SENDROMSUZ DUDAK DAMAK YARIKLI TÜRK HASTALARDA
advertisement
SENDROMSUZ DUDAK DAMAK YARIKLI TÜRK HASTALARDA, MSX1 GEN P278S POLİMORFİZMİNİN BELİRLENMESİ Tuba AKSOYLU YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ŞUBAT 2013 ANKARA Tuba AKSOYLU tarafından hazırlanan “SENDROMSUZ DUDAK DAMAK YARIKLI TÜRK HASTALARDA, MSX1 GEN P278S POLİMORFİZMİNİN BELİRLENMESİ” adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Hakkı TAŞTAN .……….……………………. Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Evrim Arzu KOÇKAYA ….…….……………………. Sağlık Hizmetleri MYO Tıb. Lab. Tek. Programı, G.Ü. Prof. Dr. Hakkı TAŞTAN .……….……………………. Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü. Prof. Dr. Şule COŞKUN CEVHER .……….……………………. Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü. Tez Savunma Tarihi: 12/02/2013 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü ....…….……………………. TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Tuba AKSOYLU iv SENDROMSUZ DUDAK DAMAK YARIKLI TÜRK HASTALARDA, MSX1 GEN P278S POLİMORFİZMİNİN BELİRLENMESİ (Yüksek Lisans Tezi) Tuba AKSOYLU GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Şubat 2013 ÖZET Yarık dudak ve/veya damak en yaygın doğum kusurlarından biridir. Bu anomali genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimi ile meydana gelir. Genetik faktörlerin başında embriyonik gelişim sırasında yer alan MSX1 gibi genler gelmektedir. Biz bu çalışmada; sendromsuz dudak damak yarığının, hastalarda ortaya çıkmasında; aday olan gen ve bölgelerin bazı mutasyon analizlerini yaparak; incelenecek genin dudak damak yarığı oluşumu üzerindeki riskte etkili olup olmadığının ortaya konulmasını ve daha sonra yapılacak araştırmalara da katkı sağlamasını amaçladık. Çalışmamızda kullanılan kan örnekleri, Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi’ne başvuran sendromsuz dudak damak yarıklı Türk hastalardan gönüllü onam formları imzalatılarak elde edilmiştir. Hastalardan alınan periferal kan örneklerinden Fenol-kloroform yöntemiyle genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. MSX1 geni üzerinde P278S polimorfizmini belirleyecek polimeraz zincir reaksiyonu yapılmıştır. Elde edilen polimeraz zincir reaksiyonu ürünlerine; RFLP metodu uygulanmıştır. RFLP metoduyla çalışılan örneklerde P278S mutasyonunu belirleyecek olan restriksiyon endonükleazlar kullanılarak gen ürünlerinin kesimi yapılmıştır. Bu enzim kesim ürünlerinin %2’lik agaroz jelde elektroforezleri yapılmıştır ve jel görüntüleme cihazında fotoğrafları çekilmiştir. Çalışma grubuna alınan sendromsuz dudak damak v yarıklı hastalarda, MSX1 geninde P278S değişimleri moleküler yöntemlerle ortaya konulmuştur ve elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. İstatistiksel analiz için Pearson Ki-Kare testi ve Hardy-Weinberg Equilibrium testi kullanılmıştır. Bu testlere göre, MSX1 genindeki P278S polimorfizmi için herhangi bir anlamlı fark saptanmamıştır. Bilim Kodu : 203.1.104 Anahtar Kelimeler : Dudak yarığı, damak yarığı, sendromsuz dudak yarığı ve/veya damak yarığı, PCR-RFLP, DNA, mutasyon, polimorfizm Sayfa Adedi : 66 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Hakkı TAŞTAN vi DETERMINATION OF MSX1 GENE WHICH IS P278S POLYMORPHISM IN TURKISH PATIENTS WITH NONSYNDROMIC CLEFT LIP AND/OR PALATE (M.Sc. Thesis) Tuba AKSOYLU GAZİ UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY February 2013 ABSTRACT Cleft lip and/or cleft palate is one of the most common congenital malformation. This abnormality arise both with the combination of genetic and environmental factors. Genetic factors are the genes like MSX1, which takes place during embryological development. In this study, we planned to evaluate the effect of the candidate gene and regions on the incidence of nonsyndromic cleft lip-palate by mutation analyzes, therefore reveal the risks of the development of the nonsyndromic cleft lip-palate and contribute the oncoming studies. The blood samples used in our study, were obtained with signed voluntary consent forms from Turkish patients with nonsyndromic cleft lip/palate admitted to Ankara University Faculty of Dentistry. Genomic DNA was isolated with phenol-chloroform method from peripheral blood samples from the patients. Polymerase chain reaction method was used to determine P278S polymorphism on MSX1 gene. RFLP method was applied to the polymerase chain reaction products. Restriction Endonuclease enzymes were used to cut the gene into fragments to determine P278S mutation in the samples. These gene fragments were analyzed with %2 agarose gel electrophoresis and photos were taken in gel imaging device. In patients with nonsyndromic cleft lip/palate received the study group, P278S changes in MSX1 gene were revealed by vii molecular methods and the datas which were obtained were evaluated statistically. For statistical analysis, Pearson chi-square test and HardyWeinberg Equilibrium test were used. According to these tests, no significant difference was observed for P278S polymorphism in MSX1 gene. Science Code : 203.1.104 Key Words : Cleft lip, cleft palate, nonsyndromic cleft lip and/or palate, PCR-RFLP, DNA, mutation, polimorphism Page Number : 66 Adviser : Prof. Dr. Hakkı TAŞTAN viii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca gerek ders aşamasında gerekse tez çalışmam boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren danışman hocam Prof. Dr. Hakkı TAŞTAN’a, istatistiksel değerlendirmelerdeki katkılarından dolayı Arş. Gör. Mehmet Güray ÜNSAL’a ve Zeynep BIYIKLI’ya, manevi destekleriyle beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan çok değerli aileme ve arkadaşlarıma teşekkürü bir borç bilirim. ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.......................................................................................................................... iv ABSTRACT................................................................................................................vi TEŞEKKÜR............................................................................................................. viii İÇİNDEKİLER........................................................................................................... ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ……….......................................................……………...xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ………………………………….........................................xii RESİMLERİN LİSTESİ .......................................................................................... xiii SİMGELER VE KISALTMALAR.......................................................................... xiv 1. GİRİŞ...………........................................................................................................ 1 2. GENEL BİLGİLER…………………………………………..……………………3 2.1. Dudak ve Damak Yarıklarının Sınıflandırılması……………………………...3 2.2. Dudak Damak Yarıklarının Epidemiyolojisi………………………………….4 2.3. Dudak ve Damak Embriyolojik Gelişimi……………...……………………...5 2.4. Nonsendromik Dudak/Damak Yarıklarında Çevrenin Rolü ………………...10 . 2.5. Nonsendromik Dudak/Damak Yarıklarında Genlerin Rolü……………...….17 2.6. Msx1 Geninin Dudak/ Damak Yarığı Oluşumundaki Rolü……………….…20 2.6.1. Msx1 geni (OFC5)………………………………………….…………20 2.6.2. Msx1 geninin yapısı……………………………………….…………..22 2.6.3. Msx1 proteini…………………...……………….…….………………22 2.6.4. Msx1 gen ifadesi………………………………………….…………...23 2.6.5. Msx1 geni ve izole DDY……………………………………………...25 2.6.6. P278S polimorfizmi.………...………………………………………...29 x Sayfa 2.7. Gen-Çevre Etkileşimi………………………………………………………...31 2.8. Gen-Gen Etkileşimi……………………………...…………………………..33 3. MATERYAL VE METOD……………………………………………………….36 3.1. Materyal……………………………………………………………………...36 3.2. Metodlar………………………………………………………………...……36 3.2.1. Fenol kloroform yöntemiyle DNA izolasyonu…………………..……36 3.2.2. Polimeraz zincir reaksiyon yöntemi (PCR)…………………………...38 3.2.3. Restriksiyon endonükleazlarla kesim…………………………………39 3.2.4. Agaroz jel elektroforezi……………………………………………….40 3.2.5. İstatistiksel analiz……………………………………………………...40 4. SONUÇ…………………………………………………………………………...42 4.1. Msx1 Geninin Amplifikasyon Sonuçları…………………………………….42 4.2. Msx1 Geninin RFLP Sonuçları…………………………………………..…..43 4.3. Msx1 Geninden Elde Edilen Genotip Sonuçlar ve Ki-Kare Testi………...…45 4.4. Hardy-Weinberg Equilibrium Testi ve Genotip Frekansların Hesaplanması……...……….………………………………………………...46 4.5. Odds Ratio Testi………....….……………………………………………….47 5. TARTIŞMA………………………………………………………………………50 KAYNAKLAR……………………………………………………………………...54 ÖZGEÇMİŞ ...............................................................................................................66 xi ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Hastaların dudak ve damak yarık tiplerine göre dağılımı………….........5 Çizelge 2.2. Dudak-damak yarığında etkili olan aday genlerden birkaçı ve kromozom lokasyonları …………………………………….…………19 Çizelge 2.3. MSX1 genindeki önemli mutasyonlardan bir kısmı…………………...28 Çizelge 2.4. Nonsendromik CL/P’li 100 Taylandlı hastalarda tespit edilen MSX1 varyant bölgeleri……………………….………...29 Çizelge 2.5. Gebelik süresince sigara maruziyetinin gelişimsel genlerden TGFA C2,TGFβ3 X5.1 veya MSX1 N8 üzerindeki etkisi…….……...32 Çizelge 3.1. Msx1 geni amplifikasyonunda kullanılan primerler…………………...39 Çizelge 4.1. Hasta ve kontrol gruplarında heterozigot ve homozigot olguların dağılımı………………………………………………………………...42 Çizelge 4.2. P278S gen bölgesinin Msx1 geni içerisindeki lokalitesi .……………..44 Çizelge 4.3. Restriksiyon endonükleazla kesim sonrasında beklenen tablo………...44 Çizelge 4.4. Msx1 geni kontrol ve hasta gruplarında gözlenen normal ve heterozigot olguların yüzde oranının istatistiksel tablosu…...…..…45 Çizelge 4.5. Pearson Ki-Kare testi………….………..………………………….......46 Çizelge 4.6. Msx1 geni için kontrol ve hasta gruplarındaki P278S değişimi ve allel frekans değerleri…...………..…………..…………………….46 Çizelge 4.7. Hardy-Weinberg Equilibrium için olasılık oran testi………………….47 Çizelge 4.8. Msx1 geni için kontrol ve hasta gruplarındaki P278S değişimi ve genotip frekans değerleri...…....…...…………………………………..47 Çizelge 4.9. Kontrol ve hasta gruplarındaki MSX1 P278S’in genotip ve allel frekans değerleri…….…..…...…..…………………………………….48 xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Yarıkların oluşmasına neden olan çevresel faktörlerden birkaçı…………11 Şekil 2.2. Folik asitin, ağız yarıklarının oluşumu üzerindeki etkisi………………....14 Şekil 2.3. Plazmadaki çinko konsantrasyonunun, ağız yarıklarının oluşumu üzerindeki etkisi……….………………………………………………....15 Şekil 2.4. Maternal sigara maruziyetinin damak dudak yarığı üzerindeki etkisi.…...33 Şekil 4.1. MwoI enziminin tanıdığı dizi ve kesim yeri ……………………………..44 xiii RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 2.1. Damak dudak yarık tipleri ……………………………………………….4 Resim 2.2. Hedgehog sinyal iletimi…………………………………………………..7 Resim 2.3. Palatogenesis sırasında mezenşimal hücre çoğalımının kontrolü için Shh ifadesinde Msx1 ve Dlx5’in antagonistik düzenin şematik gösterimi………………………………………………………...8 Resim 2.4. Damak ve dudak gelişiminin aşamaları, etkin olan genler…………...…10 Resim 2.5. Tespit edilen bazı mutasyonların konumu ile, insan msx1 gen yapısı …22 Resim 2.6. MSX-1HD-DNA kompleksinin çizilen bantı…………………………...23 Resim 2.7. MSX-1’in N-terminal kolunun yörüngesinin üç boyutlu yapısı………...23 Resim 2.8. Hücre döngüsü regülasyonunda MSX fonksiyonu için bir model………24 Resim 2.9. Erken diş hücresinde Ptc ifadesini düzenleyen genetik bir yolak modeli….............…...…………………………………………………...25 Resim 2.10. Msx1 genindeki 799G > T ve 832C > T değişimlerinin mutasyon analizi....…………………………..………………...………….……...31 Resim 2.11. Bugüne kadar tanımlanmış Msx1 genotip-fenotip korelasyonları, etkileşimleri ve mutasyonları……..…………...…………………...….34 Resim 2.12. Büyüme faktörleri, büyüme faktörü reseptörleri ve transkripsiyon faktörleri tarafından yürütülen sinyalizasyon......………………….…..35 Resim 4.1. DNA izolasyonu sonrası PCR’la çoğaltılan gen ürünlerinin jel görüntüsü.............................................................................................43 Resim 4.2. Msx1 geni restriksiyon endonükleaz ile kesimi sonrası oluşan ürünlerin agaroz jel görüntüsü……....………………………………….45 xiv SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Kısaltmalar Açıklama BMP4 Bone Morphogenic Protein 4 CL Yarık Dudak CP Yarık Damak CLP Yarık Dudak ve Damak CL/P Yarık Dudak ve/veya Damak CPO Sadece Yarık Damak DDY Yarık Dudak ve/veya Damak DHH Desert Hedgehog DLX5 Distal Less Homeobox 5 DLX2 Distal Less Homeobox 2 DNA Deoksiribonükleik Asit dNTP Deoksiribonükleotittrifosfat GSTM1 Glutatyon S-Transferaz µ1 HD Homeodomain HWE Hardy Weinberg Equilibrium IHH Indian Hedgehog ICP İzole Yarık Damak xv Kısaltmalar Açıklama ICLP İzole Yarık Dudak ve Damak IRF6 Interferon Regüle-Edici Faktörü MSX1 Kas Segmenti Homeobox 1 MES Medial Edge Epitelium MTHFR Metilentetrahidrofolat Redüktaz MgCl2 Magnezyum Klorür NAT2 N-Acetyltransferase 2 PVRL1 Polivirüs Reseptör Benzeri Protein 1 PAX9 Paired Box 9 PAX3 Paired Box 3 PTC Patched PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RARa Retinoik Asit Reseptör α RFLP Restriksiyon Enzim Uzunluk Polimorfizmleri RBC Red Blood Cell RPM Rounds Per Minute SHH Sonic Hedgehog SDS Sodyum Dodesil Sülfat STE Sodyum Chloride-Tris-EDTA Buffer TGFα Transforme Edici Büyüme Faktörü Alfa xvi Kısaltmalar Açıklama TGFβ3 Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta 3 TBP Tata’ya Bağlanan Protein TBX22 T-box 22 TE Tris-EDTA buffer YDA Tek Başına Yarık Damak 1 1. Yar k dudak ve/veya damak (DDY) üst çene kemi i ve a z tavan yumu ak doku ve kemik dokular olu turan olu turan embriyonik uzant lar n yetersiz birle mesinden ileri gelmektedir. Dudak yar klanmalar na neden olan geli imsel anomaliler gebeli in 4-7. haftalar nda etkisini gösterirken, damak yar klanmalar na neden olan geli imsel anomaliler gebeli in 7-12. haftalar nda etkisini göstermektedirler [1,2,3,4]. Oral yar klar kimi vakalarda yaln zca yar k dudak (CL), kimi vakalarda yaln zca yar k damak (CP), kimi vakalarda yar k dudak ve yar k dama n her ikiside (CLP) görülebilir. Olu an oral yar k ba ka bir sendromla birlikte görülüyorsa sendromik, ba ka bir sendromla birlikte görülmüyorsa nonsendromik yar k dudak ve/veya damak (izole DDY) olarak isimlendirilir [5]. Orofasiyal yar klar, özellikle dudak ve/veya damak yar klar olmak üzere çok önemli bir halk sa k problemidir. Dünya çap nda her 500-1000 do umda 1’ini etkilemektedir [6]. Bu rakamlar; co rafik köken, etnik köken, ya am tarz ve sosyoekonomik duruma ba r [7]. Bu nedenle birçok ara rmada bu hastal ayd nlatmak için çal malar yap lm r, fakat bugüne kadar az say da ara rma sonuçlar ortaya konulmu tur. Yar k dudak ve/veya damak (CL/P) fenotipinde önemli kromozomal anomaliler içeren, Mendelyan sendromlar n bir parças olabildi i dü