immunolojik teknikler-gıda mikrobiyolojisinde uygulamaları

Gıdalarda Mikrobiyolojik Kalite Kontrolü
İMMUNOLOJİK TEKNİKLER-GIDA MİKROBİYOLOJİSİNDE
UYGULAMALARI*
Yard. Doç. Dr. Şeref Tağı
26.04.2017
*Ş. Tağı’nın izni olmadan bu ders notunun kendi çalışma kopyeniz haricinde kısmen veya
tümü hiçbir yolla çoğaltılamaz yayınlanamaz.
Kaynak: http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/45134/title/Antibody-Alternatives/
Amaç: Bu derste immunoloji ve bunun temel özellikleri hakkında genel ve özet bilgiler
verilmesi, gıda analizlerinde ve gıda mikrobiyolojisinde antijenik yapıdaki maddelerin ve
mikroorganizma ve toksinIerin saptanmasında kullanılması uygun olan immunolojik testlerin
açıklanması ve test kitleriyle laboratuvarda uygulama yapılması amaçlanmıştır.
Giriş
Antijen ile antikor arasındaki özgül reaksiyona dayanan immunolojik yöntemler, biyolojinin
birçok dalında uygulama alanı bulmuştur. İmmunolojik yöntemler özellikle tıpta ve
veterinerlikte klinik uygulamalarda hastalıkların tanısı amacıyla geniş uygulama alanı
bulmasına karşın zirai bilim dallarında, özellikle gıdaların analizlerinde kullanımı göreceli
olarak yenidir.
Bağışıklık bilimi olarak bilinen "immunoloji", bağışıklık (immunite) olaylarını inceleyen bir
bilim dalıdır. Günümüzde immunoloji enfeksiyon etkenlerine veya toksik maddelere karşı
organizmanın kendini dayanıklı kılma mekanizmaları ve konakçıda doku zararlarına yol açan
aşırı duyarlılık olaylarını da kapsamaktadır.
Bağışıklık veya immun yanıt ise, hayvanlar aleminde konakçı organizmanın kendi kalıtsal
yapısına yabancı maddeleri tanıması, karşı koyması ve onları nötralize veya metabolize ederek
yanıt verme özelliğini ifade eder. Bağışık yanıt verme mekanizmasının en önemli özelliği,
kendine yabancı maddeleri tanıyıp ayırt edebilmesi ve bu maddeleri tekrar tanıyabilmesi
yeteneğidir.
1
İnsan ve hayvanlarda bağışıklık sistemi, kendine yabancı maddeye karşı spesifik (özgül), yani
sadece o maddeyle reaksiyona giren ve onun1a birleşebilen bir yanıt maddesi meydana
getirmektedir. Bu yanıt sayesinde söz konusu yabancı madde etkisiz bırakılmakta ve
konakçıdan atılabilmektedir. Bağışık yanıtın ikinci bir özelliği ise bu sistemde bir belleğin
oluşmasıdır. Diğer bir deyişle bu sistem ilk defa tanıyıp yanıt verdiği yabancı maddeyle ikinci
kez karşılaştığında tekrar tanımakta ve daha kuvvetli bir yanıt verebilmekte ve yabancı
maddeyi elemine etmektedir.
İmmün yanıt sonucunda çok özet olarak sonuçları açısından iki temel olay meydana gelir.
İlkinde konakçıda yabancı madde yani antijenle uyarılan B lenfositlerinin başkalaşması sonucu
meydana gelen plazma hücreleri tarafından antikorlar oluşturulurlar. Bu şekilde oluşan yanıta
"humoral" yani sıvısal bağışık yanıt adı verilmektedir. İkincisi ise, T lenfositlerinin
başkalaşması ile oluşan ve üzerlerinde spesifik hücre reseptörleri bulunan lenfoblast1arın
oluştuğu yanıttır. Bu tip yanıta hücresel bağışık yanıt adı verilmektedir (şekil 1).
