ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ
advertisement
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Süleyman BAYRAM CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman BAYRAM DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 31/5/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/ Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir. ……………….................... ………………………….. ……................................ Prof.Dr.Mehmet TOPAKTAŞ Prof.Dr.Hikmet AKKIZ Prof. Dr. Salih KAFKAS Danışman 2. Danışman Üye ...………………............... ...……………………….. Prof.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Prof. Dr. Gökhan CORAL Üye Üye Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2008D4 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir. ÖZ DOKTORA TEZİ CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman BAYRAM ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ 2. Danışman : Prof. Dr. Hikmet AKKIZ Yıl: 2010, Sayfa: 161 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ : Prof. Dr. Hikmet AKKIZ : Prof. Dr. Salih KAFKAS : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI : Prof. Dr. Gökhan CORAL Hücre döngüsü kontrol noktası kinaz 2 (CHEK2) proteini çok çeşitli hücre tiplerinde DNA hasarı yanıtına katılır. Bu yüzden farklı kanser türlerine yatkınlığın belirlenmesi için bu protein genindeki mutasyonların saptanması önemlidir. CHEK2 genindeki mutasyonlar (I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC) serin/treonin kinaz aktivitesini bozar ve bu mutasyonlar çeşitli türdeki kanserler ile ilişki gösterir. Bu çalışmada, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda hepatoselüler ve kolorektal kanser gelişiminde önemli bir rol oynayıp oynamadıklarının araştırılması amaçlanmıştır. Toplam 210 kolorektal kanserli vaka, 165 hepatoselüler kanserli vaka ve 446 sağlıklı kontrolde CHEK2 gen mutasyonları PCR-RFLP ve ARMS-PCR metotları ile araştırılmıştır. Kolorektal kanserli, hepatoselüler kanserli ve sağlıklı kontrollerin hiçbirinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Türk populasyonunda, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları yok veya çok seyrek olabilir ve bunun yanında hepatoselüler ve kolorektal kanser oluşumu üzerine bir katkıları olmayabilir. Sonuç olarak, bu çalışma sonuçları doğrultusunda Türk populasyonunda CHEK2 mutasyonlarının klinik olarak genotiplendirilmesinin gerekmediği ortaya çıkmıştır. Anahtar Kelimeler: CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları, Hepatoselüler kanser, Kolorektal kanser, Türk populasyonu. I ABSTRACT Ph. D. THESIS INVESTIGATION ON THE RELATION OF THE MUTATIONS IN CHEK2 GENE TO HEPATOCELLULAR AND COLORECTAL CANCERS Süleyman BAYRAM DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisors :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ :Prof. Dr. Hikmet AKKIZ Year: 2010, Pages: 161 Jury :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ :Prof. Dr. Hikmet AKKIZ :Prof. Dr. Salih KAFKAS :Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI :Prof. Dr. Gökhan CORAL The cell cycle checkpoint kinase 2 (CHEK2) protein participates in the DNA damage response in many cell types. Therefore to determine the susceptibility to various cancer types it is important to detect mutations in this protein coding gene. Germline mutations in CHEK2 (I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC) impair serine/threonine kinase activity and these mutations are associated with a range of cancer types. This study aimed to investigate whether CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations play an important role in the development of hepatocellular and colorectal carcinomas in Turkish population. A total of 210 colorectal cancer cases, 165 hepatocellular cancer cases and 446 healthy controls were investigated for CHEK2 mutations by PCR-RFLP and ARMS-PCR methods. None of the colorectal cancer cases, hepatocellular cancer cases and healthy controls carried the CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations. In conclusion, our results show that CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations may be absent or be very infrequent and may not contribute to the predisposition for hepatocellular and colorectal carcinomas in Turkish population. Overall, our data suggest that genotyping of CHEK2 mutations in clinical settings in the Turkish population should not be recommended. Key words: CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations, Hepatocellular cancer, Colorectal cancer, Turkish population II TEŞEKKÜR Çalışmamın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen yapıcı ve yönlendirici fikirleri ile bana daima yol gösteren öğrencileri olmaktan mutluluk duyduğum danışman hocalarım Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ’a ve Prof. Dr. Hikmet AKKIZ’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Doktora Tez İzleme Komitesi üyesi Sayın Prof. Dr. Salih KAFKAS’a ve Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI’na çalışmamın tüm aşamalarında yönlendirici ve olumlu katkılarından dolayı teşekkür ederim. Doktora tezi jüri üyesi Sayın Prof. Dr. Gökhan CORAL’a yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle katkıda bulunduğu için teşekkürlerimi sunarım. Bütün çalışmalarımda, her konuda çok büyük yardımlarını gördüğüm Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dahiliye Gastroenteroloji Moleküler Biyoloji laboratuvarı sorumlusu Sağlık Teknikeri Aynur BEKAR’a ve Kimyager Ersin AKGÖLLÜ’ye teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında yardımlarını gördüğüm, Uzman Dr. Burhan ÖZDİL, Uzman Dr. Banu KARA, Dr. Ahmet Taner SÜMBÜL ve Dr. Havva YEŞİL’e teşekkürlerimi sunarım. Kalıtsal CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları bulunan ve çalışmamızda pozitif kontrol olarak kullanılan bireylerin biyolojik materyallerini (DNA ve periferik kan) gönderen Dr. Heli NEVANLINNA (Finlandiya), Dr. Cezary CYBULSKI (Polonya), Dr. Natalia BOGDANOVA (Almanya), Dr. Børge G. NORDESTGAARD (Danimarka) ve Dr. Darina V. KONSTANTINOVA’a (Bulgaristan) en içten teşekkürlerimi sunarım. Doktora çalışmalarım esnasında tüm bölüm olanaklarından yararlanmamı sağlayan Ç.Ü. Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı çalışanlarına ve projemize maddi destek veren Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne (Proje no: FEF2008D4) teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında bana her zaman destek olan sevgili aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ ...................................................................................................................... I ABSTRACT ....................................................................................................... II TEŞEKKÜR ....................................................................................................... III İÇİNDEKİLER ................................................................................................... IV ÇİZELGELER DİZİNİ ....................................................................................... XI ŞEKİLLER DİZİNİ ............................................................................................ XII SİMGELER VE KISALTMALAR ..................................................................... XIV 1.GİRİŞ .............................................................................................................. 1 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ................................................................................ 15 2.1. CHEK2 Mutasyonlarının Akciğer Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ..................................................... 15 2.2. CHEK2 Mutasyonlarının Beyin Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 16 2.3. CHEK2 Mutasyonlarının Böbrek Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 16 2.4. CHEK2 Mutasyonlarının Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 16 2.5. CHEK2 Mutasyonlarının Li-Fraumeni Sendromu Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 21 2.6. CHEK2 Mutasyonlarının Lösemi Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ...................................................................... 22 2.7. CHEK2 Mutasyonlarının Meme Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 22 2.8. CHEK2 Mutasyonlarının Melanoma Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 40 2.9. CHEK2 Mutasyonlarının Mesane Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 41 2.10. CHEK2 Mutasyonlarının Ovaryum Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ................................................... 41 IV 2.11. CHEK2 Mutasyonlarının Özefagus Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................. 42 2.12. CHEK2 Mutasyonlarının Pankreas Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ................................................... 43 2.13. CHEK2 Mutasyonlarının Prostat Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ................................................... 43 2.14. CHEK2 Mutasyonlarının Rahim Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ................................................... 46 2.15. CHEK2 Mutasyonlarının Tiroit Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ................................................... 46 2.16. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerin Oluşumuyla İlişkisini Araştıran Çalışmalardan Elde Edilen Sonuçların Toplu Değerlendirilmesi ....................................................................... 46 3. MATERYAL ve METOD............................................................................... 49 3.1. Hasta ve Kontrol Grubu ......................................................................... 49 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları ........................... 50 3.2.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ...................................................... 50 3.2.1.1.Agaroz (Sigma) .................................................................. 50 3.2.1.2. Etil Alkol (Merck) ............................................................ 51 3.2.1.3. İzopropanol (Sigma) ......................................................... 51 3.2.1.4. Ksilol (Merck) .................................................................. 52 3.2.1.5. Mineral Yağ (Sigma) ........................................................ 52 3.2.1.6. Brom Fenol Mavisi (Sigma) .............................................. 53 3.2.1.7. Ksilen Siyanol FF (Sigma) ................................................ 53 3.2.1.8. Gliserol (Sigma) ................................................................ 54 3.2.1.9. Trizma-Baz (Sigma) .......................................................... 55 3.2.1.10. Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (Sigma) ................. 55 3.2.1.11. Borik Asit (Sigma) .......................................................... 55 3.2.1.12. Suyla Hazırlanmış % 1’lik Etidyum Bromür Çözeltisi (Merck) ............................................................ 56 3.2.1.13. DNA Polimeraz Enzimi (Fermentas) ............................... 57 V 3.2.1.14. Deoksiribonükleosid Trifosfat Seti (dNTP)(Promega) ...... 57 3.2.1.15. DNA Marker (Promega) .................................................. 58 3.2.1.16. CHEK2 I157T Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti ...................................................................... 59 3.2.1.17. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti .................................................... 60 3.2.1.18. CHEK2 1100delC Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çiftleri................................................. 60 3.2.1.19. DNA İzolasyon Kiti (Roche) ............................................ 62 3.2.1.20. PstI Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs) ... 63 3.2.1.21. Hyp188III Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs) ................................................... 64 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları....................................................... 66 3.2.2.1. Santrifüjler ......................................................................... 66 3.2.2.2. Derin Dondurucular ........................................................... 66 3.2.2.3. Steril Kabin........................................................................ 66 3.2.2.4. Polimeraz Zincir Reaksiyon Aleti (Termal Cycler) ............ 66 3.2.2.5. Vorteks Aleti ..................................................................... 67 3.2.2.6. Kuru Isıtıcı......................................................................... 67 3.2.2.7. Hasas Terazi ...................................................................... 67 3.2.2.8. Manyetik Isıtcı ve Karıştıcı ................................................ 67 3.2.2.9. Buzdolabı .......................................................................... 68 3.2.2.10. Jel Elektroforez Sistemi ................................................... 68 3.2.2.11. Jel Görüntüleme Sistemi .................................................. 68 3.2.2.12. Jel Analiz Sistemi ............................................................ 68 3.2.2.13. Otomatik Mikropipetler.................................................... 68 3.3. DNA İzolasyonu .................................................................................... 69 3.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu ................................................ 69 3.3.2. Parafine Gömülü Kolorektal Kanser Dokusundan DNA İzolasyonu ............................................................................ 70 3.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ...................................................... 72 VI 3.5. Agaroz Jel Elektroforezi......................................................................... 75 3.5.1. % 2.5’lik Agaroz Jelin Hazırlanması.............................................. 75 3.5.2. PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR Örneklerinin Jele Konması ve Elektroforez ............................................................... 75 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi ......... 76 3.6.1. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması........................ 76 3.6.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi Sonucunda Görüntülenmesi ........................................ 79 3.6.3. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Analizi. ........................................................................ 80 3.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi ..................................................................................... 84 3.7.1. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması ..................................................................... 84 3.7.2. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi Sonuçunda Görüntülenmesi ......................... 87 3.7.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Analizi ....................................................... 88 3.8. CHEK2 1100delC Mutasyonun Allele Özgü Mutasyon Belirleme Yöntemi ile Belirlenmesi........................................................................ 91 3.8.1. CHEK2 1100delC Mutasyonu İçin PCR İşlemi.............................. 94 3.8.2. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Analizinin Agaroz Jel Elektrofez ile Analizi ..................................................................... 97 3.9. İstatistiksel Analizler .............................................................................. 101 4. BULGULAR .................................................................................................. 103 4.1. Çalışma Gruplarını Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri ........................ 103 4.1.1. Kontrol Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri ............................................................................... 103 4.1.2. Kolorektal Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin VII Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri ................................................ 103 4.1.3. Hepatoselüler Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel ve Klinik Bilgileri ............................................... 107 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları......................................................................... 109 4.2.1. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı ............................................................ 110 4.2.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı ............................................................ 112 4.2.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun (Bir Nükleotid Delesyonu Sonucu Oluşan Çerçeve Kayması Mutasyonu) Sıklığı............................................................................................ 114 5. TARTIŞMA ................................................................................................... 117 5.1. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri ........................................................... 117 5.2. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Hepatoselüler Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri ........................................................... 126 6. SONUÇ ve ÖNERİLER.................................................................................. 139 KAYNAKLAR ................................................................................................... 141 ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................... 161 VIII ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerle İlişkisi......... 47 Çizelge 3.1. CHEK2 Genindeki I157T Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi.................................................................... 59 Çizelge 3.2. CHEK2 Genindeki IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi.................................................................... 60 Çizelge 3.3. CHEK2 Genindeki 1100delC Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları, GC Oranları ve Baz Dizileri............................................................ 62 Çizelge 3.4. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid................. 77 Çizelge 3.5. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı.......................................................................... 79 Çizelge 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları.................................................................................. 79 Çizelge 3.7. PstI Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve CHEK2 I157T Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid......................... 81 Çizelge 3.8. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Reaksiyon Karışımı .............................................................. 82 Çizelge 3.9. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid..........................................85 Çizelge 3.10. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı................................................................. 86 IX Çizelge 3.11. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları............................................................................ 87 Çizelge 3.12. Hyp188III Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve IVS2 + 1G>A Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid...................... 89 Çizelge 3.13 CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Belirlenmesi İçin RFLP Reaksiyon Karışımı........................................................ 90 Çizelge 3.14. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve 1100delC Mutasyonunun Oluşmasına Neden Olan Nükleotid.................................................................... 93 Çizelge 3.15. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları..................................................................... 94 Çizelge 3.16. SLC30A9 Genine Özgü Primerlerin SLC30A9 Geni Üzerindeki Konumları..................................................................... 94 Çizelge 3.17. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Ouşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı...................................................................... 96 Çizelge 3.18. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı...................................................................... 97 Çizelge 3.19. CHEK21100delC Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları........................................................................... 97 Çizelge 4.1. Kolorektal Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgiler.................................................... 104 Çizelge 4.2. Hepatoselüler Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri.................................................... 108 Çizelge 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları.................................................................... 112 X Çizelge 5.1. Farklı Populasyonlarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyonlarının Sağlıklı Bireylerde Sıklıkları............. 120 Çizelge 5.2. Farklı Populasyonlardan Meme Kanserli ve Kontrol Bireylerinde CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı............................... ......... 129 XI ŞEKİLLLER DİZİNİ SAYFA Şekil. 1.1. DNA-Hasarı Kontrol Noktası Yolağında Sinyal İletiminin Kavramsal Organizasyonu.................................................................... 2 Şekil 1.2. İnsan CHEK2 Proteininin Yapısı ve Aktivasyon Noktaları.................. 4 Şekil 1.3. CHEK2 Proteininin Aktivasyon Modeli.................................................4 Şekil 1.4. DNA-hasarı Kontrol Noktası Yolağının Şematik Görünümü................ 5 Şekil 1.5. CHEK2 Geninin Yapısı.......................................................................... 7 Şekil 1.6. CHEK2 Geni İçersinde Bu Güne Kadar Tanımlanmış Mutasyonlar..... 8 Şekil 1.7. CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonu Sonucu Oluşan Anormal İlmek.....10 Şekil 3.1. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü.......................... ........................... 80 Şekil 3.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının % 2.5’luk Agaroz Jeldeki Görüntüsü.................................................... 84 Şekil 3.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü.................................... 88 Şekil 3.4. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü................................................... 91 Şekil 3.5. CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü...................................................................... 100 Şekil 4.1. Kalın Bağırsağın Bölümleri.................................................................. 105 Şekil 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi...................................................... XII 111 Şekil 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi........................................... 113 Şekil 4.4. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi................................ 115 Şekil 5.1. Kolorektal Kanser Gelişiminde Adenom-Karsinom Geçişine Eşlik Eden Değişiklikler ............................................................................... 123 Şekil 5.2. Avrupa Kökenli Meme Kanserli Hastalarda CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı.......................................................... 128 Şekil 5.3. Genetik Anormallikler Sonucu Oluşan Monogenik Ve Poligenik Sendromlar İle Hepatoselüler Kanser Oluşumu Arasındaki İlişki. ....... 134 Şekil 5.3. Hepatoselüler Karsinogenezisin Oldukça Kompleks Ve Çok Basamaklı Süreci................................................................................. 135 Şekil 5.4. Hepatoselüler Karsinomaya Bireysel Yatkınlık Modeli. ...................... 138 XIII SİMGELER ve KISALTMALAR AATF :Apoptosis antogonizing transcription factor ARMS-PCR :Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ATM :Ataxia telangiectasia mutated ATR :Ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related bç :baz çifti °C :Santigrat derece BRCA1 :Breast cancer 1 BRCA2 :Breast cancer 2 BSA :Bovin serum albümin CDC25A :Cell division cycle 25 homolog A CDC25C :Cell division cycle 25 homolog C CHEK2 :Checkpoint kinase 2 CHEK2 1100delC :CHEK2 geninin 1100. pozisyonunda bulunan sitozin nükleotidinin delesyonu mutasyonu CHEK2 I157T :CHEK2 proteininin FHA bölgesi içersinde bulunan 157. kodonun belirlediği izolösin (I) aminoasitinin treonin (T) aminoasitine dönüşümüne neden olan mutasyon CHEK2 IVS2+1G>A :CHEK2 geninin 2. intronunun ilk nükleotidinde meydana gelen, guanin (G) nükleotidinin adenin (A) nükleotidine dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonu DNA :Deoksiribonükleik asit dNTP :Deoksiribonükleosid trifosfat E2F1 :E2F transcription factor 1 EDTA :Etilendiamintetraasetik asit FHA :Forkhead’e benzer bölge FOXM1 :Forkhead box M1 gr :gram HPLC :Yüksek performanslı sıvı kromatografisi XIV Hyp188III :Helicobacter pylori 188 III MDM2 :Mouse double minute 2 MgCI2 :Magnezyum klorür MRE11 :Meiotic recombination 11 NBS1 :Nibrin NCBI :National Center for Biotechnology Information NLS :Nükleer lokalizasyon sinyal bölgesi PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PCR-RFLP :Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi pH :Hidrojen iyonu konsantrasyonu PML :Promyelocytic leukemia PstI :Providencia stuartii I RE :Restriksiyon endonükleaz SLC30A9 :Solute Carrier Family 30 (zinc transporter), member 9 SQ/TQ :Serin:Glutamin/Treonin:Glutamin bölgesi T (Thr) :Treonin TBE :Tris Borik EDTA çözeltisi Tm :Primerin erime (Melting) sıcaklığı TP53 :Tümör protein 53 I (Ile) :İzolösin XRCC1 :X-ray repair cross complementing protein 1 XV 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM 1. GİRİŞ Hücreler DNA’ya zarar veren endojen (reaktif oksijen türevleri, DNA replikasyon hatası) ve ekzojen (genotoksik kimyasallar, ultraviyole radyasyon, radyoterapötik ve kemoterapötik ajanlar) stresler tarafından sürekli tehdit altındadırlar (Ahn ve ark., 2004). Bu streslere karşı DNA doğru bir şekilde korunamaz ise DNA’da meydana gelen hasarlar genomik yapının bozulmasına ve nesilden nesile genetik bilginin doğru bir şekilde aktarılamamasına neden olur (Bartek ve ark., 2001). Genetik bilginin bütünlüğü, DNA’ya zarar veren bu streslerden hücre döngüsü sırasında karmaşık protein haberleşme ağları ile korunur (Antoni ve ark., 2007). Bu haberleşme ağları ile hücre döngüsü durdurulur ve DNA tamir mekanizmaları aktiflenir. Eğer DNA tamiri gerçekleştirilemez ise hücre yaşlanır veya ölür. Evrim süresi boyunca organizmalar DNA hasarına yanıt verebilecek ve DNA hasarını tamir edebilecek çok sayıda haberleşme ağları edinmişlerdir (Bartek ve ark., 2001). Bu haberleşme ağlarından biri olan DNA-hasarı kontrol noktası yolağı hücrenin genomik bütünlüğünü koruyan ve organizmada tümör gelişimini engelleyen hücresel bir denetim sistemidir (Bartek ve Lukas, 2007). Bu kontrol noktası yolağı DNA hasarını algılayabilmekte ve hücre döngüsü düzenleyicilerinin aktivitelerini inhibe ederek hücre döngüsünü durdurabilmektedir. Aktiflenen DNA-hasarı kontrol noktası yolağı böylece genetik dengesizliğin meydana gelmesini engeller veya geciktirir. Bundan dolayı bu kontrol noktası yolağı kanser gelişmesine karşı bir bariyer olarak rol oynamaktadır (Bartkova ve ark., 2005; Gorgoulis ve ark., 2005). Genotoksik kimyasallar, ultraviyole ışınlar (UV) ve iyonize radyasyon gibi çevresel mutajenlerin yanında normal hücresel metabolizma sonucu oluşan reaktif oksijen türevleri ve replikasyon hataları DNA hasarlarına neden olmaktadırlar (Rotman ve Shiloh, 1997; Bartek ve ark., 2001; Hoeijmakers, 2001; Antoni ve ark., 2007). DNA-hasarı kontrol noktası yolağında DNA hasarları algılayıcı (sensör) proteinler tarafından algılanır. Algılanmış olan bu DNA hasarı sinyali, aracı (mediyatör) proteinler ile iletim (transdüser) proteinlerine aktarılır. İletim proteinlerinden etkileyici (efektör) proteinlere aktarılan DNA hasar sinyali hücrede 1 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM bir dizi biyokimyasal işleme neden olur. Bu işlemler sonucunda hücre döngüsünün durdurulması, DNA tamiri veya apopitozis gerçekleşir (Şekil 1.1.) (Niida ve Nakanishi, 2006). DNA’da Hasara Neden Olan Etkenler Hücresel metabolizma UV ışık İyonize edici radyasyon Kimyasallar Replikasyon hatası DNA hasarı Algılayıcı (sensör) proteinler İletim (transdüser) proteinler Etkileyici (efektör) proteinler DNA tamiri Hücre döngüsünün durdurulması Transkripsiyon Apopitozis Şekil. 1.1. DNA-Hasarı Kontrol Noktası Yolağında Sinyal İletiminin Kavramsal Organizasyonu CHEK2 geni insanın 22. kromozomunun uzun kolu üzerinde bulunmaktadır. CHEK2 (checkpoint kinase 2=hücre döngüsü kontrol noktası kinaz 2) geninin ürünü bir serin/treonin kinaz olup DNA-hasarı kontrol noktası yolağında bulunan merkezi bir öneme sahip iletim (transdüser) proteinidir. Bu iletim poteini 543 aminoasitten ibaret olup, dört farklı fonksiyonel bölgeye sahiptir: 2 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM 1) Serin:Glutamin/Treonin:Glutamin (SQ/TQ) dizi bölgesi (19.-69. aminoasit bölgesi): Bu bölge CHEK2 proteininin amino (NH2) uç bölgesindedir. Bu bölgede serin-glutamin (SQ) veya treonin-glutamin (TQ) aminoasit dubletlerinin 7 tanesinin bir araya gelmesinden oluşan bölge dikkat çekicidir (örn. SQ, TQ, SQ, TQ, SQ, TQ, SQ veya SQ, TQ, SQ, SQ, SQ, SQ, TQ). Çünkü CHEK2 proteininin bu bölgesi ATM (ataxia telangiectasia mutated)/ATR (ataxia telangiectasia ve Rad3 ilişkili) proteinleri tarafından fosforile edilir. Bu yüzden CHEK2 proteininin bu bölgesi düzenleyici fonksiyona sahip bir bölgedir (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001). 2) Forkhead’e benzer bölge (FHA) (115.-175. aminoasit bölgesi): CHEK2 proteininin diğer bir anahtar role sahip bölgesidir. İlk defa Forkhead (çatalbaş) transkripsiyon faktörlerinde bu Forkhead’e (çatalbaş) benzer bölgeler kimliklendirilmiştir. Daha sonraları bu bölgelerin bir çok proteinde ve özellikle de nükleus içindeki proteinlerde bulunduğu bildirilmiştir. Bu bölgenin fosforlanmış treonin aminoasitlerine bağlandığı belirlenmiştir. Bu bulgular, bu bölgenin proteinprotein etkileşiminde rolü olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu bölge CHEK2 proteininin substratları ile dinamik etkileşiminde görevlidir (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001). 3) Serin/Treonin kinaz bölgesi (226.-486. aminoasit bölgesi): Bu bölge CHEK2 proteininin oluşturmaktadır. karboksil Serin/Treonin (COOH) kinaz uç bölgesi bölgesinin CHEK2 yaklaşık yarısını proteininin anahtar fonksiyonlu bölgesi olup, bu fonksiyona sahip olması başka Serin/Treonin kinazlar ile homoloji göstermesinden kaynaklanmaktadır. Bu bölge içerisinde T-ilmeği (Tloop) bulunur (Şekil 1.2) (Bartek ve ark., 2001). 4) Nükleer Lokalizasyon Sinyal (NLS) bölgesi (515.-522. aminoasit bölgesi): Bu bölge bir veya daha fazla sayıda pozitif yüklü lizin veya arjinin aminoasitlerini bulunduran bölgedir. Proteinin bu bölgesi molekülün Nükleer Por Kompleks aracılığı ile hücrenin nükleusuna taşınmasında görev alan hedef bölgedir. Çünkü Sitozolik Nükler Transport Reseptörleri yeni sentezlenmiş CHEK2 proteinini bu sinyal bölgesinden tanıyarak nükleusa taşır (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001). CHEK2 proteini hücre döngüsü süresince hücre içerisinde aktif olmayan bir formda bulunur. Hücre içerisinde DNA hasarı meydana geldiğinde hasar sinyali sensörler (algılayıcılar) tarafından algılandıktan sonra CHEK2 proteini, ATM/ATR 3 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM Kinaz bölgesi T ilmeği Şekil 1.2. İnsan CHEK2 Proteininin Yapısı ve Aktivasyon Noktaları. Şeklin alt kısmında görülen rakamlar CHEK2 proteininin fonksiyonel bölgelerinin aminoasit aralıklarını göstermektedir. Üst kısımda kalın yazılmış olan bölgeler CHEK2 proteininin fonksiyonunun düzenlenmesi sırasında fosforlanan aminoasitleri, diğerleri DNA hasarına yanıt sırasında fosforlanan aminoasitleri göstermektedir (Antoni ve ark., 2007). aracılığı ile SQ/TQ dizi bölgesi içinde bulunan treonin 68 (T68) aminoasiti üzerinden fosforile edilir. Bu fosforilasyonu sonucunda CHEK2 proteini treonin 383 (T383) ve treonin 387 (T387) üzerinden de otofosforilasyon ile aktif forma dönüşür (Şekil 1.3.) (Bartek ve ark., 2001). Hücresel proteinlerin fosforilasyonu, fosforlanmış bu proteinlerin hızlı ve spesifik düzenlenmesini, diğer proteinlerle ve moleküllerle etkileşimini ve bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonları (yerleşimini) gibi çok yönlü fonksiyonlarını aktifleştirir. Bir çok protein kinaz çok çeşitli hücresel sinyalleri başlatır veya yayar. Bu protein kinaz enzimleri bu görevlerini ATP (adenozin trifosfat)’den protein kinaz enziminin substratına fosfat gruplarını transfer ederek substratın (=protein) modifikasyonunu (değişimini) tamamlayarak gerçekleştirirler. Kina z bö lges i Otofosforilasyon Kin az b ö lg esi Şekil 1.3. CHEK2 Proteininin Aktivasyon Modeli 4 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM DNA hasarının meydana gelmesi DNA hasarına spesifik protein komplekslerinin oluşumunu başlatır. DNA çift iplik kırığının meydana gelmesi, çift iplik kırık hasarına spesifik protein kompleksi olan MRN (MRE11(meiotic recombination 11)-RAD50-NBS1 (nibrin)) protein kompleksinin (sensör proteinler) oluşumuna neden olur, bu kompleks de ATM’yi aktive eder. Aktive olan ATM, CHEK2 proteinini fosforile eder. CHEK2 proteininin fosforlanması sonucunda hücrede bir çok CHEK2 substratı, fosforilasyon ile aktive olur. CHEK2 substratlarının fonksiyonları sonucunda, DNA hasarı meydana gelen hücrenin yaşamının geleceği belirlenir (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007). DNA çift iplik kırığı Alkilleyici ajanlar Replikasyon stresi DNA-hasarı sensörü DNA-hasarı sinyalinin iletimi DNA-hasarı sinyali effektörleri Yaşlanma DNA tamiri Apopitozis Apopitozis G1’de durdurulma S ve G2’de durdurulma G2’de durdurulma Şekil 1.4. DNA-hasarı Kontrol Noktası Yolağının Şematik Görünümü. Yeşil ile boyanan semboller CHEK2 proteinine spesifik olan substratları, mavi olanlar CHEK1 proteinine spesifik substratları göstermektedir. Kırmızı ile gösterilenler hem CHEK2 hem de CHEK1 tarafından ortak olarak kullanılan substratlardır (Antoni ve ark., 2007). 5 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM CHEK2, BRCA1 (breast cancer 1) proteininin serin 988 (S988) aminoasitini fosforile ederek DNA tamirini başlatır (Şekil 1.4.). Buna ek olarak CHEK2 bir transkripsiyon faktörü olan FOXM1 (forkhead box M1)’i fosforile ederek bu transkripsiyon faktörünün stabilitesini artırır. FOXM1 transkripsiyon faktörü homolog rekombinasyon DNA tamir mekanizmasında görev alan BRCA2 (breast cancer 2) ve baz eksizyon (kesip-çıkarma) tamir mekanizmasında görev alan XRCC1 (X-ray repair cross complementing protein 1) genlerinin ekspresyonlarını artırır (Lee ve ark., 2000; Zhang ve ark., 2004; Wang ve ark., 2006a; Wang ve ark., 2006b; Tan ve ark., 2007). DNA’da meydana gelen hasarın tamir edilebilmesi için hücre DNA sentezini ve hücre döngüsünü durdurur. CHEK2 proteini, hücre döngüsünü düzenleyen anahtar moleküllerden biri olan CDC25C (Cell division cycle 25 homolog C)’nin inhibisyon aminoasiti olan serin 216 (S216)’yı fosforile ederek G2/M hücre döngüsü kontrol noktasının gecikmesine ve hücrenin mitoz bölünmeye girişine engel olur (Matsuoka ve ark., 1998; Blasina ve ark., 1999; Chaturvedi ve ark., 1999). Bununla birlikte CHEK2 proteini, diğer bir hücre döngüsü düzenleyici proteini olan CDC25A (cell division cycle 25 homolog A)’nın serin 123 (S123), serin 178 (S178) ve serin 292 (S292) aminoasitlerini fosforile ederek hücre döngüsünün G1 evresinin gecikmesine ve S evresine girişini engeller. Ayrıca CHEK2 proteini, DNA’da hasar meydana geldiğinde hücre döngüsünü G1/S ve G2/M hücre döngüsü kontrol noktalarında p53 (tumor protein p53) proteini yolu ile durdurulmasında görev yapar. CHEK2 proteini p53 proteinini serin 20 (S20) aminoasitinden fosforile ederek p53’ün MDM2 (mouse double minute 2 homolog) ile ilişkisini bozarak p53’ün stabilitesini artırır. DNA’da hasarlar meydana geldiğinde bir transkripsiyon faktörü olan AATF (apoptosisantagonizing transcription factor), ATM ve CHEK2 tarafından fosforile edilerek aktive edilir. AATF transkripsiyon faktörü p53 ekspresyonunu artırır. Ayrıca DNA hasarı durumunda p53’ün serin 366 (S366) ve treonin 387 (T387) aminoasitleri CHEK2 proteini tarafından fosforlanarak p53 proteini aktive edilir (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007). Hücre tamir edemeyeceği kadar DNA hasarı ile karşılaştığı zaman apopitozisi başlatır. Tamir edilemeyen DNA hasarına yanıt olarak CHEK2 proteini bir çok 6 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM substrat ile etkileşimi sonucunda apopitozisi başlatır. CHEK2 proteini tamir edilemeyen DNA çift iplik kırık hasarlarına yanıtta bir tanskripsiyon faktörü olan E2F1 (E2F transcription factor 1)’in serin 364 (S364) aminoasitini fosforile eder. Bu fosforilasyon sonucunda E2F1’in stabilitesi ve transkripsiyonel aktivasyonu artar. Bunun sonucunda p53’ten bağımsız olarak apopitozis gerçekleşir. Bundan başka CHEK2 proteini, p53-bağımsız apopitozis’i tümör süpressör pre-myelötik lösemi (PML= promyelocytic leukemia) proteinini, serin 117 (S117) aminoasitinden fosforile ederek başlatır. PML bir çok pro-apopitotik yola aracılık eder (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007). Hücre yaşlanması, hücre döngüsünün durdurulmasının bir formudur. CHEK2’nin hücre yaşlanmasını indüklediği de bildirilmiştir. Sürekli replikasyon sonucunda meydana gelen telomer erozyonu CHEK2’yi aktive eder. CHEK2 proteini hücre yaşlanmasını p53 aracılığı ile başlatır (Antoni ve ark., 2007). DNA-hasarı kontrol noktası yolağı evrimsel süreç boyunca mayalardan insanlara kadar korunmuştur. İnsandaki CHEK2 geninin, Schizosaccharomyces pompe’de bulunan Cds1 kinaz geni ve Saccharomyces cerevisia’da bulunan Rad53 kinaz geni ile homolog olduğu bulunmuştur (Allen ve ark., 1994; Murakami ve Okayama, 1995). 1998 yılında insan CHEK2 geni klonlanmıştır (Matsuoka ve ark., 1998). CHEK2 geni 22. kromozomun uzun kolunda bulunmaktadır (22q12.1). CHEK2 geni yaklaşık olarak 50 kilobaz uzunluğunda ve 14 ekzondan meydana gelmektedir (Şekil 1.5.). CHEK2 geninin 11.-14. ekzonları ile baz sıraları yönünden yüksek homoloji gösteren DNA bölgeleri 2., 7., 10., 13., 15., 16., X ve Y kromozomları üzerinde bulunmaktadır (Bartek ve ark., 2001). Şekil 1.5. CHEK2 Geninin Yapısı. Şekilde, her ekzonun hangi anlamlı nükleotid çifti aralığında bulunduğu gösterilmiştir. Genin toplam uzunluğu (ekzon+intron) 50 kb kadardır. 