ünülebilir, ayn zamanda teratojenler CL/P riskini artt rabilir [8]. Yar k dudak, yar k damak ve dudak ve sadece yar k dama n dahil oldu u nonsendromik orofasiyal yar klar; büyük ölçüde bilinmeyen nedenlerin dudaklar ve z bo lu unu etkiledi i bir hastal k aral görünüm ve kavrama üzerine etkileri; sa olu turmaktad r. Konu ma, i itme, k ve sosyal bütünle me için uzun süreli olumsuz sonuçlara yol açabilir [9]. Oral yar klar aç ndan etkilenen çocuklar n; do umdan eri kin ya a kadar multidisipliner bir bak ma ihtiyac vard r ve etkilenmemi bireylere göre hayat 2 boyunca daha yüksek morbidite (hastal k oran ) ve mortaliteye (ayn hastal ktan ölüm oran ) sahiptir [10,11]. Baz ara rmalar n sonuçlar , yap sal beyin anomalilerinde yüksek frekans n oldu unu göstermi tir [12]. Rehabilitasyon; kaliteli bak m ile mümkün olmas na ra men, orofasiyal yar klar ister istemez sa k ve ilgili hizmetler aç ndan önemli harcama ile, birey, aile ve toplum için bir yük olu turmaktad r [9]. Damak dudak yar n genetik ve çevresel faktörlerin etkile imiyle olu tu u veya her iki faktörün de damak dudak yar olu umunda birlikte etkisinin oldu u dü ünülmektedir [13]. Baz hastalarda genetik faktörler ön plana ç km gibi gözükürken baz hastalarda çevresel faktörlerin, baz hastalarda ise hem genetik hem de çevresel faktörlerin birlikte damak dudak yar bildiren çal malar mevcuttur [14,15]. De izole damak dudak yar olu umuna neden oldu unu ik popülasyonlarda yap lan çal malarda n %20’ sinin ailesel kökeni oldu u belirlenmi ve böylelikle anomalinin meydana gelmesinde genetik faktörlerin önemli oldu u belirtilmi tir [14]. De ik çal malarda hem etnik hem de farkl popülasyonlara dayal mutasyon taramalar yap larak damak dudak yar n olu ma nedeni belirlenmeye çal lm r. Yaln zca gen ve gen gruplar de il, ba lant çal malar yap larak da multigenik bir defekt olan damak dudak yar için aday genlerin mevcut oldu u kromozom bölgeleri tespit edilmi tir [13,15,16]. Bu yüksek lisans tez çal mas nda; sendromsuz dudak-damak yar n, hastalarda ortaya ç kmas nda; aday olan gen ve bölgelerin baz mutasyon analizleri yap larak; incelenecek genin dudak damak yar olmad olu umu üzerindeki riskte etkili olup n ortaya konulmas ve daha sonra yap lacak ara rmalara da katk sa lamas amaçlanm r. Bu kapsamda; çal ma grubuna al nan sendromsuz dudak damak yar kl Türk hastalarda, MSX1 (Kas Segmenti Homeobox 1) genindeki P278S genetik de imi moleküler yöntemlerle ortaya konularak, elde edilecek veriler istatistiki olarak da de erlendirilmi tir. 3 2. GENEL B LG LER 2.1. Dudak ve Damak Yar klar nS Dudak ve damak yar klanmalar birçok s fland rma yap lm görülmemesine ba n s fland lmas fland lmas aç ndan günümüze kadar r. Oral yar klar , ba ka bir sendromla birlikte görülüp olarak iki gruba ay rabiliriz: zole (Non-Sendromik) oral yar klar: Bireylerde dudak ve/veya damak yar klar veya yaln zca damak yar d nda herhangi bir kusurun görülmemesi durumudur. zole Olmayan (Sendromik) oral yar klar: Bireylerde dudak ve/veya damak yar klar veya damak yar klar ile ba ka bir kusurun birlikte görülmesi durumudur. Non-sendromik veya sendromik olmas na bak lmaks n oral yar klar: Primer (Ön) damak yar klar Sekonder (Arka) damak yar klar Hem primer hem de sekonder damak yar klar Tek tarafl yar k dudak ki tarafl yar k dudak Medyan yar k dudak olarak görülebilir [17,18]. Resim 2.1’ de (A) Yar k dudak ve alveolus (B) Yar k damak (C) Eksik tek tarafl yar k dudak ve damak (D) Komple tek tarafl yar k dudak ve damak (E) Komple iki tarafl yar k dudak ve damak gösterilmi tir [9]. 4 Resim 2.1. Damak dudak yar k tipleri [9] 2.2. Dudak Damak Yar klar n Epidemiyolojisi Yayg n, çok genli bir kongenital defekt olan dudak-damak yar malformasyonu, üzerinde geni çapl çal lm olmas na ra men etiyolojisi karma kl ndan dolay hala büyük oranda bilinmemektedir. Etiyolojisi multifaktöriyeldir. Hastal geli iminde birçok genetik ve çevresel faktörlerin rol oynad n bilinmektedir. Fakat bu genetik ve çevresel faktörlerin niteli i ayd nlanmay beklemektedir [19]. Damak dudak yar klar n de ik rklarda insidanslar farkl r ve ortalama olarak 1/700 olarak bildirilmi tir [13]. Ara rmada kullan lan farkl yöntemlerden dolay kesin s kl belirlemek mümkün de ildir. Bir oran vermek gerekirse Türkiye’deki kl k 1:1000, Amerika Birle ik Devletleri’ndeki s kl k ise 1:600-1000’dir [20]. Tek ba na yar k damak (YDA) deformitesinin görülme s kl canl do umlar aras nda 0,5:1000' dir ve rklara göre farkl k göstermemektedir [4]. Kore’de yar k dudak ve damak görülme s kl 1,81/1000 olarak bildirilmi tir ayr ca Cumhuriyeti'nde canl do umda yar k dudak ve dama n görülme s kl ayr nt bu Kore hakk nda bilgi sa lamak için ülke çap nda ilk çal mad r [21]. Türkiye’de yar k dudak /damak görülme insidans binde 0,95, izole yar k damak görülme insidans binde 0,77 olarak bildirilmi tir [22]. Irklar aras nda çe itli farkl klar olmakla beraber beyaz rkta görülme insidans n 1000 canl do umda bir oldu u kabul edilmektedir. Hagberg ve arkada lar 5 taraf ndan yap lan bir çal mada; yar klar n insidans n canl do umlar aras nda 2,0/1000 oldu u ve bu oran n kad nlara göre erkeklerde daha yüksek oldu u belirtilmi tir, rölatif risk indeksi ise 1,58 olarak bulunmu tur. Hagberg ve arkada lar taraf ndan yap lan bu çal mada; ana grupta, izole yar k dudakl çocuklar n, yar k dudak ve damakl çocuklar n ve izole yar k damakl çocuklar n benzer bir insidans de eri gösterdi i (0,6-0,7/1000 canl do umda) ve bilateral yar kl çocuklar n canl do umlarda 0,3/1000 insidansa sahip oldu u belirtilmi tir [23]. Türkiye’ de Tunçbilek ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada, yar k dudak ve damak nedeni ile tedavi edilmi ve kay tlar tam olan 1229 hasta tespit edilmi tir. Bu 1229 hastan n %64,4’ ünde (793) dudak ve/veya damak yar izole dudak yar , %35,6’s nda (436) izole damak yar n, %19,4’ünde n oldu u görülmü tür (Çizelge 2.1) [24]. Çizelge 2.1. Hastalar n dudak ve damak yar k tiplerine göre da Yar k tipi n [24] % 793 64,4 239 19,4 Dudak + damak yar 554 45,0 zole damak yar 436 35,6 Submuköz damak yar 27 2,3 Dudak +/- damak yar zole dudak yar Toplam 1229 2.3. Dudak ve Damak Embriyolojik Geli imi Damak geli imi intra-uterin evresinin 5. haftas n sonunda ba lar ve a yukar 12. haftada biter [25]. Riskli olan dönem 6. haftan n biti inden 9. haftan n ba lamas na kadar olan süreyi kapsar. Oral dokular meydana getirecek dokular n hareketlenmesi, 6 birle mesi, farkl la mas ile damak, dudak ve nazal dokular olu maktad r. Bu amada fibroblast büyüme faktörleri, sonic hedgehog (shh) sinyal yola çok önemlidir [26,27]. Hedgehog yola , embriyo geli imi s ras nda hücre kaderinin belirlenmesinde anahtar roller oynayan sinyal ileti sistemi ile yak ndan ba lant ailesinin üyeleri hem omurgal hem de omurgas z embriyolar hücre ablonunun yap lanmas ileti yola r. Hedgehog n geli imi s ras nda sa layan çok say da olay kontrol ederler. Bu sinyal taraf ndan düzenlenen süreçlere örnek olarak, hücre tipinin belirlenmesi ve organlar n, sinir sisteminin, iskeletin, akci erlerin, saç, di ler ve gonadlar n geli imi s ras ndaki hücre ablonunun yap lanmas say labilir [28]. Hedgehog genleri (birisi Drosophila’da ve üçü memelilerde), lipidlerin eklenmesi ile modifiye edilen salg lanan bir proteini kodlar. Hedgehog için fonksiyonel reseptör, Patched (=yamal ) ve Smoothened (=düzeltilmi ) olarak adland lan iki adet transmembran proteindir. Hedgehog, Smoothened’ n negatif düzenleyicisi olan Patched’e ba lan r. Bu Smoothened’un Patched taraf ndan bask lanmas Smoothened’un bir hücre içi sinyal olu turmas ve sa lar. Smoothened sinyal iletimi için hedef, Drosophila’daki Cubitus interruptus (Ci) memelilerde Gli olarak adland lan transkripsiyon faktörüdür. Uyar lan transkripsiyon nükleustaki hedef genlerin aktive edilmesini sa lar (Resim 2.2) [28]. faktörü de 7 Resim 2.2. Hedgehog sinyal iletimi [28] Hedgehog ailesi; sonic hedgehog (Shh), desert hedgehog (Dhh), ve Indian hedgehog (Ihh)’dan olu ur. Shh, omurgal larda bulunmu tur ve Hedgehog sinyal yola n en iyi çal lm üyesidir [29]. Palatogenesis s ras nda Shh ekspresyonunu düzenleyen Bmp4 (Bone Morphogenic Protein 4)’ ün ifadesini Msx1 kontrol eder. Shh ifadesinin düzenlenmesinde Msx1 ve Dlx5 (Distal Less Homeobox 5) aras ndaki transkripsiyonel antagonizma, palatal raf geli imi s ras nda Shh sinyalizasyonun kesin zaman mekansal kontrolünü sa lar. Daha spesifik olarak, Dlx5, palatal epitelinin nazal taraf nda Shh sinyalizasyonunun indirekt inhibisyonunda sorumlu iken Msx1-arac Bmp4 sinyalizasyonu, damak epitelinde Shh sinyalizasyonun indüklenmesi için sorumludur. Bu antagonist kontrolünün bir sonucu olarak, damak epitelinde Shh sinyalizasyonunun bir asimetrik da vard r. Bu spesifik Shh ifade modeli, füzyon öncesi palatal raf n büyüme ve yükselmesi için çok önemlidir (Resim 2.3) [30]. 8 Mezen imal proliferasyon Resim 2.3. Palatogenesis s ras nda mezen imal hücre ço al n kontrolü için Shh ifadesinde Msx1 ve Dlx5’in antagonistik düzenin ematik gösterimi (MEE:orta kenar epiteli) [30] Palatogenesis s ras nda, Shh ifadesi palatal epitelinin a z taraf nda s rland lm r ve ektoderm içinde Shh’ n n ko ullu olarak inaktivasyonu, yar k damak ve palatal raflar n k salmas na yol açar [30]. Cobourne ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada, erken kraniyofasiyal geli im s ras nda Hedgehog sinyalinin önemli oldu u ve palatal ektodermde Shh sinyalizasyonunun a yol açaca ras nda s ifadesinin damak yar na gösterilmi tir [31]. Sonuç olarak Shh sinyalizasyonunun palatogenesis ca düzenlenmi olmas gerekir [30]. Primer ve sekonder damak olmak üzere damak geli imi, iki k mdan meydana gelir. Maksillan n kama eklinde bir mezen im kitlesi olan intermaksillar segmentinden primer damak geli meye ba lar. Üst duda n filtrumunu meydana getirecek olan bölüm ve 4 kesici di i (insisor) tutan üçgen eklindeki damak kemik bölümü olmak üzere primer damak iki bölümden olu maktad r [25]. Sekonder damak gebeli in alt nc haftas nda olu maya ba lar. Palatal ç boyunca sa ve sol maksillan n iç k sm nda a Dokuzuncu haftada, iki damak ç nt lar ba lang çta, dilin lateral yüzeyi yöndeki iki uzant olarak görülür. nt , birbirleriyle ve nazal septum ile kayna r ve dil üzerinde hareket ederek h zl horizontal (yatay) biçim de tirme gösterir. Bu lem Orta Hat Epiteli (MES: Medial edge epitelium) tamamen kayboldu unda sona ermektedir. Primer ve sekonder damak füzyonundaki ba ar zl klar kendi alanlar nda yar klara yol açar [32]. Dezmozom ve keratin fibriller sayesinde bu 9 birle meler meydana gelmektedir. Bu esnada primer dama n geli imine devam etmesi ile kemik olu umu ba lar, kesici di lerin gömüldü ü premaksillar parça meydana gelir. Yan palatin prossesler maksillar ve damak kemikleriyle kayna arak sert dama n meydana gelmesini ba lat r. Bu ç kemikle mez ve yumu ak dama nt lar n arkadaki k mlar olu turmak amac yla birle irler [17,18,25]. Resim 2.4’ te damak ve dudak geli iminin a amalar olarak; A’ da fare geli iminin E12,5 evresinde, ba n yatay ve koronal kesitleri gösterilmi tir. Bu nsan embriyonik döneminin yakla k 7. haftas na kar NS: Nazal septum, MP: Maksillar ç k gelir. (E: Göz, IS= ntermaksillar segment nt , P: Damak ç nt , T: Dil, MC= Meckel rda ). B’ de fare embriyonik geli iminin E13,5 evresinde palatal ç nt lar epitelyal biçimlenmeye geçer ve dilin üstünde yatay bir konuma yükselir. Bu insan embriyonik döneminin yakla k 8. haftas na kar raf temas k gelir. Mavi oklar ba lang çtaki ve füzyonun konumunu göstermektedir (NC: Nazal bo luk, OC: Oral bo luk). C’ de insan embriyonik döneminin yakla k olarak 9-10 haftalar na kar k gelen fare embriyonik geli imin E14,5 evresinde, intermaksillar segmentin üst dudak filtrumunu ve primer dama olu turdu u (Ph: Filtrum, UL: Üst dudak, PP: Primer damak, SP: Sekonder damak; U: Uvula) gösterilmi tir [15]. 10 Resim 2.4. Damak ve dudak geli iminin a amalar , etkin olan genler [15] Damak embriyonik geli imine göre dudak embriyonik geli imi daha basittir. Embriyolojik geli imin 11 ve 12. haftalar nda lateral ve mediyal nazal ç sma do ru ilerlemesini sa layan maksillar ç duda olu tururken, mandibular ç nt lar orta nt larda ortaya do ru ilerleyerek üst nt larda alt duda olu turur [13,15]. 2.4. Nonsendromik Dudak/Damak Yar klar nda Çevrenin Rolü Danimarka’ daki Fogh-Andersen’a göre, yar k dudak ve dama n görülme s kl 50 y l içinde ikiye ve son 100 y l içinde üçe katlanm ve arkada lar zl bir art son r [33]. Finlandiya’da, Rintala n 30 y ll k takip çal mas nda yar k damak ve dudak aç k bir ekilde e ilimi göstermi tir [34]. Bu ara rmalar, çevresel faktörlerin giderek artan bir etkisini göstermektedir. 11 Epidemiyolojik ve deneysel veriler; hamileli in erken döneminde tütün duman na annenin maruz kalmas , alkol, kötü beslenme, viral enfeksiyon, t bbi ilaçlar, yerlerindeki ve evlerdeki teratojenlerin, yar k dudak ve damak için önemli çevresel risk faktörlerinden olabilece ini dü ündürmektedir [9]. Mossey ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada çocuklardaki orofasiyal yar k ve gebelik planlamas aras nda ters bir ili ki bulunmu tur. Yani planl gebeliklerin, orofasiyal yar klar aç ndan daha dü ük risk ile ili kili oldu u belirtilmi tir [35]. Chen ve arkada lar n yapm oldu u bir çal mada; erken ya taki gebeli in santral sinir, sindirim ve kas-iskelet/integumental sistemlerinde konjenital anomali riskini artt rd belirtilmi tir [36]. Yar klar n olu mas na neden olan çevresel faktörlerden birkaç ekil 2.1’ de gösterilmi tir. Sigara Alkol ÇEVRESEL SK FAKTÖRLER laçlar Beslenme ekil 2.1. Yar klar n olu mas na neden olan çevresel faktörlerden birkaç Sigara Maternal sigara içimi oral yar klanma için en çok çal lan çevresel risk faktörüdür. Wyszynski ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada, bebeklerde maternal sigara içimi ile oral yar klar aras nda güçlü bir ili ki bulunmam r (odds oran 1,16, 12 95% güven aral (Cl) 1,01-1,33, tek tarafl Fisher testi P=0,0207), ancak bu çal ma gebelikte sigara içmenin sadece bebeklerde oral yar kla ma için küçük bir risk faktörü oldu unu do rulam r [37]. Wyszynski ve arkada lar taraf ndan yap lan birba ka çal mada ise, daha önce yap lan on bir çal ma de erlendirildi inde genel olarak odds oran CL/P için 1,29, CP için 1,32’ dir ve bu, gebeli in ilk trimesteri boyunca maternal sigara içicili i için ya yar k dudak/damak ya da yar k damakl çocuklara sahip olma konusunda küçük bir risk art göstermektedir [38]. Mossey ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada da; hamileli in ilk üç ay nda, planlanmam bir gebelik ve sigara içimi ile planlanm gebelik ve sigara içilmemesi kar la ld nda orofasiyal yar kl neredeyse üç kat na ç kt çocuklar n riski, planlanmam gebelikte görülmü tür [35]. Hartsfield ve arkada lar n yapm oldu u bir çal madaki analizlerde, gebelik öncesi bir ayl k dönem boyunca ve ilk trimester boyunca sigara içen annelerden do an CL/P’li vakalar ve böyle bir defekte sahip