Pankreas ve Kolanjiyoselüler Kanserlerinde Metilen Tetrahidrofolat

Haydarpafla Numune E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi T›p Dergisi 2008; 48 (4)
Pankreas ve Kolanjiyoselüler Kanserlerinde
Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz Gen Polimorfizmi
Sinan Akay1, Zuhal Ero¤lu2, Murat Aky›ld›z1, Buket Kosova2, Ahmet Ayd›n1, Nejat Topçuo¤lu2
ÖZET
Düflük folat al›m› ve folat metabolizmas›ndaki bozukluklar›n gastrointestinal sistem kanserlerine yol açt›¤› düflüncesi popüler olmaya bafllam›flt›r. Bu hipotezi test etmek için 25 pankreas kanseri, 25 kolanjiyoselüler kanser,
ve 88 kontrol vakas›nda, folat metabolizmas›nda rol alan
metilentetrahidrofolatredüktaz›n (MTHFR) polimorfizmine
ve serum folat düzeylerine bak›lm›flt›r. MTHFR polimorfizimi real-time PCR ve fluoresans rezonans enerji transfer
tekni¤i ile çal›fl›lm›flt›r. Pankreas kanser hastalar›nda 677
lokusu için CC, CT ve TT genotiplerinin oranlar s›ras›yla
%60, %36, ve % 4 olarak bulunmufltur. Kontrol vakalar›nda oranlar s›ras›yla %48, %46, ve %6 olarak bulunmufltur. Kolanjiyoselüler kanser hastalar›nda ise oranlar
s›ras›yla, % 44, %48 ve %8 olarak bulunmufltur. Polimorfizm da¤›l›m›nda gruplar aras›nda istatistiksel fark
bulunmam›flt›r. Serum folat düzeyleri de pankreas ve kolanjiyoselüler kanserleri hastalarda normal s›n›rlarda bulunmufltur. Pankreas ve kolanjiyoselüler kanser hastalar›nda MTHFR polimorfizmi ile ilgili normal popülasyondan
daha farkl› bir da¤›l›m olmad›¤› bulunmufltur.
Anahtar kelimeler: 5,10-metilentetrahidrofolat redüktaz polimorfizmi, pankreas kolanjiyoselüler karsinomu.
METHYLENETTRAHYDROFOLATE REDUCTASE
POLYMORPHISMS IN PANCREATIC
CHOLANGIOCELLULAR CANCER
ABSTRACT
Increasing evidence suggests that a low folate intake
1 Ege Üniversitesi Hastanesi Gastroenteroloji Bilim Dal›, Bornova, ‹zmir
2 Ege Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Genetik Anabilim Dal›, Bornova, ‹zmir
and impaired folate metabolism may be implicated in
the development of gastrointestinal cancers. To test
the hypothesis that 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphisms modify the risk of
pancreatic cholangiocellular cancer, we conducted a
hospital-based, case-control study involving 25 patients with pancreas cancer, 25 patients with cholangiocarcinoma and 88 healthy controls frequency matched by age, sex, and race. We also investigated serum
folate levels in pancreas and cholangiocarcinoma patients. MTHFR polymorphisms were determined using
the real-time PCR and fluorosence resonance energy
transfer method. Rates of CC, CT, TT genotypes for
677 locus in patients with pancreas cancer were %60,
%36, and %4, respectively. Genotype rates were
%48, %46, and %6 in the control cases, and % 44,
%48 and %8 in the cholangiocarcinoma patients, respectively. The distribution of genotypes was not different between cancer patients and control group. Serum folate levels were in the normal range in pancreas
and cholangiocarcinoma patients. The distribution of
genotypes for 677 locus of MTHFR gene in pancreas
and cholangiocarcinoma patients was not different
from the normal population.
