tc istanbul üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü danışman prof.dr
advertisement
T.C. ĐSTANBUL ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ (DOKTORA TEZĐ ) ANTĐOKSĐDAN-OKSĐDAN ETKĐLEŞĐMLERĐNĐN OKSĐDATĐF STRES VE FARKLI HÜCRE ÖLÜM SÜREÇLERĐNE ETKĐSĐ SABĐHA TOK DANIŞMAN PROF.DR.RÜSTEM NURTEN BĐYOFĐZĐK ANABĐLĐM DALI BĐYOFĐZĐK PROGRAMI ĐSTANBUL-2015 iv ĐTHAF Aileme ithaf ediyorum… v TEŞEKKÜR Bu tez çalışmasının yürütülmesinde bana destek olan tez danışmanım sayın Prof. Dr. Rüstem Nurten’e, tecrübelerini benimle paylaşan sayın Doç. Dr. Handan Akçakaya’ya, tüm Biyofizik Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve çalışanlarına, sayın Ali Öztürk’e, DETAE Đmmünoloji Anabilim Dalı’ndan sayın Doç. Dr. Suzan Adın Çınar’a, aileme ve arkadaşlarıma teşekkür ederim. Bu çalışma, Đstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 20372 vi ĐÇĐNDEKĐLER TEZ ONAYI .................................................................................................................... ĐĐ BEYAN........................................................................................................................... ĐĐĐ ĐTHAF.............................................................................................................................ĐV TEŞEKKÜR..................................................................................................................... V ĐÇĐNDEKĐLER ...............................................................................................................VĐ TABLOLAR LĐSTESĐ..................................................................................................... X ŞEKĐLLER LĐSTESĐ ......................................................................................................XĐ SEMBOLLER / KISALTMALAR LĐSTESĐ ..............................................................XVĐ ÖZET ...........................................................................................................................XĐX ABSTRACT.................................................................................................................. XX 1. GĐRĐŞ VE AMAÇ......................................................................................................... 1 2. GENEL BĐLGĐLER ...................................................................................................... 6 2.1. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller ...................................................................... 6 2.2. Antioksidanlar ........................................................................................................ 10 2.2.1. β-karoten ........................................................................................................... 11 2.3. Hücre Ölüm Çeşitleri ............................................................................................. 15 2.3.1. Apoptoz ............................................................................................................. 23 2.3.1.1. Apoptotik Hücrede Meydana Gelen Yapısal Değişimler............................. 24 2.3.1.2. Apoptoz Mekanizmaları ve Mitokondrinin Apoptozdaki Rolü ................... 25 2.3.2. Nekroz ............................................................................................................... 29 2.3.3. Otofaji ............................................................................................................... 30 2.4. Kanser Hücreleri ve Kanser Hücrelerinin Hücre Kültüründeki Davranışları ........ 33 2.4.1. K562 ve MCF-7 Kanser Hücreleri .................................................................... 34 2.5. Hücre Döngüsü ...................................................................................................... 36 3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................................... 38 3.1. GEREÇLER ........................................................................................................... 38 3.1.1. Kimyasal Maddeler ........................................................................................... 38 3.1.2. Kitler ................................................................................................................. 39 3.1.3. Antikorlar .......................................................................................................... 39 3.1.4. Antioksidanlar ................................................................................................... 40 vii 3.1.5. Çalışmada Kullanılan cihazlar .......................................................................... 40 3.1.6. Çalışmada Kullanılan Eriyikler......................................................................... 41 3.1.6.1. FACS Analizi ve Floresan Boyama ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi için Kullanılan Eriyikler................................................................................................... 41 3.1.6.2. Sitozolik ve Mitokondriyal Hücre Kesimlerinin Hazırlanması Đçin Kullanılan Eriyikler................................................................................................... 41 3.1.6.3. PAGE Đçin Kullanılan Eriyikler ................................................................... 42 3.1.6.4. Western Emdirimi Đçin Kullanılan Eriyikler ................................................ 43 3.1.6.5. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulaması Đçin Kullanılan Eriyikler ........ 43 3.2. YÖNTEMLER ....................................................................................................... 43 3.2.1. Hücre Kültürü ................................................................................................... 43 3.2.1.1. Hücrelerin Bakımı ........................................................................................ 43 3.2.1.2. Hücrelerin Pasajlanması ............................................................................... 43 3.2.1.3. Hücre Sayımı ve Ekimi ................................................................................ 44 3.2.1.4. Hücrelerin Dondurulması ............................................................................. 45 3.2.1.5. Hücrelerin Çözülmesi................................................................................... 45 3.2.2. Hücre Canlılığının Belirlenmesi ....................................................................... 45 3.2.3. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulamaları .................................................. 46 3.2.3.1. Hücrelere H2O2 Uygulanması....................................................................... 46 3.2.3.2. Hücrelere β-Karoten Uygulanması .............................................................. 46 3.2.3.3. Hücrelere H2O2 ve β-Karoten’in Birlikte Uygulanması ............................... 47 3.2.4. FACS Analizi ile Mitokondri Membran Potansiyelinin (∆Ψm) Belirlenmesi . 47 3.2.5. Đmmünfloresan Yöntemi ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi......................................... 48 3.2.6. Erken Apoptotik Hücrelerin AnnV Uygulaması Đle Belirlenmesi .................... 48 3.2.7. Nekrotik ve Apoptotik Hücrelerin AnnV - PI Uygulaması ile Belirlenmesi .... 49 3.2.8. Hücrelerin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlere Ayrılması ........................... 49 3.2.9. Liyofilizasyon ................................................................................................... 50 3.2.10. Protein Derişimlerinin Fluorometre ile Belirlenmesi ..................................... 51 3.2.11. Elektroforez ve Membrana Aktarım ............................................................... 51 3.2.12. Western Emdirim Analizi ............................................................................... 51 3.2.13. DNA (Hücre Döngüsü) Analizi ...................................................................... 52 4. BULGULAR............................................................................................................... 53 4.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi ......................................... 53 viii 4.2. Oksidatif Stresin K562 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği Değişiklikler ....................................................................................................................................... 54 4.3. Oksidatif Strese Maruz Kalan K562 Hücrelerinde Apoptoz ve Nekrozun Belirlenmesi .................................................................................................................. 57 4.4. β-karoten’in K562 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi ........................................... 62 4.5. K562 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı βkarotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi .............................................................. 65 4.5.1. K562 Hücrelerine H2O2 ve β-karotenin Aynı Anda Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................................................... 65 4.5.2. K562 Hücrelerine Önce H2O2 Sonra β-karoten Uygulanması ile ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................................................... 67 4.5.3. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................................................... 70 4.6. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasından Sonra Erken Apoptotik Sürecin Belirlenmesi .................................................................................... 72 4.7. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra Yüksek Derişimlerde H2O2 Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler ........................................... 74 4.8. Antioksidan-Oksidan Etkileşimlerinin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi ............................................................................................................................. 76 4.8.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi ....................... 77 4.8.2. β-karoten’in K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi............................... 79 4.8.3. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasının K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi.............................................................................................................. 80 4.9. Oksidatif Stres Etkisiyle K562 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler ...... 87 4.10. Antioksidan-oksidan Etkileşimleri Sonucu K562 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler .................................................................................................................. 90 4.11. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücreleri Üzerine Etkisi ............................................ 100 4.11.1. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi ............................. 100 4.11.2. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği Değişiklikler .............................................................................................................. 104 4.11.3. Oksidatif Stres Etkisiyle MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler .. 109 4.12. β-karoten’in MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi .................................... 111 ix 4.13. MCF-7 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı βkarotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi ............................................................ 112 4.13.1. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücre Canlılığı ve Proliferasyonunda Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................... 112 4.13.2. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler ................................................................................... 114 4.13.3. Önce β-karoten Sonra H2 O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerindeki Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler .............................................................................................................. 119 5. TARTIŞMA .............................................................................................................. 121 KAYNAKLAR ............................................................................................................. 133 ÖZGEÇMĐŞ .................................................................................................................. 149 x TABLOLAR LĐSTESĐ Tablo 2-1: Bcl-2 ailesi proteinleri................................................................................... 26 Tablo 2-2: Hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan bazı kanser hücre dizileri. ........ 34 Tablo 4-1: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış canlı ve erken apoptotik hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri.............................................................................. 60 Tablo 4-2: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama sonucu G2 bölgesinde kapılanmış canlı, erken apoptotik, geç apoptotik ve nekrotik hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri. .................................................... 62 xi ŞEKĐLLER LĐSTESĐ Şekil 2-1: Serbest radikal oluşumu. .................................................................................. 7 Şekil 2-2: Antioksidan-oksidan dengenin bozulması ile oksidatif stres oluşumu. ........... 9 Şekil 2-3: Oksidatif strese maruz kalan hücre. ............................................................... 10 Şekil 2-4: Antioksidan ve serbest radikal etkileşimi. ..................................................... 11 Şekil 2-5: Nekroptoz. ...................................................................................................... 16 Şekil 2-6: Kornifikasyon................................................................................................. 17 Şekil 2-7: NEToz. ........................................................................................................... 18 Şekil 2-8: Mitotik katastrof. ............................................................................................ 19 Şekil 2-9: Anoikis. .......................................................................................................... 20 Şekil 2-10: Entoz. ........................................................................................................... 22 Şekil 2-11: Mitotik katastrof, apoptoz, nekroz ve otofajik vakuolizasyonun yapısal görüntüleri....................................................................................................................... 22 Şekil 2-12: Apoptozun son evresi. .................................................................................. 25 Şekil 2-13: Mitokondriyal hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz. .......................................... 28 Şekil 2-14: Apoptozun ölüm reseptörü yolu ile mitokondri yolunun etkileşimi. ........... 29 Şekil 2-15: Otofajik hücre ölümü. .................................................................................. 31 Şekil 3-1: Hemositometrede hücre sayımı. ..................................................................... 44 Şekil 3-2: Tripan mavisi ile boyanan hücrelerin lam üzerine aktarımı........................... 45 Şekil 3-3: Tripan mavisi testi ile canlı ve ölü hücrelerin belirlenmesi. .......................... 46 Şekil 4-1: H2 O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak K562 hücre canlılığındaki değişim. ........................................................................................................................... 54 Şekil 4-2: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık mikroskobu görüntüsü. ................................................................................................... 54 Şekil 4-3: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ................................................................................................................... 56 Şekil 4-4: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre profilindeki değişiklikler. .................... 57 Şekil 4-5: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama ile apoptoz ve nekrozun belirlenmesi. .......................................................... 60 Şekil 4-6: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış apoptotik (a) ve nekrotik (b) hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri.............................................................................. 61 xii Şekil 4-7: 24 saat süre ile farklı derişimlerde β-karoten uygulamasının K562 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. ........................................................................................... 63 Şekil 4-8: 1 µM β-karotenin uygulama süresine (24, 48, 72 saat) bağlı olarak K562 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. ............................................................................................ 64 Şekil 4-9: K562 hücre profilleri ...................................................................................... 64 Şekil 4-10: Farklı derişimlerde H2O2 ve 1 µM β-karoten ile aynı anda işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ........................................... 66 Şekil 4-11: K562 hücre profilleri .................................................................................... 66 Şekil 4-12: Aynı anda H2O2 ve β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. ........................................................................................................................ 67 Şekil 4-13: Farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulamasından sonra 1 µ M β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ..................... 68 Şekil 4-14: K562 hücre profilleri ................................................................................... 69 Şekil 4-15: Önce H2O2 sonra β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. ........................................................................................................................ 69 Şekil 4-16: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (100-1000 µM) H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin zamana bağlı (24, 48, 72 saat) ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. .......................................................................................................... 70 Şekil 4-17: K562 hücre profilleri ................................................................................... 71 Şekil 4-18: Önce β-karoten sonra H2O2 ile işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. ........................................................................................................................ 71 Şekil 4-19: Önce 1µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin zamana bağlı AnnV cevabı......................................................................... 72 Şekil 4-20: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin AnnV cevabı. ............................................................................................................................. 73 Şekil 4-21: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin 24 ve 48. saatlerdeki AnnV cevabı ve hücre profili.......................................................................................... 