Antijen:
Antijen terimi genellikle bağışık yanıt verebilecek düzeyde gelişmiş canlılara verildiğinde
bağışık yanıt oluşumuna yol açan ve bu yanıt sonucu ortaya çıkan antikor ve duyarlı hücre
reseptörleriyle in vitro (hücre dışı) veya in vivo (hücre içi) koşullarda özgül olarak birleşebilme
yeteneğindeki maddeler için kullanılmaktadır. İmmun yanıta yol açan ve antikor üretimine yol
açan molekül ile antikorun bağlandığı hedef molekülü birbirinden ayırt etmek için immunojen
ve antijen terimleri ayrı ayrı kullanılmaktadır. Bir molekülün immunojen olması için bu
molekülün kendine özgü kompleks bir yapıya yani immunojeniteye sahip olması gerekir.
Ayrıca o maddenin molekül ağırlığı, yapısı, kompleks yapıda olup olmaması ve metabolize
olabilirliği, antijenin immun yanıta neden olduğu organizmanın türü, antijenin miktan, veriliş
yolu ve süresi, molekülün organizmaya yabancılık derecesi
immunojenitesine etkilidir.
2
Şekil 1. Üzerinde farklı determinantlara sahip bir antijenin oluşturduğu hücresel ve sıvısal yanıt (çok
genel) ( Ş. Tağı).
Şekil 2. Belirli bir antijene karşı antikor eldesi (http://www.the-
scientist.com/?articles.view/articleNo/45134/title/Antibody-Alternatives/)
Doğal immunojenler genellikle 1000 ve normalde 5000'nin üzerinde moleküler
ağırlığa sahip makromoleküllerdir. Yalnızca iki grup madde doğal olarak "immunojenik" dir.
Bunlar proteinler ve polisakkaritlerdir. Proteinlerin çoğu iyi antijen iken, polisakkaritler zayıf
antijenlerdir. Diğer yandan oligosakkaritler, lipidler ve nükleik asitler immun yanıt
oluşturmazlar. Fakat taşıyıcı bir proteine örneğin sığır serum albumini (BSA) bağlandıklarında
bağışık yanıt oluştururlar ve kendilerine karşı oluşturulan antikorlarla özgül olarak reaksiyona
girebilirler. Bu tip vücutta antikor sentezini uyarmayan ancak kendisine karşı meydana gelmiş
antikorlarla in vitro koşullarda spesifik olarak birleşme yeteneğinde olan maddelere "hapten"
adı verilmektedir. Basit ilaçlardan digitoksin ve mikotoksinlerden aflatoksin haptenlere örnek
olarak verilebilir.
Yukarıda bahsedilen özellikleri gösteren antijen, bir toksin molekülü veya çözünebilir
bir protein olabileceği gibi, virüs, bakteri veya küf hücresi gibi bu antijenik maddeleri
bünyesinde toplayan kompleks partikül yapıda bir organizma olabilmektedir. Bir
immunojende organizmaya verildiğin immun yanıt oluşturan ve oluşan antikorlarla spesifik
olarak birleşebilen ve antikor-antijen reaksiyonlannın özgüllüğünü belirleyen, immunolojik
aktif özel bölgeler veya gruplar vardır. Bu gruplar "antijenik determinantlar" veya "epitop"
olarak adlandırılır.
Antikor:
Antikorlar konakçıda (host) bağışık yanıt sonucunda antijenlere karşı oluşturulan ve bu
antijenlerle özgül olarak birleşebilen protein yapısındaki maddelerdir. Antikorlar globüler
yapıda olduğu için "immunoglobulinler " olarak da adlandırılırlar ve genellikle "lg" harfleriyle
gösterilirler.
Antikorlar kanın serum proteinlerinin gamma (y) globulin fraksiyonunda yer almaktadır. Eğer
immun yanıt oluşmuş serum örneği elektroforeze tabii tutulursa immunoglobulin
fraksiyonunda dolayısıyla da y-globulin fraksiyonunda bir artış olduğu gözlenecektir (şekil ).
