Genetik Mühendisliği - Hacettepe Üniversitesi

BYM613
Genetik Mühendisliği
Mutasyonlar ve Doğal Gen Transfer Mekanizmaları
Hacettepe Üniversitesi
Biyomühendislik Bölümü
2012-2013 Güz Dönemi
Dr. Eda Çelik-AKDUR
edacelik@hacettepe.edu.tr
MUTASYON bir canlının genomu içindeki DNA ya da RNA
diziliminde meydana gelen kalıcı değişimlerdir.
Mutasyonlar geri dönüşümsüzdür.
Spontane veya uyarılmış olabilir
Mutasyona sahip bir organizma mutant olarak adlandırılır.
2
1
Sessiz
mutasyon → fenotipte etkisi olmayan
Yanlış
anlamlı veya anlamsız (dur kodonu oluşur) mutasyonlar
→ kodlanan proteinin amino asit dizisinde değişiklikler oluşur,
ölüme bile neden olabilir.
Oksitlenme,
hasarlar hariç
alkilleyeci ajanlar gibi DNA’da meydana gelen
Biyoteknolojik
yöntemlerle mutasyonlar oluşturulabilir ve mutant
suşlar elde edilebilir
3
Mutasyonlar Nasıl Gerçekleşir ?
Nokta Mutasyonları
= Tek baz değişimi
Bir bazın (A, T, G, C)
başka bir bazla yer
değiştirmesi
Zincire bir ya da daha çok
bazın eklenmesi
Zincirdeki bazların
eksilmesi
Replikasyon hatası
E. coli’deki spontan mutasyon oranı, replikasyon
sırasında zincire eklenen1010 bazda yaklaşık bir bazdır.
Ör:
4
2
Çerçeve Kayması Mutasyonları
Çerçeve kayması mutasyonu bir genin protein
kodlayan kısmında ya birkaç baz çiftinin girmesi ya da
çıkması ile oluşan mutasyon çeşididir.
Bu girme ya da çıkma noktasından itibaren
kodonların doğru okuma çerçevesinde bir kayma
olur, protein farklı kodlanır.
5
Geri Mutasyon - Reversiyon
Mutantlar, kendi DNA'larında oluşan bazı
mutasyonlar sonucu tekrar orijinal (parental)
veya doğal formlarını kazanabilirler (geri
mutasyon). Bu olguda, değişen amino asit
tripleti, geri mutasyonla tekrar orijinal amino
asiti kodlayan triplet haline gelebilir.
Canlılar tekrar orijinal fenotipik karakterlerine
kavuşabilir. Böyle durumlara, aynı gende
oluşan supresör mutasyonlar (intragenik)
veya kromozom üzerinde başka gende
meydana gelen mutasyonlar (ekstragenik
supresörler) yol açabilirler.
6
3
İndüklenmiş ve/veya Yapay Mutasyonlar
Eğer hücreler mutajenik ajanlara (kimyasal, fiziksel,
biyolojik, vs.) maruz kalırsa (doğada veya labda),
mutantlar meydana gelebilir.
Mutajenler spesifik değildir.
7
Mutajenler
Sıcaklık, manyetik ve elektriksel alan, UV, proton, nötron
ışınlamaları gibi etkenler genellikle baz çifti değişimlerine yol
açarlar.
Sıcaklığın her 100°C yükseltilmesiyle organizmalarda
mutasyon oranı ~ 5 kat artar.
X ve γ ışınları gibi iyonlaştırıcı ışınlar kuvvetli fiziksel
mutagenlerdir. Çoğunlukla büyük, bazen de nokta
mutasyonlar meydana getirirler.
Bazı kimyasal maddeler, hücrenin yaşam çevriminin
herhangi bir evresinde, DNA’yı doğrudan etkileyerek bazların
kimyasal yapısını değiştirebilirler.
8
4
Spontan Mutasyonlar
Belirli bir dış etki olmaksızın,
normal hücresel etkinlikler
ya da ortamla gelişi güzel
etkileşimlerin sonucunda
ortaya çıkan mutasyonlar.
Mutasyonların kendiliğinden
meydana gelme olasılığı çok
düşük.
Genelde, tek bir gende
kendiliğinden mutasyon
olasılığı her dölde (her
replikasyon sırasında) hücre
başına ~10-5 -10-10.
Uyarılmış Mutasyonlar
Mutajen adı verilen kimyasal veya
fiziksel etkenlerle meydana gelen
mutasyonlardır.
Mutajenlerin kullanılması mutasyon
meydana gelme olasılığını çok artırır.
DNA da bazı bölgelerde (sıcak bölge)
mutasyon oranı daha yüksek olabilir.
Bir mutajenin etkinliği, arka planın
üzerine, mutasyon derecesini ne
kadar yükselttiğiyle değerlendirilir.
Mutajenler genellikle genler üzerinde
fark gözetmeden etkili
genelde
genlerin yapay mutasyona uğrama
9
şansları eşittir.
