Testis Arjinazı: İzolasyon ve Özelliklerinin Belirlenmesi

KOÇ TESTİS ARJİNAZI: İZOLASYON VE ÖZELLİKLERİNİN
BELİRLENMESİ
M. Barış Günaydın, M. Hande Gölgeli, Birce Kantar
Danışman: E. Suna Türkoğlu
ÖZET
Arjinaz (EC 3.5.3.1) arjininin ornitin ve üreye dönüşümünü katalizleyen bir metalloenzimdir.
Hepatik ve ekstrahepatik olmak üzere iki izoziminin varlığı çeşitli dokularda tanımlanmıştır.
Bu çalışmada, bir yaşında kıvırcık cinsi koç testisinde arjinaz aktivitesinin olası varlığının
saptanması sonrası enzimin çeşitli özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Verilerimiz,
testis dokusunda enzimin varlığı ve Michaelis-Menten kinetiğine uyduğu doğrultusundadır.
GİRİŞ
Arjinaz (EC 3.5.3.1), arjinini ornitin ve üreye katalizleyen bir metalloenzimdir. Farklı genler
tarafından kodlanan arjinaz I (hepatik arjinaz, Tip I) ve arjinaz II (ekstrahepatik arjinaz, Tip
II) olmak üzere iki izoziminin varlığı tanımlanmıştır. İzozimlerin katalitik aktivite için
mutlak Mn2+ gereksinimlerinin benzer olduğu gösterilmiştir. Buna karşın alt birim çeşitliliği,
dördüncül yapılanmaları, kinetik özellikleri, hücre içi yerleşimleri, doku dağılımları,
sentezlerinin düzenlenmesi ve immünolojik reaktivitelerinde farklılıklar göstermektedirler.
Arjinaz I sitozolik olup, ağırlıklı olarak karaciğerde sentezlenirken, arjinaz II
mitokondriyaldir ve böbrek, beyin, ince bağırsak, meme bezi, makrofaj gibi ekstrahepatik
dokularda yaygın olarak sentezlenmektedir (1,4-6,8,10,13).
Hepatik dokuda arjinaz I, üre döngüsünün son basamağını katalizleyerek amonyak
detoksifikasyonunda rol oynamaktadır. Ekstrahepatik dokularda da derişimi düşük olmak
üzere sentezlenebilmektedir. Üre döngüsünün aktif olmadığı dokularda arjinazın (Tip I / Tip
II) işlevi poliaminler, prolin ve glutamat biyosentezi için öncü molekül olan ornitini
sağlamaktır. Bunun yanı sıra arjinaz, nitrik oksit sentezinden sorumlu olan nitrik oksit sentaz
ile aynı substratı kullanmaktadır. Bu bağlamda arjinin homeostazında rol oynamaktadır
(Şekil 1) (1,3,4,6,8,9,11,13).
Enzimin moleküler formlarının farklı yapılanmalarının varlığı da bildirilmektedir (1,8,10).
Arjinazın moleküler formları, dokuya bağımlı olarak değişiklik gösterebilmektedir. Patolojik
durumlarda dokuya özgü enzim ekspresyonunun yanı sıra diğer izozimin ekspresyonu da
gerçekleşebilmektedir (5,16). Bu neden ile fizyolojik ve patolojik süreçte arjinazın etkisinin
olabileceği ileri sürülmektedir (4,5,8,16).
Arjinazın fizyolojik ve patolojik durumlardaki öneminin/katılımının belirlenebilmesi ve söz
konusu durumların moleküler mekanizmalarına enzim bağlamında açıklık getirebilmek amacı
ile arjinazın moleküler özelliklerinin incelendiği çok sayıda araştırma bulunmaktadır
(1,6,8,10). Bu araştırmalarda ağırlıklı olarak fare, sıçan, kobay, sığır ve insana ait başta
karaciğer ve böbrek olmak üzere çeşitli dokularda arjinaz aktivitesinin varlığı gösterilmiştir.
Enzimin biyokimyasal ve kinetik özelliklerinin belirlenmesi in vitro‟da saflaştırılması sonrası
yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. Bu çalışmalarda ağırlıklı olarak sıçan ve insan dokuları
(karaciğer ve böbrek) kullanılmıştır (1,8).
