tc ankara ün vers tes bl msel araştırma projes kes n raporu

T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
Süperkritik Akışkan Ortamında Enantiyomerik Aşırılıkta
Kiral Hidroksi Ketonların Enzimatik Sentezi
Doç. Dr. Nuray Yıldız
20050745014HPD
Başlangıç Tarihi: 30.12.2005
Bitiş Tarihi: 30.12.2006
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara - " 2006 "
1
İÇİNDEKİLER
Özet……………………………………………………………………….............3
1. Amaç ve Kapsam ……………………………………………………………..7
2. Materyal ve Yöntem
2.1. Materyal……………………………………………………………………..8
2.2. Yöntem………………………………………………………………………8
2.2.1. 6-asetoksi-3-metoksisiklo-2-heksen-1-on Sentezi (6-asetoksi enon)….8
2.2.2. Benzoil-Benzoin sentezi………………………………………………….9
2.2.3. Süperkritik Akışkan Ortamında Benzoin Sentezi……………………...9
2.2.4. Enzim Aktivitesi………………………………………………………...11
3. Analiz ve Bulgular
3.1. Enzim Taraması………………………………………………………….12
3.2.Enantiyomerik Aşırılık Değerine Sıcaklık Etkisi……………………….14
3.3.Enantiyomerik Aşırılık Değerine Basınç Etkisi…………………………16
3.4.Enantiyomerik Aşırılık Değerine Girdi/ enzim (kütle) Oranı Etkisi…..17
3.5.Tekrarlanabilirlik Deneyleri……………………………………………..18
3.6.Dönüşümün Enantiyomerik Aşırılığa Etkisi……………………………19
3.7. Yanıt Yüzey Yöntemi (RSM)…………………………………………………..21
3.7.1. Kiral benzoin sentezine sıcaklık-basınç etkisi……………………….27
3.7.2. Kiral benzoin sentezine sıcaklık-pH etkisi………………………….28
3.7.3 Kiral benzoin sentezine basınç-pH etkisi…………………………….29
4. Sonuç ve Öneriler…………………………………………………………31
5. Kaynaklar…………………………………………………………………32
6. Ekler
Ek 1. Hizmet alımı………………………………………………………….34
Ek 2. Bildiriler………………………………………………………………35
Ek 3. Yayınlar………………………………………………………………40
2
Süperkritik Akışkan Ortamında Enantiyomerik Aşırılıkta Kiral Hidroksi
Ketonların Enzimatik Sentezi
Özet
Bu çalışmada, farmasötik endüstrisi için potansiyel öneme sahip kiral hidroksi
ketonlardan 6-hidroksi-3-metoksisiklo-2-hekzen-1-on ve benzoinin lipaz enzimi
kullanılarak süperkritik karbon dioksit (SCCO2) tepkime ortamında sentezi ilk kez
araştırılmıştır. Enantiyomerik aşırılığa, ortam basıncı (70-150 bar), sıcaklığı (35-45
°C), pH (5-9) ve ortamdaki organik çözücülerin (Dimetil sülfoksit (DMSO), Aseton,
N,N-Dimetilformamit
(DMF),
Tetrahidrofuran
(THF)),
Asetonitril,
n-Hekzan,
Siklohekzan, Etil asetat) etkileri incelenmiştir.
Benzoinin süperkritik akışkan ortamında sentezinde enzim (Porcine pancreas, Candida
antarctica, Rizopus arrhizus, Pseudomonas cepacia, Aspergillus, Rhizopus niveus, Hog
pancreas, Pseudomonas fluorescens, Mucor Miehei, Candida cylindracea) taraması
yapılmıştır. İncelenen on adet enzimden sadece dört tanesi (Porcine pancreas, Candida
antarctica, Candida cylindracea, Aspergillus,) ile ürün dönüşümü sağlanabildiği ince
tabaka kromatografisi (TLC) ile belirlenmiştir. Porcine pancreas ve Candida antarctica
enzimi ile S-benzoin, Candida cylindracea (CCL) ve Aspergillus enzimleri
kullanıldığında ise R-benzoin enantiyomerik aşırılıkta elde edilmiştir. En yüksek
enantiyomerik aşırılık (ee) CCL enzimi ile elde edildiğinden işletim parametrelerinin
enantiyomerik aşırılığa etkisi CCL enzimi ile araştırılmıştır. 70 bar basınçta sıcaklık
arttıkça enantiyomerik aşırılığın değişmediği, 80 ve 90 bar basınçta ise sıcaklık ile
azaldığı görülmüştür. 35 ºC ve 40 ºC’de basınç arttıkça 90 bar’a kadar enantiyomerik
aşırılık artmış, 90 bar’dan sonra ise kritik noktadan uzaklaşılması ile azaldığı
görülmüştür. 45 ºC’de ise basınçla azaldığı belirlenmiştir.
Benzoin sentezinde en uygun deney koşullarını belirlemek için Yanıt Yüzey Yöntemi
(RSM, Design Expert 6) kullanılmıştır. Benzoinin enantiyomerik aşırılıkta üretimini
etkileyen parametrelerden pH, sıcaklık ve basınç için RSM ile deney koşulları
3
tasarlanmış ve deneyler gerçekleştirilmiştir. Modelden elde edilen optimizasyon
sonucuna göre 40 °C sıcaklık, 79 bar basınç ve 6,4 pH değerinde enantiyomerik aşırılık
% 61,2 olarak elde edilmiştir. Belirlenen koşullarda deneyler tekrarlanmış
ve
optimizasyonda elde edilen enantiyomerik aşırılık değerine ulaşılarak modelin
doğruluğu test edilmiştir.
Modelden elde edilen optimum koşullarda organik çözücü etkisi incelenmiş en yüksek
enantiyomerik aşırılık değerinin (ee= % 61,2) DMSO ile elde edildiği belirlenmiştir. Bu
koşullarda tepkime ortamına kinetik rezolüsyonu
artıran katkı maddeleri (4-
Dimethylaminopyridine (DMAP) ve trietilamin) eklenmiştir. Enantiyomerik aşırılığa
trietilaminin negatif, DMAP’ın ise pozitif etki yaptığı bulunmuştur. Optimum
koşullarda DMSO’ya DMAP eklendiğinde enantiyomerik aşırılığın % 80’e ulaştığı
belirlenmiştir.
6-hidroksi-3-metoksisiklo –2 hekzan-1-on’un SCCO2 ortamında 6-asetoksi enondan
sentezinde ise benzoin sentezinde kullanılan on adet enzim
analiz yapıldığında ürün oluşumu gözlenememiştir.
4
taranmış fakat TLC ile
Enzymatic Synthesis of Enantioselective Chiral Hydroxy Ketones in Supercritical
Medium
Abstract
α-Hydroxy ketones are important compounds for pharmaceutical industry. In this study
synthesis of benzoin and 6-hydroxy-3-methoxycyclo-2-hexen-1-one were studied in
supercritical carbon dioxide (SCCO2) reaction medium. Effects of pressure (70-90 bar),
temperature (35-45° C), pH (5-9) and organic solvents (Dimethyl sulfoxide (DMSO),
Acetone, N,N-Dimethylformamide (DMF), Tetrahydrofuran (THF)), Acetonitrile, nHexan, Cyclohexan, Ethyl acetate) on enantiomeric excess (ee) were investigated.
In a screening test, ten commercially available lipases were studied. The aim for this
screening was to obtain benzoin and 6-hydroxy-3-methoxycyclo-2-hexen-1-one with
high enantiomeric excess. It was determined that four of them, Porcine pancreas,
Candida antarctica, Aspergillus, and Candida cylindracea catalyzed the reaction and
the others, Pseudomonas florescens, Hog pacreas, Mucor miehei, Rhizopus niveus,
Pseudomonas cepacia, and Rhizopus arrhizus could not produce the benzoin. The (S)enantiomer reacted faster than the (R)-enantiomer, affording (S)-benzoin when PPL and
Candida antarctica lipase. The (R)-enantiomer reacted faster than the (S)-enantiomer
forming the (R)-benzoin. The best resullt was achieved with CCL lipase, so effects of
operating variables on ee was studied with CCL.
Enantiomeric excess decreased with increasing temperature at 80 and 90 bar, in which
there was no change in ee at 70 bar. Enantiomeric excess increased by increasing
pressure at the temperatures 35°C and 40°C, while it decreased by increasing pressure at
45°C. First, the enantiomeric excess increased with increasing pressure at 35 ºC, and a
maximum of enantiomeric excess 61.3 % was achieved at 90 bar.
5
Response Surface Method (RSM, Design Expert 6)
was used to obtain optimum
conditions for benzoin synthesis by model. Optimum conditions was found as 40 °C, 79
bar, 6,4 pH and at these conditions ee was obtained as 61.2 %. Experiments duplicated
and same results were achieved. Therefore accuracy of the model was tested.
Effects of organic solvents on ee was performed at optimum conditions and most
suitable organic solvent was found as DMSO. In order to increase the enantiomeric
excess, DMAP and trietilamin were added to DMSO and it was seen that DMAP has
positive effect on ee (80 %), however trietilamin has negative effect on ee.
There were no enzymes to synthesize the 6-hydroxy-3-methoxycyclo-2-hexen-1-one in
SCCO2 medium.
6
1. Amaç ve Kapsam
Esterleşme, transesterleşme (alkoliziz, asidoliziz, aminoliziz ve interesterleşme) ve
hidroliz gibi enzimatik tepkimeler için süperkritik akışkan ortamları değerli
biyokimyasal maddelerin sentezinde büyük önem taşımaktadır. Son yıllarda ortam
mühendisliği alanındaki gelişmelere paralel olarak süperkritik akışkanların tepkime
ortamı olarak kullanımına olan eğilim artmaktadır. Klasik sentez ortamlarına göre kısa
işletme süresi ve yüksek enantiyomerik aşırılık eldesi gibi özelikleri
üstünlük
sağlamaktadır. Biyolojik olarak aktif bileşiklerin sentezinde kullanılan kiral hidroksi
ketonlar oldukça değerli ara ürünlerdir.
Farmasötik uygulamalarda
kiral hidroksi
ketonlar özellikle antibakteriyel ve antiviral özeliği nedeniyle antibiyotik sentezinde
ara üründür. Ayrıca bu ürünler antidepresif ve kalp ilaçlarının sentezinde de önemli
girdi maddeleridir. Kiral hidroksi ketonlar
farmasotik endüstrisi için temel girdi
maddeleridir. Birim fiyatları yüksek olan bu ürünlerin sentez ve ayırma süreçlerinde;
çevre koruma yasaları ve farmakoloji endüstrilerindeki yasal kısıtlamalar nedeniyle
toksik özelik göstermeyen, üründe çözücü atığı içermeyen, çevre dostu yeni tepkime
ortamları ve ayırma teknolojilerine gerek duyulmaktadır. Bir örnek verilecek olursa,
rasemik benzoinin 100 gramı yaklaşık 3-4 dolara malolurken (R) ve (S) – benzoinin her
birinin 250 mg fiyatı 100 dolar mertebesindedir.
