huang, S.Y., Zhou, D.H., Chen, J., Xu, Y., Tian, W.P., Lu, J. and Zhu, X.Q., 2013, Protective immunity against Toxoplasma gondii induced by DNA immunization with the gene encoding a novel vaccine candidate: calcium-dependent protein kinase 3. BMC Infectious Diseases, 13:512, 1-8pp. Zhang, T.E., Yin, L.T., Li, R.H., Wang, H.L., Meng, X.L. and Yin, G.R., 2015, Protective immunity induced by peptides of AMA1, RON2 and RON4 containing T-and B-cell epitopes via an intranasal route against toxoplasmosis in mice, Parasites & Vectors, 8:15, 1-9pp. Zhao, B., Sakharkar, K.R., Lim C.S., Kangueane P. and Sakharkar M.K., 2007, MHC-Peptide binding prediction for epitope based vaccine design, International Journal of Integrative Biology, 1(2):127-140pp. 103 KAYNAKLAR DİZİNİ (devam) Zhao, G., Zhou, A., Lv, G., Meng, M., Sun, M., Bai, Y., Han, Y., Wang, L., Zhou, H., Cong, H., Zhao, Q., Zhu, X.Q. and He, S., 2013b, Identification and characterization of Toxoplasma gondii aspartic protease 1 as a novel vaccine candidate against toxoplasmosis, Parasites & Vectors, 6:175, 113pp. Zhao, G., Zhou, A., Lv, G., Meng, M., Sun, M., Bai, Y., Han, Y., Wang, L., Zhou, H., Cong, H., Zhao, Q., Zhu, X.Q. and He, S., 2013a, Toxoplasma gondii cathepsin proteases are undeveloped prominent vaccine antigens against toxoplasmosis, BMC Infectious Diseases,13:207, 1-11pp. Zhao, H., Huang, F.Y., Guo, J.L. and Tan, G.H., 2013c, Evaluation on the immune response induced by DNA vaccine encoding MIC8 co-immunized with IL-12 genetic adjuvant against Toxoplasma gondii infection, Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 31: 284-289pp. Zheng, B., Lu, S., Tong, Q., Kong, Q. and Lou, D., 2013, The virulence-related rhoptry protein 5 (ROP5) of Toxoplasma gondii is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis in mice, Vaccine, 31(41):4578-4584pp. Zhou, H., Gu, Q., Zhao, Q., Zhang, J., Cong, H., Li, Y. and He, S., 2007, Toxoplasma gondii: expression and characterization of a recombinant protein containing SAG1 and GRA2 in Pichia pastoris, Parasitology Research, 100, 829–835 pp. Zhou, H., Min, J., Zhao, Q., Gu, Q., Cong, H., Li, Y. and He, S., 2012, Protective immune response against Toxoplasma gondii elicited by a recombinant DNA vaccine with a novel genetic adjuvant, Vaccine, 30(10):1800-1806pp. 104 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Doğum Yeri ve Tarihi: İzmir, 20/06/1988 Elektronik posta adresi: esra.atalay.sahar@gmail.com Medeni Hali: Evli Eğitim Bilgileri 2012–2015 2007-2012 Yüksek Lisans Derecesi: Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Moleküler Biyoloji Bilim Dalı, Bornova/İzmir, Türkiye Lisans Derecesi: Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabiim Dalı, Bornova/İzmir, Türkiye Yayınlar [SCI (Science Citation Index) tarafından taranan dergilerde yayınlanan makaleler] Can H., Döşkaya M., Ajzenberg D., Özdemir H.G., Caner A., İz S.G., Döşkaya A.D., Atalay E., Çetinkaya Ç., Ürgen S., Karaçalı S., Ün C., Dardé M.L., Gürüz Y. (2014). Genetic characterization of Toxoplasma gondii isolates and toxoplasmosis seroprevalence in stray cats of İzmir, Turkey. PLOS One, 9(8):e104930. Uluslararası Hakemli konferans/sempozyumların bildiri kitaplarında sunulan sözlü bildirileri Döşkaya M., Atalay E., Liang L., Caner A., Can H., İz S.G., Davies H., Değirmenci Döşkaya A., Felgner P., Gürüz Y. (2014). Development of a novel six-valent recombinant protein vaccine against toxoplasmosis using antigens discovered by high-throughput protein microarray analysis of patient and infected murine