Keywords: 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase
polymorphism, pancreatic cholangiocellular cancer
G‹R‹fi
Son dönemlerde folat›n kanser oluflumundaki rolü hak-
Pankreas ve Kolanjiyoselüler Kanserlerinde Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz Gen Polimorfizmi
k›ndaki tart›flmalar artmaktad›r. Folat eksikli¤inin kansere iki flekilde yol açabilece¤i düflünülmektedir. Birincisi, eksikli¤in kromozom k›r›lmalar› ve mutasyonlara
yol açabilecek flekilde urasilin DNA’ya do¤ru yerleflememesine sebep olmas›; ikincisi ise DNA metilasyonunun bozulmas› ve kritik proto-onkojen ve tümör
bask›lay›c› genlerin ekspresyonlar›n›n de¤iflmesine sebep olmas›d›r. Folat al›m›ndaki yetersizli¤e ek olarak
folat metabolizmas›nda rol alan genlerdeki fonksiyonel
polimorfizm de kansere e¤ilim yaratabilmektedir (1-3).
Folat metabolizmas›nda önemli rol oynayan metilentetrahidrofolat reduktaz (MTHFR) geni DNA metilasyonu ile iliflkili olan anahtar bir enzimdir ve 5,10 metilentetrahidrofolat› dolafl›mdaki bask›n form olan 5 metiltetrahidrofolata geri dönüflü olmadan çevirmektedir
(4,5). MTHFR geni kromozom 1p36 üzerinde bulunmaktad›r ve s›k görülen 2 polimorfizmi rapor edilmifltir.1) 677 (C_T, alanine_valine).2) 1298 (A_C, gultamate_alanine). 677TT genotipine sahip olan bireylerdeki
enzim aktivitesi wild tip olan 677CC genotipindekilerin
%30’u kadard›r. 677CT olanlar›n ise enzim aktivitesi
normalin %65’i kadard›r. ‹kinci s›kl›kta görülen polimorfizm (1298 A_C) enzim aktivitesini bu derece etkilememektedir (6,7).
Kanserli hastalardaki metilasyon paternleri ve folat durumu aras›ndaki iliflki folat›n DNA metilasyonunu ve
dolay›s›yla kanser riskini de¤ifltirebilece¤ini akla getirmektedir. Bununla beraber, tümör geliflimi s›ras›nda
DNA hipermetilasyonu da olabilece¤inin kan›tlar› bu-
lunmaktad›r. Tümör bask›lay›c› genlerin hipermetilasyonu ve ard›ndan bask›lanmas› artm›fl kanser riskini
aç›klayabilse de folat eksikli¤inin bunu nas›l baflarabildi¤i aç›k de¤ildir (8).
Çal›flmalarda çeflitli gastrointestinal kanser türlerinde
belli MTHFR genotiplerinin farkl› s›kl›klarda bulundu¤u
gösterilmifl ve MTHFR genotipleri ile kanser tipi aras›nda iliflki kurulmaya çal›fl›lm›flt›r (9). Amac›m›z, pankreas ve kolanjiyoselüler kanserleri hastalar›ndaki
MTHFR gen polimorfizminin ne oranda da¤›l›m gösterdi¤ini ortaya koymakt›r.
MATERYAL VE METOD
Çal›flmam›zda birer gastrointestinal sistem kanseri
olan pankreas ve kolanjiyoselüler kanserli hastalarda
MTHFR gen polimorfizmi analizi yap›lm›flt›r.
Vaka-kontrol olarak dizayn edilen çal›flmaya, Haziran
2004 - Nisan 2005 tarihleri aras›nda Ege Üniversitesi
Gastroenteroloji Servisinde yatan 25 pankreas kanseri, 25 kolanjioselüler kanser vakas› al›nm›flt›r. Seksen
sekiz kontrol vakas› hastalar ile genetik olarak ilgisizdir ve tan›sal radyoloji klini¤inden al›nm›fllard›r. Tüm
hastalardan kan al›nmadan önce ayd›nlat›lm›fl onamlar› al›nm›flt›r. EDTA içeren tüplere al›nan kan örnekleri
iflleme kadar -70 santigrad derecede saklanm›flt›r.
MTHFR C677T DNA moleküler analizi periferik kan örne¤inde real-time PCR ve FRET (fluoresans rezonans
enerji transfer) tekni¤i ile çal›fl›lm›flt›r.
Ayr›ca hasta gruplar›na folik asit, homosistein , ve vi-
Tablo 1: MTHFR C677C, C677T, ve T677T genotiplerinin kanser tiplerinde ve kontrollerdeki da¤›l›m›.