Süreli yayınlarda benzoinin ve 6-hidroksi-3-metoksisiklo-2-heksen-1-on’un süperkritik
akışkan (SCF) ortamında enzimatik sentezine yönelik bir araştırma bulunmamaktadır.
Bu çalışmada, SCCO2 ortamında 6-hidroksi-3-metoksisiklo-2-heksen-1-on ve benzoin
sentezi araştırılarak, enantiyomerik aşırılığa ortam basıncı, sıcaklığı, pH ve ortamdaki
organik çözücü türünün etkileri incelenmiştir.
Çalışmanın ilk bölümünde, 6-hidroksi-3-metoksisiklo-2-heksen-1-on’un SC CO2’de
sentezinde başlangıç maddesi olarak kullanılacak olan 6-asetoksi enon ve benzoinin
sentezinde kullanılacak olan benzoil benzoin sentezi yapılmıştır. Daha sonra, süperkritik
akışkan ortamında sentezleme sürecine etki eden parametrelerin etkileri ISCO Marka
7
SFX 220 Model Süperkritik Akışkan Sisteminde incelenmiş en yüksek enatiyomerik
saflığın elde edildiği işletme koşulları belirlenmiştir.
2. Materyal ve Yöntem
2.1. Materyal
6-asetoksi-3metoksisiklo-2-heksen-1-on sentezinde, 1,3-siklohekzandion , metanol ve
titanyum klorür, benzoil-benzoin sentezinde, benzil, benzaldehit ve dimetilformamid,
benzoin sentezinde ise FLUKA enzim kiti (Porcine pancreas, Candida antarctica,
Aspergillus, Candida cylindracea,,
Pseudomonas florescens, Hog pacreas, Mucor
miehei, Rhizopus niveus, Pseudomonas cepacia, Rhizopus arrhizus), Dimetil sülfoksit
(DMSO), Aseton, N,N-Dimetilformamit (DMF), Tetrahidrofuran (THF)), Asetonitril, nHekzan, Siklohekzan, Etil asetat) kullanılmıştır. Organik çözücüler MERC’den temin
edilmiştir.
2.2. Yöntem
Başlangıç maddelerinden, 6-asetoksi-3metoksisiklo-2-heksen-1-on ve benzoil benzoinin
atmosferik koşullarda sentezi, benzoinin ise süperkritik akışkan ortamında
sentezi
aşağıda belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiştir.
2.2.1. 6-asetoksi-3-metoksisiklo-2-heksen-1-on Sentezi (6-asetoksi enon)
1 gram 1,3-siklohekzandion 30 mL metanolde çözülmüş ve manyetik karıştırıcı ile
karıştırılırken 0.8 mL titanyum klorür eklenmiştir. Tepkimenin tamamlandığı TLC ile
kontrol edilmiş ve tepkimeden sonra etil asetat/hekzan (2/1) karışımı ile kolonda süzme
işlemi gerçekleştirilmiştir.
Süzme işleminden sonra organik çözücüler döner
buharlaştırıcı ile uzaklaştırılmıştır. Geride kalan tepkime ürününün üzerine su eklenmiş
ve ayırma hunisinde kloroform ile ekstraksiyon yapılmıştır (Queseda et al. 1978).
Organik çözücüler uzaklaştırıldıktan sonra 3-metoksisiklohek-2-en-1-on 4 katı
8
mangan(III) asetat ile yükseltgenerek 6-asetoksi enon elde edilmiştir. Tepkime
tamamlandıktan sonra etil asetat/hekzan (1/1) karışımı ile kolonda süzme yapılmış ve
organik çözücüler döner buharlaştırıcı ile uzaklaştırılmıştır (Demir ve Şeşenoğlu, 2002).
2.2.2. Benzoil-Benzoin sentezi
1050 mg benzil ile 503 mg benzaldehit 3 mL dimetil formamid (DMF) içerisinde
çözülmüş ve manyetik karıştırıcı ile karışırken 66 mg potasyum siyanür (KCN)
eklenmiştir. Ürün oluşumu TLC ile takip edilmiştir. Tepkime tamamlandıktan sonra etil
asetat/hekzan (1/7) karışımında süzme yapılmış ve organik çözücüler döner
buharlaştırıcı ile uzaklaştırılmıştır (Kuebrich and Schowen, 1971).
2.2.3. Süperkritik Akışkan Ortamında Benzoin Sentezi
Benzoinin sentezinde laboratuvar ölçekli Süperkritik Akışkan Tepkime Sistemi (ISCO
SFX 220 Model) kullanılmıştır. Sistemin şematik gösterimi Şekil 1’de verilmiştir.
9
2
3
5
1
4
6
7
8
Şekil 1. Süperkritik akışkan tepkime sistemi
(1: sıvı CO2 tüpü, 2: CO2 için piston pompa, 3: yardımcı çözücü beslemesi
için yüksek basınç piston pompa, 4: sıcaklık kontrollu yüksek basınç
ekstraksiyon sistemi, 5: dolgulu kolon tipi ekstraktör, 6: kontrol ünitesi,
7:sıcaklık kontrollü ayarlanabilir vana ve örnek alma vanası, 8: yardımcı
çözücü
Rasemik benzoil-benzoin’den (% 50 R, % 50 S) süperkritik akışkan ortamında benzoin
sentezi için değişik deney koşullarında (T=30-45 °C, P=70-150 bar) çalışılmıştır.
Benzoil-benzoin 2 mL organik çözücüde çözünmüş, enzim ise 8 mL fosfat tamponunda
(pH=7) çözüldükten sonra karıştırılarak tepkime kabına konmuştur. Daha sonra
birbirine karıştırdıktan sonra 10 mL tepkime kabına konmuştur. Tepkimeden sonra elde
edilen ürünün üzerine etil asetat eklenip ekstraksiyon yapılarak ürünün su fazında
çözünmüş olan enzimden ayrılması sağlanmış böylece tepkime durdurulmuştur. Ürün
etil asetat fazından kapiler ile alınarak referanslar (benzoin ve benzoil-benzoin) ile
birlikte TLC tabakaya ekilmiş ve etil asetat/hekzan (1/3) karışımında TLC çözeltisinde
10
yürütülmüştür. Ürün oluşumu TLC ile izlenmiştir. Ürünlerin enantiyomerik aşırılığı
HPLC analizleri ile belirlenmiştir. (HPLC analiz koşulları: Kolon: Kiralpak OD kolon,
Dedektör: UV, Dalga boyu: 254 nm, Çözelti: hekzan/propanol 9/1, Akış hızı: 0.80
mL/min, Sıcaklık : 20 ºC). Ayrıca ürün NMR ve GC-MS analizleri ile de kontrol
edilmiştir. Süperkritik koşullarda sentezlenen benzoinin örnek HPLC analizi
kromotogramı Şekil 2’de verilmiştir.
UV-254nm
Retention Time
200
4.543
4.800
0
0
5
28.473
5.085
16.203
19.748
24.372
100
0
10
15
20
25
30
35
Minutes
Şekil 2. Benzoinin örnek HPLC analizi kromotogramı
2.2.4. Enzim Aktivitesi
Enzim aktivitesi titrasyon yöntemi ile belirlenmiştir. Candida cylindracea enzimi
SCCO2 ortamında 90 bar’da üç farklı sıcaklıkta (35, 40, 45 ºC) 90 dak
bekletilmiştir. Deneyler, enzim/girdi (kütle) oranı % 1,5 ve oleyik asit/oleyil
alkol mol oranı 1,33/1 alınarak 50 ºC, 200 rpm koşullarında gerçekleştirilmiştir
(Kapucu, 2003). Tepkime ortamından 60 dak sonra alınan örnekler (0,5 g) 10 mL
etanol (% 96’lık etanol içinde kütlece % 0,1 fenolftalein çözeltisi) içinde
çözülerek 0,1 N NaOH ile titre edilmiştir. Titrasyon ile ortamdaki oleyik asit
derişimi belirlendikten sonra stokiyometrik olarak oleyil aleat derişimi ( mol ester
/g enzim) bulunmuştur.
Oleyik asit + Oleyil alkol
Oleyil aleat
11
40
mAU
R-benzoin
9.267
100
S-benzoin
7.798
3.978
mAU
200
3. Analiz ve Bulgular
3.1. Enzim Taraması
FLUKA’dan sağlanan Lipaz enzimleri ile enzim taraması yapılmış, benzoil-benzoinden
benzoine dönüşüm kontrolü 35 ºC sıcaklık
ve 75 bar basınçta incelenmiştir. Bulgular
Çizelge1’de verilmiştir.
Çizelge 1. Enzim taraması (T=35 ºC P=75 bar)
Enzim
Girdi/enzim
Dönüşüm
Süre
Candida antarctica
10/20
Var
9h 30min
Rizopus arrhizus
10/20
Yok
12 h
Candida cylindracea
10/20
Var
50-60 min
Pseudomonas
10/20
Yok
12 h
Aspergillus
10/20
Var
12 h
Rhizopus niveus
10/20
Yok
12 h
Hog pancreas
10/20
Yok
12 h
Pseudomonas
10/20
Yok
12 h
Mucor Miehei
10/20
Yok
12 h
Porcine Pancreas
10/20
var
12 h
cepacia
fluorescens
İncelenen on adet enzimden sadece dört tanesi ile ürün dönüşümü sağlanabildiği ince
tabaka kromatografisi (TLC) ile belirlenmiştir. Benzoin dönüşümü elde edilen
tepkimelerin ürünleri HPLC ile analizlendiğinde ise ürün ya da girdiye ait herhangi bir
pik elde edilememiştir. Bu bulgular ışığında çözeltilerin seyreltik olduğu düşünülerek
girdi miktarı artırılmış candida cylindracea ile deneyler tekrarlanmıştır (Çizelge 2-3).
