hepatıt b vırus ıhbvı dna`sının polımeraz zıncır reaksıyonu ıpcrı ve

Viral Hepatit Derg 2002 (1)441-443
HEPATIT B VIRUS IHBVI DNA'SININ POLIMERAZ ZINCIR REAKSIYONU IPCRI
VE HIBRIDIZASYON YONTEMLERIILE ARASTIRILMASI
Serpil TUNCAYYETI$KUL, FarukAYDIN, K1van~ C:UBUKC:U, Osman Birol OZGOMO$, Yelda YAZICI, Ali Osman KILIC:
OZET
Bu c;all~mada Hepatit B virus yi.izey antijeni (HBsAg) pozitif olan 44 serum Orneginde HBV-DNA var!1g1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve hibridizasyon yOntemleri ile ara~t1nlarak iki y6ntemin sonuc;lan kar~1la~tmld1. Fenol-kloroform ekstraksiyon y6ntemi ile DNA izolasyonundan sonra PCR yap1lan Orneklerin% 68.18'inde HBV-DNA pozitifligi tespit edildi. Hibridizasyon yOntemi ile ise HBV-DNA %56.81 oranmda pozitif bulundu. Hibridizasyon ile negatif saptanan 19 serum Orneginin 5'inde PCR ile
HBV-DNA saptand1.
Sonuc; olarak, HBsAg pozitif olan hastalarm daha ucuz ve hassas bir yOntem olan PCR ile taranmas1nm, bunu takiben tedavi
planlanan olgularda biyokimyasal ve klinik kriterler gOz Oni.inde bulundurularak viral yOkteki degi~ikliklerin takibinde kantitatif
hibridizasyon yOnteminin kullan1lmas•n•n uygun olacag1 kanaatindeyiz.
Anahtar Kelimeler: HBV-DNA,. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), Hibridizasyon
SUMMARY
DETECTION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) DNA BY POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
AND HYBRIDIZATION METHODS
Jn this study, HBV DNA was investigated in Hepatitis B Virus surfage antigene (HBsAg) positive sera samples from 44 patients,
using both PCR and hybridization methods and the results were compared. After DNA isolation using phenol-chloroform extraction method, HBV-DNA was positive in 68.18% of the sera samples by PCR and 56.81% by Digene Hybrid Capture System. In
5 of hybridization negatif 19 samples, HBV-DNAwas detected by PCR.
We concluded that HBsAg positive patients should be first screened by PCR, which is more sensitive and cost effective than
hybridization method, followed the changes in viral load may be determined by hybridization for the treatment planning cases
according to biochemical and clinical findings.
Key words: HBV-DNA, PCR, Hybridization (Digene Hybrid Capture System)
Giri~
HBV'ye kar~1 olu~an antikorlann varllg1 infeksiyonun olmad1g1m kamt-
Hepatit B Virusu (HBV) insanlarda akut hepatit, kronik hepatit, ka-
zasyon gibi duyarllllg1 yoksek molekUler biyolojik tekniklerin kullam-
lamak ic;in yeterli degildir (5). Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve hibridiraciger sirozu ve hepatoselli.iler karsinoma gibi hastallklara neden ol-
ma girmesi, DNA incelemelerini mOmki.in k•lm1~t1r. Ozellikle serone-
maktad•r (1). HBV Hepadnavirus familyas1nda, 42 nm c;apmda, zarfll,
gatif ki~ilerden bula~an HBV infeksiyonlarmda, tek g6stergenin HBV-
c;ift sarmal DNA ic;eren, ikozahedral simetrili bir virus olup, zarfmda
DNA oldugu kamtlanm1~t1r. HBV-DNA saptanmas1, viral replikasyo-
protein yap1da yGzey antijeni (HBsAg), kor bOigesinde ise revers
nun ve virUsOn serumda varllgm1n en dogru gOstergesidir (6).
transkriptaz, RNA bag1ml1 DNA polimeraz enzimlerini ic;erir (2).
(:e~itli tan1 merkezlerinde farkl1 primer c;iftleri ve farkl1 protokoller
HBV'nin yi.izey antijeninden ba~ka diger iki Onemli antijeni kor antije-
kullan1lmaktad•r, bu nedenle PCR standart bir yOntem degildir. Halbu-
ni {HBcAg) vee antijeni (HBeAg)'dir (3). HBeAg virus partikOIIerinde
ki hibridizasyon yOntemi belirli bir standarta sahiptir. Bu c;all~mada
yer almaz, HBV ile infekte hepatosit yGzeyine ve seruma salg1lan1r.
merkezimizde kullan1lan PCR protokoiOni.in hassasiyetinin ogrenilme-
Onceleri HBeAg'nin serumda bulunmas1 viral partikOIIerin, DNA poli-
si ve hibridizasyon ybntemi ile klyaslanmas1 amac;lanm•~t1r.
merazm ve HBV-DNA'nm serumda bulundugunun, dolay1s1 ile replikasyonun bir g6stergesi olarak kabul edilmi~tir (4). Son y1llarda, gerek
HBV'nin genetik varyasyonlanna gerekse daha duyarh tam yOntemlerinin geli~tirilmesine bagl1 olarak al1~1lagelen serolojik profiller d1~1nda
tablolar kar§lmJza c;•kmaktad1r. HBV antijenlerinin yoklugu veya
Karadeniz Teknik Oniversitesi T1p Fakiiltesi Mikrobiyo!oji ve Klinik Mikrobiyoloji
Anabilim Dall, Trabzon.