İmmunoglobulinler molekül ağırlıklarına ve işlevlerine göre 5 sınıfa ayrılırlar. Bunlar;
Immunoglobulin G (IgG), IgM, IgA, IgD, ve IgE'dir. Bunlar arasında bağışıklık yanıt
sonucunda en fazla oluşturulan immunoglobulin “IgG”dir.
3
Structural representations of an IgG.
The heavy chain is shown in blue, light chain in green and glycosylation in orange. On the left is a
ribbon representation showing the secondary structure elements and on the right hand side is a
space-filled model of the same molecule. PDB accession number of the mouse IgG1 is 1IGY.
Şekil 3. İmmunogobulin G (IgG) nin 3 boyutlu yapısı ve şematik gösterimi (Ş. Tağı ve
http://absoluteantibody.com/antibody-resources/antibody-overview/antibody-structure/)
Antijenle antikorun birleşmesi, antijendeki spesifik determinantları (epitop) ile antikorun
birleşme yanları (paratop) arasında gerçekleşir. Bu birleşmede kovalent bağlar rol almaz.
Bunun yerine kovalent olmayan aşağıda gösterilen bağlar rol alır.
Şekil 4. Antijen antikor etkileşiminde rol alan bağlar (Ş. Tağı 2003)
Antijenlerin çoğu genellikle çok valanslı yani çok determinanta sahiptir (multivalan
4
özellik). Bir antijen organizmaya verildiğinde her bir determinantıma uygun antikorların
oluşumuna neden olur. Bu şekilde oluşan antikor "poliklonal" dır. Yani immunoglobulinler bu
determinantların herbirisine karşı farklı miktarlarda oluşur. Diğer yandan "hibridoma" tekniği
ile elde edilen " monoklonal" antikorlar bu antijenik determinantlardan yalnızca birisine karşı
oluşmuş antikorları içermektedir. Birden fazla determinanta sahip antijenlere karşı hazırlanan
poliklonal antikorlar farklı antijenler üzerinde benzer antijenik determinantlar olabileceği için
çapraz reaksiyon verebilmektedirler.
Antijenle antikor arasındaki spesifik
ve duyarlı reaksiyonlar antijen ve antikorun
saptanması ve miktarının belirlenmesi için
çok sayıda uygulama için temel
oluşturmuştur. Serum kullanılarak yapılan
ve bu nedenle "serolojik test" olarak da
adlandırılan bu teknikler antijenlerin ve
antikorların hücre ortamı dışında (in vitro)
belirlenmesinde
kullanılmaktadır.
Bu
teknikler
arasında
aglütinasyon,
immunopresipitasyon
testleri,
immunodiffuzyon, dipstik assay ve bunlara
göre daha duyarlı olan radyoimmunoassay
(RIA), fluoresans immunoassay (FIA),
enzim immunoassay’ler yaygın olarak
kullanılırlar. Aşağıda bu tekniklerden
özellikle gıda ve mikrobiyolojik analizler
için uygun olanlar hakkında genel bilgiler
verilmiştir.
Şekil 5. Antijen antikor etkileşimi (kaynak: http://www.thescientist.com/?articles.view/articleNo/45134/title/Antibody-Alternatives/)
Aglütinasyon testi
Klasik immunolojik yöntemler antijen-antikor kompleksinin çökelmesine yol açan etkileşim
üzerine kuruludur. Bu etkileşime dayalı olarak geliştirilen aglütinasyon testinde partiküler
haldeki bakteri, eritrosit gibi antijenlerin hücre yüzeylerindeki antijenik determinantlarm
antikorlarla birleşerek ağ oluşturması, kümeleşmesi ve çökelti oluşturması esastır. Ayrıca
hücreler arası elektrostatik gücün değişmesi de aglütinasyonda etkilidir. Aglütinasyon testiyle
bilinmeyen bir antijen örneğin, bakteri bilinen bir antiserumla saptanabilir veya serumda
bulunan antikorlar hastalık teşhisi için bilinen bir antijenle saptanabilir. Aglütinasyon aktif
veya pasif olarak uygulanabilir. Aktif aglütinasyonda yukarıda açıklandığı gibi doğrudan
antijen veya antikor aglütinasyonda rol alır (şekil 6 A). Pasif aglütinasyonda ise, antijen veya
antikor polystren, latex gibi taşıyıcı bir madde üzerine immobilize edilmiştir (şekil 6 B). Bu
testlerden örneğin "latex aglütinasyon" testi antikorların latex partikülleri üzerine immobilize
edilerek mikroorganizmaların identifikasyonunda veya mikrobiyel-toksinlerin saptanmasında
yaygın olarak kullanılmaktadır. Aglütinasyon testleri lam üzerinde, tüpte veya mikro
kuyucuklarda yapılabilmektedir. Aglütinasyon testlerinin duyarlılığı bundan sonraki kısımda
anlatılan presipitasyon tekniğine göre daha duyarlı olmakla birlikte yarı kantitatif sonuç
vermektedir.