olmayan kontroller aras ndaki EPHX1 113 ve/veya GSTM1(Glutatyon S-transferaz kar la lm r. 1) allellerinin frekans li kinin bir ölçütü olarak odds oran kullan larak, allelik kar la rmas ile ili kilendirilmi CL/P’ de bir risk art gözlemlenmemi tir [39]. Ulucan taraf ndan yap lan bir çal mada, sigara kullan n izole damak dudak yar kullan olu umundaki öneminin belirlenmesi için Ki-Kare testi yap lm bak bulunamam ndan kontrol ve hasta gruplar aras nda anlaml r, sigara bir fark r (P=0,123) [5]. Shaw ve arkada lar na göre; maternal sigara içimi ile ili kili riskler, annelerin % 95 güven aral 20/günde sigara içti inde izole CL/P için (odds oran 2,1, 1,3-3,6) ve izole CP (odds ratio 2,2, % 95 güven aral 1,1-4,5) için oldukça yüksektir [40]. Alkol Maternal alkol kullan fetal alkol sendromunun iyi bilinen bir nedenidir, ancak izole orofasiyal yar klarda alkolün rolü baz çal malarda bildirilen pozitif ili kiler gibi çok kesin de ildir [41,42,43]. Romitti ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada istatistiksel olarak etkile imler, Msx1 CA için yayg n 4 allelli bebekler ve 13 maternal alkol ( 4 içim/ayda) tüketimi aras nda gözlemlenmi tir ve P <0,05 de eri bulunmu tur [41]. Bu de er bize maternal alkol tüketiminin yar klanmaya bir etkisinin olabilece ini dü ündürmektedir. Beslenme Gözlemsel ara rmalar, beslenme ya da beslenme durumunun biyokimyasal önlemlerinin de erlendirilmesinin zor oldu unu ve genellikle orofasiyal yar klar n yüksek oranlar birçok yoksul popülasyonlarda mevcut olmamas na ra men orofasiyal yar klarda annenin beslenmesinin bir rolü oldu unu dü ündürmektedir [9]. Çal malar n ço unda, erken gebelikte multivitamin takviyesi alan annede orofasiyal yar k riskinin azalmas ile ba lant daha önceden yap lm oldu u; bir meta-analizde (belirli bir konuda ara rmalar n sonuçlar na bakarak birtak m yeni sonuçlara varma yöntemi), orofasiyal yar klar n do um yayg nl ndaki %25 azalma ile ili kili bulunmu tur [9,44]. Baz gözlemsel ve klinik ara rmalar, folik asitin perikonsepsiyonel dönemde (gebelik olu madan 1 ay önce ve gebeli in ilk 6-8. haftalar aras ndaki süre) kullan azaltt n nöral tüp defektlerinden ba ka di er do um kusurlar n riskini ileri sürmü tür. Bu durum, folik asitin oral yar klar üzerindeki olas etkisi aç ndan önemli tart malar yaratm r. CL/P ve CPO (sadece yar k damak)’nin etiyolojisindeki folat n rolü için baz kan tlar biraraya getirilmeye çal lm r. Kuzey Amerika’da 1990' lar n sonlar ndan bu yana zorunlu olarak tah llar folik asitçe zenginle tirilmi tir, baz yayg nl nda bir dü kan tlar bu durumun CL/P’ li do umlar n e neden oldu unu göstermi tir [44,45,46]. Canfield ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada, folik asit kullan n sadece yar k damak riskinin do um prevalans nda azalma gösterdi ini belirtmi lerdir. Bu durum, do um kusurlar n prevalans üzerinde folik asit takviyesinin baz yararlar sa layabilece ini göstermektedir [45]. Kelly ve arkada lar taraf ndan folik asitin oral yar klar üzerindeki potansiyel etkisini ve folik asitin yetersiz perikonsepsiyonal kullan ile ili kili faktörleri tan mlamak 14 için bir çal ma yap lm r. Kelly ve arkada lar taraf ndan rlanda’ da yap lan bu çal mada; yar k damak ve dudak s kl ve yar k dudak için odds oran kar la ld n 9 ayl k bebeklerde 1000' de 1,98 oldu u n, ilk trimester s ras nda folik asit alan annelerle nda, gebeli in ilk 3 ay nda folik asit almayan annelerin bebekleri için 4,36 kat daha yüksek oldu u bulunmu tur (P=0,005). Bu bulgular, folik asit al n yar k dudak ve damak olu umunu k smen önleyebilece ini desteklemektedir [47]. Li ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada, menstrüal dönem öncesinden ba lat lan di er vitaminler olmadan sadece folik asitin 400 g günlük maternal tüketiminin, Çin’ in yar klar aç ndan yüksek yayg nl k gösteren bölgesinde do mu bebeklerde CL/P riskindeki azalma ile ili kili oldu u belirtilmi tir [48]. Ulucan taraf ndan yap lan bir çal mada damak dudak yar kullanan ve kullanmayanlar kar la ld bulunmu tur (P=0,000). Folik asit kullan olu umu aç ndan folik asit nda iki grup aras nda anlaml bir fark n damak dudak yar n önlenmesi aç ndan olumlu etkisi oldu u dü ünülmektedir [5]. Folik asitin, a z yar klar n olu umu üzerindeki etkisi ekil 2.2’ de gösterilmi tir. z yar klar n olu mas önler. Kullan Folik Asit Eksikli i z yar klar ekil 2.2. Folik asitin, a z yar klar n olu mas na neden olur. n olu umu üzerindeki etkisi Fetal geli imde çinko önemlidir ve bu besin eksikli i izole yar k damak ve hayvanlarda di er malformasyonlara neden olmaktad r [49]. Filipin’de üreme ça ndaki kad nlarda plazma çinko eksikli i yayg nd r. Tamura ve arkada lar taraf ndan Filipin’ de yap lan bir çal mada, annelerde plazmadaki çinkonun yüksek 15 miktarda olmas n nonsendromik orofasiyal yar klar n olu ma riskindeki dü ile ili kili bulunmu tur. Filipin’de yap lan bu çal mada CL/P’ li çocuklar n annelerinin ortalama plazma çinko konsantrasyonu, kontrol annelerine göre daha dü ük oldu u bulunmu tur (P < 0,05) [50]. Plazmadaki çinko konsantrasyonunun, a z yar klar n olu umu üzerindeki etkisi ekil 2.3’ te gösterilmi tir. z yar klar n olu ma riski dü üktür. Yüksek ise; Plazmadaki çinko konsantrasyonu Dü ük ise; z yar klar n olu ma riski yüksektir. ekil 2.3. Plazmadaki çinko konsantrasyonunun, a z yar klar üzerindeki etkisi n olu umu Folik asit ve çinko embriyonik geli im s ras nda hücrelerdeki gen ifadesinde önemli bir rol oynayabilirler. Folik asit ve çinko hücre içerisinde traskripsiyon faktörlerinin uyar lmas nda etkili olurlar (kofaktör olarak). Uyar lan transkripsiyon faktörü de hedef genlerin aktive edilmesini sa lar. Folik asit ve çinko eksikli i gen ifadesini olumsuz yönde etkiler. Gen ifadesinin olumsuz yönde etkilenmesi sonucu hücrelerde proliferasyon ve farkl la ma gerçekle mez. Sonuç olarak a z yar klar görülür. Folik asit ve çinko ile ilgili yap lan baz çal malarda, folik asit ve çinko eksikli inin z yar klar na neden olabilece ine dair kan tlar gösterilmi tir [5,45,47,48,49,50]. 16 laçlar Annenin organik çözücülere mesleki olarak maruz kalmas ve ebeveynin tar msal kimyasallara maruz kalmas ile yar k dudak, yar k damak ve dudak, yaln z yar k damak aras ndaki ili ki tutars zd r [51,52,53]. Damak dudak yar kullan aras ndaki ili kiyi tespit etmek amac yla yap lm ile steroid fazla çal ma yoktur. Fakat yap lan baz çal malarda steroid takviyesi yap lan hayvanlarda damak dudak yar n görülmesi, risk faktörleri aras nda gebelikte steroid kullan n yer almas na sebep olmu tur [54]. Steroid hormon etkisinin mekanizmas na bak rsa; her bir steroid hormon hücre membran geçer sitozoldeki veya nükleustaki özgün reseptöre (hormona ba ml transkripsiyon faktörü) ba lan r. Bu reseptör-hormon kompleksleri nükleusta birikir ve düzenleyici DNA dizilerine (hormona yan t veren elementler: “hormone responsive elements, HRE”) ba lan rlar. Bir HRE, özgün bir hormona yan t veren bir gen veya gen gruplar n yak ndaki her h zland “enhancer” bölgede bulunur. Steroid hormon-reseptör kompleksinin, h zland bölgenin HRE’ sine ba lanmas aktifle tirir. Reseptör-hormon transkripsiyona neden olan promotor geni kompleksleri, düzenleyici DNA dizilerine ba land klar nda, özgün gen aktivitesinin ya bask lanmas na ya da uyar lmas na neden olurlar [55]. Buna ba olarak, reseptör-hormon kompleksleri dudak damak geli imiyle ilgili olan bir genin bask lanmas na neden olursa dudak damak yar klar olu abilir. Kortikosteroidler çocuk do urma ya ndaki kad nlarda çe itli ko ullar n tedavisinde tercih edilen ilk ilaçlard r. Kortikosteroidlerin insan gebeli ine olan etkileri ile ilgili bilgiler s rl r. Park-Wyllie ve arkada lar taraf ndan yap lan bir prospektif çal mas nda kortikosteroide maruz kalanlar ve kontrol gruplar aras nda önemli anomalilerin oran aç ndan istatistiksel fark bulunamam bezlerinin yapt r. Prednizon (Adrenal do al kortikosteroid hormonlara benzer sentetik, antienflamatuar ilaçlard r), terapötik dozlarda insanlarda büyük bir teratojenik risk anlam na gelmese de mevcut hayvan çal malar ile tutarl olan oral yar klar n riskinde 3-4 kat art yapmaktad r [54]. 17 Carmichael ve arkada lar taraf ndan, gebelikte maternal kortikosteroid kullan orofasiyal yar kl bir bebe in meydana gelmesi ile ili kili olup olmad amac yla bir çal ma yap lm n incelemek r. Carmichael ve arkada lar taraf ndan yap lan bu çal mada, CLP (%2,9)’ li 33 bebe in anneleri, CP (%1,0)’ li 6 bebe in anneleri ve 72 kontrol bireyleri (%1,7), gebelik sonras nda 12 hafta boyunca ve gebelik öncesindeki 4 hafta boyunca kortikosteroid kullanm için odds oran r (CLP için odds oran 1,7, CP 0,5’tir) ve bu çal man n sonucu erken gebelik s ras nda kortikosteroid kullanan kad nlarda CLP riskinde ml bir art a i aret etmektedir [56]. Carmichael ve Shaw taraf ndan yap lan bir ba ka çal mada, perikonsepsiyonal dönemi boyunca kad nlar n kortikosteroid kullan bebekler aras ndaki ili ki ara lm ve seçilmi konjenital anomalili r ve kortikosteroid kullan n, ICP (izole yar k damak) ve ICLP (izole yar k dudak ve damak) için risk art ile ili kili bulunmu tur [57]. Hviid ve arkada lar taraf ndan 12 y ll k bir dönem boyunca Danimarka' daki tüm canl do umlar n verileri kullan larak ülke çap nda bir ara rma yap lm r. Hviid ve arkada lar kortikosteroid kullan olarak anlaml art n yapm oldu u bu çal mada ise, ile ili kili olarak orofasiyal yar klar n riskinde istatistiksel tespit edilmemi tir (CL/P yayg nl k odds oran 1,05, CPO yayg nl k odds oran 1,23’tür) [58]. 2.5. Nonsendromik Dudak/Damak Yar klar nda Genlerin Rolü nsanlarda orofasiyal yar klanma için gen tan mlama sürecinin erken a amalar nda olunmas na ra men, h zlanarak devam etmektedir. Son zamanlarda, baz genlerin tüm yar klar n % 20’ sine kadar kombine bir rolü oldu u tespit edilmi tir [59]. Çal lan ba lant bulgular , 2q32–q35 ve 9q21–q33’ de önerilen olas lokuslar ve kromozom 1, 2, 4, 6, 14, 17 ve 19 (MTHFR, TGFA, D4S175, F13A1, TGF 3, D17S250 ve APOC2) üzerindeki bölgeler de dahil olmak üzere, yar k dudak ve damakta nedensel bir rol oynamaya sahip çe itli lokuslar dü ündürmektedir [60,61]. Marazita ve arkada lar taraf ndan Çin’ de yap lan ilk gen haritalama çal mas nda nonsendromik CL/P ve Kafkasyal larda olumlu sonuçlar vermi be kromozomal bölgedeki 10 genetik marker aras ndaki ba lant ve ili ki olup olmad 18 ara lm r. Marazita ve arkada lar taraf ndan yap lan bu çal mada kromozom 2, 4, 6, 17, ve 19’ daki 10 marker (TGFA, MSX1, D4S194, D4S175, F13A1, GATA185H, D17S250, D17S579, D19S49, APOC2) de erlendirilmi tir. Anlaml pozitif sonuç (P=0,01) kromozom 19 üzerindeki APOC2 için SimIBD (ba lant çal mas ) kullan larak görülmü tür ve pozitif TDT (ili kilendirme çal mas ) sonucu (P=0,004) APOC2 yak ndaki, D19S49 için elde edilmi tir. Di er markerlar için nonsendromik CL/P ile ilgili anlaml bir sonuç bulunamam r [8]. Çe itli genetik polimorfizmler, popülasyon tabanl ili ki çal malar nda incelenmi tir. Çal lan baz gen ürünleri; Büyüme faktörleri (örne in, TGFA[transforme edici büyüme faktörü alfa], TGF 3[transforme edici büyüme faktörü beta 3]) [9]. Transkripsiyon faktörleri (örne in, MSX1, IRF6[interferon regüle edici faktör], TBX22[T-box22]) [9]. Ksenobiyotik metabolizmas nda rol oynayan faktörler ( örne in, CYP1A1, GSTM1 [glutatyon S-transferaz 1], NAT2 [N-acetyltransferase 2]) [9]. Besin metabolizmas (örne in, MTHFR[metilentetrahidrofolat redüktaz]) [9]. RARa ([retinoik asit reseptör ]) veya immün yan t (örne in, PVRL1[polivirüs reseptör benzeri protein 1], IRF6)’ dir [9]. nsan çal malar nda, dudak damak yar klar n etiyolojisindeki aday genlerin rolünü de erlendirmek için ba lant ve ili ki analizleri yap lm r [59]. Damak dudak yar klar için birçok aday gen gösterilmi tir ancak bugüne kadar yap lan genetik çal malarda baz genler ön plana ç km birkaç Çizelge 2.2 ‘de verilmi tir. r. Bu ön plana ç kan aday genlerden 19 Çizelge 2.2. Dudak-damak yar nda etkili olan aday genlerden birkaç ve kromozom lokasyonlar [14,32,59,62,63,64,65,66] LOKUS ADAY GENLER 6p24-p23 OFC1 2p13 OFC2 (TGFA) 19q13 OFC3(BCL3) 4q21-q31 OFC4 4p16 OFC5 (MSX1) 1q32.3-q41 OFC6(IRF6) 11q23.3 OFC7(PVRL1) 3q28 OFC 8 (TP73L) 13q33.1-q34 OFC9 2q33 OFC10 (SUMO1) 1p36 MTHFR,PAX7,SKI 14q24 TGF 3, BMP4 17q21.1 RARA 6p23 - 25 TFAP2A, OFCC1 14q12-q13 PAX9 19q13 TGF 1, BCL3, CLPTM1, PVRL2 9q22 TGFBR1 9q22–q33 FOXE1 Xq21.1 TBX22 2q14 GLI2 19q13 CLPTM1 5q34-q35 MSX2 2q32-q33 SATB2 13q22.2 SPRY2 9q22 ROR2 20p12.3 BMP2 1p34-2q33 FAF1 20 2.6. Msx1 Geninin Dudak/Damak Yar Olu umundaki Rolü 2.6.1. Msx1 geni (OFC5) Msx1 geni (ayr ca HOX7, OFC5 ve HYD1 olarak da bilinir) nonsendromik CL/CLP/CP ile ilgili olarak analiz edilen en önemli aday genlerden biridir [67,68,69,70,71]. Msx1, di faktördür ve terminal ve kraniyofasiyal iskelet geli imi için önemli bir hücre dü ünülmektedir [70,72]. farkl la mas nda önemli bir lk kez farelerden klonlanan msx ad rol oynad Drosophilia segment homeobox genleri ile (msh) gösterdikleri benzerlik nedeniyle alm Ard ndan deniz y ld r. [73], kurba a [74], bal k [75] ve insanlarda [76] izole edilmi tir. Msx1, Msx2 ve Msx3 olmak üzere Msx gen ailesi 3 genden olu mu tur [77]. Dorsal nöral tüpte Msx3 geni, epitel-mezen im etkile iminin oldu u her dokuda Msx2 ve Msx1 genleri, en önemlisi kafa ve yüz kemiklerinin geli im gösterdi i bölgelerde ifade edilir [78,79]. Ba ca sinir sistemi geli imi, kafa ve yüz kemiklerinin geli imi, odontogenez, tümör büyüme inhibisyonu ve kol-bacak geli imlerinde Msx ailesinin protein üyeleri önemli modüle edici görevlere sahiptir [80,81,82]. Msx homeodomain bölgesinin transkripsiyon faktörü olan Tata’ ya Ba lanan Protein (TBP)’ e ba lanmas yla protein-protein etkile imleri gerçekle ir [83]. Üstelik Dlx5 (Distal Less Homeobox 5), Lhx, Dlx2 (Distal Less Homeobox 2), ve Pax3 (Paired Box 3) gibi ba ka homeodomain proteinlere de ba lanarak transkripsiyonu düzenleme özelliklerine de sahiptir [81,84,85]. Msx1 geninde meydana gelebilecek bir mutasyon sonucunda Msx1 ifadesi gerçekle mez. Msx1 ifadesinin gerçekle memesi, embriyonik geli im s ras nda epitel ve mezen im doku katmanlar aras ndaki kar kl etkile imlerde görev alan ve Msx1 ifadesi ile uyar lan ba ka bir genin aktifle memesine neden olur. Bunun sonucunda epitel ve mezen im doku katmanlar aras ndaki kar kl etkile im sekteye u rar ve farkl la ma gerçekle mez. Farkl la man n gerçekle memesi sonucunda damak dudak yar klar görülür. 