Not: XXIX. Tiirk Mikrobiyoloji Kongresi'nde (8-13 Ekim 2000, Antalya) sOzlii bildiri
olarak sunulmu~tur.
441
Gerer; ve YOntem
<;:al!~maya 1 Ocak- 30 Haziran 2000 tarihleri aras1nda Karadeniz
<;:aiJ~mam1zda HBsAg pozitif olan serumlarda PCR ile %68.18 ora-
Teknik Oniversitesi T1p FakOitesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyolo-
nlnda HBV-DNA pozitif bulundu. Olkemizde farkli protokoller kulla-
ji Anabilim Dall Laboratuvan'na ba~vuran HBsAg pozitif 44 hastan1n
nllarak yap1lan degi~ik c;al1~malarda A~c1 ve arkada~lan (4), HBsAg po-
serum Ornegi al1nd1. EDTA'Il tOp i<;ine alman yakla~1k 2 ml kan Orne-
zitif serumlarda HBV-DNA pozitifligini %42.3, Ku~timur ve ark. (8)
Sinden ayn~tmlan serum Ornekleri <;ali~ma gOnOne kadar iki ayn mik-
%38 oranmda bulmu~lard1r. Stinmez ve ark. (6) asemptomatik ta~IYICI­
rosantrifOj tOpOnde -20ooC' de sakland1. Serum Orneklerinin bir grubu
Iarda bu oram %31.3, Heper ve ark. (9) ise %26.6 olarak bulmu~lar­
kalitatif sonu<; veren PCR ytintemi ile, diger grubu kantitatif degerlere
dir. HBV-DNA pozitifligi oranlannm bu degi~kenligi c;ah~maya alman
ula~ilabilen, SIVI fazda gerc;ekle~en
gruplann, fark!Jiig1ndan ve PCR yOntemlerinin standardizasyonundan
ve radyoaktif olmayan kemilumi-
nesan molekoler hibridizasyon ytintemi (Digene Hybrid Capture
kaynakland1g1 dU~UndOrmektedir.
<;:all~mam1zda HBsAg pozitif olan serumlarda hibridizasyon ytin-
System) ile <;al1~1larak HBV-DNA varl18:1 ara~t1nld1.
PCR y6nteminde, serum tirnekleri SDS, proteinaz-K, tamponlu fe-
temi ile HBV-DNA pozitifligi % 56.81 oranmda bulundu. Zaaijer ve
nol, kloroform izoamilalkol (24:1) yOntemiyle ekstrakte edildi. Daha
arkada~[anmn
sonra 70 ml Na-asetat (pH 4.9) ilave edildi. YOzde 96'11k etanol ile
y6ntemini kullanarak yapt1klan c;al1~mada HBV-DNA pozitiflik oran1
-20ooC'de bir gece bekletilerek DNA'nm presipitasyonu sagland1, %70
% 28 bulunmu~tur. M1st1k ve ark. (11) hibridizasyon y6ntemi ile pozi-
{1 0) 109 HBsAg pozitif serumda aym hibridizasyon
etanol ile y1kand1ktan sonra 55ooC'de kurutuldu. DNA 20m I TE (1 0
tiflik oran1m %34, Ku~timur ve ark. (8) %26, Tansug ve ark. (12) ise
mM TrisHCI, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0) ic;erisinde c;ozdOrOido ve
%13.6 olarak bulmu~lard1r.
