16-20 Nıtropenik

Nötropenik Hastaların Tekrarlayan
Orofaringeal Kandidaz Ataklarından
İzole Edilen Candida albicans
Suşlarının Genotipik Analizi
Ayşegül ESKİTÜRK*, Beyza ENER**, Wim QUINT***
* Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İSTANBUL
** Uludağ Üniversitesi, Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kliniği, BURSA
*** Reiner de Graaf Gasthuis, Diagnostisch Centrum SSDZ, Department of Molecular Biology, The NETHERLANDS
ÖZET
Bu çal›flmada; 12 nötropenik hastan›n üç y›l boyunca takipleri s›ras›nda tekrarlayan orofarengeal kandidaz
ataklar›ndan izole edilen Candida albicans sufllar› kullan›ld›. Hastalardan izole edilen toplam 29 suflun genotipik tiplendirilmesinde polimorfik DNA’n›n rastgele amplifiye edilmesi (random amplified polymerase chain
reaction-PCR) ve EcoRI enzimi ile polimorfik DNA’n›n kesilmesi (restriction fragment length polymorphism)
yöntemleri kullan›ld›. DNA tiplendirmesiyle on farkl› genotip tan›mland›. Oniki (%58.4) hastan›n yedisinin
farkl› orofaringeal kandidaz ataklar›nda tek bir DNA genotipi saptan›rken, befl (%41.6) hastada iki DNA
genotipi belirlendi.
Anahtar Kelimeler : Candida albicans, PCR, Restriksiyon Enzim Analizi, Genotipleme.
SUMMARY
Genotyping Analysis of Candida albicans Strains Isolated from
Neutropenic Patients during Recurrent Oropharyngeal Candidiasis
Candida albicans strains isolated from oropharyngeal specimens were obtained from 12 neutropenic patients during 3 years follow-up. Random amplified polymerase chain reaction and EcoRI restriction fragment
length polymorphism were used to determine genotypic variabilities among 29 strains. DNA subtyping revealed a total of 10 DNA subtypes. Seven (58.4%) of 12 patients with multiple episodes of oropharyngeal candidiasis were infected with a single subtype, 5 (41.6%) of 12 patients were infected with two DNA subtypes
throughout the observation period.
Key Words : Candida albicans, PCR, Restriction Fragment Length Polymorphism, Genotyping.
16
Flora 1997;1:16-20
Nötropenik Hastaların Tekrarlayan Orofaringeal Kandidaz
Ataklarından İzole Edilen Candida albicans Suşlarının Genotipik Analizi.
GİRİŞ
Candida albicans sağlıklı bireylerin çoğunun
ağız boşluğunda bulunan zararsız bir mikroorganizma olmasına rağmen immün sistemi baskılanmış
hastalarda önemli bir patojen olarak karşımıza çıkmaktadır (1). Bu hastalarda immün cevabın zayıflaması çoğunlukla daha önceden ağızda kolonize olan
suşların doku penetrasyonu ve enflamasyon oluşturmasıyla sonlanmaktadır (2). Özellikle hematolojik
malignite tedavisi gören hastalarda immün sistemi
baskılayıcı tedavi oral Candida infeksiyonlarının tekrarlamasına yol açabilmekte ve bu hastaların yakından takip edilerek ivedilikle uygun tedavi protokolüne alınması yaşam kurtarıcı olmaktadır.
Ağız boşluğunda zararsız olarak taşınan suşların
infeksiyon nedeni olup olmadığı ya da tekrarlayan
oral Candida infeksiyonlarının aynı suşdan kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak için bu suşların
genomik DNA’larının incelenmesi gerekmektedir ve
bu amaçla çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bu metodlara restriksiyon enzimleriyle genomik DNA’nın
kesilmesi (restriction fragment length polymorphism
-RFLP), DNA fragmanlarının işaretli problarla hibridizasyonu (Southern hybridization, elektroforetik
karyotipleme-pulse field gel electropheresis) ve polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction
-PCR) örnek verilebilir (3-8).
Bu çalışmada, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’nde 1992-1995 yılları arasında takip
edilen 12 immün sistemi baskılanmış hastanın farklı
zamanlarda hastaneye kabülleri sırasında ağız boşluklarından izole edilen C. albicans suşları kullanılmıştır. Bu suşların genomik analizinde polimorfik
DNA’nın rasgele amplifiye edilmesi diye tercüme
edebileceğimiz "random amplified PCR" yöntemi ve
RFLP yöntemi kullanılmıştır.