74 Şekil 4-22: Önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ........................................... 75 xiii Şekil 4-23: Önce 1 µM β-karoten sonra 10 mM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüsü. ........................................................................ 76 Şekil 4-24: Farklı şekillerde işlem görmüş K562 hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüleri....................................................................................................................... 76 Şekil 4-25: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. ............................................................................................................................. 77 Şekil 4-26: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hüce döngüsü falarındaki değişiklikler .................................................................................................. 78 Şekil 4-27: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. ............ 79 Şekil 4-28: Kontrol hücreleri ile 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S ve G2 fazlarındaki değişimin karşılaştırmalı grafiği. ........................................... 80 Şekil 4-29: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. ..................................................................................... 81 Şekil 4-30: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş K562 hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler. ............................................................. 83 Şekil 4-31: Önce 1 µM β-karoten sonra 2 mM, 4 mM ve 10 mM H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. ..................................................................................... 84 Şekil 4-32: Kontrol grubu hücreleri ile önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde (2, 4, 10 mM) H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S ve G2 fazlarının karşılaştırmalı grafiği. .................................................................................................... 85 Şekil 4-33: K562 hücre döngüsü fazlardaki değişim grafiklerinin karşılaştırmalı gösterimi ......................................................................................................................... 87 Şekil 4-34: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. .................................................... 88 Şekil 4-35: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. .................................................... 89 Şekil 4-36: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. .................................................... 90 Şekil 4-37: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. ............................................................................................................................. 91 xiv Şekil 4-38: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. ............................................................................................................................. 92 Şekil 4-39: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. ............................................................................................................................. 93 Şekil 4-40: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi .................................................................................................. 94 Şekil 4-41: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi .................................................................................................. 95 Şekil 4-42: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi .................................................................................................. 96 Şekil 4-43: Farklı deney gruplarındaki a) Sitokrom c, b) Smac/D, c) Bcl-2, d) BCL-X, e) AIF, f) Apaf-1’in mitokondriyal ve sitozolik hücre kesimlerindeki miktarlarındaki değişikliklerin western emdirim analizi ile gösterimi ve ImageJ programı kullanılarak belirlenen bant yoğunluklarının histogram gösterimi. .................................................... 99 Şekil 4-44: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücre canlılığındaki değişim. ......................................................................................................................... 101 Şekil 4-45: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücre proliferasyonundaki değişim......................................................................................... 101 Şekil 4-46: Farklı derişimlerde H2O2 ile a) 24 saat, b) 48 saat, c) 72 saat işlem görmüş MCF-7 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık mikroskobu görüntüsü. ..................... 103 Şekil 4-47: Oksidatif stres etkisiyle MCF-7 ve K562 hücre canlılıklarındaki değişimin karşılaştırmalı gösterimi. .............................................................................................. 104 Şekil 4-48: 100 µM H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm ve hücre profilindeki değişim. ..................................................................................................... 105 Şekil 4-49: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ................................................................................................................. 106 Şekil 4-50: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücre profilindeki değişiklikler. ............. 107 xv Şekil 4-51: MCF-7 hücrelerinin Rho123 ile ∆Ψm analizinin floresan mikroskobu görüntüsü. ..................................................................................................................... 108 Şekil 4-52: Farklı Derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. ................................................................................... 108 Şekil 4-53: Farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin western emdirim analizi ............................................................................................................. 110 Şekil 4-54: Farklı derişimlerde 24 saat β-karoten uygulamasının MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. .............................................................................................................. 111 Şekil 4-55: Farklı derişimlerde β-karoten ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücre profilleri. ....................................................................................................................... 112 Şekil 4-56: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde 24 saat H2O2 uygulanmış MCF-7 hücrelerinin a) canlılık b) proliferasyonundaki değişim. ............................... 113 Şekil 4-57: Önce 2 µM β-karoten sonra 24 saat farklı derişimlerde H2O2 uygulanmış MCF-7 hücrelerinin canlılığındaki değişim.................................................................. 114 Şekil 4-58: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (250-1000 µM) H2 O2 ile 24 ve 48 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler.115 Şekil 4-59: 1 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. ........................ 116 Şekil 4-60: Önce 2 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF7 hücrelerinin a) ∆Ψm’ndeki değişiklikler, b)hücre profillerindeki değişiklikler. ....... 117 Şekil 4-61: 2 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. ........................ 118 Şekil 4-62: Önce β-karoten (1 µM ve 2 µM) sonra H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF7 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. .............................................................................................. 119 Şekil 4-63: Önce β-karoten (1 ve 2 µM) sonra H2O2 (500, 750 ve 1000 µ M) ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış MCF-7 hücrelerinin sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirim analizleri. ......................... 120 xvi SEMBOLLER / KISALTMALAR LĐSTESĐ AA Akrilamit AIF Apoptoz indükleyici faktör AnnV Anneksin V Apaf-1 Apoptotik proteaz aktifleştirici faktör-1 APS Amonyum per sülfat ATP Adenozin trifosfat BA Bis-Akrilamit BCIP Bromokloroindolfosfat BSA Sığır serum albumini β-karoten Beta-karoten Ca Kalsiyum cDMEM complete DMEM CEN Tavuk eritrosit çekirdeği CTN Buzağı timosit çekirdeği Cu Bakır CV Varyasyon katsayısı Cyt c Sitokrom c dH2O distile su DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimetil sülfoksit DNA Deoksiribonükleikasit DSBs DNA çift zincir kırıkları EDTA Etilen diamin tetra asetik asit ER Endoplazmik Retikulum FACS Floresan Aktif Hücre Ayırıcı FBS Fetal sığır serumu Fe Demir FITCH Floreseinizotiyosiyonat xvii g gram Gap Aralık Go Go fazı G1 G1 fazı G2 G2 fazı G6PD Glukoz-6-fosfat-dehidrogenaz H2O2 Hidrojen peroksit IgG Đmmunglobulin G Kaspaz Sistein bağımlı aspartat spesifik proteaz K562 Đnsan eritrolösemi hücresi M Mitoz MET Merkaptoetanol mg miligram Mg Magnezyum ml mililitre mM milimolar NET Nötrofil hücre dışı tuzağı NCCD Hücre Ölümü Nomenklatür Komitesi NBT Nitrobluetetrazolyum ort ortalama PBS Fosfat tuzu tamponu PI Propidyum Iyodid PMSF Fenilmetilsülfonilflorit PS Fosfotidil serin QC Kalite kontrol Rho123 Rodamin 123 RIP1 Reseptörle etkileşen protein1 RIP3 Reseptörle etkileşen protein3 ROS Reaktif oksijen türleri S Sentez xviii SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi Smac/D Smac/DIABLO SOD Süperoksit Dismutaz Std Standart TEMED Tetrametilendiamin TNF Tümör Nekroz Faktör Tris Tris (hidroksimetil) aminometan µl Mikrolitre µM Mikromolar ∆Ψm Mitokondri membran potansiyeli xix ÖZET Tok, S. Antioksidan Oksidan Etkileşimlerinin Oksidatif Stres ve Farklı Hücre Ölüm Süreçlerine Etkisi. Đstanbul Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik Anabilim Dalı. Doktora Tezi. Đstanbul. 2015 Hücrede normal metabolik olaylar sırasında oluşan reaktif oksijen türleri antioksidan savunma mekanizmalarıyla ortadan kaldırılarak dengelenmektedir. Antioksidan-oksidan dengenin bozulması ise kanser başta olmak üzere birçok hastalığın patogenezinden sorumlu tutulan oksidatif strese neden olmaktadır. Oksidatif stres etkisi ile protein, lipid ve membran yapılarının hasarlanması apoptoz veya farklı hücre ölümlerinin aktifleşmesine yol açar. Oksidatif stres antioksidan savunma mekanizmalarıyla önlenir ya da onarılır. Antioksidanlar, serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel düzeydeki hasarı engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu durdurmaktadırlar. Bu nedenle hastalıkların tanı ve tedavisine yönelik çalışmalarda, antioksidan uygulamaları ile antioksidan-oksidan etkileşimleri ve farklı hücre ölüm süreçlerinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. Antioksidan-oksidan etkileşimlerinin oksidatif stres ve farklı hücre ölüm süreçlerine etkisini belirlemek amacı ile K562 ve MCF-7 kanser hücrelerinde H2 O2 ve β-karoten farklı şekillerde etkileşime sokularak çeşitli analiz yöntemleri kullanılarak oksidatif hasar, mitokondri membrane potansiyelindeki değişiklikler, hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler, apoptotik ve nekrotik hücreler, sitozolik ve mitokondriyal hücre kesimlerindeki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin miktarındaki değişiklikler, farklı ölüm süreçleri, yapısal (morfolojik) değişiklikler ve hücre canlılıkları belirlendi. H2O2 ile indüklenen oksidatif strese karşı K562 hücrelerinin MCF-7 hücrelerinden daha dirençli olduğu gösterildi. Oksidatif stres etkisiyle K562 hücrelerinin apoptotik yolla ölüme gittiği belirlendi. H2O2 ile farklı şekillerde etkileşime sokulan β-karotenin, uygulama şekline ve zamana bağlı olarak, antioksidan ve prooksidan olarak etki ettiği gösterildi. K562 hücrelerindeki oksidatif hasarın 1 µM β-karoten ile önlenebildiği, MCF-7 hücrelerinde ise ancak 2 µM β-karotenin etkili olduğu belirlendi. K562 hücreleri, 1 mM’dan daha yüksek derişimlerde H2O2 uygulanmadan önce β-karoten ile muamele edildiğinde ise hücrelerin farklı bir ölüm sürecine girdiği ve bu ölüm şeklinin hücre döngüsü fazlarından bağımsız olarak gerçekleştiği gösterildi. Anahtar Kelimeler: Oksidatif stres, hücre ölümü, antioksidan, mitokondri, β-karoten Bu çalışma, Đstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 20372 xx ABSTRACT Tok, S. Effect of Antioxidant-Oxidant Interactions on Oxidative Stress and Different Cell Death Processes. Đstanbul University, Institute of Health Science, Department of Biophysics. Doctoral Thesis. Đstanbul. 2015 Reactive oxygen species formed in the cell during regular metabolic events are balanced via removal of those by antioxidant defense mechanisms. Disruption of antioxidant-oxidant balance gives rise to oxidative stress which is responsible for pathogenesis of many diseases, especially cancer. Damaging proteins, lipids and membrane structures via oxidative stress causes activation of apoptosis or different cell death mechanisms. Oxidative stress is prevented or repaired by antioxidant defense mechanisms. Reacting with free radicals, antioxidants prevent damage at the cellular level and suspend generation of degenerative diseases. Therefore, to study diagnosis and treatment of many diseases; antioxidant treatment and to identify antioxidant-oxidant interactions and different cell death processes are very crucial. To identify the effects of antioxidant-oxidant interactions on oxidative stress and different cell death processes, via interacting H2O2 with β-carotene in different ways in K562 and MCF-7 cancer cells and employing several analysis methods; oxidative damage, changes in mitochondrial membrane potential, changes in cell cycle phases, apoptotic and necrotic cells, changes in proapoptotic and antiapoptotic protein quantities in cytosolic and mitochondrial cell fractions, different death mechanisms, morphological changes, and cell viabilities are identified. It’s shown that compared to MCF-7 cells K562 cells are more resistant to oxidative stress induced by H2O2. It’s also identified that K562 cells dies via apoptotic ways with the effect of oxidative stress. It’s shown that β-carotene reacting with H2 O2 in various ways acts as antioxidant or prooxidant depending on treatment procedure and time. It’s identified that oxidative damage in K562 cells could be prevented by 1 µM β-carotene whereas the effective dose in MCF-7 cells is 2 µM. Finally, it’s shown that when K562 cells are treated with β-carotene before treatment of H2O2 concentrations above 1 mM, they enter different cell death processes and this death mechanism proceeds independent of cell cycle phases. Key Words: Oxidative stress, cell death, antioxidant, mitochondria, β-carotene. The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No. 20372 1. GĐRĐŞ VE AMAÇ Oksijenin belirli koşullarda kısmen indirgenmesi sonucu çok kısa ömürlü ve güçlü oksidan nitelikli reaktif oksijen türleri (ROS) oluşmakta ve bunlar organizmada moleküler düzeyde birçok biyolojik etkiye neden olmaktadırlar. ROS’daki artış; nükleik asitler, proteinler ve lipidleri de içeren hücre komponentlerinin hasarına neden olduğu için nörodejeneratif bozukluklar ve kanser başta olmak üzere birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır. Kanserde gen anlatımına (ekspresyonuna) neden olan DNA hasarında da ROS rol oynamaktadır. Hücre döngüsüyle ilişkili protein anlatımındaki değişiklikler, protoonkogenlerin aktifleşmesinde ve bazı tümor süpresör genlerin inaktifleşmesinde de ROS’un rol oynadığı bildirilmiştir1–3. ROS’ların hücre dışı ve hücre içi apoptoz tetikleme mekanizmalarında etkili oldukları ve apoptotik süreci gen düzeyinde etkiledikleri yapılan in vitro ve in vivo çalışmalar sonucunda ıspatlanmıştır. ROS’ların hücre ölümünü tetikleme kapasitesinin belirlenmesi ile son yıllarda kanser tedavisinde de ROS’ların kemoterapatik ajanları destekleyici olarak kullanılması ile ilgili çalışmalar yoğunlaşmıştır. ROS’lar çok düşük derişimlerde, bazı sinyal ileti yolaklarında ikinci haberci olarak davranabilmektedirler4 fakat, aşırı üretildikleri zaman hücrenin birçok hayati bileşeninde oksidatif hasara neden olmaktadırlar. Normalde, hücrede oluşan ROS antioksidan savunma mekanizmalarıyla ortadan kaldırılır. Antioksidan savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROS oluşumu birçok hastalığın patogenezinden sorumlu tutulan oksidatif strese neden olmaktadır. Alzheimer, Parkinson, Đskemi/reperfüzyon hasarı gibi birçok hastalık sürecinde oksidatif stres görülmektedir. Mitokondri hücre içi ROS oluşturan etkenlerin başında gelmektedir çünkü mitokondriyal solunum zinciri ROS’ların ana kaynağını oluşturmaktadır. Antioksidan enzimler ve pek çok antioksidan sistem mitokondride bulunmasına rağmen mitokondri ROS’ların hem birincil kaynağı hem de ana hedefi konumundadır. Normal solunum sırasında yaklaşık olarak tüketilen moleküler oksijenin bir kısmı süperoksid anyonuna dönüşmektedir ve süperoksid anyonunun dismutasyonu ile de hidrojen peroksit (H2O2) oluşmaktadır. H2O2 radikali; ATP düzeyini azaltır; hücre membranı, DNA, kalsiyum depoları ve mitokondri gibi hedef yapıların hasarına neden olur. Bu tür radikaller 2 yüksek derişimlerde hücrenin parçalanmasına yol açarlar5. H2 O2 ile indüklenen mitokondriyal oksidatif stres etkisi ile protein, lipid ve membran yapılarının hasarlanması hücre ölümünün aktifleşmesine yol açmaktadır. Bu nedenle, hücre ölüm mekanizmalarıyla ilgili yapılan çalışmaların büyük bir bölümü apoptozun düzenlenmesinde önemli rolü olan mitokondride yoğunlaşmaktadır. ROS’ların oluşumu, mitokondri membran potansiyelinde (∆Ψm) azalmaya ve membranda por oluşumuna neden olmaktadır. ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler ve oluşan porlar apoptotik ve proapoptotik proteinlerin sitoplazmaya salınımına ve apoptotik sürecin tetiklenmesine neden olmaktadır. Dolayısı ile ∆Ψm analizi hücrenin apoptoza yönlendiğini gösteren önemli belirteçlerden biridir. Bu nedenden dolayı oksidatif stres, hücre ölüm şekilleri ve bunların mekanizmaları ile ilgili çalışmalarda mitokondriyal parametrelerin incelenmesi de önem taşımaktadır. Bugün birçok hücre ölüm şekli tanımlanmaktadır. Çeşitli hücresel strese karşı ortaya çıkan ve birbirinden farklı mekanizmalara sahip olan hücre ölümleri; genel olarak apoptotik, nekrotik ve otofajik hücre ölümü olmak üzere üç tipte toplanmaktadır. Diğerleri ise normalden farklı olan hücre ölüm modellerinin geçici (kesin olmayan) tanımlarıdır. Şimdiye kadar tanımlanmış hücre ölüm şekilleri nekroptoz, kornifikasyon, NEToz, mitotik katastrof, anoikis, eksitotoksisite, ‘wallerian’ dejenerasyonu, paraptoz, piroptoz ve entoz’dur. Bazı dokularda ve belli koşullarda, bazı hücre ölüm morfolojilerinin birkaç tipi birden aynı hücrede görülebilmektedir. Kanserlerinin yarısından fazlasında hücre ölümü yolaklarında rol alan genlerden bir veya birkaçında mutasyon izlenmektedir. Bu yolakların çalışılması, yeni tedavi hedeflerini bulma açısından büyük önem taşımaktadır. Son yıllarda kanser tedavisi gibi metabolik stres yaratan durumlarda otofaji kanser tedavisi araştırmalarında önemli yer tutmaya başlamıştır. Ayrıca nekroz da kanser gelişiminde ve özellikle kanser tedavisi sürecinde sıklıkla karşılaşılan hücre ölüm mekanizmalarından biridir. Kanser ilaçlarının bir kısmı tümör hücrelerinde nekrozu uyararak etkili olmaktadır. Klinisyenler tarafından şimdiye kadar üzerinde en fazla çalışılan hücre ölümü ise apoptozdur. Apoptoz, çok hücreli organizmaların genetik şifrelerinde bulunan “hücre intiharı” programlarının gelişimsel ve/veya çevresel uyarımlarla etkinleşmesi sonucu ortaya çıkan, gelişim ve farklılaşma sırasında organ yapısı ve işlevlerinin aktif değişimini sağlayan fizyolojik hücre ölümü olarak tanımlanmaktadır6. Apoptoz hücresel 3 homeostazın sürdürülmesinde önemli role sahiptir. Birçok patalojik ve fizyolojik olayda etkin rol oynamaktadır. Apoptoz ve hücre çoğalması arasında kontrollü bir denge vardır. Bu denge apoptoz lehine bozulduğunda Alzheimer, Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar, hücre çoğalması lehine bozulduğunda ise kanser ve otoimmün hastalıklar meydana gelmektedir. Bu hastalıkların engellenmesi ya da tedavi edilebilmesi için apoptozu kontrol eden mekanizmaların iyi anlaşılması gerekmektedir. Çünkü dejeneratif hastalıklarda apoptoz mekanizmaları hızlı ve kontrol dışı çalışırken, kanserlerde tam tersine apoptoz tetikleyici mekanizmalarda işlev kaybı görülmektedir. Dolayısyla kanser tedavisinde apoptotik mekanizmalar hedef alınmaktadır ve temel olarak kanser kemoterapilerinin amacı hücre ölümünü apoptoz yolu ile uyarmaktır. Hücre metabolizmasında oluşan veya dışarıdan uygulanan oksidanların hücrede mitokondri kontrollü apoptoz sürecini tetiklediği bilinmektedir7,8. Sitotoksik ilaçlar ve radyoterapi tümör hücrelerinde apoptozu başlatabilir fakat bu tedaviler normal hücrelerde de apoptozu uyarabilir, ayrıca daha birçok olumsuz yan etkileri de vardır. Bu nedenle, son yıllarda antioksidan uygulamaları ile antioksidan-oksidan etkileşimleri üzerindeki çalışmalara yoğunlaşılarak farklı tedavi yöntemleri aranmaktadır. Antioksidanlar, serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel düzeydeki hasarı engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu durdurmaktadırlar. Oksidatif stres vücuttaki antioksidan savunma mekanizmalarıyla önlenir ya da onarılır. Antioksidanlar, aktif oksijen oluşumunu engelleyerek ya da oluşan aktif oksijenleri tutarak, oksitlenmenin neden olduğu zararları, hücresel düzeyde engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu durdurmaktadırlar9. Antioksidan özelliği keşfedilen birçok farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını vücut diyetle alırken, bir kısmını kendisi, serbest radikallere karşı bir savunma sistemi olarak üretir. Vücudun serbest radikallere karşı savunma olarak ürettiği antioksidanlar; katalaz, glutatyon peroksidaz ve SOD gibi enzimlerdir. Đnsan sağlığı bakımından antioksidan işlevleri ile ön plana çıkan maddeler ise A, E ve C vitaminleri, fenolik maddeler ve karotenoidlerdir. Kanser ve hücre ölümü çalışmalarında en çok kullanılan karotenoid ise β-karotendir. β-karotenin şimdiye kadar üzerinde en fazla çalışılan bileşik olmasının sebebi, birçok ülkede yetişen meyve ve sebzelerde en çok görülen ortak karotenoid olmasıdır. β-karoten serbest oksijen radikallerinin oluşumunu önlemesinin yanı sıra radikallerle doğrudan reaksiyona girebilir10. A vitamininin suda eriyebilen öncülü olan β-karoten güçlü bir antioksidan olup dokularda peroksil radikallerinin yakalanmasından 4 sorumludur. β-karotenin özellikle kimyasal karsinogenezde koruyucu rolü olduğu bilinmektedir11. β-karoten’nin apoptoz ve hücre döngüsünü G2/M fazında tutuklayarak, birçok insan kolon adenokarsinoma hücre soyunun çoğalmasını engellediği bildirilmiştir12. Bu etkilerin doza ve zamana bağlı olarak ve tamamen hücrenin karotenoidleri depolama yeteneği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. β-karoten’nin bcl-2 gen ailesinden olan ve programlı hücre ölümünde inhibitör olarak görev yapan Bcl-2 ve Bcl-xL anlatımlarını da azalttığı belirlenmiştir. Đnsan ve hücre kültüründe yapılan bazı çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre belli koşullarda β-karoten’nin oksidan etki gösterdiği de belirlenmiştir. β-karoten’nin derişime ve hücrenin biyolojik çevresine bağlı olarak antioksidan ya da prooksidan olarak etki eden bir hücreiçi redoks ajanı olabileceği bildirilmiştir. Oksidanlara maruz kalan hücrelerin apoptoza yönlenmesinde hücre döngüsünün hangi aşamasında olduğu da belirleyici bir etmendir13. Hücre döngüsü farklı moleküler mekanizmaların tetiklenmesiyle farklı metabolik süreçlerin işlev gördüğü fazlardan oluşmaktadır. Bunlar, genel olarak Go (dinlenme fazı), G1 (Gap1), S (DNA sentezi), G2 (Gap2) ve M (mitoz bölünme) fazları olarak ifade edilmektedir. Her bir fazda enerji gereksinimleri farklı olduğundan, enerji üretiminden sorumlu olan mitokondri reaksiyonları da farklılık göstermektedir. Kanserle ilgili yapılan çalışmalarda hücre döngüsü çalışmaları önemli yer tutmaktadır. Çünkü kanser aşırı hızda bölünen ya da apoptoza direnen hücrelerin yarattığı bir sorundur. Hücreler bir sorun ile karşılaştıklarında, önce DNA’da oluşan hasarlarını hücre döngüsünü G2 fazında tutuklayarak DNA tamir mekanizmaları ile tamir etmekte, çevresel faktörlerin iyi olmaması durumunda ise hücre bölünmesini G1 fazında durdurarak şartların iyileşmesini beklemektedirler. Bu şekilde de mümkün olmuyorsa apoptotik yolla intihar etmekte ya da farklı programlı hücre ölümleri ile yok edilmektedirler. Dolayısıyla, oksidatif stres ve hücre ölümüyle ilgili yapılan çalışmaların DNA analizleriyle de desteklenmesi önemlidir. DNA analizleri, uygulanan tedavilerin geçerliliği ve tedaviye cevap alınıp alınamadığı konusunda önemli bilgiler verir. Bu çalışmada, serbest radikallerin farklı kanser hücre soylarında (K562 ve MCF-7) meydana getirdiği oksidatif hasara karşı, antioksidan özelliği ile ön plana çıkmış olan β-karoten’in etkisi ve antioksidan-oksidan etkileşimlerinin farklı hücre ölüm süreçlerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Antioksidan-oksidan 5 uygulamalarına bağlı olarak hücrelerde meydana gelen yapısal ve işlevsel değişiklikler farklı analiz yöntemleri kullanılarak araştırıldı. ∆Ψm’ndeki değişiklikler floresan mikroskobu ve FACS “Florescein Activating Cell Sorter” analizleriyle, apoptotik ve nekrotik hücreler AnneksinV-Propidyum iyodid (AnnV-PI) analiziyle, hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler DNA analizleriyle, sitozolik ve mitokondriyal hücre kesimlerindeki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin miktarındaki değişiklikler ‘western’ emdirim analizleriyle, hücre canlılıkları tripan mavisi testiyle, yapısal değişiklikler ise ışık ve floresan mikroskobu ile belirlendi. 6 2. GENEL BĐLGĐLER 2.1. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller Serbest oksijen radikalleri, dış orbitallerinde bir veya daha fazla eşlenmemiş elektron içeren moleküler yapılar olarak tanımlanırlar (Şekil 2-1). Oksijenin belirli koşullarda kısmen indirgenmesi sonucu oluşan çok kısa ömürlü ve güçlü oksidan nitelikli oksijen metabolitleridir. Bu reaktif maddeler bazı biyolojik molekülleri hasara uğratabilirler. Çevrelerindeki moleküller ile reaksiyona girerek onlardan elektron alıp kararlı hale gelirler14. Organizmada serbest oksijen radikallerinin oluşturduğu reaksiyonlar, radikalin başka bir radikalle veya radikal olmayan ajanlar ile karşılaşması ile oluşur. Böylece serbest radikaller organizmada moleküler düzeyde birçok biyolojik etkiye neden olmaktadır. ROS’daki artış, kanser ve norolojik bozukluklar gibi birçok patalojide merkezi rol oynar15–18. Reaktif oksijen türlerindeki artış toksiktir ve nükleik asitler, proteinler ve lipidleri de içeren hücre komponentlerini hasara uğratabilir ve bu artış apoptoz ve nekrozun da gelişmesine neden olmaktadır19. ROS, DNA hasarına, özellikle en önemli nükleer lezyon olarak kabul edilen DNA çift zincir kırıklarına (DSBs) neden olmaktadır17–19. Serbest radikaller, hücrelerde iç ve dış kaynaklı etmenlere bağlı olarak oluşurlar. Dış kaynaklı etmenler arasında; bazı kimyasalların etkisi altında kalma, ilaç toksikasyonları, iyonize ve ultraviyole radyasyon, hava kirliliği yapan fitokimyasal maddeler, sigara dumanı, solventler gibi çevresel faktörler, antineoplastik ajanlar, alkol ve uyuşturucular gibi alışkanlık yapıcı maddeler bulunması nedeniyle, serbest radikaller toksikolojik açıdan da önemlidir20. Aerobik organizmalar için serbest radikallerin başlıca kaynağı moleküler oksijendir. Çünkü oksijen, ortamda sürekli bulunan ve elektrofilik ataklara en müsait olan moleküldür21. Moleküler oksijen (O2), paralel spin durumlu iki eşlenmemiş elektrona sahiptir. Oksijen, çok güçlü bir oksidan olmamasına rağmen, suya redüksiyonu sonucu çok reaktif ara ürünler oluşmasına neden olur; diğer radikallerle reaksiyona girme özelliğine sahiptir22. Organizmada geçiş metallerini (Fe 2+ ve Cu + gibi metaller) içeren enzimler vasıtasıyla moleküler oksijene tek elektronların transferi suretiyle oksitlenme reaksiyonları meydana gelir. Moleküler oksijen, yüksek derecede reaktif oksijen türleri oluşturma eğilimindedir. ROS, normal 7 ·− oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O2 ), hidrojen . peroksit ve hidroksil radikali (OH )' dir23. Oksijenin kısmi indirgenmesiyle oluşan singlet oksijen, süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali gibi aktifleşmiş oksijen türleri oldukça reaktiftir ve kalp gibi organlarda toksik etkilere yol açmaktadır24. Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal • zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R ), • • • peroksit radikalleri (ROO ), alkoksi radikalleri (RO ), tiyil radikalleri (RS ), sülfenil • • radikalleri (RSO ), tiyil peroksit radikalleri (RSO2 ) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden olurlar23. Normal oksijen atomu Elektron kaybı Serbest radikal Şekil 2-1: Serbest radikal oluşumu. H2O2, süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan + peroksidin iki proton (H ) ile birleşmesi sonucu meydana gelir23. Biyolojik sistemlerde ·− hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O2 ) dismutasyonu ile olur. Đki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak H2O2 ve moleküler oksijeni oluştururlar. Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da SOD enzimi tarafından katalizlenir. H2 O2 bir serbest radikal olmadığı halde ROS kapsamına 2+ girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli rol oynar. Çünkü Fe veya diğer geçiş 8 ·− metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O2 ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen • radikali olan hidroksil radikali (OH ) oluşturur. H2 O2 radikali; ATP düzeyini azaltır; hücre membranı, DNA, kalsiyum depoları ve mitokondri gibi hedef yapıların hasarına neden olur. Bu tür radikaller yüksek derşimlerde oldukları zaman hücrenin parçalanmasına yol açarlar5. ROS’nin zararı dışında yararlı olabildiği durumlar da vadır. ROS sinyal iletim yolağında aracı olarak fizyolojik rol oynar25. Çok düşük derişimlerde, bazı sinyal ileti yolaklarında ikinci haberci olarak davranabilmektedir4. Ancak, aşırı üretildiği zaman hücrenin birçok hayati bileşeninde oksidatif hasara neden olur. Belli hücre sistemlerinin antioksidan kapasitesi ile ROS üretimi arasında dinamik bir ilişki bulunmaktadır26. Hücrede oluşan reaktif oksijen türleri, antioksidan savunma mekanizmalarıyla ortadan kaldırılırlar. Fakat bazen hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROS oluşabilir. Organizmada hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROS’nin meydana gelmesi yani normal fizyolojik şartlarda bir denge halinde olan bu durumun bozulması sonucunda, birçok hastalığın patogenezinden sorumlu tutulan oksidatif stres meydana gelir27 (Şekil 2-2). Kısaca; oksidatif stres, serbest radikallerin oluşumu ve çeşitli antioksidan savunma sistemlerinin dengesizliği olarak tanımlanabilir28. Đskemi/reperfüzyon hasarı, Alzheimer, Parkinson ve Diyabet ‘diabetes mellitus’u da içeren birçok hastalık sürecinde oksidatif stres görülmektedir. Kanserde gen anlatımına neden olan DNA hasarında da ROS rol oynamaktadır. Bu nedenle, hücre döngüsüyle ilişkili protein anlatımındaki değişiklikler, protoonkogenlerin aktifleşmesi ve bazı tümor süpresör genlerin inaktifleşmesinde de ROS’un rol oynadığı bildirilmiştir1–3. 9 Denge AO=ROS Antioksidan (AO) Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Oksidatif stres AO < ROS Aşırı ROS üretimi Oksidatif Stres AO < ROS Antioksidan eksikliği Şekil 2-2: Antioksidan-oksidan dengenin bozulması ile oksidatif stres oluşumu. Oksidatif stres etkisi ile serbest radikallere maruz kalan hücrelerin membran yapısında bozulmalar meydana gelmektedir (Şekil 2-3). Oksidatif stresin, serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarıyla birçok kronik hastalığın oluşumuna katkıda bulunduğu düşünülmektedir23. Oksidatif stresin etkilediği en önemli hastalıklardan biri kalp yetersizliğidir. Kalp yetersizliği gelişen hastalarda SOD, CAT, GSH-Px ve E vitamini gibi miyokardiyal antioksidanlar azalırken, serbest oksijen radikallerinin ve oksidatif stresin arttığı gösterilmiştir29. Kalp yetersizliği olan hastalarda olduğu gibi, miyokard infarktüsü geçiren hastalarda da miyokardın infarkt bölgelerinde miyositlerin apoptozu söz konusudur24. Ayrıca, in vitro çalışmalar ve hayvan modellerinde, iskemi-reperfüzyon, miyokard infarktüsü ve kronik basınç yüklenmesi (hipertansiyon) gibi durumların oksidatif stres oluşturarak apoptoz yoluyla miyosit kaybına neden olduğu gösterilmiştir30. Oksidatif stresin apoptozdaki rolü birçok hücre tipinde ortaya konmuştur. Adriamisin, UV ışın ve tümör nekroz faktörü (TNF), serbest radikal oluşturarak apoptozu hızlandırır. Öte yandan, SOD, E vitamini ve troloks gibi antioksidanların apoptozu engellediği gösterilmiştir24. Beyin hücreleri özellikle oksitlenmenin sebep olduğu hasar riskini taşıdığından, oksidatif stres; Alzheimer hastalığını da içeren çeşitli nörodejeneratif düzensizliklerin patogenezi ile 10 ilişkilendirimektedir31,32. Antioksidanların, kültür nöronlarını oksidatif zarardan koruyabilidikleri ve son zamanlarda birçok antioksidan bileşiğin sinir koruyucu olduğu gösterilmiştir28. Şekil 2-3: Oksidatif strese maruz kalan hücre. 2.2. Antioksidanlar Antioksidanlar, ROS oluşumu sonucunda gelişen hasarı önlemek için vücutta geliştirilmiş olan savunma sistemleri olarak bilinirler33. Aktif oksijen oluşumunu engelleyerek ya da oluşan aktif oksijenleri tutarak, oksitlenmenin neden olduğu zararları, hücresel düzeyde engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu durdurmaktadırlar9. Antioksidanlar serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel düzeydeki hasarı engellemektedirler (Şekil 2-4). Antioksidanlar, düşük derişimlerde bile hedeflerinin oksitlenme hızını anlamlı şekilde engelleyen moleküllerdir27. Antioksidan özelliği keşfedilen birçok farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını vücut diyetle alırken, bir kısmını kendisi, serbest radikallere karşı bir savunma sistemi olarak üretir. Vücudun serbest radikallere karşı savunma olarak ürettiği antioksidanlar; katalaz, glutatyon peroksidaz ve SOD gibi enzimlerdir. Đnsan sağlığı bakımından antioksidan işlevleri ile ön plana çıkan maddeler A, E ve C vitaminleri, karotenoidler ve fenolik maddelerdir. Fenolik maddeler, meyve, sebze, baharat, tahıl ve içecekler gibi bitkisel gıdalarda yaygın olarak bulunmaktadırlar. Flavanolleri de içeren flavonoidlerin serbest radikalleri temizleme, güçlü antioksidan özelliği, hidrolitik ve oksidatif enzimleri (fosfolipaz A2, sitokrom oksigenaz, lipoksigenaz) tutma ve iltihap önleyici etkinlikleri bilinmektedir9,34. β-karoten ve α-tokoferol gibi antioksidan özellikleri bilinen maddeler kanser ve hücre ölümü çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Bunlara ek olarak bilimsel araştırmalar ve klinik protokollerde antioksidan aktiviteleri yaygın olarak kullanılan 11 likopen (domates)35, kuersetin (soğan)36,37, kaempferol (siyah çay)38, proantoyanidin (sarımsak)39, kateşin (yeşil çay)40, luteolin (enginar)41, resveratrol (üzüm ve kırmızı şarap)42 ve sülforafanı da (brokoli)43 içeren fitokimyasal maddeler bulunmaktadır44. Antioksidanların çeşitli çalışma mekanizmaları vardır. Onarıcı etki: serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması; lipid, protein, ve DNA gibi yapılarda oluşmakta olan biyolojik moleküler hasarın onarılması45, toplayıcı etki: serbest oksijen radikallerini etkileyerek onların tutulması veya daha zayıf yeni moleküle çevrilmesi, zincir kırıcı etki: serbest oksijen radikallerini bağlayarak, zincirlerini kırıp işlevlerinin engellenmesi46; serbest radikal üreten kimyasal reaksiyonların durdurulması47, baskılayıcı etki: serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak etkinliklerinin azaltılması veya inaktif şekle dönüştürülmesi23; reaksiyon hızının azaltılması48, hücresel kinaz yapılarını önleyip oksitlenme reaksiyonlarının durdurulması47, organizmadaki SOD gibi antioksidan enzimler ile enzimatik olmayan antioksidanların sentezininin artırılmasıdır49. Antioksidan tüketimindeki artış ve kanser görülme sıklığındaki düşüş arasındaki ilişki ile ilgili de bugüne kadar çok fazla şey irdelenmiştir. Hayvan modelleri ve hücre kültürleriyle yapılan çalışmalarla desteklenmiş epidemiyolojik çalışmaların sonuçları karsinogenez sürecinde oksidatif DNA hasarı olduğu teziyle uyuşmaktadır46. Bu sebeplerden, antioksidan destekleyiciler sık sık kanser önleyici diyet olarak önerilir50. e= Antioksidan Serbest radikal Normal atom Şekil 2-4: Antioksidan ve serbest radikal etkileşimi. 2.2.1. β-karoten A vitamininin suda eriyebilen öncülü olan β-karoten güçlü bir antioksidan olup dokularda peroksil radikallerinin yakalanmasından sorumludur. β-karotenin özellikle kimyasal karsinogenezde koruyucu rolü olduğu bilinmektedir11. β-karoten, özellikle 12 düşük oksijen geriliminde, peroksil radikallerini yakalar. Tek değerlikli oksijen radikallerini bağlayan serbest radikal tutucu olarak etkili bir antioksidan olmasının yanı sıra, kimyasal karsinogenezi de önler ve bu etkisini, diğer antioksidanlardan farklı olarak karsinojen ajanlarla çapraz bağlar kurarak gerçekleştirir51. Karotenoidler, bitkiler ve mikroorganizmalar tarafından sentezlenip, hayvanlar tarafından sentezlenemeyen, birçok meyve ve sebzeye parlak rengini kazandıran, doğal pigmentlerdir. Yediğimiz besinlerde onlarca karotenoid vardır ve bu karotenoidlerin çoğu antioksidan etkiye sahiptir. β-karoten şimdiye kadar üzerinde en fazla çalışılan karetenoidtir; bunun nedeni ise β-karotenin birçok ülkede yetişen meyve ve sebzelerde en çok görülen ortak karotenoid olmasıdır. β-karoten ve diğer karotenoidlerin in vitro ve hayvan modellerinde antioksidan özellikleri belirlenmiştir. Karotenoidlerin karışımı ya da diğer antioksidanlarla birlikteliği serbest radikallere karşı olan etkilerini arttırır52. Doğada 600’ün üzerinde karotenoid bulmaktadır. Bunlardan ortalama 40’ı normal bir insanın diyetinde mevcuttur. Bu karotenoidlerden 14’ü ve bazılarının da metabolitleri insan kanında ve dokularda tespit edilmiştir53. Birçok epidemiyolojik çalışma karotenoid tüketiminin artmasıyla, kronik hastalık görülme sıklığının azaldığına işaret eder. Ne var ki; bu koruyucu mekanizma tamamen anlaşılabilmiş değildir. Bu konuda çeşitli olasılıklar mevcuttur; bazı karotenoidler, retinoidlere dönüşebilirler (proenzim A etkinliğine sahiptirler), lipoksigenazların enzimatik etkinliğinini düzenleyebilirler (proinflamatuar veya bağışıklık düzenleyici molekül), antioksidan özelliğe sahip olabilirler, bir proteinin üretiminden sorumlu gen anlatımını aktifleştiriyor olabilirler54. Karotenoidlerin antioksidan etkisinin altında yatan; tek oksijeni tutma özellikleri ve peroksil radikalleri yakalama yetenekleridir55. Diyette en bol bulunan karotenoid olan β-karoten insan vücudunda A vitamini molekülüne dönüşmektedir. β-karoten serbest oksijen radikallerinin oluşumunu önlemesinin yanı sıra radikallerle doğrudan reaksiyona girebilir10. Sebze ve meyve yeme alışkanlığı az olan bireylerin plazma retinol ve β-karoten düzeyleri bu tür alışkanlığı fazla olan bireylerden düşük çıkmıştır56. Meyve ve sebzelerde flovanoidlerin önemli kısmı kabuklarında yer alır. Bu nedenle kabuklarıyla beraber ya da kabuğu fazla derinden soymadan yemek daha faydalıdır. Sebzelerin az haşlanması da, vücudun β-karoteni daha iyi absorbe etmesine yardımcı olur. Havuç, domates, patates, kavun, karpuz, kayısı ve mango zengin β-karoten kaynaklarıdır. 