KimyaKongreleri.org

3. Ulusal Afinite Teknikleri Kongresi, 12-14 Eylül 2007, Uludag Üniversitesi, Bursa
Poster 7
uBlaulTIN AKTIVE Eolcl E1 ENZIMLERININ uBlaulTIN BENZERI OOMAINLERININ
5AFLA~TIRILMA51 ve iZOTOpiK OLARAK i~ARETLENME5i
Nazll S6kmen, E.Sonay Elgin Mugla Oniversitesi Fen-Edebiyat Fakultesi, Kimya Biilumu , Mugla olu~an
Ubiquitin 76 aminoasitten
korunmu~
evrimsel olarak t;:ok iyi
ve buh.in okaryotik
hucrelerde t;:ok miktarda bulunan ISlya dayamkll bir proteindir. Ubiquitin ve ubiquitin
du~uk
benzeri modifiye ediciler
molekul aglrhkll bir protein slnlfml
olu~tururlar
ve
proteinlere kovalent olarak baglanmak sureti ile hucre siklusu, apoptoz, onkogenez,
transkripsiyon,
viral enfeksiyon ve
hucre
farkhla~masl
gibi t;:ok say Ida
hucresel
fonksiyonlan regule ederler. Ubiquitin veya ubiquitin benzeri proteinlerin konjugasyon
prosesi iki basamakta
gert;:ekle~ir
(aktivasyon ve ligasyon) ve bir seri enzim (E 1, E2 ve E3
enzimleri) ve enerji (ATP hidrolizi) gerektirir. Bu
t;:ah~mada,
ubiquitin ve benzeri
konjugasyon sistemlerinde set;:icilik ve regulasyonun nasll saglandlglnm anlayabilmek
amaci ile,
t;:e~itli
ubiquitin aktive edici E1 enzimlerinin ubiquitin benzeri domainlerinin
klonlanmasl, ekspresyonu,
t;:all~malannda
safJa~tlnlmasl
ve
Nukleer Manyetik Rezonans
kullanllmak uzere izotopik olarak
15N ile
i~aretlenmesi
(NMR)
t;:ah~malan
gert;:ekle~tirilmi~tir. Oretilen protein GB1 domaininde 6, 8HT'de ise 8 tane his-kuyrugu
it;:erdigi it;:in nikel afinite kromatografisi :ile
kromatografisi
ile
gert;:ekle~tirilmi~tir .
fraksiyonlar %16'hk SDS-PAGE'de
proteinler
birle~tirilmi~tir .
safla~tlnlml~tlr.
Safla~tlrmanln
yurutUlmu~tur .
her
Safla~tlrma
nikel afinite
basamaglnda
toplanan
Jel sonut;:,anna gore elde edilen
Ultrafiltrasyon ybntemlerinden birkat;:1 denenerek
protein GB1 t;:ozunurfuk klsmlndan Tev proteaz enzimi kullamlarak
deri~tirilen
aynlml~lIr.
Kesme
reaksiyonu sonrasl reaksiyonun tamamlamp tamamlanmadlgl SDS-PAGE ile kontrol
edilmi~tir . Aynlan protein 15N i~aretli proteinlerin uretimi M9 ortamlnda gert;:ekle~tirilmi~tir.
Elde edilen 15N-Uba3 ubiquitin benzeri domaininin 15N-1H HSQC NMR spektrumu,
uretilen rekombinant proteinin yapisal ve biyokimyasal
gostermi~tir.
KimyaKongreleri.org
36
t;:all~malar
it;:in uygun oldugunu