21 Msx1 homeodomain, di er proteinler ile özel ve fonksiyonel olarak önemli etkile imler yapar. Msx1’in TBP ve TBP-TATA kutusu DNA kompleksiyle ba land , GST çöktürme deneyleri (Çöktürme, genellikle GST (Glutathione-S- transferaz) enzimi ile füzyon halinde üretilecek ekilde klonlanm anlat m plasmidleri ile yap lmaktad r. GST’ nin, kulland olan protein sübstrat olan Glutatiyon, spesifik olmayan bir redükleyici ajan olarak kullan lmakta, ve proteinlerin redüklenmi olan thiol formlar nda tutularak çapraz ba lanmalar almaktad r.) ve jel de önlemekte görev im analizlerinde (Transkripsiyon faktörleri spesifik genin ne zaman nereden transkribe edilece ini kontrol eden regülatör sekanslara ba lan r ve traskripsiyonun gerçekle masine yard m eder. Jel de etiketlenmi nükleik aside protein ba lanmas sekanslara ba lanan transkripsiyon im analizi tekni i, n etkisini gösterir ve regülatör faktörlerinin gösterilmi tir. Transkripsiyonel bazal mekanizmas tayininde kullan labilir.) n bir üyesi olan TBP ile etkile ime ek olarak, Msx1’ in homeobox gen ailesinin di er üyeleri ile etkile im yapt görülür. Bu etkile imler transkripsiyonda önemli düzenleyici rol oynad görülmektedir. Bir transkripsiyon aktivatörü, HD (homeodomain) protein Dlx, bu proteinlerden biridir. Msx1 ve Dlx aras ndaki heterodimerizasyon, transkripsiyonel aktivitenin kayb na neden olur. N-terminal kolda ve Msx1 tan ma heliksindeki mutasyonlar, bu etkile imdeki ciddiyeti, proteinin tüm DNA ba lay yüzeyini kapsayacak ekilde etkile imi gösterir. Muhtemelen, benzer bir etkile im yüzeyi Pax3 ve Dhx2 gibi di er homeodomain proteinleri ve Msx1 aras ndaki etkile imde de kullan r [86,87]. Çe itli çal malar Msx1’ deki DNA varyasyonlar n dudak damak yar klar ile ili kili oldu unu ortaya koymu tur. Bu çal malardaki bulgulara dayanarak, Msx1 mutasyonu, di agenezisi, CL/P, ve/veya CPO’ li ailelerde bulunmu tur. Son zamanlarda, Msx1’ deki mutasyonlar, nonsendromik orofasiyal yar klar olan hastalar n % 2’ sinde tespit edilmi tir. Bu bulgular, Msx1’ in hem primer hem de sekonder palatogenezise dahil oldu unu gösterir. Bu, birincil palatogenesis s ras nda nazal ve maksillar süreçlerinde kuvvetli mezen imal desteklenmektedir [59]. Bu bak mdan damak dudak yar geninin önemi görülmektedir. ifade taraf ndan olu mas nda Msx1 22 2.6.2. Msx1 geninin yap Msx1 geni kromozom 4 üzerinde lokalizedir, 42,71 kb uzunlu undad r, 704 bp ve 1229 bp uzunlu unda iki ekzon ve 2332 bp uzunlu unda bir intron içerir (Resim 2.5) [88]. Resim 2.5. Tespit edilen baz mutasyonlar n konumu ile, insan msx1 gen yap [88] 2.6.3. Msx1 proteini Msx1 gen ürünü proteinler 297 ve 303 amino asite sahiptir. N-terminal domaini prolin tekrarlar içerir, bu da proteinin daha dengeli bir yap olarak daha s tutunmas n olmas na neden bir ekilde DNA (Deoksiribonükleik Asit)’ n n minor olu una sa lar (Resim 2.6) (Resim 2.7) [86,89]. Homeodomain bölgesini ekzon 2 bölgesi kodlar ve bu bölge proteinin ba ka proteinlerle etkile mesine neden olur [86]. Msx1 Homeodomaini DNA ba lay , protein-protein etkile imleri, protein stabilitesi ve transkripsiyon bask lay konumundad r [89]. gibi çoklu fonksiyonlar n arabuluculuk merkezi 23 Resim 2.6. MSX-1HD-DNA kompleksinin çizilen bant [86] Resim 2.7. MSX-1’in N-terminal kolunun yörüngesinin üç boyutlu yap [86] 2.6.4. Msx1 gen ifadesi Msx1 gen ifadesinin kafa ve yüz kemiklerinin geli im bölgesinde, odontoblast ve ameloblast hücrelerinin ço alma evrelerinde, damak yap meydana getirecek olan hücrelerde, kafatas kemikleri ve meninks olu umunu sa layan nöral krest kökenli hücrelerde yüksek oldu u belirtilmi tir [90,91]. Msx1 gen ifadesi hücre döngüsünün düzenlenmesi yoluyla inhibe hücrelerin farkl la mas , siklin D1 uyar lmas ile ili kilidir. Hu ve arkada lar taraf ndan bu konuda yap lan bir çal mada, Msx1 fonksiyonunun mekanizmas incelenmi tir. Hücre kültürü ve in vivo model sistemleri kullan larak, Msx1’ in ifade eksikli inin çoklu mezen imal ve epitelyal hücre 24 tiplerinin farkl la mas inhibe etti i gösterilmi tir. Msx1’ in siklin D1 ekspresyonunu yüksek seviyede koruyarak hücrenin döngüden ç engelledi i bir model önerilmi tir (Resim 2.8) [92]. Siklin D1 Hücre döngüsü Proliferasyon Farkl la ma Resim 2.8. Hücre döngüsü regülasyonunda MSX fonksiyonu için bir model [92] Resim 2.8’ de görüldü ü gibi hücre döngüsü ç blo unda (k rm sonraki farkl la ma olay nda Msx1, siklin D1 ifadesini (k rm D1 (ye il ok) hücre ço almas bile enleri (k k k rm oklar) uyar r. Siklin te vik edebilmesine ra men, di er hücre döngüsü ok) üzerinde Msx1’ in etkisi büyük ihtimalle yoktur. Bu nedenle, Msx1 aktivite kayb erken hücre döngüsü ç Msx1' in a bariyer) ve daha ekspresyonu hücre döngüsü ç na yol açabilecek iken, engelleyebilir [92]. Msx1’ in siklin D1 ifadesini uyarmas ile hücrenin döngüden ç kmas engellenir ve hücre proliferasyonu gerçekle ir. Msx1’ de meydana gelecek bir mutasyon siklin D1 ifadesinin uyar lmas olumsuz yönde etkiler. Siklin D1 ifadesinin olumsuz yönde etkilenmesi hücrenin döngüden ç kmas na yol açar. Hücrenin döngüden ç kmas , mezen imal ve epitelyal hücre tiplerinin fakl la maya gitmemesine neden olur. Bunun sonucunda dudak damak yar klar olu ur. Omurgal organlar ; epitel ve mezen im doku katmanlar aras ndaki s ral ve kar kl etkile imleri yoluyla meydana gelir. Bu süreçler doku-spesifik gen 25 ekspresyonu ve morfogenezi yöneten indüktif ve ml doku etkile imlerinin (ayr ca ikincil indüksiyon olarak da bilinir) bir dizisini içerir ve sonuçta hücre farkl la mas ve organ modellenmesine yol açar. Zhang ve arkada lar taraf ndan yap lan çal mada, Patched (Ptc) indüksiyonunda Sonic hedgehog (Shh) sinyalinin iletimini ke fetmek için bir model sistemi olarak fare geli imindeki di hücresi kullan lm r. Erken geli en molar di hücresinde Shh di epitelyum içinde ifade edilir (E9.0 ve E11.5). Epitel Shh, mezen imdeki Gli1' in ifadesine neden olur. Gli1, epitelden türetilen Bmp4 vas tas yla mezen imde indüklenen Msx1' in ürünü ile etkile ime girmesi ile Ptc ifadesini aktive edebilir. Mezen imal Bmp4, Msx1’ in ifadesini gerektirmektedir ve Msx1' in ifadesinin devam için olumlu bir geri besleme sinyali sa lar, ayr ca Ptc ifadesine neden olabilir. Ptc ifadesi böylece fare di hücresi geli iminin erken a amas nda en az iki farkl yolak taraf ndan düzenlenir (Resim 2.9) [93]. Resim 2.9. Erken di hücresinde Ptc ifadesini düzenleyen genetik bir yolak modeli [93] 2.6.5. Msx1 geni ve izole DDY lk olarak Lidral ve arkada lar taraf ndan Msx1 geni ile nonsendromik CLP ili kisini belirlemeye yönelik çal malar ba lat lm bölgesindeki CA tekrarlar n varl r [94]. Daha sonraki çal malarda intron na göre allelik varyasyon analizleri yap lm ve Msx1 geni ile izole CLP olu umu aras nda ili kiler de erlendirilmi tir [41]. 26 Otero ve arkada lar taraf ndan Kolombiya’ da nonsendromik CLP ve Msx1 CA polimorfizmi aras ndaki ili kiyi de erlendirmek amac yla bir çal ma yap lm r ve bu çal mada CLP ve Msx1 CA polimorfizmi aras nda pozitif bir ili ki bulunmu tur (P<0,0106) [95]. Jugessur ve arkada lar taraf ndan Norveç popülasyonunda yap lan bir çal mada ise, Msx1 CA polimorfizmi ile sendromsuz dudak ve/veya damak yar aras nda güçlü bir ili ki saptanamam r (P=0,72 ) [69]. Lidral ve arkada lar Filipin popülasyonunda yapm olduklar bir çal mada, nonsendromik yar kta Msx1 için olas bir rol önerdiler ancak hastal a ba mutasyonu tespit etmede ba ar z oldular (nonsendromik CL/P için P=0,26, nonsendromik CPO (sadece yar k damak) için P=0,91) [94]. Suzuki ve arkada lar Vietnam popülasyonunda, Vieira ve arkada lar Filipin popülasyonunda yapt klar çal malarda Msx1 geninde missense mutasyonlar n (P147Q; Msx1 genindeki 440C> A de vurgulanm imi) varl saptanm r ve genin önemi r [62,96]. Suzuki ve arkada lar ile Vieira ve arkada lar taraf ndan izole dudak damak yar genindeki 440C> A de olu umuna neden olarak gösterilen P147Q (Msx1 imi) polimorfizmi, Tayland popülasyonunda Tongkobpetch taraf ndan yap lan çal mada etkili olmad bulunmu tur (allelik P=0,285, genotipik P=0,277) [62,96,97]. Huang ve arkada lar taraf ndan Bat Çin’deki Han Çinlileri popülasyonunda Msx1 gen varyantlar ve oral yar klar n aras ndaki ili kiyi ara rmak amac yla bir çal ma yap lm r. Bu çal maya 206 nonsendromik yar k dudak ve damakl aileler (hastalar ve aileleri dahil) ve 224 kontrol al narak, Msx1 tek nükleotit polimorfizmleri rs3821949 ve rs12532 ve missense mutasyon P147Q (Msx1 genindeki 440C> A de imi) de erlendirilmi tir. Bu de erlendirmeye göre yap lan vaka-kontrol analizinde yar k dudak/damak ve P147Q varyant aras nda bir ili ki gözlenmesine ra men (allelik CP için P=0,021, CLP için P=0,010), Msx1 genindeki rs3821949 (allelik CL için P=0,476, CP için P=0,894; genotipik CL için P=0,574, CP için P=0,956, CLP için P=0,113) veya rs12532 (allelik CL için P=0,708, CP için P=0,602, CLP için P=0,623; genotipik CL için P=0,807, CP için P=0,614, CLP için 27 P=0,877) ve nonsendromik oral yar klar aras nda anlaml bir ili ki bulunamam [98]. Rafighdoost ve arkada lar n Güneydo u r ran popülasyonunda yapm olduklar çal mada Msx1 genindeki tek nükleotit polimorfizmi olan rs12532 AG ve rs12532 GG genotiplerinin nonsendromik dudak/damak yar riski ile ili kili oldu u bulunmu tur (rs12532 AG için P =0,001, rs12532 GG için P = 0,004 ) [99]. Jezewski ve arkada lar taraf ndan nonsendromik CL/CLP/CP ‘li 917 ki iye tüm Msx1 gen sekanslar uygulanm r ve 16 (%2) potansiyel etiyolojik mutasyonlar bildirilmi tir [68]. Hasta ve kontrol gruplar aras nda ara rmac lar taraf ndan gerçekle tirilen Msx1 geninin direkt s ralama sonuçlar , CL/CLP/CP vakalar n yakla k % 2’ sinin alt nda yatan neden olarak nokta mutasyonlar öne sürmektedir [62,68,96]. Vieira ve arkada lar n, 217 Güney Amerikal çocuklar n annelerinde yapt klar çal madaki iletim dengesizlik testi analizi sonuçlar na göre; yar k dudak damak (P=0,037), sadece yar k damak (P=0,037), yar k dudak/damak (P=0,004) ile Msx1 aras nda bir ba lant bulunmu tur. Olas k oran testi analizi sonuçlar na göre, yaln zca yar k dudak ile Msx1 aras nda bir ba lant bulunmu tur (P=0,04) [100]. Marazita ve arkada lar taraf ndan Çin’ de yap lan ilk gen haritalama çal mas nda nonsendromik CL/P ve Kafkasyal larda olumlu sonuçlar vermi be kromozomal bölgedeki 10 genetik marker aras nda ba lant ve ili ki olup olmad ara lm r ve bu çal mada Msx1’ in nonsendromik CL/P ile olan ili kisi aç ndan anlaml bir sonuç bulunamam r (P=0,30) [8]. Güney Hindistan’da Singh ve Ramu taraf ndan Msx1 (799 G> T) gen varyant nonsendromik dudak/damak yar amac yla bir çal ma yap lm varyant n etiyolojisinde yer al p almad gözlenmi tir test etmek r ve bu çal man n sonucunda Msx1 (799 G> T) gen ile nonsendromik dudak/damak yar kl korelasyon n [101]. Salahshourifar hastalar aras nda pozitif bir ve arkada lar n Malay popülasyonunda yapt klar bir çal mada, Msx1 genindeki G110G varyant n, çal madaki nonsendromik CL, CL/P’ li hastalar ve kontroller aras nda önemli bir ili ki gösterdi i bulunmu tur (P=0,001, odds ratio=2,241, 95% güven aral 1,357-3,700) [102]. Butali ve arkada lar nda, n Nijerya popülasyonunda yapt klar bir 28 çal mada, Msx1 genindeki 101C>G (A34G) genetik de iminin (genotipik P=0,00002) a z yar klanmalar nda olumlu bir etkisinin oldu u gösterilmi tir [103]. Kafa ve yüz kemiklerinin geli imindeki Msx1 geninin görevi ba ka homeobox proteinlerini regüle etmektir. DNA düzeyinde ya da protein düzeyinde bu regülasyon olabilir. Msx1 geninin rolü uan için net olarak bilinmese de izole CLP olu umunda di er genler ile etkile erek etki gösterdi i tahmin edilmektedir [62]. Msx1 genindeki önemli mutasyonlardan bir k sm Çizelge 2.3’ te verilmi tir. Çizelge 2.3. MSX1 genindeki önemli mutasyonlardan bir k sm (O.D: otozomal dominant) [16,21,39,68,74,79,97,104] Fenotip Mutasyon Amino Asit Nükleotit Tipi De imi De imi G16D G47A Missense Bilinen etkisi yok A30A C90A Sessiz mutasyon Bilinen etkisi yok A34G C101G Missense Bilinen etkisi yok E78V A233T Missense zole DDY V80V G240A Sessiz mutasyon Bilinen etkisi yok S105X C314A Nonsense G110G C330T Sessiz mutasyon O.D. DDY/ oligodonti Bilinen etkisi yok V114G T341G Missense Izole DDY G116E G347A Missense Izole DDY L118L C354T Sessiz mutasyon Bilinen etkisi yok R151S G453T Missense Izole DDY P278S C832T Missense Izole DDY S202X C605A Nonsense Witkop Sendromu A275A C825T Sessiz mutasyon Bilinen etkisi yok G267C G799T Missense Izole DDY 29 2.6.6. P278S polimorfizmi Tayland popülasyonunda yap lan bir çal mada Msx1 gen mutasyonlar n nonsendromik dudak damak yar klar na katk r. n olup olmad ara lm Tayland popülasyonunda yap lan bu çal madaki mutasyon analizlerine göre; Msx1 gen mutasyonunun, özellikle Msx1 geninin P278S bölgesinin, dudak damak yar klar nda etkili bir bölge oldu u görülmü tür. Nonsendromik dudak damak yar kl 100 Taylandl hasta için Msx1 geninin tüm kodlanan bölgelerini kapsayan mutasyon analizi yap lm nükleotit de r ve sekiz varyant bölge tespit edilmi tir. Bu varyantlar n 7’ si tek imidir (4’ü transversiyon, 3’ü transisyon), di er de ken ise intron 1' de tek bir nükleotit eksilmesidir (Çizelge 2.4) [97]. Çizelge 2.4. Nonsendromik CL/P’li 100 Taylandl hastalarda tespit edilen MSX1 varyant bölgeleri [97] Nükleotit pozisyonu Ekzon/ intron Nükleotit de imi Beklenen Heterozigotl Homozigot/ aminoasit ar n frekans hemizigotlar de ikli i n frekans 90 Exon 1 C>A A30A 0 2 101 Exon 1 C>G A34G 4 4 330 Exon 1 C>T G110G 15 15 440 Exon 1 C>A P147Q 3 0 452–14 Intron 1 del T _ 8 0 799 Exon 2 G>T G267C 1 0 832 Exon 2 C>T P278S 1 0 894 + 6 3’UTR C>T _ 0 1 30 Msx1’ in kodlama bölgeleri 6 farkl varyant içermektedir; bunlar n 2’ si sinonim (ayn anlaml ) 4’ ü nonsinonim (ayn anlaml de il)’ dir. Msx1 geninin sekanslama analizinde bulunan dört nonsinonim türevi unlard r: 101C>G (A34G) , 440C>A (P147Q), 799G>T(G267C) ve 832C>T(P278S). Bunlardan P278S ve G267C varyantlar n “muhtemel hasar verici” oldu u PolyPhen taraf ndan tahmin edilmektedir. Bu durum, çal madaki 162 kontrol grubunda mevcut de ildir. Daha önce Msx1 genindeki yanl anlaml mutasyonlar n (missense mutasyon) homeodomain proteinin N-terminal ucunda rapor edilmesinin aksine, homeodomain C-terminal ucunda ekzon 2’ deki bu potansiyel mutasyonlar bulunmu tur [97]. Msx1 geni 799G>T(G267C) konumlanm ve 832C>T(P278S) türevleri, ekzon 2’ de r. Ekzon 2' deki bu iki nonsinonim varyantlar, 799G> T (G267C) ve 832C> T (P278S), daha önce bildirilmemi tir. Msx1’ in ekzon 2 k sm ço unlukla ekson 1 k sm ile kar la ld nda ekzon 2 k sm önemli ölçüde daha az varyasyon göstermesi nedeniyle daha fazla muhafaza olmu tur [97]. Resim 2.10’ da görüldü ü gibi sol ve sa paneller s ras yla 1 ve 2 hastalar ile ilgilidir. A) Hastalar n sekans analizi, s ras yla 1. ve 2. hastalarda 799G> T ve 832C> T (oklarla) gösterilmi tir. B) Kontrollerin sekans analizi, 799 GG ve 832 CC (oklar) nükleotitindeki normal genotipler gösterilmi tir [97]. 31 Hasta 1 Hasta 2 Resim 2.10. Msx1 genindeki 799G > T and 832C > T de analizi [97] imlerinin mutasyon 2.7. Gen-Çevre Etkile imi CL/P, genler ve çevre etkile imlerinin bir kombinasyonunun neden oldu u multifaktöriyel bir hastal kt r. Bu faktörler, farkl toplumlarda CL/P için farkl katk da bulunabilir [96,105,106]. Annenin sigara içimi ve oral yar k riski aras ndaki ili ki yayg n olarak incelenmi tir. Hwang ve arkada lar taraf ndan yar k damak ve dudak riskinde kraniyofasiyal geli im s ras nda ifade edildi i bilinen TGF varyant ve annenin gebelikte sigara içmesi aras ndaki etkile imin ilk kan yay mlanm r. Hwang ve arkada lar taraf ndan TGF Taq1 bölgesindeki nadir allel ve gebelik ras nda sigara içen annelere ( 10 ya da >10 sigara/gün) sahip bebeklerde, CP riskinde art oldu u bulunmu tur [106]. Shaw ve arkada lar TGF Taq1 bölgesindeki nadir allel ile anneleri günde 20 sigara içen bebekler aras ndaki CLP ve CP için artan riskleri bildirmi tir [40]. Chevrier ve arkada lar taraf ndan yap lan bir çal mada annenin sigara içiminin, yar k dudak/damak riski ile ilgili üç geli imsel genlerin TGFA C2 (P=0,92), TGF 3 X5.1 (P=0,12) veya MSX1 N8 (P=0,74) türevleriyle etkile imine dair herhangi bir kan t bulunamam r (Çizelge 2.5) [107]. 