C677C (n)
C677T (n)
T677T (n)
pankreas kanseri
15 (%60)
9 (%36)
1 (%4)
kolanjiyoselüler
kanser
11 (%44)
12 (%48)
2 (%8)
kontrol
42 (%48)
40 (%46)
6 (%6)
Tablo 2: Pankreas ve kolanjiyoselüler kanser hastalar›nda folik asit ve homosistein düzeyleri.
Ortalama serum
folik asit (ng/ml)
Ortalama serum
Ortalama serum
vitamin B12 (pg/ml) homosistein (_mol/l)
pankreas kanseri
7.43±3
403±75
15.1±7.4
kolanjiyoselüler
kanser
6.32±2.4
381.8±170.3
15.4±7.9
209
Pankreas ve Kolanjiyoselüler Kanserlerinde Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz Gen Polimorfizmi
Tablo 3: Genotipe göre serum folik asit, vitamin B12, ve homosistein düzeyleri.
Ortalama serum folik
asit (ng/ml)
Ortalama serum
vitamin B12 (pg/ml)
Ortalama serum
homosistein (_mol/l)
C677C
7±2.9
413±182
14.8±7.2
C677T
7±2.7
371±155.8
14.5±6.2
T677T
5±2.6
351±226.8
23.3±15.9
tamin B12 düzeyleri çal›fl›lm›flt›r.
‹statistik sonuçlar› ki-kare analizi ve student t testi ile
elde edilmifltir.
BULGULAR
Pankreas kanseri, kolanjiyoselüler kanser ve kontrol
gruplar›n›n yafl ortalamalar› s›ras›yla 63.2 ± 12.2, 61.3
± 14.1, ve 60.3 ± 9.1 olarak hesaplanm›flt›r.Erkek / kad›n oranlar› da s›ras›yla 12 / 13, 11 / 14, ve 42 / 46 olarak bulunmufltur. Aralar›nda istatistiksel fark bulunmamaktad›r.
MTHFR genotipi ve pankreas ve kolanjiyoselüler kanser riskleri. Kontrol vakalar›n 677 lokusu için CC, CT
ve TT genotiplerinin oranlar› s›ras›yla %48, %46, ve
%6 olarak bulunmufltur (Tablo 1). Pankreas kanser
hastalar›nda oranlar s›ras›yla %60, %36, ve % 4 olarak bulunmufltur. Kolanjiyoselüler kanser hastalar›nda
ise oranlar s›ras›yla, % 44, %48 ve %8 olarak bulunmufltur. Polimorfizm da¤›l›m›nda gruplar aras›nda istatistiksel fark bulunmam›flt›r.
Homosistein ve folik asit düzeyleri ve pankreas ve kolanjiyoselüler kanser riskleri. Pankreas ve kolanjiyoselüler kanser hastalar›n›n homosistein ve folik asit düzeyleri Tablo ikide verilmektedir. ‹ki kanser grubu aras›nda bu de¤erler istatistiksel farkl›l›k göstermemektedir. Tablo üçte ise MTHFR genotiplerine göre serum
folik asit ve homosistein düzeylerinin ortalamalar› verilmifltir. Polimorfizme göre folik asit, vitamin B12 ve
homosistein düzeyleri aras›nda istatistiksel fark bulunmam›flt›r
TARTIfiMA
Son dönemlerde, düflük folat al›m› ve folat metabolizmas›ndaki bozukluklar›n gastrointestinal sisteme ait
kanserlerin gelifliminde rolü oldu¤u daha fazla düflünülmekedir. Bu hastane bazl› vaka kontrol çal›flmas›nda MTHFR C677T polimorfizmi ile Türk toplumunda
pankreas ve kolanjiyoselüler kanser aras›nda iliflki ba-
k›lm›fl ve iliflki bulunamam›flt›r.
Deneysel çal›flmalardan elde edilen sonuçlar folat ve
pankreas kanseri aras›ndaki iliflkiyi desteklemektedir.
Pankreas karaci¤erden sonra en çok folat içeren ikinci organd›r (10).