7 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM Bugüne kadar meme, kolorektal, akciğer, mesane, ovaryum kanserlerinde, lenfomalarda [Akut Lenfoid Lösemi (ALL), non-Hodgking Lenfoma (NHL)] ve Lifraumeni sendromunda CHEK2 geni içerisinde bir çok mutasyon tanımlanmıştır (Bartek ve Lukas, 2003) (Şekil 1.6). Bu mutasyonlar içerisinde en çok dikkati çeken mutasyonlardan biri CHEK2 proteininin Serin/Treonin kinaz bölgesini oluşturan ekzon 10’da meydana gelen CHEK2 1100delC mutasyonudur. CHEK2 1100delC mutasyonu genin 1100. pozisyonunda bulunan tek sitozin nükleotidinin delesyonu sonucunda ortaya çıkan çerçeve kayması (frameshift) tipi gen mutasyonudur. Delesyonun meydana geldiği kodon, 360. kodondur. CHEK2 360. kodon ve bu kodondan sonraki tüm kodonların aminoasit anlamları değişir ve bununla birlikte 380. kodon bir stop (durdurucu) kodona dönüşür. Bu mutasyon sonucunda yarım (=kesik, truncated) protein oluşur ve bu protein, serin/treonin kinaz fonksiyonuna sahip değildir (Wu ve ark., 2001). Kinaz Bölgesi Şekil 1.6. CHEK2 Geni İçersinde Bu Güne Kadar Tanımlanmış Mutasyonlar. CHEK2 geninde belirlenen diğer bir mutasyon I157T mutasyonudur. Bu mutasyon CHEK2 proteininin FHA bölgesi içersinde bulunan 157. kodonun belirlediği izolösin aminoasitinin treonin aminoasitine dönüşümüne neden olur (yanlış anlamlı =missense). Bu mutasyon 470. nükleotid olan Timin’in (T) Sitozin’e (C) dönüşmesi şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur. Bu mutasyon I157T [İzolösin (ATT) 157 à Treonin (ACT)] şeklinde gösterilmektedir. Yapılan çalışmalar I157T mutasyonuna sahip CHEK2 proteininin bozulmamış ve normal bir 8 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM şekilde aktive olduğunu göstermiştir. Fakat aynı çalışmalarda, CHEK2 I157T mutasyonunun CHEK2 proteini ile CHEK2’nin substratları olan p53, BRCA1 ve CDC25A proteinleri arasındaki etkileşimi bozduğu gösterilmiştir. CHEK2 I157T mutant proteini doğal-tip CHEK2’i proteini ve CHEK2 I157T mutant proteini ile dimer teşkil edebilmektedir. CHEK2 I157T mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran bireylerde aynı hücre içerisinde mutasyona uğramış allelin oluşturduğu protein ile yabani tip allelin meydana getirdiği proteinin dimer oluşturarak CHEK2 proteininin inaktivasyonuna neden olduğu ve bu mutant proteinin hücrede bu şekilde dominant negatif etki gösterdiği saptanmıştır. Bununla birlikte CHEK2 I157T mutant proteininin bozulmuş oligomerizasyonu CHEK2 I157T mutant proteinlerinde otofosforilasyonu azaltmaktadır. CHEK2 I157T mutant proteinindeki bu değişim bu proteinin fonksiyonlarını azaltmaktadır (Falck ve ark., 2001a; Falck ve ark., 2001b; Li ve ark., 2002; Schwarz ve ark., 2003). Bir diğer mutasyon ise CHEK2 geninin 2. intronunun [intervening sequence (IVS) intragenic region] ilk nükleotidinde meydana gelen, Guanin (G) nükleotidinin Adenin (A) nükleotidine dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur ve IVS2 + 1G>A şeklinde gösterilmektedir. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu mRNA modifikasyonu yapılırken 2. intronun kesip-çıkarma (splicing) işleminin yapıldığı tanınma bölgesindedir. Bu mutasyon anormal bir ilmek olayına neden olur. Anormal ilmek olayının gerçekleşmesi sonucunda pre-mRNA’nın yanlış işlenmesi meydana gelir. Böyle işlenmiş olgun mRNA’nın 3. ekzonunun 5’ tarafına 4 nükleotidin girmesi gerçekleşmiş olur (Şekil 1.7). 4 nükleotidin ekzon 3 içerisine bu girişi sonucunda bu noktadan sonra tüm kodonların aminoasit belirleyen anlamları değişir ve ayrıca CHEK2 geninin 3. ekzon bölgesinde anlamsız (stop) kodon oluşur. Bu mutasyonu taşıyan CHEK2 geninden sentezlenen CHEK2 proteininin FHA ve serin/treonin kinaz bölgeleri yoktur. Western blot analizleri IVS2 + 1G>A mutasyonunu taşıyan hücre hatlarında CHEK2 protein düzeyinin yok denecek kadar az olduğunu göstermiştir (Dong ve ark., 2003) 9 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM İntron-2 Normal ilmek Ekzon-3 Ekzon-2 Anormal ilmek CHEK2 IVS2 + 1G>A Şekil 1.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu Sonucu Oluşan Anormal İlmek İşte hücrenin DNA-hasarı kontrol noktası yolağında bulunan CHEK2 geninde yukarda belirttiğimiz mutasyonların meydana gelmesi sonucu hücrenin DNA-hasarı kontrol noktası yolağı bozulmuş olur ve böyle bireylerin tümörleşmeye karşı doğal korunma mekanizmalarını kaybettikleri, hücre transformasyonuna ve kansere yatkınlıklarının arttığı düşünülmektedir. Kontrol noktası yolağı hasarlı hücrelerde DNA hasarlarınında fazla olduğunun bulunması, kanser biyolojisi çalışan araştırmacıların bu kontrol noktası yolağı üzerindeki ilgilerini artırmıştır (Zhou ve Elledge, 2000; Bradbury ve Jackson, 2003; Thompson ve Schild, 2002; Zhou ve ark., 2003). Genin işlevini veya ifadesini bozan ve böylece kansere yakalanma riskini artıran bu tip mutasyonların belirlenmesi ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması kanserin mekanizmalarının anlaşılması ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından oldukça önemlidir. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının bazı kanser türlerinin oluşumu üzerine etkilerini araştıran bazı çalışmalar şunlardır: CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubu, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları belirlenmemiş ve ailesel meme kanseri hikayesi mevcut olan meme kanserli hastalar ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Meijers-Heijboer ve ark., 2002). Kontrol grubu 10 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM ile meme kanserli grup karşılaştırıldığında CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak önemli olduğu bildirilmiştir. Vahteristo ve ark. (2002), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı mini baz sırası saptama yöntemi ile Finlandiya kökenli sağlıklı bireylerde, meme kanserli hastalarda ayrıca BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ve ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda araştırılmıştır. Bu araştırmada meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu, fakat ailesel meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu ve CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 4.2 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.0002). Kilpivaara ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada, meme kanserli hastalarda ve sağlıklı kontrolde I157T mutasyonunun frekansı mini baz sırası saptama, direk baz sırası saptama ve değişime hassas jel elektroforez yöntemleri ile araştırmıştır. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.43 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.021). Bogdanova ve ark. (2005), tarafından CHEK2 I157T ve IVS2 + 1G>A mutasyonlarının meme kanseri ile ilişkisi iki farklı populasyondan oluşturulmuş iki farklı grupta polimeraz zincir reaksiyonu-restriksiyon fragmenti uzunluk polimorfizmi (PCR-RFLP) yöntemi ile araştırılmıştır. İlk grup alman kökenli meme kanserli hastadan ve sağlıklı bireyden meydana gelen kontrol grubundan oluşturulmuştur. Diğer grup Beyaz Rusya kökenli meme kanserli hasta ve sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubundan meydana getirilmiştir. I157T mutasyonunun meme kanser oluşumunu Alman kökenli meme kanserli hastalarda 3.6 kat (p=0.044) Beyaz Rusya kökenli meme kanserli hastalarda 4.5 kat artırdığı belirlenmiştir (p=0.005). IVS2 + 1G>A mutasyonunun meme kanseri oluşumu artırmadığını belirlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun ailesel meme kanseri yatkınlığına katkıda bulunan bir mutasyon olduğu sonuçuna varılmışlardır. Seppälä ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada, Finlandiya populasyonundan prostat kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T 11 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM mutasyonlarının frekansları ve bu mutasyonların prostat kanseri oluşumu ile ilişkileri tek zincir konformasyon polimorfizmi ve mini baz sırası saptama yöntemleri ile araştırılmıştır. Çalışmanın hasta populasyonunda ailesel prostat kanseri öyküsü bulunan prostat kanserli hastalar ve ailesel kanser öyküsü bulunmayan prostat kanserli hastalar bulunmaktadır. Ayrıca çalışmaya sağlıklı 480 bireyden oluşturulan kontrol grubu da dahil edilmiştir. Yapılan analizler sonucunda, CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının oranlarının ailesel prostat kanserli grup ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede farklılık gösterdiği [p=0.02 (1100delC) ve p=0.04 (I157T)] fakat kontrol grubu ile ailesel olmayan prostat kanserli grup arasında bu iki mutasyon yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır. Cybulski ve ark. (2004a), Polanyalı prostat kanserli ve sağlıklı bireylerde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının frekanslarını PCRRFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu mutasyonlar prostat kanser riskini 3.4 kat artırmıştır (p=0.004). Araştırıcılar bu mutasyonların ailesel prostat kanser riskini 9 kat artırdığını (p=0.0002) belirtmişlerdir. I157T yanlış anlamlı mutasyonu prostat kanser riskini 1.7 kat artırmıştır (p=0.03). Aynı zamanda I157T mutasyonu ailesel prostat kanserli hastalarda %16 oranında bulunmuş ve ailesel prostat kanserli hastalarda prostat kanseri riskini 3.8 kat artırdığı bildirilmiştir (p=0.00002). Cybulski ve ark. (2004b), tarafından 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tirod) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda I157T, IVS2 + 1 G>A ve1100delC mutasyonlarının frekansı PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotidPCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının tiroit kanseri oluşumunu 4.9 kat (p=0.0006), meme kanser oluşumunu 2.2 kat (p=0.02) ve prostat kanseri oluşumunu 2.2 kat (p=0.04) artırdığı saptanmıştır. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat (p=0.02), kolon kanser oluşumunu 2 kat (p=0.001), böbrek kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.0006), prostat kanseri oluşumunu 1.7 kat (p=0.002) ve tiroit kanseri oluşumunu 1.9 kat (p=0.04) artırdığı belirlenmiştir. 12 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM Bartsch ve ark. (2006), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının ailesel pankreas kanseri ile ilişkileri araştırılmıştır. Araştırıcılar pankreas kanseri ile CHEK2 mutasyonları arasındaki ilişkinin önemli olmadığını bildirmişlerdir. Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile akciğer, skuamöz (yassı hücre) üst solunum yolu ve böbrek kanseri oluşumu arasındaki ilişki araştırılmıştır. CHEK2 I157T mutasyonunun akciğer kanseri ile skuamöz üst solunum yolu kanserinin oluşumunu azalttığı bildirilmiştir. Zlowocka ve ark. (2008), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumu ile ilişkileri Polonya kökenli ve mesane kanserli hastalar ile kontrol grubunda araştırılmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumunu kontrol grubuna kıyasla 1.9 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir (p=0.0003). Araştırıcılar, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının Polonya populasyonunda mesane kanseri oluşumunu artırdığını bildirmişlerdir. Suspitsin ve ark. (2009), tarafından Rus populasyonunda CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonların ovaryum kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. Araştırıcılar CHEK2 geninin ovaryum kanserinin oluşumuna katkısının olmadığını bildirmişlerdir. Bugüne kadar CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler kanser oluşumu üzerine etkileri araştırılmamıştır. Bunun yanında Türk populasyonunda kolorektal kanserli fertlerde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları ve kolorektal kanser ile ilişkileri de araştırılmamıştır. İşte bu çalışmanın amacı CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları ile hepatoselüler kanser arasında bir ilişkinin olup olmadığını ve kolorektal kanserli Türk bireylerde ve herhangi bir kanser tanısı konmamış sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda söz konusu mutasyonların frekanslarını Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi (PCRRFLP) ve Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ARMS-PCR) yöntemleri ile araştırmaktır. 13 1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM 14 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR CHEK2 geni içerisinde bir çok kalıtsal mutasyon tanımlanmıştır. Fonksiyonel olmayan CHEK2 proteininin meydana gelmesine neden olan CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının birçok kanserin oluşumu üzerine etkileriyle ilgili yapılan çalışmalar şu şekilde özetlenebilir. 2.1. CHEK2 Mutasyonlarının Akciğer Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile akciğer ve skuamöz (yassı hücre) üst solunum yolu kanseri oluşumu arasındaki ilişki 3061 kanserli hasta ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır. Çalışmadaki hasta grubu 2250 akciğer kanserli ve 811 skuamöz üst solunum yolu kanserli (yassı hücreli karsinom) bireylerden oluşturulmuştur. CHEK2 I157T mutasyonlu fertlerde akciğer kanseri ile skuamöz üst solunum yolu kanserinin mutasyon olmayan fertlerdekine nazaran daha az oranda meydana geldiğini belirtmişlerdir. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının akciğer ve gırtlak kanser ile ilişkileri Polonya populasyonunda araştırılmıştır (Cybulski ve ark., 2008). Araştırma 895 akciğer kanserli hasta ve 430 gırtlak kanserli hasta ve 6391 sağlıklı bireyden oluşturulan kontrol grubu ile yapılmıştır. Akciğer kanserli grup içerisinde bu mutasyonları bulunduranların oranı %1.8 (16/895), gırtlak kanseri gelişen hastalarda %3.5 (15/430) ve sağlıklı kontrol grubunda %5.8 (370/6391) oranında saptanmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının akciğer ve gırtlak kanserine yakalanma riskini Polonya populasyonunda kontrol grubu ile kıyaslandığında azalttığı ve her iki kanser türü için bu mutasyonların koruyucu etkisi olduğunu ve bu etkinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermiştir. Araştırıcılar bu mutasyonlar nedeniyle hücre ölümünün azaldığını ve bu yüzden hücre bölünmesinin daha az meydana geldiği, sigara gibi 15 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM oldukça tehlikeli bir çevresel etmenin fazla olduğu bu tip kanserlerde kanser oluşumunun azalabileceği görüşünü ileri sürmüşlerdir. 2.2. CHEK2 Mutasyonlarının Beyin Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar El Hallani ve ark. (2009), tarafından yapılan araştırmada en yaygın beyin tümörü olan glioma ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Araştırmaya ailesel glioma hikayesi olan 79 glioma tanısı almış hasta katılmıştır. 79 hastanın hiçbirinde CHEK2 1100delC mutasyonu saptanmamıştır. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel gliomaya yatkınlık için bir risk faktörü olmadığını ve bu mutasyonun bu tür kanserde bir rolünün olmadığını bildirmişlerdir. 2.3. CHEK2 Mutasyonlarının Böbrek Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Cybulski ve ark. (2004b), 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tirod) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP (restriksiyon fragmenti uzunluk polimorfizmi) ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Çalışılan mutasyonlar içerisinde sadece I157T mutasyonunun böbrek kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.0006) arttırdığı saptanmıştır. Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile böbrek kanseri oluşumu arasındaki ilişki 954 böbrek kanserli hasta ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun böbrek kanseri oluşumunu zayıfta olsa artırdığını bildirmişlerdir. 2.4. CHEK2 Mutasyonlarının Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar 16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı ailesel kolorektal kanser geçmişi olan 149, ailesel kolorektal kanser hikayesi olmayan 513 kolorektal kanserli hastada ve toplam olarak 662 kolorektal kanserli hastada araştırılmıştır (Kilpivaara ve ark., 2003). Bu çalışmada, mutasyon sıklığı 662 kolorektal kanserli hastada %2.6 (17/662) oranında, ailesel kolorektal kanser öyküsü bulunan hasta grubunda %1.3 (2/149) ve ailesel olmayan 513 vakada %2.9 (15/513) oranında tespit edilmiştir. Vahteristo ve ark. (2002), tarafından yapılan araştırmada Finlandiya kökenli 1885 sağlıklı kontrolde CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansının %1.4 olduğu bildirilmişti. Bu araştırmada, % 1.4 oranındaki 1100delC mutasyon sıklığı ve Finlandiyanın diğer bölgelerinden gelen sağlıklı populasyonun mutasyon frekansları düzenlenip CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı %1.9 olarak kabul edilerek istatistiksel analizler yapılmıştır. Finlandiya kökenli sağlıklı populasyonun düzenlenmiş mutasyon sıklığı ile ailesel olan veya olmayan kolorektal kanserli gruplar ayrı ayrı veya tüm kolorektal kanserli hastalar bir bütün olarak analiz edildiklerinde hiçbir istatistiksel farklılığın gözlemlenmediği saptanmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kansere yatkınlık alleli olmadığını, fakat bu mutasyonun kolorektal kanser üzerinde oldukça düşük düzeyde bir etkisinin olduğunun göz ardı edilmemesi gerektiğini bildirmişlerdir. Lipton ve ark. (2003), çok sayıda kolorektal adenoması bulunan ve aralarında kolorektal kanser gelişmiş 149 hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı DNA dizi analizi yöntemi ile belirlenmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansının %2 (3/149) oranında olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar, kendi bulmuş oldukları sonuçları CHEK2 1100delC mutasyonunun %1.1’lik populasyon frekansı (Meijers-Heijboer ve ark., 2002) ile karşılaştırarak, CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu artırmadığını bildirmişlerdir (p=0.26). Meijers-Heijboer ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı ve ailesel kolorektal kanser ile ilişkisi, ailesel kolorektal kanserli 329 aileden oluşan hasta grubunda araştırılmıştır. Çalışmaya katılan ailesel kolorektal kanserli aileler kolorektal kanserin türüne göre ailesel adenomatöz polipozis (kolon ve rektumda oluşan 100-1000’lerce adenom polipler) (95 aile) ve ailesel nonpolipozis kolorektal kanser (kolonda çok sayıda polip 17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM oluşumu) (234 aile) olarak iki farklı grup şeklinde gruplandırılmıştır. Araştırmada kontrol grubu olarak, Meijers-Heijboer ve ark. (2002)’nın sağlıklı populasyondaki %1.1 (18/1620) oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon frekansı kullanılmıştır. Ailesel adenomatöz polipozis grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %0 (0/95) oranında iken ailesel nonpolipozis kolorektal kanserli grupta %2.6 (6/234) olarak saptanmıştır. Kontrol grubu ile ailesel nonpolipozis kolorektal kanserli grup CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı bakımından karşılaştırıldığında aradaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı gösterilmiştir (p=0.07). Cybulski ve ark. (2004b), tarafından yapılan çalışmada 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekansları PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Sıklıkları araştırılan mutasyonlar içerisinde sadece I157T mutasyonunun kolon kanseri oluşumunu 2 kat (p=0.001) arttırdığı diğer CHEK2 mutasyonlarının kolon kanseri oluşumu üzerine etkilerinin olmadığı bildirilmiştir. İspanyol kökenli kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser öyküsü bulunan 148 aileden ayrıca ailesel meme ve/veya ovaryum kanseri öyküsü bulunan 34 aileden toplam 442 kanserli bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı araştırılmıştır (Sánchez de Abajo ve ark., 2005). 442 bireyin hiçbirinde 1100delC mutasyonu belirlenmemiştir. Araştırıcılar, İspanyol populasyonunda ailesel olarak görülen bu iki tip kanserin CHEK2 1100delC mutasyonu ile bir ilişkilerinin olmadığı şeklinde bir yorum yapmışlardır. de Jong ve ark. (2005a), tarafından yapılan araştırmada 629 kolorektal kanserli hastada, 50 yaşından önce kolorektal kanser tanısı alan 105 hastada ve 230 bireyden meydana gelen kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı 629 kolorektal kanserli hastada %1.6 (10/629), 50 yaşından önce kolorektal kanser tanısı konmuş kolorektal kanserli hasta grubunda %0.9 (1/105) ve kontrol grubunda ise %0.4 (1/230) oranında belirlenmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda her iki kolorektal kanserli grup ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık görülmemiştir. Fakat 18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM 629 kolorektal kanserli hasta grubu kendi içerisinde ailesel kanser hikayesi olup ve erken yaşta kolorektal kansere yakalananlar ve ailesel hikayeleri olmayıp geç yaşta kolorektal kansere yakalananlar olarak tekrardan gruplandırıldığında CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel kanser öyküsü olan ve erken yaşta kolorektal kansere yakalananlarda istatistiksel olarak anlamlı derecede fazla olduğu saptanmıştır (p=0.014). Araştırıcılar araştırmanın sonucunun daha önceki bulgular ile uyumlu olduğunu ve CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu 1.5-2 kat gibi bir artırıcı etkisinin olduğunu bildirmişlerdir. Djureinovic ve ark. (2006), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonu ile kolorektal kanser arasındaki ilişki İsveç populasyonunda araştırılmıştır. Araştırmaya 174 ailesel kolorektal kanser öyküsü olan kolorektal kanser hastası, 644 sporadik (ailede kalıtsal bir kanser olmayan) kolorektal kanser hastası ve 760 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu dahil edilmiştir. Ailesel kolorektal kanser öyküsü olan hasta grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı %1.15 (2/174), sporadik kolorektal kanser grubunda %0.93 (6/644) ve kontrol grubunda ise %0.66 (5/760) olarak belirlenmiştir. Kontrol grubu ile kolorektal kanser grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıkların olmadığı saptanmıştır. İsveç populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu artırmadığı fakat hasta ve kontrol gruplarındaki birey sayılarının daha fazla olduğu çalışmalara gerek duyulduğu araştırıcılar tarafından belirtilmiştir. Isinger ve ark. (2006), Güney İsveç popuplasyonunda birincil olarak meme veya kolorektal kanser gelişiminden sonra ikincil herhangi bir kanser geliştiren 75 kanser hastasında ve 300 sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını araştırmışlardır. Kanserli grupta CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %2.7 (2/75) kontrol grubunda ise %1 (3/300) oranında belirlenmiştir. İki grup arasındaki farkın istatistiksel olarak önemli olmadığı saptanmıştır (p=0.26). Araştırıcılar, İsveç populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunun birincil meme ve kolorektal kanser için temel bir risk faktörü olmadığını ve rutin olarak bu mutasyonun klinikte taranmasının bir yararının olmayacağı şeklinde bir fikir ileri sürmüşlerdir. Kilpivaara ve ark. (2006), CHEK2 I157T mutasyonunun frekansını ailesel ve sporadik kolorektal kanserli hastalarda PCR-RFLP yöntemi ile araştırmışlardır. 19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM Çalışmada, 972 Finlandiya kökenli kolorektal kanserli hastanın ve 1885 sağlıklı bireyin I157T mutasyon frekansı belirlenmiştir. Kolorektal kanserli hastalarda (%7.8, 76/972) I157T mutasyonunun sıklığı sağlıklı kontrol grubundan (%5.3, 100/1885) daha yüksek oranda bulunmuştur. CHEK2 I157T mutasyonu kolorektal kanser oluşumunu 1.5 kat artırmıştır (p=0.008). Araştırıcılar bu çalışmadan elde edilen sonuçların, CHEK2 I157T mutasyonunun çok sayıda kanser türü için yatkınlık alleli olduğu görüşünü desteklediğini bildirmişlerdir. Weischer ve ark. (2007), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 1100delC mutasyonunun Danimarka populasyonunda meme, prostat ve kolorektal kanser oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmaya Danimarka populasyonundan 9231 birey katılmıştır. Araştırmacılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu 1.6 kat artırdığını bildirmişlerdir. Kleibl ve ark. (2009), tarafından Çek Cumhuriyeti populasyonunda CHEK2 1100delC, I157T, del5395 ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının kolorektal kanser oluşumu ile ilişkileri araştırılmıştır. Araştırmaya 631 kolorektal kanserli hasta ve 683 sağlıklı birey katılmıştır. Kolorektal kanser gelişmiş olan grupta tüm CHEK2 mutasyonlarının frekansı %6.2 (39/631) oranında bulunmuş iken kontrol grubunda bu oran %2.8 (19/683) olarak bulunmuştur (p=0.003). CHEK2 I157T mutasyonunun sıklığı kolorektal kanser ve kontrol grubunda sırasıyla %4.8 (30/631) ve %2.5 (17/683) olarak saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analiz I157T mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu 2 kat artırdığını ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı kolorektal kanserli grupta %0.63 (4/631) iken kontrol grubunda ise %0.27 (2/730) olarak belirlenmiştir. İki grup arasında 1100delC mutasyonu yönünden anlamlı bir farklılığın olmadığını saptanmıştır. Kolorektal kanserli grupta CHEK2 del5395 mutasyonu hiç bulunmamıştır. Kolorektal kanser gelişen hastalar ailesel kolorektal kanser öyküsü olanlar ve olmayan olarak iki farklı gruba ayrılıp, her iki grup mutasyon sıklıkları yönünden kontrol grubu ile karşılaştırıldıklarında bu mutasyonların ailesel kolorektal kanser grubu ile kontrol grubu arasında anlamlı bir farklılığın olmadığı bildirilmiştir. Araştırıcılar I157T mutasyonunun Çek Cumhuriyeti populasyonunda sporadik kolorektal kanser için yatkınlık alleli olduğunu, fakat aynı durumun ailesel kolorektal 20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM kanser öyküsü olan grup için söz konusu olmadığı araştırıcılar tarafından bildirilmiştir. Suchy ve ark. (2009), tarafından Polonya populasyonunda CHEK2 1100delC, I157T, del5395 ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser ve kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser ile ilişkili ailelerde kolorektal kanser oluşumunu artırıp artırmadığı araştırılmıştır. Çalışmaya 463 kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanserli hasta ve 5496 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu katılmıştır. CHEK2 IVS2 + 1 G>A, 1100delC, del5395 ve I157T mutasyonlarının sıklığı sırası ile %0.2 (1/463), %0.4 (2/463), %0.4 (2/463) ve %7.8 (36/463) olarak saptanmıştır. Kontrol grubunda CHEK2 IVS2 + 1 G>A %0.4 (22/5496), 1100delC %0.2 (12/5496), del5395 %0.4 (24/5496) oranlarında belirlenmiştir. Kolorektal kanserli grupta tüm mutasyonların oranı %8.8 (41/463) olarak bulunmuş iken kontrol grubunda %5.8 (322/5496) oranında tespit edilmiştir (p=0.01). Mutasyonlar ayrı ayrı analiz edildiğinde kalıtsal nonpolipozis kolorektal oluşumunu CHEK2 I157T mutasyonunun 1.7 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptanmıştır. Diğer CHEK2 mutasyonlarının kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser oluşumunu artırmadığı bildirilmiştir. 2.5. CHEK2 Mutasyonlarının Li-Fraumeni Sendromu Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Siddiqui ve ark. (2005), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı p53 gen mutasyonu bulunmayan 15 Li-Fraumeni sendromlu (otozomal dominant geçişli kalıtsal bir hastalık) hastada araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonu hiçbir hastada saptanmamıştır. Araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun p53 gen mutasyonu bulunmayan Li-Fraumeni sendromunda bir risk faktörü olmadığını bildirmişlerdir. Ruijs ve ark. (2009), tarafından Hollanda populasyonunda p53 mutasyonu olmayan 65 Li-Fraumeni sendromlu hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı ve Li-Fraumeni sendromu ile ilişkisi araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %6.2 (4/65) olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar, Hollanda populasyonunda 21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM CHEK2 1100delC mutasyonunun Li-Fraumeni sendromu için temel yatkınlık alleli olmadığını bildirmişlerdir. Bununla birlikte çalışmanın sonuçlarından, 1100delC mutasyonun TP53 mutasyonu olmayan kansere eğilimli ailelerde tümör gelişimine katkıda bulunabilecek bir faktör olduğu şeklinde yorumlanmıştır. 2.6. CHEK2 Mutasyonlarının Lösemi Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Sellick ve ark. (2006), tarafından yapılan çalışmada kronik lenfositik lösemi (lenfositlerin kan ve kemik iliği başta olmak üzere vücutta aşırı birikmesi) ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Araştırmada, 973 kronik lenfositik lösemili hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı belirlenmiştir. 973 hasta, kronik lenfositik lösemi geçmişi olan 121 hasta ve ailesel geçmişinde bu hastalık görülmeyen 852 hasta şeklinde iki farklı gruba ayrılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun genel sıklığı %0.8 (8/973) olarak belirlenmiştir. Ailesel olan (%0.8, 1/121) ve olmayan (%0.8 7/852) iki farklı grupta da mutasyon sıklıklarının aynı olduğu saptanmıştır. Kronik lenfositik lösemili hastalardaki CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı sağlıklı İngiliz populasyonundan elde edilen mutasyon oranı ile karşılaştırıldığında aradaki farkın istatistiksel olarak önemli olmadığı saptanmıştır (p=0.47). Ayrıca CHEK2 1100delC mutasyonu ile ailesel olan veya olmayan kronik lenfositik lösemi arasında bir ilişkinin bulunmadığı, bununla birlikte bu mutasyonun kronik lenfositik lösemi oluşumunu zayıfta olsa bir miktar artırmış olabileceği bildirilmiştir. 2.7. CHEK2 Mutasyonlarının Meme Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Allinen ve ark. (2001), BRCA1, BRCA2 ve p53 gen mutasyonları bulunmayan ve ailesel meme kanseri öyküsü olan Finlandiya populasyonundan 79 aileden 89 meme kanserli hastanın, 259 sporadik meme kanseri gelişen meme kanserli hastanın ve 200 sağlıklı bireyin CHEK2 geninde mutasyon analizi çalışması yapmışlardır. Üç 22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM farklı grup içerisinde sadece CHEK2 I157T mutasyonuna rastlanmıştır. Ailesel meme kanserli 79 aileden 7’sinde (%8.9) CHEK2 I157T mutasyonu belirlenmiştir. Sporadik meme kanserli grupta CHEK2 I157T mutasyonunun sıklığı %3.9 (10/259) oranında iken sağlıklı bireylerde %6.5 (13/200) oranında belirlenmiştir. Araştırıcılara göre, Finlandiya kökenli bireylerde CHEK2 I157T mutasyonu ailesel meme kanserine yatkınlığı artırmamaktadır. CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki 1620 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu ve BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları belirlenmemiş ve ailesel meme kanseri hikayesi mevcut olan 718 aileden 1071 meme kanserli hasta ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Meijers-Heijboer ve ark., 2002). Sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %1.1 (18/1620) oranında iken BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları olmayan ve ailesel meme kanserli hasta grubunda %5.1 (55/1071) oranında belirlenmiştir. Kontrol grubu ile meme kanserli grup karşılaştırıldığında CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak önemli olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları belirlenmeyen ailesel meme kanserli hastalardan 52’sinin erkek meme kanserli hastalar olduğu ve 52 hastada CHEK2 1100delC mutasyonun %13.5 (7/52) oranında bulunduğu saptanmıştır. Kontrol grubu ile yapılan karşılaştırmadan CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel erkek meme kanserli hastalarda meme kanseri oluşumunu 10 kat artırdığı gösterilmiştir. Sodha ve ark. (2002), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı, ailesel meme kanseri hikayesi bulunan 68 meme kanserli hastada ve 300 sağlıklı bireyden oluşturulmuş kontrol grubunda araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel meme kanseri hikayesi olan grupta %4.4 (3/68) oranında bulunduğu bunun yanında 300 sağlıklı bireyin hiçbirinde CHEK2 1100delC mutasyonunun olmadığı saptanmıştır. Araştırıcılara göre, CHEK2 1100delC mutasyonu ailesel meme kanseri oluşumunu artırmaktadır. Vahteristo ve ark. (2002), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı mini baz sırası saptama yöntemi ile Finlandiya kökenli 1885 sağlıklı bireyde, 1035 meme kanserli hastada ayrıca BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ve 23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM ailesel meme kanseri öyküsü bulunan 507 meme kanserli hastada araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı sağlıklı bireylerden oluşturulmuş kontrol grubunda %1.4 (26/1885) oranında, meme kanserli hasta grubunda %2 (21/1035), bununla birlikte BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ailesel meme kanserli hasta grubunda ise %5.5 (28/507) olarak bildirilmiştir. Meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu görülmüştür. Fakat meme kanserli hasta grubu ailesel meme kanseri hikayesi olanlar ve olmayanlar olarak gruplandırıldığında, ailesel meme kanseri olan 358 hastada CHEK2 1100delC mutasyon frekansının %3.1 (11/358) olduğu saptanmıştır. %3.1 oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon frekansı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında aradaki farkın istatistiksel olarak önemli olduğu bildirilmiştir (p=0.021). Aynı şekilde ailesel meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkında istatistiksel olarak anlamlı olduğu ve CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 4.2 kat artırdığı gösterilmiştir (p=0.0002). Ayrıca her iki memede de kanser gelişen hastalarda CHEK2 1100delC mutasyon sıklığının tek memede kanser gelişen hasta grubundan 6 kat daha fazla olduğu ve bu durumun istatistiksel olarak önemli olduğu bildirilmiştir. Meijers-Heijboer ve ark. (2003), tarafından BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları olmayan ve ailesel meme kanseri öyküsü bulunan 435 aileye ait hasta grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı ve ailesel meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Araştırmaya katılan, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları olmayan 435 ailesel meme kanser öyküsü bulunan hastalar, meme kanseri ile birlikte kolorektal kanser gelişenler ve meme kanseri ile birlikte kolorektal kanser gelişmeyen olarak iki farklı gruba ayrılmıştır. Çalışmada kontrol grubu olarak, Meijers-Heijboer ve ark. (2002)’nın sağlıklı populasyondaki %1.1 (18/1620) oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon frekansı kullanılmıştır. Meme kanseri ile birlikte kolorektal kanser gelişen 55 ailesel meme kanserli grupta CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı %18.2 (10/55), meme kanseri ile birlikte kolorektal kanser gelişmeyen 380 meme kanserli grupta mutasyon oranı %4 (15/380) olarak bulunmuştur. Ailesel meme kanserli grupların arasındaki bu farklılığın istatistiksel olarak önemli olduğu gösterilmiştir (p<0.001). Araştırıcılar yeni tanımladıkları meme 24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM kanseri ile birlikte kolorektal kanser oluşmuş bireylerde CHEK2 1100delC mutasyonunun genetik bir faktör olabileceğini fakat bu fenotipteki kanserde 1100delC mutasyonunun temel yatkınlık alleli olmadığını ve henüz belirlenemeyen yatkınlık geni veya genleri ile birlikte sinerjitik bir etkileşiminin olabileceğini bildirmişlerdir. Offit ve ark., (2003), yaptıkları çalışmada New York’lu 1665 sağlıklı gönüllü, 192 ailesel meme kanseri öyküsü olan meme kanserli hasta ve sporadik olarak meme kanseri gelişen 108 hasta olmak üzere toplam 300 meme kanserli vakada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı belirlenmiştir. Sporadik meme kanserli gruptaki 46 hastanın her iki memesinde meme kanseri gelişmiş olduğu, bununla birlikte 16 hastanın da erkek meme kanserli hasta olduğu bildirilmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı meme kanseri grupta %1 (3/300) oranında iken sağlıklı gönüllülerde %0.3 (5/1665) oranında saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analiz kanserli grup ile sağlıklı bireyler arasında CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını yönünden anlamlı bir farklılığın olmadığını göstermiştir (p=0.1). Araştırıcılar meme kanseri oluşumuna göreceli olarak düşük bir katkısı bulunan, ayrıca düşük populasyon frekansına sahip CHEK2 1100delC allelinin gelecekte Kuzey Amerika’lı hastalarda klinikte rutin genetik bir test olarak uygulanabilirliğinin sınırlı bir şekilde olabileceğini söylemişlerdir. Oldenburg ve ark. (2003), tarafından BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmamış ve ailesel meme kanseri öyküsü olan 71 aileden 237 meme kanserli hastada ve yine 71 ailenin 331 sağlıklı bireyinde CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı araştırılmıştır. Meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %11.4 (27/237) oranında iken 331 sağlıklı hasta yakınında ise %4.2 (14/331) olarak saptanmıştır. Meme kanserli hastalar ile bu hastaların yakınları olan sağlıklı kontrol bireyleri arasında CHEK2 1100delC mutasyon sıklığının istatistiksel olarak önemli derecede farklılık gösterdiği bildirilmiştir (p<0.001). 71 aile içerisinde en az bir tane CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan bireyin bulunduğu aile sayısının 15 (%21.1) olduğu bulunmuştur. Ayrıca CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan bireylerin meme kanserine yakalanma yaşının, bu mutasyonu taşımayan meme kanserli hastalardan daha küçük olduğu bildirilmiştir. 25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM Rajkumar ve ark. (2003), tarafından Güney Hindistan populasyonundan 35 yaşından küçük ve ailesel kanser geçmişi olan meme ve/veya ovaryum kanserli 22 hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı denatüre edici yüksek performanslı likit kromatografisi (dHPLC) yöntemi ile araştırmışlardır. Hastaların hiçbirinde CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmadığı saptanmıştır. Schutte ve ark. (2003), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T mutasyonunun meme kanseri ile ilişkisi BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunmayan ve ailesel meme kanseri hikayesi olan 605 aileden 737 meme kanserli birey, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları belirlenmiş ve ailesel meme kanseri öyküsü olan 335 aileden 459 meme kanserli hasta ve İngiltere, Hollanda ayrıca Kuzey Amerika’dan toplam 723 sağlıklı bireyden oluşturulmuş kontrol grubu ile araştırılmıştır. I157T mutasyonunun iki farklı ailesel meme kanseri hikayesi olan grupta meme kanseri oluşumunu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında artırmadığı gösterilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 geninde tanımlanmış kalıtsal mutasyonlardan sadece CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanserine yatkınlığa katkıda bulunabileceğine işaret etmişlerdir. Broeks ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada birinci memede meme kanseri geliştikten sonra ikinci memede de meme kanseri gelişen meme kanserli 233 hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı belirlenmiştir. Bu çalışmada kontrol grubu olarak sadece tek memede kanser gelişen ve kanser geliştikten sonra en az 5 yıl herhangi bir tür kanser gelişmeyen 191 birey kontrol grubu olarak kabul edilmiştir. İkinci memede de kanser gelişen grupta CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı %6.4 (15/233) iken kontrol grubunda bu oran %1 (2/191) oranında saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduran meme kanserli hastalarda ikinci memede de meme kanseri gelişme riskinin 6.5 kat artığı bulunmuştur. İkinci memede de kanser gelişen grup, birincil meme kanseri sonrasında radyoterapi tedavisi alanlar (X-ışını, 1-10 gray) ve almayanlar olarak tekrar gruplandırılıp CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırıldığında radyoterapi alan grupta (%7.7 13/169) 1100delC mutasyonunun oranının radyoterapi almayan gruptan (%3.1 2/64) daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonu 26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM taşıyan meme kanserli hastalarda radyoterapi tedavisinin ikinci memede de meme kanseri gelişiminde klinik bir öneminin olabileceğini bildirmişlerdir. Caligo ve ark. (2004), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun İtalyan populasyonunda meme kanseri ile ilişkisi araştırılmıştır. Araştırmaya toplam olarak 1273 birey katılmıştır. Bu bireylerin 939 meme kanseri tanısı konan hastalardan, 334 tanesi de sağlıklı kişilerden oluşturulmuştur. 