32 Çizelge 2.5. Gebelik süresince sigara maruziyetinin geli imsel genlerden TGFA C2, TGF 3 X5.1 veya MSX1 N8 üzerindeki etkisi [107] Annenin sigara içimi Hay r Gen Evet Sigara içmeyenler aras ndaki, çevresel tütün duman maruziyeti Hay r Evet Mutasyona ram allel Yüz geli imi ile ilgili genler Fetal genotip etkileri Çizelge 2.5’ te a: homozigot yaban genotip ile kar la ram allelin varl ld nda mutasyona n rölatif riski (RR), b: Maruz kalma tabakalar (gen çevre etkile imi) üzerindeki rölatif riskler aras ndaki heterojenitenin testi, CI: güven aral gösterilmi tir [107]. Romitti ve arkada lar taraf ndan CL/P ve CP riskinin, TGF 3 ve maternal sigara duman na maruziyet ile ilgili olarak gen-çevre etkile imleri taraf ndan etkilenmi oldu una dair kan tlar bildirilmi tir ve Msx1 CA için yayg n 4 allelli bebekler ile annenin alkol tüketimi aras ndaki istatistiksel bir etkile imin kan bildirilmi tir (P <0,05) [41]. Maestri ve arkada lar taraf ndan orofasiyal yar klar n riski (CL/P için P=0,010 veya CP için P=0,024), D14S61 (TGF 3' ün 450 kilobaz içinde bulunan bir marker) ve annenin sigara duman na maruziyetinin etkile imi taraf ndan önemli ölçüde etkilendi i bildirilmi tir [71]. Van den Boogaard ve arkada lar taraf ndan Hollanda popülasyonunda yap lan bir çal mada, nonsendromik orofiyal yar kl çocuklar ve hamileli in ilk trimesteri boyunca maternal sigara içimi ve homeobox geni Msx1 aras ndaki ili ki incelenmi tir ve bu ili ki için anlaml kan t sa lanm r [7]. Maternal sigara maruziyeti, Msx1 geninde mutasyonlar n olu mas na sebep olabilir. Meydana gelen mutasyon hücre proliferasyonunun gerçekle mesini önleyebilir. 33 Hücre proliferasyonunun gerçekle memesi sonucu damak dudak yar klar görülebilir ekil 2.4). Maternal sigara maruziyeti Msx1 geninde mutasyon Hücre proliferasyonunun gerçekle memesi ekil 2.4. Maternal sigara maruziyetinin damak dudak yar Dudak damak yar klar olu umu üzerindeki etkisi 2.8. Gen-Gen Etkile imi Yar klara yol açan gen-gen etkile iminin istatistiksel kan tlar MSX1 (transkripsiyon represörü) ve TGF 3 (hücre farkl la mas da dahil) [100] için ve MSX1 ve TGFA (büyüme faktörü) (P=0,04) [69] için bildirilmi tir. Vieira ve arkada lar n yapt klar bir çal mada; bir veya 169 baz çifti allellerinin birkaç na sahip olan probandlar n (ailede genetik olarak etkilenmi ilk vaka) oldu u Güney Amerika popülasyonundaki ailelerde MSX1 ve TGF 3 duyarl k allelleri aras nda bir etkile im olabilece ini dü ündüren, TGF 3 (P=0,05) ile iletim bozulma s na kan tlar bulunmaktad r [100]. Di agenezisi ile ilgili çal malar, yar k dudak ve damak ile ili kili olabilecek olas etkile imleri önermi tir. Vieira ve arkada lar öncelikli premolar agenezin FGFR1(Fibroblast büyüme faktörü1) (P=0,014) ve IRF6 (P=0,002) markerlar ile olan ili kisini göstermi lerdir. Ayn zamanda IRF6 ve MSX1 (P=0,001), IRF6 ve TGFA (P=0,03) aras ndaki etkile imlerin istatistiksel kan tlar da bildirilmi tir [108]. MSX1 ve PAX9 mutasyonlar , insan di agenezinin formlar nda gösterilmi tir. Vieira ve arkada lar etnik çe itlilik gösteren bir insan popülasyonunda yapm olduklar bir çal mada, MSX1 ve PAX9 genlerindeki di agenezisi ve DNA dizi varyasyonlar aras ndaki ili kiyi belirleme amaçlanm r. Vieira ve arkada lar n n yapm olduklar bu çal mada MSX1 veya PAX9 kodlama bölgesinde mutasyon bulunmam r. Ancak MSX1’ in PAX9 ile insanlarda di agenezine neden olabilecek etkile im kurabilece ini dü ündüren anlaml veri bulunmu tur (P=0,02) [109]. Ogawa ve arkada lar taraf ndan yap lan çal mada, bir fare modelindeki ekspresyon analizi ve insan genetik çal mas birle tirildi inde elde edilen biyokimyasal veriler, di 34 geli imi s ras nda PAX9 ve MSX1 aras nda i levsel bir ili ki oldu u gösterilmi tir [110]. Ogawa ve arkada lar n yapt bir ba ka çal mada MSX1’ in düzenlenmesinde PAX9’ un dahil olup olmad belirlemek için MSX1 ifadesi PAX9 eksikli i olan farelerin di primordias nda analiz edilmi tir. Analizler sonucu elde edilen bulgular PAX9 ve MSX1 aras ndaki ili kiyi göstermektedir [111]. Resim 2.11’ de MSX1’ in genotip-fenotip korelasyonlar , PAX9, IRF6, TGF 3, TGFA ile etkile imleri ve mutasyonlar gösterilmi tir. Di agenezisi MSX1 Anlams z mutasyon Yanl anlam mutasyonu Hipomorfik allel Yar klar Resim 2.11. Bugüne kadar tan mlanm Msx1 genotip-fenotip korelasyonlar , etkile imleri ve mutasyonlar [16] MSX1 geni kraniofasiyal geli imde önemli bir transkripsiyon faktörüdür. Orofasiyal geli imde MSX1 geni belirli bir yola izleyerek büyüme faktörleri (TGFA, TGF 3 vs.) ile etkile ime geçer ve oral yap lar n geli iminde etkili olur. MSX1 geninde meydana gelebilecek bir mutasyon, MSX1 geni ve büyüme faktörleri aras ndaki etkile imde sorunlar n görülmesine neden olur. Sonuç olarak oral yar klar görülür. Di geli iminde ise MSX1 geni farkl bir yola izleyerek ba ka bir transkripsiyon faktörü (PAX9,IRF6 vs.) ile etkile ime geçer ve di geli iminde etkili olur. MSX1 geninde meydana gelebilecek bir mutasyon, MSX1 geni ve ba ka bir transkripsiyon faktörü aras ndaki etkile imde sorunlar n görülmesine neden olur. Sonuç olarak di geli iminde di agenezi (di eksikli i) gibi anormallikler görülür (Resim 2.11). 35 Orofasiyal ve di geli imi ile ilgili olarak belirlenen önemli sinyal molekülleri (özellikle büyüme faktörleri) ve transkripsiyon faktörlerinin moleküler mekanizmas Resim 2.12’ de gösterilmektedir. Bu moleküler mekanizmaya göre; farkl büyüme faktörü-büyüme faktörü reseptörü kombinasyonlar belirli bir transkripsiyon faktörünün (DNA’ ya do rudan ba lanan proteinler) aktivasyonuna veya inaktivasyonuna yol açar. Bu transkripsiyon faktörleri genomun düzenleyici bölgelerine ba lan r ve hücre göçü, hücre bölünmesi veya hücre ölümü gibi hücre davran lar kontrol eden genlerin belirli kümelerinin ifadesini veya bask lanmas yönlendirir. Birçok durumda transkripsiyon faktörlerinin bir hücre-hücre "diyalogu" olu turulmas nda, di er hücrelerin sinyalizasyonu için hücre taraf ndan yeni büyüme faktörlerinin ifadesine yol açar [112]. Bu sinyal moleküllerinde ve transkripsiyon faktörlerinde meydana gelebilecek bir mutasyon moleküler mekanizmada aksakl klara yol açabilir, sonuç olarak orofasiyal geli imde ve di geli iminde anormalliklerin görülmesine neden olabilir. Yeni ifade edilen büyüme faktörü, ba ka bir hücreye sinyalizasyon için a aktar r. aktif büyüme faktörü reseptörü Büyüme faktörü Büyüme faktörü reseptörü transkripsiyon faktörünün aktivasyonu aktive edilmi transkripsiyon faktörü taraf ndan uyar lan gen ifadesi Resim 2.12. Büyüme faktörleri, büyüme faktörü reseptörleri ve transkripsiyon faktörleri taraf ndan yürütülen sinyalizasyon [112] 36 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Bu yüksek lisans tez çal mas nda kullan lan 70 adet kan örne i, Ankara Üniversitesi Di Hekimli i Fakültesi’nden 18.12.2007 tarihli ve 124/2 say etik kurul karar ile ve sendromsuz dudak damak yar kl Türk hastalardan gönüllü onam formlar imzalat larak elde edilmi tir. Hastalardan al nan periferal kan örneklerinden Fenolkloroform yöntemiyle genomik izolasyonu yap larak, Msx1 geni üzerindeki P278S de im bölgesinde polimeraz zincir reaksiyonu artlar na göre metod uygulanm r. Elde edilen polimeraz zincir reaksiyon ürünlerine; RFLP (Restriksiyon Enzim Uzunluk Polimorfizmleri) metodu uygulanm r. RFLP metoduyla çal lan örneklerde mutasyonu belirleyecek olan restriksiyon endonükleazlar kullan larak gen ürünlerinin kesimi yap lm r. Bu enzim kesim ürünleri %2’ lik agaroz jelde elektroforezleri yap larak jel görüntüleme cihaz nda foto raflar çekilmi tir. 3.2. Metodlar 3.2.1. Fenol kloroform yöntemiyle DNA izolasyonu .GÜN 1 ml EDTA + 9 ml kan 1. Örne in + hacminin 2,5 kat kadar RBC (Red Blood Cell) Lysis solüsyonu konur. 2. Haz rlanan kar m çalkaland ktan sonra 20 dakika buzda bekletilir. 3. 20 dakika 4000 rpm 4 ’ de santrifüj edilir. 4. Tüpte dipte beyaz çökelti görülmedi i taktirde, süpernatant n bir k sm dökülür, hacim RBC Lysis solüsyonu ilave edilerek dipte lökosit tabakas olu ana kadar lem tekrarlan r. 5. Lökosit tabakas elde edilince süpernatant dökülür. 6. RBC Lysis solüsyonuyla 1-2 kez y kama yap r. 7. Örne e 1000 µl RBC Lysis solüsyonu ilave edilir. 37 8. Vorteksle homojen hale getirilir. 9. 200 µl örnekle i leme devam edilir. Geri kalan stoklan r. 10. +500 µl STE (Sodyum Chloride-Tris-EDTA buffer) + 30 µl SDS (Sodyum dodesil sülfat) (%10’luk) + 20 µl Proteinaz K ilave edilir. 11. Örnek 56 su banyosunda 1 gece bekletilir. .GÜN 1. Örne e 1:1 oran nda fenol ilave edilir. 2. 10 dakika çalkalad ktan sonra 20 dakika buza gömülür. 3. Örnek 20 dakika 4000 rpm 4 ’de santrifüj edilir. 4. Süpernatant ba ka bir eppendorfa al r. 5. 1:1 oran nda (750 µl) kloroform ilave edilir. 6. 10 dakika çalkalad ktan sonra 20 dakika buza gömülür. 7. 20 dakika 4000 rpm 4 ’de santrifüj edilir. 8. Süpernatant ba ka bir eppendorfa al r. 9. + Hacmin 1/10’u kadar Na asetat + toplam hacmin 2 kat kadar %95’lik etanol tüpe al nan süpernatanta ilave edilir. 10. DNA iplikçikleri beyaz yumak eklinde görünür hale gelinceye kadar tüp yava ça alt-üst edilir. 11. Örnek -20 ’de 1 gece bekletilir. .GÜN 1. Örnek 20 dakika 4000 rpm 4 ’de santrifüj yap r. 2. Tüpün dibine çökmü DNA yo unlu una bak larak eklenecek olan TE (TrisEDTA buffer) miktar belirlenir. Tüpün üstüne not edilir. 3. k m dökülür. 4. Örne e +500 µl %70’lik etanol ilave edilir. 5. 20 dakika 4000 rpm (Rounds per minute) 4 ’de santrifüj yap r. 6. Alkol dikkatlice dökülerek kurumaya b rak r. 7. Eppendorf tüpüne TE ilave edilir. 8. Tüp 37 su banyosunda 1 gece bekletilir. 38 Belli miktarlarda suland lan DNA’ lar n mililitredeki miktarlar Nanodrop kullan larak tayin edilmi tir. zolasyondan istenilen sonuç elde edilmedi i takdirde di er yöntemler denenmi tir. 3.2.2. Polimeraz zincir reaksiyon yöntemi (PCR) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farkl s cakl klardaki üç olay n sikluslar halinde tekrar na dayanmaktad r. PCR ile DNA fragmentleri ço alt labilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde edilebilir [113]. PCR analizindeki 3 ana basamaklar unlard r: 1. Denatürasyon: lk ad mda ço alt lacak DNA denatüre edilir. Çift zincirli DNA, tek zincirli hale gelene kadar r (90-95 de yakla k 5 dakika süreyle) [114]. 2. le me (Annealing): S cakl k 50 ila 70 aras nda bir de ere dü ürülür ve primerlerin tek zincirli hale getirilmi DNA’ ya ba lanmas sa lan r. Bu primerler yapay oligonükleotitlerdir (15-30 nükleotit uzunlu unda) ve ço alt lacak DNA k sm n uçlar ndaki tamamlay dizilere özgül olarak ba lan r. Bu primerler, kal p DNA’ n n sentezi için, ba lang ç noktas olarak görev yaparlar [114]. 3. Uzama (Extensiyon): DNA polimeraz’ n ya dayan kl bir ekli (s cak su kaynaklar nda ya ayan bir bakteriden elde edilen enzim, Taq polimeraz) reaksiyon kar na ilave edilir ve DNA sentezi 70 ila 75 aras ndaki cakl klarda gerçekle ir. Polimeraz enzimi, nükleotitleri 5’ den 3’ ne do ru ekleyerek primerlerin uzamas kopyas sa lar ve hedef DNA’ n n iki zincirli olu turur [114]. Bu üç basama n bitiminde bir döngü tamamlan r, yeni zincirler bir sonraki döngüde kal p görevi görürler. Yirmibe -otuz döngü sonunda DNA miktar nda yakla k 1 000 000 kez artma olur. Bu yöntem ile klonlama, dizi analizi, klinik tan ve genetik 39 taramalar gibi di er i lemlerde kullan lmak üzere bol miktarda hedef DNA fragmentleri elde edilir [114]. Daha önce genomik DNA protokollere uygun bir ekilde, periferik kandan izole edilmi tir. Primerler Msx1 geninin ekzon 2 kodlama bölgesini kapsayan fragmentleri ço altmak için kullan lm r (ekzon 2 için primer 2F ve 2R; Çizelge 3.1) [97]. Polimeraz zincir reaksiyonunda izole edilmi olan 20µl yo unluk içeren 50 ng genomik DNA, 1 x PCR tamponu, 1,9-2,0 mM MgCl2 (Magnezyum Klorür), 0,2 mM dNTP(Deoksiribonükleotittrifosfat), 0,2 µM primerlerden biri, 0,5 U Taq polimeraz, u parametrelerle: 94 C’ de 40s, 58 C’ de 40s ve 72 C’ de 40s, 35 döngü için kullan lm r [97]. Çizelge 3.1 Msx1 geni amplifikasyonunda kullan lan primerler [97] sim PCR 5´-3´ için primer dizisi Ürün boyutu (bp) P278S 2F GGCTGATCATGCTCCAATGC 2R CACCAGGGCTGGAGGAAT 556 3.2.3. Restriksiyon endonükleazlarla kesim nsan genomunda tek baz de iklikleri çok s kt r. Baz lar na göre bu s kl k her 100 baz çiftinde bir olarak ortaya ç kmaktad r. Bu nükleotit de ikliklerinin büyük ço unlu u zarars zd r. DNA Polimorfizmi, DNA üzerinde hastal a neden olmayan, suskun nükleotit de imleri olarak tan mlan r. E er bu polimorfizmler, bir restriksiyon enzimi kesme bölgesinin yok olmas na ya da yeniden olu mas na neden olurlarsa; kolayl kla saptanabilirler. DNA, bu enzimlerle kesildi inde farkl uzunlukta parçalar olu ur ve analizlerde de ik pozisyonlarda görülürler. Bunlara “Restriction fragment length polimorphism” (RFLP)/ “Restriksiyon enzimi uzunluk polimorfizmleri” denilmektedir [113]. 