1
Testiste arjinazın varlığı ve özellikleri ile ilişkili araştırmaların sayısı oldukça azdır (10). Bu
çalışmada, koç testisinde arjinaz aktivitesinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Enzimin yabancı
proteinlerden ayrıştırılması sonrası kinetik davranışı incelenecek ve akrilamid kaynaklı olası
kovalan modifikasyon çalışmaları gerçekleştirilecektir.
Protein
NO
Üre
Endojen Sentez
Arjinaz
Arjinin
Ornitin
Diyet
Prolin
Poliaminler
Glutamat
Agmatin
Kreatin
Şekil1. Memelilerde arjinin metabolizması ve metabolizmada arjinazın işlevi
GEREÇ VE YÖNTEM
Araştırmada bir yaşında kıvırcık cinsi koç testisleri kullanılmıştır. Soğuk zincire uyularak
koçların kesiminden bir gün sonra ticari olarak sağlanan testisler laboratuarda zarları, yağ ve
damarları temizlendikten sonra bütün olarak -24oC‟da saklanmıştır.
Çalışmada kullanılan kimyasal ve biyokimyasallar Sigma firmasından sağlanmış olup, veriler
çift çalışmanın aritmetik ortalamasıdır.
Arjinaz aktivite analizi
Testis dokusu soğukta makas kullanılarak parçalandıktan sonra % 0,25 TritonX-100 içeren
0,1 M Tris.HCl pH 7,57‟de cam-teflon homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiştir
(300mg/ml olacak şekilde). Homojenat 26500xg‟de 30 dakika santrifüj edildikten sonra elde
edilen süpernatan enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Testis arjinaz aktivite analizi 37 o C‟da
65mM Tris.HCl/ 0,1mM Mn 2+ pH 8,6 „da 25mM arjinin varlığında gerçekleştirilmiştir.
Tepkime sonrası oluşan üre Geyer ve Dabich yöntemi kullanılarak saptanmıştır (7). Aktivite
U/ml, U/g doku, özgül aktivite veya ilk hız çalışmalarında ∆A 520/10 dakika olarak ifade
edilmiştir. Bir ünite enzim deney şartlarında dakikada bir mikromol üre oluşumuna neden
olan enzim miktarı olarak ifade edilmiştir. Örneklerde protein analizi Bradford yöntemi
kullanılarak gerçekleştirilmiştir (2).
Yabancı proteinlerin uzaklaştırılması ve kinetik davranışın belirlenmesi
İstenmeyen proteinlerin uzaklaştırılması ve arjinazın kinetik davranışının incelenebilmesi
amacı ile 4o C‟da (NH4 )2 SO4 çöktürmesi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada 26500xg‟de 30
2
dakika santrifüj edildikten sonra elde edilen süpernatan, son derişimleri 1 mM olacak şekilde
merkaptoetanol (ME) ve Mn 2+ ilavesi sonrası kullanılmıştır. Kesintili olarak gerçekleştirilen
çöktürme sonrası aktivite ve total protein analizleri gerçekleştirilmiştir.
Testis arjinazının kinetik davranışının incelenmesi, tuz çöktürmesinin % 50-75 aralığından
elde edilen enzim kaynağı (1,0-1,1 U/ml) ile gerçekleştirilmiş ve substrat olarak 2,5-25 mM
arjinin çözeltileri pH 8,6 kullanılmıştır. Aktivite ∆A 520/10 dakika olarak ifade edilmiştir.
Olası ileri saflaştırma ve/veya enzimin yükünün belirlenmesi amacı ile katyon değiştirici ön
kolon (Oasis) uygulaması gerçekleştirilmiştir. Uygulama, % 50-75 aralığından elde edilen
enzim kaynağı kullanılarak kesintili olarak gerçekleştirilmiştir. Örneğin kolona uygulanması
sonrası kesintili olarak sırası ile 0,1 M Tris.HCl pH 7,57 ; 0,15 M ve 0,5 M KCl çözeltileri
kullanılarak proteinlerin kolondan alınması yoluna gidilmiştir. Kolon çıktı örneklerinde
aktivite (∆A 520/10 dakika) ve protein (A280 ) ölçümleri gerçekleştirilmiştir.