model sera. Kısa Sözlü sunum-ePoster, 22nd ECCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) Barselona, İspanya, 10-14 Mayıs 2014. Abstract book p. 96. Uluslararası Hakemli konferans/sempozyumların bildiri kitaplarında sunulan poster bildirileri Şahar U., Döşkaya M., Caner A., Can H., Atalay E., Değirmenci Döşkaya A., Deveci R., Gürüz Y.,2014, “Preliminary analysis of monosaccharides in virulent T. gondii Ankara and Ege-1 strains by Cap LC-ESI-MS/MS”. Poster, 22nd ECCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) Barselona, İspanya, 10-14 Mayıs (2014). Abstract book p.169 Can H., Döşkaya M., Özdemir H.G., Caner A., Atalay E., Pektaş B., Gülce İz S., Değirmenci Döşkaya A., Ün C., Gürüz Y. (2014). Demonstration of Leishmania spp. by nested PCR in stray cats of İzmir located in western Turkey. Poster, 22nd ECCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) Barselona, İspanya, 10-14 Mayıs (2014). Abstract book p.168 Gülçe İz S., Döşkaya M., Elaldı N., Pablo J., Davies H., Caner A., Değirmenci Döşkaya A., Can H., Atalay E., Nakajima R., Jasinskas A., Deliloğlu Gürhan S.İ., Gürüz Y., Felgner P. (2013). Antigen Discovery from Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Genome using Protein Microarray Chips. Poster, VI. Bioengineering Congress, Kuşadası, Türkiye, 12-15 Kasım 2013. Abstract book p. 115. Ulusal ve uluslararası katılımlı bilimsel toplantılarda sunulan sözlü bildiriler Can, H., Döşkaya, M., Ajzenberg, D., Özdemir, H.G., Caner, A., Gülce, İ.S., Değirmenci, D.A., Atalay, E., Çetinkaya, Ç., Ürgen, S., Ün, C., Dardé, M.L., Gürüz, Y. (2014). Dünyada Toxoplasma gondii Genotiplerinin Coğrafik Dağılımı: Türkiye’de Son Durum. Sözlü Bildiri, 22.Ulusal Biyoloji Kongresi 23- 27 Haziran 2014, Eskişehir, Özet kitabı s. 397 105 ATALAY E. (2014). İmmünsüpresif Hastalar için Önem Taşıyan Bazı Etkenlerin Mikrobiyolojik Tanısı: Strongyloides stercoralis. Panel, 8. Ulusal Tanısal ve Moleküler Mikrobiyoloji Kongresi, 4-7 Haziran 2014, Ankara, Özet kitabı s. 77. Döşkaya, M., Caner, A., Değirmenci, D.A., Gülce, İ.S., Can, H., Gedik, Y., Atalay, E., Gürüz, Y., (2013), “Aşı Geliştirmede Rekombinant Proteinler ve Post Translasyonel Modifikasyonun Önemi” Sözlü Bildiri. II. Ulusal Glikobiyoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı) 11-14 Haziran 2013, İzmir, Türkiye. Özet kitabı s. 20. Atalay E., Deveci R., (2012) “N- ve O- Glikozilasyonu Engellenmiş Denizkestanesi Germ Hücrelerinin Döllenmesinde Glikozilasyonun Öneminin Deneysel Olarak Araştırılması” Sözlü Bildiri. 21. Ulusal Biyoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı) 3-7 Eylül 2012, İzmir, Özet kitabı s. 78. Ulusal ve uluslararası katılımlı bilimsel toplantılarda sunulan poster bildirileri Can,H., Atalay, E., Döşkaya, M., Özdemir, H.G., Caner, A., Değirmenci, D.A., Gürüz, Y., Ün, C., (2014). Kedilerde CMAH Geni Analizi. Poster bildiri, 22.Ulusal Biyoloji Kongresi 2327 Haziran 2014, Eskişehir, Özet kitabı s. 1344. Can, H., Döskaya, M., Ajzenberg, D., Özdemir, H., Caner, A., Gülce, İ.S., Degirmenci, A., Çetinkaya, Ç., Ürgen, S., Atalay, E., Karaçalı, S., Ün, C., Deveci, R., Dardé, M.L., Gürüz, Y., (2013), “İzmir İli Sokak Kedilerinde Toxoplasmosis Seroprevalansı”. Poster, 18. Ulusal Parazitoloji Kongresi 29 Eylül- 5 Ekim 2013, Denizli, Türkiye. Özet kitabı s.264. Can, H., Döskaya, M., Özdemir, H., Caner, A., Atalay, E., Pektaş, B., Töz, Ö.S., Gülce, İ.S., Degirmenci, D.A., Çetinkaya, Ç., Ürgen, S., Karaçalı, S., Ün, C., Deveci, R., Gürüz, Y., (2013), “İzmir İli Sokak Kedilerinde Leishmania spp. Varlığının