939 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %0.11 (1/939) oranında iken sağlıklı bireylerde ise %0 (0/334) oranında saptanmıştır. Mutasyon tespit edilen bireyin ailesinde CHEK2 1100delC mutasyonu tarandığında aile bireyleri içerisinde bu mutasyonu bulunduranlarda her iki memede meme kanseri, pankreas kanseri ve akciğer kanseri gelişen bireylerin olduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumu üzerine etkisinin populasyonlar arasında sınırlı olduğunu ve bu populasyonunda meme mutasyonun muhtemelen sadece kanseri oluşumu artırdığı şeklinde Kuzey Avrupa bir yorumda bulunmuşlardır. CHEK2 Meme Kanseri Vaka-Kontrol Konsorsiyumu (2004), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı 10860 meme kanseri hastasında ve 9065 bireyden oluşturulan kontrol grubunda araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansının meme kanseri grubunda %1.9 (201/10860) oranında kontrol grubunda ise %0.7 (64/9065) sıklığında olduğu bildirilmiştir. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2.3 kat arttırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptanmıştır (p<0.001). Araştırıcılar çalışmanın sonuçlarından yola çıkarak, CHEK2 1100delC mutasyonunun, meme kanseri oluşumunu arttıran diğer yatkınlık allellerinin meme kanseri oluşumu üzerine etkilerini artırdığı yönündeki hipoteze uygunluk gösterdiği şeklinde bir yorumda bulunmuşlardır. Cybulski ve ark. (2004b), 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A 27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM mutasyonlarının meme kanser oluşumunu 2.2 kat (p=0.02) artırdığı bildirilmiştir. Bununla birlikte I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat (p=0.02) arttırdığı saptanmıştır. de Bock ve ark. (2004), tarafından kalıtsal olarak CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan meme kanserli hastalarda tümörün karakteristik özelliklerini ve hastalığın gidişi araştırılmıştır. Çalışma 34 CHEK2 1100delC mutasyonu bulunan meme kanserli hasta ve 1100delC mutasyonu olmayan 102 meme kanserli hasta ile yapılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan hasta grubunda steroid reseptör pozitifliği, mutasyon taşımayan hasta grubundan daha sık bulunmuştur (p=0.04). Mutasyon taşıyanların birinci veya ikinci derece bayan yakınlarında meme kanseri gelişme sıklığının, mutasyon taşımayanlardan daha fazla olduğu gözlenmiştir (p=0.03). İkinci memede de meme kanseri gelişme riskinin CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan hasta grubunda mutasyon taşımayan gruba göre 5.74 kat artış gösterdiği saptanmıştır. Araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri hastalığının gidişini olumsuz şekilde etkileyen bir faktör olduğunu bildirmişlerdir. Dufault ve ark. (2004), tarafından BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunmayan ve ailesel meme kanseri hikayeleri olan 516 aileden meme kanseri gelişen hastalarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Alman populasyonunda önemi araştırılmıştır. Araştırma 516 ailesel meme kanserli hasta ve meme kanserli hastalar ile eşleştirilmiş 500 sağlıklı bayandan meydana getirilmiş kontrol grubu ile yapılmıştır. Bununla birlikte CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı rasgele seçilmiş 1315 bayan bireyde araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı meme kanserli grupta %1.5 (8/516) oranında iken rasgele seçilmiş bayanlardan oluşan kontrol grubunda ise %0.45 (6/1315) olarak belirlenmiştir (p=0.016). Daha önce Beyaz ırka mensup ailesel meme kanserli hastalardan (%1.6) ve kontrol gruplarından (%0.5) elde edilen CHEK2 1100delC mutasyon sıklığının bu çalışmada elde edilen mutasyon sıklığından istatistiksel olarak anlamlı düzeyde farklı olduğu belirlenmiştir. I157T ve IVS2 + 1G>A mutasyonlarının oranları sırasıyla kanserli grupta %1.93 (10/516) ve %0.39 (2/516) olarak belirlenmiştir. Kontrol grubunda ise I157T mutasyon sıklığı %1.6 (8/500) oranında iken IVS2 + 1G>A %0.4 (2/500) olarak saptanmıştır. Her iki mutasyonun 28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM sıklıkları meme kanserli grup ile kontrol grubu arasında karşılaştırıldığında aradaki farkın istatistiksel olarak önemli olmadığı gösterilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 genindeki bu mutasyonların klinikte rutin olarak meme kanseri için genetik bir test olarak taranmalarının bir öneminin olmayacağını bildirmişlerdir. Friedrichsen ve ark. (2004), batı Washington’dan genç yaştaki meme kanserli hastalar ile yapılan vaka-kontrol çalışması ile CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının meme kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. Çalışmaya meme kanserli 506 hasta ve kontrol grubu olarak 459 sağlıklı birey dahil edilmiştir. Meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının sıklıkları sırasıyla %1.2 (6/506) ve %0.4 (2/506) oranlarında saptanmıştır. Kontrol grubunda mutasyon oranları 1100delC %0.4 (2/459) ve I157T %0.9 (4/459) olarak belirlenmiştir. Meme kanserli grup ile kontrol grubu her iki mutasyon sıklığı yönünden karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Araştırıcılar elde ettikleri bulgulardan, CHEK2 genindeki bu mutasyonların batı Washington populasyonunda çok az bir sıklıkta olduğunu, bu mutasyonların meme kanseri yatkınlığında temel mutasyonlar olmadıklarını ve bu yüzden bu mutasyonların Amerika Birleşik Devletlerinde kanser koruma programı çerçevesinde taranmalarının bir yararının olmayacağı sonuçunu çıkarmışlardır. Huang ve ark. (2004), tarafından meme kanseri ile birlikte en az bir başka herhangi bir tür birincil kanser gelişen 161 kadın hasta ve 153 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Hasta grubunda mutasyon frekansı %1.9 (3/161) oranında iken kontrol grubunda ise %0.7 (1/153) olarak saptanmıştır. Hasta ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık görülmemiştir (p=0.623). Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun çok sayıda birincil kanser gelişiminde temel yatkınlık alleli olmadığını bildirmişlerdir. Kilpivaara ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada meme kanserli 1035 hasta ve 1885 sağlıklı bireylerden oluşturulan kontrol grubunda I157T mutasyonunun frekansı mini baz sırası saptama, direk baz sırası saptama ve değişime hassas jel elektroforez yöntemleri ile araştırılmıştır. Araştırıcılar meme kanserli hasta grubunda I157T mutasyonunun %7.4 (77/1035) kontrol grubunda ise %5.3 (100/1885) 29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM oranında olduğunu bildirmişlerdir. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.43 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.021). Meme kanserli hastalar ailesel meme kanseri öyküsü olanlar ve olmayan şeklinde gruplandırıldığında, 507 ailesel meme kanseri öyküsü olan hasta grubunda I157T mutasyonunun %5.5 (28/507) oranında bulunduğu belirlenmiştir. Ailesel meme kanseri öyküsü olan grubun mutasyon oranı kontrol grubu ile kıyaslandığında aradaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu bulunmuştur. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu artırdığını fakat bu artışının CHEK2 1100delC mutasyonu ile yapılan çalışmalardan elde edilen veriler ile kıyasladığında daha az olduğunu bildirmişlerdir. Neuhausen ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun erkek meme kanseri ile ilişkisi Amerikan ve İngiliz populasyonundan erkek meme kanserli hastalarda araştırılmıştır. Amerikan populasyonundan 109 erkek meme kanserli hasta ve bu hastaların kontrol grubu olarak 138 sağlıklı erkek birey çalışmaya dahil edilmiştir. İngiliz populasyon grubundan ise 79 erkek meme kanseri gelişen hasta ile 3749 birey kontrol grubu olarak alınmıştır. Amerikan populasyonundaki meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %0 (0/109) iken kontrol grubunda %0.72 (1/138) olarak saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı İngiliz populasyonundan erkek meme kanserli bireylerde %0 (0/79) oranında iken kontrol grubunda %0.56 (21/3749) olarak saptanmıştır. Araştırıcılar yapmış oldukları araştırmada, daha önceki çalışmalardan farklı olarak CHEK2 1100delC mutasyonunun erkek bireylerde meme kanseri oluşumunu artırmamış olduğunu bildirmişlerdir. İsrail populasyonunda meme kanseri gelişen 54 erkek meme kanserli hastada, 219 BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunan kadın meme kanserli hastada ve 146 sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı denatüre edici yüksek performanslı likit kromatografisi (dHPLC) yöntemi ile araştırılmıştır (Ohayon ve ark., 2004). CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı erkek meme kanserli hastalarda %0 (0/54), BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunan kadın hastalarda %0.5 (1/219) ve kontrol grubunda ise %0 (0/146) olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun İsrail populasyonunda çok düşük bir sıklıkta bulunduğunu bildirmişlerdir. 30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM Osorio ve ark. (2004), İspanyol kökenli ailesel meme kanseri öyküsü bulanan 456 meme kanseri hastasında ve 400 sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Her iki grupta da CHEK2 1100delC mutasyonu belirlenmemiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun İspanyol populasyonunda bulunmadığı veya çok düşük bir sıklıkta bulunduğu ve bu populasyonda CHEK2 1100delC mutasyonunun rutin olarak taranmasının bir öneminin olmadığı araştırıcılar tarafından önerilmiştir. Mateus Pereira ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada Amerikan populasyonundan 829 meme kanserli hastada ve 859 sağlıklı bireyden oluşturulan kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Meme kanseri grubunda mutasyon oranı %1.1 (9/829) iken kontrol grubunda %0.5 (4/859) olarak saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2.3 kat artırdığı fakat bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlenmiştir (p=0.16). Sodha ve ark. (2004), tarafından ailesel olarak erkek bireylerde meme kanseri hikayesi bulunan 26 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Hastaların 16 tanesi erkek meme kanserli birey, diğer 10 tanesi bayan meme kanserli hastadan oluşturulmuştur. Fakat bu 10 bayan hastanın aileleri içerisinde en az 1 erkek meme kanserli hastanın mevcut olduğu bildirilmiştir. Hastaların hiçbirinde BRCA1 ve BRCA2 mutasyonlarının bulunmadığı saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonu sadece 1 hastada belirlenmiştir. Bu sonuç, sağlıklı populasyondan elde edilen %1.4 oranındaki CHEK2 1100delC mutasyonu sıklığı ile karşılaştırıldığında iki grup arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını ortaya koymuştur. Syrjäkoski ve ark. (2004), yapmış oldukları çalışma ile Finlandiya populasyonundan erkeklerde gelişen meme kanseri ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. 114 meme kanseri gelişen erkek hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı %1.8 (2/114) olarak saptanmıştır. %1.8’lik CHEK2 1100delC mutasyon oranı Finlandiya kökenli sağlıklı bireylerden elde edilen %1.4 (26/1885) oranındaki CHEK2 1100delC mutasyonu ile karşılaştırıldığı zaman aradaki farkın istatistiksel 31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM olarak anlamlı olmadığı bulunmuştur. Çalışmanın sonuçlarından, CHEK2 1100delC mutasyonunun erkeklerde meme kanseri oluşumunu Finlandiya populasyonunda artırmadığı sonucuna varılmıştır. Bogdanova ve ark. (2005), tarafından CHEK2 I157T ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının meme kanseri ile ilişkisi iki farklı populasyondan oluşturulmuş iki farklı grupta PCR-RFLP yöntemi ile araştırılmıştır. İlk grup alman kökenli 996 meme kanserli hastadan ve 486 sağlıklı bireyden meydana gelen kontrol grubundan oluşturulmuştur. Diğer grup Beyaz Rusya kökenli 424 meme kanserli hasta ve 307 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubundan meydana getirilmiştir. I157T mutasyonu alman kökenli meme kanserli hasta grubunda %2.2 (22/996) sağlıklı kontrol grubunda ise %0.6 (3/486) oranlarında bulunmuştur. I157T mutasyonunun alman kökenli meme kanserli hastalarda meme kanser oluşumunu 3.6 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.044). I157T mutasyonu Beyaz Rusya kökenli meme kanseri hastalarında %5.7 (24/424) oranında iken sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda %1.3 (4/307) oranında bulunmuştur. I157T mutasyonunun Beyaz Rusya populasyonunda meme kanseri oluşumunu 4.5 kat artırdığı belirlenmiştir (p=0.005). IVS2 + 1 G>A mutasyonu alman kökenli meme kanserli hastalarda %0.3 (3/996), Beyaz Rusya kökenli hasta grubunda %0.9 (4/424), Alman kökenli kontrol grubunda %0.2 (1/486) ve Beyaz Rusya kökenli kontrol grubunda %0 (0/307) oranlarında bulunmuştur. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun ailesel meme kanseri yatkınlığına katkıda bulunan bir mutasyon olduğu sonuçuna varmışlardır. de Jong ve ark. (2005b), CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki 962 meme kanserli hasta ve 367 bireyden oluşturulmuş kontrol grubu ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır. Mutasyon sıklığı kanserli grupta %2.9 (28/962) oranında iken kontrol grubunda %0.82 (3/367) oranında tespit edilmiştir. İki grup arasında 1100delC mutasyon sıklığı yönünden istatistiksel bir farkın olmadığı bildirilmiştir. Górski ve ark. (2005), tarafından Polanya populasyonunda 2012 meme kanserli hastada ve 4000 kişiden oluşan kontrol grubu ile CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının meme kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. CHEK2 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının meme kanseri 32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM grubunda sıklıkları sırası ile %0.55 (11/2012), %0.94 (19/2012) ve %6.6 (132/2012) iken kontrol grubunda ise 1100delC %0.25 (10/4000), IVS2 + 1 G>A %0.48 (19/4000) ve I157T %4.8 (193/4000) olarak belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının meme kanserine yakalanma riskini kanserli grup ile kontrol grubu karşılaştırıldığında anlamlı düzeyde arttırdıkları fakat aynı anlamlılığın CHEK2 1100delC mutasyonu için gözlenmediği bildirilmiştir. Huzarski ve ark. (2005), tarafından yapılan araştırmada Polonya kökenli 482 meme kanserli hastada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının frekansları çalışılmıştır. Her üç mutasyonunda bu çalışma populasyonunda meme kanseri oluşumunu artırmadıkları fakat I157T mutasyonunun meme kanseri tiplere göre gruplandırıldığında lobular (küçük loblardan oluşan) tip meme kanseri oluşumunu 6.6 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir (p<0.001). Jekimovs ve ark. (2005), Avusturalya kökenli ailesel meme kanseri hikayesi olan meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri ile ilişkisini araştırmışlardır. Araştırmada, çok sayıdaki aile bireyinde meme kanseri görülen 300 aileden 300 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC mutasyon sıklığı araştırılmıştır. 300 meme kanserli hastanın tümünde, kalıtsal BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları taranmış ve %95’inde bu mutasyonlara rastlanmamıştır. CHEK2 1100delC mutasyonu %0.66 (2/300) oranında belirlenmiştir. Mutasyon belirlenen 2 ailenin ulaşılan tüm fertlerinde de CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Araştırıcılar elde edilen verileri göz önünde bulundurduklarında CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanserinin oluşması arasında herhangi bir korelasyonun olmadığı sonucuna varmışlardır. Çek Cumhuriyetinden 1046 meme kanserli hastada ve 730 sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır (Kleibl ve ark., 2005). Meme kanserli hastaların 688’i sporadik olarak meme kanseri gelişen hastalardan 358’i ailesel meme kanseri öyküsü olan ve erken yaşta meme kanserine yakalanan bireylerden oluşturulmuştur. CHEK2 1100delC mutasyonu 688 sporadik meme kanserli hastanın 3’ünde, 358 ailesel meme kanseri hikayesi olan hastanın 1’inde ve 33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM kontrol grubundan 2 kişide belirlenmiştir. Kontrol grubu ile meme kanserli gruplar arasında CHEK2 1100delC mutasyonu yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır. Araştırıcılar, Çek Cumhuriyeti populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunu klinikte rutin bir test şeklinde taranmasını önermemektedirler. Chekmariova ve ark. (2006), tarafından Rus populasyonundan sadece bir memede meme kanseri gelişen 660 meme kanserli hastada, her iki memede meme kanseri gelişen 155 meme kanserli hastada ve kontrol grubu olarak da 448 orta yaşlı kadın ile 373 ileri yaşlı kadında CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanseri arasındaki ilişki araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyon oranı tek memede meme kanseri gelişen grupta %2.1 (14/660), her iki memede meme kanseri gelişen grupta %5.2 (8/155), kontrol grubunun orta yaşlı bayanlar grubunda %0.2 (1/448) ve ileri yaştaki bayanlar grubunda ise %0 (0/373) olarak saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler CHEK2 1100delC mutasyonunun Rus populasyonunda meme kanseri oluşumunu istatistiksel olarak önemli derece artırdığı belirlenmiştir. Araştırıcılar, elde edilen sonuçlardan Rus kökenli kadınlarda CHEK2 1100delC mutasyonunun klinikte test edilmesinin faydalı olabileceğini ve bunun yanında aynı etnik kökenli ve benzer coğrafyadan özellikle Ukrayna, Belarus ve Baltık ülkelerinde benzer çalışmalara ihtiyaç olduğunu bildirmişlerdir. Cybulski ve ark. (2006a), tarafından CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları ile meme kanserine erken yaşta yakalanma riski arasındaki ilişki PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Bu araştırma 51 yaşının altındaki 3228 meme kanserli hasta ve 5496 sağlıklı bireyden oluşturulan kontrol grubu ile gerçekleştirilmiştir. 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonları meme kanserli grupta %1.45 (47/3228) oranında kontrol grubunda ise %0.62 (34/5496) oranında belirlenmiştir. Bu iki mutasyonun meme kanseri oluşumunu 2.4 kat arttırdığı gösterilmiştir (p=0.0001). I157T mutasyonu meme kanserli grupta %6.41 (207/3228) oranında, sağlıklı kontrol grubunda ise %4.8 (264/5496) oranında bulunmuş ve bu mutasyonun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat artırdığı bildirilmiştir (p=0.002). Araştırıcılar elde edilen sonuçlardan, Polonya 34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM kökenli bireylerde CHEK2 genindeki bu üç mutasyonun meme kanserine erken yaşta yakalanmaya katkılarının olduğunu bildirmişlerdir. de Bock ve ark. (2006), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanserinde östrojen reseptör pozitifliği arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışma 1084 meme kanserli hasta ve 988 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu ile yapılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı meme kanserli hastalarda %3.1 (34/1084) kontrol grubunda ise %0.9 (9/988) oranlarında saptanmıştır. İki grup arasında 1100delC mutasyon frekansı yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olduğu bulunmuştur (p<0.001). Östrojen reseptörü pozitif olan meme kanserli hastalarda 1100delC mutasyonunun sıklığının (%4.2 20/477) östrojen reseptörü negatif (%1 2/193) olanlardan anlamlı derecede farklı olduğu görülmüştür (p=0.03). Araştırıcılar bu bulguların, daha çok sayıda hasta ile yapılan çalışmalardan elde edilen bulgularla doğrulanması gerektiğini bildirmişlerdir. Bell ve ark. (2007), CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı 1646 sporadik meme kanserli hastada, erken yaşta meme kanserine yakalanan 400 hastada, 302 ailesel meme kanseri hikayesi olan meme kanserli hastada ve kontrol grubu olarak da birçok etnik kökenden 2105 bireyde araştırılmıştır. Mutasyon sıklığı sporadik meme kanserli grupta %0.5 (8/1.646), erken yaşta meme kanserine yakalanan grupta %0.5 (2/400), ailesel meme kanserli grupta %0.3 (1/302) ve kontrol grubunda ise %0 (0/2105) olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu belirlemede sınırlı bir öneminin olduğunu fakat bu mutasyonun klinikte rutin bir test olarak taranmasının fenotipik ve coğrafik olarak seçilmiş populasyonlarda değerinin olabileceğine işaret etmişlerdir. CHEK2 geninde 5395 baz çiftinin delesyonu sonucunda CHEK2 geninin 9. ve 10. ekzonunun kaybolmasına neden olan mutasyonun Belarus ve Alman populasyonunda meme kanseri oluşumunu arttırıp artırmadığı araştırılmıştır (Bogdanova ve ark., 2007). Belarus populasyonunda meme kanserli hastalarda delesyon mutasyonunun oranı %0.9 (13/1440) kontrol grubunda ise %0 (0/881) olarak belirlenmiştir. Alman populasyonundaki meme kanserli hastalarda CHEK2 del5395 mutasyon oranı %0.5 (5/990) iken sağlıklı bireylerde ise %0.1 (1/1014) olarak saptanmıştır. CHEK2 genindeki bu delesyon şeklindeki mutasyonun Belarus 35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM populasyonunda meme kanseri oluşumunu önemli derece artırdığı bulunmuştur (p=0.01). Araştırıcılar, daha çok sayıda hasta ile yapılacak çalışmaların sonuçlarına ihtiyaç duyulduğunu bildirmişlerdir. Cybulski ve ark. (2007), tarafından Polonya kökenli meme kanserli hastalarda ve sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 del5395 mutasyonunun frekansı araştırılmıştır. CHEK2 del5395 mutasyonu kontrol grubunda %0.4 (24/5496), meme kanseri için herhangi bir risk faktörü yönünden seçilmemiş meme kanseri grubunda %1 (19/1978) ve meme kanserine erken yaşta yakalanmış olan grupta %0.9 (28/3228) olarak saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler, CHEK2 del5395 mutasyonunun her iki meme kanseri grubunda meme kanseri oluşumunu kontrol grubuna nazaran önemli oranda artırdığını ortaya koymuştur (p=0.01). Margolin ve ark. (2007), tarafından yapılan çalışmada İsveç’in Stokholm şehri ve civarında CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumu ile ilişkisi 763 meme kanserli hasta ve 760 bireyden oluşan kontrol grubu ile araştırılmıştır. 763 meme kanserli hastanın 450’sinin ailesel meme kanseri öyküsünün bulunduğu belirlenmişti. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığının ailesel meme kanseri öyküsü bulunan grupta %2.2 (10/450), 313 sporadik meme kanserli hastada grubunda %0.3 (1/313) ve kontrol grubunda ise %0.7 (5/760) oranlarında saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun erken yaşta meme kanserine yakalanan ailesel meme kanseri öyküsü bulunan grupta daha sık olduğu bulunmuştur (p=0.003). Kontrol grubu ile meme kanserli gruplar karşılaştırıldıklarında ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanseri grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırdığı fakat aynı durumun sporadik meme kanserli grupta gözlenmediği gösterilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun İsveç populasyonunda bulunduğunu ve sıklığının ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda artış gösterdiğini ve meme kanserine erken yakalanma ile ilişkisinin olduğunu bildirmişlerdir. Martínez-Bouzas ve ark. (2007), tarafından İspanya’nın Bask bölgesinden 214 meme kanserli hastada ve 120 sağlıklı bayan bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Meme kanserli grupta mutasyon oranı %0.93 36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM (2/214) kontrol grubunda ise %0 (0/120) olarak saptanmıştır. Mutasyon bulunan 1. hastanın meme kanserine yakalanma yaşı 31 idi. Bununla birlikte hastanın annesine daha önce meme kanseri tanısı konmuştu. İkinci hastanın meme kanserine 40 yaşında yakalandığı ve ailesinde çok sayıda her iki memede de meme kanseri gelişen bireylerin bulunduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar kendi çalışmalarının ve diğer araştırıcıların sonuçlarından yola çıkarak CHEK2 1100delC mutasyonunun her iki memede de meme kanseri gelişen, erken yaşta meme kanserine yakalanan ve ailesel meme kanseri öyküsü bulunan ve Kuzey Avrupa populasyonundan meme kanserli hastalar gibi seçilen populasyonlarda araştırılması gerektiğini bildirmişlerdir. Schmidt ve ark. (2007), CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını premenopoz döneminde meme kanserine yakalanmış 1479 meme kanserli hastada direk baz sırası belirleme yöntemi ile araştırmışlardır. Mutasyon sıklığı %3.7 (54/1479) olarak saptanmıştır. Bu çalışmada, CHEK2 1100delC mutasyonunun diğer memede de meme kanseri oluşumunu 2.1 kat artırdığı belirlenmiştir (p=0.049). Sokolenko ve ark. (2007), tarafından Rusya’nın Saint Petersburg şehrinden ailesel meme kanseri hikayesi olan ve erken yaşta meme kanserine yakalanan 302 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının sıklığı araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %3 (9/302) oranında iken IVS2 + 1 G>A mutasyonunun oranı %0.7 (2/302) olarak saptanmıştır. Weischer ve ark. (2007), tarafından yapılan araştırmada, CHEK2 1100delC mutasyonunun Danimarka populasyonunda meme, prostat ve kolorektal kanser oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmaya Danimarka populasyonundan 9231 birey katılmıştır. Ayrıca bu çalışma içinde 1101 meme kanserli ve 4665 kontrol bireyden oluşan vaka-kontrol çalışması da yapılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanserini 3.2 kat artırdığını bildirmişlerdir. Populasyon içerisinde heterozigot olarak CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan bayanların meme kanserine yakalanma risklerinin 3 kat fazla olduğu belirlenmiştir. Chen ve ark. (2008), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun Çin populasyonunda meme kanseri oluşumunu artırıp artırmadığı ailesel meme kanseri hikayesi olan 74 meme kanserli hasta ve 50 sağlıklı birey ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır. Yapılan analizler sonunda ne meme kanserli ne de sağlıklı hiçbir Çinli 37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bireyde CHEK2 1100delC Süleyman BAYRAM mutasyonu saptanmamıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun Çin populasyonunda çok düşük bir sıklıkta bulunduğu ve ailesel meme kanserine yatkınlığa bir katkısının olmadığı bildirilmiştir. Choi ve ark. (2008), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun Kore populasyonunda meme kanseri oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmaya 493 Kore’li meme kanseri hastası katılmıştır. 493 hastanın 42’sinde BRCA1 ve/veya BRCA2 delesyon mutasyonları belirlenmiştir. 493 hastanın hiçbirinde CHEK2 1100delC mutasyonu saptanmamıştır. Araştırıcılar, Kore populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmadığını veya çok düşük bir frekansta olabileceğini bu yüzden bu mutasyonun klinik bir test olarak taranmasının bir yararının olmayacağı şeklinde bir fikir ileri sürmüşlerdir. Falchetti ve ark. (2008), İtalyan populasyonunda BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları olmayan 102 erkek meme kanseri hastasında ve 263 sağlıklı erkek bireyde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının erkek meme kanser oluşumunu arttırıp artırmadığını araştırmışlardır. Ne kanserli grupta ne de sağlıklı erkek bireylerden oluşan kontrol grubunda herhangi bir CHEK2 gen mutasyonu belirlenmiştir. Araştırıcılar, İtalyan populasyonunda CHEK2 mutasyonlarının erkek meme kanserine yatkınlıkta bir öneminin olmadığını bildirmişlerdir. González-Hormazábal ve ark. (2008), tarafından Güney Amerika populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonu ile ailesel meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışma üç farklı grup ile yapılmıştır. Birinci grup BRCA1 ve/veya BRCA2 mutasyonları olmayan ailesel meme kanseri öyküsü bulunan 196 meme kanserli hastadan oluşturulmuştur. İkinci grup 624 sağlıklı fakat en az 2 tane 1. veya 2. derece yakınlarında meme kanseri gelişmiş bireyden meydana getirilmiştir. Üçüncü grupta kendilerinde veya yakınlarında meme kanseri öyküsü olmayan 500 sağlıklı bireyden oluşturulmuştur. Her üç grupta da CHEK2 1100delC mutasyonu saptanmamıştır. Mellemkjaer ve ark. (2008), CHEK2 1100delC mutasyonunun, meme kanseri gelişen hastalarda diğer memede de meme kanseri gelişimiyle ilgili ilişkisini araştırmışlardır. Araştırmaya meme kanseri geliştikten sonra diğer memede de meme 38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM kanseri gelişen 708 meme kanserli hasta ve tek memede meme kanseri gelişmiş 1395 meme kanserli hasta dahil edilmiştir. Bu çalışmada iki memede de kanser gelişen hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %1 (7/708) oranında iken tek meme de kanser gelişmiş grupta ise mutasyon frekansının %0.72 (10/1395) olduğu saptanmıştır. Yapılan analizler CHEK2 1100delC mutasyonunun ikinci meme de meme kanseri oluşumunu istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırmadığını göstermiştir. Araştırıcılar, ikinci memede de meme kanseri gelişim riskinin CHEK2 1100delC mutasyonu ile az bir ilişkisinin olduğunu fakat bu mutasyonun ikinci memede de meme kanseri oluşumunun tek nedeni olamayacağını bildirmişlerdir. Zhang ve ark. (2008), CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını farklı populasyonlardan meme kanseri gelişen 3882 hasta ve 8609 sağlık bireyden oluşan kontrol grubunda araştırmışlardır. Bu çalışmada, CHEK2 1100delC mutasyonunun Asyalı (Pakistan ve Filipinler) hastalarda bulunmadığı, Brezilyalı hastalarda %0.7 (1/155) oranında olduğu saptanmıştır. Ailesel meme kanseri öyküsü olan 825 hastada %1.5 ve ailesel meme kanseri öyküsü olmayan 1106 hastada %0.7 ayrıca Yahudi olan ve olmayanlarda yaklaşık %1.3 oranında olduğu bulunmuştur. Araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2.6 kat artırdığını bildirmişlerdir. Cybulski ve ark. (2009), tarafından Polonya populasyonunda meme kanserine erken yaşta yakalanan ve meme kanseri için herhangi bir risk faktörü yönünden seçilmemiş 4441 meme kanserli hastada ve 51 yaşından küçük 7217 bireyden oluşan kontrol grubunda CHEK2 IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonları ile östrojen reseptörü arasındaki ilişki araştırılmıştır. Östrojen reseptör durumu, CHEK2 mutasyonları pozitif olanlar ile olmayanlar arasında karşılaştırılmıştır. CHEK2 IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonları meme kanseri grubunda %3.15 (140/4441) oranında kontrol grubunda ise %1 (70/7217) sıklığında saptanmıştır (p<0.0001). CHEK2 mutasyonu bulunan 140 meme kanserli hastanın 92 tanesinin, CHEK2 mutasyonu saptanmayan 4301 hastanın 3001 tanesinin östrojen reseptör durumları belirlenebilmiştir. CHEK2 mutasyonu olan ve östojen reseptörü pozitif meme kanserli hasta oranı %67.4 (62/92) iken CHEK2 mutasyonu olmayan ve östrojen reseptörü pozitif olan hasta oranı %58 (1742/3001) olarak saptanmıştır 39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM (p=0.01). Araştırıcılar CHEK2 mutasyonu bulunan meme kanserli hastalarda östrojen reseptör pozitifliğinin kanser oluşumunu 4 kat artırdığını ve bu hastaların tamoksifen kemoterapisi için aday olabileceklerini bildirmişlerdir. İrlanda populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumu üzerine etkisi 903 meme kanserli hasta ve 1016 sağlıklı birey ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (McInerney ve ark., 2009). CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı meme kanserli hasta grubunda %0.55 (5/903) kontrol grubunda ise %0.1 (1/1016) oranında saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler CHEK2 1100delC mutasyonunun İrlanda populasyonunda meme kanseri oluşumunu önemli oranda artırmadığını göstermiştir. Skasko ve ark. (2009), tarafından her iki memede de meme kanseri gelişen 170 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının sıklığı ve bu mutasyonların kansere yakalanma yaşı ile ilişkileri araştırılmıştır. Toplam mutasyon sıklığının %7 (12/170) olduğu saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonu 2 kişide, I157T ise toplam 10 kişide belirlenmiştir. Bu çalışmada, CHEK2 mutasyonunu bulunduran meme kanserli hastaların meme kanserine yakalanma yaşlarının mutasyon bulundurmayan hastalardan 2.1-3.8 yıl daha önce olduğu belirlenmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri ile ilişkisi Malezya populasyonundan Çinli, Hindistanlı ve Malezyalı 668 meme kanseri hastası ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Thirthagiri ve ark., 2009). CHEK2 1100delC mutasyonu meme kanserli hastalarda belirlenmemiştir. Araştırıcılar çalışmanın sonuçlarının, CHEK2 1100delC mutasyonunun Malezya populasyonunda bulunan üç farklı etnik grup içinde çok az veya hiç olmadığını ve bu gruplar için bu mutasyonun meme kanserine yatkınlıkta önemli bir rolünün bulunmadığını ve rutin olarak bu mutasyonun taranmasının gerekli olmadığını bildirmişlerdir. 2.8. CHEK2 Mutasyonlarının Melanoma Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Debniak ve ark. (2008), tarafından CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının kötü huylu 40 melanom ile ilişkileri Polonya 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM populasyonundan 627 kötü huylu melanomlu hastada ve 4621 kontrol bireyde araştırılmıştır. Kötü huylu melanom gelişen hastalarda CHEK2 I157T mutasyon oranı %5.9 (37/627) iken kontrol grubunda ise %4.9 (224/4621), CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyon oranı melanoma gelişen grupta %0.9 (4/427) iken kontrol grubunda ise %0.4 (19/4621), kanserli grupta CHEK2 1100delC %0.3 (2/627) oranında iken sağlıklı kontrol grubunda %0.2 (8/4621) sıklığında ve CHEK2 del5395 mutasyonu kötü huylu melanomlu hastalarda %0.15 (1/627) iken kontrol grubunda ise %0.5 (23/4621) oranında saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler CHEK2 genindeki kalıtsal 4 mutasyondan hiçbirinin kontrol grubu ile kıyaslandığında kötü huylu melanom oluşumunu artırmadığını göstermiştir. 2.9. CHEK2 Mutasyonlarının Mesane Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Zlowocka ve ark. (2008), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumu ile ilişkileri Polonya kökenli ve mesane kanseri için herhangi bir risk faktörü yönünden seçilmemiş 416 mesane kanserli hasta ile 3313 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır. Mesane kanserli hastalarda 4 mutasyonun toplam olarak oranı %10.6 (44/416) iken kontrol grubunda %5.9 (195/3313) olarak saptanmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumunu kontrol grubuna kıyasla 1.9 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir (p=0.0003). Araştırıcılar, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının Polonya populasyonunda mesane kanseri oluşumunu artırdığını bildirmişlerdir. 2.10. CHEK2 Mutasyonlarının Ovaryum Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Szymanska-Pasternak ve ark. (2006), CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının frekanslarını Polanya kökenli ovaryum kanserli hastada 41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu çalışmada 1108 ovaryum tümörlü (539 benign ovaryum kistadenomalı hasta, ovaryum malignesisi sınırında 122 hasta ve 447 invaziv ovaryum kanserli hasta) hastada ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda bu mutasyonların sıklıkları araştırılmıştır. I157T mutasyonu, benign ovaryum kistadenoma oluşumunu 1.7 kat (p=0.005), ovaryum malignesisine yakın oluşumu 2.6 kat (p=0.002), düşük derecedeki invaziv ovaryum kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.04) artırmıştır. Yüksek derecedeki invaziv ovaryum kanseriyle I157T mutasyonu arasında istatistiksel bir ilişki bulunmamıştır. Bu çalışmanın doğrulanması Rus kökenli ovaryum malignesisi riskindeki bireyler ile yapılmış ve I157T mutasyonun bu kanser oluşumunu 2.7 kat artırmış olduğu saptanmıştır (p=0.06). Çalışmanın sonuçları, CHEK2 mutasyonlarının çok düşük kötü huylu kanser potansiyeline sahip ovaryum tümörlerine yatkınlığı artırabileceği, fakat aynı durumun yayılımcı ovaryum kanserleri için olmadığını göstermiştir. Suspitsin ve ark. (2009), tarafından Rus populasyonunda CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonların ovaryum kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. Araştırmaya toplam 354 ovaryum kanseri tanısı olan hasta dahil edilmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %0.6 (2/354), IVS2 + 1 G>A mutasyonunun frekansı ise %0 (0/354) olarak saptanmıştır. Araştırıcılar CHEK2 geninin ovaryum kanserinin oluşumuna katkısının olmadığını bildirmişlerdir. 2.11. CHEK2 Mutasyonlarının Özefagus Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Koppert ve ark. (2004), tarafından skuamöz hücreli özefagus kanserli 190, özafagus adenokarsinomlu 196, metaplazik Barrett özefagus gelişen 99, bunun yanında displazik Barrett özefagus gelişen 66 hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Ayrıca çalışmaya 644 sağlıklı birey kontrol grubu olarak dahil edilmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun oranları skuamöz hücreli özefagus kanserinde %0.5 (1/190), özafagus adenokarsinomunda %1.5 (3/196), metaplazik Barrett’te %3 (3/99), displazik Barrett’te %1.5 (1/66) ve kontrol 42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM grubunda ise %1.4 (9/644) olarak bildirilmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda kontrol grubu ile saptanmamıştır. yapılan Bu karşılaştırmalarda sonuçların ışığında, anlamlı düzeyde farklılıklar araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun özefagus kanserine temel bir katkısının olmadığını bildirmişlerdir. 2.12. CHEK2 Mutasyonlarının Pankreas Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Bartsch ve ark. (2006), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının ailesel pankreas kanseri ile ilişkileri araştırılmıştır. Alman kökenli ailesel pankreas kanser öyküsü olan 35 aileden 81 pankreas kanserli hastada CHEK2 mutasyonlarının sıklığı belirlenmiştir. 35 ailenin sadece 1’inde (%3) CHEK2 1100delC mutasyonu belirlenmiştir. Bu oran Avrupa populasyonu için beklenen %1.4 oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon sıklığı ile karşılaştırıldığında pankreas kanseri ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişkinin önemli olmadığını göstermiştir. 