Akrilamid uygulaması
Kovalan modifikasyon çalışmaları 37o C‟da 0,1 M Tris. HCl pH 7,57‟de gerçekleştirilmiştir.
Tepkime, akrilamid ilavesi ile başlatılmıştır. Modifikasyon ortamından farklı zaman
dilimlerinde alınan örnekler, enzim aktivite analizinin gerçekleştirileceği tüplere aktarılmıştır.
Akrilamid tepkimelerinin sonlandırılması, aktivite analiz ortamında bulunan 15 mM ME ile
sağlanmıştır. Kalan aktivitenin belirlenmesi ve çalışma süresi boyunca enzimin kararlılığı
kontrol deneyleri ile saptanmıştır.
BULGULAR
Testis arjinaz aktivitesi
Testis dokusunda arjinaz aktivitesinin varlığı kademeli (differential) santrifügasyon tekniği
kullanılarak araştırılmıştır. Bu amaçla doku, % 0,25 TritonX-100 içeren 0,1 M Tris.HCl pH
7,57 içerisinde cam-teflon homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiş ve kesintili olmak
üzere farklı hızlarda santrifügasyon işlemi uygulanmıştır. İşlemin her bir basamağından
örnekler alınarak enzim aktivite ve protein analizleri gerçekleştirilmiştir. Analizlerin
sonuçları Tablo 1‟de verilmektedir. Enzim aktivitesi ağırlıklı olarak 26500xg‟de elde edilen
süpernatanda bulunmaktadır.
Tablo1. Kademeli santrifügasyon örneklerinde total arjinaz aktivitesi ve total protein derişimi
Örnek
2000xg çökelti
(tam hücre,çekirdek,vs)
26500xg çökelti
(mitokondria,lizozom, vs)
26500xg süpernatan
(mikrozomlar,vs)
Total Protein (mg)
Total Aktivite (U)
0,84
0,7
0,70
0,6
6,5
1,5
Enzimin biyolojik zarlarla olası ilişkisinin ve olası Mn 2+ gereksiniminin araştırılması amacı
ile dokular deterjan varlığında ve yokluğunda 0,1 M Tris.HCl pH 7,57 içerisinde cam-teflon
homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiş ve 26500xg elde edilen lizatta, enzim
aktivitesi Mn 2+ ile zenginleştirilme işleminin oda sıcaklığında (25 oC) ve 55oC „da
gerçekleştirilmesi sonrası analiz edilmiştir. Ayrıca deterjan varlığında ve yokluğunda protein
derişimleri saptanmıştır (Tablo 2). Deterjan uygulaması ve 55oC‟da gerçekleştirilen enzimin
Mn 2+ ile zenginleştirilmesi aktivitenin artmasına neden olmuştur. Protein derişimi de deterjan
uygulanan doku örneklerine ait lizatlarda yaklaşık % 39 artmaktadır.
3
Tablo 2. Enzim aktivitesi ve protein derişimini etkileyen faktörler
Deterjan uygulaması
Aktivite (U/ml)
25 oC
55oC
0,23
0,31
0,12
0,22
var
yok
Protein (mg/ml)
1,29
0,93
Enzim aktivitesinin saklama koşullarına bağlı zaman içindeki kararlılığı incelenmiştir. Bu
amaçla aktivite analizi, -240 C‟da bütün olarak saklanan dokuda (Tablo 3) ve -240 C ile 40
C‟da saklanan 26500xg‟de elde edilen lizatta (Şekil 2) gerçekleştirilmiştir.
Tablo 3. Testis arjinazının -240 C‟da kararlılığı
Gün
(U/ml)
1
2
21
Aktivite
(U/g doku)
0,30
0,28
0,25
Protein
(mg/ml)
Özgül Aktivite
(U/mg)
1,31
1,30
1,30
0,23
0,21
0,20
1,0
0,92
0,83
Aktivite
(U/ml)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
Gün
4
6
8
Şekil 2. 26500x g elde edilen lizatın -240 C ve 40 C‟da kararlılığı
Dokunun bütün olarak -240 C‟da saklanması aktivitede (sırası ile U/ml ve U/g doku olarak) 2.
gün % 6,77 ve % 8; 21. gün ise % 16,77 ve % 17 azalmaya neden olmuştur. Özgül aktivite
ise 2. gün % 8,7; 21. gün % 13 düşmektedir. (Tablo 3).