MATERYAL ve METOD
C. albicans suşları immün sistemi baskılanmış
12 hastadan izole edildi ve üç yıl içinde toplam 29
suş toplandı. Mikrobiyolojik tanımlama serumda
germ-tube oluşturma ve mısır unlu agarda klamidospor oluşturma özellikleri incelenerek yapıldı.
DNA İzolasyonu I: Saburaud agarda üretilen
Candida kolonileri 10 mL fosfat tamponlu tuzlu suda süspanse edildi. Bu süspansiyondan 0.5 mL alınarak santrifüj edildi ve 0.5 mL 25 mM K2HPO4,
10 mM MgCl2, 2 mM dihidroeritrol, 1 M sorbitol,
0.1 mg/mL zymolase (ICN, USA) içeren karışım çökeltiye eklenerek 37°C’de 90 dakika inkübe edildi.
Oluşan sferoplastlardan DNA izolasyonunda Boom
ve arkadaşlarının tarif ettiği yöntem kullanıldı (9).
Flora 1997;1:16-20
Eskitürk A, Ener B, Quint W.
PCR: Amplifikasyonlar 10 mM TRIS-HCl, 2.5
mM MgCl2, 50 mM KCl, %0.01 jelatin, %0.1 Triton-X, 0.2 mM dNTP, 50 pmol primerler, 0.5 U
Taq polymerase (Super Taq, Sphaero, Netherlands)
ve 10 ng DNA içeren 100 mL reaksiyon karışımı
içinde gerçekleştirildi. Rasgele amplifikasyon amacıyla Van Belkum ve arkadaşları tarafından tanımlanan aşağıdaki primerler kullanıldı (8).
ERIC1(AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG)
ERIC2(ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC)
PCR Biomed 60 "thermocyler" içinde 94°C’de 5
dakika denatürasyonu takiben, 94°C’de 1 dakika
25°C’de 1 dakika, 74°C’de 1 dakika basamaklarından oluşan 35 döngü ve son olarak 74°C’de 10 dakika tutularak gerçekleştirildi. Reaksiyon ürünü etidyum bromid içeren %2’lik agaroz jelinde ve TBE
tamponda (89 mM Tris, 89 mM borik asid, 0.2 mM
EDTA) yürütüldükten sonra UV transiluminatörde
incelendi. Bant paternleri gözle değerlendirilerek AJ harfleriyle isimlendirildi (Bant paternlerindeki minimal değişiklikler A’, I’ gibi harflerle isimlendirildiyse de, aynı genotipde olarak değerlendirildi).
DNA İzolasyonu II: C. albicans kolonileri 5
mL YPD (yeast extract-peptone-dextrose) sıvı besiyerinde bir gece inkübe edildi. Santrifüj sonrası oluşan çöküntü 150 µL 3 mg/mL zymolase ve %10’
luk 2 merkaptoetanol içeren SCE tamponda (1 m
sorbitol, 0.1 M sodyum sitrat, 0.06 M EDTA) 37°C’
de 90 dakika inkübe edildi. Oluşan sferoplastlardan
DNA izolasyonunda Holm ve arkadaşlarının tarif ettiği yöntem kullanıldı (10).
RFLP Analizi: 10 µg DNA 10 Ü EcoRI (Promega, USA) enzimi ile enzime uygun reaksiyon tamponu içinde 37°C’de bir gece inkübe edildi. Kesilen
DNA fragmanları %1’lik agaroz jelinde bir gece yürütüldü. Kesimden oluşan bantlar gözle değerlendirildi ve "Bakteriophage λDNA" moleküler standart
olarak kullanıldı.
Southern Hibridizasyon: EcoRI ile kesilen
DNA fragmanları kapiller transfer yöntemiyle
membrana (Hybond-Amersham, USA) geçirildi (11).
Membran 2xSSC (1xSSC-0.15 M sodyum klorür,
0.015 M sodyum sitrat) ve %1’lik SDS içeren yıkama solusyonuyla yıkandıktan sonra plastik bir torbaya konuldu ve 0.9 mM sodyum klorür, 50 mM sodyum sitrat, 0.2 mM EDTA, 100 µg denatüre Denhardt spermi, %10’luk SDS ve distile su içeren prehibridizasyon solusyonunda 25°C’de bir gece inkübe
edildi. Hibridizasyon için 32P işaretli (AGC)7 probu
kullanıldı. Bir gece inkübasyon sonrası 2xSSC solüsyonuyla 30°C’de ve 35°C’de iki kez yıkanan membranlar -70°C’de bir gece otoradyograma bırakıldı.