2.13. CHEK2 Mutasyonlarının Prostat Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Seppälä ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada Finlandiya populasyonundan prostat kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının frekansları ve bu mutasyonların prostat kanseri oluşumu ile ilişkileri tek zincir konformasyon polimorfizmi ve mini baz sırası saptama yöntemleri ile araştırılmıştır. Çalışmanın hasta populasyonunda ailesel prostat kanseri öyküsü bulunan 120 prostat kanserli hasta ve ailesel kanser öyküsü bulunmayan 537 prostat kanserli hasta bulunmaktadır. Ayrıca çalışmaya sağlıklı 480 bireyden oluşturulan kontrol grubu da dahil edilmiştir. Ailesel kanser öyküsü bulunan hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı %3.3 (4/120) bunun yanında I157T mutasyonunun sıklığı %10.8 (13/120) oranında saptanmıştır. Ailesel kanser öyküsü olmayan prostat kanserli grupta 1100delC mutasyonunun oranı %1.3 (7/537), I157T mutasyonunun 43 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM frekansı %7.8 (42/537) olarak belirlenmiştir. Sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda 1100delC mutasyonunun sıklığı %0.4 (2/480), I157T mutasyonunun oranı %5.4 (26/480) olarak bulunmuştur. Yapılan analizler sonucunda, CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının oranlarının ailesel prostat kanserli grup ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede farklılık gösterdiği (p=0.02 ve p=0.04) fakat kontrol grubu ile ailesel olmayan prostat kanserli grup arasında bu iki mutasyon yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır (p=0.15 ve p=0.13). Cybulski ve ark. (2004b), 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının prostat kanseri oluşumunu 2.2 kat (p=0.04) artırdığı bildirilmiştir. Bununla birlikte I157T mutasyonunun prostat kanser oluşumunu 1.7 kat (p=0.002) arttırdığı saptanmıştır. Cybulski ve ark. (2004a), tarafından Polonyalı 690 prostat kanserli ve 1921 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1G>A mutasyonlarının frekansları PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Araştırıcılar kontrol grubunda bu mutasyonların %0.5 (9/1921) oranında olduğunu prostat kanserli hasta grubunda ise %1.6 (11/690) oranında olduğunu bildirmişlerdir. Bu mutasyonlar prostat kanseri oluşumunu 3.4 kat artırmıştır (p=0.004). Aynı çalışma içerisinde ailesel prostat kanseri öyküsü olan prostat kanserli bireylerin 98’inin 4’ünde bu mutasyonlar saptanmıştır. Araştırıcılar bu mutasyonların ailesel prostat kanseri oluşumunu 9 kat artırdığını (p=0.0002) belirtmişlerdir. Yine aynı çalışma içerisinde CHEK2 I157T mutasyonunun sıklığı da araştırılmıştır. Prostat kanserli hastalarda bu mutasyonun oranı %7.8 iken kontrol grubunda ise %4.8 oranında tespit edilmiştir. CHEK2 I157T mutasyonu prostat kanseri oluşumunu 1.7 kat artırmıştır (p=0.03). I157T mutasyonunun ailesel prostat kanseri öyküsü olan prostat kanserli hastalarda %16 oranında bulunduğu ve bu mutasyonun ailesel prostat kanseri oluşumunu 3.8 kat artırdığı bildirilmiştir 44 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM (p=0.00002). Araştırıcılar elde edilen sonuçlardan bu iki mutasyonun Polonya kökenli erkek fertlerde prostat kanseri oluşumunu orta derecede artırdığı yorumuna varmışlardır. Prostat kanseri ile CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonları arasındaki ilişkiyi prostat kanseri için herhangi bir risk faktörü göz önünde bulundurmadan seçilmiş 1864 prostat kanserli hasta, 249 ailesel prostat kanseri öyküsü bulunan prostat kanserli hasta ve 5496 kontrol grubu ile yapılan çalışmada araştırılmıştır (Cybulski ve ark., 2006b). Herhangi bir risk faktörü gözetmeden seçilmiş prostat kanserli hasta grubunda del5395, 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının oranları sırası ile %0.8 (15/1864), %0.8 (14/1864), %0.8 (15/1864) ve %7.6 (142/1864) olarak belirlenmiştir. Ayrıca bu çalışmada ailesel prostat kanseri öyküsü bulunan prostat kanserli hasta grubunda del5395 mutasyonu %1.6 (4/249), 1100delC mutasyonu %1.2 (3/249), IVS2 + 1 G>A mutasyonu %2 (5/249) ve I157T mutasyonu %12 (30/249) oranlarında saptanmıştır. Sağlıklı bireylerden oluşturulmuş kontrol grubunda del5395, 1100delC, IVS2 + 1 G>A, ve I157T mutasyonlarının oranları sırası ile %0.4 (24/5496), %0.2 (12/5496), %0.4 (22/5496) ve %4.8 (264/5496) olarak belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda CHEK2 geninde araştırılan mutasyonlarının kontrol grubu ile kıyaslandığında hem ailesel hikayesi olan hem de herhangi bir risk faktörü gözetmeden seçilmiş prostat kanserli gruplarda prostat kanseri oluşumu istatistiksel olarak önemli oranlarda artırmışlardır. Araştırıcılar bu mutasyonların diğer Slav populasyonlarda özellikle Ukrayna, Belarus, Rusya, Baltık ve Balkan ülkelerinde de bulunabileceğini ve bu mutasyonların prostat kanserine yatkınlığa ne kadar katkılarının olduğunun ortaya çıkarılmasının önemli bir sonuç olabileceği bildirilmiştir. Weischer ve ark. (2007), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 1100delC mutasyonunun Danimarka populasyonunda meme, prostat ve kolorektal kanser oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmaya Danimarka populasyonundan 9231 birey katılmıştır. Ayrıca bu çalışma içinde 1101 meme kanserli ve 4665 kontrol bireyden oluşan vaka-kontrol çalışması da yapılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 45 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 1100delC mutasyonunun Süleyman BAYRAM prostat kanseri oluşumunu 2.3 kat artırdığını bildirmişlerdir. 2.14. CHEK2 Mutasyonlarının Rahim Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Konstantinova ve ark. (2008), tarafından rahim kanseri ile CHEK2 I157T mutasyonu arasındaki ilişki Bulgaristan populasyonundan 268 rahim kanseri tanısı konmuş hasta ve 449 sağlıklı bireyle yapılan çalışma ile araştırılmıştır. CHEK2 I157T mutasyonunun sıklığı rahim kanserli hastalarda %1.86 (5/268) oranında iken sağlıklı bireylerde %2.45 (11/449) oranında saptanmıştır. İki grup arasındaki farklılığın istatistiksel bir öneminin olmadığı yapılan istatistiksel analizler ile gösterilmiştir. Araştırıcılar rahim kanseri ile ilgili ilk araştırma olmasında dolayı bu tip çalışmaların daha geniş ve farklı etnik kökenden hastalarla yapılması gerektiği şeklinde bir öneride bulunmuşlardır. 2.15. CHEK2 Mutasyonlarının Tiroit Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar Cybulski ve ark. (2004b), 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının tiroit kanseri oluşumunu 4.9 kat (p=0.0006) artırdığı bildirilmiştir. Bununla birlikte I157T mutasyonunun tiroit kanseri oluşumunu 1.9 kat (p=0.04) artırdığı saptanmıştır. 2.16. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerin Oluşumuyla İlişkisini Araştıran Çalışmalardan Elde Edilen Sonuçların Toplu Değerlendirilmesi 46 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM CHEK2 genindeki 1100delC, IVS2 + 1 G>A, I157T ve del5395 mutasyonlarının 17 farklı kanser türünün oluşumu üzerine etkileri ile ilgili yapılmış çalışmalardan elde edilen sonuçlar toplu olarak Çizelge 2.1’de gösterilmiştir. Ayrıca Çizelge 2.1 aynı kanser türü ile ilgili kaç çalışma yapıldığı ve her mutasyonun ayrı ayrı kanser oluşumu ile ilişkisi bulunan çalışma sayısı ve herhangi bir ilişkinin bulunmadığı çalışma sayıları belirtilmiştir. Çizelge 2.1. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerle İlişkisi. CHEK2 Mutasyon Tipi 1100del IVS2 + 1 I157T del5395 C G>A (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Akciğer Kanseri (2) -1 -1 -2 -1 Beyin Kanseri (1) -1 ------Böbrek Kanseri (2) -1 -1 2 ---Gırtlak Kanseri (1) -1 -1 -1 -1 Kolorektal Kanser (13) 1 9 -2 4 --2 Li-Fraumeni Sendromu (2) 1 1 ------Lösemi (1) -1 ------Meme Kanseri (51) 16 26 4 4 6 5 3 2 Melanoma (1) -1 -1 -1 -1 Mesane Kanseri (1) 1 -1 -1 -1 -Ovaryum Kanseri (2) -2 -2 1 ---Özefagus Kanseri (1) -1 ------Pankreas Kanseri (1) -1 -1 -1 --Prostat Kanseri (5) 5 -3 -4 -1 -Rahim Kanseri (1) -----1 --Tiroit Kanseri (1) 1 -1 -1 ---Üst solunum Yolu Kanseri (1) -----1 --(+) : Mutasyon ile kanser türü arasında pozitif ilişki bulunan çalışma sayısı (-) : Mutasyon ile kanser türü arasında pozitif ilişki bulunmayan çalışma sayısı -: Veri yok Kanser Türü (Yapılan Çalışma Sayısı) 47 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM 48 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3. MATERYAL ve METOD Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesine başvuran 821 bireyden (kolorektal kanserli, hepatoselüler kanserli ve sağlıklı kontrol bireyler) toplanan dokular (periferik kan ve kolorektal doku) materyal olarak kullanılmıştır. 3.1. Hasta ve Kontrol Grubu Çalışmada, kolorektal kanserli hasta grubu, hepatoselüler kanserli hasta grubu ve herhangi bir kanser tanısı konulmamış sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubu olmak üzere üç farklı deney grubu oluşturulmuştur. Kolorektal ve hepatoselüler kanser grupları 2002-2009 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Gastroenteroloji Bilim Dalı’na başvurup, klinik olarak hepatoselüler veya kolorektal kanser tanısı konulan hastaların dokularından meydana getirilmiştir. Araştırmamıza hepatoselüler kanser tanısı alan 165 hasta ve kolorektal kanser teşhisi konulan 210 hasta dahil edilmiştir. 165 hepatoselüler ve 78 kolorektal kanser tanılı hastadan 0.5 molar (M) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (5.4 mg) içeren vakumlu tüplere (BD Vacutainer®, İngiltere) 2 ml periferik kan alınmıştır. Hasta ve kontrol grubu bireylerinden alınan periferik kanlar DNA izolasyonu yapılana kadar +4 oC’de saklanmıştır. Periferik kandan genomik DNA izolasyonu kan alındıktan sonraki iki gün içinde yapılarak, izole edilen DNA’lar -80 ºC’de çalışma gününe kadar muhafaza edilmiştir. Ayrıca, çalışmamızdaki kolorektal kanser tanısı konmuş 132 hastanın parafine gömülü kolorektal kanser doku örnekleri Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Bilim Dalın’dan elde edilmiştir. 2004-2009 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesine kontrol amaçlı başvuran, kendisinde herhangi bir kanser saptanmamış 446 bireyden EDTA içeren vakumlu tüplere 2 ml periferik kan alınarak araştırmanın kontrol grubu oluşturulmuştur. Kontrol bireyler belirlenirken, hasta grubunun yaş ortalamasına yakın olmasına özen gösterilmiştir. 49 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Araştırmaya katılan çalışma ve kontrol grubu bireylerinin kanları gönüllülük esasına dayanarak etik kurallar çerçevesinde toplanmıştır. Hem hasta hem de kontrol grubundaki gönüllüler, çalışmaya katılmadan önce çalışmanın amacı ve içeriği hakkında açık bir dille bilgilendirilmiştir. Araştırmamıza dahil ettiğimiz kanserli olguların ve kontrol grubuna ait bireylerin tüm bilgileri Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesinin Arşiv bölümündeki hasta dosyalarından uzman doktorlar ile birlikte toplanmıştır. Bu çalışmada kolorektal ve hepatoselüler kanserli hastalarda ve herhangi bir kanser saptanmamış sağlıklı bireylerde CHEK2 geninde I157T, IVS2+1G>A ve 1100delC mutasyonlarının olup olmadığı araştırılmıştır. Çalışma Çukurova Üniversitesi, Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Gastroenteroloji Bilim Dalı, Moleküler Biyoloji ve Genetik laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları 3.2.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 3.2.1.1. Agaroz (Sigma) Agaroz, kırmızı alg cinsleri olan Gelidium ve Gracilaria’dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözündürülüp soğutulduğu zaman, polimerizasyon ile karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu sonucunda jel yapısına dönüşür. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Kullanılacak jelin büyüklüğüne ve konsantrasyonuna göre tartılan agaroz, Tris Borik EDTA (TBE) tamponu içerisinde kaynatma yolu ile çözündürüldü. Agaroz jel, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi (PCRRFLP) ve Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ARMS-PCR) sonuçlarını görüntüleme amacıyla kullanılmıştır. Hazırlanan agaroz jele yüklenen örnekler elektriksel alanda belirli bir süre boyunca boyutlarına ve moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılmıştır. Agaroza ait özellikler aşağıda verilmiştir. 50 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Formu: Toz Toplam katkı: ≤ %10 nem Kül: ≤ % 1 Renk: Beyaz-Kirli Beyaz Geçiş sıcaklığı: 36°C ±1.5°C (Jel Noktası) Sulfat (SO4-2) anyon kalıntısı: ≤%0.15 Dış aktiviteler: DNaz ve RNaz aktivitesi belirlenmemiştir CAS No: 9012-36-6 Sigma No: A5093-100G Lot No: 039K003 3.2.1.2. Etil Alkol (Merck) Parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan DNA izolasyonu yapılırken dokulardaki suyun ve ksilolün uzaklaştırılması işleminde farklı yüzde oranlarında (%100, %80, %60 %40) etil alkol serileri kullanılmıştır. Etil alkole ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Ethyl alcohol Kapalı formülü: C2H6O Molekül ağırlığı: 46.07 g/mol Kaynama noktası: 78.4°C Donma noktası:-114.3°C CAS No: 64-17-5 Merck No: 1.00986.2500 3.2.1.3. İzopropanol (Sigma) Parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan ve periferik kandan DNA izolasyonu işlemlerinde izopropanol DNA’nın çökelmesinde (presipitasyonunda) kullanıldı. İzopropanole ait özellikler aşağıda verilmiştir. 51 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Kimyasal adı: Isopropyl alcohol Kapalı formülü: (CH3)2CHOH Molekül ağırlığı: 60.10 g/mol Kaynama noktası: 82°C Donma noktası: −89.5°C CAS No: 67-63-0 Sigma No: I9516 Lot No: 51K3485 3.2.1.4. Ksilol (Merck) Parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan DNA izolasyonu işleminden önce, dokunun gömülü olduğu parafinin uzaklaştırılmasında ksilol kullanılmıştır. Ksilole ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Dimethylbenzene Kapalı formülü: C6H4(CH3)2 Molekül ağırlığı: 106.17 g/mol Kaynama noktası: 137-143°C Donma noktası: >-34°C CAS No: 1330-20-7 Merk No: 1.08685.2500 Lot No: K33776585 441 3.2.1.5. Mineral Yağ (Sigma) RFLP işlemleri sırasında reaksiyon içeriklerinin ısı etkisiyle uçmasını ve yanlış pozitiflik veya yanlış negatifliğin oluşmasını engellemek amacıyla reaksiyon içeriklerinin üzeri mineral yağ ile kaplanarak RFLP işlemi mineral yağ altında yapılmıştır. Mineral yağa ait özellikler aşağıda verilmiştir. 52 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Rengi: Beyaz Yoğunluğu: 0.84 g/mL (25°C) Formu: Hafif yağ CAS No: 8042-47-5 Sigma No: M5904-500ML 3.2.1.6. Brom Fenol Mavisi (Sigma) Brom fenol mavisi agaroz jel elektroforez işlemleri sırasında PCR, PCRRFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jelde ne kadar bir mesafe aldıklarını gözlemek amacı ile jel yükleme tamponunda kullanılmıştır. Brom fenol mavisi 0.5X konsantrasyonundaki TBE tamponunda yaklaşık olarak 300 baz çiftlik (bç) DNA fragmenti ile aynı anda hareket eder. Brom fenol mavisine ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: 3′,3′′,5′,5′′-Tetrabromophenolsulfophthalein sodium salt Kapalı formülü: C19H9Br4NaO5S Molekül ağırlığı: 691.94 CAS No: 34725-61-6 Sigma No: B5525-25G 3.2.1.7. Ksilen Siyanol FF (Sigma) Ksilen Siyanol FF agaroz jel elektroforez işlemleri sırasında PCR, PCRRFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jelde ne kadar bir mesafe aldıklarını gözlemek amacı ile jel yükleme tamponunda kullanılmıştır. Ksilen Siyanol FF 0.5X konsantrasyonundaki TBE tamponunda yaklaşık olarak 4 kilobaz çiftlik DNA fragmenti ile aynı anda hareket eder. Ksilen Siyanol FF’e ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Xylene Cyanol FF 53 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Kapalı formülü: C25H27N2NaO6S2 Molekül ağırlığı: 538.61 CAS No: 2650-17-1 Sigma No: X4126-10G 3.2.1.8. Gliserol (Sigma) Gliserol agaroz jel elektroforez işlemleri sırasında PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin jel kuyucuklarının içine çökmesini sağlamak amacıyla jel yükleme tamponunda kullanılmıştır. Gliserol örneklerin yoğunluklarını arttırarak agaroz jelde oluşturulan kuyucukların içine çökmesini sağlamaktadır. Gliserole ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Glycerol, 1,2,3-Propanetriol, Glycerin Kapalı formülü: HOCH2CH(OH)CH2OH Molekül ağırlığı: 92.09 Kaynama noktası: 182 °C Donma noktası: 20 °C Yoğunluğu: 1.25 g/mL CAS No: 56-81-5 Sigma No: G8773 Lot No: 58H0056 Jel Yükleme Tamponunun (Jel-loading buffer) Hazırlanışı: % 0.25 (m/v) Brom fenol mavisi % 0.25 (m/v) Ksilen Siyanol FF % 0.30 (v/v) Gliserol 0.25 gr brom fenol mavisi, 0.25 gr ksilen siyanol FF tartıldı ve 30 ml gliserol eklendi son hacim 100 ml olacak şekilde 70 ml distile su ilave edilerek karıştırıldı. Çözünmeleri için ısıtıldı. +4 oC sıcaklığında saklandı. 54 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.2.1.9. Trizma-Baz (Sigma) Trizma-Baz, TBE tamponunda kullanılmıştır. TBE tamponu agaroz jel hazırlanmasında ve elektroforez işlemlerinde kullanılmıştır. Trizma-Baza ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Kapalı formülü: C4H11NO3 Molekül ağırlığı: 121.14 Kaynama noktası: 219-220 °C Erime noktası: 167-172 °C CAS No: 77-86-1 Sigma No: T6066 3.2.1.10. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (Sigma) Etilendiamintetraasetik asit, TBE tamponunda kullanılmıştır. TBE tamponu agaroz jel hazırlanmasında ve elektroforez işlemlerinde kullanılmıştır. Etilendiamintetraasetik asite ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate Kapalı formülü: C10H14N2Na2O8 · 2H2O Molekül ağırlığı: 372.24 Kaynama noktası: 248 °C CAS No: 9012-36-6 Sigma No: E5134 3.2.1.11. Borik Asit (Sigma) Borik asit, TBE tamponunda kullanılmıştır. TBE tamponu agaroz jelde ve elektroforez işlemlerinde kullanılmıştır. Borik asite ait özellikler aşağıda verilmiştir. 55 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Kimyasal adı: Boric acid Kapalı formülü: H3BO3 Molekül ağırlığı: 61.83 Kaynama noktası: 160 °C CAS No: 10043-35-3 Sigma No: B6768 Tris-Borik asit-EDTA (TBE) Tamponunun Hazırlanışı: Moleküler biyolojide TBE tamponu elektroforezde kullanılan en yaygın tamponlardan biridir. Bu tampon DNA molekülünün proton almasını önler ve DNA molekülünü suda çözünür durumda tutar. EDTA özellikle magnezyum (Mg+2) gibi divalent katyonların bir şelatörüdür (şelant, çelatör, çelant, kıskaçlayıcı, iyon tutucu). Şelatörler; üzerlerinde bulunan reseptörleri aracılığı ile elementleri ve diğer etkileşim yapacağı maddeleri bağlayıp çözünmeyen bir kompleks oluştururlar. Bu tamponda EDTA nükleik asitlerin enzimatik parçalanmasını önlemektedir. TBE Tamponu (10X): Trizma bazdan 108 gr, borik asitten 55 gr, EDTA’dan 9.3 gr tartıldı. Son hacim 1 litre olacak şekilde steril distile su ilave edildi. Tüm bileşenlerin steril su içerisinde çözünmesi sağlandı (pH:8.3). Oda sıcaklığında saklandı. TBE Tamponu (1X): 100 ml TBE tamponunun (10X) üzerine 900 ml steril distile su ilave edildi. Oda sıcaklığında saklandı. 3.2.1.12. Suyla Hazırlanmış % 1’lik Etidyum Bromür Çözeltisi (Merck) Etidyum bromür PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jelde görünür hale gelmesi amacıyla kullanıldı. Etidyum bromür DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm’deki ışığı absorblaması sonucu fluoresan etki göstermesi ile DNA’yı agaroz jelde görünür hale getirir. Etidyum bromür çözeltisi karanlık ortamda ve +4 oC’de saklandı. Etidyum bromüre ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: 3,8-Diamino-5-etil-6-fenilfenantridinium bromür 56 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Kapalı formülü: C21H20BrN3 Molekül ağırlığı: 394.31 g/mol Erime noktası: 238-240 °C Yoğunluk: 1.00 g/cm3 CAS No: 1239-45-8 Merck No: 1116080030 3.2.1.13. DNA Polimeraz Enzimi (Fermentas) DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleosid trifosfattan uzun polinükleotid zincir sentezini kataliz eder. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5’ uçtan 3’ uca doğru olup, primerin serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki deoksiribonükleosid trifosfat’ların nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır. Bu çalışmada Fermentas Life Sciences firmasının ürettiği Taq DNA polimeraz (Cat No. EP0402) (Lot No: 00030644) kullanılmıştır. Kullanılan Taq DNA polimeraz enziminin konsantrasyonu 5U/μl’dir. PCR tamponu olarak10X konsantrasyonda MgCI2 içermeyen 500mM KCI, 100mM Tris-HCI (pH:8.8) ve %0.8 Nonidet P40 içeren tampon kullanıldı. 3.2.1.14. Deoksiribonükleosid Trifosfat (dNTP) Seti (Promega) PCR reaksiyonunda kullanılmak üzere dATP, dCTP, dGTP ve dTTP’i içeren dNTP seti Promega firmasından (Cat. No. U1420) (Lot. No. 252313) satın alınmıştır. dNTP seti aşağıdaki bileşikleri belirtilen miktarlarda içermektedir. 1. Kimyasal adı :dATP (2’deoxyadenosine 5’triphosphate, sodyum tuzu) Kapalı formülü :C10H12N5O12P3Na4 Molekül ağırlığı :579.2 Konsantrasyonu :100mM (pH:7.5) 57 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Miktarı:100μl 2. Kimyasal adı:dCTP (2’ deoxycytidine 5’ triphosphate, sodyum tuzu) Kapalı formülü:C10H12N3O13P3Na4 Molekül ağırlığı:555.1 Konsantrasyonu:100mM (pH:7.5) Miktarı:100μl 3. Kimyasal adı:dGTP (2’deoxyguanosine 5’triphosphate, sodyum tuzu) Kapalı formülü:C10H12N5O13P3Na4 Molekül ağırlığı:595.1 Konsantrasyonu:100mM (pH:7.5) Miktarı:100μl 4. Kimyasal adı:dTTP (2’deoxythymidine 5’triphosphate, sodyum tuzu) Kapalı formülü:C10H13N2O14P3Na4 Molekül ağırlığı:570.1 Konsantrasyonu:100mM (pH:7.5) Miktarı:100μl 10 mM dNTP Karışımının Hazırlanışı: Amplifikasyon esnasında denatüre edilen zincirin tamamlanmasında kullanılacak olan deoksiribonükleosid trifosfatlar eşit oranda dATP, dCTP, dGTP ve dTTP’lerden oluşur. 100 mM’lık dATP, dCTP, dGTP, dTTP nükleotid stok çözeltilerinden 10’ar μl alınarak üzerlerine 60 μl steril distile su ilave edilerek toplam hacimi 100 μl olan 10 mM konsantrasyonda dNTP karışımı hazırlandı. Santrifüjle karıştırılıp -20 oC’de saklandı. 3.2.1.15. DNA Marker (Promega) PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin kaç baz çifti uzunluğunda olduklarının doğrulanması amacıyla Promega firmasının üretmiş olduğu “50 bp DNA Step Ladder” (Cat No. G4521) (Lot No. 226076) DNA marker’ı (DNA belirteçi) kullanılmıştır. DNA marker’ı etidyum bromür ile boyanmış % 2’lik agaroz jelde 80 voltajda 2-3 saat elektroforez edildiğinde en küçüğü 50 baz çifti en büyüğü 800 baz 58 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM çifti büyüklüğünde olan ve her biri 50 baz çiftlik artış gösteren 16 DNA parçasından oluşmaktadır. Üretici firmanın önerileri doğrultusunda agaroz jele 5 μl DNA marker’ı ve 1 μl mavi/turuncu 6X yükleme boyası [(Cat No. G190A) (% 15 Ficoll® , % 0.03 bromfenol mavisi, % 0.03 ksilen siyanol FF, % 0.4 turuncu G, 10mM Tris-HCI (pH:7.5), 50mM EDTA] şeklinde yüklenmiştir. 3.2.1.16. CHEK2 I157T Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti CHEK2 genindeki I157T mutasyonunu saptamak için seçilen primer çifti ile CHEK2 I157T mutasyonunun oluşmasına neden olan nükleotidin de içinde bulunduğu 155 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti amplifiye edilmiştir. Kullanılan primerlerin uzunlukları, erime sıcaklıkları (Tm), guanin-sitozin (GC) baz oranı ve baz dizisi Çizelge 3.1.’de gösterilmiştir. Primerler, liyofilize halde, 0.2 µmol sentez skalasında sentezlenmiş ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmış ticari olarak (Ella Biotech GmbH Am Klopferspitz 1982152 Martinsried/Germany) satın alınan CHEK2 I157T İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde üretici firmanın önerisi olan 533 µl aynı şekilde CHEK2 I157T Geri primeri de 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 528 µl PCR için uygun saflıktaki steril distile su ilave edilerek çözüldü ve -20 oC’de saklanmıştır. Çizelge 3.1. CHEK2 Genindeki I157T Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi. Uzunluk Tm GC Primer (bç) CHEK2 I157T İleri 5’-ACC CAT GTA TCT AGG AGA GCT 22 CHEK2 I157T Geri (oC) (%) Baz dizisi 60.3 50.0 G-3’ 5’-CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT 24 61.0 45.8 GCA-3’ 59 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.2.1.17. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti CHEK2 genindeki IVS2 + 1G>A mutasyonunu saptamak için seçilen primer çifti ile CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun oluşmasına neden olan nükleotidin de içinde bulunduğu 491 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti amplifiye edilmiştir. Kullanılan primerlerin uzunlukları, erime sıcaklıkları (Tm), guanin-sitozin (GC) oranları ve baz dizisi Çizelge 3.2.’de gösterilmiştir. Primerler, liyofilize halde 0.2 µmol sentez skalasında sentezlenmiş ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmış ticari olarak (Ella Biotech GmbH Am Klopferspitz 1982152 Martinsried/Germany) satın alınan CHEK2 IVS2 + 1G>A İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde üretici firmanın önerisi olan 502 µl aynı şekilde CHEK2 IVS2 + 1G>A Geri primeri de 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 572 µl PCR için uygun saflıktaki steril distile su eklenerek çözüldü ve –20 oC’de saklanmıştır. Çizelge 3.2. CHEK2 Genindeki IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi. Uzunluk Tm GC Primer (bç) (oC) (%) Baz dizisi CHEK2 IVS2 + 1G>A İleri 5’-ATT TAT GAG CAA TTT TTA AAC 22 49.1 22.7 G-3’ CHEK2 IVS2 + 1G>A Geri 5’-TCC AGT AAC CAT AAG ATA ATA 28 56.3 25.0 ATA TTA C-3’ 3.2.1.18. CHEK2 1100delC Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çiftleri CHEK2 genindeki 1100delC mutasyonunu saptamak için kullanılan ARMSPCR yönteminde CHEK2 geninde meydana gelen 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilen ve 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilen iki ayrı özgün primer çiftleri kullanıldı. 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek özgün primerler ile 183 baz çiftlik (bç) bir 60 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM DNA fragmenti amplifiye edildi. CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek özgün primer çiftleri ile 184 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti çoğaltıldı. Hem CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına özgü hem de bu mutasyonun bulunmamasına özgü yapılan ayrı ayrı iki farklı reaksiyonda PCR reaksiyonun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol amaçlı seçilen bir primer çifti ile solute carrier family 30 (zinc transporter), member 9 (SLC30A9) genine ait 309 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti amplifiye edildi. Membran taşıma proteinlerinin çözünen molekülleri taşıyan, çözünen taşıyıcı (SLC) grubu (solute carrier, SLC) içindeki 300 üye gen 47 gen ailesi içerisinde toplanmıştır. Çeşitli SLC grupları tarafından taşınan çözünen moleküller oldukça çeşitlidir. Bunlar yüklü ve yüksüz organik moleküller ile inorganik iyonlardır. Bizim çalışmamızda kontrol geni olarak kullanılan SLC30A9 geni tarafından sentezlenen protein hücre içi çinko düzenlenmesinde görev alan çözünen molekülleri taşıyan membran taşıma protenidir. Bu proteini kodlayan gen 4. kromozomun kısa kolunda bulunmaktadır (4p13-p12). Çalışmada kontrol olarak SLC30A9 geninde 309 baz çifti amplifikasyona neden olan primer çiftinin kullanılmasının sebebi hem CHEK2 1100delC mutasyonunun oluşturabilecek hem de bulunması bulunmaması durumunda durumunda DNA amplifikasyonu DNA amplifikasyonu oluşturabilecek özgün primerlerin Tm değerlerinin bu kontrol primer çiftinin Tm değerine çok yakın olmalarıdır. Böylece hem CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına hem de bulunmamasına özgü yapılacak iki farklı reaksiyonda da PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığı SLC30A9 geninde 309 baz çiftinin amplifikasyonu ile kontrol edildi. Kullanılan primerlerin uzunlukları, erime sıcaklıkları (Tm), GC oranları ve baz dizileri Çizelge 3.3.’de gösterilmiştir. Primerler, liyofilize halde 0.2 µmol sentez skalasında sentezlenmiş ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmış ticari olarak (Sigma, Life Science) satın alınan CHEK2 M-CHEK2del1100C İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde üretici firmanın önerisi olan 836 µl, CHEK2 MCHEK2del1100C Geri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1076 µl, WCHEK21100delC İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 836 µl; WCHEK21100delC Geri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1169µl; 61 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM SLC30A9-Kontrol İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1246 µl; SLC30A9-Kontrol Geri primeri ise 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1284 µl PCR için uygun saflıktaki steril distile su eklenerek çözüldü ve –20 oC’de saklandı. Çizelge 3.3. CHEK2 Genindeki 1100delC Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları, GC Oranları ve Baz Dizileri. Uzunluk Tm GC Primer (bç) (oC) (%) M-CHEK2del1100C İleri 5'-GCA AAG ACA TGA ATC 24 60.6 37.5 TGT AAA GTC-3' M-CHEK2del1100C Geri 5'-AAA TCT TGG AGT GCC 24 64.3 33.3 CAA AAT AAT-3' W-CHEK21100delC İleri 5'-GCA AAG ACA TGA ATC 24 60.6 37.5 TGTA AAG TC-3' W-CHEK21100delC Geri 5'-AAA TCT TGG AGT GCC 24 67.8 41.6 CAA AAT CAG-3' SLC30A9-Kontrol İleri 5'-GTC AAA GCC ACC AGT 21 60.6 47.6 TAC AGT-3' SLC30A9-Kontrol Geri DNA dizisi 5'-TTC CCC ACC ACT TTA 20 61.4 50 CTG AC-3' 3.2.1.19. DNA İzolasyon Kiti (Roche) Roche firmasının ürettiği yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti (High Pure PCR Template Preparation Kit) (Cat. No. 11 796 828 001) periferik kandan ve parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan genomik DNA izolasyonu için kullanılmıştır. Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kitinin içerisinde aşağıdaki bileşikler ve tüpler bulunmaktadır. 62 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kitinin içeriği: 1.Doku Parçalama Çözeltisi (Tissue Lysis Buffer)………….......………………20 ml (4M üre, 200mM NaCI, 200mM EDTA, pH: 7.4, 25 oC) 2.Bağlanma çözeltisi (Binding Buffer)…….……………………………………20 ml (6M guanidine-HCI, 10mM üre, 10 mM Tris-HCI, % 20 Triton X-100 (v/v),pH:4.4, 25 oC) 3.Proteinaz K (recombinant PCR grade, Liyofilize) (4.5 ml distile su ilave edildikten sonra kullanıldı) 4.İnhibitör Uzaklaştırıcı Çözelti (Inhibitor Remal Buffer)………………………33 ml (5M guanidine-HCI, 20mM Tris-HCI, pH:6.6, 25 oC) (20 ml etanol ilave edildikten sonra kullanıldı) 5.Yıkama çözeltisi (Wash Buffer)….....................................................................20 ml (20mM NaCI, 2mM Tris-HCI, pH:7.5) (80 ml etanol ilave edildikten sonra kullanıldı) 6.Çözdürme Çözeltisi (Elution Buffer)..................................................................40 ml (10mM Tris, pH:8.5, 25 oC) 7.Filtreli tüpler (High Pure Filter Tubes).........................................................100 Adet (Polypropylen) 8.Toplama Tüpleri (Collection Tubes).............................................................400 Adet 3.2.1.20. PstI Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs) CHEK2 I157T mutasyonu bu çalışmada PCR-RFLP yöntemi ile belirlenmiştir. I157T mutasyonu New England Biolabs firmasının ürettiği PstI restriksiyon endonükleaz enzimi ile belirlenmiştir. Providencia stuartii 164 (ATCC 49762) bakterisine ait PstI genini taşıyan Escherichia coli suşundan PstI restiriksiyon endonükleaz enzimi üretilmiştir. Bu enzim restriksiyon etkisini yapışkan uç oluşturarak gösterir. PstI restriksiyon endonükleaz enzimine ait özellikler aşağıda verilmiştir. 63 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM PstI Enziminin Miktarı (katkı) :10.000 U (200 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH:7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), % 0.15 Triton X100, 200 μg/ml bovine serum albumin (BSA), % 50 gliserol) Ünite Tanımlılığı :50µl reaksiyon eriyiği içerisinde 1 µgr λ DNA’sını 37 o C’de 1 saat içinde parçalayan enzim miktarına 1 ünite denir PstI Enziminin Konsantrasyonu :20.000 U/ml (1 µgr substrat DNA’nın kesimi için gerekli olan minimum enzim miktarı 16 saatte 0.25 ünitedir) : 5’...C TGCA ↓ G...3’ PstI Tanıma Bölgesi 3’...G ↑ ACGT Enzim için Optimum Buffer C...5’ :NEBuffer3 (100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, pH:7.9) Optimum İnkübasyon Sıcaklığı :37 oC Sıcaklıkla İnaktivasyonu :80 oC/20 dakika Saklanma Sıcaklığı :-20 oC Lot No :0410905 New England Biolabs No :R0140S 3.2.1.21. Hyp188III Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs) CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu bu çalışmada PCR-RFLP yöntemi ile araştırılmıştır. IVS2 + 1G>A mutasyonu New England Biolabs firmasının ürettiği Hyp188III restriksiyon endonükleazı enzimi ile belirlenmiştir. Helicobacter pylori 188 (S.A. Thompson) bakterisine ait Hpy188III genini taşıyan Escherichia coli suşundan Hpy188III restriksiyon endonükleaz enzimi üretilmiştir. Bu enzim 64 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM restriksiyon etkisini yapışkan uç oluşturarak gösterir. Hpy188III restriksiyon endonükleaz enzimine ait özellikler aşağıda verilmiştir. Hpy188III Enziminin Miktarı (katkı) :2.500 U (250 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH:7.5), 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 200 μg/ml BSA, % 50 gliserol) Ünite Tanımlılığı :50µl reaksiyon eriyiği içerisinde 1 µgr pUC19 DNA’sını 37 oC’de 1 saat içinde parçalayan enzim miktarına 1 ünite denir Hpy188III Enziminin Konsantrasyonu :5.000 U/ml (1 µgr substrat DNA’nın kesimi için gerekli olan minimum enzim miktarı 16 saatte 0.25 ünitedir) : 5’...TC ↓ NN GA...3’ Hpy188III Tanıma Bölgesi 3’...AG NN ↑ CT ...5’ (N = Herhangi bir nükleotid) Enzim için Optimum Buffer :NEBuffer 4 (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, magnesium acetate, dithiothreitol, pH:7.9) Optimum İnkübasyon sıcaklığı :37 oC Sıcaklıkla inaktivasyonu :65 oC / 20 dakika Saklanma Sıcaklığı :-20 oC Lot No :0050801 New England Biolabs No :R0622L 65 10 mM 1 mM 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.2.2. Kullanılan Deney Ekipmanları 3.2.2.1. Santrifüjler DNA izolasyonu çalışmalarında dakikada 18.000 devir yapabilen, -20 oC ile +40 oC sıcaklıkları arasında ayarlanabilen, 278 x 333 x 620 mm boyutlarında olan 1.5 ve 2.0 ml eppendorf tüplerine uyumlu ve 12 adet tüp kapasiteli MIKRO 22R model HETTICH marka soğutmalı santrifüj kullanılmıştır. PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR işlemlerinde reaksiyon reaktiflerini deney tüpünün dibine toplamak amacıyla dakikada 13.000 devir yapabilen 0.2 ve 0.5 ml eppendorf tüplerine uyumlu ve 16 adet tüp kapasiteli FORCE 13 model TECHNE CAMBRIDGE marka masaüstü mikrosantrifüj kullanılmıştır. 3.2.2.2. Derin Dondurucular Çalışmamızda kullanılan saf malzemelerin saklanmasında -20 oC sıcaklığa inebilen ETUP 514 SL model ARISTON marka derin dondurucu kullanılmıştır. İzole edilen DNA’ların saklanmasında -80 oC’ye inebilen MDF-192 model SANYO marka derin dondurucu kullanılmıştır. 3.2.2.3. Steril Kabin PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR işlemlerinin yapılmasında HEPA filtreli 37500-02 Model Labconco Purifier PCR Enclosures marka steril kabin kullanılmıştır. 3.2.2.4. Polimeraz Zincir Reaksiyon Aleti (Termal Cycler) PCR işleminde GeneAmpR PCR System 9700 model Applied Biosystems (Applied Biosystems, Singapore) marka termal cycler kullanılmıştır. Termal cycler cihazı 0.2 ml eppendorf deney tüpüne uyumlu ve 96 adet mikrotüp kapasitelidir. 66 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.2.2.5. Vorteks Aleti Saf malzemeleri reaksiyonlardan önce homojen hale getirmek ve deney tüpüne eklenen çözeltilerin homojen karışmasını sağlamak için MS2 model IKA (IKA-WORKS, INC. USA) marka vorteks cihazı kullanılmıştır. Vorteks cihazı dakikada 200-2500 devir/dakika (rpm) yapabilme, 4.5 mm yörüngesi bulunan ve maksimum 0.1 kg yük kaldırabilme özelliklerine sahiptir. 3.2.2.6. Kuru Isıtıcı Isı ile inkübasyon gerektiren, dondurulmuş sarf malzemlerin çözülmesi ve PCR-RFLP gibi işlemler FALC (FALC INSTRUMENTS s.r.l. ITALY) marka kuru ısıtıcı ile yapılmıştır. Kuru ısıtıcı cihazının 0.5, 1.5 ve 2.0 ml eppendorf tüplerine uyumlu alimünyumdan yapılmış blokları bulunmaktadır. Kuru ısıtıcı cihazı 0-100 oC sıcaklıklar arasında elektronik olarak ayarlanabilmektedir. 3.2.2.7. Hasas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan SBA 41 model SCALTEC (Scaltec Instruments GmbH Deutschland/Germany) marka hasas terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır. 3.2.2.8. Manyetik Isıtcı ve Karıştıcı Kimyasal çözeltilerin karıştırılması ve ısıtılması işlemleri, özellikle agaroz jelin hazırlanması IKAMAG® RCT basic model IKA LABORTECHNIK (IKA ®WERKE GMBH&CO.KG STAUFEN/GERMANY) marka manyetik ısıtıcı ve karıştırıcı ile yapılmıştır. 67 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.2.2.9. Buzdolabı Çalışmada PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR gibi reaksiyonlar sonucu oluşan ürünler, ayrıca buzdolabında saklanması gereken sarf kimyasalların saklanmasında BK 9512 NF model BEKO (BEKO Ticaret A.Ş. İstanbul/Türkiye) marka buzdolabı kullanılmıştır. 3.2.2.10. Jel Elektroforez Sistemi PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jel ile elektroforezinde yatay jel tankı ve düzeneği olarak Elektrophoretic Gel System Midicell Primo EC330 model Thermo EC marka jel elektroforez sistemi kullanılmıştır. Elektroforez güç kaynağı olarak EC 105 model E-C Apparatus Corporation (Florida, USA) marka güç kaynağı kullanılmıştır. 3.2.2.11. Jel Görüntüleme Sistemi Elektroforez sonuçları BioDoc IITM Biometra marka görüntüleme sistemi ile görüntülenmiştir. Görüntüleme sisteminde beyaz ve UV ışık yayabilen iki farklı lamba ve bilgisayara bağlı kamera bulunmaktadır. 3.2.2.12. Jel Analiz Sistemi Jel görüntüleme sistemindeki kamera ile alınan görüntüler BioDocAnalyze 1.0 BDA U-90 Biometra (Göttingen, Germany) programı ile analiz edilmiştir. Analiz edilen görüntüler bu program altında bilgisayara kayıt edilmiştir. 3.2.2.13. Otomatik Mikropipetler DNA izolasyonu, PCR, PCR-RFLP, ARMS-PCR ve agaroz jel gibi bir çok işlemde ayarlanabilen ve belirli aralıktaki hacimlerde sıvı alma kapasitesi bulunan 68 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM GILSON (72 rue Gambetta, B.P. 45, 95400 Villiers-le-Bel, FRANCE) marka Pipetman P2 model (0.1-2μl arası hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P10 model (0.5-10μl arası hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P20 model (2-20μl arası hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P100 model (20-100μl arası hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P200 model (30-200μl arası hacimlerde sıvı çekebilen) ve Pipetman P1000 model (0.2-1 ml arası hacimlerde sıvı çekebilen) otomatik pipetler kullanılmıştır. 3.3. DNA İzolasyonu 3.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının belirlenmesindeki ilk aşama, periferik kandan cam lifli filtreye nükleik asit bağlama metoduna göre gerçekleştirilen DNA izolasyonudur. Çalışmalar, ticari olarak satılan DNA izolasyonu kitinin (Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti) protokolüne göre gerçekleştirildi. Protokol aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır. 1. EDTA’lı tüplere alınan periferik kandan 200 µl alınıp 2ml kapasiteli eppendorf tüpüne aktarıldıktan sonra bunun üzerine 200 µl bağlanma çözeltisi ve 40 µl Proteinaz K ilave edildi; pipetle resüspanse edilerek homojenizasyon sağlandı. 2. Tüpler, önceden 70 oC’ye ayarlanan kuru ısı bloğunda 10 dakika inkübasyona bırakıldı. 3. İnkübasyon sonunda, karışımın üzerine 100 µl izopropanol eklendi ve pipet ile iyice karıştırıldı. 4. Eppendorf tüpü içinde bulunan örneğin tamamı toplama tüpü içine yerleştirilmiş filtreli tüpün içine pipet ile aktarıldı. 5. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 6. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. 7. Filtreli tüpün üzerine 500 µl inhibitör uzaklaştırıcı çözeltisi eklendi. 8. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj edildi. 