12
Çizelge 2. Candida cylindracea ile dönüşüm kontrolü (T=35 ºC ve P=75 bar)
Girdi/enzim
Dönüşüm
Süre
30/30
Var
1 h 20 min
30/30
Var
1 h 10 min
35/35
Var
2 h 30 min
35/35
Var
2 h 30 min
Çizelge 3. Candida cylindracea ile dönüşüm kontrolü (T=40-50 ºC ve P=75 bar)
Girdi/enzim
Dönüşüm
T (ºC)
Süre
35/35
Var
40
1h
35/35
Var
40
1h
35/35
Var
50
50 min
Girdi derişiminin 10/20 – 35/35 (girdi/enzim) aralığında değiştirilmesi ile de HPLC
analizlerinden ürün ve girdi değerleri belirlenememiştir. Örneklerin analizlenmesi için
beklediği süre (2-3 hafta) içinde bozunduğu düşünülerek 40 ºC sıcaklık ve 75 bar
basınç değerinde 35/35 girdi/enzim oranında deneyler tekrarlanmış ve %50 dönüşüm
değeri civarında alınan örneklerin analizi 1-2 gün içinde gerçekleştirilerek
enantiyomerik aşırılık değeri (ee) % 46 (45-60 min) olarak elde edilmiştir (Çizelge 4).
Çizelge 4. Candida cylindracea ile dönüşüm kontrolü ve enantiyomerik aşırılık (ee)
değeri (T=40 ºC P=75 bar)
Girdi/enzim
Dönüşüm
T (ºC)
Süre
ee (%)
35/35
% 50
40
45 min
46
Enantiyomerik aşırılık değeri HPLC’de elde edildikten sonra, enzim kitinde dönüşüm
elde edilen enzimler ile 35 ºC, 90 bar, girdi/enzim (1/1) koşullarında deneyler tekrar
yapılmış ve en büyük enantiyomerik aşırılık değerinin CCL enzimi ile elde edildiği
saptanmıştır (Çizelge 5).
13
Çizelge 5. Dönüşüm elde edilen enzimler ve ve enantiyomerik aşırılık değerleri
(T=35 ºC P=90 bar)
Enzim
Girdi/enzim
Süre
Enantiomeric
excess (%)
Candida antarctica
30/30
9 h 30 min
33,1 (S)
Candida cylindracea
30/30
50-60 min
61,3 (R)
Aspergillus
30/30
12 h
29,5 (R)
Candida antarctica ve porcine pacreas enzimi ile S-benzoin, candida cylindracea ve
aspergillus enzimleri kullanıldığında ise R-benzoinin enantiomerik aşırılık değerleri
elde edilmiştir. En yüksek ee CCL ile elde edildiğinden işletim parametrelerinin
enantiyomerik aşırılığa etkisi CCL enzimi ile araştırılmıştır.
3.2.Enantiyomerik Aşırılık Değerine Sıcaklık Etkisi
70 bar basınçta sıcaklık arttıkça enantiyomerik aşırılık değişmemiştir. 80 ve 90 bar
basınçta ise sıcaklık ile enantiyomerik aşırılık azalmış ve en yüksek ee değeri 80
bar, 35 ºC’de % 46,7, 90 bar 35 ºC’de % 61,3 olarak bulunmuştur (Çizelge 6).
14
Çizelge 6. Enantiyomerik Aşırılığa Sıcaklık Etkisi (Girdi/enzim (kütle)= 1/1)
Basınç (bar)
70
80
90
Sıcaklık (˚C)
Enantiyomerik aşırılık (%)
35
46,6
40
46,5
45
44,3
35
46,7
40
43,2
45
24,3
35
61,3
40
43,3
45
19,8
En uygun basınç olarak belirlenen 90 bar basınçta farklı sıcaklıklarda (35, 40, 45 ˚C)
candida cylindracea enzimi 90 dakika SCCO2 ortamında bekletilmiş ve daha sonra
titrasyon ile aktivitesi belirlenmiştir (Kapucu 2003). Elde edilen sonuçlara göre sıcaklık
ile candida cylindracea enziminin aktivitesi düşmektedir (Çizelge 7).
Çizelge 7. Enzim Aktivitesinin Sıcaklıkla Değişimi (90 bar, inkübasyon süresi 1,5 saat)
T (ºC)
Aktivite (mol ester/g enzim)
35
0,0498
40
0,0398
45
0,0375
15
Benzer şekilde Hartmann et al. (2001) 3-hidroksi-5-fenil-4-pentonoicasitetilester
hidrolizinde 103 bar basınçta
40-50 ˚C’de
sıcaklık etkisini incelemişler ve
enantiyoseçimliliğin yüksek sıcaklıkta (50 °C) azaldığını ve en yüksek değerin 45 ˚C’de
elde edildiğini saptamışlardır.
3.3.Enantiyomerik Aşırılık Değerine Basınç Etkisi
Sıcaklık 35 ºC’ de basınç arttıkça 90 bara kadar enantiyomerik aşırılık artmış, 90 bar
değerinden sonra ise kritik noktadan uzaklaşılması ile azaldığı görülmüştür. 90 barda en
yüksek enantiyomerik aşırılık değeri % 61,3 bulunmuştur. 40 ºC ee değişmemiş, 45
ºC’de ise basınçla azaldığı belirlenmiştir (Çizelge 8). Elde edilen sonuçlar, süperkritik
akışkan ortamında enantiyoseçimliliğin basınç ve sıcaklığa bağlı olduğunu göstermiştir.
Enantiyoseçimliliğin 80 ve 90 bar basınçta, sıcaklık arttıkça enzim aktivitesindeki
düşmeye bağlı olarak azaldığı düşünülmektedir (Çizelge 7). Enantiyomerik aşırılık 35
°C’ de kritik nokta yakınında basınç ile artmış, kritik noktadan uzaklaştıkça basınç ile
azalmıştır (Çizelge 8). SCCO2 ortamında kritik nokta yakınında CO2 ve enzim
moleküllerinin etkileşimi arttığından enzim konformasyonu değişir ve aktif konumların
ortaya çıkması ile enantiyoseçimlik artar. Kritik noktadan uzaklaştıkça ise yüksek
basınçta enzim CO2 etkileşimi enzimin konformasyonunu bozduğundan enantiyomerik
aşırılık düşmektedir. Süreli yayınlarda benzer bulgulara rastlanmaktadır. Ikushima et al.
(1996) candida cylindracea enzimi ile n-valerik asit ve sitronelol esterleşmesi
çalışmışlar ve kritik nokta yakınında steroseçimliliğin yüksek olduğunu bulmuşlardır.
Kritik nokta yakınında girdi derişiminin maksimum değere ulaştığını ve bu durumun da
tepkime hızını ve enantiyoseçimliliği etkilediğini, ayrıca; IR spektroskopik çalışma
bulgularına göre enzim yapısının basınç ile değiştiğini vurgulamışlardır. Hartmann et al.
(2001) 3-hidroksi-5-fenil-4-pentonoicasitetilester hidrolizini değişik lipaz enzimi ile
çalışmışlar
ve
en
iyi
sonucu
pseudomonas
cepacia
ile
elde
etmişlerdir.
Enantiyoseçimliliğin basınca bağlı olduğu, 103 bar değerine kadar arttığı sonra basınç
ile azaldığı belirlenmiştir. 103 bar değerinden sonra enantiyoseçimliliğin azalması, CO2
ile enzimin karbamat iyonu oluşturarak inaktif olmasına bağlanmıştır.
16
Çizelge 8. Enantiyomerik Aşırılığa Basınç Etkisi (Girdi/enzim (kütle)= 1/1)
Sıcaklık (˚C)
35
40
45
Basınç (bar)
Enantiyomerik aşırılık (%)
70
46,6
80
46,7
90
61,3
120
30,0
150
31,0
70
46,5
80
43,2
90
43,3
70
44,3
80
24,3
90
19,8
3.4.Enantiyomerik Aşırılık Değerine Girdi/ enzim (kütle) Oranı Etkisi
Girdi/enzim oranının etkisi, en yüksek enantiyomerik aşırılık değerinin elde edildiği 35
ºC ve 90 bar basınçta incelenmiştir. Çizelge 9’da görüldüğü gibi oran 1’den 2’ye
yükseldiğinde enantiyomerik aşırılık değeri azalmış, oran 4’e çıktığında ise
enantiyomerik aşırılık biraz artmıştır. Fakat girdi/enzim oranı 2 ve 4 iken ince tabaka
kromatografide takip etmek zor olmuş ve HPLC grafiğinde pikler çok küçük olarak
belirmiştir. Bu nedenle elde edilen değerin güvenilirliği azdır. En uygun girdi/enzim
oranı 1/1 olarak belirlenmiştir.
17
Çizelge 9. Enantiyomerik Aşırılığa Girdi/enzim (kütle) Oranının Etkisi (35 ˚C, 90 bar)
Girdi/enzim
Enantiyomerik aşırılık (%)
1
61,3
2
24,0
4
34,0
Rasemik benzoinin 250 miligramı yaklaşık 20 dolara malolurken (R) ve (S)– benzoinin
her birinin 100 mg fiyatı 300 dolar mertebesindedir. CCL enziminin 10 gramının fiyatı
ise 80 dolardır. Bu durumda enzim miktarının fazla (girdi/enzim=1/1) olmasının, elde
edilecek ürünün değeri düşünüldüğünde çok önemli olmadığı açıktır.
3.5.Tekrarlanabilirlik Deneyleri
Deneylerin tekrarlanabilirliği en iyi koşul olarak belirlenen 35 ºC, 90 bar basınçta test
edilmiştir. Ayrıca, 40 ºC, 80 bar ve 35 ˚C, 80 bar koşullarında da deneyler
tekrarlanmıştır.
18
Çizelge 10. Deneylerin Tekrarlanabilirliklerinin Kontrolü
Deney Koşulları
Enantiyomerik aşırılık (%)
35 ºC, 90 bar
58,2
59,5
64,2
60,5
61,3
40 ºC, 80 bar
42,6
43,2
35 ºC, 80 bar
46,7
43,5
Çizelge 10’da görüldüğü gibi deneyler tekrarlanabilmektedir.