17
Nötropenik Hastaların Tekrarlayan Orofaringeal Kandidaz
Ataklarından İzole Edilen Candida albicans Suşlarının Genotipik Analizi.
Eskitürk A, Ener B, Quint W.
Tablo 1. İmmün Sistemi Baskılanmış Hastalardan İzole Edilen C. albicans Suşlarının İzolasyon
Tarihleri ve PCR-Genotipleme Sonuçları.
Hasta
Örnek
numarası
Örnek
tarihi
1 (AML)
16247
31.12.1993
A
5086
06.04.1994
A
8501
22.06.1994
B
9952
04.08.1994
C
10627
10.08.1994
C
1477
27.01.1995
A
5588
17.04.1995
A
16021
20.11.1994
A
16248
24.11.1994
A
17273
14.12.1994
A
5463
12.04.1994
D
10431
03.08.1994
E
6522
05.05.1994
F
9626
14.07.1994
F
12354
14.09.1994
F
10013
25.07.1994
A’
10350
01.08.1994
A’
13619
07.10.1994
A’
7740
05.07.1992
G
12669
25.11.1992
A’
8244
10.06.1994
H
15035
03.11.1994
I
5512
11.04.1995
F’
7346
16.05.1995
F’
4965
04.04.1994
I’
6973
10.05.1994
I’
7018
16.05.1994
I’
11631
31.08.1994
A’
13931
12.10.1994
J
2( AML)
3 (AML)
4 (AML)
5 (KİT)
6 (AIDS)
7 (KİT)
8 (KİT)
9 (AIDS)
10 (AML)
11 (MM)
12 (AML)
PCR
paterni
BULGULAR
Tablo 1’de çalışmaya alınan suşların izole edildikleri tarih ve PCR genotiplemesi ile elde edilen sonuçlar verilmiştir.
Şekil 1’de gösterildiği gibi PCR genotipleme ile
18
29 örnekten on genotip tanımlanabilmiştir. Hastaların yedisinde (%58.4) aynı DNA tipinin tekrarlayan
ataklardan sorumlu olduğu, hastaların beşinde
(%41.6) ise yeni bir genotipin ortaya çıktığı izlenmektedir. Belirlenen genotiplerden (A-A’)’ nün örneklerin 12’sinde saptanması bu suşların ayrımında
bir diğer genotipleme yönteminin kullanılmasıyla
farklılık saptanıp saptanmayacağı sorusunu gündeme getirmiştir. Bu amaçla bu 12 suş EcoRI restriksiyon enzimiyle kesilerek agaroz jelde yürütülmüş ve
fotoğraflar gözle değerlendirilmiştir (Şekil 2). Ancak
gözle değerlendirme saptanan bantların tam olarak
ayrımında yeterli olamamış ve jel üzerinde belirlenen
bantların membrana geçirilmesini takiben 32P işaretli (AGC)7 probu ile hibridizasyon yapılarak elde edilen otoradyogramlar değerlendirmiştir (Şekil 3).
Otoradyogramların değerlendirilmesiyle PCR genotiplemesi ile aynı genotipte olduğu saptanan suşların
RFLP analizi ile de aynı genotipte olduğu belirlenmiştir.
TARTIŞMA
Deri ve mukozalarda normal flora elemanı olarak
bulunan Candida türleri ile konak arasında dinamik
bir ilişki vardır. Normal koşullar altında hastalık oluşturmayan bu mantarlar, konağın mikroorganizma
çoğalmasını ve invazyonunu önleme yeteneği azaldığı zaman hastalığa sebep olabilen fırsatçı patojenlerdir. Deri ve mukozaları tutan yüzeyel infeksiyonlardan, karaciğer, böbrek, dalak ve akciğerlerin tutulduğu yaygın infeksiyonlara kadar değişebilen hastalık
tabloları oluşturabilirler. Son yıllarda bir çok yeni kemoterapötiğin kullanıma girmesi, transplantasyon
teknolojisinin hızla gelişmesi ve HIV ile infekte hasta sayısındaki artış immün sistemi baskılanmış hasta
populasyonunun giderek artmasına neden olmaktadır. Nötrofil fonksiyonları bozulan ya da sayısı azalan
hastalarda genellikle yaygın sistemik infeksiyonlar
görülürken, T hücre defektlerinde mukokutanöz infeksiyonlara rastlanmakta ve bu infeksiyonlarda
mortalite oranı %35-50’ye varabilmektedir (3).