Şekil 2‟de görüldüğü gibi 26500xg‟de elde edilen lizatta enzim aktivitesi (-240 C ve 40 C‟da
saklanma sonrası) 7. günün sonunda % 8,33 düşmektedir.
Kinetik davranışın belirlenmesi
Testis arjinazının kinetik özelliklerinin belirlenmesi amacı ile 26500xg‟ de elde edilen lizatta
yabancı/istenmeyen proteinlerin uzaklaştırılması yoluna gidilmiştir.
Bir ön çalışma
niteliğinde gerçekleşen bu işlem, 4o C‟da (NH4 )2 SO4 çöktürmesi ile gerçekleştirilmiştir.
4
Tuz çöktürmesi % 30-45, % 50-75 ve % 80-100 kesitlerinde olmak üzere uygulanmıştır. Her
bir doygunluk sonrası çökelti, 26500xg‟de 30 dakika santrifüj sonrası elde edilmiştir. Çökelti
0,1 M Tris.HCl pH 7,57 içerisinde çözünmüş ve aktivite analizi ile protein derişimleri
saptanmıştır. Özgül aktivitenin en yüksek olduğu %50-75 çökelti özütü kinetik çalışmalarda
kullanılmıştır. Söz konusu özüt, yabancı proteinlerden yaklaşık 2 faktör saflaştırılmış ve geri
kazanım ise % 33 olarak saptanmıştır (Tablo 4).
Tablo 4. Testis arjinazının kısmıi saflaştırılması
Örnek
26500xg özütü
% 50-75 (NH4 )2 SO4
özütü
Total
Protein
(mg)
48,10
8,72
Aktivite
Özgül
Total
(U/mg)
(U)
0,21
10,18
0,39
3,4
Saflaştırma
Faktörü
Geri
Kazanım
-
„100‟
1,86
% 33
Koç testis arjinazının Michaelis-Menten kinetiğine uygunluğu ve substratı olan arjinine
ilgisinin (Km ) saptanması amacı ile pH 8,6 „da elde edilen Lineweaver-Burk grafiği Şekil
3‟de verilmektedir. Enzim, Michaelis-Menten kinetiğine uymakta olup, arjinin için Km değeri
6,67 mM olarak saptanmıştır.
v-1
8
6
4
2
0
0
0,1
0,2
S
-1
0,3
-1
, mM
0,4
0,5
Şekil 3. Arjinin için pH 8,6‟da Lineweaver-Burk grafiği. Aktivite ∆A 520/10 dakika olarak ifade edilmiştir.
Testis arjinazının pH 7,57‟de olası yükü ile ilişkili ön kolon verileri Şekil 4‟de görülmektedir.
Kromatogram, enzimin söz konusu pH‟da eksi yüklü olduğunu düşündürmektedir.
5
0,4
3
0,3
2
0,15 M
KCl
0,1
0
0
1
2
3
4
5
A520
0,2
0,5 M
KCl
1
6
Tüp numarası
Şekil 4. Testis arjinazının katyon değiştirici kolon kromatografisi. (
∆A 520/10 dakika olarak ifade edilmiştir.
): A280 , (------): A520 . Aktivite
Akrilamid tepkimeleri
Testis arjinaz aktivitesinin (%50-75 çökelti özütünün pH 7,57‟de) 30 mM akrilamid
varlığında zamana bağlı değişimi Şekil 5‟de verilmektedir. Enzim aktivitesi çalışılan zaman
diliminde değişmemektedir.
0,4
0,3
Aktivite
A280
4
0,2
0,1
0
0
20
40
60
80
100
120
Dakika
Şekil 5. Testis arjinaz aktivitesinin 30 mM akrilamid varlığında inaktivasyonu. Kontrol (
Aktivite ∆A 520/10 dakika olarak ifade edilmiştir.
), Akrilamid (
).