13 A vitamini oksidatif nedenlerle oluşan hücre yıkımının tamirinde önemli rol oynayan bir vitamindir. A vitamini eksikliği olan sıçanlarda süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz enzim düzeylerinde azalma ve lipid peroksidasyonunda artma saptanmıştır. Bazı epidemiyolojik çalışmalarda ateroskleroz va kanser insidansının uygun miktarda β-karoten ve diğer karotenoidleri alan kişilerde daha düşük olduğu belirlenmiştir57. β-karoten’nin yanında izoflavon, retinoik asit ve α-tokoferol gibi birçok beslenme faktörünün kanser gelişimini engellediği öne sürülmektedir58–63. Bu beslenme faktörlerinin; anti-kanser etkilerini, apoptozu indükleyerek, antioksidan gibi davranarak, anti-inflamatuvar ajan gibi davranarak veya farklılaşmayı indükleyerek ortaya koyduğu düşünülmektedir58,64. Çok sayıda epidemiyolojik çalışmada; fazla miktarda karotenoidlerce zengin meyve ve sebze tüketen ve/veya yüksek miktarlarda β-karoten serumu alan bireylerin diğerlerine oranla özellikle akciğer olmak üzere birçok tümör bölgesindeki kansere karşı düşük risk taşıdığı gösterilmiştir60,65,66. Hücre kültürü ve hayvan deneylerinden elde edilen bulgular65,67 en fazla provitamin A aktivitesine sahip karotenoid olan β-karoten’nin, bu ilişkiden sorumlu bileşik olabileceğini göstermektedir65. Bu bulgulara dayanarak β-karoten’nin kronik farmakolojik dozları kullanılarak insan çalışmaları da yapılmıştır. Beklenmedik bir şekilde insan aracılı denemeler, sigara içenlerde akciğer kanseri oluş sıklığını düşürmemiş hatta daha da arttırmıştır65,68,69. Bu nedenle; β-karoten ve diğer karotenoidlerin, fizyolojik işlevleri ayarlama ve hücre çoğalmasındaki rolünün etki mekanizmasının anlaşılması için büyük bir çaba harcanmıştır. β-karoten’nin hücre içi redoks konumunu düzenleyebilme yeteneği, onun kanseri önlemede hem faydalı hem de zararlı bir ajan olarak rolünü açıklayabilecek bir mekanizma gibi düşünülmektedir. Bu bileşik, kendi özelliklerinin yanında etki gösterdiği biyolojik çevrenin redoks potansiyeline de bağlı olarak, serbest radikal üretimini engelleyerek antioksidan65,67,70,71 ya da serbest radikallerle indüklenen reaksiyonları ilerleterek prooksidan olarak görev yapıyor olabilir65,72,73. Her iki durumda da, bu molekül hücre proliferasyonundaki değişime katkıda bulunmaktadır. Bu hipoteze göre, birçok hücreiçi redoks modülatörünün, hücre proliferasyonu ve apoptozla ilgili farklı sinyal yolaklarının düzenlenmesinde anahtar rol oynadığı bildirilmiştir65,74. Geçmiş epidemiyolojik bildirilerde de, karotenoidlerce zengin yiyeceklerin besinlerle alınması ve kanser oluş sıklığı arasında ters bir ilişki olduğu gösterilmiştir75–77. Daha sonraları, Barrett’s özofagusu ve oral lökoplaki hastaları ile yürütülen çalışmalarda, β-karoten alımından sonra NK ‘Natural Killer’ hücrelerinde 14 artış olduğu gösterilmiştir75,78. Buna rağmen, sağlıklı bireylerde herhangi bir etkiye rastlanmamıştır79. Sigara ile indüklenen DNA hasarı (kansere neden olan) ile ilişkili çalışmalarda β-karoten’nin herhangi bir koruyucu etkisi görülmemiştir80. Bunun yanında; β-karotenin, seçili mitojenlere karşı hücre aracılı bağışık (immün) yanıtta makul bir artış gösterdiği belirlenmiştir75,80. Başka bir çalışmada; β-karoten’nin apoptoz ve hücre döngüsünü G2/M fazında tutuklayarak, birçok insan kolon adenokarsinoma hücre soyunun (COLO 320 HSR, LS-174, HT-29 ve WiDr) çoğalmasını engellediği bildirilmiştir12. Bu etkilerin doza ve zamana bağlı olarak ve tamamen hücrenin karotenoidleri depolama yeteneği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. β-karoten’nin inhibe edici derişimlerinin, G2/M geçişinin anahtar düzenleyicisi olan siklin A anlatımını azalttığı gösterilmiştir12. Epidemiyolojik çalışmalar, fazla miktarda β-karoten ve diğer karotenoidlerce zengin besinlerin alımının, kolon neoplazisine karşı riskin azaldığını göstermektedir12,81,82. β-karoten alımının; adenom polipleri olan hastalarda kolon hücre proliferasyon oranını azalttığı bildirilmiştir83. Đlginç bir şekilde; bu karotenoidin insandaki kolonik neoplastik dokularda biriktiği gösterilmiştir12,84,85 ve birçok deneysel çalışmada; kemoterapötiklerin sitotoksisitesini arttırmak için önerilmektedir12,86. Sonuç olarak, birçok bildiride, hayvan modellerinde kolon kanseri oluşumuna karşı β-karoten’nin koruyucu etkisinin olduğu gösterilmiştir12,87–90 ve karotenoidlerin insan kolon kanseri hücre soylarının üremesini engelleyici etkileri gözlemlenmiştir12,91–93. Buna rağmen, β-karoten’nin kolon kanserine karşı koruyucu mekanizması çok iyi anlaşılamamıştır. β-karoten’nin apoptozu indükleyerek insan kolon adenokarsinoma hücre soylarının çoğalmasını engellediği düşünülmektedir12,94. β-karoten’nin, kolon91 kanser hücreleri dışında, melanoma95, prostat96, ağız, akciğer ve göğüs97 kanseri hücrelerini de içeren birçok tümör hücresinin çoğalmasını inhibe edici etkisi olduğu bilinmektedir. β-karoten’nin hücre içine alımının iki farklı mekanizma ile gerçekleşiyor olabileceği; bunlardan birinin bu karotenoidin pasif transportla hücre membranından geçişi olduğu, diğerinin ise metabolik olarak endositozla geçişi olabileceği düşünülmektedir98. β-karoten’nin bcl-2 gen ailesinden olan ve programlı hücre ölümünde inhibitör olarak görev yapan Bcl-2 ve Bcl-xL anlatımlarını da azalttığı belirlenmiştir12. Fakat proapoptotik Bax’ın, karotenoid muamelesinden etkilenmediği görülmüştür. Bcl-2’nin antioksidan yolağındaki rolü, bu proteinin ROS oluşumunu ve lipid peroksidasyonu ürünlerini azaltarak hücre ölümünü engellemesi ile açıklanmıştır99. Bu bulgular, β-karoten’nin derişime ve hücrenin biyolojik çevresine bağlı olarak 15 antioksidan ya da prooksidan olarak etki eden bir hücreiçi redoks ajanı olabileceğini göstermektedir12. 2.3. Hücre Ölüm Çeşitleri Çok hücreli organizmalarda hücre bölünmesi ile artan hücre popülasyonu hücre ölümleriyle dengelenir. Yine organizmada hücreler çeşitli fizyolojik ve fizyolojik olmayan olaylar ve yaşlanma sonucu ölürler100. Hücre ölümü ile ilgili yapılan ilk çalışmalar 19. yüzyılın ortalarında başlamış ve artan bir ilgiyle günümüze kadar gelmiştir. Yapılan birçok çalışma ile farklı mekanizmalara sahip çeşitli hücre ölüm tipleri tanımlanmış ve bu ölüm tipleri arasındaki ortak yolakların keşfi ile hücre ölümü tanım ve sınıflandırılması konusunda büyük karışıklıklar yaşanmıştır. Hücre ölümü araştırmalarında ortak bir dil kullanılması amacıyla 2005’de ‘Hücre Ölümü Nomenklatür Komitesi’ (NCCD) kurulmuştur. NCCD, hücre ölümü ve farklılaşması üzerine önerilerini yapmış ve yeni varsayılan hücre ölüm şekilleri tanımlanmıştır. Bu komite tarafından, daha önceleri yapısal özelliklere göre yapılan hücre ölümü sınıflandırması yerine, ölçülebilir biyokimyasal ve işlevsel özelliklere dayanan yeni bir hücre ölümü sınıflandırmasının yapılabileceği önerilmiştir101. Hücre ölümü yapısal görünüme göre (apoptotik, nekrotik, otofajik ya da mitozla ilişkili), enzimolojik kriterlere göre (nükleaz ya da kaspazlar, katepsinler ve transglutaminazlar gibi farklı proteaz sınıflarını içerip içermemelerine), işlevsel kriterlere göre (programlı ya da rastgele, fizyolojik ya da patolojik) ya da immünolojik kriterlere göre (immunogenik veya immunogenik olmayan) sınıflandırılmaktadır102. Şimdiye kadar birçok hücre ölüm tipi tanımlanmıştır. Bu ölüm tipleri, Apoptoz (kaspaz bağımlı veya bağımsız hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz, ölüm reseptörleri yolu ile hücre dışı ölüm uyaranlı apoptoz), Otofaji, Nekroz, Nekroptoz, Kornifikasyon, NEToz, Mitotik Katastrof, Anoikis, Eksitotoksisite, ‘Wallerian’ Dejenerasyonu, Paraptoz, Piroptoz, Entoz vs olmak üzere çeşitli şekillerde sınıflandırılmıştır. Fakat çeşitli hücresel strese karşı ortaya çıkan ve birbirinden farklı mekanizmalara sahip olan hücre ölümleri; yapısal, fizyolojik ve biyokimyasal olarak ele alındığında apoptotik, nekrotik ve otofajik hücre ölümü olmak üzere üç tipte toplanmaktadır. Diğerleri ise normalden farklı olan (belirli bir tipe uygun özellikte olmayan) hücre ölüm modellerinin geçici (kesin olmayan) tanımlarıdır. 16 Đlk keşfedilen programlı hücre ölüm şekli Apoptoz’dur ve hücre intiharı olarak da tanımlanmaktadır. Apoptoz, fizyolojik koşullarda çalışan bir ölüm mekanizması olmasına rağmen bazı patolojik koşullar da apoptotik hücre ölümü tetiklenir. Enerji üretim yetmezliği, iyon kanallarındaki bozukluklar veya pH dengesindeki aşırı değişimler gibi bazı fizyolojik koşulların aşırı derecede bozulması sonucu ortaya çıkan hücre ölümü Nekroz olarak tanımlanmıştır. Programlı nekroz ise, DNA hasarı ile veya ölüm reseptörleri yolu ile uyarılmaktadır. Eğer kaspaz-8 inaktif olursa, reseptörle etkileşen protein1 (RIP1) ve protein3 (RIP3) aktifleşerek nekrotik ölümü gerçekleştirirler. Bu kontrollü mekanizma Nekroptoz olarak isimlendirilmektedir103 (Şekil 2-5). Şekil 2-5: Nekroptoz. Sinyal kompleksleri TNFα tarafından tetiklenerek NF-κB’nin aktifleşmesine, apoptoza ve nekroptoza aracılık eder. (Kaynak104’den alınarak düzenlenmiştir) Hücrenin kendini yemesi şeklinde gelişen hücre ölümü ise otofaji olarak adlandırılmaktadır. Otofajik hücre ölümünde, devamlı işleyen otofaji sonrasında 17 yaşamsal organellerin ve proteinlerin ortadan kaldırılması ile yetmezliğe giren hücre kaspaz-bağımsız yoldan ölüme gider. Kornifikasyon; programlı hücre ölümünün epidermiste keratinositlerde gerçekleşen, hem yapısal hem de biyokimyasal olarak apoptozdan oldukça farklı olan çok özel bir çeşididir105. Kornifikasyon, kornifiye olmuş deri katmanının işlevi için gerekli olan, korneositlerin oluşumuna neden olur. Kornifikasyon bazen ‘keratinizasyon’ veya ‘kornifiye olmuş zarf formasyonu’ olarak adlandırılır106,107 ve diğer çekirdeksizleşmiş dokulardaki (lenf epitelyum ve olgun kırmızı kan hücreleri) gibi ölümle son bulan farklılaşma programı olarak düşünülmektedir108,109 (Şekil 2-6). Bunun nedeni, temelde bu süreçlerin hücre ölümünün moleküler mekanizmasının ( özellikle kaspazların) aktifleşmesinde rol oynamasına bağlı oluşudur109–112. Fakat korneositlerin tersine hem olgun kırmızı kan hücreleri hem de lenf epitel hücreleri stresle indüklenen ölüm sürecine girme özelliklerini devam ettirirler113,114 ve bundan dolayı kornifikasyon iyi niyetli (gerçek) bir hücre ölüm programı olarak düşünülmektedir101. Şekil 2-6: Kornifikasyon. Deri farklılaşması sırasında epidermisin farklı katmanlarında sentezlenen proteinler görülmektedir. Bazal katmanlarda apoptoz gerçekleşirken üst katmanlarda kornifikasyon meydana gelmektedir. (Kaynak106’den alınarak düzenlenmiştir) 18 Diğer bir hücre ölüm şekli olan NEToz (Netotik hücre ölümü) sadece granülositlerde gözlenir115. Kaspaz bağımsız, kaspaz inhibitörlerinden ve nekroztatinden etkilenmez. Otofajik ölüm mekanizması ile ortak yanları vardır. NET’ler ‘Neutrophil extracellular traps’ (Nötrofil hücre dışı tuzağı), DNA ve histonlar gibi bileşenlerden oluşurlar ve üzerleri çeşitli proteinlerle bezenmiştir106. Mitokondriler de NET oluşumu için DNA kaynağı olabilmektedir116. NET oluşumu NEToz-bağımlı bir süreç tarafından düzenlendiği düşünülen çok hızlı ve aktif bir süreçtir116 (Şekil 2-7). NEToz farklı bir ölüm tipi olarak sınıflandırılmakla birlikte üzerinde daha fazla araştırılmaya gereksinim vardır. Şekil 2-7: NEToz. Netotik hücre ölümü ile NET oluşumu. (Kaynak117 ’dan alınarak düzenlenmiştir) Mitotik katastrof (mitotik çöküş); hatalı mitoz sırasında veya hemen sonrasında meydana gelen bir hücre ölüm modelidir. Mitotik katastroftaki yapısal değişimler mikro-çekirdekleşme (kromozom ve/veya kromozom parçalarının yavru çekirdekler arasında eşit dağılmaması) veya multi-çekirdekleşmedir (sitokinez sırasında eksik veya hatalı ayrılmadan dolayı benzer veya farklı boyutlarda iki veya daha fazla çekirdek bulunması) (Şekil 2-8). Fakat bu terimin kullanımında yaygınlaşmış bir kabul yoktur118–120 ve mitotik katastrof apoptotik morfoloji ve nekrozu tetikleyebilir121. Bu nedenlerden dolayı NCCD, mitotik katastrof için daha kesin ve daha çok bilgi içeren ‘multi çekirdekleşmeyle başlayan hücre ölümü’ veya ‘metafaz sırasında oluşan hücre ölümü’ ifadelerinin kullanılmasını önermiştir101. 19 Şekil 2-8: Mitotik katastrof. Mitotik mekanizmalarda kimyasal veya genetik düzensizlikler olmadığı sürece, hücre diploid döller oluşturmak üzere hücre döngüsünün farklı fazlarında normal şekilde ilerler (a). Fakat, M fazında mitotik mekanizmayı etkileyen problemler veya kromozomal hatalar meydana gelirse, mitotik katastrof tetiklenerek hücre M fazında tutuklanır (b-d). Bu hücrenin akıbeti 3 şekilde olabilir. Hücre mitoz tamamlanmadan ölür (b), bir sonraki döngünün G1 fazına ulaşır (mitotik kayma) ve daha sonra ölür (c) veya mitozu tamamlar ve yaşlanır (d). (Kaynak122’den alınarak düzenlenmiştir) 20 Anoikis, substratlara veya diğer hücrelere bağlanma kaybı ile tetiklenen apoptoza denir123 (Şekil 2-9). NCCD tarihsel nedenler ve literatürde yaygın olarak kullanılmasıdan dolayı bu terimin kullanılmasını onaylamaktadır. Şekil 2-9: Anoikis. Đntegrin yokluğunda anoikis. (Kaynak124’den alınarak düzenlenmiştir) Eksitotoksisite, nöronlarda meydana gelen bir hücre ölüm şekli olarak tanımlanmıştır fakat apoptoz ve nekroz gibi diğer hücre ölüm şekilleri ile örtüşüyor gibi görünmektedir ve bu nedenle eksitotoksisite aslında farklı bir ölüm şekli olarak düşünülmemektedir101. ‘Wallerian’ Dejenerasyonu, sinir sisteminde meydana gelmektedir. Nöron ya da aksonun bir parçası, ana hücre gövdesini etkilemeden dejenere olur. ‘Wallerian’ dejenerasyonundan etkilenen nöronlar sağ kaldığı için bu terimin hücre ölüm şekli olarak tanımlanması doğru bulunmamaktadır125. 21 Paraptoz terimi ilk olarak, yapısal ve biyokimyasal açıdan apoptozdan farklı bir programlı hücre ölüm şeklini tanımlamak için kullanılmıştır126. Birçok hücre çeşidinde paraptoz, ‘insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü I’ anlatımı ile tetiklenir ve sitoplazmik vakuollenme ve mitokondriyal şişme meydana gelir fakat apoptoza ait herhangi bir yapısal özelliği taşımaz126. Paraptozun meydana gelmesi kaspaz inhibitörleriyle veya anti-apoptotik Bcl-2 benzeri proteinlerin aşırı sentezlenmesiyle engellenemez ve mitojenle-aktif protein kinaz ailesinin bazı üyelerini içeren sinyal kaskadlarından kaynaklandığı düşünülmektedir127. Bu nedenlerden dolayı paraptozun farklı bir ölüm çeşidi olup olmadığı çok net değildir. Piroptoz (patojen uyarılı konak hücre ölümü), ilk defa ‘salmonella typhimurium’ ile enfekte makrofajlarda gözlemlenmiştir128. Piroptoz kaspaz-1’in apikal aktifleşmesini içerir fakat kaspaz-3’ün aktifleşmesini içermez. Hücre ölümünün bu çeşidi IL-1β ve IL-18 salınımına neden olduğundan hem lokal hem de sistemik inflamatuar reaksiyonlarda önemli rolü olduğu düşünülmektedir129,130. Piroptoza uğrayan makrofajlar apoptoza özgü yapısal özellikler sergilemenin yanında nekroza özgü özellikler de sergileyebilmektedir131. Entoz, ilk olarak ‘Huntington’ hastalarından alınan lenfoblastlarda gözlemlenen bir çeşit hücresel kannibalizm (saldıran hücrenin lizozom aracılı sindirimi) olarak tanımlanmıştır132. Bu hücre ölüm çeşidinde bir hedef hücre komşu bir ev sahibi hücreyi istila eder ve ev sahibi hücre tarafından özümsenir. Özümsenen hücre fagozom içinde ölür133. Entotik özümseme sürecinde özümsenen hücrede; aktin polimerleşmesi ve miyozin II, Rho ve Rho kinaz ROCK aktivitesi gerekmektedir134. Entoz, Bcl-2 ve z-VAD-fmk tarafından inhibe edilemez ve yutulan hücre görsel olarak normal görünür, daha sonra ortadan kaybolur. Bu da büyük ihtimalle lizozomal bozulma yoluyla gerçekleşir. Nadiren, yutulan hücreler yutan hücrenin içinde bölünebilir veya tekrar dışarı salınabilirler133 (Şekil 2-10). Entoz hücre ölüm mekanizmasının gerçekleşebilmesi için her iki hücre aynı türden olmalı ve homotipik bağlantı kurulmalıdır. ‘Hücre içinde hücre’ morfolojisini incelemek zor olduğundan, bu hala araştırılmaya açık bir hücre ölüm modelidir135. 22 Şekil 2-10: Entoz. Matriks-bağımsız bir hedef hücre komşu bir hücreyi istila eder. Hedef hücre ev sahibi hücre tarafından özümsenir. Özümsenen hücre lizozamal enzimler tarafından bozulabilir, ev sahibi hücre içinde bölünebilir veya ev sahibi hücreden tekrar dışarı salınabilir. (Kaynak134’den alınarak düzenlenmiştir) Farklı hücre ölüm şekillerinin belirlenebilmesi için moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik çalışmaların yanında hücre morfolojilerinin mikroskobik görüntüleme yöntemleriyle de izlenmesi önem taşımaktadır. Şekil 2-11’de farklı katabolik süreçlere giren hücrelerin electron mikroskobu görüntüleri karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir. Şekil 2-11: Mitotik katastrof, apoptoz, nekroz ve otofajik vakuolizasyonun yapısal görüntüleri. (a) Đnsan kolorektal karsinoma HCT-116 hücrelerinin multi-çekirdekleşmesi, (b) Đnsan servikal karsinoma HeLa hücrelerinde piknoz, kromatin yoğunlaşması, plazma membranında kabarcık oluşumu, (c) Murine kolorektal karsinoma CT26 hücrelerinde membran dilasyonu ve hücre hacminin artması, (d) Murine striatal hücrelerinde otofajik vakualizasyon. (Kaynak134’den alınarak düzenlenmiştir) 23 Hücre ölüm şekilleri ile ilgili doğru bir sınıflandırmanın yapılabilmesi için kullanılacak tekniklerin çok dikkatli seçilmesi gereklidir. Bir hücre ölüm tipi için belirlenen özellikler farklı bir ölüm tipinde de gözlemlenebilir. Bu nedenle hücre ölümlerini ayırt edici özellikler gözönüne alınarak farklı biyokimyasal ve işlevsel yöntemler kullanılmalıdır. 2.3.1. Apoptoz Apoptoz terimi ilk defa 1972’de Kerr ve arkadaşları136 tarafından hücre ölümünün özel yapısal bir şeklini ifade etmek için kullanılmıştır. Apoptoz programlı bir hücre ölüm şekli olup, hücre intiharı olarak tanımlanmaktadır. Gelişim, dokularda hücre popülasyonunun korunması ve yaşlanma gibi homeostatik bir mekanizmanın sağlanması amacıyla fizyolojik olarak meydana gelir. Bunun yanında hücreler, hastalıklar veya zararlı ajanlar tarafından zarar gördüğünde veya bağışık reaksiyonlarda, koruyucu bir mekanizma olarak apoptoz oluşur137–139. Apoptotik hücre sayısı kişinin ya da organizmanın sağlıklı ya da hasta oluşunu belirlediğinden, apoptozun işlevsel mekanizmaları hücrede denge unsurudur140. Apoptotik hücreler organizmanın bazı dokularında ve hücrelerinde sürekli olarak oluşmaktadırlar ve bu oluşum ömür boyu devam etmektedir. Böylece ölüm (apoptoz) ve yeniden yapım (mitoz) bu dokularda doku homeostazını oluşturmak üzere dinamik bir denge halinde süregelir137. Her hücre çoğalır (proliferasyon), farklılaşır (diferansiasyon) ve ölür. Yeniden yapım ve yıkımın bir düzen içinde oluşu, apoptoz ve proliferasyon dengesinin sağlıklı bir şekilde sürdürülmesine bağlıdır141–143. Son yıllarda bu dengenin bozulmasının birçok önemli hastalığın patogenezinde rol aldığı gösterilmiştir144. Artmış proliferasyon ve azalmış apoptozun karsinogenezde rol oynadığı düşünülmektedir145. Ayrıca bazı durumlarda, apoptoza direnç göstermek, hücre kaybını azaltarak tümöre avantaj sağlamaktadır146. Apoptoz sürecinde rolü olan biyokimyasal ve genetik komponentlerin aydınlatılması, apoptozun aktifleşmesine ya da inhibisyonuna yönelik çalışmalar; kanser, AIDS ve otoimmün bozukluklar gibi birçok hastalıkta yeni tedavi olanaklarını gündeme getirmektedir147. 