5
Şekil 6. A. Aglütinasyon test prensibi (Ş. Tağı 2003), B. Lateks aglütinasyon testi
Presipitasyon
Bu testin esası aglütinasyona benzemekle birlikte farklı olarak direk antijen yerine protein,
hormon, toksin gibi çözünür (suda eriyebilen) antijenler veya antijenin çözünür fraksiyonu
kullanılır. Presipitasyon tekniği tüp içinde sıvı ortamda ve katı ortamda uygulanmaktadır.
Sıvı ortamda presipitasyon tekniğinde, dar çaplı küçük tüplerde antiserum antijen üzerine
farklı oranlarda ilave edilir. Antijen antiserumla reaksiyona girerse iki sıvının temas
yüzeyinde presipitasyon halkası oluşur. Farklı oranlarda seyreltilen antikor antijen bulunan
çözeltiye ilave edilince optimum antijen antikor konsantrasyonunun bulunduğu tüplerde
reaksiyon gözlenir (şekil 7).
Katı ortamda presipitasyon testi ise immunodifuzyon testi olarak da bilinir. Testin esası bir jel
ortamında antijen ve antikorun birbirine doğru diffüze olması ve birleşmelerine
dayanmaktadır (şekil 7).
Şekil 7 . Sıvı ortamda tüpte (kaynak: http://intranet.tdmu.edu.ua) ve katı ortamda agar jel
ortamında presipitasyon ( kaynak Ş. Tağı Yüksek lisans tezi 1991,
http://www.mikrobiyoloji.org/pdf/702031101.pdf)
6
Yaygın olarak kullanılan çift-immunodifuzyon veya yaygın adıyla "Ouchterlony "
yönteminde belirli kalınlıkta dökülmüş yumuşak agara birbirlerinden belirli uzaklıkta ve
çaplardaki kuyucuklara antijen ve antiserum konulur ve inkübe edilir. Bu esnada birbirlerine
doğru yayılan antijen ve antikorlar optimum konsantrasyonlarında birleştiği bölgede presipite
olurlar ve presipitasyonun olduğu bölgede gözle görülür bantlar oluştururlar (şekil 7). Bu
yöntemle bilinen antiserumla bilinmeyen antijen veya tam tersi yapılacağı gibi, antiserumun
seri dilüsyonlarının merkezdeki antijen kuyucuğu etrafindaki kuyucuklara konulması ile
antikorun titresi saptanabilmektedir (titre: Antikorun gücünü gösterir. Burada bant oluşumuna
yol açan antikorun en düşük konsantrasyonudur).
İşaretlenmiş antikorlarla yapılan immunoassay'ler
Bu yöntemlerde antikor immunolojik özelliklerini kaybetmeden bir işaretleyici
molekül ile işaretlenir. Burada kullanılan işaretleyici fluoresans bir boyaysa Fluoresan
. immunoassay; bir radyoizotopsa Radyo immunoassay ve bir enzim ise Enzim Immunoassay
(EI) tekniği olarak adlandırılmaktadır. Bu tekniklerden immunofluoresans ve enzim
immunoassay’lerden bahsedilecektir.