Önceki çal›flmalarda beslenme ile düflük folat al›m› ve
düflük serum folat düzeyinin pankreas kanseri riski ile
birlikteli¤i rapor edilmifltir (11,12). Pankreas kanseri
riski ile dietteki folat miktar› aras›ndaki iliflki iki vakakontrol çal›flmas› (13,14) ve 3 kohort çal›flma ile araflt›r›lm›flt›r (9,15,16). Befl çal›flmalardaki toplam 722 vakan›n sonucuna göre dietteki folat al›m› ile pankreas
kanseri riski ters orant› göstermektedir ve bu çal›flmalar›n üçünde oran istatistiksel olarak anlaml› bulunmufltur, ancak çal›flmam›zda serum folat düzeyleri
normal s›n›rlarda bulunmufl ve hastal›¤›n etyolojisinde
rol oynad›¤› düflüncesinden uzaklaflt›rm›flt›r.
MTHFR aktivitesinin azalmas›na neden olan genetik
polimorfizm, homosistein remetilasyonu için gerekli
olan 5-metil terahidrofolat›n azalmas›yla ve timidilat ve
purin sentezinin öncül molekülü olan 5,10 metilen
THF’›n birikimiyle sonuçlanmaktad›r. Baz› çal›flmalar
tümör dokular› ve periferik lenfositlerdeki gen hipometilasyonu ile MTHFR genotipleri aras›nda anlaml› iliflkiden bahsetse de (17-19) di¤er çal›flmalar ya hiçbir iliflki göstermemifl (20) ya da bu birlikteli¤i sadece folat
eksikli¤i ile gösterebilmifllerdir (21,22). Pankreas adenokanseri çok say›da genetik ve epigenetik de¤ifliklileri olan oldukça agresif bir kanser tipidir. Bir çal›flmada
gen hipometilasyonun pankreas kanserinde s›kl›kla
karfl›lafl›lan bir epigenetik fenomen oldu¤u ve ilgili
genlerin fazla ekspresyonu ile beraber görüldü¤ü rapor edilmifltir (23). Bizim çal›flmam›z desteklemese de
homozigot MTHFR TT genotipinin hipometilasyon yolu ile pankreas kanserine yol açt›¤› konusu daha ileri
araflt›rma gerektirmektedir.
Folik asit ya da 5 metil tetrahidrofolat homosisteinin
methionine metabolik olarak dönüflümünde kofaktör-
210
Pankreas ve Kolanjiyoselüler Kanserlerinde Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz Gen Polimorfizmi
dür. Bu reaksiyonda metiltetrahidrofolat substrat rolü
de üstlenmektedir. Metionin yüzden fazla biyokimyasal reaksiyonda metil donörü olan SAM’e (S-adenosylmethionin) metabolize olmaktad›r. dUMP’nin metilasyon ile dTMP’ye dönüflmesi reaksiyonunda da 5,10
metilen tetrahidrofolat rol oynamaktad›r. 5,10 metilentetrahidrofolat›n, 5 metiltetrahidrofolata indirgenme reaksiyonu 5,10 metilen tetrahidrofolat redüktaz taraf›ndan katalizlenmektedir (24).
Asya toplumunda 677 TT homozigot olarak bulunma
s›kl›¤› %12; heterozigot %50’dir. 677TT genotipindeki
bireylerin DNA’s›n›n d›flar›dan daha fazla metil grup
kabul ediyor olmas› CC genotipine göre daha az metil
grubu tafl›d›¤›n› göstermektedir, ancak bunun kanser
ile olan iliflkisinin kan›tlanmas› gerekmektedir (19).
Çal›flmalarda kolorektal kanser riskinin 677TT genotipi
tafl›yanlarda %50 azald›¤› gösterilmifltir, ancak baflka
çal›flmalar bunun folat statüsü ve yafl ile de¤iflkenlik
gösterebilece¤ini göstermektedir (25,26). 677TT genotipinin özofagus kanserli hastalarda anlaml› olarak
daha fazla oldu¤unun gösterilmifltir. Mide kanseri için
de benzer sonuçlar elde edilmifltir (27). Türkiyeden yap›lm›fl bir çal›flmada T allelinin bulunmas›n›n premenapozal kad›nlarda meme kanseri olas›l›¤›n› art›rd›¤›n›
göstermifltir (28). Akci¤er kanseri ile MTHFR gen polimorfizmi aras›nda iliflki bulunmam›flt›r (29). Alkolik sirozu olanlarda 677TT genotipi artm›fl HCC riski getirmektedir (30).