TARTIŞMA
Arjinaz, üreotelik organizmaların dokularında yaygın olarak bulunmaktadır. Organizmadan
organizmaya ve aynı organizmaya ait farklı dokularda enzim aktivitesi değişiklik
göstermektedir. Testis dokusunda enzimin aktivitesi ve özelliklerinin tanımlandığı
çalışmaların çok kısıtlı olduğu belirlenmiştir. Boğa testis dokusunda enzimin varlığı ve
aktivitesinin 0,43 U/g doku olduğu Porembska ve arkadaşlarının gerçekleştirdiği bir
çalışmada bildirilmektedir (10). Araştırmamızda, koç testis dokusunda arjinaz aktivitesinin
varlığı kanıtlanmıştır. Deney şartlarımızda aktivite gram dokuda 1,0 ünitedir.
6
Memelilerde enzimin hücre içindeki yerleşimi çeşitli araştırmacılar tarafından incelenmiştir
(1,8,10). Genel olarak alt birim çeşitliliği ve doku farklılığı dikkate alınarak derişimleri farklı
olmak üzere enzimin mikrozomal, mitokondrial, lizozomal, sitozolik ve plazma zarına bağlı
olabileceği bildirilmektedir. Araştırmamızda enzim aktivitesi bir nötral deterjan olan TritonX100 varlığında ve yokluğunda kademeli santrifügasyon sonrası elde edilen lizat örneklerinde
araştırılmıştır. Enzim aktivitesinin deterjan uygulaması sonrası artması, enzimin biyolojik
zarla ilişkili ve/veya organel yapılanmasında da yer aldığını göstermektedir.
Enzimin katalizden doğrudan sorumlu mutlak Mn2+ gereksinimi bulunmaktadır. Mn2+ „ın
yapıdan uzaklaştırılması aktivite kaybı ile sonuçlanmaktadır. Çalışmamızda, zenginleştirme
işleminin gerçekleştiği sıcaklık ile aktivite arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu amaç ile deterjan
varlığında ve yokluğunda elde edilen 26500xg‟de lizat örneklerinde, Mn2+ ile zenginleştirme
işlemi oda sıcaklığında ve 55°C‟de gerçekleştirilmiştir. Uygulama her iki koşulda da 1 mM
Mn2+ varlığında gerçekleştirilmiştir. Zenginleştirme işlemi deterjan varlığında ve yokluğunda
enzim aktivitesinde artışa neden olmuştur. Aktivitedeki artış, enzimde konformasyonel
değişikliğin olmasına ve bu değişiklik sonucu, enzimin Mn2+ bağlanma bölgelerine daha fazla
Mn2+ ulaşmasının sağlanmasıyla ilişkilendirilmiştir. Artış oranı, zenginleştirme işleminin
uygulandığı sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir.
Enzim aktivitesinin saklama koşullarına bağlı olarak zaman içindeki kararlılığı incelemiştir.
Parçalanmadan bütün olarak -24o C‟de saklanan doku örneklerinde ve -24o C ile 4 o C‟da
saklanan (26500xg‟de detarjan varlığında elde edilen) lizat örneklerinde yapılan çalışmalar ile
enzim aktivitesinin kararlılık gösterdiği saptanmıştır.
Enzimin kinetik davranışının belirlenmesi için yabancı proteinlerin uzaklaştırılması
/saflaştırma işlemi olanaklarımız doğrultusunda bir ön çalışma olarak gerçekleştirilmiştir.
Kısmi saflaştırma sonrası enzim yaklaşık iki faktör saflaştırılmış ve geri kazanım ise %33
olarak hesaplanmıştır. Bu sonuç saflaştırma işleminde tuz çöktürmesi önce farklı bir yöntemin
uygulanması gerekliliğini ve sistemde olası inhibitör varlığını düşündürmektedir.
Testis arjinaz aktivitesinin kinetik davranışı, pH 8,6‟da gerçekleştirilen çalışmalar sonrası elde
edilen Lineweaver- Burk grafiği ile saptanmıştır. Doğrusal olarak elde edilen LineweaverBurk grafiği, enzimin Michaelis-Menten kinetiğine uyduğunu doğrulamaktadır. Enzimin
substratı olan arjinine ilgisini gösteren Km değeri ise 6,67 mM olarak belirlenmiştir. Memeli
arjinazlarının Km değerleri, çalışılan doku ve kullanılan yönteme bağlı olarak farklılıklar
göstermektedir. Bildirilen Km değerleri karaciğerde 1-10 mM ve diğer dokularda ise 4-35
mM‟dır (8,14).