40 Çal mam zda PCR’ da gerekli ço altmalar yap ld ktan sonra, Msx1 genindeki nükleotitlerin de imini tan yan MwoI restriksiyon endonükleaz kullan larak bu gendeki nokta de imleri tespit edilmi tir. 3.2.4. Agaroz jel elektroforezi Agaroz, deniz yosunundan üretilen bir polisakkarittir. % 0,5 ve 2 (m/v) aras ndaki konsantrasyonlarda sulu çözeltilerde çözüldü ünde kat bir jel olu turur. Elektri i iletecek olan tampon çözelti varl nda agaroz jele elektriksel alan uyguland nda, DNA fragmentleri ekil ve ebatlar na göre belirli bir h zda pozitif elektroda (DNA son derece negatif yüklüdür) do ru jelin içinde hareket eder. Küçük do rusal fragmentler, agaroz liflerin olu turdu u a n engeline tak larak yava ilerleyen büyük fragmentlerden daha h zl hareket eder. Dolay yla elektroforezin bu i levi, DNA fragment kar mlar ebatlar na göre ay rmak için kullan r. DNA örnekleri jel yüzeyindeki kuyucuklara yerle tirilir, güç kayna aç r ve ayr yol veya hatlarda DNA örneklerinin jel içinde göç etmesine izin verilir. Eklenen boyada göç eder ve elektroforez i lemlerini takip etmek için kullan r. DNA, jeldeki etidyum bromürü kapmas yla veya elektroforezden bat lmas yla boyan r. UV sonra jelin etidyum bromür çözeltisine kla ayd nlat nca DNA renkli bir bant olarak görülür [87]. Çal mam zda Msx1 geninde MwoI restriksiyon endonükleaz enzimi ile muamele edilmi PCR ürünleri %2’ lik agaroz jelde, elektroforezde (page; Poliakrilamid jel elektroforezi) yürütülerek DNA parçalar tamponu kullan lm r. DNA’ n n UV n birbirinden ayr sa lanm r. TBE5X k alt nda görüntülenebilmesi için EtBr ilave edilmi tir. Jel UV Transilluminatörde görüntülenerek, sonras nda foto raf çekilmi tir. PCR ürünleri kesim noktalar na göre de erlendirilmi tir. 3.2.5. statistiksel analiz statiksel analiz için; Pearson Ki-Kare testi, Hardy-Weinberg Equilibrium ve Odds ratio testleri uygulanm r. Dudak damak yar kl bireylerde P278S de iminin allel 41 frekanslar için Pearson Ki-Kare testi kullan lm kontrol ve hasta gruplar nda gen de farkl k olup olmad r. Pearson Ki-Kare testi ile, imleri incelenerek, aralar nda anlaml bir na bak larak, gen de de erlendirilmi tir. P278S de Equilibrium testi kullan lm iminin hastal k üzerine etkisi iminin genotip frekanslar için Hardy-Weinberg r. Hardy-Weinberg Equilibrium testi ile, beklenen ve gözlenen de erler aras ndaki fark n anlaml olup olmad elimizdeki Türk hasta popülasyonunun genotip yap uyumlu olup olmad saptanm n, Hardy-weinberg kural ile olacakt r. Hastal a yakalanma risk oran belirlenmesinde ise odds ratio testi kullan lm olarak belirlenmi tir. de erlendirilecek, böylece n r. Anlaml k seviyeleri P<0,05 42 4. SONUÇ Msx1 geninin P278S bölgesinin, sendromsuz dudak ve/veya damak yar kl hastal ile ili kili olup olmad belirlemek için, Türk hasta ve kontrollerden al nan örneklerle, kromozom 4 üzerinde yer alan Msx1 geninin P278S bölgesindeki polimorfizmlerinin belirlenmesi amac yla yap lan bu yüksek lisans tez çal mas ile, 70 hasta birey (21 kad n 49 erkek) ve 81 kontrol grubundan al nan örnekler incelenmi tir. ncelemeler Msx1 geninin ekzon 2 bölgesindeki P278S bölgesinde gerçekle tirilmi tir. Sendromsuz dudak ve/veya damak yar kl Türk hastalarla yap lan polimorfizm çal mas nda, çal mada kullan lan 70 hastan n DNA örne inden sadece 3 hastada gen de imi belirlenmi tir. Bunlar n 3’ ü de heterozigot olarak belirlenmi tir. 81 bireyin bulundu u kontrol grubunda ise, heterozigot ve homozigot olguya rastlanmam r (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. Hasta ve kontrol gruplar nda heterozigot ve homozigot olgular n da Birey PCR RFLP Normal Heterozigot Homozigot Toplam Hasta + + 67 3 0 70 Kontrol + + 81 0 0 81 Toplam + + 148 3 0 151 4.1. Msx1 Geninin Amplifikasyon Sonuçlar DNA izolasyonunun belirtilen fenol kloroform metoduyla gerçekle tirilmesi sonras nda, hasta ve kontrol gruplar ndan Msx1 geni üzerinde 556 baz çiftlik bölge, PCR yöntemiyle amplifiye edildi, haz rlanan %2’ lik agaroz jel elektroforez yöntemi ile kontrol edildi (Resim 4.1). 43 Resim 4.1. DNA izolasyonu sonras PCR’la ço alt lan gen ürünlerinin jel görüntüsü 4.2. Msx1 Geninin RFLP Sonuçlar PCR ile amplifikasyonu yap lm ürünlerin gendeki de imini tan yan spesifik restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesimi sonras jel haz rlanarak analizler yap ld . MwoI restiriksiyon endonükleaz ile kesim yap lan PCR ürünleri kesim noktalar na göre de erlendirildi. Buna göre; 70 hastadan 3 heterozigot, 67 normal birey tespit edildi, mutant birey ise tespit edilmedi. RFLP metodu için, P278S bölgesinin Msx1 geni içerisindeki lokalitesi, MwoI enziminin, kesim için tan ma bölgesi olan “gcnnnnn/nngc” ve kesim yeri tespit edilmi tir ( ekil 4.1) (Çizelge 4.2). Msx1 geninin amplifiye edilen 556 baz çiftlik bölgesinin MwoI restriksiyon endonükleaz enzimi için, kesim bölgesi içeren homozigot bireylerde 120 bazçiftlik ekstra bant olmas beklenirken, çal mam zda homozigot birey tespit edilmedi. Heterozigot bireylerde ise 120 ve 108 bazçiftlik 2 bant gözlenmi tir (Çizelge 4.3). 44 MwoI enziminin tanma dizisi : gcnnnnn/nngc (enzim kesim yeri) 108 556 bp 448 448 436 120 8/61/90/121/148/165/197/219/301/328/ 380/395 Tan mlanan bölge ekil 4.1. MwoI enziminin tan dizi ve kesim yeri Çizelge 4.2. P278S gen bölgesinin Msx1 geni içerisindeki lokalitesi 2812 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 ttcatttgca aaatatattt tctggtatttg cttaacccct ccctccgcaa tggcgctgga tctccagctc ccaaggcaaa tgctgccacc ccgcggcggg aaaagtagac caagtgcctt tttggctatt tgcttttttt acacaagacg gcgcaagttc gctcagcctc gagactacaa ggctgccttc tgcctcgctc aggaacttct gcgcgatgcc attactactt ttctttcggc aaccgtaagc cgccagaagc actgagacgc gaggcagagc ggcctctcct tac(g)gtgcct cccctgcggg cggcaccgag cttg(ggctga cctcagggcg cgcggacgcc agtacctgtc aggtgaagat tggagaagct tccctctcgg ctggcccctt gttgcaatgg gcacttggcg tcatgctcca gctgagcccc cttcaccacc catcgccgag atggttccag gaagatggcc cggccccgca ccagcgcgcc gaattggaga gcactcaata atgc)ttctct ccagcctgca gcgcagcttgc cgcgcggagt aaccgccgcg gccaagccca gctgtagcgg gcgctg(c)ctg C>T (P278S) Çizelge 4.3. Restriksiyon endonükleazla kesim sonras nda beklenen tablo CC CT TT 120 108 8-395 (Tan mlanan Bölge) - - - - - - - RFLP metodu için gerekli ko ullar sa land ktan sonra, MwoI restriksiyon enzimi ile kesim gerçekle tirilmi ve jelde görüntülenmi tir (Resim 4.2). 45 Resim 4.2. Msx1 geni restriksiyon endonükleaz ile kesimi sonras olu an ürünlerin agaroz jel görüntüsü 4.3. Msx1 Geninden Elde Edilen Genotip Sonuçlar ve Ki-Kare Testi Msx1 geninde PCR ürünlerinin MwoI restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek agaroz jelde yürütüldükten sonra restiriksiyon endonükleaz enziminin gen de imini tan ma ve kesilimini gerçekle tirme durumuna göre; hasta ve kontrol bireylerin bu de imi ta ma durumlar say larak veriler elde edildi. Elde edilen bu veriler istatistiki olarak de erlendirildi. Sendromsuz dudak ve/veya damak yar kl Türk hastalarla yap lan polimorfizm çal mas nda, çal mada kullan lan 70 hastan n DNA örne ine bak ld gen de imi belirlendi (tek nükleotit de grubunda ise heterozigot olguya rastlanmam nda 3 hastada imi). 81 bireyin bulundu u kontrol r (Çizelge 4.4). Çizelge 4.4. Msx1 geni kontrol ve hasta gruplar nda gözlenen normal ve heterozigot olgular n yüzde oran n istatistiksel tablosu 46 Allel frekanslar belirlemek için yap lan Pearson Ki-Kare istatistiksel analizine göre P=0,060 bulunmu tur (Çizelge 4.5). P de eri 0,05’ ten büyük ç kt gen bölgesinin P278S de için MSX1 iminin dudak damak olu umunda belirleyici oldu unu söyleyemeyiz. Ancak P de eri 0,05’ ten çok büyük bir de er olmad geninde önemli bir gen de imi olabilece i dikkatten kaçmamal ndan MSX1 r. Kontrol ve hasta gruplar ndaki allel frekans de erleri Çizelge 4.6’ da gösterilmi tir. Çizelge 4.5. Pearson Ki-Kare testi Çizelge 4.6. Msx1 geni için kontrol ve hasta gruplar ndaki P278S de imi ve allel frekans de erleri Kontrol (n=81) Hasta (n=70) P de eri P278S de imi 3 0,060 Allel frekans 162 (%100) C 137 (%97,9) 3 (%2,1) T 4.4. Hardy-Weinberg Equilibrium Testi ve Genotip Frekanslar n Hesaplanmas statiksel analizlerden bir di eri olan Hardy Weinberg Equilibrium testi (HWE), hasta ve kontrol gruplar na ayr ayr uygulanm r. Hasta grubunda, Hardy Weinberg Equilibrium testinde P de eri P>0,05 oldu u için Hardy Weinberg dengesinden sapma olmad saptanm bölgesindeki gen de r. Hardy Weinberg dengesine göre, Msx1 geni P278S imleri, sendromsuz dudak ve/veya damak yar hastal için bir etki te kil etmemektedir. Hardy Weinberg Equilibrium testi kontrol grubuna 47 uyguland nda, grup içerisinde hiç heterozigot ve homozigot bulunmad (heterozigot=0, homozigot=0) hesaplanamam dengesinden sapma olup olmad için r. Bu nedenle Hardy Weinberg hakk nda bir de erlendirme yap lamam r (Çizelge 4.7). Kontrol ve hasta gruplar ndaki genotip frekans de erleri Çizelge 4.8’ de gösterilmi tir. Çizelge 4.7. Hardy-Weinberg Equilibrium için olas k oran testi Hasta P=0,834227 P>0,05 oldugu için Hardy-Weinberg’den sapma yoktur. Kontrol Hardy-Weinberg hesaplanamad Çizelge 4.8. Msx1 geni için kontrol ve hasta gruplar ndaki P278S de genotip frekans de erleri Kontrol (n=81) Hasta (n=70) P278S de imi 3 imi ve P de eri 0,834227 Genotip frekans 67 (%95,7) 81(%100) CC 3 (%4,3) CT 4.5. Odds Ratio Testi statiksel de erlendirmede son olarak hastal a belirlenmesinde odds ratio testi sonuçlar dikkate al nm yakalanma risk oran n r. Odds ratio testi beklenen ve gözlenenin birbirine oran eklinde hesaplanan bir testtir. Bu nedenle, yapt z çal ma de erlendirildi inde, kontrol grubunda hiç heterozigot ve homozigot bireyin olmamas , odds ratio testi hesaplamalar nda paydan n s r olmas na neden olmu tur ve bu durum bir belirsizlik ifadesi ortaya ç kard hesaplanamam için, odds ratio testi r. Bu nedenle odds ratio testine göre anlaml ya da anlams z bir sonuç elde edilememi tir. 48 Bu çal madaki kontrol ve hasta gruplar nda yap lan istatistiki analizlerde elde edilen genotip ve allel frekans de erleri tek bir çizelgede gösterilmi tir (Çizelge 4.9). Çizelge 4.9. Kontrol ve hasta gruplar ndaki MSX1 P278S’in genotip ve allel frekans de erleri Hasta (n=70) Kontrol (n=81) Genotip 81 (%100) 67 (%95,7) CC CT 3 (%4,3) 0 TT 0 0 df 1 2 0,022220 P de eri 0,834227 Allel C 137 (%97,9) 162 (%100) T 3 (%2,1) 0 df 1 P de eri 0,060 Sonuç olarak; damak dudak yar klar nda etkili olan önemli genlerden biri Msx1 genidir. Bu genin etkisi yap lan birçok çal mada kan tlanm r. Bu yüksek lisans tez çal mas nda Msx1 geni P278S bölgesinde meydana gelen gen de analizlerinin ve istatistiksel hesaplamalar imleri n gerçekle tirilmesiyle bu gen bölgesinin sendromsuz dudak damak yar kl Türk hastalarda genetik risk faktörü olup olmad belirlenmi tir. Yap lan istatiksel analizlere göre Türk popülasyonundaki gerek allel gerekse genotip frekanslar bölgesinin P278S de etkisinin olmad n P de eri 0,05’ ten büyük ç kt iminin damak dudak yar hastal n olu umundaki sonucunu ortaya koymaktad r. Ancak Pearson Ki-Kare testine göre bulunan P de eri 0,05’ ten çok büyük bir de er olmad önemli bir gen de için Msx1 gen imi olabilece i dikkatten kaçmamal ndan Msx1 geninde r. Bu konuda daha detayl ara rmalara ihtiyaç vard r. Türkiye’ de damak dudak yar klar konusunda baz çal malar yap lm olsa da, temelleri moleküler analize dayal çal malar oldukça 49 tl r, bu yüzden moleküler analiz temeline dayal , büyük aile ve popülasyon çal malar na ihtiyaç vard r. 50 5. TARTI MA zdaki yar klar, özellikle dudak ve/veya damak yar klar , çok önemli bir halk sa k problemidir, dünya çap nda her 500-1000 do umda 1’ ini etkilemektedir [6]. Bu rakamlar; etnik köken, co rafik köken, ya am tarz ve sosyoekonomik duruma ba r [7]. Damak dudak yar n genetik ve çevresel faktörlerin etkile imiyle olu tu u veya her iki faktörün de damak dudak yar olu umunda birlikte etkisinin oldu u dü ünülmektedir [13]. Baz hastalarda genetik faktörler ön plana ç km gibi gözükürken baz hastalarda çevresel faktörlerin, baz hastalarda ise hem genetik hem de çevresel faktörlerin birlikte damak dudak yar olu umuna neden oldu unu bildiren çal malar mevcuttur [14,15]. Damak dudak yar klar n de ik rklarda insidanslar farkl kullan lan farkl yöntemlerden dolay kesin s kl r [13]. Ara rmada belirlemek mümkün de ildir. Bir oran vermek gerekirse Türkiye’deki s kl k 1:1000, Amerika Birle ik Devletleri’ndeki kl k ise 1:600-1000’dir [20]. Kore’de yar k dudak ve damak görülme s kl 1,81/1000 olarak bildirilmi tir ayr ca bu Kore Cumhuriyeti'nde canl do umda yar k dudak ve dama n görülme s kl hakk nda ayr nt bilgi sa lamak için ülke çap nda ilk çal mad r [21]. Türkiye'de çok az say da istatistiksel çal ma bulunmaktad r, bu çal malardan birinde yar k dudak/damak görülme insidans binde 0,95, izole yar k damak görülme insidans binde 0,77 olarak bildirilmi tir [22]. Türkiye’ de yap lan birba ka çal mada, yar k dudak ve damak nedeni ile tedavi edilmi ve kay tlar tam olan 1229 hasta tespit edilmi tir. Bu 1229 hastan n %64,4’ ünde (793) dudak ve/veya damak yar yar n, %19,4’ünde izole dudak yar , %35,6’s nda (436) izole damak n oldu u görülmü tür [24]. Msx1 geni, nonsendromik CL/CLP/CP ile ilgili olarak analiz edilen en önemli aday genlerden biridir [67,68,69,70,71]. Msx1, di ve kraniyofasiyal iskelet geli imi için önemli bir faktördür ve terminal hücre farkl la mas nda önemli bir rol oynad dü ünülmektedir [70,72]. Dudak damak yar ve Msx1 geni ile ilgili farkl popülasyonlarda yap lan çal malar genin hastal k üzerindeki etkisini ortaya koymaktad r. Msx1 genindeki varyasyonlar n belirlenmesi için yap lan; dizi analizi, 51 çok say da popülasyon üzerinde çal lan SNP analizleri ve ba lant analizleri gibi birçok çal ma mevcuttur [68,69,96,97,100]. Vietnam ve Tayland popülasyonlar nda yap lan çal malarda, Msx1 geninin sendromsuz dudak damak yar katk olu umuna %2 oran nda belirlenmi tir [96,97]. Vieira ve arkada lar n Güney Amerika popülasyonunda (CLP ve CPO için P=0,037, CL/P için P=0,004), Otero ve arkada lar n Kolombiya popülasyonunda (P<0,0106) yapm olduklar çal malarda, Msx1 CA polimorfizminin dudak damak yar olu mas aç ndan olumlu bir etkisinin oldu u ileri sürülürken [95,100]; Jugessur arkada lar ve arkada lar n Norveç popülasyonunda (P=0,72), Lidral ve n Filipin popülasyonunda (CL/P için P=0,26, CPO için P=0,91) yapm olduklar çal malarda Msx1 CA polimorfizminin dudak damak yar aç ndan olumlu bir etkisinin olmad Huang ve arkada lar ileri sürülmü tür [69,94]. n Bat Çin’deki Han Çinlileri popülasyonunda (CP için P=0,021, CLP için P=0,010), Suzuki ve arkada lar Vieira ve arkada lar olu mas n Vietnam popülasyonunda, n Filipin popülasyonunda yapm Msx1 genindeki P147Q (440C>A) genetik de çal malarda P147Q genetik de imin, olduklar çal malarda, iminin varl dudak damak yar saptanm r ve bu olu mas aç ndan olumlu bir etkisinin oldu u ileri sürülürken [62,96,98]; Tongkobpetch ve arkada lar taraf ndan Tayland popülasyonununda yap lan çal mada P147Q genetik de dudak damak yar olu mas iminin aç ndan olumlu bir etkisinin olmad ileri sürülmü tür (allelik P=0,285, genotipik P=0,277) [97]. Butali ve arkada lar n Nijerya popülasyonunda (P=0,00002) yapm çal mada Msx1 genindeki A34G (101C>G) genetik de olduklar iminin dudak damak yar olu mas aç ndan olumlu bir etkisinin oldu u ileri sürülürken [103], Salahshourifar ve arkada lar n Malay popülasyonunda (P=0,813) yapm A34G (101C>G) genetik de bir etkisinin olmad iminin dudak damak yar ileri sürülmü tür [102]. olduklar çal mada olu mas aç ndan olumlu 52 Tongkobpetch ve arkada lar taraf ndan Tayland popülasyonununda, Salahshourifar ve arkada lar n Malay popülasyonunda (P=0,001), Jezewski ve arkada lar n Asya popülasyonunda (CL/P + CPO için P=0,0368, CPO için P=0,0072) yapm olduklar çal malarda Msx1 genindeki G110G (330C>T) genetik de damak yar iminin dudak olu mas aç ndan olumlu bir etkisinin oldu u ileri sürülmü tür [68,97,102]. Rafighdoost ve arkada lar taraf ndan Güneydo u ran popülasyonunda yapm olduklar çal mada Msx1 tek nükleotit polimorfizmi olan rs12532 (rs12532 AG genotipi için P=0,001, rs12532 GG genotipi için P=0,004) genetik de dudak/damak yar iminin olu mas aç ndan olumlu bir etkisinin oldu u ileri sürülürken [99], Huang ve arkada lar n Bat Çin’deki Han Çinlileri popülasyonunda yapm olduklar çal mada rs12532 (allelik CL için P=0,708, CP için P=0,602, CLP için P=0,623; genotipik CL için P=0,807, CP için P=0,614, CLP için P=0,877) genetik de iminin dudak damak yar olu mas aç ndan olumlu bir etkisinin olmad ileri sürülmü tür [98]. Huang