MYCOPLASMA PCR KĐTĐ

MYCOPLASMA PCR KĐTĐ
Kat. No: SNP-MYC-K
GĐRĐŞ
SAKLAMA KOŞULLARI
SNP Mycoplasma PCR Kiti, hücre kültürü gibi biyolojik materyallerde mycoplasma
•
Buffer A Hariç tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
türlerini tespit eder.
•
Buffer A 2-8 °C’ de saklanmalıdır.
KĐT PRENSĐBĐ
DNA ĐZOLASYONU
Test prensibi klasik PCR ve Agaroz Jel Elektroforezidir.
1.
Ependorf tüp içine 500 µl hücre kültür sıvısı alıp 10000 rpm. +4 0C’de 2dk
2.
Ependorf
PCR, nükleik asitlerin in-vitro olarak (canlı organizma dışında), uygun koşullar
altında çoğaltılmasına dayanmaktadır. Çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna
santrifüj yapınız
özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı olan, 18-25 baz uzunluğunda bir
çift sentetik oligonükleotid primer kullanarak, bu iki primer ile sınırlandırılan
tüp’ün
dibindeki
beyaz
pellet’e
dokunmadan
üst
sıvıyı
(Süpernatant) pipet yardımı ile çekip atınız.
3.
bölgenin enzimatik olarak sentezlenmesi sağlanır.
Ependorf tüp içine Buffer A’ dan 400 µl alıp 10000 rpm. +4 0C’de 2dk
santrifüj yapınız.
DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel
4.
Đkinci adımı tekrarlayınız.
üzerinde hareketine dayanmaktadır.
5.
Ependorf tüp’ün içine Buffer A’ dan 200 µl ilave edip, vorteksleyiniz ve 95
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
6.
0
C’de 5dk tutunuz,
Isı bloğundan aldığınız bu ependorf tüp’ü 10000 rpm. +4 0C’de 2dk santrifüj
Kit, PCR için gerekli tüm bileşenleri içerisinde bulundurur. Tüm mycoplasma
yapınız ve berrak/şeffaf olan üst sıvıdan (Süpernatant) 5 µl Real Time PCR
türlerine spesifik primer yardımı ile örnekteki mycoplasma türlerinin varlığı tespit
testi için kullanınız.
edilir.
Buffer A yardımı ile tek solüsyonla DNA izolasyonu
çok kısa sürede
yapılabilmektedir.
TEST PROSEDÜRÜ
•
Bir örnek için, her 0,2 ml’lik PCR tüpüne, 20 µl master miks ve 0,3 µl Hot
Start Taq DNA Polimeraz konulur. Sonra 5 µl (~10-100 ng) örnek
DNA ‘sı ilave edilir.
TESPĐT EDĐLEBĐLEN MYCOPLASMA TÜRLERĐ
M. fermentans
M. gallisepticum
M. ovipneumoniae
M. hyorhinis
M. pulmonis
M. pirum
M. arginini
M. arthritidis
M. capricolu
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır.
•
Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz
miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan karışımdan 20.5’ er µl
tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları konulmalıdır.
PCR PROGRAMI
M. orale
M. bovis
M. salivarium
M. pneumoniae
M. hominis
M. haemofelis
M. genitalium
M. hyopneumoniae
Ayrıca Acholeplasma
Ayrıca Spiroplasma
KĐT ĐÇERĐĞĐ
•
•
•
•
Bileşen
Mycoplasma Master Miks
Buffer A
Hot Start Taq DNA Polymerase
Pozitif Kontrol DNA
20 Test
430 µl
3 ml x 4,5 ml
10 µl
20 µl
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
35 Döngü
ANALĐZ
OLASI PROBLEMLER
PCR işlemi bittikten sonra, PCR ürünleri % 1’ lik Agaroz jelde, tank büyüklüğüne
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
uygun voltaj ve sürede yürütülür. Bu süre 10 cm x 10 cm bir jel için ortalama 160
•
V ve 40 dakikadır. Bu değerler farklı tank ebatlarına göre değişebilir. Jel
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
yürütüldükten sonra UV tablası üzerine alınıp, ilgili bantlar açısından analiz edilir.
•
Test’te inhibitör varlığı,
Eğer bant yoksa “negatif” sonucu verilir. Eğer aradığımız bp uzunluğunda bant
söz konusudur.
varsa o örnek için “Mycoplasma pozitif” sonucu verilir.
DNA eksikliği,
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
Bölge
Uzunluk (bp)
Mycoplasma
250
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Böyle durumlarda çalışma tekrar edilmeli eğer aynı problem devam ediyorsa
yeniden DNA izolasyonu yapılmalıdır.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
tech@snp.com.tr.
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
M: 100 bp marker
1: Pozitif örnek
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
2: Pozitif örnek
3: Negatif örnek
4: Negatif örnek
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012