3.6. Dönüşümün Enantiyomerik Aşırılığa Etkisi
Benzoinin, rasemik bir girdiden kinetik rezolüsyon ile sentezinde dönüşüm değeri %
50’nin üzerinde iken enantiyomerik aşırılık değerinin çok az arttığı ya da % 50
dönüşümde elde edilen değere yakın olduğu saptanmıştır (Çizelge 11). Süreli
yayınlardan elde edilen bilgilere göre, girdi rasemik olduğunda kinetik rezolüsyon
yönteminde tepkimenin % 50’de durdurulması gerekmektedir (Demir et al., 2002). En
yüksek enantiyomerik aşırılık değeri % 50 dönüşümde elde edilirken, dönüşümün
artması ile azalması gerekmektedir. Buna karşın Çizelge 11’da görüldüğü gibi
dönüşümün artması enantiyomerik aşırılığı belirgin olarak değiştirmemiştir. Bu
durumda, üründe S-benzoinin R-benzoine dönüşmüş olabileceği düşünülmüştür. S-
19
benzoinin R-benzoine dönüşüp dönüşmediğini test etmek için SCCO2 ortamında yapılan
deneyde benzoil-benzoin yerine S-benzoin ile çalışılmış ve S-benzoinin enantiyomerik
aşırılığı % 93,5’tan %92,2 ve %87,7’ye düşmüştür (Çizelge 12, Şekil 3) bu durum Sbenzoinin R-benzoine dönüştüğünü düşündürmüştür.
Çizelge 11. Dönüşüme Karşı Enantiyomerik Aşırılık Değerleri
Deney koşulları
Süre (dakika)
Dönüşüm (%)
Enantiyomerik aşırılık
(%)
35 ˚C, 90 bar (deney
90
≈ % 50
59,5
1)
100
> % 50
60,7
120
>> % 50
56,5
35 ˚C, 90 bar (deney
85
≈ % 50
64,2
2)
90
> % 50
63,6
100
>> % 50
64,8
35 ˚C, 90 bar (deney
85
≈ % 50
60,5
3)
95
> % 50
68,0
110
>> % 50
62,0
60
≈ % 50
42,6
70
> % 50
46,7
85
>> % 50
48,7
40
≈ % 50
43,3
50
>> % 50
51,2
50
≈ % 50
24,3
60
>> % 50
37,9
40 ˚C, 80 bar
40 ˚C, 90 bar
45 ˚C, 80 bar
20
Çizelge 12. SCCO2’de S-benzoinin ile R-benzoine Dönüşüm Kontrolü
Deney Koşulları
Enantiyomerik Aşırılık S-benzoin
(%)
Saf S-benzoin (referans)
93,5
45 ºC, 150 bar, 9 saat
92,2
40 ºC, 80 bar, 1 saat
87,7
UV-254nm
Retention Time
1000
1000
0
0
2
4
6
8
10
12
500
18.695
16.267
11.752
5.787
5.868
5.938
6.293
6.682
6.720
7.077
7.155
7.253
7.327
7.397
7.463
7.508
7.720
7.797
7.897
7.970
8.042
8.255
8.328
8.398
8.443
8.732
8.813
8.877
8.938
9.018
9.098
9.185
9.235
9.302
9.370
9.448
9.538
9.603
9.672
9.757
9.828
9.902
10.167
10.733
10.802
10.880
500
0.083
0.152
0.228
0.313
0.380
0.442
0.513
0.582
0.650
0.720
0.807
0.867
0.940
1.018
1.100
1.157
1.223
1.315
1.380
1.437
1.530
1.603
1.673
1.745
1.793
1.865
1.938
2.030
2.102
2.157
2.227
2.317
2.388
2.460
2.532
2.603
2.677
2.818
2.888
2.963
3.020
3.103
3.250
3.293
3.390
3.443
3.813
4.178
4.497
5.107
5.310
mAU
1500
mAU
1500
0
14
16
18
20
Minutes
Şekil 3. 40 ºC, 80 bar, S-benzoinin, R-benzoine dönüşüm kontrolü (11,752 dak: Sbenzoin; 16,267 dak: R-benzoin)
3.7. Yanıt Yüzey Yöntemi (RSM)
Benzoil-benzoinden süperkritik akışkan ortamında kiral benzoin sentezinde en uygun deney
koşullarını belirlemek için yanıt yüzey yöntemi (RSM) kullanılmıştır. Enantiyomerik aşırılığı
etkilediği belirlenen 3 parametre (pH, sıcaklık, basınç) bağımsız değişken ve enantiyomerik
aşırılık yanıt fonksiyonu olarak seçilmiştir. Deney tasarımına geçilmeden önce bağımsız
değişkenlerin alt ve üst sınırlarını belirlemek için ön denemeler yapılmıştır. pH’ın
21
enantiyomerik aşırılığa etkisi incelenmiş ve pH’ın 5’ten 7’ye
artması ile enantiyomerik
aşırılığın önce arttığı pH 9’dan sonra ise azaldığı belirlenmiştir (Çizelge 12). Bu nedenle pH
aralığı 5-9 olarak seçilmiştir. Basınç aralığı 70-90 bar ve sıcaklık aralığı 35-45 ºC olarak
belirlenmiştir
Çizelge 12. Enantiyomerik aşırılığa pH etkisi
pH
T (ºC)
P (bar)
Enantiyomerik aşırılık
(%)
5
35
90
44,0
7
35
90
61,3
9
35
90
55,6
Kiral benzoin oluşumunu etkileyen üç bağımsız değişken (k=3) için 23 faktoriyel
merkezi bileşen tasarımı uygulanmıştır. Faktoriyel tasarım, 8 faktoriyel nokta (2k), 6
eksenel nokta (2k) ve merkez noktalardaki 6 deneyden oluşmaktadır.
Y cevabı için üretilen 2. derece polinom model:
Y = β 0 + β1 x1 + β 2 x 2 + β12 x12 + β 22 x 22 + β 32 x32 + β 1 β 2 x1 x 2 + β1 β 3 x1 x3
+ β 2 β 3 x 2 x3 + ε ..........................................................................(1)
Eşitlik 1’de verilen 2. derece polinom katsayılarının belirlenmesi için 20 noktada
(N=2k+2k+n0, k=3) deney gerekmektedir.
Eşitlik 1’de Y, alınan cevabı, x1, x2, x3, ise kodlanmış bağımsız değişkenleri, β0 kayma,
βi, i=1..3 katsayılar lineer katsayılar, β i2 katsayıları kuadratik katsayılar, çarpım halindeki
katsayılar iç etkileşim katsayıları, ε deneysel hatadır.
Bağımsız değişkenlerin kodlanmış şekli aşağıdaki gibidir:
22
xi =
X i − X i*
.............................................................................................(2)
∆xi
Yukarıdaki denklemde xi i. bağımsız değişkenin kodlanmış değeri, Xi bağımsız
değişkenin gerçek değerini, X i* merkez noktadaki gerçek değerini, ∆Xi
basamak
değişimini gösterir.
Kiral benzoin sentezi için tasarımda yer alan bağımsız değişkenler Çizelge 13’te seçilen
bağımsız değişkenlerin gerçek ve kodlanmış değerleri Çizelge 14’te, tasarım matrisinin
kodlanmış ve gerçek değişkenler cinsinden oluşturulması ve elde edilen cevap Çizelge
15’te verilmiştir.
Çizelge 13. Deney tasarım yönteminde kullanılan bağımsız değişkenler
Bağımsız değişken
Tasarım değişkeni
Sıcaklık (ºC)
X1
Basınç (bar)
X2
pH
X3
Çizelge 14. Kiral benzoin sentezinde bağımsız değişkenlerin bağımsız ve kodlanmış
değerleri
Bağımsız değişkenler
Aralık ve seviyeleri
Kodlanmış
gerçek
-1,68
-1
0
1
1,68
X1
T, ºC
31,59
35,00
40,00
45,00
48,41
X2
P, bar
63,18
70,00
80,00
90,00
96,82
X3
pH
3,64
5,00
7,00
9,00
13,36
23
Çizelge 15. Tasarım matrisinin kodlanmış ve gerçek değişkenler cinsinden
oluşturulması ve elde edilen cevap
Deney no
x1
x2
x3
T, ºC
P, bar
pH
ee, %
1
-1
-1
-1
35,0
70,00
5,00
33,6
2
1
-1
-1
45,00
70,00
5,00
39,6
3
-1
1
-1
35,00
90,00
5,00
36,0
4
1
1
-1
45,00
90,00
5,00
33,0
5
-1
-1
1
35,00
70,00
9,00
24,8
6
1
-1
1
45,00
70,00
9,00
30,6
7
-1
1
1
35,00
90,00
9,00
18,8
8
1
1
1
45,00
90,00
9,00
22,2
9
-1,68
0
0
31,59
80,00
7,00
38,7
10
1,68
0
0
48,41
80,00
7,00
39,6
11
0
-1,68
0
40,00
63,18
7,00
34,2
12
0
1,68
0
40,00
96,82
7,00
23,0
13
0
0
-1,68
40,00
80,00
3,64
43,7
14
0
0
1,68
40,00
80,00
10,36
8,00
15
0
0
0
40,00
80,00
7,00
54,6
16
0
0
0
40,00
80,00
7,00
60,4
17
0
0
0
40,00
80,00
7,00
58,7
18
0
0
0
40,00
80,00
7,00
63,7
19
0
0
0
40,00
80,00
7,00
65,7
20
0
0
0
40,00
80,00
7,00
55,8
24
Cevap için elde edilen modellerin varyans analizi (ANOVA testi) sonuçlarından önemli
olanlar Çizelge 16’da yer almaktadır.
Çizelge 16. Kiral benzoin sentezi optimizasyonunda kullanılan modelin ANOVA testi
F değeri
Prob>F
Model
28,36
<0,0001
Β1
0,73
0,4124
Β2
5,45
0,0417
Β3
43,57
<0,0001
β12
40,02
<0,0001
β 22
91,96
<0,0001
β 32
109,00
<0,0001
β1 β2
0,86
0,3748
β1 β3
0,26
0,6244
β2 β3
0,69
0,4253
Lack of fit
0,99
0,5045
Std sapma
4,34
C.V
11,06
R2
0,9623
Adj R2
0,9284
Kiral benzoin üretimine pH, sıcaklığın karesi, basıncın karesi ve pH’ın karesi incelenen
parametreler arasında en etkili olmuştur. İkinci derecede önemli parametre basınçtır.
Design Expert-6 yazılımıyla yapılan tasarım ve çözüm sonunda 2. derece model
önerilmekte ve tanımlanan Cevap Yüzey modelinin kullanılan sistem için uygun
olduğunu göstermektedir. Cevap Yüzey yönteminin doğruluğunun test edilmesi için
varyans analizi (ANOVA) yapılmıştır. Modelin F-testi 28,36 olarak bulunmuştur, bu
25
kullanılan regresyon modelin önemli olduğunu gösterir. Prob>F değerlerinin 0,05’ten
küçük olması ilgili model parametrelerinin önemini belirtir. Buna göre, basınç, pH,
sıcaklığın karesi, basıncın karesi ve pH’ın karesi davranışı belirleyicidir. İkili
etkileşimler içinde etkinlik sırası sırasıyla sıcaklık-basınç (β1β2: p=0,3748), basınç-pH
(β2β3: p=0,4253), sıcaklık-pH’dır (β1β3: p=0,6244). Modelin standart sapması 4,34’tür.