F1uoresans immunoassay (FIA)
İmmunofluoresans vaya fluoresans antikor tekniği olarak
da bilinen bu tekniğin esası antikorun bir fluoresans özellikteki bir maddeyle işaretlenerek
antijen-antikor1a birleşme reaksiyonunun UV mikroskobu altında belirlenmesidir. Bu
amaçla en yaygın olarak Fluorescein isotiosyanate (FITC) veya rhodamin B izotiyosiyanat
(RITC) kullanılmaktadır. Bu maddeler isotiyosiyanat ara bileşikleriyle antikorun Fc
bölgesindeki amino gruplarına bağlanarak antikor boya konjugatı oluşturulur.
Şekil 8. Salça örneğinde bulunan küf hiflerinin IFA tekniği ile boyandıktan sonra adi ışık ve
floresan ışıkta görünümleri ( kaynak Ş. Tağı Yüksek lisans tezi 1991,
http://www.mikrobiyoloji.org/pdf/702031101.pdf)
Yöntem direkt ve indirekt olmak üzere iki şekilde uygulanır. Direkt yöntemde antijen,
örneğin bakteri içeren örnek bir lam üzerine tespit edilir. Preparat üzerine fluoresan bir
boyayla işaretli antikorlar eklenir ve inkübe edilir ve inkübasyonu takiben yıkanır. Preparat
7
UV mikroskop altında incelenir. Eğer antijenle antikor reaksiyona girmişse boyayla işaretli
antikorlar antijenle birleşecek ve yıkamayla gitmeyecektir. Eğer işaretleyici boya olarak
FITC kullanılmışsa 430 nm UV altında uyarılan fluoresans boya 530 nm dalga boyunda yeşil
renkte ışık verecek ve bakteriler koyu renkli bir zeminde spesifik olarak görülebilecektir.
İşaretleyici boya olarak Rhodamin kullanılması durumunda ise bu dalga boyları 550 ve 580
olacaktır
Direkt yönteme göre daha hassas olan indirekt fluoresan antikor tekniğinde ise
hazırlanan preparat üzerine ilk başta işaretlenmemiş birincil antikorlar konur ve inkübe edilir
(şekil 8). Yıkamayı takiben birincil antikora karşı hazırlanmış ve işaretlenmiş antikorlar ilave
edilir ve bunu inkübasyon-yıkama işlemleri takip eder. Eğer antijen antikor reaksiyonu varsa
birincil antikorlar antijene bağlanacak ve sonradan ilave edilen ikincil işaretli antikorlar da
işaretsiz antikorlara bağlanacaktır. UV altında yukarıda açıklandığı gibi antijen varlığı
belirlenecektir.
Enzim İmmunoassay (ElA)
Enzim immunoassay'de antikor fluoresan boya yerine bir enzim ile işaretlenir ve enzim aktivitesinin
renk reaksiyonuna göre ölçülmesi sonucu antijen antikor reaksiyonu saptanır. EIA lerden en yaygın
kullanılan şekli ([Enzyme Linked Immunosorbent Assay'ı) (ELISA)'dır. ELISA tekniği ile antijen
aranmasında kullanılan direkt yöntem "sandwich" ya da "çift antikor" yöntemi olarak da
bilinmektedir (şekil 9). Bu yöntemde aranılan antijene karşı antikor katı bir taşıyıcı yüzeye
absorbsiyonla veya kovalent olarak bağlanır. Daha sonra, antijen saptanacak örnek ilave edilir ve
inkübe edilir. İnkübasyon sonunda yıkamayı takiben enzimle işaretli antikorlar (IgG) ilave edilir ve
tekrar inkübasyon ve yıkama işlemleri yapılır. Daha sonra enzimin substratı ilave edilir ve oluşan
renk yoğunluğu spektrofotometrik olarak ölçülür. ELISA için en yaygın kullanılan katı taşıyıcı
destek ortamı veya matriks olarak polystryene ve polyvinyl chloride'den yapılan plastik tüpler ya
da daha yaygın olarak kullanılan 96 kuyucuklu mikrotiter plate'lerdir.