ve arkada lar n Bat Çin’deki Han Çinlileri popülasyonunda yapm olduklar çal mada Msx1 geninde tek nükleotit polimorfizmi olan rs3821949 (allelik CL için P=0,476, CP için P=0,894; genotipik CL için P=0,574, CP için P=0,956, CLP için P=0,113) genetik de imi ve nonsendromik oral yar klar n olu umu aras nda anlaml bir ili ki olmad ileri sürülmü tür [98]. Rafighdoost ve arkada lar taraf ndan Güneydo u ran popülasyonunda yap lan çal mada, MSX1 tek nükleotit polimorfizmi olan rs3775261 genetik de nonsendromik dudak/damak yar k hastal olmad iminin n olu mas aç ndan bir risk faktörü ileri sürülmü tür [99]. Tongkobpetch ve arkada lar taraf ndan Tayland popülasyonunda, Singh ve Ramu taraf ndan Güney Hindistan popülasyonunda yap lan çal malarda Msx1 geni G267C (799 G> T) genetik de iminin dudak damak yar etkisinin oldu u ileri sürülmü tür [97,101]. olu mas aç ndan olumlu bir 53 Tongkobpetch ve arkada lar taraf ndan Tayland popülasyonunda yap lan çal madaki mutasyon analizleri sonuçlar na göre; Msx1 geninin ekzon 2 k sm ndaki missense tipi mutasyon ile 832C > T nükleotit de aminoasit de ikli inin izole dudak damak imi sonucu beklenen P278S yar na sebep olabilece i dü ünülmektedir [97]. Yap lan bu tez çal mas nda; Türk popülasyonundaki gerek allel gerekse genotip frekanslar n P de eri 0,05’ ten büyük ç kt için, Tongkobpetch ve arkada lar [97] taraf ndan bahsedilen Msx1 gen bölgesindeki P278S genetik de damak yar iminin, dudak olu umunda belirleyici oldu unu söyleyemeyiz. Ancak bu tez çal mas ndaki Pearson Ki-Kare testine göre bulunan P de eri 0,05’ ten çok büyük bir de er ç kmad de ndan Msx1 genindeki P278S genetik de imi olabilece i dikkatten kaçmamal iminin önemli bir gen r. Çal mam zda elde etti imiz bu verilerle, Türk popülasyonunda Msx1 geninde meydana gelen bu de sendromsuz dudak damak yar klar imin n olu umundaki etkisinin olup olmad saptam olsak da Msx1 genindeki bu de imin Türk popülasyonu için öneminin net bir ekilde anla labilmesi için daha fazla moleküler temelli mutasyon çal malar yla ve daha geni popülasyon gruplar olu turularak yap lacak çal malarla Msx1 geni P278S genetik de ayd nlat lmal genetik de iminin dudak damak yar na etkisinin olup olmad r. Bu çal madan elde edilen sonuçlar n, Msx1 genindeki P278S iminin nonsendromik dudak/damak yar na etkisi ile ilgili olarak, Türk toplumu için önemli bir veri olu turdu una inanmaktay z. Türkiye’ de Msx1 P278S de imiyle ilgili herhangi bir çal ma bulunmamas yapm önemini artt rmaktad r. Dolay yla bu tez çal mas oldu umuz bu tezin n, Türk popülasyonunda Msx1 geni üzerinde yap lacak olan bundan sonraki genetik ara rmalara kanaatindeyiz. k tutaca 54 KAYNAKLAR 1. Ho nuter, M., Aktunç, E., Karg , E., Ünalacak, M., Babucçu, O., Demircan, N., I kdemir, A., “Yar k damak dudak aile rehberi’’, Süleyman Demirel Üniversitesi T p Fakültesi Dergisi, 9( 1 ):9 - 1 3 (2002). 2. Coleman, J. R., Sykes, J. M. “The embryology, classification, epidemiology, and genetics of facial clefting” Facial Plastic Surgery Clinics of North America, 9(1):1-13 (2001). 3. Anastassov, G. E., Joos, U., “Comprehensive management of cleft lip and palate deformities”, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 59(9):1062-1075; discussion 1075-77 (2001). 4. Rajesh, P., Rajesh, R., Narayanan, V., Baig, M. F., Prabhu, V. R., Venkatesan, A., ”A Clinical profile to assess the potential risk factors for cleft lip and palate”, Journal of the Indian Society of Pedodontics and Preventive Dentistry, 18(4):147-150 (2000). 5. Ulucan, K., “Yar k damak-dudak vakalar nda fenotip genotip ili kisinin incelenmesi’’, Doktora Tezi, Marmara Üniversitesi Sa k Bilimleri Enstitüsü, stanbul, 1-72 (2009). 6. Murray, J. C., “Face facts: Genes, environment, and clefts”, American Journal of Human Genetics, 57:227–232 (1995). 7. Van den Boogaard, M. J. H., De Costa, D., Krepels, I. P. C., Liu, F., Van Duijn, C., Sinke, R. J., Lindhout, D., Steegers-Theunissen, R. P. M., “The MSX1 allele 4 homozygous child exposed to smoking at periconception is most sensitive in developing nonsyndromic orofacial clefts”, Human Genetics, 124: 525-534 (2008). 8. Marazita, M. L., Field, L. L., Cooper, M. E., Tobias, R., Maher, B. S., Peanch tlertajorn, S., Liu, Y., “Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in China: Assessment of candidate regions”, The Cleft Palate– Craniofacial Journal, 39(2): 149-156 (2002). 9. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M.J., Shaw, W. C., “Cleft lip and palate’’, Lancet, 374(9703): 1773–1785 (2009). 10. Ngai, C. W., Martin, W. L., Tonks, A., Wyldes, M. P., Kilby, M. D.,” Are isolated facial cleft lip and palate associated with increased perinatal mortality? A cohort study from the West Midlands Region 1995–1997”, The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine, 17(3): 203–206 (2005). 55 11. Christensen, K., Juel, K., Herskind, A. M., Murray, J. C.,” Long term follow up study of survival associated with cleft lip and palate at birth”, BMJ, 328(7453): 1405 (2004). 12. Nopoulos, P., Langbehn, D. R., Canady, J., Magnotta, V., Richman, L., “Abnormal brain structure in children with isolated clefts of the lip or palate”, Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine, 161(8):753–758 (2007). 13. Murray, J. C.,” Gene/environment causes of cleft lip and/or palate’’, Clinical Genetics, 61(4): 248–256 (2002). 14. Carinci, F., Scapoli, L., Palmieri, A., Zollino, I., Pezzetti, F., “Human genetic factors in nonsyndromic cleft lip and palate: An update”, International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 71(10):15091519( 2007). 15. Stanier, P., Moore, G. E., “Genetics of cleft lip and palate: syndromic genes contribute to the incidence of nonsyndromic clefts”, Human Molecular Genetics, 13(1):R73–R81 (2004). 16. Vieira, A. R., “Unraveling human cleft lip and palate research’’, Journal of Dental Research, 87(2):119-125 (2008). 17. Moore, K. L., Persaut, T. V. N, “ nsan Embriyolojisi 6. Bask ”, Y ld m M., Okar ., Dalç k H., Nobel Kitabevleri (2002). 18. Moore, K. L., “The developing human 3rd edition”, WB Saunders, Philadelphia, 197-213(1988). 19. Sözen, M. A., Tolarova, M. M., Spritz, R. A., “BCL3 geni ve nonsendromik dudak/damak hastal : Bir ili kilendirme çal mas ”, p Ara rmalar Dergisi, 5: 9-12 (2007). 20. Borçbakan, C., “An analysis of 1000 cases of cleft lip and palate in Turkey”, The Cleft Palate Journal, 6: 210-212( 1969). 21. Kim, S., Kim, W. J., Oh, C., Kim, J., “Cleft lip and palate incidence among the live births in the republic of Korea’’, Journal of Korean Medical Science, 17(1): 49-52 (2002). 22. Tunçbilek, E. (ed)., “Türkiye’de konjenital malformasyon s kl , da , risk faktörleri ve yenido anlar n antropometrik de erlendirilmesi”, Ankara TÜB TAK Matbaas , 94 (1996). 56 23. Hagberg, C., Larson, O., Milerad, J., “Incidence of cleft lip and palate and risks of additional malformations”, The Cleft Palate–Craniofacial Journal, 35(1):40-45(1998). 24. Tunçbilek, G., Özgür, F., Balc , S., “1229 Yar k dudak ve damak hastas nda görülen ek malfarmasyon ve sendromlar’’, Çocuk Sa ve Hastal klar Dergisi, 47(3):172-176( 2004). 25. Kerrigan, J. J., Mansell, J. P., Sengupta, A., Brown, N., Sandy, J. R., “Palatogenesis and potential mechanisms for clefting”, Journal of the Royal College of Surgeons of Edinburgh, 45(6):351-358 (2000). 26. Belloni, E., Muenke, M., Roessler, E., Traverso, G., Siegel-Bartelt, J., Frumkin, A., Mitchell, H. F., Donis-Keller, H., Helms, C., Hing, A. V., Heng, H. H., Koop, B., Martindale, D., Rommens, J. M., Tsui, L. C., Scherer, S. W., “Identification of Sonic hedgehog as a candidate gene responsible for holoprosencephaly”, Nature Genetics, 14(3):353-356 (1996). 27. Chiang, C., Litingtung, Y., Lee, E., Young, K. E., Corden, J. L., Westphal, H., Beachy, P. A.,”Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function”, Nature, 383 (6599):407-413 (1996). 28. Cooper, G. M., Hausman, R. E., “Hücre:Moleküler Yakla m 3.bask ” , Sak zl , M., Atabey, N., zmir Kitabevi, zmir, 578 (2006). 29. Choy, S. W., Cheng, S. H., “Hedgehog Signaling”, Vitamins & Hormones, 88:1-23 ( 2012). 30. Han, J., Mayo, J., Xu, X., Li, J., Bringas, P. Jr., Maas, R. L., Rubenstein, J. L., Chai,Y., “Indirect modulation of Shh signaling by Dlx5 affects the oralnasal patterning of palate and rescues cleftpalate in Msx1-null mice”, Development, 136 (24):4225-4233 (2009). 31. Cobourne, M. T., Xavier, G. M., Depew, M., Hagan, L., Sealby, J., Webster, Z., Sharpe, P. T., “ Sonic hedgehog signalling inhibits palatogenesis and arrests tooth development in a mouse model of the nevoid basal cell carcinoma syndrome”, Developmental Biology, 331(1):38-49 (2009). 32. Wong, F. K., Hagg, U., “ An update on the aetiology of orofacial clefts’’ Hong Kong Medical Journal, 10(5): 331-336( 2004). 33. Fogh-Andersen, P. , “Genetic and non-genetic factors in the etiology of facial clefts”, Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery, 1: 22-29 (1967). 57 34. Rintala, A., Ponka, A., Sarna, S., Stegars, T.,” Cleft lip and palate in Finland in 1948-75: correlations to infections, seasonal and yearly variations”, Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery,, 17(3): 197-201 (1983). 35. Mossey, P. A., Davies, J. A., Little, J., “ Prevention of orofacial clefts: does pregnancy planning have a role?”, The Cleft Palate-Craniofacial Journal, 44(3): 244–250 (2007). 36. Chen, X. K., Wen, S. W., Fleming, N., Yang, Q., Walker, M. C.,” Teenage pregnancy and congenital anomalies: which system is vulnerable?”, Human Reproduction, 22(6): 1730–1735 (2007). 37. Wyszynski, D. F., Wu, T., “Use of U.S. birth certificate data to estimate the risk of maternal cigarette smoking for oral clefting”, The Cleft PalateCraniofacial Journal, 39(2):188-192 (2002). 38. Wyszynski, D.F., Duffy, D. L., Beaty, T.H., “Maternal cigarette smoking and oral clefts: A meta-analysis”, The Cleft Palate-Craniofacial Journal, 34(3): 206-210 (1997). 39. Hartsfield, J. K., Hickman, T. A., Everett, E. T., Shaw, G. M., Lammer, E. J., Finnell, R. A., “Analysis of the EPHX1 113 polymorphism and GSTM1 homozygous null polymorphism and oral clefting associated with maternal smoking”, American Journal of Medical Genetics, 102(1):21-24 (2001). 40. Shaw, G. M., Wasserman, C. R, Lammer, E. J., O'Malley, C. D., Murray, J. C., Basart, A. M., Tolarova, M. M., “Orofacial clefts, parental cigarette smoking, and transforming growth factor-alpha gene variants”, American Journal of Human Genetics, 58(3):551-561, (1996). 41. Romitti, P. A., Lidral, A. C., Munger, R. G., Daack-H rsch, S., Burns, T. L., Murray, J. C., “Candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palate and maternal cigarette smoking and alcohol consumption: evaluation of genotype-environment nteractions from a population-based case-control study of orofacial clefts”, Teratology, 59(1):39–50 (1999). 42. Chevrier, C., Perret, C., Bahuau, M., Nelva, A., Herman, C., Francannet, C., Robert-Gnansia, E., Cordier, S., “Interaction between the ADH1C polymorphism and maternal alcohol intake in the risk of nonsyndromic oral clefts: An evaluation of the contribution of child and maternal genotypes”, Birth Defects Research (Part A): Clinical and Molecular Teratology ,73(2): 114–122 (2005). 43. Bille, C., Olsen, J., Vach, W., Knudsen, V.K., Olsen, S. F., Rasmussen, K., Murray, J. C., Andersen, A. M., Christensen, K., “ Oral clefts and life 58 style factors: a case cohort study based on prospective Danish data”, European Journal of Epidemiology, 22(3): 173–181 (2007). 44. Johnson, C. Y., Little, J., “Folate intake, markers of folate status and oral clefts: is the evidence converging? “, International Journal of Epidemiology, 37(5): 1041–1058 (2008). 45. Canfield, M. A, Collins, J. S, Botto, L. D., Williams, L. J., Mai, C. T., Kirby, R. S., Pearson, K., Devine, O., Mulinare, J., “ Changes in the birth prevalence of selected birth defects after grain fortification with folic acid in the United States: findings from a multi-state populationbased study”, Birth Defects Research (Part A): Clinical and Molecular Teratology, 73(10): 679–689 (2005). 46. Simmons, C. J., Mosley, B. S., Fulton-Bond, C. A., Hobbs, C. A., “Birth defects in Arkansas: is folic acid fortifi cation making a difference?”, Birth Defects Research (Part A): Clinical and Molecular Teratology, 70(9): 559–564 (2004). 47. Kelly, D., O'Dowd, T., Reulbach, U., “Use of folic acid supplements and risk of cleft lip and palate in infants: a population-based cohort study”, The British Journal of General Practice, 62(600):e466-472 (2012). 48. Li, S., Chao, A., Li, Z., Moore, C. A., Liu, Y., Zhu, J., Erickson, J. D., Hao, L., Berry, R. J., “Folic acid use and nonsyndromic orofacial clefts in China: a prospective cohort study”, Epidemiology, 23(3):423-432 (2012). 49. Warkany, J., Petering, H. G., “Congenital malformations of the central nervous system in rats produced by maternal zinc deficiency” , Teratology ,5(3): 319–334 (1972). 50. Tamura, T., Munger, R. G., Corcoran, C., Bacayao, J. Y., Nepomuceno, B., Solon, F., “Plasma zinc concentrations of mothers and the risk of nonsyndromic oral clefts in their children in the Philippines”, Birth Defects Research (Part A): Clinical and Molecular Teratology, 73:612–616 (2005). 51. Shaw, G. M., Nelson, V., Iovannisci, D. M., Finnell, R. H., Lammer, E. J., “Maternal occupational chemical exposures and biotransformation genotypes as risk factors for selected congenital anomalies”, American Journal of Epidemiology, 157(6):475-484 (2003). 52. Gordon, J. E., Shy, C. M., “Agricultural chemical use and congenital cleft lip and/or palate”, Archives of Environmental Health, 36(5):213-221 (1981). 59 53. Garcia, A. M., “Occupational exposure to pesticides and congenital malformations: a review of mechanisms, methods, and results”, American Journal of Industrial Medicine, 33(3):232-240 (1998). 54. Park-Wyllie, L., Mazzotta, P., Pastuszak, A., Moretti, M. E., Beique, L., Hunnisett, L., Friesen, M. H., Jasobson, S., Kasapinovic, S., Chang, D., Diav-Citrin, O., Chitayat, D., Nulman, I., Einarson, T. R., Koren, G., ”Birth defects after maternal exposure to corticosteroids: prospective cohort study and meta-analysis of epidemiological studies”, Teratology, 62(6):385-392 (2000). 55. Champe, P. C., Harvey, R. A., “Biyokimya 2. Bask ”, Tokullugil, A., Dirican, M., Ulukaya, E., Nobel T p Kitabevleri, stanbul, 226 (1997). 56. Carmichael, S. L., Shaw, G. M., Ma, C., Werler, M. M., Rasmussen, S. A., Lammer, E. J., “Maternal corticosteroid use and orofacial clefts”, American Journal Of Obstetrics and Gynecology, 197(6):585.e1-7; discussion 683-684, e1-7 (2007). 57. Carmichael, S. L., Shaw, G. M., “Maternal corticosteroid use and risk of selected congenital anomalies”, American Journal of Medical Genetics, 86(3):242–244 (1999). 