Memeli arjinazları, yük açısından da farklılıklar göstermektedir. Genel olarak bazik özellik
taşımalarına karşın, farklı dokularda farklı yüklere sahip formların varlığı bildirilmektedir
(1,8,10). Çalışmamızda, koç testis arjinazının pH 7,57‟de olası yükünün belirlenmesi
amacıyla katyon değiştirici ön kolon uygulaması gerçekleştirilmiştir. Örneğin (0,62 mg
protein) uygulama sonrası kolona tutunmaması ve yüksek derişimde olmak üzere tek tüpte
alınması (0,52 mg protein) koç testis arjinazının ağırlıklı olarak eksi yüklü olduğunu
düşündürmektedir. İzoformların ve/veya izoenzimlerin ayrıştırılabilmesi için olasılıkla
anyonik-katyonik iyon değiştirici kromotografisileri çalışmalar yapılması gerekmektedir.
Kovalan modifikasyonlar, enzimlerin yapısal ve katalitik özelliklerinin belirlenmesinde
kullanılan temel yöntemdir. Modifikasyonlar, gruba özgü ajanların uygun şartlarda
7
kullanılması ile gerçekleştirilir. Çalışmalarda, ajanın birden fazla gruba duyarlı olması ve
enzimin çalışılan pH‟da uygun iyonize formda olması gibi nedenlerden dolayı aynı hedefe
duyarlı farklı ajanlarla modifikasyonun doğrulanması gerekmektedir.
Bu çalışmada, testis arjinazının aktif bölgesinde katalizde olası işlevi olan sülfidril grubunun
varlığı araştırılmıştır. Sülfidril grubuna duyarlı alkilasyon ajanı olarak akrilamid uygulaması
gerçekleştirilmiştir. Akrilamid, endüstride yaygın olarak kullanılan toksik bir kimyasaldır.
Sigara dumanında ve yüksek sıcaklıkta pişirme yöntemi uygulanan gıda maddelerinde
bulunduğu bildirilmektedir. In vivo‟da CYP2E1 ile aktivasyonu sonrası oluşan epoksiti,
glisidamid, potansiyel bir mutajendir. Araştırmalar, in vivo‟da akrilamidin nörotoksik,
genotoksik, karsinojenik doz-bağımlı etkileri olduğunu ve üreme sistemlerinde hasara yol
açtığını bildirmektedir (12,15).
Sıçan ve fare testislerinde yapılan araştırmalarda doz-bağımlı olarak akrilamid, testosteron
düzeyi ve sperm stoklarının azalmasına; tübüler fonksiyonu düzenleyen ve testosteron
salgılayan leydig hücrelerinin, germ hücrelerinin kaybıyla ilişkilendirilen bir şekilde
hiperplaziye uğradığı bildirilmektedir. Bunun yanı sıra seminifer tübülde histopatolojik
lezyonlar oluşmasına ve tümör görülme sıklığının artmasına neden olmuştur (15).
Akrilamidin söz konusu etkilerinin testiste arjinazın fizyopatolojik bir süreçte ortaya çıkan ve
NO sentezini kısıtlayan aktivitesiyle ilgili olabileceğini düşündürmektedir.
Araştırmamızda akrilamid ile gerçekleştirilen inaktivasyon çalışmaları, enzimin katalitik
bölgesinda kritik sülfidril gruplarının olmadığını göstermektedir. Benzer sonuçlara, insan ve
sığır karaciğer arjinazında da ulaşılmış olup, sülfidril gruplarının proteinin dördüncül
yapısının oluşmasında önemli olduğu bildirilmiştir (14). In vitro‟ da deneysel şartlarımızda
akrilamid, testis arjinaz aktivitesi üzerine etki göstermemektedir. Akrilamidin enzim aktivitesi
üzerine doğrudan ve/veya dolaylı etkisinin in vivo şartlarda araştırılması gerekmektedir.