Uygunluğun zayıflığı (lack of fit) testinde F değerinin büyük olması modelin
uygunluğunu gösterir. Regresyon katsayısı R2=0,9623 bulunmuştur. Bu sayının yüksek
olması bağımsız değişkenler arasındaki ilişkinin model tarafından iyi şekilde ifade
edildiğini gösterir. Modelde ‘doğru kesinlik’ (adequate precision) değeri, cevabın
hataya oranını ölçmektedir ve 4’ten büyük değeri istenir. Modeldeki değeri 15,249’dur.
Denklem katsayıları için en küçük kareler yöntemi ile standart hata, F testi ve standart
sapma değerleri Çizelge 17’de verilmiştir.
Çizelge 17. En küçük kareler yöntemiyle bulunan bazı katsayılar
Model
Hesaplanan
Serbestlik
Standart sapma
F testi
parametresi
katsayı
derecesi
Kayma
59,81
1
1,77
28,36
X1
1,00
1
1,17
0,73
X2
-2,74
1
1,17
5,45
X3
-7,75
1
1,17
43,57
X12
-7,23
1
1,14
40,02
X 22
-10,96
1
1,14
91,96
X 32
-11,93
1
1,14
109,00
X1 X2
-1,43
1
1,53
0,86
X1 X3
0,77
1
1,53
0,26
X2 X3
-1,28
1
1,53
0,69
26
Kiral benzoin sentezinde önerilen denklem Eşitlik 3’te kodlanmış değişkenler cinsinden
ifade edilmiştir.
Y = 59,81 + 1,00 x1 − 2,74 x 2 − 7,75 x3 − 7,23x12 − 10,96 x 22 − 11,93x32 − 1,43x1 x 2 +
0,77 x1 x3 − 1,28 x 2 x3 ...................................................................................................(3)
3.7.1. Kiral benzoin sentezine sıcaklık-basınç etkisi
Benzoin sentezi için belirlenen parametrelerin (pH, sıcaklık, basınç) kodlanmış değerler
cinsinden enantiyomerik aşırılık ile ilişkisini veren eşitlik 3’te pH sabit alınıp sıcaklıkbasınç arasındaki etkileşim incelendiğinde [x3=0 (pH)] sistemi tanımlayan denklem
aşağıdaki gibi elde edilmiştir (eşitlik 4). Sıcaklık-basınç (x1-x2) iç-etkileşimleri etkisinin
benzoin dönüşümünü azaltmak yönünde olduğu görülmektedir (β1β2<0) Sıcaklık-basınç
iç etkileşiminin çizimi şekil 1’de yer almaktadır.
Y = 59,81 + 1,00 x1 − 2,74 x 2 − 7,23 x12 − 10,96 x 22 − 1,43 x1 x 2 + .........................................(4)
Çizimin eliptik yapısı, deneysel bölge içinde durgun bir noktaya (maksimim nokta, 40
°C, 80 bar pH 7) sahip olunduğunu, ve sıcaklık-basınç iç etkileşiminin önemli olduğunu
gösterir. Görüldüğü gibi enantiyomerik aşırılık durgun noktadan uzaklaştıkça azalır.
Çalışılan aralıkta sıcaklığın, basıncın düşük değerlerinde artırılması enantiyomerik
aşırılığı önce yükseltip sonra azaltmakta, basıncın yüksek değerlerinde ise
azaltmaktadır. Sabit sıcaklıkta basıncın artmasıyla enantiyomerik aşırılık önce artıp
sonra azalmaktadır.
27
Şekil 4. Kiral benzoin sentezine sıcaklık-basınç etkileşiminin üç boyutlu gösterim
3.7.2. Kiral benzoin sentezine sıcaklık-pH etkisi
Eşitlik 3’te x2=0 (basınç) alındığında sistemi tanımlayan denklem aşağıdaki gibi elde
edilmiştir (eşitlik 5). Sıcaklık-pH iç-etkileşimleri benzoin dönüşümünü artırma
yönündedir. (β1β3>0) sıcaklık-pH iç etkileşiminin çizimi şekil 5’te verilmiştir.
Y = 59,81 + 1,00 x1 − 7,75 x3 − 7,23 x12 − 11,93 x32 + 0,77 x1 x3 ...............................(5)
Çizimin eliptik yapısı, deneysel bölge içinde durgun bir noktaya (maksimim nokta)
sahip olunduğunu, ve sıcaklık-pH iç etkileşiminin önemli olduğunu gösterir. Görüldüğü
gibi enantiyomerik aşırılık durgun noktadan uzaklaştıkça azalır. Çalışılan aralıkta
sıcaklığın, pH’ın düşük değerlerinde artırılması enantiyomerik aşırılığı önce yükseltip
28
sonra azaltmakta, pH’ın yüksek değerlerinde ise enantiyomerik aşırılığı azaltmaktadır.
Sabit sıcaklıkta pH’ın artmasıyla enantiyomerik aşırılık önce artıp sonra azalmaktadır.
Şekil 5. Kiral benzoin sentezine sıcaklık-pH etkileşiminin etkisi üç boyutlu gösterim
3.7.3 Kiral benzoin sentezine basınç-pH etkisi
Eşitlik 3’te x1=0 (sıcaklık) alınıp sistemi tanımlayan denklem aşağıdaki gibi elde
edilmiştir (eşitlik 6). basınç-pH (x2-x3) iç-etkileşiminin benzoin dönüşümünü azaltma
yönünde olduğu görülmektedir (β2β3<0) basınç-pH iç etkileşiminin çizimi şekil 6’da
verilmiştir.
Y = 59,81 − 2,74 x 2 − 7,75 x3 − 10,96 x 22 − 1193 x32 − 1,28 x 2 x3 ............................................(6)
29
Çizimin eliptik yapısı, deneysel bölge içinde durgun bir noktaya (maksimim nokta, 40
°C, 80 bar, pH 7) sahip olunduğunu, ve basınç-pH iç etkileşiminin önemli olduğunu
gösterir. Enantiyomerik aşırılık durgun noktadan uzaklaştıkça azalır. Çalışılan aralıkta
basıncın, pH’ın düşük değerlerinde artırılması enantiyomerik aşırılığı önce yükseltip
sonra azaltmakta, pH’ın yüksek değerlerinde ise enantiyomerik aşırılığı azaltmaktadır.
Sabit basınçta pH’ın artmasıyla enantiyomerik aşırılık önce artıp sonra düşmektedir.
Şekil 6. Kiral benzoin sentezine basınç-pH etkileşiminin üç boyutlu çizim
Sonuç olarak, benzoin sentezini etkileyen parametreler için pH (5-9), sıcaklık (35-45
°C), basınç (70-90 bar) için RSM yöntemi ile deney tasarımı yapılıp optimize
edildiğinde optimum deney koşullarının 40 °C, 79 bar ve 6,4 pH değerinde
enantiyomerik aşırılık % 61,2 olduğu belirlenmiştir. Bu koşullarda tepkime ortamına
kinetik rezolüsyonu artıran katkı maddeleri (4-Dimethylaminopyridine (DMAP) ve
trietilamin) eklendiğinde enantiyomerik aşırılığa trietilaminin negatif, DMAP’ın ise
30
pozitif etki yaptığı bulunmuştur. Optimum koşullarda DMSO’ya DMAP eklendiğinde
enantiyomerik aşırılığın % 80’e ulaştığı belirlenmiştir (Şekil 7).
Şekil 7. Optimum koşullarda DMSO+DMAP’ın ee’ye etkisi
6-hidroksi-3-metoksisiklo –2 hekzan-1-on’un SCCO2 ortamında 6-asetoksi enondan
sentezinde ise benzoin sentezinde kullanılan on adet enzim
taranmış fakat TLC ile
analiz yapıldığında ürün oluşumu gözlenememiştir.
4. Sonuç ve Öneriler
Benzoin sentezinde en uygun enzimin candida cylindrace, organik çözücünün ise
DMSO olduğu belirlenmiştir. Optimum koşullarda (40 °C, 79 bar ve 6,4 pH ) katkı
maddesi (DMAP) ile en yüksek enantiyomerik aşırılık % 80 değerine ulaşılmıştır. 6hidroksi-3-metoksisiklo –2 hekzan-1-on’un
gözlenmemiştir.
31
SCCO2 ortamında sentezinde ürün
İleri kimyasal madde üretiminde
çevre ile uyumlu (yeşil kimya) bir proses
geliştirilebileceğinden biyoteknoloji ve farmasötik alanlarında bilimsel araştırmaya
önemli katkı sağlanmıştır. Ayrıca diğer benzoin türevlerine bu çalışma koşulları
uygulanarak yüksek enantiyomerik aşırılık elde edilebileceği düşünülmektedir.
5. Kaynaklar
1. A. S. Demir, H. Hamamcı, Ö. Sesenoglu, R. Neslihanoğlu, B. Asikoglu and D.
Capanoğlu, Fungal deracenization of benzoin, Tetrahedron Letters 43 (2002) 64476449.
2. T. Hartmann, H. H. Meyer and T. Scheper, The enantioselective hydrolysis of 3hydroxy-5-phenyl-4-pentenoicacidethylester in supercritical carbon dioxide using
lipases, Enzyme and Microbial Technology 28 (2001) 653-660.
3. Y. Ikushima, N. Saito, K. Hatakeda and O. Sato, Promotion of a lipase catalyzed
esterification in supercritical carbon dioxide in the near critical region, Chemical Engineering
Science 51 11 (1996) 2817-2822.
4. N. Kapucu, Lipaz enziminin katalizlediği bir ester üretiminin süperkritik CO2’de incelenmesi,
Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, 2003.
5. Kuebrich, J. P.,Schowen, R. L., 1971. J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 1220.
6. Queseda, M. L.,Schlessinger, R. H., Parsons, W. H. J. Organic Chemistry, 1978, 43; 3968.
32
6. Ekler
Ek 1. Hizmet alımı
Ek 2. Bildiriler
Ek 3. Yayınlar
33
Ek 1. Hizmet Alımı
Hizmet Alımı:
Analizler için 5000 YTL talep edilmiş ve HPLC analizleri yaptırılmıştır.