10ml'si PCR amplifikasyonu ic;in kullanildl. Amplifikasyon ic;in 5'-CAA
Hibridizasyon ile negatif bulunan serum Orneklerinin %26.3'U
GGT ATG TIG CCC GTI TG-3' ve 5'-AAA GCC CTG CGAACC ACT
PCR ile pozitif bulundu. HBsAg pozitif Orneklerde hibridizasyon nega-
GA-3' primerleri kullanilarak HBsAg gen bOigesinin 329-587 niikle-
tif iken PCR ile Badur ve ark. {3) %8.5, Ku~timur ve ark. {8) ise% 16.2,
otidleri arasmda kalan 259 baz c;iftlik btilgesi c;ogaltild1 (7). PCR ic;in
Teke~
otomatik thermal-cycler (TECHNE) kullandd1. PCR iirOnleri %2'lik
lerdir. Pawlotsky ve ark. {14) yapt1klan c;all~mada, hibridizasyon ilene-
agaroz jelde 60 voltta 1 saat yOrOtoldO, 0.1 glml ethidiyum bromiir ile
gatif bulunan serum Orneklerinin %50'sinde PCR ile pozitif sonu<; al-
ve ark. (13) ise %6 oranmda pozitiflik bulduklarm1 rapor
etmi~­
boyand1ktan sonra ultraviyole transilluminattirde incelenerek polaroid
ml~[ardJr. Bu c;ah~mada elde edilen sonuc;lann aksine Otlu ve ark.'n1n
kamera ile gOrOntOiendi.
(15) yapt18:1 bir <;all~mada hibridizasyon ile %22.8 olan pozitiflik ora-
Hibridizasyon yOnteminde serum Ornekleri, Digene Hybrid Captu-
nl, PCR ile %15.3 olarak saptanm1~t1r.
re System ile kit prosedOrOne uyularak c;ali~Jid1 ve sonuc;lar lumino-
HBV-DNA'mn tespiti i<;in degi~ik molekUier biyolojik teknikler
metrede okundu. NOkleik asit miktar tayini yapilarak mililitrede 5 pi-
mevcuttur. HBV-DNA dOzeyi, HBV infeksiyonunun antiviral tedavisi-
kogram ve iizerindeki degerler pozitif olarak degerlendirildi.
nin prognozu ac;1smdan tinemlidir. Antiviral tedavinin amaCI, HBV
replikasyonunun durdurulmas1 ve daha sonra virusun eradike edilme-
Bulgular
sidir (10). Serumda HBV-DNA'mn 8 haftadan daha uzun sOre hibridi-
<;:all~maya al1nan 44 serum Orneginin PCR yOntemiyle 30'unda
caglm yans1t1r. YUksek dUzeyli HBV-DNA varl1g1, replikasyonun ileri
(%68.18), hibridizasyon ytintemiyle 25'inde (%56.81) HBV-DNA po-
derecede oldugunun ifadesidir {16). Tedavi uygulanacak olgularda
zitif bulundu. Hibridizasyonda 5 pglml'nin altmda deger Olc;Ulen 19
replikasyonun en kesin gOstergesi olan HBV-DNA dozeyinin belirlen-
zasyon ile saptanmas• kronikle~me egilimini, tersi durum iyile~me ola-
serum 6rneginin 5'i {%26.3) PCR ile pozitif bulundu (Tablo 1).
mesi Onemlidir (1 0). Hibridizasyon esas1na dayanan y6ntemlerin kolay
uygulanabilme, yOksek OzgUIIOkte olma ve kantitatif sonuc; al1nabilme
gibi OstUnliikleri yan1nda duyarliliklan dU~UktOr (1 7).
Tablo 1: HBsAg pozitif olgularda PCR ve hibridizasyon
Bu c;al1~mada elde edilen sonuc;lar, HBsAg pozitif olan hastalarm
tincelikle PCR ile ara~tmlmas1, daha sonra biyokimyasal ve klinik but-
metodlan ile HBV-DNA sonuc;lan ve birbiri ile ili~kisi
gular degerlendirilerek tedavi planlanan olgulann kantitasyon ic;in hibridizasyon c;ali~masma allnmasmm uygun olacagm1 ortaya koymu~tur.
HiBRiDiZASYON
Sonuc; o[arak; laboratuvarlar aras1 standardizasyon problemlerine rag-
"'"u
442
+
(>5 pg/mli
-
+
25 (%56.81)
5 (%11.36)
-
0
14 {%31.81)
14 (%31.81)
Top! am
25 (%56.81)
19 (%43.18)
44 (%100)
Toplam
men HBV-DNA varllgmm ara~tlfllmasmda tarama testi olarak en duyarll tekniklerden biri olan PCR'm kullandmasJ hem ucuz, hem de has-
(<5pg/mll
30 (%68.18)
sas olmas1 ac;Js1ndan tercih edilmelidir.
KAYNAKlAR
10- TUret S, Fidan 1: HBsAg pozitif serum Orneklerinde Hepatit B
virus DNA'smm hibridizasyon y6ntemi ile tespiti ve HBeAg ve Anti-
1- Kthc;turgay K, M1st1k R: TOrkiye'de viral hepatitler. 11 K. Klhc;tur-
gay (ed). Viral Hepatit 94, 2. bask!" s 1-14, 1994
2- Murray R P, Rosenthal K S, Kobayashi G S, Pfaller M: Hepatitis
Viruses 'Medical Microbiology 3. Bask•' Kitab1nda s 523, 1998.