SONUÇ
Çalışmamızda koç testisinde arjinazın varlığı, hücre içinde sitozolik ve biyolojik zarla ilişkili
olarak bulunduğu, Michaelis-Menten kinetiğine uyduğu, pH 8,6‟da arjinin için Km‟inin 6,67
mM olduğu, fizyolojik pH‟da olasılıkla eksi yüklü olarak bulunduğu ve katalitik bölgesinde
kritik sülfidril grubunun olmadığı saptanmıştır.
Herhangi bir molekülün canlı organizmada iyilik veya hastalık halinde etkisinin
anlaşılabilmesi için bu molekülle ilgili olarak yapılan in vitro biyokimyasal çalışmalar son
derece önemli ve gereklidir. Özellikle söz konusu molekül bir enzimse; bu enzimin yapısının,
organizmadaki yerleşiminin ve biyokimyasal davranışlarının belirlenmesi, enzimin dahil
olabileceği süreçlerin anlaşılmasına ışık tutmaktadır. Koç testis arjinazının birçok özelliğini
belirlediğimiz bu çalışmanın, testis sağlığı ve hastalıklarında arjinazın rolü/önemi ile ilişkili
araştırmalarda katkısı olabileceğini düşünmekteyiz.
8
KAYNAKÇA
1. Ash D.E “Structure and Function of Arginases” 2004;134:2760S-2764S.
2.Bradford, M.M. A rapid and sensitivite method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Chem., 1996;72(12),248-254
3.Bivalacqua T.J. et al. “Overexpression of arginase in the aged mouse penis impairs erectile
function and decreases eNOS activity: influence of in vivo gene therapy of anti-arginase” ,
Am J Physiol Heart Circ Physiol 292,2007.
4.Cederbaum S.D. “Arginases I and II: do their functions overlap?” , Mol. Genet. Metab.,
USA;2004;81:38-44.
5.Chrzanowska A., Krawczyk M., Barańczyk-Kuźma A. “Changes in arginase isoenzymes
pattern in human hepatocellular carcinoma”, Biochem. and Biophys. Res. Comm.,
2006;377:337-340.
6.Dowling D.P. et al. “Evolution of the arginasse fold and functional diversity” , Cell. Mol.
Life Sci. 2008;65:2039-2055.
7.Geyer,J.W. ve Dabich,D. “Rapid Method for Determination of Arginase Activity in Tissue
Homogenates” , Anal.Biochem.,1971;39:412-417.
8.Jenkinson P. et al. “Comparativde Properties of Arginases”, Comp. Biochem. Physiol. Vol.
114B;1996;1: 107-132.
9.Morris S.M. “Recent advances in arginine metabolism: roles and regulation of the
arginases” , Br. J. Pharm.,2009;157:922-930.
10.Nadolska-Lutyk J. , Grabon W. and Porembska Z. “Arginase in Bull Testis” 1990;27(3).
11.Nikolic J. et al. “The role of L-arginine in toxic liver failure: interrelation of arginase,
polyamine catabolic enzymes and nitric oxide synthase” Amino Acids (2007) 32:127-131.
12.Özturan Özer H.E. “Akrilamid Kaynaklı Olası Oksidatif Stresin Sıçan Doku Arjinaz ve
Nitrik oksit Sentaz Aktivitelerine Etkisi” , Biyokimya Programı Yüksek Lisans
Tezi,Ankara;2007.
13.Que L.G. “Effects of Arginase Isoforms on NO Production by nNOS” ,Nitric oxide Vol.
6,2002;1-8.
14.Türkoğlu, E.S. “Inactivation of Bovine Liver Arginase by 1-Ethyl-3-(3dimethylaminoproply) Carbodiimide” , Doctor of Philosophy Degree in Biochemistry Middle
East Technical University,1989 March.
15.Wang H. “Reproductive toxicity of acrylamide-treated male rats” , Reproductive
Toxicology 29,USA,2010;225-230.
9
16.Wei C.L. et al. “Induction of Arginase II in Livers of Bile Duct-Ligated Rats” , Biochem.
Pharm., 2002;1738:1-8.
10