34
Ek. 2. Bildiriler
Uluslararası
-Yildiz N, Çelebi, Demir A. S., Calimli A., ''Chiral Synthesis of Benzoin in
Supercritical Fluid'' 1 st International IUPAC Conference in Green Sustainable
Chemistry, Dresden, Germany September 10-15, 2006
Ulusal
- Çelebi N, Yıldız N, Demir A.S, Çalımlı A., ''Süperkritik Akışkan Ortamında
Benzoinin Enzimatik Sentezine İşletme Parametrelerinin Etkisi'' UKMK-7 Yedinci
Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi Anadolu Üniversitesi, Eskişehir (2006)
35
Chiral Synthesis of Benzoin in Supercritical Fluid
Yildiz, N., Faculty of Engineering, Department of Chemical Engineering, 06100,
Tandogan, Ankara, Turkey, Celebi, N., Ankara/Turkey, Calimli, A.,Ankara/Turkey
Enzymes are used as chiral catalysis because of their high selectivity. The biological
effect of chiral compounds is dependent one of the enantiomers, so it is important to
produce in enantiomerically pure form. The resolution of enantiomers by
enantioselective synthesis with enzymes has been exploited extensively for twenty
years. Especial interest in the use of lipases as synthetic chiral catalyst has risen rapidly.
Because of their ability to catalyze reactions, in organic as well as in aqueous systems,
lipases lead to the enantioselective synthesis of wide variety of compounds via
hydrolysis, esterification and transesterification (2).
The first report on the enzyme catalyzed reactions in supercritical fluids was in 1985
(1). Manipulating the physical properties of the solvent by changing pressure or
temperature distinguishes supercritical fluid from conventional solvents (3). Especially
carbon dioxide is the most favorite among fluids, because it is non-toxic, nonflammable,
non-expensive and safe and also its critical temperature and pressure is suitable for
thermally unstable compounds.
Chiral α–hydroxy ketones are important structural units in many biologically active
compounds and they are versatile building blocks in asymmetric synthesis. Benzoin is
one of the important α–hydroxy ketones. In this work, the enzymatic hydrolysis of
chiral benzoin from racemic benzoyl benzoin to obtain with high enantiomeric excess
was investigated. It is the first study to synthesize benzoin in SCCO2 media.
Enantioselective enzymatic hydrolysis of benzoyl-benzoin catalyzed by Candida
cylindracea (CCL) lipase has been carried out in SCCO2. It was found that CCL lipase
enantioselectively hydrolyzed the (R)-benzoin. The enantiomeric excess of product (eep)
was maximized at 35 °C near critical region 90 bar and obtained 61.3 % at 50 %
conversion. CCL was not catalyzed the reaction at atmospheric condition.
Literature
[1] (a) Hammond D. A., Karel M., Klibanov A. M. and Krukonis V. J Appl. Biochem.
Biotech. 1985, 11(5) 393. (b) Nakamura K., Chi Y. M., Yamada Y. and Yano T.,Eng.
Commun. 1985, 45, 207. (c) Randolph T., Blanch W. H., Prausnitz J. M. and Wilke C.
R., Biotech. Lett. 1985, 7(5) 325. [2] . Mase N., Sako T., Horikawa Y. and Takabe
K.,Tetrahedron Letters 2003, 44, 5175. [3] Matsuda T., Watanabe K., Harada T and
Nakamura K., Catalysis Today 2004, 96, 103.
36
SÜPERKRİTİK AKIŞKAN ORTAMINDA BENZOİNİN ENZİMATİK
SENTEZİNE İŞLETME PARAMETRELERİNİN ETKİSİ
NURAY ÇELEBİ1, NURAY YILDIZ2, AYHAN S. DEMİR3, AYLA ÇALIMLI2
1
2
Başkent Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, 06530, Ankara, Türkiye
Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü,
06100, Tandoğan, Ankara, Türkiye
3
Ortadoğu Teknik Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, 06531, Ankara, Türkiye
GİRİŞ
Süperkritik akışkan (SKA) ortamında biyokatalizörler üzerine yapılan araştırmalar çok
değişik enzimlerin bu ortamda katalitik olarak aktif olduklarını göstermiştir.
Süperkritik karbon dioksit (SCCO2) ortamında lipaz enzimi kullanılarak esterifikasyon
(1-3), hidroliz (4) alkoliz (5, 6) tepkimeleri genellikle kesikli sistemlerde
gerçekleştirilmiştir. Bu tepkimelerdeki enontiyomerik aşırılık % 70-99 arasında
değişmektedir. Bu araştırmalar lipaz enziminin SCCO2 ortamında yaygın olarak
kullanılabileceğini göstermektedir.
Biyolojik olarak aktif bileşiklerin sentezinde kullanılan kiral hidroksi ketonlar değerli
ara ürünlerdir. Farmasötik uygulamalarda kiral hidroksi ketonlar özellikle
antibakteriyel ve antiviral özeliği nedeniyle antibiyotik sentezinde ara ürünlerdir.
Ayrıca bu ürünler antidepresif ve kalp ilaçlarının sentezinde de önemli girdi
maddeleridir. Süperkritik akışkan ortamında benzoinin sentezi ile ilgili süreli yayınlarda
araştırma bulunmamaktadır. Bu çalışmada SKA ortamında bir kiral hidroksi keton olan
benzoinin yüksek enantiyoseçimli sentezi için uygun işletim koşulları incelenmiştir.
37
YÖNTEM
SCCO2 ortamında benzoin sentezi ISCO marka SFX 220 model süperkritik akışkan
ekstraksiyon/ tepkime cihazı ile yapılmıştır. Başlangıç maddesi olarak benzoil-benzoin
kullanılmış ve tepkime basıncı ve sıcaklığının enantiyomerik aşırılığa etkisi
incelenmiştir. Tepkimede dönüşüm , ince tabaka kromatografisi ile kontrol edilmiş,
enantiyomerik aşırılık ise HPLC’de belirlenmiştir.
SONUÇ
Benzoil-Benzoin’den Süperkritik akışkan (SKA) ortamında benzoin sentezi candida
cylindracea lipaz enzimi ile farklı sıcaklık (35-45 ºC) ve basınçta (70-90 bar)
gerçekleştirilmiştir. 10 ticari lipaz enzimi ile dönüşüme göre tarama yapılmış, bunlardan
dört tanesinin (porcine pancreas, candida antarctica, aspergillus ve candida
cylindracea) tepkimeyi katalizlelediği, diğerlerinin ise (pseudomonas cepacia, rhizopus
niveus, rhizopus arrhizus, mucor miehei, pseudomonas florescens ve hog pancreas)
ürün oluşturmadığı belirlenmiştir. Tepkimeyi katalizleyen dört enzim içinde en hızlı
tepkime candida cylindracea ile elde edildiğinden sıcaklık ve basınç etkisi candida
cylindracea ile incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, SKA ortamda enantiyoseçimliliğin
basınç ve sıcaklığa bağlı olduğunu göstermiştir. En yüksek enantiyomerik aşırılık değeri
35 °C sıcaklık ve 90 bar basınçta % 61,3 olarak bulunmuştur.
TEŞEKKÜR
Çalışmaya katkılarından dolayı TÜBİTAK (Proje No: 104T352) ve Ankara Üniversitesi
Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğüne (Proje No: 20050745014HDP) teşekkür
ederiz.
38
KAYNAKLAR
1. Martins ,J.F., Carvalho, I.B., Sampaio, T.C. and Barreiros, S.,1994. Lipase-Catalyzed
Enontioselective Esterification of Glycidol in Supercritical Carbon Dioxide. Enzyme
Microb.Technol., 16; 785-790.
2. Ikushima, Y., Saito, N. and Yokoyama, T. 1993. Solvents effects on an enzymatic
ester synthesis in supercritical carbon dioxide. Chemistry Letters, 109-112.
3. Rantakyla, M. and Aaltonen, O. 1994. Enantioselective esterification of ibuprofen in
supercritical carbon dioxide. Biotechnology Letters, 16 (8); 825-830.
4. Rantakyla, M., Alkio, M. and Aaltonen O. 1996. Stereospecific hydrolysis of 3-(4methoxyphenyl)glycidic ester in supercritical carbon dioxide by immobilized lipase.
Biotechnology Letters, 18 (9); 1089-1094.
5. Michor, H., Marr, R., Gamse, T., Schilling, T., Klingsbicheh, E., Schwab, H., 1996.
Enzymatic Catalysis in Supercritical Carbon Dioxide: Comparison of Different Lipases
and a Novel Esterase. Biotechnol. Lett., (18); 79-84.
6. Cernia, E., Palocci, C., Gasparrini, F., Misiti, D. and Fagnano, N. 1994.
Enantioselectivity and reactivity of immobilized lipase in supercritical carbon dioxide.
Journal of Molecular Catalysis, 89; L11-L18.
39
Ek 3. Yayınlar (Science Citation Index (SCI) Kapsamında)
1.Celebi, N.,Yildiz, N., Demir, A.S., Calımlı, A., Enzymatic Synthesis of Benzoin in
Supercritical Carbondioxide, Journal of Supercritical Fluids (in press, 15 December 2006
40
ENZYMATIC SYNTHESIS OF BENZOIN IN SUPERCRITICAL
CARBON DIOXIDE
Nuray Celebia, *Nuray Yildizb, Ayhan S. Demirc, Ayla Calımlıb
a
Baskent University, Faculty of Engineering, 06530, Ankara, Turkey
b
Ankara University, Faculty of Engineering, Department of Chemical
Engineering, 06100, Tandogan, Ankara, Turkey
c
Middle East Technical University, Faculty of Arts and Sciences,
Department of Chemistry, 06531, Ankara, Turkey
*
Correspondence should be addressed to:
Ankara University, Faculty of Engineering,
Department of Chemical Engineering, 06100, Tandoğan, Ankara, Turkey
Tel.: +90 (312) 2126725
Fax: +90 (312) 2121546
E-mail: nyildiz@eng.ankara.edu.tr
41
Abstract
Enantioselective enzymatic hydrolysis of benzoyl-benzoin catalyzed by Candida
cylindracea (CCL) lipase was carried out in SCCO2. It was found that CCL lipase
enantioselectively hydrolyzed the (R)-benzoin. The enantiomeric excess of product (eep)
was maximized at 35°C near the critical region 90 bar and obtained 61.3 % at a 50%
conversion. CCL did not catalyze the reaction in an atmospherical condition.