24 2.3.1.1. Apoptotik Hücrede Meydana Gelen Yapısal Değişimler Apoptoz süreci; DNA hasarına genlerin yanıtı, hücre membranı tarafından ölüm sinyallerinin alınması (Fas ligandı), hücreye doğrudan proteolitik enzim girişi (granzim) olmak üzere üç farklı şekilde işleyebilir148. Apoptoz sürecinde belli başlı üç anahtar bileşen vardır. Bunlar; Bcl-2 ailesi proteinleri, kaspazlar ve Apaf-1 (Apoptotik proteaz aktifleştirici faktör-1) proteinidir. Bu bileşenlerin biyokimyasal olarak aktifleşmesi, apoptozda gözlenen mitokondriyal hasar, çekirdek zarı kırılması, DNA fragmentasyonu, kromatin yoğunlaşması ve apoptotik cisimlerin şekillenmesi gibi yapısal değişikliklerden sorumludur149. Apoptotik sinyal alındıktan sonra hücrede yapısal ve biyokimyasal değişimler başlar. Hücre küçülmeye ve kondanse olmaya başlar, hücre iskeleti dağılır ve çekirdek zarı yer yer erir. Çekirdek DNA’sı parçalara ayrılır150,151. Apoptoza uğrayan bir hücrede laminin ve aktin flamentlerinin kesilmesi sonucu sitoplazma çekilmeye ve küçülmeye başlar. Kromatin ve çekirdekte bulunan yapısal proteinlerin parçalanması sonucu çekirdekte kondensasyon başlar ve çoğu zaman çekirdek kromatinin çekirdek membranının iç yüzüne yerleşmesi nedeniyle at nalı biçiminde görülür. Hücre büzülmeye ve küçülmeye devam eder ve makrofajların tanıyabileceği ve normal hücrelerden daha kolay ayırt edilebileceği membranla çevrili küçük parçalara ayrılır. Đçlerinde sitoplazma ve sıkıca paketlenmiş organeller ve bazılarında çekirdek parçaları da bulunan apoptotik cisimler meydana gelir152–154. Çekirdek de hücre gibi büzüşür ve bazen membranla sarılı olarak birkaç parçaya ayrılabilir. Nükleer porlar kromatinin membrana komşu olmadığı bölgelerde yoğunlaşırlar152. Apoptoz sırasında apoptotik hücrelerin membranlarındaki en belirgin değişim, normalde hücre membranının sitoplazmik yüzeyinde yer alan negatif yüklü fosfotidilserin (PS) birimlerinin hücre membranının dış yüzüne çıkmasıdır. Bu durum apoptotik cisimciğin fagositozu için bir uyarıdır. Apoptotik cisimcikler, sitokin salgılanmasını ve inflamasyon oluşumunu uyarmaksızın, makrofajlar ya da komşu hücreler tarafından fagosite edilirler (Şekil 2-12). Hücre iskeleti apoptozda önemli bir role sahiptir155. Apoptozun en belirgin özelliklerinden biri de hücre içi Ca ve Mg bağımlı endojen endonükleaz enziminin aktifleşmesi ile kromozomal DNA’nın nükleozomal birimlere parçalanmasıdır. Apoptotik hücrelerin DNA’sı agoroz jel elektroforezinde merdiven basamağına benzer (ladder formasyonu) bir yapı biçiminde görülür. Bu, apoptoz için tipik bir görünüm sağlar150,156,157. 25 Şekil 2-12: Apoptozun son evresi. (Kaynak158’den alınarak düzenlenmiştir) 2.3.1.2. Apoptoz Mekanizmaları ve Mitokondrinin Apoptozdaki Rolü Hücrenin kendi otomatik saati olan genlerin aktifleşmesi veya çevreden gelen sinyallerle apoptoz başlamaktadır142. Organizmada apoptozu uyaran ve engelleyen çok sayıda gen bulunmaktadır159. Apoptozu etkileyen hücre içi uyaranlar arasında sitokinler, hücre içi kalsiyum miktarında artış, TNF, DNA hasarı nedeniyle bir tümör süpressör gen olan p53’ün aktifleşmesi, viral bakteriyel enfeksiyonlar, glukokortikoidler ve onkogenlerin yer aldığı bilinmektedir. Ayrıca radyasyon, hipertermi, sitotoksik antikanser ilaçları ve hipoksi gibi nekroz oluşturabilen etkenler hafif dozlarda apoptoz meydana getirirler. Apoptoz çevreye rahatsızlık vermeksizin gelişse de bazen apoptoz dolaylı olarak çevre dokuda nekrozu başlatabilir ya da tam tersi nekroz apoptoz gelişimine yol açabilir159. Apoptozun düzenlenmesi Bcl2 / Bax gen ailesi ile sağlanır. Bu ailenin 20’den fazla üyesi tanımlanmıştır; bunlardan bazıları apoptoz inhibitörüdür (antiapoptotik), bazıları ise apoptozu uyarır ve proapoptotik genler olarak tanımlanırlar160 (Tablo 2-1). Apoptotik sinyalin alınmasından sonra kısaca; Bax (proapoptotik) proteinleri, mitokondri membranının iyon geçirgenliğini (permeabilitesini) değiştirir. 26 Membrandaki bu değişiklikler nedeniyle sitokrom c ve AIF (Apoptoz Đndükleyici Faktör) gibi mitokondri membranı içinde yer alan faktörler sitoplazmaya geçerler161. AIF doğrudan yoğunlaşan kromatine ve parçalanan çekirdeğe yönelirken, sitoplazmadaki sitokrom c apoptozun en son basamağında görev alır ve bir sitoplazma proteini olan Apaf-1’e bağlanarak prokaspaz-9’u aktifleştirir ve oluşan bu kompleks ‘apoptosom’ olarak isimlendirilir. Prokaspaz-9’un aktifleşmesi, bir seri kaspazın aktifleşmesine neden olur160,162. Tablo 2-1: Bcl-2 ailesi proteinleri. Antiapoptotik üyeler Bcl-2 Bcl-XL Bcl-W Mcl-1 Bfl-1/A1 Bcl-G Proapoptotik üyeler Bax Bak Bok Bcl-Xs Bad Bik Bid Bim Krk Mtd Nip3 Nix Nora Bcl-B Kaspazlar (cystein-dependent aspartate specific protease), sistein proteaz ailesine ait, apoptotik hücre ölümünün ana düzenleyicileri olarak görev yapan enzimlerdir. Bu enzimler sadece apoptozun başlangıç evresinde değil sonlanma aşamasında da 400’den fazla substratı proteolitik olarak keserek apoptotik hücre ölümünün karakteristiklerinin oluşmasından sorumludurlar. Yani apoptoz sırasında kaspazlar özgün substratlarının kesilmesinden ve tipik apoptoz ile ilişkili biyokimyasal ve yapısal değişikliklerden sorumludurlar163–165. Kaspazlar post-transkripsiyonel seviyede düzenlenip aktif olmayan pro-kaspaz olarak sentezlenmektedir. Çeşitli kaynaklardan gelen proapoptotik sinyallerin tetiklenmesi ile prokaspazlar proteazlar tarafından sindirilerek aktif kaspazlar haline dönüştürülür. Mitokondriyal dinamikler apoptotik yolaklara esas olarak kaspazların tetiklenmesi ve kromozomal parçalanma ile katılırlar166,167. Bugüne kadar memelilerde 14 adet kaspaz tanımlanmıştır. Kaspaz enzimleri apoptozu başlatıcı kaspazlar (kaspaz-2, -8, -9, -10) ve apoptozu sonlandırıcı kaspazlar (kaspaz -3, -6, -7) olmak üzere iki grupta incelenmektedir. 27 Diğer kaspazlar ise proinflamatuar sitokinlerin inflamasyon sürecinde görev almaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, kaspaz aktifleşme sürecinin başlatıcı kaspazlar ve sonlandırıcı kaspazlar için farklı olduğunu göstermektedir168,169. Mitokondri apoptozun düzenlenmesinde en önemli rolü oynayan organeldir. Apoptotik kaskad iki ana yol ile başlatılır. Bunlar; ölüm reseptörü yolu (ekstrinsik-dış yolak) ve mitokondri yolu (intrinsik-iç yolak)’dur170. Mitokondriyal hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz kaspaz bağımlı ve kaspaz bağımsız olarak gerçekleşebilir (Şekil 2-13). Apoptoz esnasında, mitokondri membran geçirgenliği artar ve proapoptotik faktörler sitoplazmaya salınarak apoptotik fenotipin oluşmasına neden olur25. Dış mitokondri membranında bulunan antiapoptotik Bcl-2 ailesi proteinleri (Bcl-2 ve Bcl-XL) hücrenin yaşlanmasını teşvik ederken, bu protein grubunun proapoptotik üyeleri olan Bad ve Bax mitokondri membranında doğrudan etkileşerek ya da antiapoptotik üyelere bağlanarak heterodimerik molekülleri oluştururlar ve hücreyi ölüme sürükler. Bax, dış mitokondri membranında por oluşturarak ∆Ψm’nin değişimini sağlayarak sitokrom c ile AIF’in bu pordan salınmasına aracılık eder. Bcl-2 ve Bcl-XL por oluşumunu önlemektedir. Bax ya da Bad’ın Bcl-2 ve Bcl-XL ile heterodimer oluşturması da bu proteinlerin koruyucu etkilerini ortadan kaldırır171. 28 Şekil 2-13: Mitokondriyal hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz. Mitokondri dış membran permeabilizasyonu, MOMP; mitokondri transmembran potansiyeli, ∆ψm; reaktif oksijen türleri, ROS; mitokondri iç membran boşluğu, IMS; sitokrom c, CYTC; apoptoz inhibe edici protein, IAP; endonükleaz G, ENDOG; apoptoz indükleyici faktör, AIF; mitokondiriyel iç membran, IM; mitokondiriyel dış membran, OM; geçirgenlik değişim por kompleksi, PTPC. (Kaynak122’den alınarak düzenlenmiştir) Proapoptotik ve antiapoptotik aile üyeleri mitokondri yüzeyinde karşılaştıklarında burada henüz tam olarak aydınlatılamamış bir mekanizma ile sitokrom c salınımının kontrolü için yarışmaya girerler. Eğer proapoptotik moleküller baskın gelirse mitokondriden sitokrom c gibi bir dizi molekül salınır. Ölüm reseptörü yolağı ile mitokondriyal yolak, kaspaz-3 aktifleşmesi düzeyinde birleşir. Kaspaz-3’ün aktifleşmesi IAP (apaptoz inhibitörleri) proteinleri tarafından inhibe edilir. Mitokondriden salınan Smac/DIABLO proteinleri de IAP inhibitörleridir. Kaspaz-3 yolağının altında apoptotik program dallanmaya başlar ve bu dallanmanın sonucunda sinyal tüm hücreye iletilir ve hücre sonunda ortadan kaldırılır171. 29 Ölüm reseptörü yolu, sitokinin hücre yüzeyine bağlanması sonucu, kaspaz 8 veya kaspaz-10’un reseptör aracılığı ile aktifleşmesi ve onu izleyen kaspaz-3 ve kaspaz7’nin aktifleşmesini kapsamaktadır172. Mitokondri ve ölüm reseptörü yolakları arasındaki çapraz etkileşim ve birleşmeler proapoptotik Bcl-2 ailesi üyelerinden Bid tarafından sağlanır. Bid’in kaspaz-8 tarafından kesilmesi ölüm etkinliğini arttırır ve proteinin mitokondriye girmesine olanak verir. Bid mitokondriden sitokrom c çıkışını gerçekleştirir (Şekil 2-14). Birçok durumda bu iki yolak arasındaki etkileşim minimum düzeydedir ve her bir yolak bağımsız bir biçimde çalışır171. Şekil 2-14: Apoptozun ölüm reseptörü yolu ile mitokondri yolunun etkileşimi. (Kaynak173’den alınmıştır) 2.3.2. Nekroz Nekrotik hücre ölümü veya nekroz, yapısal olarak hücrenin hacim kazanması, organellerin şişmesi, plazma membranının parçalanması ve buna bağlı olarak intraselüler içeriğin kaybı ile belirlenir101. 30 Uzun süre nekroz sadece kontrolsüz rastgele meydana gelen hücre ölüm çeşidi olarak düşünülmüştür fakat nekrotik hücre ölümünün meydana gelmesinde hassas şekilde düzenlenmiş birtakım sinyal ileti yolakları ve katabolik mekanizmaların rol oynadığına dair deliller bulunmaktadır174,175. Programlı nekroz, DNA hasarıyla veya ölüm reseptörleri yolu ile uyarılır. Kaspaz-8 inaktif olursa, RIP1 ve RIP3 aktifleşerek nekrotik ölümü gerçekleştirirler. Bu kontrollü mekanizma nekroptoz olarak isimlendirilir103. Nekroptozun programlı ve tesadüfi nekroz çeşitlerini ayırmak için uygun bir yol olduğu düşünülmektedir101. Nekroz; ATP miktarının azalıp, hücre homeostazının hızla bozulduğu, inflamasyon (iltihap) yanıtının geliştiği patolojik bir hücre ölüm şekli olup çeşitli fiziksel ve kimyasal dış etmenlerle gerçekleşir. Oksijensiz kalma, aşırı ısı değişimi ve çeşitli toksinlerin etkileri nedeniyle meydana gelen travmatik hücre ölüm şeklidir. Nekroz sırasında hücrede meydana gelen olaylar şu şekilde özetlenebilir: Endoplazmik retikulum, mitokondri, golgi kompleksi gibi organellerde şişme; hücre zarının su ve iyon taşıma dengesinin bozulması, dış ortamdan Ca+2 iyonlarının hücre içine geçmesi, su girişinin aşırı derecede artması; hücre içinde artan Ca+2’ların endonükleazları aktifleştirmesi ile DNA da kırıklar oluşması, nüklear kromatinin dağılması, çekirdek zarının parçalanması; giren su nedeniyle hücre zarının parçalanması, hücre içi bileşenlerin etrafa yayılması ve o bölgede inflamasyonun meydana gelmesidir100. Çeşitli aracıların, organellerin ve hücresel işlemlerin nekrotik hücre ölümünde rol oynadığı bilinmektedir fakat bunların kendi aralarındaki ilişkilere tam olarak açıklık getirilememiştir. Şimdiye kadar nekrozu net bir şekilde belirleyebilecek biyokimyasal bir değişim üzerinde tam olarak uzlaşılamamıştır101. 2.3.3. Otofaji Otofaji, kendi kendini (auto) yeme (phagy) anlamına gelmektedir ve hücrenin açlıkla karşılaştığı fizyolojik koşullarda, besin elde etmek için hücre içindeki yapıları ne şekilde parçaladığını ifade etmek amacı ile kullanılmıştır176. Otofaji, hücre içi makro moleküllerin ve organellerin bir kesecik içine alınarak lizozomlara yönlendirilmesi ve burada lizozomla birleşerek parçalanmasına yol açan bir mekanizmadır (Şekil 2-15). Uzun ömürlü proteinler ve hücre içi organeller otofaji sistemi tarafından parçalanırlar ve oluşan yapıtaşları hücre kulanımı için yeniden kazandırılır177,178. Yapılan ilk çalışmalarda; otofajinin, besin yokluğunda hücre içi moleküllerin geri dönüşümünü 31 sağlayarak hücrenin stres ortamına uyumuna yardım ettiği ve böylelikle hücre homeostazının etkili bir yol olduğu gösterilmiştir177,178. Son on yılda yapılan çalışmalar ise otofajinin; metabolizmanın düzenlenmesi, forfogenez, hücre farklılaşması, yaşlanma, hücre ölümü ve bağışıklık sisteminin bir parçası olarak hücre içi patojenlerin yıkımında da etkili bir rol oynadığını ortaya koymuştur178,179. Yapılan araştırmalar, otofaji anormalliklerinin, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve enfeksiyon hastalıkları gibi önemli sağlık sorunlarının da nedenleri arasında yer aldığını göstermektedir180. Şekil 2-15: Otofajik hücre ölümü. (Kaynak122’den alınarak düzenlenmiştir) Otofaji, makrootofaji, mikrootofaji ve şaperon aracılı otofaji şeklinde en az üç farklı mekanizma ile gerçekleşmektedir176. Otofaji mekanizmalarında rol oynayan proteinlerin çoğu ‘otofaji ile bağlantılı proteinler’ (Autophagy-related proteins) ya da kısaca Atg proteinleri, mayada yapılan çalışmalar sonucunda bulunmuş ve günümüzde 30’dan fazla Atg geni tanımlanmıştır181. Açlık, hipoksi ve çeşitli stres koşulları, hücredeki otofajik etkinliği uyarmaktadır. Otofajik hücre ölümünde en belirgin yapısal değişiklik, sitoplazmada oluşan iki veya daha fazla katmanlı zarla (lipid bilayer) çevrili keseciklerin oluşmasıdır. Bu kesecikler sitoplazma parçaları ve/veya mitokondri, endoplazmik retikulum (ER) gibi organelleri içerirler ve lizozomla kaynaşıp, içlerinde taşıdıkları yüklerin lizozomal enzimler tarafından parçalanmasını sağlarlar. Bu, hücre için hayati önem taşıyan bazı protein ve mitokondri gibi enerji metabolizmasında rol oynayan organellerin yıkımına yol açmaktadır176. Otofaji görülen hücrelerde, apoptozdan farklı bir ölüm gözlenmesine 32 rağmen, hücre ölümüne yol açan moleküler mekanizmaları hala ayrıntılı olarak tanımlanmadığından, otofajinin bu ölümde aktif rol oynayıp oynamadığı hala tartışılmaktadır182,183. Artmış otofaji görülen hücrelerde meydana gelen programlı ölüm, apoptozdan çok farklı yapısal ve moleküler özellikler taşımaktadır. Otofajik hücre ölümünde, kromatin yoğunlaşması gibi çekirdeğe özgü değişiklikler apoptotik hücre ölümüne nazaran çok daha sonra olmaktadır. Ölüm, kaspaz etkinliğine bağımlı olmadığından, ne DNA merdivenleri ne de apoptotik cisimcik oluşması gözlenmemektedir. Ayrıca, otofajide, ölü hücrelerin fagositoz tarafından temizlenmesi apoptozdakinden çok daha geç ve düzensiz bir biçimde olmaktadır176. Otofajik hücre ölümü daha çok sitoplazmada gelişen bir hücre ölümüdür, apoptozun en önemli hedefi ise DNA’nın bulunduğu hücre çekirdeğidir. Lenfositler gibi küçük sitoplazmalı hücrelerin yok edilmesi için apoptoz genellikle yeterli olurken, büyük sitoplazmalı moleküllerin yok edilmesi birden fazla mekanizmanın aynı anda aktifleşmesini gerektirebilir176. Böylece, apoptotik moleküler mekanizmalar çekirdeği yok ederken, otofaji sitoplazmayı ve buradaki organelleri temizleyerek ölümü hızlandırıyor olabilir görüşü literatürde bazı çalışmalarla desteklenmektedir176,184,185. Otofajinin açlık durumunda hücresel yapı taşlarının yıkılarak geri dönüşümü ve hücrenin enerji depolarını yenileyerek apoptotik hücre ölümünü engellediği ya da zıt olarak hücre ölümüne yol açtığının gösterilmesine ek olarak apoptozla karmaşık bir ilişkide olduğu pek çok yayında ifade edilmektedir176,186. Otofaji özellikle apoptotik hücre ölümünün baskılandığı koşullarda aktifleşerek, apoptozla ölmesi mümkün olmayan hücrelerin ölümüne yol açabilir. Bu özelliğiyle, bazı durumlarda apoptoz yanında bir ‘B planı hücre ölümü’ şeklinde görev yapabilir176. Bununla birlikte, otofaji ve apoptoz arasında en az üç farklı bağlantı gözlenmiştir. Otofaji; apoptoza paralel olarak hücre ölümüne yol açabildiği gibi, apoptozu baskılayarak hücrenin hayatta kalmasını sağlayabilir ya da apoptoz için bir ön koşul olabilir187. Bazı durumlarda otofaji ve apotoz hücrede birbirine zıt etkiler yaratabilmektedir. Bu durumda, otofaji hücre ölümüne karşı bir hayatta kalma mekanizması olarak çalışarak, apoptozun durdurulmasına ve ölümün engellenmesine yol açmaktadır176. Otofaji metabolik stres, ilaç ya da radyasyon hasarıyla karşı karşıya kalan hücrelerde anormal ve hasarlı proteinlerin yok edilmesinde ve genomik DNA’nın hasardan korunmasında önemli rol oynar. Otofaji yokluğunda tümor hücrelerinde, DNA hasarı, gen amplifikasyonu ve kromozomal anormallikler artmaktadır188. Ayrıca otofajinin; meme, prostat ve kolon 33 kanserlerindeki inhibisyonu, bu hücrelerin radyoterapiye ölüm yanıtını artırmaktadır189. Bazı durumlarda, otofaji kendi başına hücre ölümüne sebep olmaksızın apoptotik hücre ölümüne yardımcı olabilmektedir. Örneğin; besin yokluğunda otofaji bağımlı hücresel ATP düzeyinin sürdürülmesi apoptozun önemli belirteçlerinden olan fosfotidilserinlerin hücre zarının dışına transferini sağlar176. Bundan başka, apoptozda görülen hücre zarı tomurcuklanması (blebbing) enerji bağımlıdır ve aktin-miyozin kasılması ATP ile meydana gelmektedir190. Bu gözlemlerden ortaya çıkan karmaşık ilişkiler, moleküler düzeyde otofaji yolaklarının apoptoz sistemi ile birlikte düzenlenebileceğine, aynı sinyal bağlantılarıyla uyarılabileceklerine ve bazı ortak proteinlerin bu iki sistemin birbiriyle ilişkilerini düzenleyebileceğine işaret etmektedir176. 