KAYNAKLAR
1. Blount BC, Mack MM, Wehr CM, MacGregor JT, Hiatt RA, Wang G,
vitamin B12, homocyst(e)ine, and colorectal cancer risk. Cancer Epide -
Wickramasinghe SN, Everson RB, Ames BN. Folate deficiency causes
miol Biomarkers Prev. 1999; 8: 825-9.
uracil misincorporation into human DNA and chromosome breakage:
9. Stolzenberg-Solomon RZ, Pietinen P, Barrett MJ, Taylor PR, Virtamo
implications for cancer and neuronal damage. Proc Natl Acad Sci USA
J, Albanes D. Dietary and other methyl-group availability factors and
1997; 94: 3290-3295.
pancreatic cancer risk in a cohort of male smokers. Am J Epidemiol.
2. Choi SW, Mason JB. Folate and carcinogenesis: an integrated sche -
2001;153:680-687.
me. J Nutr. 2000; 130: 129-132.
10. Balaghi M, Horne D, Woodward S, Wagner C. Pancreatic one-car -
3. Kim YI. Folate and DNA methylation: a mechanistic link between fola -
bon metabolism in early folate deficiency in rats. Am J Clin Nutr. 1993;
te deficiency and colorectal cancer? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
58: 198-203.
2004; 13: 511-519.
11. Stolzenberg-Solomon RZ, Albanes D, Nieto FJ, et al. Pancreatic
4. Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG,
cancer risk and nutrition-related methyl-group availability indicators in
Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, et al. A can -
male smokers. J Natl Cancer Inst. 1999; 91: 535-41.
didate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in
12. Stolzenberg-Solomon RZ, Pietinen P, Barrett MJ, et al. Dietary and
methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet. 1995; 10: 111–113.
other methyl-group availability factors and pancreatic cancer risk in a
5. Weisberg I, Tran P, Christensen B, Sibani S, Rozen R. A second ge -
cohort of male smokers. Am J Epidemiol. 2001; 153: 680-7.
netic polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)
13. Silverman DT, Swanson CA, Gridley G, Wacholder S, Greenberg RS,
associated with decreased enzyme activity. Mol Genet Metab. 1998; 64:
Brown LM, Hayes RB, Swanson GM, Schoenberg JB, Pottern LM,
169-172.
Schwartz AG, Fraumeni JF Jr, Hoover RN. Dietary and nutritional factors
6. Friedman G, Goldschmidt N, Friedlander Y, Ben-Yehuda A, Selhub J,
and pancreatic cancer: a case-control study based on direct interviews.
Babaey S, Mendel M, Kidron M, Bar-On H. A common mutation A1298C
J Natl Cancer Inst. 1998; 90: 1710-1719.
in human methylenetetrahydrofolate reductase gene: association with
14. Baghurst PA, McMichael AJ, Slavotinek AH, Baghurst KI, Boyle P,
plasma total homocysteine and folate concentrations.
Walker AM. A case-control study of diet and cancer of the pancreas. Am
J Nutr. 1999; 129: 1656-1661.
J Epidemiol. 1991; 134: 167-179.
7. Klerk M, Verhoef P, Clarke R, Blom HJ, Kok FJ, Schouten EG. MTHFR
15. Skinner HG, Michaud DS, Giovannucci EL, Rimm EB, Stampfer MJ,
677C¡T polymorphism and risk of coronary heart disease: a meta-analy -
Willett WC, Colditz GA, Fuchs CS. A prospective study of folate intake
sis. JAMA 2002; 288: 2023-2031.
and the risk of pancreatic cancer in men and women. Am J Epidemiol.
8. Ma J, Stampfer MJ, Christensen B, Giovannucci E, Hunter DJ, Chen
2004; 160: 248-258.