Author Keywords: Supercritical carbondioxide, Candida cylindracea (CCL),
Enantiomeric excess (ee), Benzoin, Enantioselectivity
Article Outline
1. Introduction
2. Experimental
2.1. Materials
2.2 Methods
2.2.1 Starting Material Preparation
2.2.2 Analysis
2.2.3 Screening of Lipases
2.2.4 Reaction in SCCO2
2.2.5 Enzyme Stability in SCCO2
3. Results and Discussion
3.1 Effect of pressure with candida cylindracea
3.2 Effect of temperature with candida cylindracea
4. Conclusions
42
1. Introduction
Supercritical fluids (SCF) are those compounds that exist at a temperature and pressure
that are above their corresponding critical values. Their physical properties make them
very attractive for biocatalytic processes. They exhibit low surface tension and viscosity
and high diffusivity that is comparable to gases. On the other hand, they show liquid
like density, which promotes the enhanced solubility of solutes compared to the
solubility of gases. The most important characteristic is that the solubility of solutes can
be manipulated by changes in pressure and temperature, especially near the critical
point (1). While the supercritical fluids have been used mainly for extractions, the
application of this medium to other processes such as chromatography, polymer coating,
encapsulation of nanoparticles, chemical and enzymatic reactions have been extensively
explored (2).
Today, enzymes are widely used in pharmacology, and the food, and detergent
industries. Therefore, the number of publications of enzymatic organic synthesis
increased rapidly over the last few decades (3). Enzymes are used as chiral catalysts
because of their high selectivity. The biological effect of chiral compounds is dependent
on one enantiomer, to where it is important to produce in an enantiomerically pure
form. The resolution of enantiomers by enantioselective synthesis with enzymes has
been exploited extensively for twenty years. Special interest in the use of lipases as
synthetic chiral catalyst has increased rapidly. Because of their ability to catalyze
reactions, in organic as well as in aqueous systems, lipases lead to the enantioselective
synthesis of a wide variety of compounds via hydrolysis, esterification, and
transesterification (4).
43
The first report on the enzyme catalyzed reactions in supercritical fluids was published
in 1985 (5). Manipulating the physical properties of the solvent by changing the
pressure or temperature distinguishes supercritical fluid from conventional solvents (2).
Carbon dioxide is especially favored among fluids, because it is non-toxic,
nonflammable, inexpensive, and safe, also in which its critical temperature and pressure
are suitable for thermally unstable compounds. The enzymes employed in most of the
work involving supercritical fluids, and more specifically, carbon dioxide, are lipases
(6). Advantages of using supercritical fluids in enzymatic reactions are as follows: i)
increasing the rate of mass transfer, ii) simple separation of the product iii)
environmentally benign reaction media (7). SCCO2 can replace the commonly used
nonpolar organic solvents in organic synthesis (3). With respect to enantioselectivity,
most of the literature investigated enzymatic reactions that had shown high
enantioselectivity in conventional organic media. An advantage from using supercritical
fluid for enantioselectivity has not yet been clarified (8).
Generally only one enantiomer of chiral compounds has the desired biological activity.
The biologically inactive enantiomer may cause unwanted side effects.
Chiral α-
hydroxy ketones especially benzoins are important structural units in many biologically
active compounds and they are versatile building blocks in asymmetric synthesis (9). It
is important to obtain enantiopure benzoin from racemic benzoyl-benzoin. In this work,
the enzymatic synthesis of chiral benzoin in high enantiomeric excess from racemic
benzoyl benzoin was investigated (Figure 1). In the next step we will apply the results
to the unsymmetrical benzoins to develop a method for enantioselective synthesis of
unsymmetrical benzoins. Because there is
no convenient method for the
enantioselective synthesis of unsymmetrical benzoins. It is the first study to synthesize
benzoin in SCCO2 media.
44
2. Experimental
2.1 Materials
Porcine pancreatic lipase (PPL) was purchased from Merck (60 U/mg). Lipase basic kit was
supplied from Fluka. It contained Pseudomonas cepacia lipase (40 U/mg), Candida cylindracea
lipase (CCL) (2.8 U/mg), Rhizopus niveus lipase (1.7 U/mg), Aspergillus lipase (0.94 U/mg),
Mucor miehei lipase (1.4 U/mg), Hog pancreas lipase (23.9 U/mg), Candida antarctica lipase
(2.7 U/mg), Pseudomonas florescens lipase (36 U/mg), Rhizopus arrhizus lipase (2.2 U/mg).
Other chemicals were obtained from Merck.
2.2. Methods
2.2.1 Starting Material Preparation
Racemic benzoyl-benzoin was synthesized according to the literature (10). 1,050 mg benzil and
481 µL benzaldehyde were dissolved in 3 mL dimethyl formamide (DMF) and 66 mg KCN was
added to this solution. Then, benzoyl-benzoin formation was monitored with thin layer
chromatography (TLC) analysis. Benzoyl-benzoin was isolated from the impurities with
preparative column chromatography on silica gel 60 (mesh size 40-63 µm).
2.2.2 Analysis
TLC was carried out on aluminum sheets precoated with silica gel 60F254 (Merck) and the spots
were visualized with UV light (λ=254 nm). Enantiomeric excess was determined by HPLC
analysis. The column was applied from Daicel industries type Chiralcel OD (0,46 cmx 25 cm).
The compounds were detected with a UV-detector at 254 nm. The column was operated at room
temperature. The mobile phase was n-hexane/2-propanol (9:1 v/v). The flow rate was set to 0.8
mL/min, and the injection volume was 10 µL.
45
2.2.3. Screening of Lipases
In a screening test, ten commercially available lipases were studied. The aim for this screening
was to obtain enzymes with high benzoin enantiomeric excess. It was determined that four of
them, Porcine pancreas, Candida antarctica, Aspergillus, and Candida cylindracea catalyzed
the reaction and the others, Pseudomonas florescens, Hog pacreas, Mucor miehei, Rhizopus
niveus, Pseudomonas cepacia, and Rhizopus arrhizus could not produce the benzoin. In the
experiments, 10 mg benzoyl- benzoin was put into a 0.6 mL DMSO, and 10 mg lipase enzyme
was added to 4 mL potassium phosphate buffer (50 mM, pH=7). The enzyme and substrate
solution were mixed in SCCO2 at 35°C and 90 bar afterwards. As is shown in Table 1, the best
result was achieved with the CCL lipase. After 90 min, a 50% conversion with an enantiomeric
excess of 61.3% was accomplished for CCL. In a comparable experiment a long reaction time
of approx. 12 h was obtained with only 14.0% enantiomeric excess of benzoin with Porcine
pancreas lipase. Enantiomeric excess values for benzoin with Aspergillus and Candida
antarctica were 29.5% with a 4 h reaction time and 33.1% at 50% conversion with a 9 h
reaction time, respectively, at the same temperature and pressure. Therefore, Aspergillus and
Candida antarctica were not suitable for the optimization experiments in SSCO2. The (S)enantiomer reacted faster than the (R)-enantiomer, affording (S)-benzoin when PPL and
Candida antarctica lipase. The (R)-enantiomer reacted faster than the (S)-enantiomer forming
the (S)-benzoin. The results are shown in Table 1.
2.2.4 Reaction in SCCO2
The Enantioselective hydrolysis of benzoyl-benzoin was performed in a supercritical fluid batch
reactor. The scheme of the SCCO2 reactor is shown in Fig 2. It consists of a reactor with an
internal volume of 10 mL, 690 bar maximum pressure and 150°C maximum temperature,
controlled by a thermostat. The system consisted of two high-pressure syringe pumps (100 DX
model, Isco Inc. Lincoln, NE, USA), a reactor (2.5.10-6 m3), a controller unit (SXF Controller,
Isco Inc., Lincoln, NE, USA) and an adjustable flow rate restrictor (Restrictor Temperature
46
Controller, Isco Inc., Lincoln, NE, USA). Experiments were undertaken in the absence of a cosolvent with CCL at pressures of 70, 80, 90, 100, and 120 bar and at temperatures of 35, 40, and
45°C. 30 mg racemic benzoyl-benzoin and 30 mg enzyme were dissolved in 2 mL DMSO
(Dimethyl sulfoxide) and 8 mL potassium phosphate buffer (50 mM pH=7) respectively, and
then mixed and put into the 10 mL SCF reactor. The reaction mixture was extracted with ethyl
acetate in order to separate the benzoin and benzoyl-benzoin. Progress of the reaction was
followed by careful monitoring with TLC analysis up to a 50% conversion.
2.2.5 Enzyme Stability in SCCO2
The enzyme activity of candida cylindracea was tested at different temperatures (35-45ºC) at 90
bar, and 90 min incubation time in SCCO2. The activity was measured by employing
esterification oleic acid and oleil alcohol with titration (11). Experiments were carried out with
enzyme/substrate (w/w): 1.5% and acid/alcohol mol ratio 1.33/1 at 50ºC. The velocity of the
stirrer was 200 rpm. At given conditions, oleil alcohol, oleic acid, and Candida cylindracea
were mixed and after 90 min a sample was taken from the reaction mixture and titrated with 0.1
N NaOH.
3. Results and Discussion
3.1 The effect of pressure with candida cylindracea
The effect of pressure on enantiomeric excess (ee) was investigated between 70 bar and 90 bar
at the temperatures 35ºC, 40ºC, and 45ºC (Table 2). The pressure effect on ee was also
investigated up to 150 bar at 35ºC. Enantiomeric excess increased by increasing pressure at the
temperatures 35°C and 40°C, while it decreased by increasing pressure at 45°C. First, the
enantiomeric excess increased with increasing pressure at 35ºC, and a maximum of
47
enantiomeric excess 61.3% was achieved at 90 bar. Afterwards, the enantiomeric excess
decreased as is shown in Fig 3.
It noteworthy to mention that pressurized SCCO2 would affect the structure of the enzyme,
changing its specific activity. The interactions between CO2 and enzyme molecules, near the
critical region, are increased and enabled to stimulate conformational changes of the enzyme.
As a result of this interaction, active sites of enzyme appear and catalyze the enantioselective
synthesis of benzoin up to 90 bar pressure. Above 100 bar, enantioseletivity decreases because
of the formation of carbamates that in turn brings about the inactivation of the enzyme.
Similar changes were found by other researchers (12). They studied secondary structures of an
enzyme in SCCO2 and interactions operating between carbon dioxide and enzyme molecules. It
was found that a SCCO2 medium in the near critical region should be a trigger to the activation
of the enzyme by causing the movement of surface groups and creating an active site, producing
stereoselective machinery. In a corresponding manner, the other authors stated that
enantioselectivity depended on the pressure in the enzymatic hydrolysis of 3-hydroxy-5-phenyl4-pentenoicacidethylester (3). Enantioselectivity increased with pressure and a 103 bar
maximum value was reached. Afterwards, the enantioselectivity decreased with pressure. They
thought that above 103 bar the enantioselectivity decreased indicating a direct inactivation of
the enzyme by formation of carbamates. The formation of carbamates leads to the inactivation
of enzyme. These effects predominated at a pressure above 103 bar. Similarly, the esterification
of trifluoromethyl alcohol by lipase was examined (2) and it was found that at 55ºC,
enantioselectivity decreased when the pressure (8-19 MPa) increased. They proposed that the
large change in density could significantly change the interaction of CO2 and enzyme, causing
the formation of carbamates from carbon dioxide and free amine groups on the surface of the
enzyme. These interactions may change the conformation of the enzyme in response to pressure.