69 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 9. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. 10. Filtreli tüpün üzerine 500 µl yıkama çözeltisi eklendi ve 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 11. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. Filtreli tüpün üzerine ikinci kez 500 µl yıkama çözeltisi eklendi. Böylece yıkama işlemi iki defa tekrar edilmiş oldu. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 12. Santrifüj bittikten sonra, toplama tüplerinin alt kısmında biriken sıvı uzaklaştırıldı ve 13000 devir/dakikada 10 saniye santrifüj edildi. 13. Filtreli tüpler, temiz birer eppendorf tüpünün içine yerleştirildi ve 70 oC’ye ayarlanmış kuru ısı bloğunda ısıtılmış olan çözdürme çözeltisinden 200 µl ilave edilerek 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 14. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı. Eppendorf tüpünde geri kalan çözelti pürifiye edilmiş genomik DNA’dır. Bu aşamadan sonra çözünmüş DNA’lar -80 o C’de polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilinceye kadar saklandı. 3.3.2 Parafine Gömülü Kolorektal Kanser Dokusundan DNA İzolasyonu Bu araştırmada, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı arşivlerinden bulunan, kolorektal kanser tanısı konmuş olgulara ait 132 adet parafine gömülü kolorektal kanser doku örneği kullanılmıştır. Çalışmada, parafine gömülü tümör doku örneklerinden, ticari olarak satılan DNA izolasyon kiti (Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti) kullanılarak genomik DNA izole edildi. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalında kolorektal kanser tanısı alan parafine gömülü dokular mikrotom ile 5 μm kalınlığında kesilmiştir. Parafine gömülü doku örneklerinden kesit alabilmek için mikrotomun temiz olmasına dikkat edildi. Kesit alınırken mikrotom bıçağı her kullanımda değiştirilip, alkolle temizlendi. 5 μm kalınlığında alınan 10-15 adet (25-50 mg) kesit steril eppendorf tüplere konuldu. Çalışmalar, ticari olarak satılan DNA izolasyonu kitinin (Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti) protokolüne göre gerçekleştirildi. 70 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Protokol aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır. 1. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl ksilol (parafini çözmek ve uzaklaştırmak için) eklendi. Tüp hafifçe 2-3 dakika alt üst edildi ve 37 oC’de 30 dakika süre ile kuru ısı bloğunda tutularak parafinin çözülmesi sağlandı. 1 dakika 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı. 2. Parafinin tamamen uzaklaştırılması için bu işlem 3 kez tekrarlandı. 3. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl %99’lık etanol (dokulardaki suyu ve ksilolü uzaklaştırmak için) eklendi. 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı. 4. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl %80’lık etanol eklendi. 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı. 5. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl %60’lık etanol eklendi. 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı. 6. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl %40’lık etanol eklendi. 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı. 7. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl steril çift distile su eklendi (etanolu uzaklaştırmak için). 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı. 8. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine dokuların parçalanması için 200 μl doku parçalama çözeltisi ve hücresel proteinlerin uzaklaştırılması amacıyla 40 μl Proteinaz K eklendi. Örnekler kuru ısı bloğunda 37 oC’de bir gece inkübasyona bırakıldı. 9. Bir gece inkübasyonun ardından 2 ml’lik tüplerin içine ilaveten 20 μl Proteinaz K eklenerek kuru ısı bloğunda 55 oC’de 4 saat inkübasyon yapıldı. 10. Örneklerin üzerine 200µl bağlanma çözeltisi ilave edildi ve karışım vorteks ile homojen hale getirildi. Örnekler kuru ısı bloğunda 70 oC’de 10 dakika süreyle inkübe edildi. 71 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 11. 100 µl izopropanol (açığa çıkan DNA’ların toplanması için) ilave edildi ve vorteks ile iyi bir şekilde homojen edildi. Eppendorf tüpü içinde bulunan örneğin tamamı toplama tüpü içine yerleştirilmiş filtreli tüpün içine pipet ile aktarıldı 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 12. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. Filtreli tüpün üzerine 500µl inhibitör uzaklaştırıcı çözeltisi eklendi ve 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı 13. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. Filtreli tüpün üzerine 500 µl yıkama çözeltisi (DNA’nın yıkanarak temizlenmesi için) eklendi ve 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 14. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. Filtreli tüpün üzerine ikinci kez 500 µl yıkama çözeltisi eklendi. Böylece yıkama işlemi iki defa tekrar edilmiş oldu. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı. 15. Santrifüj bittikten sonra, toplama tüplerinin alt kısmında biriken sıvı uzaklaştırıldı ve 13 000 devir/dakikada 10 saniye santrifüj edildi. 16. Filtreli tüpler, temiz birer eppendorf tüpün içine yerleştirildi ve 70 oC’ye ayarlanmış kuru ısı bloğunda ısıtılmış olan çözdürme çözeltisinden 200 µl ilave edilerek 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj yapıldı. 17. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı. Eppendorf tüpünde geri kalan çözelti saflaştırılmış genomik DNA’dır. Bu aşama sonra çözünmüş DNA’lar -80 oC’de polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilinceye kadar saklandı. 3.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’da dizisi bilinen belirli bir bölgenin çoğaltılmasına (amplifikasyon) olanak veren in vitro DNA sentez yöntemidir. PCR, 3 ana basamaktan oluşur. 1. Amplifiye edilecek çift iplikli DNA’nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu (denaturation=denatürasyon). 72 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 2. Primerlerin özgül hibridizasyonuna olanak sağlayacak sıcaklıkta [Tm (erime sıcaklığı) değerinin 3-5 oC altındaki sıcaklık] hedef bölgelere bağlanmaları (annealing=bağlanma). 3. Taq DNA polimeraz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği 72 oC sıcaklıkta, primerlerden itibaren DNA zincirlerinin (ipliklerinin) sentezlenmesi (extension=uzama). PCR reaksiyonunda bu üç aşamanın döngü sayısı, başlangıçta kalıp olarak kullanılan DNA konsantrasyonuna bağlıdır. Tek DNA sarmalı ile başlandığında en fazla 40 döngü, çok sayıda DNA sarmalı ile başlandığında ise ideal döngü sayısı 30 olmalıdır. Çok döngü, hatalara yol açarak spesifik olmayan ürünler oluşturmaktadır. Bunun sebebi; substrat kullanımının azalması, enzimin kararsız hale gelmesi, son ürün inhibisyonu, spesifik olmayan ürün veya primer-dimer yapışması ve ürünün tam olarak denatüre olmamasıdır. PCR reaksiyonunun gerçekleşebilmesi için gerekli temel bileşenler aşağıdaki gibidir. Kalıp DNA: Saflaştırılan DNA, amplifiye edilecek DNA parçalarına kalıp görevi yapar. Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm dalga boyunda maksimum absorbsiyon özelliği gösterir. Bu nedenle 260 nm’de ölçülen absorbsiyon değerleri (A260) oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin μgr düzeyinde miktarlarının belirlenmesinde kullanılır. Bunun yanı sıra proteinlerde 280 nm’de maksimum absorbsiyon özelliği gösterirler, bu nedenle 280 nm’de ölçülen bir değerdeki artış A260/A280 oranında düşmeye neden olur. Saflaştırılmış kalıp DNA için A260/A280 oranı 1.75-1.8’in üzerinde olmalıdır. Primerler (oligonükleotidler): Kullanılacak primerler yalnızca amplifiye edilecek bölgeye özel olmalıdır. Tipik primerler yaklaşık % 50 G+C bazlarına sahip 18-28 nükleotid uzunluğunda, sentetik olarak sentez edilmiş tek zincirli oligonükleotidlerdir. Denatürasyonun ardından primerlerin bağlanma aşamasındaki Tm (erime derecesi) değerinin saptanması, PCR reaksiyonunun gerçekleşmesi açısından büyük öneme sahiptir ve yandaki formül ile kolayca hesaplanır: Tm= 4 oC x (G+C) sayısı + 2 oC x (A+T) sayısı. 73 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM DNA polimeraz: Termostabil karakterde DNA polimerazlardan PCR’de en yaygın kullanılanı Thermus aquaticus’dan elde edilen Taq DNA polimerazdır. Taq DNA polimeraz’ın polimerizasyon oranı (nükleotid/saniye) enzim için en uygun sıcaklık olan 70-80 oC’da 35-100’dür. 50 µl’lik bir reaksiyon hacmi için önerilen miktar 1.25 ünitedir (U). Bununla beraber amplifikasyon bölgesine göre bu miktar değişebilir. Yüksek konsantrasyonlarda enzim kullanımı spesifik olmayan ürünlerin oluşmasına, düşük konsantrasyonda ise yetersiz ürün oluşmasına sebep olabilir. MgCI2: Mg+2 iyonları dNTP'ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar, polimeraz aktivitesini stimüle ederler ve çift iplikli DNA’nın Tm değerini artırırlar, ayrıca primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu nedenle MgCI2’ün PCR’nin özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCI2 konsantrasyonu olarak 1.0-2.5 mM’lık değer Düşük Mg+2 tercih edilir. konsantrasyonu, ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg+2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. PCR tamponu: PCR için uygun tampon 10-50 mM arasında değişen TrisHCI’dir. Tamponun pH'sı ise 8.3-8.8 arasında değişir. Bu tampona son konsantrasyonu 50 mM kadar KCI çözeltisi eklenmesi primerin kalıp DNA’ya yapışmasını kolaylaştırır. Ancak 50 mM’ın üzerindeki KCI ve NaCI çözeltilerinin eklenmesi polimeraz aktivitesini düşürür. % 10 ve daha az derişimdeki dimetilsülfoksit (DMSO) derişimi de yararlıdır. Jelatin, bovin serum albümin (BSA), Tween-20 ve Laureth-12 gibi iyonik olmayan maddelerin enzim kararlılığına etkisi vardır, fakat mutlak zorunlu değildir. PCR tamponları çoğunlukla satın alınan enzimle birlikte 10X konsantrasyonda sağlanmaktadır. Bu tampon 1X konsantrasyonunda kullanılmaktadır. dNTP Karışımı: Taq DNA polimeraz düşük dNTP konsantrasyonlarında kalıba uygun doğru bazları seçmede daha başarılı olmakla birlikte, normal koşullarda PCR 200 µM dNTP konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Optimal dNTP konsantrasyonu; (1) MgCI2 konsantrasyonuna, (2) reaksiyon koşullarına, (3) primer konsantrasyonuna, (4) çoğaltılacak ürünün boyuna, (5) PCR döngü sayısına bağlıdır. 74 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.5. Agaroz Jel Elektroforezi PCR işleminden sonra amplifikasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini, PCRRFLP ve ARMS-PCR sonucunda mutasyon bulunup bulunmadığı agaroz jel elektroforezi ile belirlenmiştir. 3.5.1. % 2.5’lik Agaroz Jelin Hazırlanması 1. % 2.5’lik agaroz jel için 2.5 gram tartılan agaroz 500 ml’lik bir erlene konuldu. Bunun üzerine 100 ml 1X TBE çözeltisi eklendi. 2. Bu karışım manyetik ısıtıcı ve karıştırıcı üzerine konularak eritildi. Karışım tamamen berraklaştıktan sonra çeker ocak altında soğumaya bırakıldı. 3. El yakmayacak kadar soğuyuncaya dek beklendi (50-55 oC). Daha sonra 0.5 μg/ml etidyum bromür olacak şekilde etidyum bromür eklendi. Etidyum bromür’ün homojen bir şekilde dağılması için jel iyi bir şekilde karıştırıldı. 4. Jel hazırlama tepsisinin “stoper” ları takılarak tarak uygun pozisyona yerleştirildi. Bunun üzerine ılımış olan sıvı agaroz yavaşça boşatıldı. Bunu yaparken hava kabarcığı oluşmaması için azami dikkat gösterildi. Yine de oluşan hava kabarcıkları bir pipet ucu yardımıyla tepsinin bir köşesine itildi. 5. Oda sıcaklığında jelin iyice soğuyarak tamamen polimerize olması beklendi. 6. “stoper” lar çıkarıldıktan sonra jel tepsisi elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin üzerine jelin üst yüzeyini aşacak şekilde 1X TBE eriyiği dolduruldu. Ardından taraklar dikkatle ve çok yavaş hareketlerle jelin içinden çıkarıldı.Böylece jelin kuyucukları oluşturuldu. 3.5.2. PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR Örneklerinin Jele Konması ve Elektroforez PCR’da DNA amplifikasyonun başarılı bir şekilde gerçekleşip gerçekleşmediğini, amplifiye edilen ürünlerin restriksiyon endonükleazlar ile kesilip kesilmediğini ve ARMS-PCR sonucunda hangi allelerin çoğalıp çoğalmadığını 75 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM kontrol etmek amacı ile örnekler, işlemlerin bitiminden sonra % 2.5’lik agaroz jellere yüklendi. Agaroz jele örneklerin tatbiki aşağıdaki sıra ile gerçekleştirilmiştir. 1. Jelin birinci kuyucuğuna, oluşan ürünlerin büyüklüğünü ölçebilmek için gerekli olan DNA marker (DNA işaretçisi) (5 µl DNA marker’i ve 1 μl mavi/turuncu 6X yükleme tamponu) kondu. 2. Örnekler jel yükleme tamponu ile karıştırılıp (5 µl PCR ürünü ve 1 µl 6X jel yükleme tamponu) jeldeki kuyulara çok dikkatli bir şekilde konuldu. 3. Elektroforez tankının kapağı kapatıldı, elektrotlar kırmızı ve siyah renkler birbirini tutacak şekilde güç kaynağına bağlandı. 4. Voltaj, 1-5 V/cm (anot ve katot arasındaki mesafe ölçülerek) ilerleme sağlayabilmek için yaklaşık 90-120 Volt olarak ayarlandı. Güç kaynağı çalıştırıldı. 5. Jel Yükleme tamponunun açık mavi fraksiyonu jelin 2/3’üne ulaştığında elektroforez durduruldu. Kapak açılıp jel tepsisi elektroforez tankından çıkarıldı. 6. Yürütme sonrasına jel, BioDoc IITM Biometra jel görüntüleme sistemi ile görüntülendi. Görüntü bilgisayara bağlı kamera yardımıyla bilgisayara kaydedildi. 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi 3.6.1. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması CHEK2 I157T mutasyonu, CHEK2 proteininin Forkhead-ilişkili bölgesi (FHA) (115.-175. aminoasitleri arasındaki bölge) içerisindeki yanlış anlamlı (=missense) bir mutasyondur. Bu mutasyon 470. nükleotid olan Timin’in Sitozin’e (470 T>C) dönüşmesi sonucu meydana gelir. Bu mutasyon [İzolösin (ATT) 157 à Treonin (ACT)] transisyon tipi nokta mutasyonudur. CHEK2 I157T mutasyonunun olup olmadığı Cybulski ve ark. (2004b)’nın kullanmış oldukları PCR-RFLP yöntemi ile belirlenmiştir. İçerisinde CHEK2 I157T mutasyonunun meydana gelebileceği 155 baz çiftlik (bç) genomik insan DNA’sının polimeraz zincir reaksiyonu ile 76 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM amplifikasyonu için CHEK2 I157T İleri: 5’- ACC CAT GTA TCT AGG AGA GCT G -3’ ve CHEK2 I157T Geri: 5’- CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT GCA -3’ primerleri kullanılmıştır. National Center for Biotechnology Information (NCBI) nükleotid veri tabanından alınan AY800241 rapor numaralı insan DNA sırası kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) programından yararlanılmıştır. Çizelge 3.4’te kullanılan primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli nükleotidler) ve I157T mutasyonun bulunduğu bölge (büyük harf ve mavi renkli nükleotid) gösterilmiştir. Çizelge 3.4. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid. 20821 5’ctttcggatt ttcagggtag gtaatgaata cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg 20881 tcattgtttt tagatatttt cccactataa atctctgcta ttcaaagtct gaaacaaaat 20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacaT tgcagacata gaagatcaca 21001 gtggcaatgg aacctttgta aatacagagc ttgtagggaa aggaaaacgc cgtcctttga 3’ DNA izolasyonu ile izole edilen DNA örneklerinden CHEK2 I157T mutasyonunun olup olmadığını belirlemek amacıyla, mutasyonun olabileceği 155 bç.’lik bir gen bölgesi PCR ile çoğaltıldı. Aynı zamanda her çalışma için pozitif kontrol reaksiyonu gerçekleştirildi. Pozitif kontrol reaksiyonunda kullanılan CHEK2 I157T mutasyonunu homozigot ve heterozigot olarak bulunduran DNA örnekleri Dr. Heli Nevanlinna (Department of Obstetrics and Gynecology Helsinki University Central Hospital Biomedicum Helsinki 4th floor P.O. BOX 700 00029 HUS Finland), Dr. Cezary Cybulski (International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland), Dr. Natalia Bogdanova (Hannover Medical School Frauenklinik (OE6411) CarlNeuberg-Str.1 30625 Hannover Germany), Dr. Børge G. Nordestgaard (Department of Clinical Biochemistry, Herlev University Hospital, Herlev Ringvej 75, DK-2730 Herlev, Denmark.) ve Dr. Darina V. Konstantinova (Department of Chemistry and 77 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Biochemistry Medical Faculty Medical University—Sofia 2 Zdrave St. 1431 Sofia Bulgaria)’dan sağlanmıştır. Her bir örnek için, daha önce otoklavda sterilize edilen 0.2 ml’lik PCR tüpünde 25 μl’lik bir PCR reaksiyonu hazırlandı. PCR protokolü aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır. 1. Tüm PCR eriyiklerinin bir araya konulduğu ana karışım 1.5 veya 2 ml’lik steril eppendorf tüpleri içerisinde hazırlandı. Tüplere pipetaj sırasındaki kayıplar göz önünde bulundurularak çoğaltılacak örnek sayısından 3-5 örnek kadar fazla olacak şekilde PCR karışımı hazırlandı. Çizelge 3.5’te ana karışımın hazırlanışı ve PCR eriyiklerinden 25 μl’lik bir PCR reaksiyonu için ne kadar alınması gerektiği ve eriyiklerin reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir. 2. Ana karışım vorteks ile karıştırıldıktan sonra çeperlere yapışan damlacıklardan da yararlanmak için çok kısa bir santrifüj (spin) (8000 devir/dakikada 10 saniye) ile tüm sıvı bir araya toplandı. 3. 0.2 μl’lik steril PCR tüpleri etiketlendikten sonra PCR ana karışımından bunların her birine 17.5 μl konuldu. 4. Her etiketli PCR tüpüne aynı etikete sahip DNA tüplerinden 7.5’er μl DNA eklenerek her tüpün içinde 25 μl’lik PCR karışımı oluşturuldu. Negatif (su) ve pozitif (CHEK2 I157T mutasyonunu homozigot ve heterozigot olarak bulunduran DNA) kontrollerde aynı şekilde etiketlendi. 5. Bütün tüpler GeneAmpR PCR System 9700 (Applied Biosystems) PCR cihazına yerleştirildi. Çizelge 3.6’daki PCR protokolü programlanarak PCR cihazı çalıştırıldı. 6. Ardından PCR cihazından çıkarılan örnekler agaroz jel elektroforez ile analiz edilinceye kadar 4 oC’de saklandı. 78 3. MATERYAL ve METOD Çizelge 3.5. Malzeme Süleyman BAYRAM CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı. Stok Son Konsantrasyon Alınan Miktar Konsantrasyon (25μl’de) (μl) PCR tamponu 10X 1X 2.5 μl MgCI2 25 mM 1,5 mM 1.5 μl dNTP karışımı 10 mM 200 μM 0.5 μl CHEK2 I157T 50 pmol/μl 12.5 pmol/μl 0.25 μl 50 pmol/μl 12.5 pmol/μl 0.25 μl 5 U/μl 3U 0.6 μl DNA 15-30 ng/μl 112.5-225 ng 7.5 μl ddH2O -- -- 11.9 μl İleri Primer CHEK2 I157T Geri Primer Taq DNA polimeraz Çizelge 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları. Reaksiyon Aşaması Sıcaklık Süre Döngü sayısı 1 (ºC) İlk denatürasyon 94 3 dakika Denatürasyon 94 30 saniye Bağlanma (Annealing) 56 40 saniye Uzama (Extension) 72 30 saniye Son Uzama 72 5 dakika 1 Soğutma 4 -- -- 30 3.6.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi Sonucunda Görüntülenmesi CHEK2 I157T mutasyonunun bulunabileceği bölgenin PCR reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda bu bölgenin çoğaltılıp çoğaltılamadığı %2.5’luk agaroz jel 79 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM elektroforez ile kontrol edildi. Birinci kuyucuğa DNA marker diğer kuyulara PCR ürünleri yüklendi. Jel 90 voltta 30 dakika elektroforeze tabi tutuldu. BioDoc IITM Biometra jel görüntüleme sistemi ile DNA bantları incelendi. CHEK2 I157T mutasyonunun olabileceği bölge için 155 bç’lik 1 adet bant gözlenir (Şekil 3.1.). M 1 3 2 250 bç 200 bç 4 5 6 155 bç 150 bç 100 bç 50 bç Şekil 3.1. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-6: CHEK2 I157T mutasyonunun olabileceği 155 bç’lik DNA fragmenti. 3.6.3. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Analizi Restriksiyon endonükleazlar (RE) çift iplikli DNA’yı kesen enzimlerdir. RE DNA diziliminde iki yönlü simetri oluşturan palindromik (her iki yönden de aynı biçimden okunan) bölgelerdeki baz dizilerini tanırlar ve bu dizilerden her iki DNA zincirini keserler. Bu enzimler bakterilerden izole edilir ve bakteriye giren viral DNA’yı parçalayarak bakteriyi virüs enfeksiyonundan korurlar. Restriksiyon enzimlerinin bilimsel adlandırılması izole edildiği bakterinin üç harfli kısaltmasını 80 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM takip eden suş tanımlamasıyla beraber bulundukları sıraya göre romen rakamıyla yapılır. CHEK2 I157T mutasyonunu RFLP yöntemi ile saptayabilmek için PstI restriksiyon enzimi kullanıldı. Bu enzim 5’...CTGCA ↓ G...3’ sırasına sahip 6 nükleotidlik DNA bölgesini tanır ve 3’ tarafındaki GA bazları arasında yapışkan uç oluşturacak şekilde kesim yapar. Çizelge 3.7’de PstI restriksiyon enziminin tanıma bölgesi (altı çizili olan 6 nükleotid) gösterilmiştir. Bu tanıma bölgesi CHEK2 I157T mutasyonun bulunduğu nükleotidi de içine almaktadır [çizelgede büyük harfle ve mavi renk ile gösterilen T nükleotidi (470 T>C)]. 470. nükleotid olan Timin’in (T) Sitozin’e (470 T>C) dönüşmesi sonucu PstI restriksiyon enziminin tanıma ve kesim bölgesi tamamlanmış olur ve bu durumda enzim 155 bç’lik DNA parçasını 136 ve 19 bç’lik iki parçaya böler. Çizelge 3.7. PstI Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve CHEK2 I157T Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid. 20821 5’ a cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg 20881 tcattgtttt tagatatttt cccactataa atctctgcta ttcaaagtct gaaacaaaat 20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacaT tgca↓gacata gaagatcaca 21001 gtgg 3’ RFLP protokolü aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır. 1. RFLP reaksiyonu için gerekli ana karışım, 1.5 veya 2 ml’lik steril eppendorf tüpü içinde hazırlandı. Deney tüplerine ana karışımın pipetle aktarılması sırasındaki kayıplar göz önünde bulundurularak kesim yapılacak örnek sayısından 3-5 örnek kadar fazla olacak şekilde karışım hazırlandı. Çizelge 3.8’de ana karışımın hazırlanışı ve RFLP eriyiklerinden 20 μl’lik bir RFLP reaksiyonu için ne kadar alınması gerektiği ve eriyiklerin reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir. 2. Çizelge 3.8’de verilen kimyasallar belirtilen miktarlarda karıştırıldı. Öncelikle su, tampon ve BSA sonrasında enzim karışıma eklendi. Ardından vorteks ile 81 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM karıştırılıp, kısa bir spin santrifüj (8000 devir/dakikada 10 saniye) ile tüm sıvının tüpün alt kısmında toplanması sağlandı. 3. 0.5 ml’lik steril tüpler PCR ürünleri ile eşleşecek şekilde etiketlenip, içlerine 15 μl RFLP reaksiyon karışımından konuldu. Her çalışma için yapılan pozitif kontrollerde (CHEK2 I157T mutasyonunu homozigot ve heterozigot olarak bulunduran PCR ürünleri) aynı şekilde etiketlendi. 4. Tüplere aynı isimli PCR ürünlerinden 5 μl eklendi. 5. Kısa bir spin santrifüj (8000 devir/dakikada 10 saniye) ile tüm damlacıklar bir araya toplandı ve her tüpün üzerine mineral oil eklendi. Buharlaşmayı önlemek için tüm tüplerin kapak kenarları parafilm ile sıkıca sarıldı. Sonra tüplerin tamamı daha önceden, enzim üreticisinin tavsiyesi doğrultusunda 37 oC’ye ısıtılan kuru ısı bloğuna yerleştirildi. 6. 37 oC’de bir gece inkübasyonun ardından (16 saat), tüpler kuru ısı bloğundan alınarak 4 oC’de soğumaya bırakıldı. Bu arada yukarıda anlatılan yöntemler ile % 2.5’lik agaroz jel hazırlandı. 7. Tüm RFLP ürünleri ve DNA marker’ı, tek tek jel yükleme tamponu ile karıştırılarak jele yüklendi. Yükleme esnasında pipet ile aktarma işlemi çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirildi. Jel 90 voltta elektroforez edildi. 8. 30-45 dakika sonra elektroforez durduruldu. Jel tepsisinden çıkarılan jel, jel görüntüleme sistemi ile incelendi ve bilgisayara bağlı kamera yardımıyla görüntünün fotoğrafı çekildi ve bilgisayara kaydedildi. Çizelge 3.8. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Reaksiyonu Karışımı. Malzeme Stok Son Konsantrasyon Alınan Miktar (20 μl’de) Konsantrasyon (μl) 1X 2 μl Bovin serum albumin 10mg/ml 100μg/ml 0.2 μl PstI 20.000 U/ml 12 U 0.6 μl PCR ürünü -- -- 5 μl ddH2O -- -- 12.2 μl NEBuffer 3 10X 82 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Kesim reaksiyonu sonucu oluşan ürünler % 2.5’lik agaroz jelde yürütülüp görüntülendikten sonra, olguların genotiplemeleri gerçekleştirildi. Kesim sonucunda elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bandlar aşağıda belirtilmiştir. Görüntülü açıklamada Şekil 3.2.’de görülmektedir. a- Mutasyon bulunmayan genotipteki olgularda 155 bç’i büyüklüğündeki tek bir DNA fragmenti (RE tanıma bölgesi bulamadığından PCR ürünü kesilmemiştir) görülmüştür. b- Heterozigot mutant genotiplerde 155, 136 ve 19 bç’i büyüklüğünde üç DNA fragmenti (RE bir mutant allel bulunduğundan dolayı bir tanıma bölgesine sahiptir diğer allelde tanıma bölgesi olmadığından kesilmemiştir) görülmüştür. c- Homozigot mutant genotiplerde 136 ve 19 bç’i büyüklüğünde iki DNA fragmenti (RE iki mutant allel bulunduğundan dolayı tüm PCR ürünleri kesmiştir) görülmüştür. Hem heterozigot mutant genotipte hem de homozigot mutant genotipte 19 bç’lik DNA fragmenti elektroforez işlemi sırasında çok hızlı hareket ettiğinden dolayı agaroz jelden çıktığından jel görüntüsünde bulunmamaktır. 83 3. MATERYAL ve METOD M Süleyman BAYRAM 1 2 3 4 5 6 250 bç 200 bç 155 bç 136 bç 150 bç 100 bç 50 bç Şekil 3.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının % 2.5’luk Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-2: CHEK2 kodon 157 homozigot mutasyon olmayan genotip (155 bç) (İzolösin/İzolösin), 3-4: CHEK2 kodon 157 heterozigot mutant genotip (155 ve 136 bç) (İzolösin/Treonin), 5-6: CHEK2 kodon 157 homozigot mutant (136 bç) (Treonin/Treonin). 3.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi 3.7.1. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması IVS2 + 1G>A mutasyonu CHEK2 geninin 2. intronunun ilk nükleotidinde meydana gelen, Guanin (G) nükleotidinin Adenin (A) nükleotidine dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur. Bu mutasyon CHEK2 mRNA'sında anormal ilmeğe sebep olarak 2. intronun kesip-çıkarma (splicing) işleminin doğru bir şekilde yapılamamasına neden olur. Anormal ilmek ekzon 3 içerisine 4 nükleotidin girişine neden olur böylece bu noktadan sonraki tüm kodonlar değişir ve durdurucu 84 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM kodon oluşur ve yarım CHEK2 proteininin sentezi meydan gelir. Bu durum CHEK2’nin fonksiyonel olmayan proteininin sentezine yol açar. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu Cybulski ve ark. (2004b)’nın kullanmış oldukları PCR-RFLP yöntemi ile belirlenmiştir. İçerisinde IVS2 + 1G>A mutasyonunun bulunduğu 491 bç’lik genomik insan DNA’sının polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifikasyonu için CHEK2 IVS2 + 1G>A İleri: 5’- ATT TAT GAG CAA TTT TTA AAC G-3’ ve CHEK2 IVS2 + 1G>A Geri: 5’- TCC AGT AAC CAT AAG ATA ATA ATA TTA C- 3’ primer çifti kullanılmıştır. National Center for Biotechnology Information (NCBI) nükleotid veri tabanından alınan AY800241 rapor numaralı insan DNA dizisi kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) programından yararlanılmıştır. Çizelge 3.9.’da kullanılan primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli nükleotidler) ve IVS2 + 1G>A mutasyonun bulunduğu bölge (büyük harf ve mavi renkli nükleotid) gösterilmiştir. Çizelge 3.9. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid. 20581 5’ tcttgataag cagattgata attctgattg ccttcttagg ctattttcct acaattagca 20641 tttatgagca atttttaaac gtttgataca tgaaattcaa cagccctctg atgcatgctt 20701 ttatattaca gaatgtgtga atgacaacta ctggtttggg agggacaaaa gctgtgaata 20761 ttgctttgat gaaccactgc tgaaaagaac agataaatac cgaacataca gcaagaaaca 20821 ctttcggatt ttcaggGtag gtaatgaata cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg 20881 tcattgtttt tagatatttt cccactataa atctctgcta ttcaaagtct gaaacaaaat 20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacat tgcatacata gaagatcaca 21001 gtggcaatgg aacctttgta aatacagagc ttgtagggaa aggaaaacgc cgtcctttga 21061 ataacaattc tgaaattgca ctgtcactaa gcagaaataa aggtaatatt attatcttat 21121 ggttactgga attttttttt tccactctct cataggagga aaatttgtcc tgtccttaca 3’ PCR reaktiflerinin hazırlanması ve yapılan işlemler aynen CHEK2 I157T mutasyonu için anlatılan şekliyle yapıldı. Bununla birlikte IVS2 + 1G>A 85 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM mutasyonuna spesifik primerler kullanıldı. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonun optimum amplifikasyonun gerçekleştirildiği PCR reaksiyon karışımı, PCR sıcaklıkları ve döngü sayısı Çizelge 3.10 ve Çizelge 3.11’de verilmiştir. Pozitif kontrol reaksiyonunda kullanılan CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran DNA örnekleri Dr. Heli Nevanlinna (Department of Obstetrics and Gynecology Helsinki University Central Hospital Biomedicum Helsinki 4th floor P.O. BOX 700 00029 HUS Finland), Dr. Cezary Cybulski (International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland), Dr. Natalia Bogdanova (Hannover Medical School Frauenklinik (OE6411) Carl-Neuberg-Str.1 30625 Hannover Germany)’dan temin edilmiştir. Çizelge 3.10. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı. Malzeme Stok Son Konsantrasyon Alınan Miktar Konsantrasyon (μl’de) (μl) PCR tamponu 10X 1X 2.5 μl MgCI2 25 mM 1,5 mM 1.5 μl dNTP karışımı 10 mM 200 μM 0.5 μl CHEK2 IVS2 + 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl 5 U/μl 0.12 U 0.6 μl DNA 15-30 ng/μl 4.5-9 ng 7.5 μl ddH2O -- -- 11.9 μl 1G>A İleri Primer CHEK2 IVS2 + 1G>A Geri Primer Taq DNA polimeraz 86 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Çizelge 3.11. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları. Reaksiyon Aşaması Sıcaklık Süre Döngü sayısı (ºC) İlk denatürasyon 95 5 dakika Denatürasyon 94 1 dakika Bağlanma (Annealing) 53 1 dakika Uzama (Extension) 72 1 dakika Son Uzama 72 7 dakika 1 35 1 3.7.2. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi Sonucunda Görüntülenmesi CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun olabileceği bölgenin PCR reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda bu bölgenin çoğaltılıp çoğaltılamadığı % 2.5’luk agaroz jel elektroforez ile kontrol edildi. Birinci kuyucuğa DNA marker’ı diğer kuyulara PCR ürünleri yüklendi. Jel 90 voltta 30 dakika elektroforeze tabi tutuldu. Jel görüntüleme sistemi ile agaroz jel incelendi. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun olabileceği nükleotidi içine alan 491 bç’lik 1 adet DNA fragmenti gözlendi. (Şekil.3.3) 87 3. MATERYAL ve METOD M 500 450 400 350 300 1 Süleyman BAYRAM 2 3 4 5 6 7 491 bç bç bç bç bç bç 250 bç 200 bç 150 bç 100 bç 50 bç Şekil 3.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-7 CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun olabileceği 491 bç’lik DNA fragmenti. 3.7.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP Analizi CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunu RFLP yöntemi ile saptayabilmek için Hyp188III restriksiyon enzimi kullanıldı. Bu enzim 5’...TC ↓ NNGA...3’ sıralarına sahip 6 baz çiftlik DNA bölgesini tanır ve 5’ tarafından TC nükleotidlerinden sonra kesim yaparak yapışkan uç oluşturur. Çizelge 3.12’deki büyük harfle gösterilen G nükleotidinin A nükleotidine transisyonu sonucu enzimin tanıma bölgesinin oluşumu tamamlanır. Çizelge 3.12.’de Hyp188III restriksiyon enziminin tanıma bölgesi (altı çizili olan kırmızı renkli 6 nükleotid) ve IVS2 + 1G>A mutasyon noktası (büyük harf ve mavi renkli nükleotid) gösterilmiştir. Hyp188III restriksiyon enzimi CHEK2 88 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM IVS2 + 1G>A mutasyonu bulunan, 491 bç’lik PCR ürününü 194 ve 297 bç’lik iki parçaya bölmektedir. Çizelge 3. 12. Hyp188III Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve IVS2 + 1G>A Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid. 20581 5’ a 20641 tttatgagca atttttaaac gtttgataca tgaaattcaa cagccctctg atgcatgctt 20701 ttatattaca gaatgtgtga atgacaacta ctggtttggg agggacaaaa gctgtgaata 20761 ttgctttgat gaaccactgc tgaaaagaac agataaatac cgaacataca gcaagaaaca 20821 ctttcggatt ttc ↓ aggGtag gtaatgaata cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg 20881 tcattgtttt tagatatttt cccactataa atctctgcta ttcaaagtct gaaacaaaat 20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacat tgcatacata gaagatcaca 21001 gtggcaatgg aacctttgta aatacagagc ttgtagggaa aggaaaacgc cgtcctttga 21061 ataacaattc tgaaattgca ctgtcactaa gcagaaataa aggtaatatt attatcttat 21121 ggttactgga 3’ RFLP protokolü CHEK2 I157T mutasyonunun belirlenmesindeki şekliyle uygulandı. Bununla birlikte IVS2 + 1G>A mutasyonunun belirlenmesi için Hyp188III restriksiyon enzimi kullanıldı. Çizelge 3.13’de ana karışımın hazırlanışı ve RFLP eriyiğinden 20 μl’lik bir RFLP reaksiyonu için ne kadar alınması gerektiği ve reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir. Çizelge 3.13. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Belirlenmesi İçin RFLP Reaksiyonu Karışımı. Malzeme Stok İstenen Konsantrasyon Alınan Miktar (20 μl’de) Konsantrasyon (μl) NEBuffer 4 10X 1X 2 μl Bovin serum albumin 10mg/ml 100μg/ml 0.2 μl Hyp188III enzimi 5.000 U/ml 12 U 2.4 μl PCR ürünü -- -- 5 μl ddH2O -- -- 10.4 μl 89 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Kesim reaksiyonu sonucu oluşan ürünler %2.5’lik agaroz jelde yürütülüp görüntülendikten sonra, olguların genotiplemeleri gerçekleştirildi. Kesim sonucunda elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bandlar Şekil 3.4’de görülmektedir. 1. Mutasyon bulunmayan genotipteki olgularda 491 bç’i büyüklüğünde tek DNA fragmenti (RE tanıma bölgesi bulamadığından PCR ürünü kesilmemiştir) görülmüştür (Şekil 3.4.’de 3.-5.). 2. Heterozigot mutant genotiplerde 491, 297 ve 194 bç’i büyüklüğünde üç DNA fragmenti (RE bir mutant allel bulunduğundan dolayı bir tanıma bölgesine sahiptir, diğer allelde tanıma bölgesi olmadığında kesilmemiştir) görülmüştür (Şekil 3.4.’de 1.-2.). 3. Homozigot mutant genotipler olsa idi sadece 297 ve 194 bç’i büyüklüğünde iki DNA fragmenti (RE iki mutant allel bulunduğundan dolayı tüm PCR ürünleri kesmiştir) görülecekti. Ancak bu pozitif kontrol temin edilemediği için kullanılamamıştır. 90 3. MATERYAL ve METOD M Süleyman BAYRAM 1 2 3 4 5 500 bç 491 bç 300 bç 297 bç 200 bç 194 bç 50 bç Şekil 3.4. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-2 nolu bandlar CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunu heterozigot olarak taşıyan örneklerde (491, 297 ve 194 bç), 3-5 nolu bandlar CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu bulunmayan örneklerde görülmektedir (491 bç). 3.8. CHEK2 1100delC Mutasyonun Allele Özgü Mutasyon Belirleme Yöntemi İle Belirlenmesi CHEK2 1100delC mutasyonu CHEK2 geninin 1100. pozisyonda bulunan Sitozin (C) nükleotidinin delesyonudur. Meydana gelen nükleotid delesyonu çerçeve kayması (frameshift) mutasyonuna neden olur. 1100. pozisyondaki sitozin delesyonu 380. kodonda durdurucu kodon oluşumu ile sonuçlanır. Bu mutasyon sonucunda yarım (truncated, =kesik) protein oluşmakta ve bu protein, kinaz fonksiyonuna sahip değildir. CHEK2 1100delC mutasyonu Margolin ve ark. (2007), kullanmış oldukları yöntem ile belirlenmiştir. Bu yöntem allele özgü nükleotidlerle mutasyon belirleme 91 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM tekniğidir (Allele Refractory Mutation Detection System, ARMS). İki farklı allel için aynı koşullarda iki farklı tüpte iki ayrı PCR reaksiyonu gerçekleştirildi. Böylece aynı kişiye ait DNA örneğinden iki farklı PCR reaksiyonu yapıldı. İki farklı PCR reaksiyonu arasındaki tek farklılık CHEK2 1100delC mutasyonunu belirlemek amacıyla kullanılan primer çiftlerinin farklılığıdır. Bu farklı PCR reaksiyonlarından birine CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primer çifti eklendi. Eğer DNA örneğinde CHEK2 1100delC mutasyonu bulunuyor ise 183 bç’lik DNA parçasının amplifikasyon bandı görülür. Eğer bu DNA örneğinde 1100delC mutasyonu yok ise herhangi bir amplifikasyon bandı görülmez. Aynı bireye ait DNA örneğinden yapılan diğer PCR reaksiyonunda ise CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primer çifti eklendi. Eğer DNA örneğinde CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmuyor ise bu 184 bç’lik DNA parçasının amplifikasyon bandı görülür. Eğer bu DNA örneğinde 1100delC mutasyonu var ise bu durumda herhangi bir amplifikasyon bandı görülmez. Aynı bireyin DNA örneğine ait iki farklı tüpteki PCR reaksiyonu sonucunda amplifikasyon bandı oluşup oluşmamasına göre de bireyin CHEK2 1100delC mutasyonuna sahip olup olmadığına varsa mutasyonlu gen için ferdin heterozigot ya da homozigot olup olmadığına karar verilir. Ayrıca aynı bireyin DNA örneğine ait iki farklı tüpteki PCR reaksiyonuna bir de kontrol primer eklendi. Bu kontrol primer çifti PCR reaksiyonunun çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amacıyla kullanıldı. Bu primer çifti tamamen farklı bir genin dizisini çoğaltacak olan bir çift primerdir. CHEK2 1100delC mutasyonun belirlenmesinde 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek M-CHEK2del1100C İleri: 5’- GCA AAG ACA TGA ATC TGT AAA GTC -3’ ve M-CHEK2del1100C Geri: 5’- AAA TCT TGG AGT GCC CAA AAT AAT -3’ primer çifti kullanılmıştır. Bununla birlikte 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek W-CHEK21100delC İleri: 5’- GCA AAG ACA TGA ATC TGT AAA GTC -3’ ve W-CHEK21100delC Geri: 5’- AAA TCT TGG AGT GCC CAA AAT CAG- 3’ primer çifti ile 1100delC mutasyonunun bulunmadığı allel (yabani tip allel) belirlenmiştir. National Center for Biotechnology Information (NCBI) nükleotid veri tabanından alınan rapor numarası 92 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM olan AY800241 insan genomik sırası kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) programından yararlanılmıştır. Hem 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda, hem de 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amaçlı SLC30A9 geninde 309 bç’lik DNA parçasının amplifikasyon bandını görmek için Kontrol-İleri: 5’-GTC AAA GCC ACC AGT TAC AGT -3’ ve Kontrol-Geri: 5’-TTC CCC ACC ACT TTA CTG AC-3’ primer çiftleri kullanılmıştır. Çizelge 3.14.’te 1100delC mutasyonu olmayan CHEK2 gen dizisi, 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli ile nükleotidler) ve 1100delC mutasyonunun oluşmasına neden olan Sitozin (büyük harfle ve kırmızı renkli) nükleotidi gösterilmiştir. Çizelge 3.14. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve 1100delC Mutasyonunun Oluşmasına Neden Olan Nükleotid. 50041 5’ aattttaatt taagcaaaat taaatgtcct aacttgcaaa gacatgaatc tgtaaagtcc 50101 agattaatgg caggtgtgaa ttgtacaata gaaactgatc tagcctacgt gtcttcttgg 50161 actggcagac tatgttaatc tttttatttt atggcaagtt caacattatt cccttttgta 50221 ctgaatttta gattaCtgat tttgggcact ccaagatttt gggagagacc tctctcatga 3’ Çizelge 3. 15’te CHEK2 1100delC mutasyonu bulunan CHEK2 gen dizisi, CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli nükleotidler) gösterilmiştir. 93 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Çizelge 3.15. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları. 50041 5’ aattttaatt taagcaaaat taaatgtcct aacttgcaaa gacatgaatc tgtaaagtcc 50101 agattaatgg caggtgtgaa ttgtacaata gaaactgatc tagcctacgt gtcttcttgg 50161 actggcagac tatgttaatc tttttatttt atggcaagtt caacattatt cccttttgta 50221 ctgaatttta gattattat tttgggcact ccaagatttt gggagagacc tctctcatga 3’ Çizelge 3.16’da hem 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonlarında hem de 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonlarında PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amaçlı kullanılan SLC30A9 geninde 309 bç’lik band amplifikasyonu meydan getiren primerlerin SLC30A9 geni üzerindeki konumu gösterilmiştir. Çizelge 3.16. SLC30A9 Genine Özgü Primerlerin SLC30A9 Geni Üzerindeki Konumları. 