J, Willett WC, Selhub J, Hennekens CH, Gravel R, Rozen R. A polymorp -
16. Larsson SC, Hakansson N, Giovannucci E, Wolk A. Folate intake and
hism of the methionine synthase gene: association with plasma folate,
pancreatic cancer incidence: a prospective study of Swedish women
211
Pankreas ve Kolanjiyoselüler Kanserlerinde Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz Gen Polimorfizmi
and men. J Natl Cancer Inst. 2006; 98: 407-413.
Cancer Res 2003;63:4158 – 66.
17. Stren LL, Mason JB, Selhub J, et al. Genomic DNA hypomethylati -
24. Toffoli G, De Mattia E. Pharmacogenetic relevance of MTHFR poly -
on, a characteristic of most cancers, is present in peripheral leukocytes
morphisms Pharmacogenomics 2008; 9: 1195-206.
of individuals who are homozygous for the C677T polymorphism in the
25. Osian G, Procopciuc L, Vlad L. MTHFR polymorphisms as prognos -
methylenetetrahydrofolate reductase gene. Cancer Epidemiol Biomar -
tic factors in sporadic colorectal cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 2007;
kers Prev. 2000; 9: 849-53.
16: 251-6.
18. Castro R, Rivera I, Ravasco P, et al. 5,10-methylenetetrahydrofolate
26. Cao HX, Gao CM, Takezaki T, Wu JZ, Ding JH, Liu YT, Li SP, Su P,
reductase (MTHFR) 677C-T and 1298A-C mutations are associated with
Cao J, Hamajima N, Tajima KGenetic polymorphisms of methylenetet -
DNA hypomethylation. J Med Genet. 2004; 41: 454-8.
rahydrofolate reductase and susceptibility to colorectal cancer Asian
19. Oyama K, Kawakami K, Maeda K, et al. The association between
Pac J Cancer Prev. 2008; 9: 203-8.
methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and promoter
27. Stolzenberg-Solomon RZ, Qiao YL, Abnet CC, Ratnasinghe DL,
methylation in proximal colon cancer. Anticancer Res. 2004; 24: 649-54.
Dawsey SM, Dong ZW, Taylor PR, Mark SD. Esophageal and gastric
20. Narayanan S, McConnell J, Little J, et al. Associations between two
cardia cancer risk and folate and vitamin B(12)-related polymorphisms
common variants C677T and A1298C in the methylenetetrahydrofolate re -
in Linxian, China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2003; 12:
ductase gene and measures of folate metabolism and DNA stability (strand
1222–1226.
breaks, misincorporated uracil, and DNA methylation status) in human
28. Ergul E, Sazci A, Utkan Z, Canturk NZ. Polymorphisms in the MTHFR
lymphocytes in vivo. Cancer Epidemil Biomark Prev. 2004; 13: 1436-43.
gene are associated with breast cancer. Tumour Biol. 2003; 24: 286-90.
21. Friso S, Choi SW. Gene-nutrient interactions and DNA methylation.
29. Boccia S, Boffetta P, Brennan P, Ricciardi G, Gianfagna F, Matsuo
J Nutr. 2002; 132: 2382-2387S.
K, van Duijn CM, Hung RJ. Meta-analyses of the methylenetetrahydro -
22. Friso S, Choi SW, Girelli D, et al. A common mutation in the 5,10-
folate reductase C677T and A1298C polymorphisms and risk of head
methylenetetrahydrofolate reductase gene affects genomic DNA meth -
and neck and lung cancer Cancer Lett. 2009; 273: 55-61.
ylation through an interaction with folate status. Proc Natl Acad Sci USA
30. Fabris C, Toniutto P, Falleti E, Fontanini E, Cussigh A, Bitetto D, For -
2002; 99: 5606-11.
nasiere E, Fumolo E, Avellini C, Minisini R, Pirisi M. MTHFR C677T Poly -
23. Sato N, Maitra A, Fukushima N, et al. Frequent hypomethylation of
morphism and Risk of HCC in Patients With Liver Cirrhosis: Role of Ma -
multiple genes overexpressed in pancreatic ductal adenocarcinoma.
le Gender and Alcohol Consumption. Alcohol Clin Exp Res. 2008 Oct 18.
212