48
In order to compare enantoselectivity in SCCO2 and atmospheric pressure, the reaction was also
performed at atmospheric condition without CO2. With CCL the catalysis in the SCCO2 shows
better results with respect to atmospheric pressure in which benzoin was not obtained.
Therefore, it was thought that SCCO2 could provide a suitable approach for enantioselective
preparation of chiral compounds.
Rantakyla and Aaltonen studied the enantioselective esterification of racemic ibuprofen
with n-propanol by immobilized Mucor miehei lipase in SCCO2 (13). The observation
in the variation of the enantioselectivity by changing the pressure is in contrast to the
case for benzoyl-benzoin hydrolysis, in which they found that enantiomeric excess was
unaffected by pressure changes. These contrary results are probably due to the enzyme
activity that may change during the reaction.
Contrary results were also described by Mase (4). They performed lipase catalyzed
asymmetrization of 1,3-propanediacetate. The effect of pressure was examined at a
constant temperature.
Enantioselectivity was found to be slightly dependent on
pressure.
As shown in literature studies, it is generally complicated to find a common rule to
identify how pressure affects the enantioselectivity of chiral compounds. As a result, it
may be said that the effect of pressure on enantioselectivity changes depending on the
reaction conditions such as substrate, temperature, enzyme and pressure.
3.2 Effect of temperature with candida cylindracea
The temperature effect was studied between 35-45ºC and at pressures between 70-90 bar (Table
2). Enantiomeric excess decreased with increasing temperature at 80 and 90 bar, in which there
was no change in temperature at 70 bar. The decreasing enzyme stability at higher temperatures
may cause a decrease in enantiomeric excess values (Table 3). Similar changes were found by
49
other researchers (13). They studied the esterification of racemic ibuprofen with n-propanol by
lipase and found that the reaction rate and enantiomeric excess were at 50ºC maximally while
they decreased steeply above 50ºC.
4. Conclusions
*Benzoin was synthesized enantioselectively with the hydrolysis of benzoyl-benzoin in SCCO2.
The best enantiomeric excess obtained was 61.3% at 35ºC temperature and 90 bar pressure. It is
important to see that benzoin can be synthesized with candida cylindracea stereoselectively in
SCCO2. It is clear that SCCO2 can provide a good approach for the enantioselective preparation
of chiral compounds compared to atmospheric pressure.
Acknowledgment
The financial support of the Scientific and Technical Research Council of Turkey (TUBITAK,
Project no: 104 T 352) and Ankara University Scientific Research Project (BAP, Project no:
20050745014HPD) are gratefully acknowledged.
REFERENCES
1. M. Vermue and J. Tramper,
Chemistry, 67 (1995) 345-373.
Biocatalysis in non-conventional media, Applied
2. T. Matsuda, K. Watanabe, T. Harada and K. Nakamura, Enzymatic reactions in
supercritical CO2: carboxylation, asymmetric reduction and esterification, Catalysis
Today 96 (2004) 103-111.
3. T. Hartmann, H. Meyer and T. Scheper, The enantioselective hydrolysis of 3-hydroxy-5phenyl-4-pentenoicacidethylester in supercritical carbon dioxide using lipases, Enzyme and
Microbial Technology 28 (2001) 653-660
4. N. Mase, T. Sako, Y. Horikawa and K. Takabe, Novel strategic lipase catalyzed
asymmetrizationof 1,3-propanediacetate in supercritical carbon dioxide, Tetrahedron
Letters 44 (2003) 5175-5178.
50
5. (a) D. A. Hammond, M. Karel, A. M. Klibanov and V. J. Krukonis, Enzymatic
reactions in supercritical gases. Appl. Biochem. Biotech. 11 5 (1985) 393-400.
(b) K. Nakamura, Y. M. Chi, Y. Yamada and T. Yano, Lipase activity and stability in
supercritical carbon dioxide, Chem. Eng. Commun. 45 (1985) 207-212.
(c) T. Randolph, W. H. Blanch, J. M. Prausnitz, C. R. Wilke,
supercritical fluid, Biotech. Lett. 7 5 (1985) 325-328.
Enzymatic catalysis in
6.A. J. Mesiano, E. J. Beckman and A. J. Russell, Supercritical Biocatalysis, Chem.
Rev. 99 (1999) 623-633.
7.G. Glowacz, M. Bariszlovich, M. Linke, P. Richter, C. Funchs and J. T. Mörsel,
Stereoselectivity of lipases in supercritical carbon dioxide. I. Dependence of the regioand enantioselectivity of porcine pancreas lipase on the water content during the
hydrolysis of triolein and its partial glycerides, Chemistry and Physics of Lipids 79
(1996) 101-106.
8. T. Matsuda, R. Kanamaru, K. Watanabe, T. Kamitanaka, T. Harada and K.
Nakamura, Control of enantioselectivityof lipase catalyzed esterification in supercritical
carbon dioxide by tuning the pressure and temperature, Tetrahedron: Asymmetry 14
(2003) 2087-2091.
9. A. S. Demir, O. Sesenoğlu, A new and efficient chemoenzymatic route to Both
enantiomers of 4-hydroxycyclohex-2-en-1-one, Organic Letters, 4 12 (2002), 20212023
10. J. P. Kuebrich and R. L. Schowen, J. Am. Chem. Soc. 93 (1971) 1220
11. N. Kapucu, Lipase catalyzed ester production in supercritical carbon dioxide, Ph.D.
Thesis, Ankara University, 2003.
12. Y. Ikushima, N. Saito, M. Arai and H. W. Blanch, Activation of a lipase triggered by
interactions with supercritical carbon dioxide in the near critical region, Physical
Chemistry 99 22 (1995) 8941-8944.
13. M. Rantakyla and O. Aaltonen, Enantioselective esterification of ibuprofen in supercritical
carbon dioxide by immobilized lipase,16 8 (1994) 825-830.
51
LIST of FIGURES
Figure 1. Reaction scheme of the enantioselective hydrolysis of benzoyl-benzoin.
Figure 2. Experimental system for the synthesis of benzoin from benzoyl-benzoin.
Figure 3. Enantiomeric excess as a function of pressure at 35 °C.
52
O
O
OH
O
CCL
O
Buffer
+
+ C6H5COOH
O
Benzoic acid
O
Rac-Benzoyl-benzoin
R-Benzoin
O
Benzoyl-benzoin
Figure 1. Reaction scheme of the enantioselective hydrolysis of benzoyl-benzoin.
53
Figure 2. Experimental system for the synthesis of benzoin from benzoyl-benzoin.
54
70
Enantiomeric excess (%)
60
50
40
30
20
10
0
60
80
100
120
140
160
180
Pressure (bar)
Figure 3. Enantiomeric excess as a function of pressure at 35 °C.
55
LIST of TABLE LEGENDS
Table 1. Screening of lipases for enantioselective hydrolysis of benzoyl-benzoin in
SCCO2 at 90 bar, 35 ºC
Table 2. Pressure and temperature effect for enantiomeric excess
Table 3. Effect of temperature on lipase activity at 90 bar (incubation time 90 min)
Table 1. Screening of lipases for enantioselective hydrolysis
of benzoyl-benzoin in SCCO2 at 90 bar, 35 ºC
56
Enzyme
Porcine pancreas
Candida antarctica
Aspergillus
Candida cylindracea
Conversion
(%)
50
50
50
50
eep (%)
14.0 (S)
33.1 (S)
29.5 (R)
61.3 (R)
ee = (moles of major enantiomer - moles of other enantiomer / total moles of both
enantiomers)*100
Table 2. Pressure and temperature effect for enantiomeric excess
Temperature (ºC)
Pressure (bar)
70
eep (%)
46,6
57
35
40
45
80
90
46.7
61.3
70
80
90
70
80
90
46,5
42.6
43.3
44,3
24.3
19.8
Table 3. Effect of temperature on lipase activity at 90 bar (incubation time 90 min)
58
T (ºC)
Activitiy (mol ester/g enzyme)
35
0.0498
40
0.0398
45
0.0375
59
YAYINEVİNDEN GELEN KABUL YAZISI
Online : (www.sciencedirect.com)
----- Original Message ----From: "Author Gateway" <authorsupport@elsevier.com>
To: <Nuray.Yildiz@eng.ankara.edu.tr>
Sent: Tuesday, December 19, 2006 12:35 PM
Subject: Article tracking [SUPFLU_1309]
> Article title: ENZYMATIC SYNTHESIS OF BENZOIN IN SUPERCRITICAL CARBON
> DIOXIDE
> Reference: SUPFLU1309
> Journal title: The Journal of Supercritical Fluids
> Corresponding author: Dr Nuray Yildiz
> First author: Dr. Nuray Celebi
> Received at Editorial Office: 21-MAR-2006
> Article revised: 6-NOV-2006
> Article accepted for publication: 15-DEC-2006
> Expected dispatch of proofs: 12-JAN-2007
>
> Author Gateway article tracking service from Elsevier
>
> The expected dispatch date of your proofs will be 12-JAN-2007. Please note
> this date is only provided as a guide: it may change due to delays in the
> production process.
>
> When you receive the proofs please use it to check the typesetting and
> editing, also the completeness and correctness of the text, tables and
> figures. Changes to the article as accepted for publication will not be
> considered. You may also be asked to validate any questions that have
> arisen during the preparation of your proofs and these are included in a
> "query form" which is sent along with the proofs.
>
> More detailed information will follow when you receive the proofs.
>
> -------------------------------------------------------------------->
> This e-mail has been sent to you from Elsevier Limited, The Boulevard,
60
> Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, United Kingdom. To ensure
> delivery to your inbox (not bulk or junk folders), please add
> authorsupport@elsevier.com to your address book or safe senders list.
>
> For all enquiries, problems or suggestions regarding this service, please
> contact mailto:authorsupport@elsevier.com.
>
> Copyright (c) 2006 Elsevier Limited. All rights reserved. Please read our
> privacy policy at http://authors.elsevier.com/privacypolicy.
>
> [T-16-v5.3.1]
>
61