2.4. Kanser Hücreleri ve Kanser Hücrelerinin Hücre Kültüründeki Davranışları Hücre kültürü besiyerleri, hücrelerin normal metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan ortamı sağlayan besleyici çözeltilerdir. Đçeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla gerekli ozmolarite ve pH’yı da sağlarlar ve hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun sıcaklık, nem ve pH’nın sağlanması çok önemlidir. Kanser hücrelerinin kültürde gözlenen en önemli özelliği sınırsız çoğalma yetenekleri yani ölümsüzlükleridir. Bu hücrelerin çoğalma faktörlerine normal hücreler kadar gereksinim duymamaları hatta transformasyona yol açan faktörleri (TGF) salgılayabilmeleri onların değişmiş çoğalma özelliklerini yansıtır191. Tablo 2.2’de hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan bazı kanser hücre soyları gösterilmiştir. Normal hücrelerin karşılıklı temas üzerine, çoğalmalarının durmasına yol açan kontakt inhibisyonu kanser hücrelerinde gözlenmez. Bu nedenle kanser hücreleri bulundukları kültür şişelerinin tabanlarını örtecek bir yoğunluğa geldikten sonra da çoğalmalarını sürdürüp hücre yığınları oluştururlar. Aralarındaki ilginin düşük olması nedeniyle, normal somatik hücrelerin kültürlerinde gözlendiği gibi, normal dokuları anımsatan yapılar oluşturmazlar. Kanser hücrelerinde, hormal hücrelerde görülen, katı yüzeylere bağlanarak çoğalma eğiliminin de büyük öçüde ortadan kalktığı gözlenir. Buna rağmen, kanser hücreleri normal hücrelerin aksine, düşük lektin (membran proteinlerinin şeker molekülleriyle etkileşen çok sayıda bağlanma bölgesine sahip bitki kökenli proteinler) derişimlerinde bile topaklaşırlar. Kanser hücrelerinin fibronektin ağından yoksun olmaları ve sıklıkla çevrelerine plasminojeni aktifleştiren bir proteaz 34 salgılamaları, yüzeylerinde meydana gelen yapısal ve işlevsel değişiklikleri yansıtan özellikler arasındadır. Aktif mikroflamentlerinin yokluğundan kaynaklanan bozuk hücre iskeleti ve ‘Warburg etkisi’ olarak tanımlanan ve glikozu büyük ölçüde glikolitik yolla değerlendirme eğilimleri, değişik kanser hücrelerinin ortak olan diğer genel özellikleri arasında sayılabilir191. Tablo 2-2: Hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan bazı kanser hücre dizileri. Hücre Serisi Hücre Tipi ve Kökeni K562 CML transforme eritrolösemi hücre dizisi MCF-7 Meme adenokarsinoma hücresi dizisi HL60 Lösemi hücre dizisi (insan) HCT-116 Kolon karsinoma hücre dizisi A-2780 Yumurtalık kanser hücre dizisi A-549 Akciğer kanseri epitel hücre dizisi (insan) ARH-77 Plazma lösemi hücre dizisi 2.4.1. K562 ve MCF-7 Kanser Hücreleri K562 hücreleri, kronik miyeloid löseminin blastik kriz evresinden kaynaklanan miyeoid hücre dizileridir192,193. Kronik miyeloid löseminin hücresel işeretleyicilerinden biri olan Philadelphia kromozomu, hücrelerin granülositik serilerinde bulunur193. Bu hücreler, oksidatif stres, anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesi, eritroid farklılaşma ve glutatyon sistemi ile ilgili çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır194,195. K562 hücrelerine elektron mikroskobunda bakıldığında, düzgün şekilli, kısa mikrovillüslü, farklılaşmış lösemi hücrelerine benzer şekilde görülebilir193. Giemsa ile hazırlanmış preparatlarda ise yaklaşık 20 µ m çapında iki ya da daha fazla parçalı çekirdekli farklılaşmamış blast hücreleri olarak görülebilirler. Basofilik sitoplazmaları 35 hiç granül içermez193,194. K562 lösemi hücreleri kendilerini yenileme özellikleriyle hemopoetik pluripotent hücrelere benzerler. Bu hücre dizilerinde, B hücrelerine ait immunoglobulinler, Epstein-Barr virüs (EBV) genomu nükleer antijenine karşı reseptörler yoktur193,196. K562 hücre soyu lenfositik karaktere sahip değildir197. Bu hücreler, T lenfosit serilerinde bulunan B lenfosit serilerinde görülmeyen C’/Fc reseptörlerini bulundurmazlar; MLC (Mikst lenfosit kültürü) reaksiyonlarını uyaramazlar. Diğer tarafdan, T antijeni bulunmayan K562 hücreleri, yüksek radyasyona karşı hassastır ve timidin tarafından büyüme inhibisyonu söz konusudur. K562, immunoglobulin Fc alıcıları ve pinositoz için güçlüdür fakat fagosit değildir veya antikor bağımlı fagositoz ya da sitolize aracılık etmez193. Kültür medyumunda süspansiyon olarak büyüyen K562 hücrelerinin sayılarının iki katına çıkma süreleri ortalama 12 saattir198,199. Miyeloid lösemi hücreleri normal hücrelere göre daha yavaş proliferasyon ve büyüme hızına sahiptirler. Lösemi hücreleri belirli olgunluğa erişmedikçe bölünmezler. Olgunlaşma ve proliferasyon birbirine bağlı olaylardır194. K562 hücrelerinde normal kromozom sayısının yaklaşık 1,5 katı kromozom bulunur. Bu nedenle bu hücre serilerinde abl/bcr füzyon geni anlatımı nedeniyle apoptoza karşı direnç vardır200. Fakat sitotoksisite ve apoptoz çalışmaları için kullanımı oldukça yaygındır. Kültürde spontan olarak apoptoza gitmeyen K562 hücrelerinde farklı maddelerle apoptozu indüklemek iyi sonuçlar vermektedir201. MCF-7 hücreleri ise meme kanseri ile ilgili in vitro çalışmalarda en çok kullanılan hücre soylarından biridir. Bu hücreler, bulundukları kültür kabının tabanına yapışma özelliği gösteren adherent hücrelerdir. 1973 yılında Herbert Soule and arkadaşları bu hücreleri keşfetmiş ve Dentroit’deki ‘Michigan Cancer Foundation-7’ enstitüsüne atıf olarak bu ismi vermişlerdir202. MCF-7 meme kanseri hücreleri, insan adenokarsinomu kaynaklıdır. Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser türüdür ve meme kanserinin tedavisi oldukça zordur, çünkü tedavide farklı cevaplar sergileyen, farklı tümör sınıfları mevcuttur. Meme kanser gelişiminde, apoptoz ve hücre proliferasyonu arasında bir dengesizlik söz konusudur ve hücre döngüsünün sorunsuz olarak çalışması, hücre büyümesi ve hücre proliferasyonu için önemlidir203–206. Bu konuda yapılan çalışmalarda, MCF-7 meme kanseri hücreleri sıklıkla tercih edilmektedir. 36 2.5. Hücre Döngüsü Đnsan vücudundaki hücrelerin bir bölümü yaşam boyunca bölünme geçirirler. Bu nedenle sürekli bir farklılaşma söz konusudur. Hücrelerin bölünme hızları, hücrenin türüne, bulunduğu yere ve ihtiyaca göre değişmektedir. Bir hücrenin bölünebilmesi için, DNA, sitoplazma ve diğer hücre içeriğini iki katına çıkarması ve dolayısıyla belli bir büyüklüğe ulaşması gerekir207. DNA sentezi, bakterilere zıt olarak ökaryotik hücrelerde sürekli değildir. Hücre bölünmesinden önce sentez işlemi gerçekleşir. DNA sentezi, ökaryotik hücrelerde hücre döngüsünün sentez evresi olarak adlandırılan S fazında gerçekleşmektedir. S fazından önce ve sonra birer zaman aralığı (Gap) ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle hücre döngüsü G1 (ilk aralık), S (sentez), G2 (ikinci aralık) ve M (mitoz) olmak üzere dört evreden oluşur. G1, S ve G2 evrelerinin hepsine birden interfaz adı verilir. Interfaz, mitoza hazırlık evresidir. Đnterfazın G1 evresinde; hücre için gerekli RNA ve proteinler sentezlenir, DNA için sentez hazırlığı yapılır. S evresinde, RNA sentezi devam ederken protein sentezi en üst düzeye ulaşır, DNA sentezi yapılarak DNA miktarı iki katına çıkar. G2 evresinde; DNA sentezi tamamlanmıştır fakat RNA ve protein sentezi G1 evresindeki kadar olmamakla birlikte devam eder. Dokulardaki birçok bölünmeyen hücre, S evresinden hemen önce, yeteri kadar büyümemişlerse, hücre döngüsünü durdururlar. Böyle dinlenme durumundaki hücrelere Go durumundaki hücreler denir. Go birkaç gün, birkaç hafta sürebilir ya da hücre bölünmekten tamamen vazgeçebilir100. Hücre döngüsünün süresi hücre türüne göre farklılık göstermektedir. Bu süre hayvan hücrelerinde ortalama 18-26 saat iken bakteri hücresinde 20-30 dakikadır. Ancak bu süre, yüksek yapılı organizmalarda hücrenin bulunduğu dokuya göre değişebilmektedir. Örneğin, hızlı bölünebilen insan hücresinin iki yavru hücre oluşturması sırasında mitoz için 30 dakika, G1 için 9 saat, S için 10 saat, G2 için ise 4.5 saatlik süre gerekmektedir207. Hücre döngüsünün farklı evrelerindeki koordinasyon, kontrol noktaları (checkpoints) tarafından sağlanır. Hücre döngüsü kontrol noktalarının görevi, tamamlanmamış veya hasarlı kromozomların eşleşmesini engellemek ve bunların yavru hücrelere geçişini önlemektir. Hücre döngüsü boyunca belirlenmiş 3 kontrol noktası vardır, bunlar G1, M ve G2 kontrol noktalarıdır. G1 kontrol noktası; DNA’da bir hasar olduğunda hücre döngüsünün G1 de durmasını sağlar. Bu safhada çok iyi bilinen bir 37 kontrol noktası p53 proteinidir208. p53 DNA hasarına yanıt olarak salınır ve hücre döngüsü durur. p53 proteininin, hipoksi, bazı onkojenlerin aktifleşmesi, DNA hasarı gibi olaylar sonrası hücrenin; hücre döngüsünde duraklamaya veya apoptoza gitmesinde karar mekanizmasında önemli bir rolü vardır209,210. Yapılan çalışmalarda bazı kanser tiplerinde bu genin mutasyona uğradığı belirlenmiştir. p53’ün işlevini yitirmesi, G1’de hücre döngüsünün durdurulmasını önler ve hasarlı DNA içeren hücre, bölünme aşamalarını tamamlar ve bunun sonucunda mutasyonlar ortaya çıkar211,212. G2 kontrol noktası; DNA eşlemesinde bir hata olur ve ortamda eşleşmemiş DNA bulunursa, hücre döngüsünün G2 de durmasını sağlar100. Örneğin, rasyasyon ile hasara uğrayan DNA tamamen tamir oluncaya kadar G2 safhasında kalır213,214. M kontrol noktası ise; mitoz esnasında yavru kromozomlar mitotik iğcik üzerinde uygun şekilde dizilmezlerse, döngüyü M evresinde durdurmaktadır100. 38 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. GEREÇLER 3.1.1. Kimyasal Maddeler Akrilamit (Sigma) APS (Sigma) Aprotinin (Sigma) Bis-akrilamit (Sigma) Brome fenol mavisi (sigma) BSA “Bovine Serum Albumin” (Santa Cruz) CAPS (Merck) DMEM F-12 (Gibco) EDTA (Sigma) FBS (Gibco) H2O2 (Merck) MET (Sigma) NP 40 (Merck) Penicilin streptomycin (Gibco) PMSF (Sigma) Rho123 (Santa Cruz) SDS (Sigma) Standart (Invitrogen) TEMED (Sigma) Tripan Mavisi (Sigma) Tripsin EDTA (Gibco) Triton X-100 (Merck) 39 Tween 20 (Riedel) Gliserin, metanol, etanol, Tris, MgCl2, HCl, NaCl, KCl, KH2 HPO4, Na2HPO4.2H2O ve diğer tüm kimyasal malzemeler Sigma ve Merck firmalarından sağlandı. 3.1.2. Kitler Annexin V:FITC Apoptoz Belirleme Kiti (AbD Serotec) Kromojenik Substrat ‘Chromogenic Substrate’ (BCIP/NBT) (Invitrogen) Hücre Fraksiyonlama Kiti ‘Cell Fractionation Kit’ (MitoSciences) DNA Analiz Kiti ‘Cycle Test Plus DNA Reagent Kit’ (Becton Dickinson) DNA Kalite Kontrol Boncukları ‘DNA QC Particles’ (Becton Dickinson) Jel Aktarım Kiti ‘iBlot Gel Transfer Stacks, Nitrocellulose’ (Invitrogen) Protein Miktarı Belirleme Kiti ‘Quant-iT Protein Kit’ (Invitrogen) Western Emdirim Arttırıcı Kiti ‘Western Blot Enhancer Kit’ (Thermo Scientific) 3.1.3. Antikorlar ‘Anti-Cytochrome c, Rabbit Monoclonal Antibody’ (Millipore) ‘Anti-Smac/DIABLO, Mouse Monoclonal IgG’ (Upstate, Millipore) ‘Rabbit Polyclonal to Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase’ (Abcam) ‘Anti-AIF, Rabbit Monoclonal IgG’ (Millipore) ‘Purified Mouse Anti-Human Apaf-1’ (Becton Dickinson) ‘Anti-Bcl2, Mouse Monoclonal IgG’ (Millipore) ‘Mouse Anti-BCL-X Monoclonal Antibody’ (Upstate, Millipore) ‘Anti-Caspase 3, Rabbit Monoclonal IgG’ (Millipore) ‘Alkaline Phosphatase Conjugated Affinity Purified Secondary Antibody’ (Millipore) ‘Alkaline Phosphatase Conjugated Affinity Purified Goat Anti Rabbit IgG’ (Millipore) 40 3.1.4. Antioksidanlar β-karoten (Sigma) 3.1.5. Çalışmada Kullanılan cihazlar Floresan mikroskobu (Olympus BX51) Görüntüleme sistemi (DP2-BSW) Liyafilizatör (LABCONCO) Güç kaynağı (BĐO-RAD) Jel aktarım cihazı (Invitrogen) Fluorometre (Invitrogen) Buz Makinesi (HOSHIZAKI) Derin Dondurucu (-80 oC) (NUAIRE) Derin Dondurucu (-20 oC) (Şenocak) Isıtıcı (120 oC) (BIOSAN) Distile Su Cihazı (GFL) Elektroforez Tankı ( Đnvitrogen) Etüv (Sanyo) FACS Cihazı (Becton Dickinson) Hassas Tartı (SCALTEC) Laminar Hava Akım Cihazı ELB 2472 (Heraus) Manyetik Karıştırıcı (BIOSAN) Orbital Çalkalayıcı (BIOSAN) Karıştırıcı “Vorteks” (BIOSAN) Otoklav (HIRAYAMA) pH Metre (Hanna) Santrifüj Aletleri Tipleri (Hettich) Sıvı Azot Tankı (34 XT Taylor Wharton) 41 Su Banyosu (37 oC) (Heidolph) Ters Mikroskop (Olympus) 3.1.6. Çalışmada Kullanılan Eriyikler 3.1.6.1. FACS Analizi ve Floresan Boyama ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi için Kullanılan Eriyikler PBS 8,0 g NaCl 0,2 g KCl 1,44 g Na2HPO4.2H2 O 0,2 g KH2HPO4 dH2O ile 1000 ml’ye tamamlandı (HCl ile pH: 7,4’e ayarlandı). Rodamin123 Rho123 1 mg/ml olacak şekilde % 95’lik mutlak etanolde çözüldü. 3.1.6.2. Sitozolik ve Mitokondriyal Hücre Kesimlerinin Hazırlanması Đçin Kullanılan Eriyikler Hipertonik Eriyiği 20 mM HEPES (pH:7,4) 10 mM KCl 2 mM MgCl2 1 mM EDTA 1 mM PMSF 10 µg/ml Aprotinin Hücre Parçalama (Lizis) Eriyiği 150 mM NaCl 5 mM EDTA 50 mM Tris-HCl (pH: 8.0) %1 NP 40 42 %1 CAPS %2 Triton X-100 1 mM Aprotinin 3.1.6.3. PAGE Đçin Kullanılan Eriyikler %12’lik Alt jel AA/BA (30/0,8) 1,5 M Tris HCl (pH:8,8) %10 SDS %10 APS 6,5 M TEMED dH2O %5’lik Üst jel AA/BA (30/0,8) %10 SDS %10 APS 6,5 M TEMED 1 M Tris HCl (pH:6,8) dH2O Yükleme eriyiği (2x) 1 M Tris HCl (pH: 6,8) 14 M MET % 10 SDS % 99 Gliserin % 0,1 Bromfenol mavisi dH2O 43 Durdurma Eriyiği 20 mM Tris HCl (pH:8,0) 5 mM EDTA 3.1.6.4. Western Emdirimi Đçin Kullanılan Eriyikler TBST 10 mM Tris HCl (pH: 8,0) 150 mM NaCl % 0,05 Tween 20 dH2O’da çözüldü. BSA’lı TBST % 0,5’lik BSA, TBST içerisinde çözüldü. 3.1.6.5. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulaması Đçin Kullanılan Eriyikler H2O2 Stok 1M H2O2, %35’lik H2O2 kullanılarak, steril dH2O ile hazırlandı. β-karoten Stok 10 mM β-karoten, metanolde β-karotenin çözülmesi ile hazırlandı. 3.2. YÖNTEMLER 3.2.1. Hücre Kültürü 3.2.1.1. Hücrelerin Bakımı Hücreler (K562, MCF-7), kültür şişelerinde (flask) %10 FBS ve %1 antibiyotik (100 µg/ml streptomisin ve 100 U/ml penisilin) içeren DMEM F-12 medyumu (complete DMEM) içerisinde, 37 0C’de % 5 CO2’li kültür ortamında yetiştirildi. 2-3 günde bir ters (invert) mikroskopta kontrol edilen hücreler semikonfluent duruma geldikçe pasajları yapıldı. 3.2.1.2. Hücrelerin Pasajlanması K562 hücreleri (süspansiyon hücreler) kültür şişelerinden hücre kazıyıcı (cell scraper) ile kaldırılıp 15 ml’lik steril falkon tüplerine aktarılarak 3000 devir/dakika’da 5 44 dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonrası süpernatant (üst sıvı) uzaklaştırılırken hücre pelleti (çöken kısım) taze cDMEM’de çözüldü. Kültür şişelerinde 1-2 x 105 hücre/ml olacak şekilde hücre ekimi gerçekleştirildi ve etüve kaldırıldı. Tabana yapışan (adherent) MCF-7 hücrelerinin pasajı ise tripsinleme ile yapıldı. Hücreler semikonfluent duruma geldikçe kültür şişelerindeki üst sıvıları dökülerek üzerlerini kaplayacak kadar tripsin-EDTA ile 2-5 dakika muamele edildi. Tabandan kaldırılan hücreler santrifüj tüplerine aktarılarak üzerlerine 4-5 ml DMEM eklendikten sonra 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonrası üst sıvı uzaklaştırılıp, hücreler 5 ml cDMEM’le yıkandıktan (3000 devir/dakika, 5 dakika santrifüj) sonra kültür şişelerine ekildi ve etüve kaldırıldı. 3.2.1.3. Hücre Sayımı ve Ekimi Kültür ortamında çoğaltılan hücreler yüzeyden kaldırılarak santrifüj tüplerine aktarıldı. Yıkama işlemlerinden sonra pelet cDMEM’de çözülerek hücre süspansiyonu içinden bir miktar çekilip, tam ortasına lamel yerleştirilen hemositometreye (Neubauer tipi) aktarıldı (Şekil 3-1). Şekil 3-1: Hemositometrede hücre sayımı. Mikroskopta incelenen hemositometrenin köşelerinde bulunan 16’şar kareden bir kısmı sayılarak ortalama hücre sayısı (ort.h.s.) bulundu. Daha sonra 1 ml’deki hücre sayısı; Ort. h. s. x 16 x 104 şeklinde hesaplandı. Toplam hücre sayısı ise seyreltme faktörü (s.f.) ile ml’deki hücre sayısı çarpılarak elde edildi; 45 Ort. h. s. x 16 x 104 x s.f. Hücre sayısı belirlendikten sonra ekilmek istenen hücre sayısı, ml’deki hücre sayısı ile orantı kurularak hesaplandı. Belirlenen hacim, hücre süspansiyonundan çekilerek içinde cDMEM bulunan kültür şişelerine aktarıldı. 3.2.1.4. Hücrelerin Dondurulması Hücreler bulundukları kültür şişelerinden toplanıp santrifüj tüplerine aktarıldıktan sonra 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüj edildi. Pelet, tüp içerisindeki hücre sayısı 2-8x106 olacak şekilde FBS ile süspanse edildi. Hücreler, DMSO/hücre süspansiyonu oranı 1:9 olacak şekilde hızlı bir şekilde kryo tüplere aktarılarak -80 0C’ye kaldırıldı. 24 saat -80 0C’de bekletildikden sonra -196 0C’lik sıvı azot tankına alındı. 3.2.1.5. Hücrelerin Çözülmesi Hücreler sıvı azot tankından alınarak 37 0C’de su banyosunda veya avuç içinde ısıtılarak çözüldü. Hücreler çözülür çözülmez DMSO’yu uzaklaştırmak amacı ile 2 kez medyum ile yıkandı (3000 devir/dakika’da 5 dakika). Son olarak pelet medyumda çözülerek içinde cDMEM bulunan kültür şişelerine aktarıldıktan sonra mikroskopta incelenip etüve kaldırıldı. Hücrelerin üst sıvıları 24 saat sonra tekrar değiştirildi. 3.2.2. Hücre Canlılığının Belirlenmesi Hücre canlılığı Tripan mavisi (Trypan Blue Exclusion) testi ile belirlendi. Hücreler kültür şişelerinden toplanıp santrifüj tüplerine aktarılarak dakikadaki devir sayısı 3000 olacak şekilde 5 dakika santrifüjlendikten sonra PBS ile bir kez yıkandı. Hücre süspansiyonu 1:1 oranında % 0,4’lük Tripan mavisi ile karıştırılarak 4-5 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Karışımdan alınan örnek lam üzerinde ışık mikroskobunda incelendi (Şekil 3-2). Şekil 3-2: Tripan mavisi ile boyanan hücrelerin lam üzerine aktarımı. 46 Canlı hücreler membran bütünlükleri ve geçirgenlikleri bozulmadığı için boyayı içine almayacaklarından, boyanmamış hücreler canlı, mavi boyanmış hücreler ise ölü olarak kabul edildi (Şekil 3-3). Şekil 3-3: Tripan mavisi testi ile canlı ve ölü hücrelerin belirlenmesi. Hücre canlılığı (%); ‘canlı hücre sayısı (x100) / toplam hücre sayısı’ ile belirlendi. 3.2.3. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulamaları 3.2.3.1. Hücrelere H2O2 Uygulanması K562 ve MCF-7 hücreleri, kültür şişelerinde veya 6 kuyulu kültür plaklarında eşit sayıda hücre/cDMEM olacak şekilde ekildi. Ekimden bir gün sonra hücrelere farklı derişimlerde H2O2 verilerek 24, 48 ve 72 saat boyunca etüvde bekletildi. Bu sürelerin sonunda, H2O2’nin hücrelerde yarattığı oksidatif etkiler farklı yöntemler kullanılarak belirlendi. 3.2.3.2. Hücrelere β-Karoten Uygulanması β-karoten’in K562 ve MCF-7 hücrelerinde tek başına etkisinin olup olmadığını belirlemek amacıyla, hücreler 6 kuyulu kültür plaklarının her bir kuyusunda 25x104 hücre / 2 ml cDMEM olacak şekilde ekildi ve ekimden 24 saat sonra hücrelere farklı derişimlerde (0,1 nM-100 µM) ve (1-4 µM) β-karoten verilerek 37 oC’de 24 saat bekletildi. Bu süre sonunda Akım Sitometri analizleri ile ∆Ψm’ndeki değişiklikler incelendi. Elde edilen sonuçlara göre, β-karoten’in bu derişimlerde tek başına ∆Ψm 47 açısından herhangi bir etkisinin olmadığı görüldü ve çalışılacak derişim 1 µM olarak seçildi. Daha sonra 1 µM β-karoten’in zamana bağlı etkisini belirlemek amacı ile hücreler 24, 48 ve 72 saat süreyle β-karoten ile muamele edilerek FACS analizleri yapıldı. 3.2.3.3. Hücrelere H2O2 ve β-Karoten’in Birlikte Uygulanması H2O2 ve β-karotenin hücrelere aynı anda uygulanması: K562 hücreleri 6 kuyulu kültür plaklarının her bir kuyusunda 25x104 hücre/2ml cDMEM olacak şekilde ekildikten 24 saat sonra, 100 µM, 250 µM, 500 µM, 750 µ M, 1000 µM H2O2 ve 1 µM β-karoten hücrelere aynı anda verildi. Hücreler 24, 48 ve 72 saat süre ile 37 oC’de bekletildikten sonra FACS analizleri ile ∆Ψm’ndeki değişiklikler incelendi. Önce H2O2 sonra β-karoten uygulanması: Hücreler 6 kuyulu kültür plaklarına ekildikten bir gün sonra 100 µM, 250 µM, 500 µM, 750 µM, 1000 µM H2O2 verildi. 24 saat sonra H2O2’yi uzaklaştırmak için kuyulardaki hücreler toplanıp kuyu içerikleri tüplere aktarıldı ve tüplerdeki hücreler 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlenip üst sıvılar atıldı. Çöken hücreler 2 ml medyumda çözülerek aynı kuyulara tekrar ekildi. Daha sonra 1 µM β-karoten hücrelere verilip 24 saatlik zaman aralıkları ile 72 saat boyunca inkübe edilelerek FACS analizleri yapıldı. Önce β-karoten sonra H2O2 uygulanması: Hücreler 6 kuyulu kültür plaklarına ekildikten bir gün sonra 1 µM β-karoten ile muamele edildi. 24 saatlik β-karoten muamelesinden sonra β-karoteni uzaklaştırmak için kuyulardaki hücreler toplanıp kuyu içerikleri tüplere aktarıldı ve 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlenip üst sıvı atıldı. Çöken hücreler 2 ml medyumda çözülerek aynı kuyulara tekrar ekildikten sonra 100 µM, 250 µM, 500 µM, 750 µM ve 1000 µM H2O2 hücrelere uygulandı. Hücrelerin 24, 48 ve 72 saat süre ile 37 oC’deki inkübasyonundan sonra FACS analizleri yapıldı. 3.2.4. FACS Analizi ile Mitokondri Membran Potansiyelinin (∆Ψm) Belirlenmesi ∆Ψm, lipofilik katyonik bir floresan boya olan Rodamin123 (Rho123) kullanılarak belirlendi. Deney sürecini tamamlamış hücreler kültür şişelerinden toplanıp FACS tüplerine aktarıldı ve 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendikten sonra hücre peleti 2 ml serumsuz medyumda çözüldü. Kontrol dışındaki tüm tüplere 0,5 µg/ml Rho123 eklendi ve tüpler 37 0C’de 15 dakika karanlıkta inkübe edildi. Đnkübasyon süresi sonunda hücreler 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendikten sonra üst 48 sıvılar uzaklaştırıldı. Çöken hücreler 2,5 ml PBS’de çözüldü ve 3000 devir/dakika’da tekrar 5 dakika santrifüj edildi. Son olarak 500 µ l PBS’de çözülen hücreler FACS cihazından geçirilerek Rho123’ün floresan yogunluğu üzerinden ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. 3.2.5. Đmmünfloresan Yöntemi ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm’ndeki değişimin floresan mikroskobunda görüntülenebilmesi için, hücrelerin 2 ml cDMEM’li ortamda, 6 kuyulu plaklardaki lameller üzerine bir gün önceden ekilerek yapışmaları sağlandı. Oksidan ve antioksidan maddeler deney gruplarına göre uygulanıp, hücreler deney sürecini tamamladıktan sonra PBS ile 3 kez yıkandı. Her bir kuyuda 0,75 µ l Rho123 / ml DMEM olacak şekilde Rho123-DMEM karışımı uygulandıktan sonra hücreler 15 dakika 37 0C’de karanlıkta bekletildi. Bu süre sonunda hücreler tekrar PBS ile 3 kez yıkandı ve lameller lamların üzerine kapatılarak hücrelerin Olympus BX51 floresan mikroskobunda belli büyütmelerde görüntüleri alınıp fotoğrafları çekildi. 