361 5’ aagtaaatct aattcagaag ttttgataga ggaaaatgtt ctggtctgtc aaagccacca 421 gttacagtgc ttctctgcaa aattttggag gtattaaaaa aagtttttgt ttttttacag 481 ccacgctcca gaacagcatc agtgtttttt aagggaccag gaaaagtggt gatggttgca 541 atttgcatgt aagtactgaa aaataagctt tgtgaaatag aatatattct tttaaatatg 601 tatatcctta aatatgtaaa tttattacat ggtagctagc tatagagttt gaggtttatt 661 ttgttttagg aggaaattga ataagtcttt attattgtca gtaaagtggt ggggaaagag 3’ 3.8.1. CHEK2 1100delC Mutasyonu İçin PCR İşlemi CHEK2 1100delC mutasyonunun belirlenmesi için yapılan PCR reaksiyonlarında 1100delC mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran bireylerin kan örnekleri ile DNA örnekleri Dr. Heli Nevanlinna (Department of Obstetrics and Gynecology Helsinki University Central Hospital Biomedicum Helsinki 4th floor P.O. BOX 700 00029 HUS Finland), Dr. Cezary Cybulski (1International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical 94 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM University, Szczecin, Poland), Dr. Natalia Bogdanova (Hannover Medical School Frauenklinik (OE6411) Carl-Neuberg-Str.1 30625 Hannover Germany), ve Dr. Børge G. Nordestgaard (Department of Clinical Biochemistry, Herlev University Hospital, Herlev Ringvej 75, DK-2730 Herlev, Denmark) tarafından gönderilmiştir. Bu bireylerin DNA örnekleri pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. PCR işlemi için gerekli hazırlıklar şu şekilde yapılmıştır: 1. Tüm PCR eriyiklerinin bir araya konulduğu ana karışım 1.5 veya 2 ml’lik steril eppendorf tüpleri içerisinde hazırlandı. Her örnek için iki farklı ana karışım oluşturuldu. Bu karışımların birbirlerinden farkı kullanılan primerlerden kaynaklanmaktadır. Birinci karışımda CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primer çifti bulunmaktadır (Çizelge 3.17). İkinci karışımda ise CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primer çifti kullanılmıştır (Çizelge 3.18). PCR tüplerine ana karışımın pipet ile aktarılması sırasındaki kayıplar göz önünde bulundurularak çoğaltılacak örnek sayısından 3-5 örnek kadar daha fazlası olacak şekilde PCR ana karışımı hazırlandı. Çizelge 3.17 ve Çizelge 3.18’de ana karışımların hazırlanışı ve PCR eriyiklerinden 25 μl’lik bir PCR reaksiyonu için ne kadar alınması gerektiği ve reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir. 2. Ana karışımlar vorteksle karıştırıldıktan sonra çeperlere yapışan damlacıklardan da yararlanmak için çok kısa bir santrifüj (spin) (8000 devir/dakika 10 saniye) ile tüm sıvı bir araya toplandı. 3. 0.2 μl’lik steril PCR tüpleri etiketlendikten sonra PCR ana karışımlardan bunların her birine 17.5 μl konuldu. PCR tüpleri etiketlenirken aynı bireyin DNA örneği için CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına ve bulunmamasına özgün yapılacak iki farklı reaksiyon içim iki farklı PCR tüpü etiketlendi. 4. Her bir etiketli PCR tüpüne aynı etikete sahip DNA tüplerinden 7.5’er μl DNA eklenerek her tüpün içinde 25 μl’lik PCR karışımı oluşturuldu. Böylece aynı bireyin DNA örneğinden CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına ve bulunmamasına özgün yapılacak iki farklı reaksiyon için iki farklı tüpün her birine 7.5 μl DNA eklendi. Negatif (su) ve pozitif (CHEK2 1100delC 95 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran DNA) kontrollerde aynı şekilde etiketlenip PCR tüplerine eklendi. 5. Bütün tüpler GeneAmpR PCR System 9700 (Applied Biosystems) PCR cihazına yerleştirildi. Çizelge 3.19’ deki PCR protokolü programlanarak PCR cihazı çalıştırıldı. 6. Ardından PCR cihazından çıkarılan örnekler agaroz jel elektroforez ile analiz edilinceye kadar 4 oC’ye kaldırıldı. Çizelge 3.17. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı. Malzeme Stok İstenen Alınan Konsantrasyon Konsantrasyon Miktar (μl’de) (μl) PCR tamponu 10X 1X 2.5 μl MgCI2 25 mM 2 mM 2 μl dNTP karışımı 10 mM 200 μM 0.5 μl M-CHEK2del1100C İleri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl M-CHEK2del1100C Geri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl Kontrol-İleri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl Kontrol-Geri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl Taq DNA polimeraz 5 U/μl 0.12 U 0.6 μl DNA 15-30 ng/μl 4.5-9 ng 7.5 μl ddH2O -- -- 10.9 μl 96 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM Çizelge 3.18. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı. Malzeme Stok İstenen Alınan Konsantrasyon Konsantrasyon Miktar (μl) (25μl’de) PCR tamponu 10X 1X 2.5 μl MgCI2 25 mM 2 mM 2 μl dNTP karışımı 10 mM 200 μM 0.5 μl W-CHEK21100delC İleri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl W-CHEK21100delC Geri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl Kontrol-İleri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl Kontrol-Geri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl Taq DNA polimeraz 5 U/μl 0.12 U 0.6 μl DNA 15-30 ng/μl 4.5-9 ng 7.5 μl ddH2O -- -- 10.9 μl Çizelge 3. 19. CHEK21100delC Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları. Reaksiyon Aşaması Sıcaklık Süre Döngü sayısı 1 (ºC) İlk denatürasyon 95 5 dakika Denatürasyon 95 20 saniye Bağlanma (Annealing) 59 20 saniye Uzama (Extension) 72 20 saniye Son Uzaman 72 5 dakika 40 1 3.8.2. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Agaroz Jel Elektrofez ile Analizi Bireylerin CHEK2 1100delC mutasyonunu bulundurup bulundurmadığı ARMS-PCR reaksiyonundan sonra %2.5’luk agaroz jel elektroforez ile belirlendi. Agaroz jelin birinci kuyusuna DNA markeri, daha sonraki kuyulara aynı örnek için 97 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM yapılmış iki farklı reaksiyon ürünü de yüklendi. Tüm deneylerde ilk önce CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunun ürünü hemen bunun yanına yine aynı bireye ait DNA örneği ile yapılmış ve CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunun ürünü yüklendi. Jel 90 voltta 30 dakika elektroforeze tabi tutuldu. Jel görüntüleme sistemi ile agaroz jel incelendi. ARMS-PCR reaksiyonu sonucu oluşan ürünler % 2.5’lik agaroz jelde yürütülüp görüntülendikten sonra, olguların genotiplemeleri gerçekleştirildi. ARMSPCR sonucunda elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bandların anlamı aşağıda belirtilmiştir. 1. a: CHEK2 1100delC mutasyonunu heterozigot olarak taşıyan genotipteki (CHEK2 geninin bir allelinin 1100. pozisyonundaki nükleotidi delesyon ile kaybolmuş, fakat diğer allelin 1100. pozisyonunda herhangi bir delesyon söz konusu değil) bireylerde allelin birinde 1100delC mutasyonunun bulunmasından dolayı 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda 183 bç’i büyüklüğünde PCR ürünü ve PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amacıyla eklenen primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır. Bu reaksiyonun ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusundaki DNA’nın elektroforezi sonucunda 2 adet DNA amplifikasyon bandı görülmektedir (Şekil 3.5. 2. kuyu). b: CHEK2 1100delC mutasyonunu heterozigot olarak taşıyan bireyin DNA örneği ile yapılmış olan ve 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda da allelerden birinin mutasyona uğramamış olması sebebiyle PCR reaksiyonunda 184 bç’i büyüklüğünde PCR ürünü ve PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amacıyla eklenen primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır bu reaksiyonun ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusundaki DNA’nın elektroforezi sonucunda görülmektedir (Şekil 3.5. 3. kuyu) 98 2 adet DNA amplifikasyon bandı 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 2. a: CHEK2 1100delC mutasyonu olmayan genotipteki bireylerde 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda CHEK2 1100delC mutasyonu olmadığından dolayı herhangi bir DNA amplifikasyon bandı görülmemiştir. Fakat bu reaksiyonda PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amacıyla eklenen primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır bu reaksiyonun ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusundaki DNA’nın elektroforezi sonunda 1 adet DNA amplifikasyon bandı görülmektedir (Şekil 3.5. 4. kuyu) b: CHEK2 1100delC mutasyonu olmayan bireyin DNA örneği ile yapılmış olan ve 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda ise allelerin her ikisinde de 1100delC mutasyonunun olmaması nedeniyle 184 bç’i büyüklüğünde PCR ürünü ve PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amacıyla eklenen primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır. Bu reaksiyonun ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusunda 2 adet DNA amplifikasyon bandı görülmektedir (Şekil 3.5. 5. kuyu). 99 3. MATERYAL ve METOD M Süleyman BAYRAM 2. kuyu 3. kuyu 350 bç 300 bç 250 bç 200 bç 4. kuyu 5. kuyu 309 bç 184 bç 150 bç 100 bç 50 bç Şekil 3.5. CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçacıklarının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 2. kuyu: 1100delC mutasyonunu heterozigot taşıyan pozitif kontrolün CHEK2 1100delC mutasyonuna spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç’lik (kontrol amplifikasyonu) ve 183 bç.’lik (mutant allelin amplifikasyonu) bandları, 3. kuyu: 1100delC mutasyonu heterozigot taşıyan pozitif kontrolün CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmamasına spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç.’lik (kontrol amplifikasyonu) ve 184 bç.’lik (mutasyona uğramamış allelin amplifikasyonu) bandları, 4. kuyu: 1100delC mutasyonu taşımayan bireyin CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç.’lik sadece kontrol amplifikasyonu bandı var, 1100delC mutasyonu bulunmadığı için 183 bç’lik amplifikasyon bandı yoktur. 5. kuyu: 1100delC mutasyonu taşımayan bireyin (homozigot yabani tip) CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmamasına spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç.’lik kontrol amplifikasyon ve 184 bç.’lik (mutasyona uğramamış allellerin amplifikasyonu) bandları. 100 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 3.9. İstatistiksel Analizler Kolorektal kanser ile kontrol grubu ve hepatoselüler kanser ile kontrol grubu arasında sayısal değişkenlerin (yaş) ortalamalarının karşılaştırılmasında Student’s ttesti, kategorik değişkenlerin (cinsiyet, alkol ve sigara kullanımı gibi) frekansları yönünden farklılıkların karşılaştırılmasında Ki-Kare (χ2) testi kullanıldı. Kolorektal kanser ile kontrol grubu ve hepatoselüler kanser ile kontrol grubu arasında CHEK2 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekansları yönünden farklılıklar χ2 testi ile kontrol edilir. p değerinin 0.05 küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir. Bütün istatistiksel yöntemler, “SPSS (Statistical Packages of Social Sciences, SPSS for Windows, Version 15,0 Chicago, IC, USA)” istatistiksel paket programı kullanılarak yapıldı. 101 3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM 102 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM 4. BULGULAR 4.1. Çalışma Gruplarını Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri 4.1.1. Kontrol Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri Kontrol çalışma grubu, herhangi bir kanser tanısı almamış sağlıklı 446 bireylerden oluşmuştur. Bu gruptaki bireylerin genel özellikleri Çizelge 4.1 ve 4.2’de gösterilmiştir. Kontrol çalışma grubundaki bireylerin %52’si (231/446) erkeklerden %48’i (214/446) kadınlardan oluşmaktadır. Bu grubun bireylerinin yaş ortalaması 50.14±12.88 olarak bulunmuştur. Kontrol grubunun %55.2’si (246/446) 50 yaş ve üzerinde iken %44.8’i (200/446) ise 50 yaş altında idi. Kontrol grubundaki bireylerin 162 tanesi (%36.3) sigara içerken, 284 tanesi (%63.7) sigara içmemektedir. Bununla birlikte bu grubu oluşturan 446 bireyin 135 tanesinin (%30.3) alkol kullanım öyküsü mevcut iken 311 tanesinin (%69.7) alkol kullanım öyküsü bulunmamaktadır. 4.1.2. Kolorektal Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri Kolorektal çalışma grubu, raporları ve dosyaları taranan patolojik olarak kolorektal kanser tanısı almış 210 bireyden oluşmuştur. Kolorektal kanser çalışma grubundaki bireylerin genel, klinik ve patolojik bilgileri Çizelge 4.1’de gösterilmiştir. Kolorektal kanser çalışma grubundaki bireylerin %54.8’i (115/210) erkeklerden %45.2’si (95/210) kadınlardan oluşmaktadır. Cinsiyet durumu yönünden kontrol çalışma grubu ile kolorektal kanser çalışma grubu arasında yapılan karşılaştırma sonucunda önemli bir fark görülmedi (Çizelge 4.1). Kolorektal çalışma grubunu oluşturan bireylerin yaş ortalaması 53.75±14.62 olarak bulundu. Kolorektal kanser grubunu oluşturan bireylerin %66.7’si (140/210) 50 yaş ve üzerinde, %33.3’ü (20/210) ise 50 yaş altında idi. 103 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM Çizelge 4.1. Kolorektal Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgiler. Kolorektal Kanser Çalışma Grubu (%) Cinsiyet Erkek 115 (% 54.8) Kadın 95 (% 45.2) Yaş (yıl) Yaş Aralığı 11-86 Ortalama yaş 53.75 ± 14.62 ≥50 140 (% 66.7) <50 70 (% 33.3) Sigara İçen 86 (% 41.0) İçmeyen 124 (% 59.0) Alkol Kullanan 73 (% 34.8) Kullanmayan 137 (% 65.2) Tümörün Lokalizasyonu Proksimal 80 (% 38.1) Distal 100 (% 47.6) Rektum 30 (% 14.3) Tümörün Farklılaşma Derecesi İyi Derecede 25 (% 11.9) Farklılaşma Orta Derecede 139 (% 66.2) Farklılaşma Kötü Derecede 46 (% 21.9) Farklılaşma Tümörün Histolojik Tipi Adenokanser 183 (%87.1) Müsinöz kanser 27 (% 12.9) a : Pearson ki-kare (χ2) testi ile belirlenmiştir. b : Student’s t-testi ile belirlenmiştir. Kontrol Çalışma Grubu (%) p 0.495a 231 (% 52.0) 214 (% 48.0) 0.001a,b 10-84 50.14 ± 12.88 246 (% 55.2) 200 (% 44.8) 0.254a 162 (% 36.3) 284 (% 63.7) 0.249a 135 (% 30.3) 311 (% 69.7) ---- ---- --- Yapılan istatistiksel analizler sonucunda kolorektal çalışma grubu ile kontrol çalışma grubu arasında yaş yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.1). Kolorektal çalışma grubunu oluşturan bireylerin 86 tanesinin (%41.0) sigara kullanım öyküsü bulunurken, 124 tanesinin (%59.0) sigara 104 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM kullanım öyküsünün bulunmadığı belirlenmiştir. Kontrol çalışma grubu ile kolorektal çalışma grubu arasında sigara kullanımı yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı yapılan istatistiksel analizler sonucunda saptanmıştır (Çizelge 4.1). 210 kolorektal kanserli hastanın %34.8’inin (73/210) alkol tüketimi mevcut iken, %65.2’sinin (137/210) alkol kullanım hikayesinin bulunmadığı belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel analiz kontrol çalışma grubu ile kolorektal kanser çalışma grubu arasında alkol tüketimi yönünden önemli bir farklılığın olmadığını göstermiştir (Çizelge 4.1). İleum, ince bağırsağın son kısmıdır ve insanlarda yaklaşık 4 metre uzunluğundadır. İleum, ileoçekal valf (=kapakçık: organlar içindeki sıvının geri kaçışını önleyen viseral kıvrım) ile çekumdan ayrılır. Kolon, ileoçekal valfden anüse kadar uzanır ve yaklaşık 1.5 metre uzunluğundadır. Gastrointestinal sistemin yaklaşık 1/5’ini oluşturur. Anatomik olarak çekum, çıkan kolon, transvers kolon, inen kolon, sigmoid kolon ve rektum’dan oluşur (Şekil 4.1.). Transvers Kolon 50 cm İnen Kolon 10 cm Çıkan Kolon 10 cm İleum Rektum 15 cm Çekum 10 cm Sigmoid Kolon 50 cm Anal Kanal 5 cm Şekil 4.1. Kalın Bağırsağın Bölümleri. Çıkan kolon, ascending kolon olarak da adlandırılmaktadır. Çıkan kolon, kolona ince bağırsağın eklendiği yerden başlar ve kişinin üst sağ karın bölgesine 105 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM kadar uzanır. Transvers kolon, yatay kolon olarak da adlandırılmaktadır. Transvers kolon, vücudu sağdan sola doğru geçen bölümdür. İnen (descending) kolon sol tarafın altına kadar uzanır. Sigmoid kolon S biçiminden dolayı kıvrımlı kolon olarak da adlandırılmaktadır. Tümörün lokalizasyon yeri, patologlar tarafından proksimal (çekum, çıkan kolon ve transvers kolon), distal (inen kolon ve sigmoid kolon) ve rektum olarak 3 farklı alt gruba ayrılmıştır. Kolorektal kanserli hastaların %38.1’inde (80/210) tümörün proksimal bölgede olduğu belirlenmiştir. 210 kolorektal kanserli hastanın 100 (%47.6) tanesinde kanser distal bölge içerisinde gelişmiştir. Bununla birlikte %14.3 (30/210) oranında rektum bölgesinde kanser gözlenmiştir (Çizelge 4.1). Tümörün farklılaşması, tümör hücresinin kökenini aldığı normal hücrelerden yapısal ve fonksiyonel olarak ne kadar farklılaştığını belirtmektedir. Kolorektal kanserler iyi farklılaşmış formdan kötü farklılaşmış forma kadar değişen geniş spektrum içerisinde bulunurlar. Histolojik derecelendirme henüz dünya çapında kabul edilmiş kriterlere sahip olmasa da genellikle 3 evreye ayrılır. Birinci derecedeki tümör hücreleri iyi farklılaşmış, ikinci derecedekiler orta derecede farklılaşmış, üçüncü derecedekiler kötü faklılaşmış özellikteki hücrelerden ibarettir. Kötü farklılaşmış grupta, tümör hücrelerinde belirgin morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler vardır. Hücreler ve çekirdekleri şekil, hacim ve boyanma özellikleri bakımından birbirlerinden ve köken aldığı hücrelerden önemli ayrıcalıklar gösterir. Çekirdekleri büyüktür, koyu renk boyanır ve genellikle büyük nukleoluslar içerir. Tümörlerde farklılaşma kötüleştikçe genel olarak mitoz sayısı artar ve normalden farklı mitoz şekilleri ortaya çıkar. Tümörler farklılaşma özelliklerine göre patologlar tarafından analiz edildiğinde, çalışmaya dahil edilen hastalarda gelişen tümörlerin %11.9 (25/210) iyi derecede farklılaşmış tümör özelliğinde iken, %66.2’si (139/219) orta derecede farklılaşmış ve %21.9’u (46/210) kötü derecede farklılaşmış tümör karakterinde olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.1.). Kolorektal kanserlerin %95’ini adenokarsinomalar oluşturur. Diğer alt tipler daha az sıklıkta görülür. Adenokarsinomada tümör hücreleri, silindirik ve goblet hücre (salgı oluşturup kayganlık sağlayan hücreler) kombinasyonu ile nadir endokrin 106 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM hücreler (bağırsağın, salgı oluşturması ve hareketinin düzenlenmesinde görevli hormonlar üreten hücreler) ve paneth hücrelerinden (sindirim enzimleri salgılayan hücreler) oluşur. Kolorektal karsinomaların diğer bir histolojik varyantı müsinöz karsinomadır. Müsinöz karsinoma, tümör hücre topluluklarıyla karışık geniş ekstrasellüler müsin gölcüklerinin olduğu özel bir kolorektal karsinoma tipidir. Müsin tümör kitlesinin en azından yarısını meydana getirir Çalışmamızdaki hastaların tümör dokuları histolojilerine göre ayrıldığında %87.1’i (183/210) adenokarsinoma grubunda iken %12.9’unun (27/210) müsinöz kanser histolojik alt tipinde olduğu patologlar tarafından rapor edilmiştir (Çizelge 4.1.). 4.1.3. Hepatoselüler Kanser Hasta Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel ve Klinik Bilgileri Hepatoselüler kanser çalışma grubu, raporları ve dosyaları taranan klinik, laboratuvar, radyolojik ve patolojik bulguları ile hepatoselüler kanser tanısı konmuş 165 bireyden oluşmuştur. Hastalara, Barselona Kriterleri’ne göre karaciğer sirozu olan vakalarda iki radyolojik veya bir radyolojik birde biyokimyasal parametre (alfafetoprotein düzeyi) baz alınarak veya karaciğer sirozu olmayan vakalarda patoloji sonucuna göre hepatoselüler kanser tanısı konulmuştur. Hepatoselüler kanser çalışma grubundaki bireylerin genel ve klinik bilgileri Çizelge 4.2.’de gösterilmiştir. Hepatoselüler kanser çalışma grubundaki bireylerin %79.4’ü (131/165) erkeklerden %20.6’sı (34/165) kadınlardan oluşmaktadır. Cinsiyet durumu yönünden kontrol çalışma grubu ile hepatoselüler kanser çalışma grubu arasında istatistiksel olarak önemli bir fark görülmüştür (Çizelge 4.2). Hepatoselüler kanser çalışma grubunu oluşturan bireylerin yaş ortalaması 59.34±11.08 olarak bulundu. Hepatoselüler kanser grubunu oluşturan bireylerin %86.7’si (143/165) 50 yaş ve üzerinde, %13.3’ü (22/165) ise 50 yaş altında idi. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda hepatoselüler kanser çalışma grubu ile kontrol çalışma grubu arasında yaş yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.2). 107 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM Çizelge 4.2. Hepatoselüler Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel Klinik ve Patolojik Bilgileri Hepatoselüler Kontrol p Kanser Çalışma Çalışma Grubu Grubu (%) (%) Cinsiyet <0.001a Erkek 131 (% 79.4) 232 (% 52.0) Kadın 34 (% 20.6) 214 (% 48.0) Yaş (yıl) <0.001a,b Yaş Aralığı 20-81 10-84 Ortalama yaş 59.34 ± 11.08 50.14 ± 12.88 <50 22 (% 13.3) 246 (% 55.2) ≥50 143 (% 86.7) 200 (% 44.8) Sigara 0.074a İçen 73 (% 44.2) 162 (% 36.3) İçmeyen 92 (% 55.8) 284 (% 63.7) Alkol 0.566a Kullanan 46 (% 27.9) 135 (% 30.3) Kullanmayan 119 (% 72.1) 311 (% 69.7) Viral Enfeksiyon Olma ve Olmama Durumu Hepatit B (+) 95 (% 58.8) -Hepatit C (+) 39 (% 23.6) -Hepatit B ve C (+) 2 (% 1.2) -Viral Enfeksiyon Yok 27 (% 16.4) -(Viral Marker’ları “-”) Karaciğer Sirozu Olan 133 (% 80.6) -Olmayan 23 (% 19.4) -Tümörün Evresi (BCLC) Erken 36 (% 21.8) -Orta 30 (% 18.2) -İleri 29 (% 17.6) -Son 70 (% 42.4) -a : Pearson ki-kare (χ2) testi ile belirlenmiştir. b : Student’s t-testi ile belirlenmiştir Hepatoselüler kanser çalışma grubunu oluşturan bireylerin 73 tanesinin (%44.2) sigara kullanım öyküsü bulunurken, 92 tanesinin (%55.8) sigara kullanım öyküsünün bulunmadığı belirlenmiştir. Kontrol çalışma grubu ile hepatoselüler kanser çalışma grubu arasında sigara kullanımı yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı yapılan istatistiksel analizler sonucunda saptanmıştır (Çizelge 108 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM 4.2). 165 hepatoselüler kanserli hastanın %27.9’unun (46/165) alkol tüketimi mevcut iken, %72.1’inin hiç alkol kullanmadığı belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel analiz sonucunda kontrol çalışma grubu ile hepatoselüler kanser çalışma grubu arasında alkol tüketimi yönünden önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır (Çizelge 4.2). Hepatoselüler kanser tanısı konmuş 165 hastanın 95 tanesinde (%58.8) kronik hepatit B enfeksiyonu, 39 tanesinde (%23.6) kronik hepatit C enfeksiyonu ve 2 tanesinde kronik hepatit B ve C koenfeksiyonu saptanmıştır. Bunun yanında hepatoselüler kanser gelişen hastaların %16.4’ünde (27/165) herhangi bir viral enfeksiyonun olmadığı belirlenmiştir (Çizelge 4.2). Hepatoselüler kanser tanısı konmuş 165 hastanın %80.6’sında (133/165) karaciğer sirozu gelişmiş iken %19.4’ünde (32/165) karaciğer sirozunun gelişmediği saptanmıştır. Hepatoselüler kanser’in altta yatan nedene, epidemiolojik (populasyonda hastalığı etkileyen faktörler) zemine ve karaciğer fonksiyon bozukluğunun şiddetine bağlı olan heterojen doğası, dünya genelinde kullanılan belirli bir evreleme (stage) sisteminin ortaya konulmasına engel olmaktadır. Solid (sıvı özelliği olmayan; katı doku özelliğinde) tümörler için yaygın olarak kullanılan sınıflandırma (klasifikasyon) sistemi, altta yatan sirozun derecesini içermediği için ciddi kısıtlamalar içermektedir. Bu nedenden dolayı diğer evreleme sistemleri olan Barselona Kliniği Karaciğer Kanseri Klasifikasyonu (BCLC) ve Karaciğer Kanseri İtalya Skorlaması geliştirilmiştir. Bu araştırmada hepatoselüler kanser Barselona Kliniği Karaciğer Kanseri Klasifikasyonu (BCLC) ile evrelendirilmiştir. Bu evrelendirme sisteminde hepatoselüler kanser erken, orta, ileri ve son dönem olmak üzere 4 farklı alt gruba ayrılmıştır. Çalışma grubu hastalarının tümör evreleri Çizelge 4.2.’de görülmektedir. 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları 109 4. BULGULAR 4.2.1. Süleyman BAYRAM Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı CHEK2 genine özgü primerler ile belirtilen koşullarda söz konusu mutasyonu belirlemek amacıyla 155 bç’lik DNA bölgesi PCR işlemiyle çoğaltıldı. Bu çoğaltılmış DNA fragmentleri CHEK2 I157T mutasyonunu saptamak amacıyla PstI (5’ C TGCA ↓ G 3’) restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilmesini takiben RFLP’yi belirlemek amacıyla agaroz jelde elektroforeze tabi tutuldu. Elektroforez sonrası çekilen jel fotoğrafının incelenmesi sonucunda CHEK2 I157T mutasyonunun araştırıldığı DNA bölgesinin PCR ürününün RE ile muamele edilmeden önce 155 bç. uzunluğunda olduğu saptandı. RE ile muameleyi takiben mutasyonu heterozigot (birinci pozitif kontrol) ve homozigot olarak taşıyan (ikinci pozitif kontrol) ayrıca mutasyonu taşımayan fertlerin DNA’larının elektroforezi sonucunda şu durum saptandı (Şekil 4.2.): 1. Mutasyonu heterozigot olarak taşıyan I/T genotipli bireyde (birinci pozitif kontrol) 155 bç’lik, 136 bç’lik ve 19 bç’lik üç DNA fragmenti gözlendi (Şekil 4.2’de 2. kuyu). Burada 19 bç’lik parça jelde görülmemektedir. Çünkü elektroforez işlemi sırasında 19 bç’lik parça hızlı göç ettiği için jelden dışarı çıkmıştır. 2. Mutasyonu homozigot halde taşıyan T/T genotipli fertlerde (2. pozitif kontrol) sadece 136 bç’lik ve 19 bç’lik iki DNA fragmenti gözlendi (Şekil 4.2’de 3. kuyu) 3. Mutasyonu taşımayan I/I genotipli fertlerde ise sadece 155 bç’lik bir DNA fragmenti gözlendi (Şekil 4.2’de 4-8. kuyular). Bunlar deneydeki kolorektal ve hepatoselüler kanserli hastalar ile kontrol grubu bireylerinden örneklerdir. Kontrol çalışma grubunda 446 birey, kolorektal çalışma grubunda 210 ve hepatoselüler kanser grubunda 165 bireyde olmak üzere toplam 821 bireyde CHEK2 I157T mutasyonunun bulunup bulunmadığı araştırılmıştır. Çalışma grubunun hiçbir bireyinde CHEK2 I157T mutasyonu belirlenmemiştir (Çizelge 4.3). 110 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM 1. kuyu 2. kuyu 3. kuyu 4. kuyu 5. kuyu 6. kuyu 7. kuyu 8. kuyu 250 bç 155 bç 200 bç 150 bç 100 bç 136 bç 50 bç Şekil 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi. 1. kuyu: DNA marker, 2. kuyu: Birinci pozitif kontrol (CHEK2 I/T heterozigot genotipi), 3. kuyu: İkinci pozitif kontrol (CHEK2 T/T homozigot genotipi), 4-5. kuyular mutasyon bulunmayan genotip (kolorektal kanserli hastalar), 6-7. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (hepatoselüler kanserli hastalar), 8. kuyu: mutasyon bulunmayan genotip (kontrol grubu bireyi). 111 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM Çizelge 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları Çalışma CHEK2 Mutasyonun Sıklıkları Grupları I157T IVS +1G>A 1100delC n (%) n (%) n (%) 0/446 (% 0) 0/446 (% 0) 0/446 (% 0) 0/210 (% 0) 0/210 (% 0) 0/210 (% 0) 0/165 (% 0) 0/165 (% 0) 0/165 (% 0) 0/821 (%0) 0/821 (%0) 0/821 (%0) Kontrol Çalışma Grubu (n=446) Kolorektal Kanser Çalışma Grubu (n=210) Hepatoselüler Kanser Çalışma Grubu (n=165) Toplam (n=821) 4.2.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı CHEK2 genine özgü primerler ile belirtilen koşullarda CHEK2 IVS2 + 1 G>A nokta mutasyonunu belirlemek amacıyla 491 bç’lik DNA bölgesi PCR işlemiyle çoğaltıldı. Bu çoğaltılmış DNA fragmentleri CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonunu saptamak amacıyla Hyp188III (5’ TC ↓NNGA 3’) RE enzimiyle muamele edilmesini takiben RFLP’yi belirlemek amacıyla agaroz jelde elektroforeze tabi tutuldu. Elektroforez sonrası çekilen jel fotoğrafının incelenmesi sonucunda CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonunun araştırıldığı DNA bölgesinin PCR ürününün RE ile muamele edilmeden 491 bç uzunluğunda olduğu saptandı. RE ile muameleyi takiben mutasyonu heterozigot halde taşıyan (pozitif kontrol) ve mutasyon taşımayan bireylerin DNA’larının elektroforezi sonucunda şu durum saptandı (Şekil 4.3.): 112 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM 1. Mutasyonu heterozigot halde taşıyan bireyde (pozitif kontrol) 491 bç’lik, 297 bç’lik ve 194 bç’lik üç DNA fragmenti gözlendi (Şekil 4.3.’de 2. kuyu) 2. Mutasyon taşımayan kolorektal ve hepatoselüler kanserli hastalar ile kontrol grubu bireylerinde sadece 491 bç’lik tek bir DNA fragmenti saptandı (Şekil 4.3.’de 3-10. kuyular) Toplam olarak Türk populasyonundan 821 bireyde bu mutasyonun sıklığı araştırılmıştır. Çalışma gruplarının hiçbir bireyinde CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonu belirlenmemiştir (Çizelge 4.3). 1. kuyu 2. kuyu 3. kuyu 4. kuyu 5. kuyu 6. kuyu 7. kuyu 8. kuyu 9. kuyu 10. kuyu 500 bç 300 bç 297 bç 200 bç 194 bç 491 bç 50 bç Şekil 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi 1. kuyu: DNA marker, 2. kuyu: pozitif kontrol (CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonu hetorozigot genotipli birey), 3-5. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (kolorektal kanserli hastalar), 6-8. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (hepatoselüler kanserli hastalar), 8-10. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (kontrol grubu bireyleri). 113 4. BULGULAR 4.2.3. Kontrol, Süleyman BAYRAM Kolorektal Gruplarında CHEK2 Kanser ve 1100delC Hepatoselüler Kanser Mutasyonunun (Bir Çalışma Nükleotid Delesyonu Sonucu Oluşan Çerçeve Kayması Mutasyonu) Sıklığı CHEK2 1100delC mutasyonuna özgü primerler ile belirtilen koşullarda gerçekleştirilen ARMS-PCR’yi takiben PCR ürünü agaroz jelde yürütüldü. Elektroforez sonrası çekilen jel fotoğrafının incelenmesi sonucunda CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunup bulunmadığı belirlendi. Her örnek için mutasyonun bulunmasına ve mutasyonun bulunmamasına özgü iki ARMS-PCR yapıldı. Her iki tip ARMS-PCR sonucunda 309 bç.’lik kontrol PCR ürünü görüldü (Şekil 4.4.). Mutasyona özgü ARMS-PCR’da eğer örnek CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduruyorsa 183 bç’lik mutasyon bandı görüldü. Mutasyonun bulunmamasına özgü yapılan ARMS-PCR’da eğer örnek mutasyon bulundurmuyor ise 184 bç’lik yabani tip allelin çoğaldığı görüldü (Şekil 4.4.). Kontrol çalışma grubunda 446 birey, kolorektal çalışma grubunda 210 ve hepatoselüler kanser grubunda 165 bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunup bulunmadığı 1642 adet PCR reaksiyonu ile belirlenmiştir. Toplam olarak Türk populasyonundan 821 bireyde bu mutasyonun sıklığı araştırılmıştır. Hiçbir çalışma grubu bireyinde CHEK2 1100delC mutasyonu belirlenmemiştir (Çizelge 4.3). Şekil 4.4.’de CHEK2 1100delC mutasyonun ARMS-PCR ile analizi gösterilmiştir. Her ARMS-PCR işleminde pozitif kontrol olarak heterozigot CHEK2 1100delC mutasyonlu örnekler kullanılmıştır. Her örnek için 2 adet ARMS-PCR yapılmıştır. Bu örnekler agaroz jelde yan yana yüklenmiştir. Daima 1. kuyuya mutasyona özgü gerçekleştirilen reaksiyon ürünü 2. kuyuya mutasyon bulunmamasına özgü yapılan reaksiyonun ürünü yüklenmiştir. Böylece 1. kuyuda ve 2. kuyudaki DNA’nın elektroforezi sonucunda 183 bç ve 184 bç’lik. bandların görülmesi heterozigot mutant olarak tanımlanmıştır (Şekil 4.4.). Sadece 2. kuyudaki DNA’nın elektroforezi sonucunda 184 bç’lik bandın görülmesi bu bireyin CHEK2 1100delC mutasyonunu bulundurmadığını göstermiştir (Şekil 4.4.). Tüm CHEK2 1100delC ARMS-PCR analizlerinde heterozigot (ilk 1. 2. kuyu) mutant örnekler pozitif kontrol olarak kullanıldı. Şekil 4.4.’de ilk 1. ve 2. kuyular dışındaki 1. ve 2. 114 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM kuyular (4 örnek) mutasyon bulunmayan örneklerdir. Bunların yanındaki ilk kuyuda DNA markerı görülmektedir. Pozitif Kontrol Marker 1. kuyu 2. kuyu 1. Örnek 1. kuyu 2. kuyu 2. Örnek 1. kuyu 2. kuyu 3. Örnek 1. kuyu 2. kuyu 4. Örnek 1. kuyu 2. kuyu 309 bç.’lik kontrol PCR ürünü 300 bç 250 bç 200 bç 150 bç 183 bç 184 bç 100 bç 50 bç Şekil 4.4. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi. Marker: DNA marker, Pozitif Kontrol: CHEK2 1100delC mutasyonunu hetorozigot olarak bulunduran örnek, 1. -2. Örnek: CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmayan genotip (kolorektal kanserli hastalar), 3. Örnek: CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmayan genotip (hepatoselüler kanserli hasta), 4. Örnek: CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmayan genotip (kontrol grubu bireyi). 115 4. BULGULAR Süleyman BAYRAM 116 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM 5. TARTIŞMA Bu çalışma, DNA-hasarı kontrol noktası yolağında yer alan merkezi bir öneme sahip CHEK2 geninde daha önce belirlenen kalıtsal I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda kolorektal ve hepatoselüler kanser oluşumu üzerine etkilerinin olup olmadığını PCR-RFLP ve ARMS-PCR yöntemleri ile araştırmak amacıyla yapılmıştır. Bu çalışmada Türk populasyonundan kolorektal kanserli hastalar, hepatoselüler kanserli hastalar ve herhangi bir kanser tanısı konulmamış sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları araştırılmış ve çalışmadan elde edilen sonuçlar diğer populasyonlardan elde edilen CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları ile karşılaştırılmıştır. 5.1. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri Kolorektal kanserler, özellikle gelişmiş batı ülkelerinin önemli bir sağlık sorunudur. Kolorektal kanser insidansı (belirli bir nüfusta belirli bir zaman dilimi içerisinde belirli bir hastalık için yeni olguların sayısı) tarama programlarına rağmen yaşam tarzı ve beslenme alışkanlıkları açısından benzerlikler taşıyan Kuzey Amerika ve Avrupa’da giderek artmaktadır (Parkin ve ark., 2005; Center ve ark., 2009a; Center ve ark., 2009b). Endüstrileşmiş ülkelerdeki insidans gelişmekte olan ülkelere göre daha yüksektir. Gelişmiş ülkelerde kolorektal kanser insidansı ve kolorektal kanser kaynaklı ölümler ikinci sırada yer alırken, gelişmekte olan ülkelerde beşinci sıradadır (Parkin ve ark., 2005; Center ve ark., 2009; Center ve ark., 2009b). Kolorektal kanser insidansı coğrafik bölgeler ve etnik gruplar arasında önemli farklılıklar gösterir. Amerika Birleşik Devletleri, Kanada, Avustralya, Yeni Zelanda ve Orta Avrupa yüksek indisans bölgeleridir. Bunun yanında Asya, Güney Amerika ve Sub-Saharan Afrika düşük insidans bölgeleridir. Türkiye’de kolorektal kanser kadın cinsiyette en sık görülen 2. kanser türü iken erkek cinsiyette 4. sıradadır. Kolorektal kanser insidansının ülkelere göre farklı olması çevresel ve bölgesel 117 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM faktörlere kanserojenlere ve beslenmeye bağlanmaktadır (Parkin ve ark., 2005; Center ve ark., 2009a; Center ve ark., 2009b). Düşük kolorektal kanser insidansına sahip bölgelerden (örneğin Asya) batı ülkelerine göç eden insanlarda kolorektal kanser riskinin artması, yaşam biçimi ile ilgili faktörlerin ve bölgesel beslenme alışkanlıklarının önemli bir risk faktörü olabileceğini desteklemektedir (Marchand, 1999). Kolorektal karsinogenezis sürecinde hücrelerin genomunun sürekli DNA’ya zarar veren ajanlar ile karşılaştığı ve hücrenin genomik bütünlüğünün bozularak kolorektal karsinogenezisin geliştiği gösterilmiştir (de la Chapelle, 2004; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Bununla birlikte kolorektal karsinogenezis sürecinde DNA onarım mekanizmalarının ve bu mekanizmalarda görev alan genlerdeki kalıtsal mutasyonların önemleri yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (de la Chapelle, 2004; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Kolorektal kanserlerin gelişiminde rol alan genetik mekanizmaların ortaya konması gerek erken tanının konması ve gerekse ileri dönemlerde prognozun (kanserin seyrinin) belirlenmesi ve buna uygun ilave tedavilerin uygulanmasında moleküler birer belirteç olarak kullanılmasını sağlayacaktır. Bu sebeplerden dolayı DNA-hasarı kontrol noktası yolağının ve bu yolakta bulunan genlerde meydana gelen kalıtsal (örneğin CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları) veya somatik mutasyonların belirlenmesinin önemi bu karsinogenezis sürecinde artmaktadır. Bu çalışmada patolojik olarak kolorektal kanser tanısı almış 210 hastanın hiç birinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Aynı şekilde herhangi bir kanser tanısı almamış sağlıklı 446 bireyde de bu kalıtsal mutasyonlar bulunmamıştır. Bugüne kadar birçok araştırıcı tarafından CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının kolorektal kanser oluşumu üzerine etkileri farklı populasyonlarda araştırılmıştır (Kilpivaara ve ark., 2003; Lipton ve ark., 2003; Meijers-Heijboer ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004b; Sánchez de Abajo ve ark., 2005; de Jong ve ark., 2005a; Djureinovic ve ark., 2006; Isinger ve ark., 2006; Kilpivaara ve ark., 2006; Weischer ve ark. 2007; Kleibl ve ark., 2009; Suchy ve ark., 2009). CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser üzerine bir etkisinin olmadığı yapılan araştırmaların büyük bir çoğunluğunda 118 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM görülmüştür (Kilpivaara ve ark., 2003; Lipton ve ark., 2003; Meijers-Heijboer ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004; Sánchez de Abajo ve ark., 2005; Djureinovic ve ark., 2005; Isinger ve ark., 2006; Kilpivaara ve ark., 2006; Kleibl ve ark., 2009; Suchy ve ark., 2009). Fakat bir çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun Danimarka populasyonunda kolorektal kanser oluşumunu artırdığı saptanmıştır (Weischer ve ark., 2007). Yine bir başka çalışmada ailesel kolorektal kanser geçmişi mevcut ve erken yaşta kolorektal kansere yakalanan hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu arttırdığı saptanmıştır (de Jong ve ark., 2005a). Bizde çalışmamızda kolorektal kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunu saptayamadık. Bu bulgularımız, kolorektal kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonu saptayamayan önceki araştırıcıların sonuçları tarafından desteklenmektedir. CHEK2 I157T mutasyonunun kolorektal kanser oluşumu üzerindeki etkisini araştıran tüm çalışmalarda I157T mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırdığı saptanmıştır (Cybulski ve ark., 2004b; Kilpivaara ve ark., 2006; Kleibl ve ark., 2009; Suchy ve ark., 2009). Bizim çalışmamızda kolorektal kanserli hastalarda CHEK2 I157T mutasyonu saptayamadık. Bizim sonuçlarla bu araştırıcıların sonuçları arasındaki fark populasyon farklılığından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, bizim çalışmamızdaki hastalarda kolorektal kanserin gelişmesinin başka nedenlere dayandığı görüşündeyiz. Bunun yanında CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonunun kolorektal kanser oluşumu üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı yapılan 3 farklı araştırma ile gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b; Kleibl ve ark., 2009; Suchy ve ark., 2009). Bu araştırmalarda bizim sonuçlarımızı destekler yöndedir. Zira bizim hastalarımızda da CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonu saptanmamıştır. Ayrıca CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının farklı populasyonlarda aynı kanser türünün oluşumu üzerine etkilerinin farklı olduğu değişik araştırıcılar tarafından saptanmıştır (Martínez-Bouzas ve ark., 2007; Weischer ve ark., 2008). Aynı kanser türü üzerine bu kalıtsal mutasyonların etkilerinin populasyonlar arasındaki bu tip farklılıkları, bu kalıtsal mutasyonların frekanslarının populasyonlar arasında farklılık göstermesinden kaynaklanabilir 119 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM (Çizelge 5.1.) (Antoni ve ark., 2007). Yapmış olduğumuz çalışmada 821 Türk bireyde bu mutasyonların saptanmamış olması bu mutasyonların Türk populasyonununda çok az bir sıklıkta veya hiç bulmadığına işaret etmektedir. Bu sebepler I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda kolorektal kanser oluşumuna katkılarının olmadığını