58. Hviid, A., Mølgaard-Nielsen, D., “Corticosteroid use during pregnancy and risk of orofacial clefts”, Canadian Medical Association Journal, 183(7):796-804 (2011). 59. Lidral, C. A., Moreno, L. M., Bullard, S. A., “Genetic factors and orofacial clefting”, Seminars in Orthodontics, 14(2):103-114 (2008). 60. Prescott, N. J., Lees, M. M., Winter, R. M., Malcolm, S., “Identification of susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in a two stage genome scan of aff ected sib-pairs”, Human Genetics, 106(3): 345-350 (2000). 61. Zeiger, J. S., Hetmanski, J. B., Beaty, T. H., VanderKolk, C. A., Wyszynski, D. F., Bailey-Wilson, J. E., de Luna, R. O., Perandones, C., Tolarova, M. M., Mosby, T., Bennun, R., Segovia, M., Calda, P., Pugh, E. W., Doheny, K., McIntosh, I., “Evidence for linkage of nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate to a region on chromosome 2”, European Journal of Human Genetics, 11(11):835-839 (2003). 62. Vieira, A. R., Avila, J. R., Daack-Hirsch, S., Dragan, E., Fe´ lix, M. T., Rahimov, F., Harrington, J., Schultz, R. R., Watanabe, Y., Johnson, M., Fang, J., O’Brien, S. E., Orioli, M. L., Castilla, E. E., FitzPatrick, D. R., Jiang, R., Marazita, L. M., Murray, J. C., “Medical sequencing of candidate 60 genes for nonsyndromic cleft lip and palate”, PLoS Genetics, 1(6): e64 (2005). 63. Mangold, E., Reutter, H., León-Cachón, R. B. R., Ludwig, K. U., Herms, S., Chacón-Camacho, Ó., Ortiz-López, R., Paredes-Zenteno, M., ArizpeCantú, A., Muñoz-Jiménez, S. G., Nowak, S., Kramer, F. J., Wienker, T. F., Nöthen, M. M., Knapp, M., Rojas-Martínez, A., “Evaluating SKI as a candidate gene for non-syndromic cleft lip with or without cleft palate”, European Journal of Oral Sciences, 120(5):373-377 (2012). 64. Sahoo, T., Theisen, A., Sanchez-Lara, P. A., Marble, M., Schweitzer, D. N., Torchia, B. S., Lamb, A. N., Bejjani, B. A., Shaffer, L. G., Lacassie, Y., “Microdeletion 20p12.3 involving BMP2 contributes to syndromic forms of cleft palate”, American Journal of Medical Genetics Part A, 155(7):16461653 (2011). 65. Ghassibe-Sabbagh, M., Desmyter, L., Langenberg, T., Claes, F., Boute, O., Bayet, B., Pellerin, P., Hermans, K., Backx, L., Mansilla, M. A., Imoehl, S., Nowak, S., Ludwig, K. U., Baluardo, C., Ferrian, M., Mossey, P. A., Noethen, M., Dewerchin, M., François, G., Revencu, N., Vanwijck, R., Hecht, J., Mangold, E., Murray, J., Rubini, M., Vermeesch, J. R., Poirel, H. A., Carmeliet, P., Vikkula, M., “FAF1, a gene that s disrupted in cleft palate and has conserved function in zebrafish”, American Journal of Human Genetics ,88(2):150-161 (2011). 66. Hong, W., Hetmanski, J. B., Ruczinski, I., Liang, K. Y., Fallin, M. D., Redett, R. J., Raymond, G. V., Chou, Y. H., Chen, P. K., Yeow, V., Chong, S. S., Cheah, F. Sh., Jabs, E. W., Scott, A. F., Beaty, T. H., “ROR2 gene is associated with risk of non-syndromic cleft palate in an Asian population”, Chinese Medical Journal, 125(3):476-480 (2012). 67. Carinci, F., Pezzetti, F., Scapoli, L., Martinelli, M., Avantaggiato, A., Carinci, P., Padula, E., Baciliero, U., Gombos, F., Laino, G., Rullo, R., Cenzi, R., Carls, F., Tognon, M., “Recent developments in orofacial cleft genetics”, The Journal of Craniofacial Surgery, 14(2):130-143 (2003). 68. Jezewski, P. A., Vieira, A. R., Nishimura, C., Ludwig, B., Johnson, M., O’Brien, S. E., Daack-Hirsch, S., Schultz, R. E., Weber, A., Nepomucena, B., Romitti, P. A., Christensen, K., Orioli, I. M., Castilla, E. E., Machida, J., Natsume, N., Murray, J. C., “Complete sequencing shows a role for MSX1 in non-syndromic cleft lip and palate”, Journal of Medical Genetics, 40(6):399–407 (2003). 69. Jugessur, A., Lie, R. T., Wilcox, J. A., Murray, J. C., Taylor, A. J., Saugstad, O. D., Vindenes, A. H., Abyholm, F., “Variants of developmental genes (TGFA, TGF 3, and MSX1) and their associations with orofacial 61 clefts: A case-parent triad analysis”, Genetic Epidemiology, 24(3): 230– 239 (2003). 70. Blin-Wakkach, C., Lezot, F., Ghoul-Mazgar, S., Hotton, D., Monteiro, S., Teillaud, C., Pibouin, L., Orestes-Cardoso, S., Papagerakis, P., Macdougall, M., Robert, B., Berdal, A., “Endogenous Msx1 antisense transcript: In vivo and in vitro evidences, structure, and potential involvement in skeleton development in mammals”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(13):7336–7341 (2001). 71. Maestri, N. E., Beaty, T. H., Hetmanski, J., Smith, E. A., McIntosh, I., Wyszynski, D. F., Liang, K., Duffy, D. L., VanderKolk, C., “Application of transmission disequilibrium tests to nonsyndromic oral clefts: Including candidate genes and environmental exposures in the models”, American Journal of Medical Genetics, 73(3):337–344 (1997). 72. Lidral, A. C., Romitti, P. A., Basart, A. M., Doetschman, T., Leysens, N. J., Daack-Hirsch, S., Semina, E. V., Johnson, L. R., Machida, J., Burds, A., Parnell, T. J., Rubenstein, J. L. R., Murray, J. C., “Association of MSX1 and TGF 3 with nonsyndromic clefting in humans”, American Journal of Human Genetics, 63(2):557–568 (1998). 73. Dobias, S. L., Ma, L., Wu, H., Bell, J. R., Maxson, R.,” The evolution of Msx gene function: expression and regulation of a sea urchin Msx class homeobox gene”, Mechanisms of Development, 61(1-2):37-48 (1997). 74. Su, M.W., Suzuki, H. R., Solursh, M., Ramirez, F., “Progressively restricted expression of a new homeobox-containing gene during Xenopus laevis embryogenesis”, Development, 111: 1179- 1187 (1991). 75. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M., “Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish”, Development ,121(2):347-357 (1995). 76. Padanilam, B. J., Stadler, H. S., Mills, K. A., McLeod, L. B., Solursh, M., Lee, B., Ramirez, F., Buetow, K. H., Murray, J. C., “Characterization of the human HOX 7 cDNA and identification of polymorphic markers”, Human Molecular Genetics, 1(6):407-410 (1992). 77. Davidson, D. R., Hill, R. E.,” Msh-like genes: a family of homeobox genes with wideranging expression during vertebrate development”, Sem in Dev Biol., 2 :405-412 (1991). 78. Davidson, D., “The function and evolution of Msx genes: pointers and paradoxes”, Trends in Genetics, 11(10):405-411 (1995). 62 79. Shimeld, S. M., McKay, I. J., Sharpe, P. T., “The murine homeobox gene Msx-3 shows highly restricted expression in the developing neural tube”, Mechanisms of Development, 55(2):201-210 (1996). 80. Bendall, A. J., Abate-Shen, C., “Roles for Msx and Dlx homeoproteins in vertebrate development”, Gene, 247(1-2):17–31(2000). 81. Bendall, A. J., Ding, J., Hu, G., Shen, M. M., Abate-Shen, C., “Msx1 antagonizes the myogenic activity of Pax3 in migrating limb muscle Precursors”, Development, 126(22): 4965-4976 (1999). 82. Catron, K. M., Wang, H., Hu, G., Shen, M. M., Abate-Shen, C., “Comparison of MSX-1 and MSX-2 suggests a molecular basis for functional redundancy”, Mechanisms of Development, 55(2):185-199 (1996). 83. Catron, K. M., Iler, N., Abate, C., “Nucleotides flanking a conserved TAAT core dictate the DNA binding specificity of three murine homeodomain proteins”, Molecular and Cellular Biology, 13(4):2354-2365 (1993). 84. Bendall, A.J., Rincon-Limas, D.E., Botas, J., Abate-Shen, C., “Protein complex formation between Msx1 and Lhx2 homeoproteins is incompatible with DNA binding activity”, Differentiation, 63(3):151-157 (1998). 85. Zhang, H., Hu, G., Wang, H., Sciavolino, P., Iler, N., Shen, M. M., AbateShen, C., “Heterodimerization of Msx and Dlx homeoproteins results in functional antagonism”, Molecular and Cellular Biology, 17(5):2920-2932 (1997). 86. Hovde, S., Abate-Shen, C., Geiger, J. H., “Crystal structure of the Msx-1 homeodomain/DNA complex”, Biochemistry, 40(40):12013-12021 (2001). 87. Turner, P. C., McLennan, A. G., Bates, A. D., White, M. R. H., “Moleküler Biyoloji 2. Bask ”, Konuk M. , Nobel Yay n Da m, Ankara, 113-114,172 (2004). 88. Pawlowska, E., Jan k-Pap s, K., Jarosinska, M., Szcpzepanska, J., Blasiak, J., “Mutations in the human homeobox MSX1 gene in the congenital lack of permanent teeth”, The Tohoku Journal of Experimental Medicine, 217(4):307-312 (2009). 89. Alappat, S., Zhang, Z. Y., Chen, Y. P., “Msx homeobox gene family and craniofacial development”, Cell research,13(6):429-442 (2003). 90. Tureckova, J., Sahlberg, C., Aberg, T., Ruch, J. V., Thesleff, I., Peterkova, R., “Comparison of expression of the msx-1, msx-2, BMP-2 and BMP-4 63 genes in the mouse upper diastemal and molar tooth primordia”, The International Journal of Developmental Biology, 39(3): 459-468 (1995). 91. Zhang Z., Song Y., Zhao X., Zhang X., Fermin C., Chen Y., “ Rescue of cleft palate in Msx1-deficient mice by transgenic Bmp4 reveals a network of BMP and Shh signaling in the regulation of mammalian palatogenesis”, Development, 129(17): 4135-4146 (2002). 92. Hu, G., Lee, H., Price, S. M., Shen, M. M., Abate-Shen, C.,” Msx homeobox genes inhibit differentitation through upregulation of cyclin D1”, Development , 128(12): 2373-2384 (2001). 93. Zhang, Y., Zhao, X., Hu, Y., St Amand, T., Zhang, M., Ramamurthy, R., Qiu, M., Chen, Y., “Msx1 is required for the induction of Patched by Sonic hedgehog in the mammalian tooth germ”, Developmental Dynamics., 215(1):45-53 (1999). 94. Lidral, A. C., Murray, J. C., Buetow, K. H., Basart, A. M., Schearer, H., Shiang, R., Naval, A., Layda, E., Magee, K., Magee, W., ”Studies of the candidate genes TGF 2, MSX1, TGFA, and TGF 3 in the etiology of cleft lip and palate in the Philippines”, The Cleft Palate-Craniofacial Journal, 34 (1):1-6 (1997). 95. Otero,L., Gutiérrez,S., Cháves,M., Vargas,C., Bérmudez,L.,“Association of MSX1 with nonsyndromic cleft lip and palate in a Colombian population”, The Cleft Palate-Craniofacial Journal, 44(6):653-656 (2007). 96. Suzuki, Y., Jezewski, P. A., Machida, J., Watanabe, Y., Shi, M., Cooper, M. E., Viet le, L., Nquyen, T. D., Hai, H., Natsume, N., Shimozato, K., Marazita, M. L., Murray, J. C., “In a Vietnamese population, MSX1 variants contribute to cleft lip and palate”, Genetics in Medicine, 6(3):117125 (2004). 97. Tongkobpetch, S., Siriwan, P., Shotelersuk, V., “MSX1 mutations contribute to nonsyndromic cleft lip in a Thai population”, Journal of Human Genetics, 51(8):671–676 (2006). 98. Huang, Y.Q., Ma, J., Ma, M., Deng, Y., Li, Y.D., Ren, H.W., Zhao, G.Z., Guo, S.S., Wang, Y.Y., Zhang, G.X., Shi, B., “Association between MSX1 variants and oral clefts in Han Chinese in Western China”, DNA and Cell Biology, 30(12):1057-1061 (2011). 99. Rafighdoost, H., Hashemi, M., Narouei, A., Eskanadri-Nasab, E., DashtiKhadivaki, G., Taheri, M., “ Association between CDH1 and MSX1 gene polymorphisms and the risk of nonsyndromic cleft lip and/or cleft palate in a Southeast Iranian population”, The Cleft Palate-Craniofacial Journal, (2012). 64 100. Vieira, A.R., Orioli, I. M., Castilla, E. E., Cooper, M. E., Marazita, M. L., Murray, J. C., “MSX1 and TGF 3 contribute to clefting in South America”, Journal of Dental Research, 82(4):289-292 (2003). 101. Singh,V.P., Ramu,D.,“Association of MSX1 799G>T variant with nonsynd romic cleft lip/palate in South Indian adolescent patients”, International Journal of Paediatric Dentistry, 22(3):228-231 (2012). 102. Salahshourifar, I., Halim, A. S., Wan Sulaiman, W. A., Zilfalil, B. A.,” Contribution of MSX1 variants to the risk of non-syndromic cleft lip and palate in a Malay population”, Journal of Human Genetics , 56(11):755758 (2011). 103. Butali, A., Mossey, P. A., Adeyemo, W. L., Jezewski, P. A., Onwuamah, C. K., Ogunlewe, M. O., Ugboko, V. I., Adejuyigbe, O., Adigun, A. I., AbdurRahman, L. O., Onah, I. I., Audu, R. A., Idigbe, E. O., Mansilla, M. A., Dragan, E. A., Petrin, A. L., Bullard, S. A., Uduezue, A. O., Akpata, O., Osaguona, A. O., Olasoji, H. O., Ligali, T. O., Kejeh, B. M., Iseh, K. R., Olaitan, P. B., Adebola, A. R., Efunkoya, E., Adesina, O. A., Oluwatosin, O. M., Murray, J. C., “ Genetic studies in the Nigerian population implicate an Msx1 mutation in complex oral facial clefting disorders”, The Cleft Palate-Craniofacial Journal, 48(6):646-653 (2011). 104. Vastardis, H., Karimbux, N., Guthua, S. W., Seidman, J. G., Seidman, C. E., “A human MSX1 homeodomain missense mutation causes selective tooth Agenesis”, Nature Genetics, 13 (4):417-421 (1996). 105. Leoyklang, P., Siriwan, P., Shotelersuk, V., “A mutation of the p63 gene in non-syndromic cleft lip”, Journal of Medical Genetics, 43(6):e28 (2006). 106. Hwang, S. J., Beaty, T. H., Panny, S. R., Street, N. A., Joseph, J. M., Gordon, S., McIntosh, I., Francomano, C. A., “ Association study of transforming growth factor alpha (TGFa) TaqI polymorphism and oral clefts: indication of gene-environment interaction in a population-based sample of infants with birth defects”, American Journal of Epidemiology, 141(7):629–636 (1995). 107. Chevrier, C., Bahuau, M., Perret, C., Iovannisci, M. D., Nelva, A., Herman, C., Vazquez, M. P., Francannet, C., Robert-Gnansia, E., Lammer, J. E., Cordier, S., “Genetic susceptibilities in the association between maternal exposure to tobacco smoke and the risk of nonsyndromic oral cleft”, American Journal of Medical Genetics Part A, 146A(18):2396–2406 (2008). 108. Vieira, A. R., Modesto, A., Meira, R., Barbosa, A. S., Lidral, A. C., Murray, J. C., “ Interferon regulatory factor 6 (IRF6) and fibroblast growth 65 factor receptor 1 (FGFR1) contribute to human tooth agenesis”, American Journal of Medical Genetics Part A, 143A(6):538-545 (2007). 109. Vieira, A. R., Meira, R., Modesto, A., Murray, J. C., “MSX1, PAX9, and TGFA contribute to tooth agenesis in humans”, Journal of Dental Research, 83(9):723-727 (2004). 110. Ogawa, T., Kapadia, H., Wang, B., D'Souza, R. N., “Studies on Pax9-Msx1 protein interactions”, Archives of Oral Biology, 50(2):141-145 (2005). 111. Ogawa, T., Kapadia, H., Feng, J. Q., Raghow, R., Peters, H., D'Souza, R. N., “Functional consequences of interactions between Pax9 and Msx1 genes in normal and abnormal tooth development”, The Journal Of Biological Chemistry, 281(27):18363-18369 (2006). 112. Kouskoura, T., Fragou, N., Alexiou, M., John, N., Sommer, L., Graf, D., Katsaros, C., Mitsiadis, T. A., “The genetic basis of craniofacial and dental abnormalities”, Schweizer Monatsschrift für Zahnmedizin, 121(78):636-646 (2011). 113. Akar, N., “Klinik Moleküler Patoloji’ye Giri Yay nlar , Ankara, 154,225 (1999). 2. Bask ”, Ant p A. . 114. Klug, W. S., Cummings, M. R., “Genetik Kavramlar 6. Bask ”, Öner C. , Palme Yay nc k, Ankara, 515-516 (2003). 66 ÖZGEÇM Ki isel Bilgiler Soyad , ad : AKSOYLU,Tuba Uyru u : T.C. Do um Tarihi ve Yeri : 16.04.1986 Ankara Medeni Hali : Bekar Cep Telefonu : (0505)7086964 Email : tuuba_ak.soylu@hotmail.com itim Derece E itim Birimi Mezuniyet Yüksek Lisans Gazi Üniversitesi/Moleküler Biy. ve Gen. 2013 Lisans Gazi Üniversitesi/Biyoloji 2009 Lise Fatih Sultan Mehmet Lisesi(YDA) 2004 Yabanc Dil ngilizce