Moleküler Yöntemlerle Araştırılması”. Poster, 18. Ulusal Parazitoloji Kongresi 29 Eylül- 5 Ekim 2013, Denizli, Türkiye. Özet kitabı s.204. Kıvrak, E.E., Taşbakan, I.M., Döşkaya, M., Caner, A., Pullukçu, H., Değirmenci D.A., Yılmaz, M., Can, H., Atalay, E., Alver, O., Töz, H., Gürüz Y., (2013), “Dışkı örneklerinde Strongyloides stercoralis’in Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Tanısı”. Poster, 18. Ulusal Parazitoloji Kongresi 29 Eylül- 5 Ekim 2013, Denizli, Türkiye. Özet kitabı s.183 (18. Ulusal Parazitoloji Kongresinde Poster Birincilik ödülü almıştır). Atalay E., Deveci R., (2013), “Denizkestanesi Paracentrotus lividus’da N- ve OGlikozilasyonun Döllenmedeki Etkisinin Araştırılması”. Poster, II. Ulusal Glikobiyoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı) 11-14 Haziran 2013, İzmir, Türkiye. Özet kitabı s. 43. Projeler Proje başlığı: N- ve O- Glikozilasyonu Engellenmiş Deniz Kestanesi Germ Hücrelerinin Döllenmesinde Glikozilasyonun Öneminin Deneysel Olarak Araştırılması Görevi: Yürütücü Proje tarihi: 2011-2012 Projeyi destekleyen kuruluş: TÜBİTAK 2209 Proje başlığı: İzmir ili sokak kedilerinde Leishmania spp. varlığının moleküler ve serolojik yöntemlerle araştırılması Görevi: Araştırmacı Proje tarihi: 2013-2014 Projeyi destekleyen kuruluş: Ege Üniversitesi Rektörlüğü Araştırma Fon Saymanlığı (2013TIP099) Proje Başlığı: Toxoplasmosise Karşı Adjuvante Multivalan Rekombinant Protein Aşısının Oluşturulması Görevi: Bursiyer Proje tarihi: 2010-2013 Projeyi destekleyen kuruluş: TÜBİTAK SBAG 1001 (Proje No:110S200) 106 Proje Başlığı: Doğal hayatta saptanan Toxoplasma gondii suşlarının izolasyonu ve mikrosatellit genotiplendirilmesi Görevi: Araştırmacı Proje tarihi: 2014-2017 Projeyi destekleyen kuruluş: Ege Üniversitesi Rektörlüğü Araştırma Fon Saymanlığı (2014 TIP 073) Kongreler ve Diğer Eğitimler I. ULUSAL VE ULUSLARARASI KONGRE VE SEMPOZYUM 11. Ege Diyabet Günleri Kursu 14-15 Kasım 2013, İzmir, Türkiye 18. Ulusal Parazitoloji Kongresi 29 Eylül- 5 Ekim 2013, Denizli, Türkiye Uluslararası Katılımlı Genotiplendirme Sempozyumu 19 Haziran 2013, İzmir, Türkiye II. Ulusal Glikobiyoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı) 11-14 Haziran 2013, İzmir, Türkiye 21.Ulusal Biyoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı) 3- 7 Eylül 2012, İzmir, Türkiye Kanser Biyolojisi ve İmmunolojisi Kursu 29-30 Mart 2012, İzmir, Türkiye Discussion Meeting on Sialoglycobiology 26-27 Kasım 2011,İzmir, Türkiye II. KONGRE VE SEMPOZYUM DÜZENLEMEDE ALINAN GÖREVLER 19 Haziran 2013 tarihinde İzmirde düzenlenen “Uluslararası Katılımlı Genotiplendirme Sempozyumu” organizasyon komitesinde yer almıştır. III. DİĞER EGİTİMLER Malign Hastalıklarda Klinik Araştırmalar Çalıştayı, 12-13 Eylül 2013, T.C. Sağlık Bakanlığı ve Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, İzmir. Temel İyi Klinik Uygulamalar Eğitimi, 6-7 Eylül 2013, T.C. Sağlık Bakanlığı ve Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, İzmir. Glikobiyolojide Optik ve Analitik Yöntemler Çalıştayı, II. Ulusal Glikobiyoloji Kongresi, Uluslararası Katılımlı, 11-14 Haziran 2013, İzmir. Pedagojik Formasyon Sertifikası Programı, Ege Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, 2010-2011, İzmir. KAZANILAN BURSLAR TÜBİTAK Araştırmacı Proje Bursu (8 ay), 15/ 02 /2013-15 / 10 /2013 Patent Başvuruları 2014, 2014/11565, Kurutulmuş meyve ve sebzelerde H2O2 (hidrojen peroksit) tayini. Üğeliği Bulunan Dernekler Türkiye Aşı Bilimi Derneği, Üye, Denetleme Kurulu yedek üyesi Türkiye Parazitoloji Derneği, Üye