3.2.6. Erken Apoptotik Hücrelerin AnnV Uygulaması Đle Belirlenmesi Normal hücrelerde hücre zarının sitoplazmik yüzünde membran lipitlerinden biri olan fosfotidilserin (PS) bulunmaktadır. Eğer hücre apoptoza giderse normalde iç yüzde yerleşmiş olan PS molekülleri hücre zarının dış yüzeyine geçmektedir. Bu yer değişitirme hücre membran bütünlüğünün bozulmadığı apoptotik hücre ölümünün erken dönemlerinde meydana gelir. AnnV, hücrenin dış yüzeyine geçen PS' e bağlanabilen bir protein olduğu için, floresan bir madde (FITC) ile işaretlenerek apoptotik hücre görünür hale getirilebilir215–217. AnnV'ın PS'e bağlanma oranı FACS analizleri ile ölçülebilmektedir. Önce β-karoten sonra H2O2 uygulanan deney grubundaki hücrelerin erken apoptotik döneme girip girmediği AnnV'ın PS'e bağlanma oranı ile akım sitometride ölçüldü. AnnV uygulaması için kültür şişelerindeki hücreler toplanıp FACS tüplerine aktarılarak dakikadaki devir sayısı 3000 olacak şekilde 5 dakika santrifüjlendikten sonra 2,5 ml soğuk PBS ile yıkandı. Daha sonra hücre peletleri 100 µl yükleme tamponunda çözülerek üzerlerine 5 µl AnnV eklenip karıştırıldı. Hücreler 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta bekletildikten sonra üzerlerine 400’er µl yükleme tamponu eklenerek FACS analizleri yapıldı. 49 3.2.7. Nekrotik ve Apoptotik Hücrelerin AnnV - PI Uygulaması ile Belirlenmesi Apoptotik hücrelerde olduğu gibi nekrotik hücrelerin yüzeyinde de AnnV bağlanması görülebildiği için ikinci boya olarak PI kullanılarak FACS analizleri ile erken apoptotik, nekrotik, geç apoptotik ve canlı hücre ayrımı yapılabilmektedir. Analiz sonucu AnnV(-) PI(-) olan hücreler canlı, AnnV(+) PI(-) olan hücreler erken apoptotik, AnnV(+) PI(+) olan hücreler geç apoptotik, AnnV(-) PI(+) olan hücreler nekrotik olarak birbirinden ayrılmaktadır218. Bu ayrımın yapılabilmesi için deney grubu hücrelerinin analizinden önce akım sitometri cihazının kalibrasyonu için; canlı-boyanmamış, canlı-AnnV ile boyanmış, canlı-PI ile boyanmış, apoptotik-AnnV ile boyanmış ve nekrotik-PI ile boyanmış hücreler hazırlandı. Apoptotik hücreler 500 µM H2 O2 uygulaması ile elde edilirken, nekrotik hücreleri elde etmek için canlı hücreler 3000 devir/dakikada 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası hücreler lizis tamponunda çözülerek, buz içerisinde insülin enjektörü ile 25 kez çek-bırak yapılıp patlatılarak nekroza uğratıldı. Canlı, apoptotik ve nekrotik hücreler çeşitli yıkama işlemlerinden sonra AnnV veya PI ile boyanarak analiz için hazır hale getirildi. Deney grubu hücreleri ise bulundukları kültür şişelerinden toplanarak FACS tüplerine aktarıldı ve ‘‘Annexin V: FITC’’ kit protokolüne uygun olarak hazırlandı. Bu protokole göre, hücreler 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendikten sonra PBS ile 1 kez yıkandı. Daha sonra hemositometrede sayılarak, kit içeriğinde bulunan ve dH2 O ile 1:4 oranında seyreltilen bağlama tamponunun 200 µl’nde hücre yoğunluğu 5x105 hücre/ml olacak şekilde süspanse edildi. Her bir tüpe 195 µl hücre süspansiyonu, 5 µ l AnnV-FITC eklenerek karıştırıldı ve karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika bekletildi. Đnkübasyon süresi sonunda hücreler 200 µl bağlama tamponu ile 1 kez yıkandıktan sonra tekrar 190 µl bağlama tamponunda süspanse edildi. Son olarak hücre süspansiyonu üzerine 10 µl PI eklenerek akım sitometri analizleri yapıldı. 3.2.8. Hücrelerin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlere Ayrılması Manual olarak hücre kesimlerinin hazırlanması: Hücre kesimlerinin hazırlanması için deney grubu hücreleri 24, 48 ve 72. saatlerde kültürlendikleri ortamlardan toplanarak santrifüj tüplerine aktarıldı ve dakikadaki devir sayısı 3000 olacak şekilde 10 dakika santrifüjlendi. Hücreler 1 kez soğuk PBS ile yıkandı ve pelet üzerine soğuk hipertonik eriyiği eklenerek 30 dakika buz üzerinde bekletildi. 50 Daha sonra insülin enjektörüyle yaklaşık 20-25 kez çek-bırak yapılarak hücre membranı parçalandı. Hücre lizatı 10 000 x g’de 10 dakika +4oC’de santrifüjlendi ve süpernatant başka bir tübe aktarılarak (sitozolik kesim) -80 0C’ye kaldırıldı. Hücre peleti soğuk lizis eriyiğinde çözülerek buz üzerinde 30 dakika bekletildikten sonra 12 000 x g’de +4oC’de 20 dakika santrifüjlendi. Süpernatant başka bir tübe aktarılarak (mitokondriyal kesim) -80 oC’ye kaldırıldı. Hücre fraksiyonlama kiti ile hücre kesimlerinin hazırlanması: Hücreler 24, 48 ve 72. saatlerde kültürlendikleri ortamlardan toplanarak santrifüj tüplerine aktarıldı ve 3000 devir/dakika'da 10 dakika santrifüjlendi. Daha sonra 1 kez DMEM ile yıkanan hücreler ‘‘Cell Fractionation Kit’’ içeriğinde bulunan A tamponunda çözüldü ve hemositometrede sayılarak hücre yoğunluğu 6,6 x 106 hücre/ml olacak şekilde hücre süspansiyonu hazırlandı. Kit içeriğindeki ‘Deterjan I’ ve A tamponu 1:1000 oranında karıştırılarak B tamponu hazırlandı. Hücre süspansiyonu üzerine aynı hacimde B tamponu eklenerek 7 dakika oda sıcaklığında orbital çalkalayıcıda inkübe edildi. Đnkübasyon sonunda hücreler 5000 x g’de 4 0C’de 1 dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonrası pellet buzda bekletilirken süpernatant başka bir tüpe aktarılıp 10 000 x g’de 4 0C’de 1 dakika santrifüjlendikten sonra elde edilen süpernatant (sitozolik kesim) başka bir tüpe aktarılıp -80 0C’ye kaldırıldı, hücre peleti ise buzda bekletildi. Daha sonra ‘Deterjan II’ ve A tamponu 1:25 oranında birbirine karıştırılarak C tamponu hazırlandı. Buzda bekletilen peletler eşit hacimlerde A tamponunda süspanse edilip birbirleri ile karıştırıldıktan sonra üzerlerine aynı hacimde C tamponu eklenip karıştırıldı ve 10 dakika oda sıcaklığında orbital çalkalayıcıda inkübe edildi. Đnkübasyon sonrasında hücreler 5000 x g’de 4 0C’de 1 dakika santrifüjlendi. Süpernatant 10 000 x g’de 4 0C’de 1 dakika tekrar santrifüjlendi ve santrifüj sonrası elde edilen yeni süpernatant (mitokondriyal kesim) başka bir tüpe aktarılarak -80 0C’ye kaldırıldı. 3.2.9. Liyofilizasyon Sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış olan hücreler -80 0C’den alınıp buz içinde bulundukları tüplerin kapakları delinerek hızlı bir şekilde liyofilizasyon aletine yerleştirilip yaklaşık 0,3 mBar, -40 0C’de liyofilize edildi. 1 ml’lik örnekler yaklaşık 9-10 saatte liyofilize edildikten sonra 200 µ l’lik uygun tamponlarda çözülerek 5 kat yoğunlaştırıldı ve -80 0C’ye kaldırıldı. 51 3.2.10. Protein Derişimlerinin Fluorometre ile Belirlenmesi Sitozolik ve mitokondriyal hücre kesimleri hazırlanıp liyofilize edilen örnekler ‘Quant-iT Protein Kit’’protokolüne uygun olarak hazırlandıktan sonra protein derişimleri ‘Qubit Fluorometre’ aletinde µg/µl cinsinden ölçüldü. Her bir örnek için kit içeriğinde bulunan ‘protein reagent’ 1:200 oranında ‘protein buffer’ da seyreltilerek çalışma çözeltisi hazırlandı. Aletin kalibrasyonu için kitte bulunan standartların (std1, std2 ve std3) herbirinden 10’ar µl alınarak 190 µl çalışma çözeltisinde çözüldü. Ölçümü yapılacak olan örneklerden 2’şer µl alınıp 198’er µ l çalışma çözeltisinde çözülerek toplam hacim 200 µ l olacak şekilde ayarlandı. Standartlar ve örnekler 15 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra fluorometri aletinde protein derişimleri ölçüldü. Daha sonra derişimi en düşük olan örneğe göre tüm örneklerin protein konsantasyonları çeşitli hesaplamalarla eşitlendi. 3.2.11. Elektroforez ve Membrana Aktarım Protein derişimleri eşitlenen örnekler jellere yüklenmeden önce belirlenen miktarlarda yükleme tamponu ile karıştırılarak 72 0C’de 10 dakika denatürlendi. Daha sonra hazırlanan jellere veya ‘% 12’lik Nupage jel’ lere örnekler ve uygun standartlar yüklenerek ‘Surelock Xcell’ elektroforez cihazı ile çift jel çalışılarak elektroforez yapıldı. Elektroforez sonrası ‘IBLOT Jel Transfer Cihazı’ kullanılarak membrana aktarım işlemi gerçekleştirildi. 3.2.12. Western Emdirim Analizi ‘Western’ emdirim analizleri için nitroselüloz membran % 0,5’lik BSA’lı TBST (Tris tamponlu tuz çözeltisi) ile oda sıcaklığında 2 saat çalkalanarak doyurulduktan sonra TBST ile 2 kez 5’er dakika yıkandı. Primer antikor ile gece boyunca +4 0C’de karanlıkta bekletildi. Ertesi gün 3 kez 5’er dakika TBST ile yıkandıktan sonra sekonder antikor ile 1,5 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Daha sonra 3 kez 5’er dakika TBST ile yıkanıp ‘BCIP/NBT’ substrat tamponu ile karanlıkta oda sıcaklığında 1-60 dakika bekletildi. Son olarak membran dH2 O ile 2 kez 2’şer dakika yıkanarak kurutuldu. Jeldeki bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldükten sonra analizleri yapıldı. 52 3.2.13. DNA (Hücre Döngüsü) Analizi Deney sürecini tamamlamış hücreler “Cycle test plus DNA reagent” kitindeki protokole uygun olarak hazırlandıktan sonra FACS cihazı ve ‘Modfit’ yazılım programı kullanılarak hücre döngüsü analizleri yapıldı. Analizden önce ‘‘DNA QC Particles’’ kiti kullanılarak FACS cihazının DNA analizi için kalibrasyonu yapıldı. Kalibrasyon işlemi için üç farklı örnek hazırlandı. Birinci örnek, 1 ml PI içine kit içerisinde bulunan CEN’den “Chicken Erythrocyte Nucleus” (tavuk eritrosit çekirdekleri) 40 µl eklenerek; ikinci örnek, 1 ml PI içine CTN’den “Calf Thymocyte Nucleus” (buzağı timosit çekirdekleri) 40 µl eklenerek; üçüncü örnek ise 1 ml PBS içerisine bir damla QC boncuklarından damlatılarak hazırlandı ve örnekler FACS cihazından geçirilerek kalibrasyon işlemi yapıldı. Daha sonra ‘‘Cycle test plus DNA reagent’’protokolüne göre; deney grubu hücreleri FACS tüplerine aktarılarak, oda sıcaklığında 300 x g’de 5 dakika santrifüjlendi. Üst sıvıları uzaklaştırılan hücreler 1 ml’lik tampon çözelti içerisinde çözülerek tekrar 300 x g’de 5 dakika santrifüjlendi. Yıkama işlemi aynı şekilde bir kez daha tekrarlandıktan sonra hücreler 1x106 hücre/ml olacak şekilde tampon çözeltide süspanse edildi. Boyama işlemi için hücre süspansiyonları oda sıcaklığında 400 x g’de 5 dakika santrifüjlendikten sonra üst sıvılar uzaklaştırılarak her bir tüpe 250’şer µl çözelti A’dan (tripsin tampon) eklenip 10 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Daha sonra her bir tüpe 200’er µl çözelti B’den (tripsin inhibitörü ve RNaz tamponu) eklenip karıştırıldıktan sonra tüpler 10 dakika daha oda sıcaklığında bekletildi. Son olarak tüplere 200’er µl soğuk çözelti C’den (PI boyama çözeltisi) eklenerek +4 0C’de karanlıkta 10 dakika bekletildi ve bu süre sonunda örnekler FACS cihazından geçirilerek ModFit programı ile DNA analizleri yapıldı. 53 4. BULGULAR 4.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi Oksidatif stresin K562 hücrelerinde etkisini belirlemek amacı ile hücrelere farklı derişim (100, 250, 500, 750, 1000 µM) ve sürelerde (24, 48 ve 72 saat) H2O2 uygulamasının ardından ‘Gereç ve Yöntemler’ bölümünde anlatıldığı şekilde hücre canlılık testi yapıldı. Bu test sonuçlarına göre, H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak K562 hücrelerinin canlılığının azaldığı belirlendi. Şekil 4-1’de H2 O2’nin derişime bağlı etkisine bakıldığında 24. saatte 500 µM H2O2 derişiminde hücre canlılığının %90’lara düştüğü, 750 µM’da %65’lere, 1000 µM’da ise %25’lere düştüğü görüldü. Zamana bağlı olarak H2O2’in etkisi incelendiğinde ise hücrelere 24 saat süre ile 750 µM H2O2 uygulandığında %65’lerde olan hücre canlılığının, 48.saatte %40’ın altına, 72.saatte ise %20’lere düştüğü görüldü. Sonuç olarak; K562 hücrelerinde oksidatif stresin H2O2 derişim ve uygulama süresi ile doğru orantılı olarak arttığı belirlendi. Hücrelerin ışık mikroskobu ile elde edilen yapısal görüntüleri de canlılık testi sonuçlarını desteklemektedir. Şekil 4-2’de, kontrol hücrelerinin (madde uygulanmayan hücreler) canlı, 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile muamele görmüş hücrelerin ise tamamına yakınının ölü (parçalanmış, membran bütünlüğü bozulmuş) hücreler olduğu görüldü. 54 Şekil 4-1: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak K562 hücre canlılığındaki değişim. Kontrol 1000 µM H2O2 (72. saat) Şekil 4-2: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık mikroskobu görüntüsü. 4.2. Oksidatif Stresin Değişiklikler K562 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği Hidrojen peroksidin K562 hücrelerinde oluşturduğu oksidatif hasar ∆Ψm’nde meydana getirdiği değişiklikler açısından Akım Sitometri analizleri ile Rodamin 123’ün floresan yoğunluğu üzerinden belirlendi. Lipofilik katyonik bir boya olan Rho123 hücre içine girdiğinde yüksek negatif membran potansiyeline sahip olan mitokondride birikmektedir. ∆Ψm depolarize olduğunda Rho123’ün mitokondride tutulumu azalır ve bu durum hücre içi floresan yoğunluğunun azalması şeklinde sonuçlanır. 55 ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler ve oluşan porlar apoptotik ve proapoptotik proteinlerin sitoplazmaya salınımına ve apoptotik sürecin başlamasına neden olmaktadır. Bu nedenle ∆Ψm analizi hücrenin apoptoza yönlendiğini gösteren önemli belirteçlerden biridir. K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikleri belirlemek amacı ile hücrelere 24, 48 ve 72 saat süre ile 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 verildi. Akım sitometride yapılan analizlere göre; 100 µM H2O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark görülmedi. 250 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan ikinci bir hücre popülasyonunun ortaya çıktığı ve bu popülasyonun büyüklüğünün H2O2 derişimi ve uygulama süresi arttıkça arttığı görülmektedir. 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile muamele gören hücrelerin ise tamamına yakınının floresan yoğunluğunun azaldığı belirlendi (Şekil 4-3). Floresan yoğunluğundaki bu düşüş ∆Ψm depolarizasyonunu göstermektedir. Sonuç olarak, depolarizasyonun tetiklenmesi için minimum 250 µM H2 O2 derişimine gereksinim olduğu ve H2O2 derişimi ile uygulama süresi arttıkça K562 hücrelerinin ∆Ψm’nin azaldığı belirlendi. FACS analizlerinde, kapılanmış hücrelere bakıldığında ise, hücrelerin granülite (SSC-Side Scatter) ve büyüklüklerinde (FSC-Forward Scatter) değişiklikler olduğu görüldü (Şekil 4-4). 56 24 Saat 48 Saat 72 Saat 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-3: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. K562 hücrelerine 24, 48 ve 72 saat süre ile 100-1000 µM H2O2 verilerek FACS analizleri yapıldı. (Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.) 57 24 Saat 48 Saat 72 Saat Kontrol 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-4: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre profilindeki değişiklikler. K562 hücrelerine 24, 48 ve 72 saat süre ile 100-1000 µM H2O2 verilerek FACS analizinde kapılanmış hücreler incelendi. 4.3. Oksidatif Strese Maruz Kalan K562 Hücrelerinde Apoptoz ve Nekrozun Belirlenmesi K562 hücrelerine 24 saat süreyle farklı derişimlerde H2O2 uygulandıktan sonra apoptotik ve nekrotik hücreler, ‘AnnexinV:FITC’ kiti kullanılarak ‘Gereç ve Yöntemler’ bölümünde anlatıldığı şekilde belirlendi. FACS cihazında hücreler, canlı (G1) ve ölü (G2) hücrelerin ayrı kapılandığı noktasal grafiklerle incelendi. Analiz sonuçlarına göre; G1’deki hücre popülasyonu H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak azalırken G2’deki hücre popülasyonunun ise giderek arttığı gözlemlendi (Şekil 4-5 a). 58 G1’deki hücre popülasyonuna göre dörde ayrılmış nokta grafik histogramında canlı kabul edilen boyanmamış hücre popülasyonunun giderek azaldığı, yalnız AnnV, yalnız PI ve AnnV + PI ile boyanmış hücre popülasyonunun giderek arttığı gözlemlendi (Şekil 4-5 b). Analiz sonucu elde edilen sayısal değerlere göre; canlı hücre popülasyonu kontrol hücrelerinde % 93,3 iken 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 18,9’a düştüğü; erken apoptotik hücre popülasyonunun ise % 1,1’den % 3,7’ye yükseldiği belirlendi (Tablo 4-1). Apoptotik hücre popülasyonunun kontrol hücrelerinde % 2,2 iken 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 68,1’e yükseldiği görüldü (Şekil 4-6 a). Nekrotik hücre popülasyonunun ise % 3,4’den % 9,4’e kadar arttığı belirlendi (Şekil 4-6 b). G2’deki hücre popülasyonuna göre dörde ayrılmış nokta grafik histogramında, H2O2 derişimi arttıkça, AnnV + PI ile boyanan hücre popülasyonunun arttığı; boyanmamış hücreler ile yalnız AnnV ve yalnız PI ile boyanmış hücre popülasyonlarının ise giderek azaldığı gözlemlendi (Şekil 4-5 c). Analiz sonucu elde edilen sayısal değerlere göre; apoptotik hücre popülasyonu kontrol hücrelerinde % 26,6 iken 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 97,1’e yükseldiği görüldü. Canlı hücre popülasyonunun % 36,4’den % 0,4’e, erken apoptotik hücre popülasyonunun % 3,6’dan % 0,4’e; nekrotik hücre popülasyonunun ise % 33,4’den % 2,1’e düştüğü belirlendi (Tablo 4-2). 59 a G2 G1 250 µM Kontrol 750 µM 500 µM 1000 µM b Kontrol 250 µM 750 µM 500 µM 1000 µM 60 c Kontrol 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-5: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI boyama ile apoptoz ve nekrozun belirlenmesi. a) FSC/SSC parametrelerine göre kapılanmış canlı (G1-kırmızı) ve ölü (G2-yeşil) hücre profillerindeki değişim, b) Yalnız canlı hücrelerin kapılandığı G1 bölgesindeki hücrelerin değişimini gösteren noktasal grafik, c) Yalnız ölü hücrelerin kapılandığı G2 bölgesindeki hücrelerin değişimini gösteren noktasal grafik. Tablo 4-1: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış canlı ve erken apoptotik hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri G1’deki hücreler H2O2 Derişimi 0 µM (%) 250 µM (%) 500 µM (%) 750 µM (%) 1000 µM (%) Canlı Hücreler PI(-) AnnV(-) Erken Apoptotik Hücreler PI(-) AnnV(+) 93,3 73,5 66,4 23,9 18,9 1,1 5,5 3,8 4,9 3,7 61 a b Şekil 4-6: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış apoptotik (a) ve nekrotik (b) hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri. 62 Tablo 4-2: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI boyama sonucu G2 bölgesinde kapılanmış canlı, erken apoptotik, geç apoptotik ve nekrotik hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri. G2’deki Hücreler H2O2 Derişimi 0 µM (%) 250 µM (%) 500 µM (%) 750 µM (%) 1000 µM (%) Canlı Hücreler PI(-) AnnV(+) Erken Apoptotik Hücreler PI(-) AnnV(+) Geç Apoptotik Hücreler PI(+) AnnV(+) Nekrotik Hücreler PI(+) AnnV(-) 36,4 18,6 3,2 0,3 0,4 3,6 4,4 0,8 0,6 0,4 26,6 70,7 93,0 96,6 97,1 33,4 6,3 3,0 2,6 2,1 4.4. β-karoten’in K562 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi Güçlü bir antioksidan olan β-karotenin K562 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi FACS analizleri ile belirlendi. K562 hücreleri 24 saat süreyle 100 µM, 10 µM, 1 µM, 1 nM ve 0,1 nM β-karoten ile muamele edildi. Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden yapılan analizlerde β-karotenin tek başına K562 hücrelerinde ∆Ψm açısından bir değişikliğe neden olmadığı görüldü (Şekil 4-7). Bunun üzerine; antioksidan-oksidan etkileşimlerini belirlemek amacı ile yapılacak olan deneylerde kullanılacak β-karoten derişimi 1 µM olarak seçildi. Daha sonra, 1 µM β-karotenin deney takip süresi olan 24, 48 ve 72. saatlerde K562 hücrelerine etkisinin olup olmadığı araştırıldı ve analiz sonuçlarına göre zamana bağlı olarak da β-karotenin K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde kontrole kıyasla herhangi bir değişikliğe neden olmadığı görüldü (Şekil 4-8). FACS analizleri sırasında kapılanmış hücre profilleri incelendiğinde, hücrelerin granülite ve büyüklüklerinde de herhangi bir farka rastlanmadı (Şekil 4-9). 