Yakın zamana kadar fungal infeksiyonların geçiş
yolları, kolonizasyon ve infeksiyonlarının patogenezi
ve epidemiyolojisi hakkında bakterilerle kıyaslanınca
çok az bilgi mevcuttu. Ancak son yıllarda hızla gelişen moleküler biyoloji metodları şimdiye kadar cevabı bilinmeyen bir çok sorunun cevaplanmasını mümkün kıldığı gibi Candida infeksiyonlarında da geniş
bir kullanım alanı bulmuştur. Çalışmamızda kullanılan "random amplified PCR" yöntemi son yıllarda bir
çok patojenin tiplendirilmesinde kullanılmaktadır
(12). Bu yöntemin temeli polimorfik DNA’nın özel
primer annealing-kavuşma bölgelerinden amplifiye
edilmesidir. Sabit primer bölgeleri tek bir değişken
Flora 1997;1:16-20
Nötropenik Hastaların Tekrarlayan Orofaringeal Kandidaz
Ataklarından İzole Edilen Candida albicans Suşlarının Genotipik Analizi.
Eskitürk A, Ener B, Quint W.
Şekil 1. Nötropenik hastalardan izole edilen C. albicans suşlarının PCR
genotipleme ile analizi. (Rakamlar Tablo 1’deki hasta numaralarını göstermektedir, hasta örnekleri arasında 1kb ağırlık belirteci [weight marker]
bulunmaktadır.)
Şekil 3. Aynı jelin 32P işaretli (AGC)7 probuyla
hibridizasyon sonrası değerlendirilmesi.
Şekil 2. Tablo 1’de PCR genotipleme ile benzer
bant paternleri veren (A,A’) 12 C. albicans suşunun EcoRI-RFLP yöntemiyle agaroz jelde gösterilmesi (M-molecular weigth marker, Hind III ile
kesilmiş λDNA).
‘domain’e bağlanabilir ya da primerler DNA’daki değişik yerlerde bulunan ortak bölgelere bağlanabilir.
Bu durumda ya primer bağlanma yerleri arasındaki
uzaklık ya da primerlerin bağlanma yerleri farklı olacak ve tekrar eden bu farklılıklar amplifiye DNA’nın
uzunluğunun değişmesine ve jelde gözle görülebilen
bant paternlerinin oluşmasına neden olacaktır. C. albicans suşlarının tiplendirilmesinde seçilen ERIC
Flora 1997;1:16-20
(enterobacterial repetitive intergenic consensus) primerleri genom boyunca tekrarlayan gen dizilerine
bağlanmaktadır. Polimorfik DNA’nın amplifikasyonunda kavuşma- annealing ısısı olarak 25°C kullanılmakta, böylece primerlerin daha az seçici olarak
bağlanması ve Şekil 1’de görüldüğü gibi tekrarlayan
bant örnekleri oluşması sağlanmaktadır. Bu yöntemle yaklaşık 100 suş bir hafta gibi kısa bir sürede değerlendirilebilmektedir. Çalışmamıza aldığımız 12
hastanın, hastaneye farklı zamanlarda kabulleri sırasında ağız mukozalarından üretilen C. albicans suşları bu yöntemle incelenerek tekrarlayan atakların
aynı suşla oluşup oluşmadığı araştırılmıştır. Hastala-
19
Eskitürk A, Ener B, Quint W.
rın yedisinde (%58) aynı suşun tekrarlayan ataklardan sorumlu olduğu görülmektedir. Genotipik tiplendirilme metodlarından optimal yararlanımın sağlanması amacıyla genellikle en az iki yöntemin kombinasyonu önerildiğinden, PCR yöntemi RFLP yöntemi ile kıyaslanmıştır. EcoRI restriksiyon enzimi kullanımı ve 32P işaretli (AGC)7 probuyla işaretleme sonrası elde edilen bantların değerlendirilmesiyle her iki
yöntem arasında %100 uyum saptanmıştır.
Van Belkum ve arkaaşları PCR yöntemiyle 24
nötropenik hastanın seri izolatlarını inceleyerek hastaların %55’inde (8,13); bir başka çalışmalarında 11
kemik iliği tranplantasyon hastasının seri izolatlarını
inceleyerek hastaların %90’ında aynı genotipin tekrarlayan ataklardan sorumlu olduğunu göstermişlerdir. Bart-Delabbesse ve arkadaşları dört AIDS hastasının tekrarlayan ataklarından izole ettikleri suşları
EcoRI RFLP ve karyotipleme metodlarıyla çalışmış,
hastaların üçünde atakların aynı suşla oluştuğunu
saptamışlardır (14). Barchiesi ve arkadaşları 28
AIDS hastasından farklı zamanlarda ağız mukozasından izole ettikleri suşların %54.5’inde (15), Pfaller ve
arkadaşları 29 AIDS hastasının %38’inde (16) aynı
genotipe bağlı tekrarlayan orofarengial Candida
atakları görüldüğünü bildirmektedirler.