Antikorun katı yüzeye
absorpsiyonla veya
kovalent
imobilizasyonu
Antijen içeren
örneğin ilavesi ve
inkübasyonu
Enzimle işaretli
ikincil antikorun
ilave edilmesi ve
inkübasyonu
Enzim sustratının
ilavesi, inkübasyon ve
renk yoğunluğunun
ölçülmesi
Şekil 9. Antijen saptanmasında sandwich ELISA yönteminin uygulanışı (Ş. Tağı 2003)
Aynca katı faz olarak polycarbonate kürecikler, manyetik kürecikler de kullanılmaktadır ELISA
8
testinde her inkübasyon aşamasını takiben antikorlar tarafından spesifik olarak bağlanmayan
analitler yıkama işlemi ile ayrılmaktadır. Matriks olarak küreciklerin kullanıldığı durumda ise
bağlanmayan analitler santrifugasyon veya manyetik alan kullanılarak yapılmaktadır. Işaretlemede
en fazla kullanılan enzimler ise alkalen fosfataz (substarı: p-nitrofenilphosphate), Peroxidase
(substrat.ethylbenzidine/HrOı, phenylenediaminel Rı02), f3-galactosidase (substrat: nitrophenYlf3-D-galactopyranoside)dır. Ayrıca işaretlemede kullanılan enzimlerin floresans veya
kemiluminesans özellikdeki substratları da kullanılabilmekte ve oluşan reaksiyon ürünleri
florometrik veya kemuluminometrik olarak ölçülebilmektedir.
Şekil 10. Çok kuyucuklu ELISA plakası ve okuyucu cihazı
ELISA formatının bir benzeri olan "dipstick assays" ya da test şeriti de kullanılan bir formattır.
Burada antikorlar genellikle nitrosellulose ve p-divinyldifluorene gibi materyallerden yapılan.
membran biçimindeki yüzeylere adsorpsiyonla bağlanarak kullanılmaktadır.
İMMUNOAFİNİTE KOLON + HPLC YÖNTEMİYLE MiKOTOKSİN TEŞHİS VE
MİKTAR TAYİNİ
İmmunoafinite kolon, saptanacak mikotoksine karşı spesifik (özgül) olan antikorları
içerir (şekil 11). Bu antikorlar kolon dolgu veya destek materyaline bağlanmıştır. Test
örneğinden elde edilen ekstrakt kolondan geçirildiğinde aranılan mikotoksin kolondaki
antikorlara özgül olarak bağlanır ve böylece mikotoksin ekstraktdan ayrılmış olur. Örnek
ekstraktı kolondan geçirildikten sonra antikorlara bağlanmayan ve kolon içinde bulunan
diğer molekülleri uzaklaştırmak için uygun bir çözelti geçirilerek kolon yıkanır. Son
aşamada ise antikor ile mikotoksin arasındaki bağ, uygun bir solvent (genelikle orta
polaritede) geçirilerek kırılır ve mikotoksin kolondan serbest kalır (elue edilir). Bu
şekilde mikotoksin çok saf ve temizlenmis olur ve miktarının tayin edilmesi amacıyla
HPLC’e verilebilir.
9
Şekil 11. İmünoaffinite kolonunun çalışma prensibi (Ş. Tağı, 2003)
LABORATUVAR UYGULAMASI
Uygulamada aşağıdaki kitler ve mikroorganizmalar kullanılacaktır
Kitler: Salmonella Latex Test Kiti (Oxoid), E. coli O157 Latex Test Kiti (Oxoid).
Dryspot Staphytect Plus Test Kiti (oxoid)
Mikroorganizmalar
18-20 saatlik stok kültürler. Tryptic Soy Broth (TSB)’de ve Tryptic Soy Agar (TSA)’da geliştirildi.
Salmonella Enteritidis, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus
10