⇒
Mutantlar…
hücre fizyolojisinin anlaşılabilmesi için araç
endüstriyel organizmalar kadar değerli - kapasite
üstü üretim için kullanılma şansına sahip
Mutasyonun uyarılması ve mutant seçimi
bioproses uygulamaları için önemlidir
Ölümcül mutasyon => mutantı inceleyemeyebiliriz
10
5
Örnek
Cynthia Kenyon, 2011.
http://www.ted.com/talks/cynthia_kenyon_experiments_that_hint_of_longer_lives.html
Seçilebilir Mutasyon
Mutant hücrelerin
yaşayabileceği
önceden belirlenmiş
çevre koşulları vardır.
Mutant suş, bu
koşullarda yaşamayı
başarırken doğal suş
ölür; bu sayede
mutant seçimi
yapılmış olur.
11
Seçilemeyen Mutasyon
Doğal ve mutant suşların
ayırt edilebileceği bir
kültür ortamı
hazırlanamaz.
Mutant hücreler hücre
hücre denenerek tespit
edilir.
High-throughput
screening ?!
12
6
Direk veya Dolaylı Seçim
Ör:
Antibiyotik resistansı -> direk
Lizin oksotrof (auxotroph) -> dolaylı
Sıcaklığa duyarlı -> koşullu
13
Replicate Plating
Belli bir suş soyunun,
belli bir metabolit için
oksotrof
olup olmadığını
anlamaya yarayan hızlı
bir görüntüleme
tekniğidir.
14
7
Replicate Plating
15
Site-Directed Mutagenesis
Bölgesel Yönlendirilmiş Mutasyon
• Labda mutant yaratmak için
kullanılan yöntemin temeli =>
• Hazır kitleri mevcut
16
8
BAKTERİLERİN DOĞAL GEN TRANSFER
MEKANİZMALARI
1. Genetik Rekombinasyon
2. Transformasyon
3. Transdüksiyon
4. Epizomlar ve Konjugasyon
5. Transpozonlar: İç Gen Aktarımı
17
1.Genetik Rekombinasyon
DNA molekülüne ait parçaların (DNA dizilerinin) birbirlerine
göre yerleşimlerinin çeşitli yollarla değişmesiyle meydana gelen
yeni yerleşim düzenlemelerine rekombinasyon denir.
Günümüzdeki tüm organizmaların DNA’ları rekombinanttır.
Genomda şifrelenen ve aktiviteleri düzenlenen enzimler
tarafından katalizlenen temel bir süreçtir.
“Homolog rekombinasyon” gen aktarımında kullanılan bir
tekniktir.
18
9
Homolog Rekombinasyon
Bir bireyin sahip olduğu DNA moleküllerinin veya
aynı türe (ya da
yakın türlere) ait bireylerin DNA’larının homoloji (benzerlik) gösteren
bölgeleri arasında parça hareketleridir.
Ökaryotlarda crossing-over yoluyla, bakterilerde transformasyonla
gerçekleşir.
19
2. Transformasyon
Bakterilerde transformasyon, hücre veya proteinlerle beraber
olmayan DNA'nın alınması sonucu meydana gelen istikrarlı
kalıtsal değişiklik olarak ifade edilebilir.
Bakterinin ortamdan yabancı DNA'yı içine alabilme özelliğine
yetkinlik (competence) adı verilir.
Yetkinliğin iki tipini ayırd etmek gerekir:
Doğal Yetkinlik: Bu türler, DNA'nın hücre zarı içinden içeri
taşınmasını sağlayan mekanizmalar için gereken genlere
sahiptir.
Yapay Yetkinlik: Yapay yetkinlik için gerekli proteinler
hücrenin genleri tarafında kodlanmaz. Laboratuvar işlemleri
ile, yani doğada normalde rastlanmayan şartlar
altında, hücre zarı 'nın DNA'ya geçirgen olması sağlanır.
20
10
3. Transdüksiyon
Bir bakteriden (verici) diğerine (alıcı) bir
bakteriyofaj aracılığıyla DNA molekülü
parçası taşınması olayıdır.
İkiye ayrılır;
1. Genel (kısıtlı olmayan) transdüksiyon :
Virüs DNA’sı kromozoma entegre olmaz
2. Özel (kısıtlı ) transdüksiyon:
Virüs DNA’sı kromozoma entegre olur
21
22
11
4. Epizomlar ve Konjugasyon
Epizom, konak organizmanın kromozom DNA’sı ile
bütünleşebilen bir plazmiddir (Ör: F plasmid).
Bu yüzden uzun süre bütünlüğünü koruyabilir,
her hücre bölünmesinde kopyalanır ve genetik yapının
bir parçası olarak varlığını sürdürür.
Konjugasyon, bakteriler arasında direk temas ve köprü
oluşması suretiyle verici DNA segmentlerinin alıcı
hücrelere geçmesidir.
23
5. Transpozonlar
Transpozonlar bakteri DNA’sı, plazmidleri ve bakteriofajları
arasında yer değiştiren DNA parçacıklarıdır.
Yer değiştirdikleri için bunlara aynı zamanda “sıçrayıcı
genler” de denir.
Bakterilerde genelde antibiyotik
Insanlarda da mevcuttur.
Tranpozonların kimi kendini kopyalayarak, kimi kendini
çevreleyen DNA'dan kesip çıkarak hareket eder.
Bu özelliklerinden dolayı, bilim adamları transpozonları
canlılardaki DNA'yı değiştirmek için bir araç olarak kullanırlar.
24
resistansını
kodlarlar.
12