açıklayabilir. Ayrıca bizim çalışma grubunu oluşturan hastalarda CHEK2 geninde I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının bulunmamasına karşılık kolorektal kanser gelişmesinin sebepleri aşağıda belirttiğimiz nedenlerden biri veya birkaçı olabilir. Çizelge 5.1. Farklı Populasyonlarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyonlarının Sağlıklı Bireylerde Sıklıkları. Populasyon Hollanda Finlandiya Polanya Almanya Amerika Avustralya İsveç Beyaz Rusya Çek Cumhuriyeti İtalya Kanada --: Veri yok 1100delC 1.3–1.6 1.1–1.4 0.2–0.25 0.15–0.25 0.3-0.4 0.14 0.6–1.0 -0.3 0.11 0.2 Mutasyon Sıklıkları (%) I157T IVS + 1 G>A --5.5 -4.8 0.3 0.6 0-0.4 0.9 -----1.3 0.2 ------- Kolorektal kanserin etiyolojisinde çevresel faktörler, prekanseröz hastalıklar (kolorektal polipler ve iltihabi barsak hastalıkları) ve genetik faktörler rol oynamaktadır (Lin, 2009; Akkız, 2009a). Çevresel faktörler olarak özellikle yüksek ısıda pişirilen kırmızı et, şeker ve yağ (kolesterol) oranı yönünden yüksek kalorili beslenme alışkanlığı, lifsel içeriği olmayan beslenme alışkanlığı, kanserojenlere temas, sigara, alkol, iyonize radyasyon, katkı maddeleri ve oksijen radikalleri bildirilmektedir (Lin, 2009; Akkız, 2009a). Gıdalarda pişirme yöntemine bağlı olarak oluşan heterosiklik aromatik aminler, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve saklama amaçlı kullanılan nitrit, nitrat ve benzeri bileşiklerin kolorektal kanser riskini 120 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM arttırabileceği öne sürülmektedir (Lin, 2009; Rock, 1998; Akkız, 2009a). Heterosiklik aromatik aminler ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar gıdaların kızartma, ızgara, alev ve közde pişirilmesi sırasında oluşan genotoksik kimyasallardır (Lin, 2009; Rock, 1998). Bu tür pişirme yöntemlerini tercih edenlerin 6.5 kat daha fazla kolorektal kanser riskine sahip oldukları bildirilmektedir. Yağdan zengin ve düşük lifli gıdaların kolondan geçiş sürelerinin uzun olması kanserojenlerle kolon hücrelerinin uzun süre maruz kalmalarına neden olur ve bunun sonucunda da kolorektal kanser oluşumu gerçekleşir (Giovannucci, 2002; Lin, 2009; Akkız, 2009a). Beslenme ile alınan yağ karaciğerde kolesterol ve safra asiti sentezini artırmaktadır. Kolonda bulunan bakteriler bu bileşikleri sekonder safra asitlerine, kolesterol metabolitlerine ve diğer toksik metabolitlere dönüştürürler. Hem safra asitlerinin hem de serbest yağ asitlerinin kolon mukozasında hasar yaptıkları ve kolon epitelinin proliferasyon kapasitesini artırdıkları belirlenmiştir (Huxley, 2007; Akkız, 2009a). Kolorektal kanserler hem kalıtsal (~%5) hem de sporadik (~%95) olarak meydana gelmektedir (Lynch ve ark., 1993; Burt ve ark., 1995). Kalıtsal kolorektal kanserlerin başlıca iki tipi vardır (Burt ve ark., 1995; Jo ve Chung, 2005; Akkız, 2009b). Bunlar ailesel adenomatöz polipozis (FAP) ve kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanserdir (HNPCC). Ailesel adenomatöz polipozis’in çok sayıda alt tipi (gardner sendromu, turcot sendromu, peutz-jeghers sendromu, cowden sendromu) vardır (Burt ve ark., 1995; Jo ve Chung, 2005; Akkız, 2009b). FAP sendromu ile birlikte izlenen kolorektal kanserlerdeki mekanizma şu şekilde gerçekleşir; 5. kromozomun uzun kolunda (5q21) bulunan APC tümör süpresör genine ait mutant bir allel bir ebeveynden aktarılır. Heterozigot bireyin yabani-tip allelinde de meydana gelen kayıp (heterozigotluk kaybı=LOH) ve somatik mutasyonlar sonucunda FAP ilişkili kolorektal kanser gelişir. APC gen mutasyonlarının büyük çoğunluğu (>%90) yanlış anlamlı veya çerçeve kayması mutasyonlarıdır. Ailesel adenomatöz polipozis otozomal dominant kalıtım gösterir ve hemen hemen tüm vakalarda penetransı %100 olan bir hastalıktır. Radyografik ve makroskopik olarak bağırsakta normal mukozanın çok hafif kabarıklarından büyük kitlelere kadar değişen yüzlerce iyi huylu poliple (kolonun iç duvarından kaynaklanan ve barsak boşluğuna doğru 121 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM büyüyen anormal oluşum) seyreden bir durum söz konusudur (Burt ve ark., 1995; Chung ve Rustgi, 2003; Lynch ve de la Chapelle, 2003; Jo ve Chung, 2005). Kalıtsal kolon kanserlerinin ikinci tipi olan kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanserin (HNPCC) iki alt tipi vardır (Lynch I sendromu ve Lynch II sendromu) (Chung ve Rustgi, 2003). Otozomal dominant kalıtım gösteren HNPCC, kolorektal kanser gelişme yaşının erken olmasına ve kanserlerin çoğunlukla çıkan kolonda (sağ solon) gelişmesine yol açar. Hatalı eşleşme tamiri (mismatch repair=MMR) genlerindeki mutasyonlar bu hastalığın ortaya çıkmasında rol oynar (Lynch ve de la Chapelle, 2003; Chung ve Rustgi, 2003; Jo ve Chung, 2005). HNPCC gelişen ailelerin %1560’ında ikinci kromozomda bulunan (2p16) hMSH2 (human MutS protein homolog 2, =insan MutS protein homologu 2) ve üçüncü kromozomda bulunan (3p21) hMLH1 (human MutL protein homolog 1, =insan MutL protein homologu 1) hatalı eşleşme tamiri genlerinde kalıtsal mutasyonlar saptanmıştır. HNPCC gelişen hastalarda birçok MMR geninde [hPMS1 (human postmeiotic segregation increased 1, =insanda mayoz bölünmeden sonra ayrılmada artan 1), hPMS2 (human postmeiotic segregation increased 2, = insanda mayoz bölünmeden sonra ayrılmada artan 2) ve hMSH6 (human mutS homolog 6, =insan mutS homolog 6)] gibi daha az sıklıkta bulunan kalıtsal mutasyonlar da bildirilmiştir (Lynch ve de la Chapelle, 2003; Chung ve Rustgi, 2003; Jo ve Chung, 2005; Akkız, 2009b). Kolorektal karsinogenezis oldukça kompleks ve çok basamaklı bir süreçtir (de la Chapelle, 2004; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Kolorektal kanserin mekanizmasına ışık tutan en önemli özelliklerden birisi bu tümörlerin uzunca bir premalign (kanser öncesi) aşamadan sonra adenomalardan (benign neoplazi=iyi huylu tümör) geliştiğinin anlaşılmasıdır. Bu süreç onkogen ve tümör süpresör genlerde meydana gelen ardışık mutasyonlar sonucu kolonik lezyondan adenomatöz polipe ve adenomatöz polipten malign tümöre doğru bir gidişin olduğunu gösterir ve bu durum Volgelstein’in adenoma-karsinoma dizisi olarak bilinir (Şekil 5.1.) (Vogelstein ve ark., 1988; de la Chapelle, 2004; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b;). Bununla birlikte kolorektal kanserin moleküler genetik çalışmalarından kolorektal kanserin patogenezinin çok basamaklı bir süreç olduğu belirlenmiştir. En az 5 genin sırasıyla dahil edilebileceği bir süreç olduğu 122 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM saptanmıştır. Başlangıçta 5. kromozomdaki (5q21) hem APC (adenomatosis polyposis coli) hem de MCC (mutated in colorectal cancers) genlerinde mutasyonlar gelişir ve daha sonra bunlara 12. kromozomun kısa kolunun (12p12) üzerindeki Kras onkogen, 18. kromozomun uzun kolunda (18q21) bulunan DCC (deleted in colorectal carcinoma) ve 17. kromozomun kısa kolunda (17p12) lokalize olmuş p53 tümör süpressör gen mutasyonları eklenerek kolorektal karsinogenezis gelişir. Bu mutasyonlara gen metilasyonları ile mikrosatellit instabilitesi de dahil olabilir (de la Chapelle, 2004; Söreide ve ark., 2006; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Metastaz APC Normal adenoma K-ras DCC/Smad4 Orta adenoma Erken adenoma BAX p53 Geç adenoma IGF-IIR Karsinoma TGF-βRII Şekil 5.1. Kolorektal Kanser Gelişiminde Adenom-Karsinom Geçişine Eşlik Eden Değişiklikler. Kolorektal kanserlerdeki mekanizma şu şekilde gerçekleşir; 5. kromozomun uzun kolunda (5q21) bulunan APC geninde meydana gelen anlamsız mutasyonlar ve çerçeve kayması sonucu normal adenoma erken adenomaya ilerler. Hiperproliferatif özellikte bulunan ve DNA metilasyon kayıpları ve mikrosatellit instabilitenin (BAX, IGR-IIR, TGFβRII) meydana geldiği erken adenomada 12. kromozomun kısa kolunda bulunan (12p12) K-ras onkogenindeki mutasyonlar erken adenomu orta adenoma ilerletir. 18. kromozomun uzun kolunda bulunan DCC (18q21) ve SMAD4 (18q21) tümör süpresör genlerdeki mutasyonlar ile geç adenoma gelişir. Geç adenomada meydana gelen p53 (17p12) mutasyonları ile kolorektal kanser gelişmiş olur (Söreide ve ark., 2006). 123 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Kolorektal kanser üç farklı mekanizma ile de gelişebilir; kromozomal instabilite mekanizması, mikrosatellit instabilite mekanizması ve epigenetik bir mekanizma olan metilasyondur (de la Chapelle, 2004; Söreide ve ark., 2006; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b;). Kolorektal kanserde genetik değişikliklerin sıklığının oldukça yüksek olmasının en önemli nedeni kolorektal karsinogenezisin uzun bir sürede tamamlanmasıdır. Kromozomal instabilite kolorektal karsinogeneziste dominant mekanizmadır. Kolorektal kanserlerin %60-%80’inde bu durum görülür ve genomda bir çok bölgede allel kayıpları ve kazanımları, kromozomal amplifikasyonlar ve translokasyonlar ile karakterize edilirler. Kromozomal instabilite yolağında genetik değişikliklerin en sık gözlendiği başlıca lokuslar şunlardır: APC geninin bulunduğu 5q21; COX-2 geninin bulunduğu 1q25; p53 geninin bulunduğu 17p12; SMAD2 (mothers against decapentaplegic homolog 2, =decapentaplegic karşıtı anneler homolog 2), SMAD4 (mothers against decapentaplegic homolog 4, =decapentaplegic karşıtı anneler homolog 2) ve DCC genlerinin bulunduğu 18q21; K-ras genin bulunduğu 12p21 ve β-katenin genin bulunduğu 3q21’ir lokuslardır (de la Chapelle, 2004; Söreide ve ark., 2006; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b;). Mikrosatellit instabilitesi genomda tekrarlanan DNA dizilerinin sayılarında artış veya azalış ile tanımlanmaktadır (Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b). Mikrosatellit DNA 1–9 baz çiftlik, ardışık olarak tekrarlanan birimlerden oluşmuş DNA sıralarıdır. Genomda yaklaşık yarım milyon mikrosatellit lokusu bulunmaktadır. Mikrosatellitler tüm genom boyunca dağılmışlardır, ancak genellikle kodlanmayan bölgelerde lokalize olmuşlardır. Mikrosatellit instabilitesi, hatalı eşleşme tamir (mismatch repair=MMR) genlerinin (hMSH2, hMLH1, hPMS2 ve hMSH6) inaktivasyonu sonucu gelişmektedir (Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b). DNA MMR proteinleri DNA replikasyonu sırasında ortaya çıkan küçük dizilim hatalarını tanıyarak düzeltirler. Bu genlerde meydana gelen inaktivasyon sonucunda mikrosatellitlerin bulunduğu bölgelerde yer alan genlerde DNA sıra hataları oluşur. Kolorektal kanserde bu sıra hataları, kritik öneme sahip büyüme ve regülasyon genlerinde [TGFβRII (Transforming growth factor, beta receptor II, =dönüştürücü büyüme faktörü, beta reseptör II), BAX (BCL2-associated X protein, =B hücre 124 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM lenfoma 2-ilişkili X protein), IGF-IIR (insulin-like growth factor 2 receptor, =insüline-benzer büyüme faktörü 2 reseptör), hMSH6, hMSH3 ve PTEN] ortaya çıkar ve bunun sonucunda da kolorektal kanser meydana gelir (Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b). Kolorektal karsinogeneziste yeni tanımlanan bir epigenetik mekanizma olan CpG nükleotid adalarının metilenmesidir (CIMP). CpG adaları memelilerdeki genlerin promoterlerinin yaklaşık %40’ında bulunmaktadır ve yaklaşık olarak 3001000 baz çiftlik uzunlukta olup %50’lik bir oranda CG nükleotidlerinden meydana gelir. CIMP, çok sayıda fonksiyonel öneme sahip genlerin promoter bölgelerinin metilasyonu sonucu gelişir ve genlerin transkripsiyonel olarak susturulmasına yol açar. Kolorektal karsinogeneziste CIMP ile bir çok genin [p16, THBS1 (thrombospondin 1), MGMT (O-6-methylguanine-DNA methyltransferase, =O-6metilguanin-DNA metiltransferaz) ve hMLH1] inaktive olduğu gösterilmiştir (Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b). Yukarıda anlatılan genetik anormallikler sonucunda kolorektal karsinogeneziste beş önemli hücresel iletişim yolağının [Adenomatöz Poliposis Coli (APC)/β-katenin, DNA hatalı eşleşme tamir, Transforming Growth Faktör-β/SMAD, Mitojen Aktivasyon Protein Kinaz (MAPK) ve p53 yolağı] bozulduğu gösterilmiştir (Akkız, 2009b) Yukarıda anlatıldığı gibi kolorektal karsinogeneziste çevresel ve genetiksel risk faktörleri önemli rol oynamaktadırlar. Bizim kolorektal kanserli hastalarda CHEK2 geninde I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanamamıştır. Ancak kolorektal karsinogenezise katkısı bulunan APC, hMSH2 ve hMLH1 gibi genlerde daha önce belirlenen kalıtsal mutasyonların, diğer başka aday genlerde bulunan kalıtsal mutasyonların ve bunun yanında somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin bizim çalıştığımız hastalarda kolorektal kanser gelişimine neden olabileceği görüşündeyiz. Bu yüzden APC, hMSH2 ve hMLH1 genlerindeki kalıtsal mutasyonların ve kolorektal karsinoma için fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların, bunun yanında kolorektal karsinogenezise katkıda bulunabilecek somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin araştırılması gerekmektedir. Çünkü toplum içerisinde genin işlevini veya ifadesini 125 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM bozan böylece kansere yakalanma riskini artıran kalıtsal mutasyonların belirlenmesi ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması ve kolorektal karsinogenezis ile ilişkisinin anlaşılması tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve önceden önleyici tedbirlerin alınması bakımından oldukça önemlidir. 5.2. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Hepatoselüler Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri Histolojik olarak primer karaciğer kanserleri farklı alt türlere ayrılmaktadır. Bu alt türler hepatoselüler karsinoma (HSK), intrahepatik safra yolları kanseri (kolanjiokarsinoma), safra yolları kistadenokarsinomu ve hepatoblastomadır (Farazi ve DePinho, 2006). HSK hepatositlerden köken alır ve primer karaciğer kanserlerinin %85-90’ını oluşturmaktadır (El-Serag ve Rudolph, 2007; Dragani, 2010). HSK dünya genelinde beşinci sıklıkta görülen kanser türüdür ve kanser nedenli ölümlerde üçüncü sırayı almaktadır (El-Serag ve Rudolph, 2007). Yıllık olarak 620000’den daha fazla sayıda bireye HSK tanısı (bir yılda yeni tanı alanların sayısı) konulmakla birlikte, HSK yıllık olarak 600000’den fazla kişinin bu nedenle ölümüne yol açar (Schütte ve ark., 2009). Hepatoselüler kanser gerek insidansı gerekse risk faktörleri açısından belirgin coğrafik farklılıklar göstermektedir. HSK insidansı bakımından dünya üç bölgeye (yüksek, orta ve düşük) ayrılmaktır (El-Serag ve Rudolph, 2007). HSK insidansı özellikle hepatit B virüs (HBV) enfeksiyonunun endemik olduğu SubSaharan Afrika (Sahara çölünün güneyinde yer alan ülkeler) ve Doğu Asya’da (Çin, Tayvan ve Singapur) oldukça yüksektir (yıllık oran 120 olgu/ 100000 kişi). Japonya, Yunanistan, İtalya, Güney Pasifik adaları, Batı Avrupa ve Türkiye’de HSK insidansı orta derecededir (yıllık oran 10-20 olgu/100000 kişi). Kuzey Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri düşük insidans bölgeleridir (yıllık oran 5 olgu/100000 kişi) (ElSerag ve Rudolph, 2007). Çevresel faktörler ile kalıtsal faktörlerin indüklediği heptoselüler karsinogenezis sürecinde hepatosit hücresinin genomu sürekli DNA’ya zarar veren ajanlar ile karşılaşır ve hücrenin genomik bütünlüğü bozulur sonuç olarak hepatoselüler karsinoma gelişir (Farazi ve DePinho, 2006). Bu sebeplerden dolayı 126 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM DNA-hasarı kontrol noktası yolağının ve bu yolakta bulunan genlerde meydana gelen kalıtsal (örneğin CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları) veya somatik mutasyonların önemi bu karsinogenezis sürecinde artmaktadır. Bu çalışmada klinik, laboratuvar, radyolojik ve patolojik bulguları ile hepatoselüler kanser tanısı konmuş 165 hastanın hiç birinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Aynı şekilde herhangi bir kanser tanısı konulmamış sağlıklı 446 bireyde de bu kalıtsal mutasyonlar bulunmamıştır. Şimdiye kadar CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler kanser oluşumu üzerine etkileri araştırılmamıştır. 1998 yılında insan CHEK2 geninin klonlanması ve DNA-hasarı kontrol noktası ile ilişkisinin belirlenmesinden sonra hem sporadik hem de ailesel (herediter=kalıtsal) insan kanserlerinde CHEK2 mutasyonları araştırılmıştır. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının etkileri farklı populasyonlarda ve farklı kanser türlerinde (akciğer, beyin, böbrek, gırtlak, kolorektal, Li-Fraumeni, meme, melanoma, mesane, ovaryum, özefagus, pankreas, prostat, rahim, tiroit ve üst solumun kanseri) araştırılmıştır (Seppälä ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004b; Thompson ve ark., 2006; Brennan ve ark., 2007). Bu araştırmalarda sağlıklı bireyler ile ailesel kanser öyküsü olan veya sporadik kanser gelişen hastalarda mutasyon sıklıkları karşılaştırılarak kanser oluşumu üzerine etkiler belirlenmiştir. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının belli bir kanser türünün oluşumu üzerinde belirgin bir etkisi var iken farklı bir kanser türü için aynı durumun söz konusu olmadığı saptanmıştır (Cybulski ve ark., 2004b). Buna ek olarak aynı tür kanser oluşumu üzerine aynı CHEK2 mutasyonunun farklı populasyonlarda farklı etkileri olduğu saptanmıştır (Martínez-Bouzas ve ark., 2007; Weischer ve ark., 2008). CHEK2 1100delC mutasyonun meme kanseri oluşumu üzerine etkisi farklı populasyonlarda ve bir ülkeden diğer ülkeye anlamlı farklılıklar gösterdiği yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (Martinez-Bouzas ve ark., 2007; Weischer ve ark., 2008). CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı Kuzey ve Batı Avrupa’da ayrıca Rusya’da en fazla, fakat Güney Avrupa, Güney Amerika ve Asya’da çok az bir sıklıkta belirlenmiştir. Meme kanserli hastalarda 1100delC mutasyonunun sıklığı Avrupa ülkelerinde de kuzeyden güneye gidildikçe azalmaktadır (Şekil 5.2.) Populasyon 127 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM farklılıkları, en belirgin şeklinde CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumu üzerine etkisiyle ilgili olarak yapılan araştırmalarda görülmektedir (Çizelge 5.2.) % 3.1 % 2.7 % 3.6 % 1.2 % 1.6 Bask Bölgesi % 0.21 % 0.38 % 0.93 % 0.1 %0 Şekil 5.2. Avrupa Kökenli Meme Kanserli Hastalarda CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı. 128 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Çizelge 5.2. Farklı Populasyonlardan Meme Kanserli ve Kontrol Bireylerinde CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı. Mutasyon Sıklığı % Bayan Meme Kanserli Kontrol (n) Hastalar (n) % 2.8 (212) % 11.4 (237)b, c Hollanda % 1.3 (460) % 2.5 (79)b, c % 1.6 (184) % 3.8 (1706)a % 1.4 (1885) % 5.5 (507)b, c Finlandiya % 1.1 (447) % 2.9 (464) Danimarka % 0.5 (4643) % 1.2 (1088)a, d Rusya % 0.2 (448) % 5.2 (155)e -% 4.0 (380)b, c % 0.5 (1315) % 1.6 (516)b, c Almanya % 0.7 (651) % 1.4 (71)b, c -% 2.3 (86)f % 0.25 (401) 1.1% (985)a Çek Cumhuriyeti % 0.3 (730) % 0.3 (358)b, c Bask Bölgesi % 0.0 (120) % 0.9 (214)a, d İspanya % 0.0 (400) % 0.0 (400)b, c İtalya % 0.0 (334) % 0.1 (939)b İngiltere % 0.0 (300) % 4.0 (68)b, d Amerika % 0.5 (859) % 1.1 (829)b, d Amerika (New York) % 0.4 (569) % 0.0 (67)b, c Amerika (Kaliforniya ) -% 0.4 (1112)a, d Kanada % 0.2 (496) % 1.4 (1199)a, d -% 0.6 (300)b, c Avustralya % 0.14 (736) % 0.7 (1474)a Aşkenazi Yahudileri % 0.3 (1096) % 3.0 (33)b, c % 0.0 (196)b, c Şili % 0.0 (1024) a Ailesel meme kanseri hikayesi olmayan meme kanserli hastalar b Ailesel meme kanseri hikayesi olan meme kanserli hastalar c BRCA1/2 mutasyonları saptanmayan meme kanserli hastalar d BRCA1/2 mutasyonları araştırılmayan meme kanserli hastalar e Her iki memede de meme kanseri gelişen meme kanserli hastalar f Meme kanserine erken yaşta yakalanan meme kanserli hastalar Populasyon CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının kansere yatkınlık açısından ılımlı derece penetrans (bir gen ya da gen grubunun oluşturması beklenen fenotipin bireyler arasında %0-100 arasında değişen görülme sıklığı) etkilerinin olduğu saptanarak prostat ve meme kanseri oluşumunu artırdığı gösterilmiştir (Meijers- 129 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Heijboer ve ark., 2002; Vahteristo ve ark., 2002; Oldenburg ve ark. 2003; Seppälä ve ark., 2003; Kilpivaara ve ark., 2004; Cybulski ve ark., 2004b; Górski ve ark., 2005; Cybulski ve ark., 2006a). Fakat birçok çalışmada da CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumu üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı da belirlenmiştir (Mateus Pereira ve ark., 2004; Friedrichsen ve ark., 2004; Baeyens ve ark., 2005; Kleibl ve ark., 2005; Rashid ve ark., 2005; Einarsdóttir ve ark., 2006). Bununla birlikte, 1100delC ve I157T mutasyonlarının diğer genler (BRCA1, BRCA2 ve p53 gibi) veya faktörler (DNA’ya zarar veren kimyasallar ve ışınlar gibi) ile sinerjik etkileşimleri sonucu kanser oluşumunun artış gösterdiği bildirilmiştir (Meijers-Heijboer ve ark., 2002; Vahteristo ve ark., 2002; Oldenburg ve ark. 2003; Friedrichsen ve ark., 2004; CHEK2 Meme Kanseri Vaka-Kontrol Konsorsiyumu, 2004). Örneğin, CHEK2 1100delC mutasyonu birinci derece akrabalarında meme kanseri gelişen veya ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda daha fazla sıklıkta bulunmuştur. Buna ek olarak, meme kanserine yakalanma yaşının CHEK2 1100delC mutasyonu bulunan hastalarda, bu mutasyonu bulundurmayanlara oranla daha düşük olduğu belirlenmiştir (Vahteristo ve ark., 2002; Friedrichsen ve ark., 2004; CHEK2 Meme Kanseri Vaka-Kontrol Konsorsiyumu, 2004; Górski ve ark., 2005). CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduran meme kanserli hastalarda ikinci memede de meme kanseri oluşumunun artış gösterdiği belirlenmiştir (Vahteristo ve ark., 2002; Broeks ve ark., 2004; de Bock ve ark., 2004; Kilpivaara ve ark., 2005; Schmidt ve ark., 2007). Birinci memede meme kanseri geliştikten sonra radyasyon tedavisi alan hastalarda ikinci memede de meme kanseri gelişenlerde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığının yüksek olduğu saptanmıştır (Broeks ve ark., 2004). Buna ek olarak CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduranların mamografik olmayan X ışınına maruz kalanlarda da meme kanseri oluşumunun artış gösterdiği bildirilmiştir (Bernstein ve ark., 2006). Bu veriler, CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduran bireylerde iyonize radyasyon gibi çevresel DNA-hasarı meydana getiren faktörlerin kanser oluşumunu artırdığına işaret etmektedir. Tüm bu bulgular, CHEK2’nin diğer genler veya faktörler ile sinerjik etkileşim içinde olduğunu ve çok sayıda organ kanseri için kanser yatkınlık geni olduğu hipotezi ile uyumludur. 130 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM I157T mutasyonunun yumurtalık, kolorektal, böbrek, tiroit, mesane kanseri ve lösemi oluşumunu artırdığı gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b; SzymanskaPasternak ve ark., 2006; Kilpivaara ve ark., 2006; Rudd ve ark., 2006; Złowocka ve ark., 2008). Bununla birlikte CHEK2 I157T mutasyonunun gırtlak ve akciğer kanseri oluşumunu azalttığı belirlenmiştir (Cybulski ve ark., 2008). Pankreas ve rahim kanseri oluşumu ile CHEK2 I157T mutasyonu arasında herhangi bir ilişkinin olmadığı saptanmıştır (Bartsch ve ark., 2006; Konstantinova ve ark., 2008). CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun meme, prostat ve tiroit kanseri oluşumunu artırdığı bildirilmiştir (Dong ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004a; Cybulski ve ark., 2004b; Górski ve ark., 2005). Böbrek, kolorektal ve ovaryum kanserlerinin oluşumu üzerine IVS2 + 1G> A mutasyonunun bir etkisinin olmadığı gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b; Suchy ve ark., 2009; Suspitsin ve ark., 2009). Bizim yaptığımız çalışmada hepatoselüler kanserli hiçbir hasta ve sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının saptanmaması ve bu kalıtsal mutasyonların Türk populasyonunda hepatoselüler kanser oluşumunu üzerine bir etkilerinin olmaması populasyon farklılığından kaynaklanmış olabilir. Çünkü CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının farklı populasyonlarda aynı kanser türünün oluşumu üzerine etkilerinin farklı olduğu önceki çalışmalar ile gösterilmiştir (Weischer ve ark., 2008; Martínez-Bouzas ve ark., 2007). Aynı kanser türü üzerine bu kalıtsal mutasyonların etkilerinin populasyonlar arasındaki bu tip farklılıkları, bu kalıtsal mutasyonların frekanslarının populasyonlar arasında farklılık göstermesinden kaynaklanabilir. Çünkü farklı populasyonlardan olan sağlıklı bireylerde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıklarının farklı olduğu saptanmıştır (Çizelge 5.1.) (Antoni ve ark., 2007). Bu yüzden bu kalıtsal mutasyonların hepatoselüler karsinogenezis üzerine etkilerinin daha net bir şekilde belirlenmesi için bu mutasyonların frekanslarının yüksek olduğu hepatoselüler kanserin endemik olduğu populasyonlarda da ve/veya araştırılması gerekmektedir. Bununla birlikte CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler karsinogenezis sürecine herhangi bir katkıları olmayabilir. Çünkü 131 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının farklı kanser türlerinin oluşumu üzerine etkilerinin de farklı olduğu gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b). Örneğin CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının meme, prostat, kolorektal kanser oluşumunu artırmış iken pankreas, rahim, özefagus kanser türlerinin oluşumu üzerine bu mutasyonların etkilerinin olmadığı belirlenmiştir (Cybulski ve ark., 2004b). Aynı durum hepatoselüler karsinogenezis içinde geçerli olabilir. Ayrıca bizim çalışmamızda CHEK2 geninde I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının bulunmamasına karşılık hepatoselüler kanser gelişmesinin sebebi aşağıda belirteceğimiz nedenlerden biri veya birkaçı olabilir. HSK’nın patogenezinde rol oynayan major risk faktörleri olarak kronik hepatit B, C ve D virüs enfeksiyonları, toksinler (alkol, aflatoksin B1), ilaçlar (anabolik steroidler) ve metabolik karaciğer hastalıkları [alfa-1 antitripsin eksiliği, tip 1 glikojen depo hastalığı (Von Gierke’s hastalığı), hemokromatozis, akut intermitant porfiria, porfiria kutanea tarda ve tip 1 tirozinemi] tanımlanmıştır (Farazi ve DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007; Dragani, 2010). HSK’nın gelişmesinde rol oynayan bir diğer major risk faktörü ise karaciğer sirozudur. HSK’ların %70-90’ı sirotik karaciğerde gelişmektedir (Farazi ve DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007). Ayrıca, obezitenin epidemik hale gelmesi, tip II diyabet ve insülin direnci insidansının artması, alkolik olmayan karaciğer yağlanmasının (NASH) giderek yaygınlaşması HSK patogenezinde rol oynayan en önemli risk faktörlerinden biri olan karaciğer sirozunun gelişmesine neden olarak HSK’nın oluşumunu artırmaktadırlar (Schütte ve ark., 2009). Bizim hastaların %83.4’ünde hepatit B ve hepatit C virüs enfeksiyonu vardır. Ayrıca %80.6’sında ise siroz gelişmiştir. Bu durumda bizim hastalarda HSK gelişmesinin ana nedeni bu sebepler olabilir. Geriye kalan %20’sinde ise CHEK2 mutasyonlarının dışında kalıtsal nedenler olabilir. Aynı durum virüs enfeksiyonlu hastalar içinde söz konusu olabilir. Alfa-1 antitripsin eksiliği otozomal resesif kalıtım özelliği gösteren bir hastalıktır. Bu hastalığa 14. kromozomun uzun kolunda (14q32.1) bulunan SERPINA1 [serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1] geninde meydana gelen çok sayıdaki mutasyonlar neden olur (Fairbanks ve Tavill, 2008). Tip 1 glikojen depo hastalığına glukoz-6-fosfotaz enziminin 132 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM bozulmuş aktivitesi neden olur ve karaciğerde aşırı miktarda glikojen birikir. Bu hastalığın iki alt tip vardır (tip Ia ve tip Ib). Her iki alt tip hastalık otozomal resesif kalıtım özelliği gösterir. Tip Ia’da 17. kromozomda bulunan glukoz-6-fosfotaz (G6PC) geninde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar glukoz-6-fosfotaz enziminin aktivitesini tamamen ortadan kaldırır. Tip Ib’de 11. kromozomda bulunan glukoz-6fosfotaz translokaz (SLC37A4) geninde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar endoplazmik retikulum membranında glukoz-6-fosfotaz translokaz enzim eksikliğine neden olur (Janecke ve ark. 2001). Hemokromatozis otozomal resesif kalıtım gösteren ve karaciğerde aşırı miktarda demir birikmesine neden olan bir hastalıktır. Hemokromatozis hastalığına 6. kromozomda (6p21.3) bulunan hemokromatozis (HFE) geninde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar neden olur (Alexander ve Kowdley, 2009). Hepatik porfiria hastalığı “hem” gruplarının biyosentez yolağındaki hasarlardan meydana gelen kalıtsal bir hastalıktır. Akut intermitant porfiria hastalığı otozomal dominant kalıtım gösterir bu hastalığa 11. kromozomda (11q23.3) bulunan hidroksimetilbilane sentetaz (porfobilinojen deaminaz) (HMBS) genin kodlanan ve kodlanmayan bölgelerinde meydana gelen çok sayıdaki mutasyonlar neden olmaktadır. Porfiria kutanea tarda hastalığına 1. kromozomda (1p34) bulunan üroporfinojen dekarboksilaz (UROD) geninde meydana gelen çok sayıdaki kalıtsal yanlış anlamlı veya insersiyon/delesyon şeklindeki mutasyonlar neden olmaktadır. Bu hastalık otozomal dominat kalıtım özelliği gösterir (Andant ve ark., 2000; Aarsand ve ark., 2009). Tip 1 tirozinemi hastalığı tirozin aminoasidinin yıkımından sorumlu fumaril asetoasetat hidrolaz enzimini kodlayan 15. kromozomda (15q23q25) bulunan gende meydana gelen kalıtsal mutasyonlar sonucu oluşur. Tip 1 tirozinemi hastalığı fumaril asetoasetat hidrolaz enziminin eksikliğinden dolayı tirozin aminoasitinin katabolik reaksiyonunun ara ürünlerinin karaciğerde birikmesi sonucunda karaciğerde hasarlar meydana getirerek akut hepatik bozukluğa, karaciğer sirozuna ve HSK’ya neden olur (Scott, 2006). Alfa-1 antitripsin eksiliği, tip 1 glikojen depo hastalığı (Von Gierke’s hastalığı), hemokromatozis, akut intermitant porfiria, porfiria kutanea tarda ve aynı zamanda tip 1 tirozinemi gibi çok az bir sıklıkta bulunan monogenik sendromlar ile poligenik özellik gösteren birçok hastalık (otoimmün hepatit, tip 2 diyabet, 133 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM hipotiroidizm ve alkolik olmayan karaciğer yağlanması) hepatoselüler kanser oluşumunu artırmaktadır. Monogenik veya poligenik bu hastalıkların oluşmasına gen veya genlerde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar neden olmakta ve sonuç olarak karaciğer hasarı (siroz) ve hepatoselüler karsinoma gelişmektedir (Şekil 5.3.) (Dragani, 2010). Tip 1 tirozinemi (15q23-q25) Hemokromatozis (6p21.3) Alfa-1 antitripsin (14q32.1) Siroz Porfiryalar (1p34) (11q23.3) Tümöre ilerleme HSK NASH Otoimmün Hepatit Tip 2 Diyabet Şekil 5.3. Genetik Anormallikler Sonucu Oluşan Monogenik ve Poligenik Sendromlar İle Hepatoselüler Kanser Oluşumu Arasındaki İlişki. Monogenik veya poligenik mutasyonlar ve/veya polimorfizmler sonucu oluşan sendromlar karaciğer hasarı ve nekrozuna (hücre ölümü) neden olarak karaciğer sirozunu meydana getirir. Karaciğer sirozu hepatositlerde somatik mutasyonların ve genetik hasarın oluşmasına ve/veya artmasına neden olarak hepatoselüler karsinoma oluşumuna katkıda bulunur (Dragani, 2010). Hepatoselüler karsinogenezis oldukça kompleks ve çok basamaklı bir süreçtir. Kronik hepatit B (HBV), kronik hepatit C (HCV) virüs enfeksiyonları, kronik alkolizm ve diğer etiyolojik (hastalık etkeni) faktörler kronik hepatit ve karaciğer sirozuna neden olan sürekli hepatosit hasarına, reaktif oksijen türlerinin artmasına, doku inflamasyonuna (iltihap) ve rejenerasyonuna bunların sonucunda da hücrede gelişen genetik ve epigenetik değişiklikler yoluyla hepatoselüler karsinogenezise katkıda bulunurlar (Şekil 5.4.) (Farazi ve DePinho, 2006; Akkız, 2007; Yam ve ark., 2010). Bununla birlikte etiyolojik farktörlerin direkt etkileri de (HBV virüsünün genoma entegrasyonu, viral onkogenler ile viral proteinlerin onkogenik etkileri gibi) hepatoselüler karsinogenezisi tetikler (Pang ve Poon, 2007; 134 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Akkız, 2007). Etiyolojik faktörün farklılığına bağlı olarak hepatosit hücresinde görülen genetik ve epigenetik değişikliklerin oldukça farklı olduğu gösterilmiştir (Farazi ve DePinho, 2006; Akkız, 2007; El-Serag ve Rudolph, 2007). HSK’da görülen genetik anormalikler şu şekilde sıralanabilir: allel kayıpları, kromozomal değişiklikler, somatik gen mutasyonları, belirli genlerin ekspresyonlarında değişiklikler, DNA amplifikasyonları/delesyonları ve epigenetik değişiklikler (Llovet ve Bruix, 2008). Kronik HBV/HCV İnfeksiyonu Kronik Alkolizm Diğer etiyolojik faktörler Kronik hepatit ve Karaciğer sirozu Erken evre Displazik nodül Genetik ve epigenetik (pre-kanseröz lezyon) değişiklikler Geç evre Displazik nodül (pre-kanseröz lezyon) Hepatoselüler karsinoma (HSK) Tümörün yayılımı (metastaz) Şekil 5.4. Hepatoselüler Karsinogenezisin Oldukça Kompleks ve Çok Basamaklı Süreci. HSK vakalarının büyük çoğunluğu kronik hepatit ve/veya siroz zemininde gelişmektedir. Displazik (düzensiz doku oluşumu) nodüller hepatoselüler karsinogeneziste pre-kanseröz lezyonlardır ve sirotik zeminde ortaya çıkmaktadırlar. Hepatoselüler karsinogenezis sürecinde genetik ve epigenetik değişiklikler hücrede birikmektedirler. (Yam ve ark., 2010) 135 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Hepatoselüler karsinogeneziste rol oynayan bir çok aday gen belirlenmiştir. Bu genler c-myc (8q), Siklin A2 (4q), retinoblastoma 1 (Rb1) (13q), axis inhibition protein 1 (=eksen engelleyici protein 1) (AXIN1) (16p), p53 (17p), cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (=siklin-bağlımlı kinaz inhibitörü 2A) (p16) (9p), E-Cadherin (=E-Kaderin)(16p), suppressor of cytokine signaling (=sitokin sinyal baskılayıcı) (SOCS) (16p) ve phosphatase and tensin homolog (=fosfotaz ve tensin homolog) (PTEN) (10q)’dur (Farazi ve DePinho, 2006; Llovet ve Bruix, 2008). Bir çok onkogen (β-katenin, Siklin D1 gibi) ve tümör süpressör gende [p53, p16INK4a, APC (adenomatosis polyposis coli, =adenomatöz polipozis koli), AXIN1 gibi] somatik mutasyonlar bildirilmektedir (Farazi ve DePinho, 2006). Epigenetik bir değişiklik olan hipermetilasyon ile bir çok genin [p16INK4a, E-Cadherin, COX-2 (cyclooxygenase-2, =siklooksijenaz 2), ASC (Caspase recruitment domaincontaining protein 5, =kaspaz toplanma bölgesi bulunduran protein 5), DLC1 (deleted in liver cancer 1, = karaciğer kanserinde silinmiş 1)] ifadesinin hepatoselüler karsinogeneziste değişikliğe uğradığı gösterilmiştir (Farazi ve DePinho, 2006). Bunlar ile birlikte telomer kısalması, telomeraz aktivasyonu, kromozomların mitoz bölünme sırasında birbirlerinden ayrılması sırasında meydana gelen anormallikler ve DNA-hasarına yanıt yolaklarında bulunan genlerdeki allel kayıplarının hepatoselüler karsinogenezin moleküler patogenezine önemli katkılarının olduğu saptanmıştır (Farazi ve DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007). Hepatoselüler karsinomada en sık görülen kromozom mutasyonları, kromozomların kısa ve uzun kollarındaki artışlar (1q, 6p, 8q, 11q ve 17q) ve delesyonlardır (1p, 4q, 8p, 13q ve 17p) (Farazi ve DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007). Hepatoselüler karsinogeneziste 4 hücresel sinyal iletim yolağının (p53, Wnt/β-katenin, retinoblastoma, EGFR-RasMAPKK) bozulduğu gösterilmiştir (Farazi ve DePinho, 2006;, Akkız, 2007; ElSerag ve Rudolph, 2007). HSK’da genetik değişikliklerin bu denli zengin olmasının iki nedeni olabilir. Birincisi, klinik olarak HSK tanısı konulmadan önce çok sayıda genetik değişikliğin birikmesi gerekmektedir. Etiyolojik faktör ile ilk karşılaşma ve HSK gelişmesi arasındaki latent periyod oldukça uzundur. İkincisi ise değişik etiyolojik faktörler hepatosit içinde farklı genleri hedeflemekte ve değiştirmektedir. 136 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Etiyolojik sebeplerle ilişkili olarak gelişen genetik heterojenite bu tümörlerin fenotipik heterojenitesi ile sonuçlanmaktadır (Farazi ve DePinho, 2006; Akkız, 2007) Yukarıda anlatıldığı gibi hepatoselüler karsinogenezis sürecinde çevresel ve genetiksel risk faktörleri önemli rol oynamaktadırlar. Yapılan çalışmalar çok açık bir şekilde göstermektedir ki aynı çevresel risk faktörlerine maruz kalan bireylerin hepsinde hepatoselüler kanser gelişmemektedir. Bununla birlikte hepatoselüler kanser için genetik risk faktörlerini taşıyan her bireyde de hepatoselüler kanser oluşmamaktadır (Farazi ve DePinho, 2006). Ancak çevresel ve genetiksel risk faktörlerin ikisine birden maruz kalan bireylerde hepatoselüler kanser oluşumunun oldukça artmış olduğu bildirilmektedir (Şekil 5.5.) (Dragani, 2010). Bizim sonuçlarımız, hepatoselüler karsinoma için çevresel risk faktörleri ile karşılaşan (hepatit B, hepatit C ve alkol gibi) veya karşılaşmayan ama sonuç olarak hepatoselüler kanser gelişen hastalarımızda hepatoselüler karsinogenezise katkıda bulunan metabolik karaciğer hastalıkları ile ilişkili kalıtsal mutasyonların, diğer başka aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların, bunun yanında somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin bizim çalışmış olduğumuz hastalarda hepatoselüler kanser gelişimine neden olabileceğini göstermektedir. Bu yüzden metabolik karaciğer hastalıkları ile ilişkili kalıtsal mutasyonların ve hepatoselüler karsinoma için fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların, bunun yanında hepatoselüler karsinogenezise katkıda bulunabilecek somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin araştırılması gerekmektedir. Çünkü toplum içerisinde genin işlevini veya ifadesini bozan böylece kansere yakalanma riskini artıran kalıtsal mutasyonların belirlenmesi ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması, bunların hepatoselüler karsinogenezis ile ilişkisinin anlaşılması, tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve önceden önleyici tedbirlerin alınması bakımından oldukça önemlidir. 137 5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM Çevresel Faktörler (HBV, HCV, Alkol) HSK için yüksek genetik risk taşıyan bireylerinde bulunduğu genel populasyon Şekil 5.5. HSK gelişen bireyler Hepatoselüler Karsinomaya Bireysel Yatkınlık Modeli. Genel populasyonda nadir sendromları (monogenik durum) veya yatkınlık allellerini kombine (poligenik durum) olarak taşıyan bireyler HSK için yüksek genetik riske sahiptir. Farklı renkler ile gösterilen bireyler HSK için farklı genetik yatkınlığa sahip (monogenik veya poligenik) bireyleri göstermektedir. Bu durum hepatosellüller kanser için genetik heterojenite modelidir (sol taraf). Hepatoselüler kanser için genetik yatkınlığı bulunan veya bulunmayan bireyler hepatoselüler kanser için çevresel risk faktörlerine (hepatit virüs infeksiyonları, alkol tüketimi vb.) maruz kalabilirler ve bu durumda hepatoselüler karsinoma gelişir (sağ taraf). 138 6. SONUÇ ve ÖNERİLER Süleyman BAYRAM 6. SONUÇ ve ÖNERİLER Bu çalışmada, Türk populasyonundan kolorektal kanserli, hepatoselüler kanserli ve herhangi bir kanser tanısı almamış toplam 821 bireyin hiçbirinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Bu sonuç CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda bulunmadığını veya çok az bir sıklıkta bulanabileceğini göstermektedir. Bu bilgiler çerçevesinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda hepatoselüler kanser ve kolorektal kanser oluşum üzerine herhangi bir etkilerinin olmadığı belirlenmiştir. Bu yüzden bu mutasyonların Türk populasyonunda klinik bir test olarak taranmalarının bir faydasının olmayacağı açıktır. Fakat daha kesin bir yargıya varabilmek için Türk populasyonundan daha çok sayıda hepatoselüler kanserli, kolorektal kanserli ve sağlıklı bireyin yer aldığı ileri çalışmalara gerek vardır. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları populasyonlar arasında farklılıklar göstermektedir. Bu yüzden farklı populasyonlarda aynı kanser türünün oluşumu üzerine bu mutasyonların etkileri farklı olabilir. Daha önce herhangi bir populasyonda bu mutasyonların hepatoselüler kanser oluşumu üzerine etkileri araştırılmamıştır. Bu yüzden bu kalıtsal CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler karsinogenezis üzerine etkilerinin daha net bir şekilde belirlenmesi için bu mutasyonların frekanslarının yüksek olduğu Kuzey Avrupa populasyonu gibi ve/veya hepatoselüler kanserin endemik olduğu populasyonlardan daha çok sayıda hepatoselüler kanserli hastaların katıldığı ileri çalışmalara da gerek duyulmaktadır. Ayrıca bizim hastalarda CHEK2 gen mutasyonu belirleyemediğimiz için bu hastalarda hepatoselüler ve kolorektal kanser gelişmesinin başka nedenleri olduğu görüşündeyiz. Bu sebeple daha önce kanser oluşumundan sorumlu olduğu belirlenen kalıtsal mutasyonların ve fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların, bunun yanında somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin bu hastalarda kolorektal ve hepatoselüler kanser gelişimine neden olmuş olabileceğini göstermektedir. Bu yüzden daha önce belirlenmiş kalıtsal 139 6. SONUÇ ve ÖNERİLER Süleyman BAYRAM mutasyonların ve fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların bunun yanında kolorektal ve hepatoselüler karsinogenezise katkıda bulunabilecek somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin araştırılması gerekmektedir. Çünkü toplum içerisinde genin işlevini veya ifadesini bozan böylece kansere yakalanma riskini artıran kalıtsal mutasyonların belirlenmesi ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması, kolorektal ve hepatoselüler karsinogenezis ile ilişkilerinin anlaşılması tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve önceden önleyici tedbirlerin alınması bakımından oldukça önemlidir. 140 KAYNAKLAR AARSAND, A.K., BOMAN, H. and SANDBERG, S., 2009. Familial and sporadic porphyria cutanea tarda: characterization and diagnostic strategies. Clin. Chem., 55:795–803. AHN, J., URIST, M. and PRIVES, C., 2004. The Chk2 protein kinase. DNA Repair (Amst), 3(8-9):1039-1047. AKKIZ, H., 2007. Hepatoselüler Karsinomanın Moleküler Patogenezi. Türkiye Klinikleri J. Int. Med. Sci., 3(34):32-7 , 2009a. Kolorektal Kanserin Gelişmesinde Çevresel Risk Faktörleri. Türkiye Klinikleri J. Med. Oncol-Special Topics 2(3):1-4. , 2009b. Kolorektal Karsinomanın Moleküler Patogenezi. Türkiye Klinikleri J. Med. Oncol-Special Topics 2(3):5-12. ALEXANDER, J. and KOWDLEY, K.V., 2009. HFE-associated hereditary hemochromatosis. Genet. Med., 11:307–313. ALLEN, J. B., ZHOU, Z., SIEDE, W., FRIEDBERG, E. C. and ELLEDGE, S. J., 1994. The SAD1/RAD53 protein kinase controls multiple checkpoints and DNA damage-induced transcription in yeast. Genes Dev., 8: 2401–2415. ALLINEN, M., HUUSKO, P., MÄNTYNIEMI, S., LAUNONEN, V., WINQVIST, R., 2001. Mutation analysis of the CHK2 gene in families with hereditary breast cancer. Br. J. Cancer, 85(2):209-12. ANDANT, C., PUY, H., BOGARD, C., FAIVRE, J., SOULE, J.C., NORDMANN, Y. and DEYBACH, J.C., 2000. Hepatocellular carcinoma in patients with acute hepatic porphyria: frequency of occurrence and related factors. J. Hepatol., 32:933–939. ANTONI, L., SODHA, N., COLLINS, I. and GARRETT, M.D., 2007. CHEK2 kinase: cancer susceptibility and cancer therapy-two side of the same coin?. Nat. Rev. Cancer., 7:925-936. BAEYENS, A., CLAES, K., WILLEMS, P., DE RUYCK, K., THIERENS, H. and VRAL, A., 2005. Chromosomal radiosensitivity of breast cancer with a CHEK2 mutation. Cancer Genet. Cytogenet., 163(2):106-112. 141 BARTEK, J., FALCK, J. and LUKAS, J., 2001. CHK2 kinase--a busy messenger. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2(12):877-886. BARTEK, J. and LUKAS, J., 2003. Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer. Cancer Cell., 3(5):421-9. BARTEK, J. and LUKAS, J., 2007. DNA damage checkpoints: from initiation to recovery or adaptation. Curr. Opin. Cell. Biol. 19(2):238-45. BARTKOVA, J., HOREJSÍ, Z., KOED, K., KRÄMER, A., TORT, F., ZIEGER, K., GULDBERG, P., SEHESTED, M., NESLAND, J. M., LUKAS, C., ØRNTOFT, T., LUKAS, J. and BARTEK, J., 2005. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature, 434:864–870. BARTSCH, D. K., KRYSEWSKI, K., SINA-FREY, M., FENDRICH, V., RIEDER, H., LANGER, P., KRESS, R., SCHNEIDER, M., HAHN, S.A. and SLATER, E.P., 2006. Low frequency of CHEK2 mutations in familial pancreatic cancer. Fam. Cancer, 5(4):305-308. BLASINA, A., de WEYER, I. V., LAUS, M.C., LUYTEN, W.H., PARKER, A.E. and McGOWAN, C.H., 1999. A human homologue of the checkpoint kinase Cds1 directly inhibits Cdc25 phosphatase. Curr. Biol., 1:1–10. BELL, D. W., KIM, S. H., GODWIN, A. K., SCHIRIPO, T. A., HARRIS, P. L., HASERLAT, S. M., WAHRER, D. C., HAIMAN, C. A., DALY, M. B., NIENDORF, K. B., SMITH, M. R., SGROI, D. C., GARBER, J. E., OLOPADE, O. I., LE MARCHAND, L., HENDERSON, B. E., ALTSHULER, D., HABER, D. A. and FREEDMAN, M. L., 2007. Genetic and functional analysis of CHEK2 (CHK2) variants in multiethnic cohorts. Int. J. Cancer, 121(12):2661-2667. BERNSTEIN, J. L., TERAOKA, S. N., JOHN, E. M., ANDRULIS, I. L., KNIGHT, J. A., LAPINSKI, R., OLSON, E. R., WOLITZER, A. L., SEMINARA, D., WHITTEMORE, A. S. and CONCANNON, P., 2006. The CHEK2*1100delC allelic variant and risk of breast cancer: screening results from the Breast Cancer Family Registry. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 15(2):348-352. 142 BOGDANOVA, N., ENSSEN-DUBROWINSKAJA, N., FESHCHENKO, S., LAZJUK, G. I., ROGOV, Y. I., DAMMANN, O., BREMER, M., KARSTENS, J. H., SOHN, C. and DÖRK, T., 2005. Association of two mutations in the CHEK2 gene with breast cancer. Int. J. Cancer, 116(2):263-266. BOGDANOVA, N., FESHCHENKO, S., CYBULSKI, C. and DÖRK, T., 2007 CHEK2 mutation and hereditary breast cancer. J. Clin. Oncol., 25(19):e26. BRADBURY, J. M. and JACKSON, S. P. 2003., The complex matter of DNA double-strand break detection. Biochem. Soc. Trans., 31:40–44. BRENNAN, P., McKAY, J., MOORE, L., ZARIDZE, D., MUKERIA, A., SZESZENIA-DABROWSKA, N., LISSOWSKA, J., RUDNAI, P., FABIANOVA, E., MATES, D., BENCKO, V., FORETOVA, L., JANOUT, V., CHOW, W. H., ROTHMAN, N., CHABRIER, A., GABORIEAU, V., ODEFREY, F., SOUTHEY, M., HASHIBE, M., HALL, J., BOFFETTA, P., PETO, J., PETO, R. and HUNG, R. J., 2007. Uncommon CHEK2 mis-sense variant and reduced risk of tobacco-related cancers: case control study. Hum. Mol. Genet., 16(15):1794-1801. BROEKS, A., DE WITTE, L., NOOIJEN, A., HUSEINOVIC, A., KLIJN, J. G., VAN LEEUWEN, F. E., RUSSELL, N. S. and VAN'T VEER, L. J., 2004. Excess risk for contralateral breast cancer in CHEK2*1100delC germline mutation carriers. Breast Cancer Res. Treat., 83(1):91-93. BURT, R.W., DiSARIO, J.A. and CANNON-ALBRIGHT, L., 1995. Genetics of colon cancer: impact of inheritance on colon cancer risk. Annu. Rev. Med., 46:371-9. CALIGO, M. A., AGATA, S., ACETO, G., CRUCIANELLI, R., MANOUKIAN, S., PEISSEL, B., SCAINI, M. C., SENSI, E., VESCHI, S., CAMA, A., RADICE, P., VIEL, A., D'ANDREA, E. and MONTAGNA, M., 2004. The CHEK2 c.1100delC mutation plays an irrelevant role in breast cancer predisposition in Italy. Hum. Mutat., 24(1):100-101. 143 CENTER, M.M., JEMAL, A. and WARD, E., 2009a. International trends in colorectal cancer incidence rates. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.,18:1688–1694. CENTER, M.M., JEMAL, A., SMITH, R.A. and WARD, E., 2009b. Worldwide variations in colorectal cancer. C.A. Cancer J. Clin. 59(6):366-78. CHATURVEDI, P., ENG, W. K., ZHU, Y., MATTERN, M. R., MISHRA, R., HURLE, M. R., ZHANG, X., ANNAN, R. S., LU, Q., FAUCETTE, L. F., SCOTT, G. F., LI, X., CARR, S. A., JOHNSON, R. K., WINKLER, J. D. and ZHOU, B. B., 1999. Mammalian Chk2 is a downstream effector of the ATMdependent DNA damage checkpoint pathway. Oncogene, 18:4047–4054. CHEK2 BREAST CANCER CASE-CONTROL CONSORTIUM., 2004. CHEK2*1100delC and susceptibility to breast cancer: a collaborative analysis involving 10860 breast cancer cases and 9065 controls from 10 studies. Am. J. Hum. Genet., 74(6):1175-1182. CHEKMARIOVA, E. V., SOKOLENKO, A. P., BUSLOV, K. G., IYEVLEVA, A. G., ULIBINA, Y. M., ROZANOV, M. E., MITIUSHKINA, N. V., TOGO, A. V., MATSKO, D. E., VOSKRESENSKIY, D. A., CHAGUNAVA, O. L., DEVILEE, P., CORNELISSE, C., SEMIGLAZOV, V. F. and IMYANITOV, E. N., 2006. CHEK2 1100delC mutation is frequent among Russian breast cancer patients. Breast Cancer Res. Treat., 100(1):99-102. CHEN, W., YURONG, S. and LIANSHENG, N., 2008. Breast cancer lowpenetrance allele 1100delC in the CHEK2 gene: not present in the Chinese familial breast cancer population. Adv. Ther., 25(5):496-501. CHOI, D. H., CHO, D. Y., LEE, M. H., PARK, H. S., AHN, S. H., SON, B. H. and HAFFTY, B. G., 2008. The CHEK2 1100delC mutation is not present in Korean patients with breast cancer cases tested for BRCA1 and BRCA2 mutation. Breast Cancer Res. Treat., 112(3):569-73. CHUNG, D.C. and RUSTGI, A.K., 2003. The hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: genetics and clinical implications. Ann. Intern. Med. 138(7):560-70. 144 CYBULSKI, C., HUZARSKI, T., GÓRSKI, B., MASOJĆ, B., MIERZEJEWSKI, M., DEBNIAK, T., GLINIEWICZ, B., MATYJASIK, J., ZŁOWOCKA, E., KURZAWSKI, G., SIKORSKI, A., POSMYK, M., SZWIEC, M., CZAJKA, R., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J. 2004a., A novel founder CHEK2 mutation is associated with increased prostate cancer risk. Cancer Res., 64(8):2677-2679. CYBULSKI, C., GÓRSKI, B., HUZARSKI, T., MASOJĆ, B., MIERZEJEWSKI, M., DEBNIAK, T., TEODORCZYK, U., BYRSKI, T., GRONWALD, J., MATYJASIK, J., ZLOWOCKA, E., LENNER, M., GRABOWSKA, E., NEJ, K., CASTANEDA, J., MEDREK, K., SZYMAŃSKA, A., SZYMAŃSKA, J., KURZAWSKI, G., SUCHY, J., OSZUREK, O., WITEK, A., NAROD, S. A., LUBIŃSKI, J., 2004b. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene, Am. J. Hum. Genet., 75(6):1131-1135. CYBULSKI, C., GÓRSKI, B., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GRONWALD, J., DEBNIAK, T., WOKOLORCZYK, D., JAKUBOWSKA, A., KOWALSKA, E., OSZUREK, O., NAROD, S. A. and LUBINSKI, J., 2006a. CHEK2positive breast cancers in young Polish women. Clin. Cancer Res., 12(16):4832-4835. CYBULSKI, C., WOKOŁORCZYK, GRONWALD, J., GÓRSKI, D., HUZARSKI, B., DEBNIAK, T., T., BYRSKI, T., MASOJĆ, B., JAKUBOWSKA, A., GLINIEWICZ, B., SIKORSKI, A., STAWICKA, M., GODLEWSKI, D., KWIAS, Z., ANTCZAK, A., KRAJKA, K., LAUER, W., SOSNOWSKI, M., SIKORSKA-RADEK, P., BAR, K., KLIJER, R., ZDROJOWY, R., MAŁKIEWICZ, B., BORKOWSKI, A., BORKOWSKI, T., SZWIEC, M., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2006b. A large germline deletion in the Chek2 kinase gene is associated with an increased risk of prostate cancer. J. Med. Genet., 43(11):863-866. CYBULSKI, C., WOKOŁORCZYK, GRONWALD, J., GÓRSKI, D., HUZARSKI, B., DEBNIAK, T., T., BYRSKI, T., MASOJĆ, B., JAKUBOWSKA, A., VAN DE WETERING, T., NAROD, S. A. and 145 LUBIŃSKI, J., 2007. A deletion in CHEK2 of 5,395 bp predisposes to breast cancer in Poland. Breast Cancer Res. Treat., 102(1):119-22. CYBULSKI, C., MASOJC, B., OSZUTOWSKA, D., JAWOROWSKA, E., GRODZKI, T., WALOSZCZYK, P., SERWATOWSKI, P., PANKOWSKI, J., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GÓRSKI, B., JAKUBOWSKA, A., DEBNIAK, T., WOKOLORCZYK, D., GRONWALD, J., TARNOWSKA, C., SERRANO-FERNÁNDEZ, P., LUBINSKI, J. and NAROD, S. A., 2008. Constitutional CHEK2 mutations are associated with a decreased risk of lung and laryngeal cancers. Carcinogenesis, 29(4):762-765. CYBULSKI, C., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GRONWALD, J., DEBNIAK, T., JAKUBOWSKA, A., GÓRSKI, B., WOKOŁORCZYK, D., MASOJĆ, B., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2009. Estrogen receptor status in CHEK2positive breast cancers: implications for chemoprevention. Clin. Genet., 75(1):72-8. de BOCK, G. H., SCHUTTE, M., KROL-WARMERDAM, E. M., SEYNAEVE, C., BLOM, J., BREKELMANS, C. T., MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN ASPEREN, C. J., CORNELISSE, C. J., DEVILEE, P., TOLLENAAR, R. A. and KLIJN, J. G., 2004. Tumour characteristics and prognosis of breast cancer patients carrying the germline CHEK2*1100delC variant. J. Med. Genet., 41(10):731-735. de BOCK, G. H., MOURITS, M. J., SCHUTTE, M., KROL-WARMERDAM, E. M., SEYNAEVE, C., BLOM, J., BREKELMANS, C. T., MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN ASPEREN, C. J., CORNELISSE, C. J., DEVILEE, P., TOLLENAAR, R. A. and KLIJN, J. G., 2006. Association between the CHEK2*1100delC germ line mutation and estrogen receptor status. Int. J. Gynecol. Cancer, 16 (Suppl 2):552-555. de JONG, M. M., NOLTE, I. M., TE MEERMAN, G. J., VAN DER GRAAF, W. T., MULDER, M. J., VAN DER STEEGE, G., BRUINENBERG, M., SCHAAPVELD, M., NIESSEN, R. C., BERENDS, M. J., SIJMONS, R. H., HOFSTRA, R. M., DE VRIES, E. G. and KLEIBEUKER, J. H., 2005a. 146 Colorectal cancer and the CHEK2 1100delC mutation. Genes Chromosomes Cancer, 43(4):377-382. de JONG, M. M., NOLTE, I. M., TE MEERMAN, G. J., VAN DER GRAAF, W. T., OOSTEROM, E., BRUINENBERG, M., STEEGE, G., OOSTERWIJK, J. C., VAN DER HOUT, A. H., BOEZEN, H. M., SCHAAPVELD, M., KLEIBEUKER, J. H. and DE VRIES, E. G., 2005b. No increased susceptibility to breast cancer from combined CHEK2 1100delC genotype and the HLA class III region risk factors. Eur. J. Cancer, 41(12):1819-1823. de la CHAPELLE A., 2004. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat. Rev. Cancer. 4(10):769-80. DEBNIAK, T., SCOTT, R. J., GÓRSKI, B., CYBULSKI, C., VAN DE WETERING, T., SERRANO-FERNANDEZ, P., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., NAGAY, L., DEBNIAK, B., KOWALSKA, E., JAKUBOWSKA, A., GRONWALD, J., WOKOLORCZYK, D., MALESZKA, R., KŁADNY, J. and LUBINSKI, J., 2008. Common variants of DNA repair genes and malignant melanoma. Eur. J. Cancer, 44(1):110-114. DJUREINOVIC, T., LINDBLOM, A., DALÉN, J., DEDORSON, S., EDLER, D., HJERN, F., HOLM, J., LENANDER, C., LINDFORSS, U., LUNDQVIST, N., OLIVECRONA, H., OLSSON, L., PÅHLMAN, L., RUTEGÅRD, J., SMEDH, K., TÖRNQVIST, A., EIBERG, H. and BISGAARD, M. L., 2006. The CHEK2 1100delC variant in Swedish colorectal cancer. Anticancer Res., 26(6C):4885-8. DONG, X., WANG, L., TANIGUCHI, K., WANG, X., CUNNINGHAM, J. M., MCDONNELL, S. K., QIAN, C., MARKS, A. F., SLAGER, S. L., PETERSON, B. J., SMITH, D. I., CHEVILLE, J. C., BLUTE, M. L., JACOBSEN, S. J., SCHAID, D. J., TINDALL, D. J., THIBODEAU, S. N. and LIU, W., 2003. Mutations in CHEK2 associated with prostate cancer risk. Am. J. Hum. Genet. 72(2):270-280 DRAGANI, T.A., 2010. Risk of HCC: Genetic heterogeneity and complex genetics. J. Hepatol., 52: 252-257. 147 DUFAULT, M. R., BETZ, B., WAPPENSCHMIDT, B., HOFMANN, W., BANDICK, K., GOLLA, A., PIETSCHMANN, A., NESTLE-KRÄMLING, C., RHIEM, K., HÜTTNER, C., VON LINDERN, C., DALL, P., KIECHLE, M., UNTCH, M., JONAT, W., MEINDL, A., SCHERNECK, S., NIEDERACHER, D., SCHMUTZLER, R. K. and ARNOLD, N., 2004. Limited relevance of the CHEK2 gene in hereditary breast cancer. Int. J. Cancer, 110(3):320-325. EINARSDÓTTIR, K., HUMPHREYS, K., BONNARD, C., PALMGREN, J., ILES, M. M., SJÖLANDER, A., LI, Y., CHIA, K. S., LIU, E. T., HALL, P., LIU, J. and WEDRÉN, S., 2006. Linkage disequilibrium mapping of CHEK2: common variation and breast cancer risk. PLoS Med. 3(6):e168. EL HALLANI, S., BOISSELIER, B., MARIE, Y., PARIS, S., IDBAIH, A., CARPENTIER, C., HOANG-XUAN, K., DELATTRE, J. Y. and SANSON, M., 2009. TP53 mutations but no CHEK2 *1100DelC variant in familial gliomas. Cancer Genet. Cytogenet., 188(2):126-8. El-SERAG, H.B. and RUDOLPH, K.L., 2007. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology, 132(7):2557-76. FAIRBANKS, K.D. and TAVILL A.S., 2008. Liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency: a review. Am. J. Gastroenterol., 103:2136–2141. FALCHETTI, M., LUPI, R., RIZZOLO, P., CECCARELLI, K., ZANNA, I., CALÒ, V., TOMMASI, S., MASALA, G., PARADISO, A., GULINO, A., GIANNINI, G., RUSSO, A., PALLI, D. and OTTINI, L., 2008. BRCA1/BRCA2 rearrangements and CHEK2 common mutations are infrequent in Italian male breast cancer cases. Breast Cancer Res. Treat., 110(1):161-7. FALCK, J., LUKAS, C., PROTOPOPKOVA, M., LUKAS, J., SELIVANOVA, G. and BARTEK J., 2001a. Functional impact of concomitant versus alternative defects in the Chk2-p53 tumour suppressor pathway. Oncogene, 20:5503– 5510. 148 FALCK, J., MAILAND, N., SYLJUÅSEN, R. G., BARTEK, J. and LUKAS, J., 2001b. The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. Nature, 410:842–847. FARAZI, P.A. and DePINHO, R.A., 2006. Hepatocellular carcinoma pathogenesis: from genes to environment. Nat. Rev. Cancer, 6(9):674-87. FRIEDRICHSEN, D. M., MALONE, K. E., DOODY, D. R., DALING, J. R. and OSTRANDER, E. A., 2004. Frequency of CHEK2 mutations in a population based, case-control study of breast cancer in young women. Breast Cancer Res.;6(6):R629-635. GIOVANNUCCI, E., 2002. Modifiable risk factors for colon cancer. Gastroenterol. Clin. North Am., 31(4):925-43. GONZÁLEZ-HORMAZÁBAL, P., CASTRO, V. G., BLANCO, R., GÓMEZ, F., PERALTA, O., WAUGH, E., BRAVO, T., REYES, J. M. and JARA, L., 2008. Absence of CHEK2 1100delC mutation in familial breast cancer cases from a South American population. Breast Cancer Res. Treat. 110(3):543-54. GORGOULIS, V. G., VASSILIOU, L. V., KARAKAIDOS, P., ZACHARATOS, P., KOTSINAS, A., LILOGLOU, T., VENERE, M., DITULLIO RA, J. R., KASTRINAKIS, N. G., LEVY, B., KLETSAS, D., YONETA, A., HERLYN, M., KITTAS, C. and HALAZONETIS, T. D., 2005. Activation of the DNA damage checkpoint and genomic instability in human precancerous lesions. Nature, 434:907–913. GÓRSKI, B., CYBULSKI, C., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GRONWALD, J., JAKUBOWSKA, A., STAWICKA, M., GOZDECKA-GRODECKA, S., SZWIEC, M., URBAŃSKI, K., MITUŚ, J., MARCZYK, E., DZIUBA, J., WANDZEL, P., SURDYKA, D., HAUS, O., JANISZEWSKA, H., DEBNIAK, T., TOŁOCZKO-GRABAREK, A., MEDREK, K., MASOJĆ, B., MIERZEJEWSKI, M., KOWALSKA, E., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2005 Breast cancer predisposing alleles in Poland. Breast Cancer Res. Treat. 92(1):19-24. HOEIJMAKERS, J. H., 2001. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature, 411:366–374. 149 HUANG, J., DOMCHEK, S. M., BROSE, M. S., REBBECK, T. R., NATHANSON, K. L. and WEBER, B. L., 2004. Germline CHEK2*1100delC mutations in breast cancer patients with multiple primary cancers. J. Med. Genet. 41(11):e120. HUXLEY, R., 2007. The role of lifestyle risk factors on mortality from colorectal cancer in populations of the Asia-Pacific region. Asian Pac. J. Cancer Prev., 8(2):191-8. HUZARSKI, T., CYBULSKI, C., DOMAGAŁA, W., GRONWALD, J., BYRSKI, T., SZWIEC, M., WOYKE, S., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2005. Pathology of breast cancer in women with constitutional CHEK2 mutations. Breast Cancer Res. Treat. 90(2):187-189. ISINGER, A., BHAT, M., BORG, A. and NILBERT, M., 2006. CHEK2 1100delC in patients with metachronous cancers of the breast and the colorectum. BMC Cancer, 6:64. JANECKE, A.R., MAYATEPEK, E. and UTERMANN, G., 2001. Molecular genetics of type 1 glycogen storage disease. Mol. Genet. Metab., 73:117–125. JEKIMOVS, C. R., CHEN, X., ARNOLD, J., GATEI, M., RICHARD, D. J., SPURDLE, A. B., KHANNA, K. K., CHENEVIX-TRENCH, G. and kConFab Investigators., 2005. Low frequency of CHEK2 1100delC allele in Australian multiple-case breast cancer families: functional analysis in heterozygous individuals. Br. J. Cancer, 92(4):784-790. JO, W.S. and CHUNG, D.C., 2005. Genetics of hereditary colorectal cancer. Semin. Oncol., 32(1):11-23. KILPIVAARA, O., LAIHO, P., AALTONEN, L. A. and NEVANLINNA, H., 2003. CHEK2 1100delC and colorectal cancer. J. Med. Genet., 40(10):e110. KILPIVAARA, O., VAHTERISTO, P., FALCK, J., SYRJÄKOSKI, K., EEROLA, H., EASTON, D., BARTKOVA, J., LUKAS, J., HEIKKILÄ, P., AITTOMÄKI, K., HOLLI, K., BLOMQVIST, C., KALLIONIEMI, O. P., BARTEK, J. and NEVANLINNA, H. 2004., CHEK2 variant I157T may be associated with increased breast cancer risk. Int. J. Cancer, 111(4):543-547. 150 KILPIVAARA, O., BARTKOVA, J., EEROLA, H., SYRJÄKOSKI, K., VAHTERISTO, P., LUKAS, J., BLOMQVIST, C., HOLLI, K., HEIKKILÄ, P., SAUTER, G., KALLIONIEMI, O. P., BARTEK, J. and NEVANLINNA, H., 2005. Correlation of CHEK2 protein expression and c.1100delC mutation status with tumor characteristics among unselected breast cancer patients. Int. J. Cancer, 113(4):575-580. KILPIVAARA, O., ALHOPURO, P., VAHTERISTO, P., AALTONEN, L. A., and NEVANLINNA, H., 2006. CHEK2 I157T associates with familial and sporadic colorectal cancer. J. Med. Genet., 43(7):e34. KLEIBL, Z., NOVOTNY, J., BEZDICKOVA, D., MALIK, R., KLEIBLOVA, P., FORETOVA, L., PETRUZELKA, L., ILENCIKOVA, D., CINEK, P. and POHLREICH, P., 2005. The CHEK2 c.1100delC germline mutation rarely contributes to breast cancer development in the Czech Republic. Breast Cancer Res. Treat., 90(2):165-167. KLEIBL, Z., HAVRANEK, O., HLAVATA, I., NOVOTNY, J., SEVCIK, J., POHLREICH, P. and SOUCEK P., 2009. The CHEK2 gene I157T mutation and other alterations in its proximity increase the risk of sporadic colorectal cancer in the Czech population. Eur. J. Cancer, 45(4):618-624. KONSTANTINOVA, D. V., KADIYSKA, T. K., KANEVA, R. P., TOSHEVA, E. G., GUSEVA, V. T., DIMITROV, B. H., DIMITROV, R. G., DOGANOV, N. I., IVANOV, S. I., KREMENSKY, I. M. and MITEV, V. I., 2008. CHEK2 I157T and Endometrial Cancer. DNA Cell Biol., doi:10.1089/dna.2008.0781. KOPPERT, L. B., SCHUTTE, M., ABBOU, M., TILANUS, H. W. and DINJENS, W. N., 2004. The CHEK2(*)1100delC mutation has no major contribution in oesophageal carcinogenesis. Br. J. Cancer, 90(4):888-891. LEE, J. S., COLLINS, K. M., BROWN, A. L., LEE, C. H. and CHUNG, J. H., 2000. hCds1-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response. Nature, 404:201–204. LI, J., WILLIAMS, B. L., HAIRE, L. F., GOLDBERG, M., WILKER, E., DUROCHER, D., YAFFE, M. B., JACKSON, S. P., SMERDON, S. J., 2002. 151 Structural and functional versatility of the FHA domain in DNA-damage signaling by the tumor suppressor kinase Chk2. Mol. Cell., 9:1045–1054. LIN, O.S., 2009. Acquired risk factors for colorectal cancer. Methods Mol. Biol., 472:361-72. LIPTON, L., FLEISCHMANN, C., SIEBER, O. M., THOMAS, H. J., HODGSON, S. V., TOMLINSON, I. P. and HOULSTON, R. S., 2003. Contribution of the CHEK2 1100delC variant to risk of multiple colorectal adenoma and carcinoma. Cancer Lett., 200(2):149-152. LLOVET, J.M. and BRUIX, J., 2008. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 48(4):1312-27. LYNCH, H.T., SMYRK, T.C., WATSON, P., LANSPA, S.J., LYNCH, J.F., LYNCH, P.M., CAVALIERI, R.J. and BOLAND, C.R., 1993. Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer: an updated review. Gastroenterology, 104(5):1535-49. LYNCH, H.T. and de la CHAPELLE, A., 2003. Hereditary colorectal cancer. N. Engl. J. Med. 348(10):919-32. MARCHAND, L.L., 1999. Combined influence of genetic and dietary factors on colorectal cancer incidence in Japanese Americans. J. Natl. Cancer Inst. Monogr.,26:101-5. MARGOLIN, S., EIBERG, H., LINDBLOM, A. and BISGAARD, M. L., 2007. CHEK2 1100delC is prevalent in Swedish early onset familial breast cancer. BMC Cancer, 7:163. MARKOWITZ, S.D. and BERTAGNOLLI, M.M., 2009. Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer. N. Engl. J. Med., 361(25):244960. MARTINEZ-BOUZAS, C., BERISTAIN, E., GUERRA, I., GOROSTIAGA, J., MENDIZABAL, J. L., DE-PABLO, J. L., GARCÍA-ALEGRÍA, E., SANZPARRA, A. and TEJADA, M. I., 2007. CHEK2 1100delC is present in familial breast cancer cases of the Basque Country. Breast Cancer Res. Treat., 103(1):111-113. 152 MATEUS PEREIRA, L. H., SIGURDSON, A. J., DOODY, M. M., PINEDA, M. A., ALEXANDER, B. H., GREENE, M. H. and STRUEWING, J. P., 2004. CHEK2:1100delC and female breast cancer in the United States. Int. J. Cancer, 112(3):541-543 MATSUOKA, S., HUANG, M. and ELLEDGE, S. J., 1998. Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science, 282:1893–1897. McINERNEY, N. M., MILLER, N., ROWAN, A., COLLERAN, G., BARCLAY, E., CURRAN, C., KERIN, M. J., TOMLINSON, I. P. and SAWYER, E., 2009. Evaluation of variants in the CHEK2, BRIP1 and PALB2 genes in an Irish breast cancer cohort. Breast Cancer Res. Treat., doi: 10.1007/s10549-0090540-9. MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN DEN OUWELAND, A., KLIJN, J., WASIELEWSKI, M., DE SNOO, A., OLDENBURG, R., HOLLESTELLE, A., HOUBEN, M., CREPIN, E., VAN VEGHEL-PLANDSOEN, M., ELSTRODT, F., VAN DUIJN, C., BARTELS, C., MEIJERS, C., SCHUTTE, M., McGUFFOG, L., THOMPSON, D., EASTON, D., SODHA, N., SEAL, S., BARFOOT, R., MANGION, J., CHANG-CLAUDE, J., ECCLES, D., EELES, R., EVANS, D. G., HOULSTON, R., MURDAY, V., NAROD, S., PERETZ, T., PETO, J., PHELAN, C., ZHANG, H. X., SZABO, C., DEVILEE, P., GOLDGAR, D., FUTREAL, P. A., NATHANSON, K. L., WEBER, B., RAHMAN, N., STRATTON, M. R. and CHEK2-BREAST CANCER CONSORTIUM, 2002. Low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2(*)1100delC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2 mutations. Nat. Genet., 31(1):55-59. MEIJERS-HEIJBOER, H., WIJNEN, J., VASEN, H., WASIELEWSKI, M., WAGNER, A., HOLLESTELLE, A., ELSTRODT, F., VAN DEN BOS, R., DE SNOO, A., FAT, G. T., BREKELMANS, C., JAGMOHAN, S., FRANKEN, P., VERKUIJLEN, P., VAN DEN OUWELAND, A., CHAPMAN, P., TOPS, C., MÖSLEIN, G., BURN, J., LYNCH, H., KLIJN, J., FODDE, R. and SCHUTTE, M., 2003. The CHEK2 1100delC mutation 153 identifies families with a hereditary breast and colorectal cancer phenotype. Am. J. Hum. Genet., 72(5):1308-1314. MELLEMKJAER, L., DAHL, C., OLSEN, J. H., BERTELSEN, L., GULDBERG, P., CHRISTENSEN, J., BØRRESEN-DALE, A. L., STOVALL, M., LANGHOLZ, B., BERNSTEIN, L., LYNCH, C. F., MALONE, K. E., HAILE, R. W., ANDERSSON, M., THOMAS, D. C., CONCANNON, P., CAPANU, M., BOICE, J. D. Jr., WECARE STUDY COLLABORATIVE GROUP, and BERNSTEIN, J. L., 2008. Risk for contralateral breast cancer among carriers of the CHEK2*1100delC mutation in the WECARE Study. Br. J. Cancer, 98(4):728-733. MURAKAMI, H. and OKAYAMA, H., 1995. A kinase from fission yeast responsible for blocking mitosis in S phase. Nature, 374:817–819. NEUHAUSEN, S., DUNNING, A., STEELE, L., YAKUMO, K., HOFFMAN, M., SZABO, C., TEE, L., BAINES, C., PHAROAH, P., GOLDGAR, D. and EASTON, D., 2004. Role of CHEK2*1100delC in unselected series of nonBRCA1/2 male breast cancers. Int. J. Cancer, 108(3):477-478. NIIDA, H. and NAKANISHI, M., 2006. DNA damage checkpoints in mammals, Mutagenesis, 21(1):3-9. OFFIT, K., PIERCE, H., KIRCHHOFF, T., KOLACHANA, P., RAPAPORT, B., GREGERSEN, P., JOHNSON, S., YOSSEPOWITCH, O., HUANG, H., SATAGOPAN, J., ROBSON, M., SCHEUER, L., NAFA, K. and ELLIS, N., 2003. Frequency of CHEK2*1100delC in New York breast cancer cases and controls. BMC Med. Genet., 4:1. OHAYON, T., GAL, I., BARUCH, R. G., SZABO, C. and FRIEDMAN, E., 2004. CHEK2*1100delC and male breast cancer risk in Israel. Int. J. Cancer, 108(3):479-480. OLDENBURG, R. A., KROEZE-JANSEMA, K., KRAAN, J., MORREAU, H., KLIJN, J. G., HOOGERBRUGGE, N., LIGTENBERG, M. J., VAN ASPEREN, C. J., VASEN, H. F., MEIJERS, C., MEIJERS-HEIJBOER, H., de BOCK, T. H., CORNELISSE, C. J. and DEVILEE, P., 2003. The 154 CHEK2*1100delC variant acts as a breast cancer risk modifier in nonBRCA1/BRCA2 multiple-case families. Cancer Res., 63(23):8153-8157. OSORIO, A., RODRIGUEZ-LÓPEZ, R., DIEZ, O., DE LA HOYA, M., IGNACIO MARTÍNEZ, J., VEGA, A., ESTEBAN-CARDEÑOSA, E., ALONSO, C., CALDÉS, T. and BENÍTEZ, J., 2004. The breast cancer low-penetrance allele 1100delC in the CHEK2 gene is not present in Spanish familial breast cancer population. Int. J. Cancer, 108(1):54-56. PANG, R.W. and POON, R.T., 2007. From molecular biology to targeted therapies for hepatocellular carcinoma: the future is now. Oncology, 72 (Suppl 1):3044. PARKIN, D.M., BRAY, F., FERLAY, J. and PISANI, P., 2005. Global cancer statistics, 2002. C.A. Cancer J. Clin.55:74–108. RAJKUMAR, T., SOUMITTRA, N., NANCY, N. K., SWAMINATHAN, R., SRIDEVI, V. and SHANTA, V., 2003. BRCA1, BRCA2 and CHEK2 (1100 del C) germline mutations in hereditary breast and ovarian cancer families in South India. Asian Pac. J. Cancer Prev., 4(3):203-208. RASHID, M. U., JAKUBOWSKA, A., JUSTENHOVEN, C., HARTH, V., PESCH, B., BAISCH, C., PIERL, C. B., BRÜNING, T., KO, Y., BENNER, A., WICHMANN, H. E., BRAUCH, H., HAMANN, U. and GENICA NETWORK, 2005. German populations with infrequent CHEK2*1100delC and minor associations with early-onset and familial breast cancer. Eur. J. Cancer, 41(18):2896-2903. ROCK, C.L., 1998. Nutritional factors in cancer prevention. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 12(5):975-91. ROTMAN, G. and SHILOH, Y., 1997. The ATM gene and protein:possible roles in genome surveillance, checkpoint controls and cellular defence against oxidative stres. Cancer Surv., 29:285–304. RUDD, M. F., SELLICK, G. S., WEBB, E. L., CATOVSKY, D. and HOULSTON, R. S., 2006. Variants in the ATM-BRCA2-CHEK2 axis predispose to chronic lymphocytic leukemia. Blood, 108(2):638-644. 155 RUIJS, M. W., BROEKS, A., MENKO, F. H., AUSEMS, M. G., WAGNER, A., OLDENBURG, R., MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN'T VEER, L. J. and VERHOEF, S., 2009. The contribution of CHEK2 to the TP53-negative LiFraumeni phenotype. Hered. Cancer Clin. Pract., 7(1):4. SÁNCHEZ DE ABAJO, A., DE LA HOYA, M., GODINO, J., FURIÓ, V., TOSAR, A., PÉREZ-SEGURA, P., DIAZ-RUBIO, E. and CALDÉS, T., 2005. The CHEK2 1100delC allele is not relevant for risk assessment in HNPCC and HBCC Spanish families. Fam. Cancer, 4(2):183-186. SCHMIDT, M. K., TOLLENAAR, R. A., DE KEMP, S. R., BROEKS, A., CORNELISSE, C. J., SMIT, V. T., PETERSE, J. L., VAN LEEUWEN, F. E., VAN'T VEER, L. J., 2007. Breast cancer survival and tumor characteristics in premenopausal women carrying the CHEK2*1100delC germline mutation. J. SCHUTTE, K., BORNSCHEIN, J. and MALFERTHEINER P., 2009. Hepatocellular carcinoma--epidemiological trends and risk factors. Dig. Dis., 27(2):80-92. SCHUTTE, M., SEAL, S., BARFOOT, R., MEIJERS-HEIJBOER, H., WASIELEWSKI, M., EVANS, D. G., ECCLES, D., MEIJERS, C., LOHMAN, F., KLIJN, J., VAN DEN OUWELAND, A., FUTREAL, P. A., NATHANSON, K. L., WEBER, B. L., EASTON, D. F., STRATTON, M. R., RAHMAN, N. and BREAST CANCER LINKAGE CONSORTIUM, 2003. Variants in CHEK2 other than 1100delC do not make a major contribution to breast cancer susceptibility. Am. J. Hum. Genet., 72(4):1023-1028. SCHWARZ, J. K., LOVLY, C. M. and PIWNICA-WORMS, H., 2003. Regulation of the Chk2 protein kinase by oligomerization-mediated cis- and transphosphorylation. Mol. Cancer. Res., 1:598–609. Clin. Oncol., 25(1):64-69. SCOTT, C.R., 2006. The genetic tyrosinemias. Am. J. Med. Genet. C. Semin. Med. Genet., 142C:121–126. SELLICK, G. S., SULLIVAN, K., CATOVSKY, D. and HOULSTON, R. S., 2006. CHEK2*1100delC and risk of chronic lymphocytic leukemia. Leuk. Lymphoma. 47(12):2659-2660. SEPPÄLÄ, E. H., IKONEN, T., MONONEN, N., AUTIO, V., RÖKMAN, A., MATIKAINEN, M. P., TAMMELA, T. L. and SCHLEUTKER, J., 2003. 156 CHEK2 variants associate with hereditary prostate cancer. Br. J. Cancer, 89(10):1966-1970. SIDDIQUI, R., ONEL, K., FACIO, F., NAFA, K., DIAZ, L. R., KAUFF, N., HUANG, H., ROBSON, M., ELLIS, N. and OFFIT, K., 2005. The TP53 mutational spectrum and frequency of CHEK2*1100delC in Li-Fraumeni-like kindreds. Fam. Cancer, 4(2):177-81. SKASKO, E., KLUSKA, A., NIWIŃSKA, A., KWIATKOWSKA, E., BAŁABAS, A., PIATKOWSKA, M., DABROWSKA, M., NOWAKOWSKA, D. and PIEŃKOWSKI, T., 2009. Age at onset of bilateral breast cancer, the presence of hereditary BRCA1, BRCA2, CHEK2 gene mutations and positive family history of cancer. Onkologie, 32(4):182-188. SODHA, N., BULLOCK, S., TAYLOR, R., MITCHELL, G., GUERTL-LACKNER, B., WILLIAMS, R. D., BEVAN, S., BISHOP, K., MCGUIRE, S., HOULSTON, R. S. and EELES, R. A., 2002. CHEK2 variants in susceptibility to breast cancer and evidence of retention of the wild type allele in tumours. Br. J. Cancer, 87(12):1445-1448. SODHA, N., WILSON, C., BULLOCK, S. L., PHILLIMORE, H., HOULSTON, R. S. and EELES, R. A., 2004. Analysis of familial male breast cancer for germline mutations in CHEK2. Cancer Lett., 215(2):187-189. SOKOLENKO, A. P., ROZANOV, M. E., MITIUSHKINA, N. V., SHERINA, N. Y., IYEVLEVA, A. G., CHEKMARIOVA, E. V., BUSLOV, K. G., SHILOV, E. S., TOGO, A. V., BIT-SAVA, E. M., VOSKRESENSKIY, D. A., CHAGUNAVA, O. L., DEVILEE, P., CORNELISSE, C., SEMIGLAZOV, V. F. and IMYANITOV, E. N., 2007. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia. Fam. Cancer, 6(3):281-286. SOREIDE, K., JANSSEN, E.A., SOILAND, H., KORNER, H. and BAAK, J.P., 2006. Microsatellite instability in colorectal cancer. Br. J. Surg., 93(4):395406. 157 SUCHY, J., CYBULSKI, C., WOKOŁORCZYK, D., OSZUREK, O., GÓRSKI, B., DĘBNIAK, T., JAKUBOWSKA, A., GRONWALD, J., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., DZIUBA, I., GOGACZ, M., WIŚNIOWSKI, R., WANDZEL, P., BANASZKIEWICZ, Z., KURZAWSKI, G., KŁADNY, J., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2009. CHEK2 mutations and HNPCC - related colorectal cancer. Int. J. Cancer, doi: 10.1002/ijc.25003 . SUSPITSIN, E. N., SHERINA, N. Y., PONOMARIOVA, D. N., SOKOLENKO, A. P., IYEVLEVA, A. G., GORODNOVA, T. V., ZAITSEVA, O. A., YATSUK, O. S., TOGO, A. V., TKACHENKO, N. N., SHIYANOV, G. A., LOBEIKO, O. S., KRYLOVA, N. Y., MATSKO, D. E., MAXIMOV, S. Y., URMANCHEYEVA, A. F., PORHANOVA, N. V. and IMYANITOV, E. N., 2009. High frequency of BRCA1, but not CHEK2 or NBS1 (NBN), founder mutations in Russian ovarian cancer patients. Hered. Cancer Clin. Pract. 7(1):5. SYRJÄKOSKI, K., KUUKASJÄRVI, T., AUVINEN, A. and KALLIONIEMI, O. P., 2004. CHEK2 1100delC is not a risk factor for male breast cancer population. Int. J. Cancer, 108(3):475-476. SZYMANSKA-PASTERNAK, J., SZYMANSKA, A., MEDREK, K., IMYANITOV, E. N., CYBULSKI, C., GORSKI, B., MAGNOWSKI, P., DZIUBA, I., GUGALA, K., DEBNIAK, B., GOZDZ, S., SOKOLENKO, A. P., KRYLOVA N. Y., LOBEIKO, O. S., NAROD, S. A. and LUBINSKI, J., 2006. CHEK2 variants predispose to benign, borderline and low-grade invasive ovarian tumors. Gynecol. Oncol., 102(3):429-431. TAN, Y., RAYCHAUDHURI, P. and COSTA, R. H., 2007. Chk2 mediates stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of DNA repair genes. Mol. Cell Biol., 27:1007–1016. THIRTHAGIRI, E., CHEONG, L. S., YIP, C. H. and TEO, S. H., 2009. CHEK2*1100delC does not contribute to risk to breast cancer among Malay, Chinese and Indians in Malaysia. Fam. Cancer, 8(4):355-358. THOMPSON, D., SEAL, S., SCHUTTE, M., McGUFFOG, L., BARFOOT, R., RENWICK, A., EELES, R., SODHA, N., HOULSTON, R., SHANLEY, S., 158 KLIJN, J., WASIELEWSKI, M., CHANG-CLAUDE, J., FUTREAL, P. A., WEBER, B. L., NATHANSON, K. L., STRATTON, M., MEIJERSHEIJBOER, H., RAHMAN, N. and EASTON, D. F., 2006. A multicenter study of cancer incidence in CHEK2 1100delC mutation carriers. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 15(12):2542-2545. THOMPSON, L. H. and SCHILD, D., 2002. Recombinational DNA repair and human disease. Mutat Res., 509:49–78. VAHTERISTO, P., BARTKOVA, J., EEROLA, H., SYRJÄKOSKI, K., OJALA, S., KILPIVAARA, O., TAMMINEN, A., KONONEN, J., AITTOMÄKI, K., HEIKKILÄ, P., HOLLI, K., BLOMQVIST, C., BARTEK, J., KALLIONIEMI, O. P. and NEVANLINNA, H., 2002. A CHEK2 genetic variant contributing to a substantial fraction of familial breast cancer. Am. J. Hum. Genet., 71(2):432-438. VOGELSTEIN, B., FEARON, E.R., HAMILTON, S.R., KERN, S.E., PREISINGER, A.C., LEPPERT, M., NAKAMURA, Y., WHITE, R., SMITS, A.M. and BOS, J.L., 1988. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N. Engl. J. Med., 319(9):525-32. WANG, H. C., CHOU, W. C., SHIEH, S. Y. and SHEN, C. Y., 2006a. Ataxia telangiectasia mutated and checkpoint kinase 2 regulate BRCA1 to promote the fidelity of DNA endjoining. Cancer Res., 66:1391–1400. WANG, H. C., CHOU, W. C., SHIEH, S. Y. and SHEN, C. Y., 2006b. Checkpoint kinase 2-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the fidelity of nonhomologous end-joining. Cancer Res., 66:1401–1408. WEISCHER, M., BOJESEN, S. E., TYBJAERG-HANSEN, A., AXELSSON, C. K. and NORDESTGAARD, B. G., 2007. Increased risk of breast cancer associated with CHEK2*1100delC. J. Clin. Oncol., 25(1):57-63. WEISCHER, M., BOJESEN, S. E., ELLERVIK, C., TYBJAERG-HANSEN, A. and NORDESTGAARD, B. G., 2008. CHEK2*1100delC genotyping for clinical assessment of breast cancer risk: meta-analyses of 26000 patient cases and 27000 controls. J. Clin. Oncol., 26(4):542-548. 159 WU, X., WEBSTER, S. R. and CHEN, J., 2001. Characterization of tumorassociated Chk2 mutations. J. Biol. Chem., 276:2971–2974. YAM, J.W., WONG, C.M. and NG, I.O., 2010. Molecular and functional genetics of hepatocellular carcinoma. Front. Biosci. (Schol Ed)., 2:117-34. ZHANG, J., WILLERS, H., FENG, Z., GHOSH, J. C., KIM, S., WEAVER, D. T., CHUNG, J. H., POWELL, S. N. and XIA, F., 2004. Chk2 phosphorylation of BRCA1 regulates DNA double-strand break repair. Mol. Cell Biol., 24:708– 718. ZHANG, S., PHELAN, C. M., ZHANG, P., ROUSSEAU, F., GHADIRIAN, P., ROBIDOUX, A., FOULKES, W., HAMEL, N., McCREADY, D., TRUDEAU, M., LYNCH, H., HORSMAN, D., DE MATSUDA, M. L., AZIZ, Z., GOMES, M., COSTA, M. M., LIEDE, A., POLL, A., SUN, P. and NAROD, S. A., 2008 Frequency of the CHEK2 1100delC mutation among women with breast cancer: an international study. Cancer Res., 68(7):21542157. ZHOU, B. B. and ELLEDGE, S. J., 2000. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. Nature, 408:433–439. ZHOU, B. B., ANDERSON, H. J. and ROBERGE, M., 2003. Targeting DNA checkpoint kinases in cancer therapy. Cancer Biol. Ther. 2:S16–S22. ZŁOWOCKA, E., CYBULSKI, C., GÓRSKI, B., DEBNIAK, T., SŁOJEWSKI, M., WOKOŁORCZYK, D., SERRANO-FERNÁNDEZ, P., MATYJASIK, J., VAN DE WETERING, T., SIKORSKI, A., SCOTT, R. J. and LUBIŃSKI, J., 2008. Germline mutations in the CHEK2 kinase gene are associated with an increased risk of bladder cancer. Int. J. Cancer, 122(3):583-586. 160 ÖZGEÇMİŞ 1981 yılında Adana’da doğdu. İlk, orta, lise eğitimini bu ilde tamamladı. 1999 yılında Çukurova Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümünde öğrenimine başladı ve 2003 yılında Biyolog ünvanıyla mezun oldu. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisans öğrenimine başladı. 2005 yılında “Lamivudin’in İnsan Periferal Lenfositlerinde In Vitro Genotoksik Etkileri” adlı Yüksek Lisans tezini tamamladı. 2006 yılında Çukurova Üniversitesi. Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında doktora öğrenimine ve araştırma görevlisi olarak çalışmaya başladı. 13.09.2004 tarihinden itibaren Ç. Ü. Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Gastroenteroloji Bilim Dalının Moleküler Biyoloji ve Genetik laboratuvarında araştırıcı olarak çalışmaktadır. 161