Çalışmamızda hastaların %41.6’sında atakların
farklı genotiplere bağlı oluştuğu görülmektedir. Tekrarlayan atakların aynı suşun antifungal tedaviye direnç kazanması nedeniyle ya da hastanın ağzında
bulunabilecek farklı suşlardan birinin baskın hale
geçmesiyle oluştuğu savunabilirse de hastaların hiçbirinde tedavide kullanılan flukonazol’e karşı direnç
saptanmaması (yayınlanmamış veri), bu atakların konak ve patojen arasındaki henüz bilmediğimiz bir
mekanizmayla oluştuğunu düşündürmektedir.
KAYNAKLAR
1.
2.
3.
20
Anaissie ER. Oppurtunistic mycoses in the immünocompromised host: experience at a cancer center and review. Clin Infect Dis 1992;14:43-50.
Hellstein J, Vawter-Hugart H, Fotos P, Schmid J, Soll D.
Genetic similarity and phenotypic diversity of commensal and pathogenic strains of Candida albicans isolated
from the oral cavity. J Clin Microbiol 1993;31:3190-9.
Pfaller M. Epidemiological typing methods for mycoses.
Clin Infect Dis 1992;14 (Suppl 1):4-10.
Nötropenik Hastaların Tekrarlayan Orofaringeal Kandidaz
Ataklarından İzole Edilen Candida albicans Suşlarının Genotipik Analizi.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Vazquez J, Beckley A, Sobel J, Zervos M. Comparison
of restriction enzyme analysis and pulsed-field gel electropheresis as typing system for Candida albicans. J Clin
Microbiol 1991;29:962-9.
Scherer S, Stevens D. Application of DNA typing method to epidemiology and taxonomy of Candida species.
J Clin Microbiol 1987;25:675-9.
Stevens D, Odds F, Scherer S. Application of DNA typing methods to Candida albicans epidemiology and correlations with phenotype. Rev Infect Dis 1990;12:25866.
Magee PT, Bowdin L, Staudinger J. Comparison of moleculer typing methods for Candida albicans. J Clin Microbiol 1992;30:2674-9.
Van Belkum A, Melchers W, Pauw B, Shrerer S, Quint
W, Meis J. Genotypic characterization of sequental Candida albicans strain isolated from flucanazole treated neutropenic patients. J Infect Dis 1994;169:1062-70.
Boom R, Sol A, Salimans M, et al. Rapid and simple
method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol
1990;28:495-503.
Holm C, Meeks D, fangman W, Botsein D. A rapid an
efficient method for isolating DNA from yeast. Gene
1986;42:169-73.
Sambrook J, Frish E, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed, Cold Spring: Cold Spring Harbour, 1989:9;31-7.
Van Belkum A. DNA fingerprinting of medically important microorganisms by use of PCR. Clin Microbiol Rew
1994;7:174-84.
Van Belkum A, Mol W, Saene R, Ball L, Velzen D, Quint W. PCR-mediated genotyping of Candida albicans
strains from bone marrow transplanted patients. Bone
Marrow Tranplant 1994;13:811-5
Bart-Delabesse E, Boiron P, Carlotti A, Dupont B. Candida albicans genotyping studies with patients with
AIDS developing resistance to fluconazole. J Clin Microbiol 1993;31:2933-7.
Barchiesi F, Hollis R, McGough D, Scalise G, Rinaldi M,
Pfaller M. DNA subtypes and fluconazole susceptibilities
of Candida albicans isolates from the oral cavities of patients with AIDS. Clin Infect Dis 1995;20:634-40.
Pfaller M, Rhine-Chalberg J, Redding W, et al. Variations
in fluconazole susceptibility and electropheretic karyotype among oral isolates of Candida albicans from patients with AIDS and oral candidiasis. J Clin Microbiol
1994;32:59-64.
YAZIŞMA ADRESİ:
Yard. Doç. Dr. Ayşegül ESKİTÜRK
Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
81326 Haydarpaşa-İSTANBUL
Makalenin Geliş Tarihi: 12.07.1996, Kabul Tarihi: 25.09.1996
Flora 1997;1:16-20