3- Badur 5: Hepatit B Virus Moleki.iler Viroloji ve Serolojik Tam,
"K. Kilu;turgay (ed). Viral Hepatit 94, 2. Bask1" Kitabmda s 75-79,
1994, Viral Hepatitle Sava?•m Dernegi, istanbul.
g6stergeleriyle
kar~da~tmlmas1.
11- M1st1k R, Akal1n H, Heper Y, Ozakln C, HelvaCJ S, TOre 0:
HBV-DNA'smm PCR ve Hibridizasyon y6ntemleri ile ka~da~tmlmali
olarak gOsterilmesi, IV. Ulusal Viral Hepatit Simpozyumu, 1998, Ankara, Program ve Kongre Kitab1 s:145.
12- Tansug $, Onal E, DUzgUns1vac1 E, GUvel H: HBsAg pozitif ol-
4- A~c1 Z, Akbulut A, Doymaz MZ, Felek S, K1hc; 5: Serumda Hepatit 8 Virus DNA'smm PCR y6ntemi ile taranmas1
HBe pozitiflikleri ile kar~da~tiTIImasJ. Mikrobiyoloji BOiteni, 1999, 33:
215-221.
ve
HBV serolojik
gulann ve bu olgularda HBV-DNA dUzeylerinin degerlendirilmesi. Viral Hepatit Dergisi, 1999, 2: 129-136.
Viral Hepatit Dergisi, 1996, 2(1): 6-9.
13- Tekej S, Alp MN, $imjek S, Kalkanl! S, Budak T: D.O. T1p Fa-
5- Yi.icesoy M, Ta~l1 H, Bahar iH, Yulug N: Degi~ik serolojik belir-
kUitesi Genetik Tan1 Laboratuvanna Ba~vuran 340 Hastanm 'Hybrid
leyicilerin degerlendirilmesinde HBV-DNA saptanmasmm Onemi. Vi-
Capture Sistemi' ve PCR yOntemi ile belirlenmi~ HBV-DNA sonuc;lan-
ral Hepatit Dergisi, 2000, 2: 109-112.
nm degerlendirilmesi, I. Ulusal Molekoler ve Tan1sal Mikrobiyoloji
6- SOnmez E, Durmaz R, K1zdkaya N, Ozbilge H, COnal S, Yolog-
Kongresi, 24-27 Nisan 2000, Kapadokya, Kongre KitabJ s:20.
lu S: HBsAg pozitif serumlarda HBV-DNA'n1n iki ayn PCR yOntemi ile
14- Pawlotsky JM, Bastie A, Lonjon I at all: What Technique sho-
taranmas1 ve sonuc;lanmn serolojik gOstergelerle kar~da~tlrllmas1. The
uld be used for routine detection and quantification of HBV DNA in
journal Of infectious Diseases and Clinical Microbiology, 1996, 1(3):
clinical samples?. J Virol Methods, 1997, 65(2): 245-53.
172-176.
15- Otlu B, Durmaz R, $ahin K, Tekerekoglu M, BUyOkberber N:
7- Yokosuka 0, Tagawa M, Ornata M: PCR detection of Hepatitis
Hepatit B Virus DNA's1nm ara~unlmasmda "In House" Polimeraz Zin-
B Virus, "Diagnostic Molecular Microbiology" Kitabmda s 322-326,
cir Reaksiyon {PZR) Y6nteminin 'Digene Hybrid Capture' sistemi ile
kar~Jia~tmlmas1,
1993.
8- Ku~timur S, <;1rak M, Fidan
i, Mansuroglu H, Rota S, TUret S: Se-
I. Ulusal MolekUier ve Tamsal Mikrobiyoloji Kongre-
si, 24-27 Nisan 2000, Kapadokya, Kongre Kitab1 s:21.
rumda Hepatit B Virus DNA {HBV-DNA) Saptanmasmm PCR ve hibri-
16- Yenen 0$: Viral hepatitler, "Wilke TA, S6yletir G, Doganay M
dizasyon yOntemleri ile kar~da~t1nlmasl, J. Ulusal MolekUier ve Tamsal
(ed) infeksiyon Hastaliklan" Kitabmda s:633-681, 1996, Nobel T1p Ki-
Mikrobiyoloji Kongresi, 24-27 Nisan 2000, Kapadokya, Kongre Kitab1
tabevleri, istanbul.
s:26.
9- Heper Y, M1st1k R, Ozakln C, TOre 0: Hepatit B Virus {HBV)
markerleri ile HBV-DNA ili~kisi: Bursa bOigesi sonuc;~an. Viral Hepatit
17- Durmaz R: MolekOier yOntemlerin uygulanmas1nda kar~da~l­
lan sorunlar, IV. Ulusal Viral Hepatit Simpozyumu, 1998, Ankara,
Program ve Kongre Kitab1 s:79.
Dergisi, 1999,2:137-139.
443