63 100 μM 1 μM 10 μM 1 nM 0,1 nM Şekil 4-7: 24 saat süre ile farklı derişimlerde β-karoten uygulamasının K562 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 64 1 µM 24 Saat 48 Saat 72 Saat Şekil 4-8: 1 µM β-karotenin uygulama süresine (24, 48, 72 saat) bağlı olarak K562 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) a b Şekil 4-9: K562 hücre profilleri a) Kontrol hücreleri, b) 1 µM β-karoten ile 48 saat işlem görmüş hücreler. 65 4.5. K562 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı β-karotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi K562 hücrelerinde β-karotenin derişim ve uygulama süresine bağlı olarak tek başına ∆Ψm’ni, hücre büyüklük ve granülitesini değiştirmediği belirlendikten sonra, H2O2’nin meydana getirdiği oksidatif hasarına karşı bir antioksidan etki gösterip gösteremeyeceğini belirlemek amacıyla hücrelere H2O2 ile muamele etmeden önce, sonra ve H2O2 ile birlikte 1 µM β -karoten verilerek ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. 4.5.1. K562 Hücrelerine H2O2 ve β-karotenin Aynı Anda Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler K562 hücrelerine farklı derişimlerde H2O2 ve 1 µM β-karoten aynı anda uygulanarak 24, 48 ve 72. saatlerde FACS analizleri ile ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler belirlendi. Buna göre, 1 µ M β-karoten ile birlikte artan derişimlerde H2O2 uygulamasının K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde azalmaya neden olduğu (Şekil 4-10), hücre granülite ve büyüklüğünün de değiştiği görüldü (Şekil 4-11). Bu sonuçlar, K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde, H2 O2 ve β-karoten’in birlikte yarattığı etkinin, H2O2’nin tek başına yarattığı etkiye benzer olduğunu hatta zamana bağlı olarak hücrelerdeki oksidatif etkinin biraz daha arttırdığını göstermektedir (Şekil 4-12). 66 24 Saat 48 Saat 72 Saat 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-10: Farklı derişimlerde H2O2 ve 1 µM β-karoten ile aynı anda işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise H2O2 ve β-karoten ile aynı anda muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) a b Şekil 4-11: K562 hücre profilleri a) Kontrol hücreleri, b) H2O2 ve β-karoten ile aynı anda 72 saat işlem görmüş hücreler. 67 Şekil 4-12: Aynı anda H2O2 ve β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. 4.5.2. K562 Hücrelerine Önce H2O2 Sonra β-karoten Uygulanması ile ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler K562 hücrelerine önce 24 saat süre ile 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 24, 48 ve 72 saat süreyle uygulandı. H2 O2 uzaklaştırıldıktan sonra hücrelere 24 saat süreyle 1 µM β-karoten verilip, ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre, bu gruptaki hücrelerin ∆Ψm’nin azaldığı (Şekil 4-13), hücre granülite ve büyüklüklerinin de değiştiği (Şekil 4-14) görüldü. H2 O2 ile muamele edildikten sonra 24 ve 72 saat süreyle β-karotenle muamele edilen hücrelerdeki ∆Ψm’ndeki değişikliklerin, yalnız H2O2 ile muamele edilen hücre gruplarındaki ∆Ψm değişiklikleri 68 ile benzer olduğu fakat 48. saatte β-karotenin H2O2’nin yarattığı oksidatif etkiyi arttırıcı yönde etki ettiği görüldü (Şekil 4-15). 24 Saat 48 Saat 72 Saat 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-13: Farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulamasından sonra 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce H2O2 sonra β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 69 a b Şekil 4-14: K562 hücre profilleri a) Kontrol hücreleri, b) Önce H2O2 sonra β-karotenle 48 saat işlem görmüş hücreler. Şekil 4-15: Önce H2O2 sonra β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. 70 4.5.3. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler K562 hücrelerine önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 verilerek 24, 48 ve 72. saatlerde ∆Ψm’nde değişiklikler belirlendi. Bu gruptaki hücrelerde floresan yoğunluğunda bir farklılık olmadığı yani ∆Ψm’nin değişmediği (kontrol gubu ile aynı olduğu) görüldü (Şekil 4-16). ∆Ψm’nde depolarizasyon söz konusu değilken hücre profilinin kontrole kıyasla değiştiği gözlemlendi (Şekil 4-17). β-karoten, hücrelere H2O2 uygulanmadan önce verildiğinde antioksidan özelliği ön plana çıkmakta yani ∆Ψm açısından tam koruma sağlamaktadır. Şekil 4-18’de görüldüğü gibi yalnız H2O2 uygulanan hücrlelerde ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonu H2O2 uygulama süresi ve derişimine bağlı olarak artmakta fakat hücrelere önce β-karoten sonra H2O2 uygulandığında ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonu ortaya çıkmamakta, β-karoten H2O2’nin oksidatif etkisine karşı tam koruma sağlamaktadır. 24 Saat 48 Saat 72 Saat 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-16: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (100-1000 µM) H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin zamana bağlı (24, 48, 72 saat) ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra H2O2 ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 71 b a Şekil 4-17: K562 hücre profilleri a) Kontrol hücreleri, b) Önce β-karoten sonra H2O2 ile 72 saat işlem görmüş hücreler. H2O2 24 Saat Önce β-karoten sonra H2O2 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-18: Önce β-karoten sonra H2O2 ile işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. 72 4.6. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasından Sonra Erken Apoptotik Sürecin Belirlenmesi Farklı derişimlerde H2O2’ye maruz bırakılmadan önce β-karoten ile muamele edilen hücrelerde ∆Ψm değişmezken hücre granülite ve büyüklüğünün değişmesi, bu hücrelerin apoptoza yönlenmiş olabileceğini düşündürdü. Apoptotik sürecin ilk belirtileri hücre profilinin değişmesidir, ∆Ψm değişimi ise bundan sonraki aşamadır. Bu nedenle hücrelerin erken apoptotik sürece girip girmediğini belirlemek için hücreler floresan işaretli AnnV ile muamele edilerek AnnV'ın PS'e bağlanma oranı FACS analizleri ile belirlendi. Sonuçlar, H2O2 derişim ve uygulama süresi ile doğru orantılı olarak floresan yoğunluğunun arttığını yani AnnV cevabının pozitif çıktığını, hücrelerin apoptoza yönlendiğini gösterdi (Şekil 4-19). Bu çalışmanın kontrolü olarak yalnız H2O2 ve yalnız β-karoten uygulanan hücre gruplarında da AnnV analizi yapıldı ve beklendiği gibi farklı derişimlerde H2O2 uygulanan hücre grubunda floresan yoğunluğunun hızla arttığı (Şekil 4-20), yalnız β-karoten uygulanan grupta ise değişmediği görüldü (Şekil 4-21). 24 Saat AnnV 48 Saat 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM Şekil 4-19: Önce 1µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin zamana bağlı AnnV cevabı. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra H2O2 ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 73 AnnV 100 µM 250 µM 750 µM 500 µM 1000 µM Şekil 4-20: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin AnnV cevabı. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise H2O2 ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 74 AnnV Kontrol β-karoten (1 µM) 24 saat Kontrol β-karoten (1 µM) 48 saat Şekil 4-21: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin 24 ve 48. saatlerdeki AnnV cevabı ve hücre profili. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 4.7. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra Yüksek Derişimlerde H2O2 Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler K562 hücrelerine önce β-karoten sonra H2O2 uygulanmasından sonra ∆Ψm’nin değişmemesi yani β-karotenin ∆Ψm açısından tam koruma sağlaması fakat bu gruptaki hücre profilinin değişmesi ve AnnV analiziyle hücrelerin apoptoza yönlenmiş olduğunun gözlemlenmesi üzerine hücrelere önce 1µM β-karoten daha sonra yüksek derişimlerde (2000, 3000, 4000, 5000, 10000 µM) H2O2 verilerek, β-karotenin hücreleri hangi H2 O2 derişimine kadar koruyabileceği test edildi. Analiz sonuçlarına göre, daha 2000 µM H2O2 derişiminde ∆Ψm’nin hızlı bir şekilde değiştiği, floresan yogunluğu azalmış ikinci hücre grubunun ortaya çıktığı görüldü. 24 ve 48. saatlerde 10.000 µM’da hücrelerin tamamında ∆Ψm’nin azaldığı yani tüm hücre popülasyonunun sola kaydığı gözlemlenirken, 72. saatte ise daha 4000 µM’da hücrelerin tamamında floresan yoğunluğunun azaldığı belirlendi (Şekil 4-22). Bu gruptaki hücrelerin morfolojileri ışık 75 mikroskobunda incelendiğinde oldukça ilginç görüntüler elde edildi (Şekil 4-23). Yalnız H2O2 uygulanan hücre grubunda 1000 µM’da hücrelerin tamamına yakınının ölü ve parçalanmış hücreler olduğu, önce β-karoten sonra yüksek derişimde H2O2 uygulanan hücrelerde 10000 µM’da bile hücrelerin membran bütünlüklerinin bozulmadığı hücre içeriklerinin kutuplaşmış olduğu görüldü (Şekil 4-24). Bu durum, hücrelerin ölüm şeklinin apoptoz dışında farklı bir programlanmış hücre ölüm şekli olduğunu düşündürdü. sonra 48.saat 72.saat 2000 µM 2 24.saat 3000 µM 4000 µM 5000 µM 10000 µM Şekil 4-22: Önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. (Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra yüksek derişimlerde H2O2 ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.) 76 Şekil 4-23: Önce 1 µM β-karoten sonra 10 mM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüsü. (100x büyütme) Şekil 4-24: Farklı şekillerde işlem görmüş K562 hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüleri. a) Kontrol hücreleri, b) Yalnız 1000 µM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş hücreler, c) Önce 1 µM β-karoten sonra 10 mM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş hücreler (100x büyütme). 4.8. Antioksidan-Oksidan Etkileşimlerinin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi Antioksidan oksidan etkileşimlerinin K562 hücre döngüsü fazları üzerine etkisi H2O2 ve β-karoten üzerinden ModFit yazılım programı kullanılarak DNA analizleri ile belirlendi. K562 hücrelerine yalnız H2O2 uygulamasıyla oksidatif stresin hücre döngüsü fazları üzerine etkisi belirlendikten sonra tek başına β-karoten etkisi incelendi. Daha sonra hücrelere önce 1µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (100-1000 µM ve 2000-10000 µM) H2 O2 uygulanarak antioksidan-oksidan etkileşimlerinin hücre döngüsü fazları üzerine etkisi inceledi. 77 4.8.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi K562 hücrelerine artan derişimlerde H2O2 uygulandıktan sonra yapılan DNA analizine göre H2O2’nin hücre döngüsü fazlarındaki değişimi indüklediği görüldü (Şekil 4-25). G1 fazındaki hücre popülasyonunun kontrol grubunda % 33.25 iken 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde sırasıyla % 30.08, % 5.02, % 4.42’ye düştüğü görüldü (Şekil 4-26 a). G2/M fazındaki hücre popülasyonunun ise kontrol grubunda % 9.69 iken 100, 500 ve 1000 µM H2O2 uygulanan hücrelerde sırasıyla % 17.74, % 36.47, % 23.30’a yükseldiği belirlendi (Şekil 4-26 b). S fazındaki hücre popülasyonunun ise kontrol grubunda % 57.07 iken 1000 µM H2O2 ile işlem gören hücrelerde % 72.28’lere kadar yükseldiği görüldü (Şekil 4-26 c). S fazındaki bu birikim (akümülasyon) hücre döngüsü inhibisyonunu işaret etmektedir. G1: % 30.08 S: % 52.19 G2: % 17.74 G1: % 33.25 S: % 57.07 G2: % 9.69 Kontrol 100µM H2O 2 G1: % 5.02 S: % 58.52 G2: % 36.47 500µM H2O2 G1: % 4.42 S: % 72.28 G2: % 23.30 1000µM H2O 2 Şekil 4-25: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. 78 a G1 fazındaki hücre popülasyonu (%) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Kontrol 100 500 1000 H2O2 (µM) b 40 G2 fazındaki hücre popülasyonu (%) 35 30 25 20 15 10 5 0 Kontrol 100 500 1000 H2O2 (µM) c 80 S fazındaki hücre popülasyonu (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 Kontrol 100 500 1000 H2O2 (µM) Şekil 4-26: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hüce döngüsü falarındaki değişiklikler a) G1 fazındaki değişim b) G2 fazındaki değişim c) S fazındaki değişim grafikleri. 79 4.8.2. β-karoten’in K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi Antioksidan oksidan etkileşimlerinin hücre döngüsü fazları üzerine etkisinin belirlenebilmesi için, öncelikle β-karoten’in tek başına hücre döngüsü fazları üzerine etkisinin olup olmadığı DNA analizleriyle belirlendi. 1 µM β-karoten K562 hücrelerine uygulandıktan sonra yapılan analizlerden elde edilen sonuçlara göre; hücre döngüsü fazlarında anlamlı bir değişikliğe rastlanmadı (Şekil 4-27). G1 ve G2 fazlarındaki hücre popülasyonu kontrol grubuna göre sadece % 2,3 , S fazındaki hücre popülasyonu ise % 4,6 civarında değişmektedir (Şekil 4-28). Bu fark, DNA analizi farklı zamanlarda yapılan kontrol hücreleri arasında bile görülebilmektedir. β-karoten’in tek başına K562 hücre döngüsü fazları üzerine herhangi bir etkisinin olmaması, daha önce ∆Ψm üzerine yapılan deney sonuçlarıyla da uyumludur. G1: % 33.25 S: % 57.07 G2: % 9.69 Kontrol G1: % 35.56 S: % 52.48 G2: % 11.96 1 µM β-karoten Şekil 4-27: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. 80 70 Hücre popülasyonu (%) 60 50 G1 40 S G2 30 20 10 0 Kontrol β-karoten Şekil 4-28: Kontrol hücreleri ile 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S ve G2 fazlarındaki değişimin karşılaştırmalı grafiği. 4.8.3. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasının K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi K562 hücrelerine önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 uygulandıktan sonra yapılan DNA analizleri; hücrelere oksidatif stres uygulamasından önce β-karoten uygulanmasının hücre döngüsü fazları üzerinde değişikliğe neden olduğunu göstermektedir (Şekil 4-29). G1 fazındaki hücre popülasyonu kontrol grubunda % 33.25 iken önce β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde sırasıyla % 34.74, % 6.01, % 5.79’a düşmektedir (Şekil 4-30 a). G2/M fazındaki hücre popülasyonu ise kontrol grubunda % 9.69 iken önce β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 uygulanan hücrelerde sırasıyla % 12.91, % 64.61, % 67.95’e yükselmektedir (Şekil 4-30 b). S fazındaki hücre popülasyonu kontrol grubunda % 57.07 iken önce β-karoten sonra 100 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde % 52.35’e, 500 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde % 29.39’a, 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise % 26.26’ya düşmektedir (Şekil 4-30 c). Bu sonuçlar, önce β-karoten sonra H2O2 (100, 500, 1000 µM) uygulamasının K562 hücrelerinin G2/M fazında tutuklanmasına neden olduğunu göstermektedir. 81 G1: % 34.74 S: % 52.35 G2: % 12.91 G1: % 33.25 S: % 57.07 G2: % 9.69 Kontrol 1 µM β-k-100µM H2O2 G1: % 6.01 S: % 29.39 G2: % 64.61 1 µM β-k-500µM H2O2 G1: % 5.79 S: % 26.26 G2: % 67.95 1 µM β-k1000µM H2O2 Şekil 4-29: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. 82 a G1 fazındaki hücre Popülasyonu (%) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Kontrol 100 µM 500 µM 1000 µM H2O2 G2 fazındaki hücre Popülasyonu (%) b 70 60 50 40 30 20 10 0 Kontrol 100 µM 500 µM H2O2 1000 µM 83 c S fazındaki hücre Popülasyonu (%) 60 50 40 30 20 10 0 Kontrol 100 µM 500 µM 1000 µM H2O2 Şekil 4-30: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş K562 hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler. a) G1 fazındaki değişim, b) G2 fazındaki değişim, c) S fazındaki değişim grafikleri. K562 hücrelerine yüksek derişimde (2, 4, 10 mM) H2O2 uygulanmadan önce 1 µM β-karoten uygulanıp yapılan DNA analizleri, hücre döngüsü fazları oranlarında önemli bir değişikliğin olmadığını, kontrol grubu ile aynı hücre döngüsü profilinin ortaya çıktığını fakat hücre sayısının azaldığını göstermektedir (Şekil 4-31). Kontrol grubu hücreleri ile 2, 4 ve 10 mM H2O2 ile işlem görmüş hücreler karşılaştırıldığında G1 fazında kontrole göre en fazla % 3,23 (4 mM’da), S fazında en fazla % 5,31 (2 mM’da) ve G2 fazında en fazla % 4,85 (10 mM’da) değişiklik olduğu belirlendi (Şekil 4-32). 84 G1: % 33.25 S: % 57.07 G2: % 9.69 G1: % 31.02 S: % 62.38 G2: % 6.60 1 µM β-k-2mM H2O 2 Kontrol G1: % 34.87 S: % 60.29 G2: % 4.84 G1: % 36.48 S: % 55.30 G2: % 8.23 1 µM β-k-4mM H 2O2 1 µM β-k-10mM H2O 2 Şekil 4-31: Önce 1 µM β-karoten sonra 2 mM, 4 mM ve 10 mM H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. 85 80 70 Hücre popülasyonu (%) 60 50 G1 40 S 30 G2 20 10 0 Kontrol 2000 4000 10000 H2O2 Şekil 4-32: Kontrol grubu hücreleri ile önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde (2, 4, 10 mM) H2 O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S ve G2 fazlarının karşılaştırmalı grafiği. K562 hücre döngüsü fazlarında, yalnız H2 O2 muamelesinin yarattığı etki ile önce β-karoten sonra normal (100, 500, 1000 µ M) ve yüksek derişimde (2000, 4000, 10000 µM) H2O2 muamelesinin yarattığı etkinin birbirlerinden farklı ve bağımsız olduğu görülmüştür (Şekil 4-33). 86 a H2O2 Grubu 90 80 Hücre popülasyonu (%) 70 60 Kontrol 100 µM 500 µM 1000µM 50 40 30 20 10 0 G1 b S G2 Önce β-karoten sonra H2O2 Grubu 70 Hücre popülasyonu (%) 60 50 Kontrol 40 100 µM 500 µM 30 1000 µM 20 10 0 G1 S G2 87 c Önce β-karoten sonra H2O2 Grubu (yüksek derişim) 90 Hücre popülasyonu (%) 80 70 60 Kontrol 2000 50 4000 40 10000 30 20 10 0 G1 S G2 Şekil 4-33: K562 hücre döngüsü fazlardaki değişim grafiklerinin karşılaştırmalı gösterimi a) Yalnız H2O2 (100-1000 µM), b) Önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 (100-1000 µM), c) Önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde H2O2 (2000-10000 µM) ile işlem görmüş hücreler. 4.9. Oksidatif Stres Etkisiyle K562 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler K562 hücrelerine 250, 500 ve 1000 µM H2 O2 uygulandıktan 48 saat sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayırım işlemi Gereç ve Yöntemler Bölümü’nde anlatıldığı şekilde yapıldı. Kesimleme işleminin tam olarak gerçekleşip gerçekleşmediği sitoplazmik bir enzim olan Glukoz-6-fosfat-dehidrogenaz (G6PD) ile yapılan ‘western’ emdirim analizi ile belirlendi. Elde edilen sonuçlar, G6PD sinyallerinin sitoplazmik kesimde var olduğunu mitokondriyal kesimde ise hiç bant olmadığını yani mitokondriyal ve sitozolik ayırımın tam olarak yapılabildiğini göstermektedir (Şekil 4-34 a). Daha sonra yapılan ‘western’ emdirim analizleri ile apoptotik proteinlerden Sitokrom c (Cyt c) ve Smac/DIABLO’nun (Smac/D) mitokondriden sitoplazmaya salınımına bakıldı. Farklı derişimlerde H2O2 uygulanmış hücre gruplarında Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya salındığı ve bu proteinlerin sitoplazmik miktarlarının H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak arttığı belirlendi (Şekil 4-34 a). ‘Đmage J’ programı kullanılarak ölçülen bant yoğunluklarından elde 88 edilen sayısal değerler, Cyt c miktarının sitoplazmik kesimde kontrol hücrelerinde yaklaşık % 16 iken 250, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin sitoplazmik kesiminde sırasıyla % 19, % 29 ve % 46’ya yükseldiğini göstermektedir. Sitozolik kesimdeki Smac/D miktarının ise kontrol hücrelerinde yaklaşık % 25 iken 250, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin sitoplazmik kesiminde sırasıyla % 28, % 39 ve % 77’ye yükseldiği belirlendi (Şekil 4-34 b). a H2O 2 (µM) K 250 500 1000 H2O 2 (µM ) K 250 500 1000 Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Sitokrom c Smac/D Glikoz-6-fosfatdehidrogenaz b 80 70 45 40 35 K 250 30 25 500 1000 20 15 10 5 0 Smac/D miktarı (%) Sitokrom c miktarı (%) 50 60 K 250 500 1000 50 40 30 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-34: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. a) Fare kökenli anti-Smac/D, sıçan kökenli anti-Sitokrom c ve anti-Glikoz-6-fosfat dehidrogenaz varlığında western emdirimi, b) H2O2 etkisi ile mitokondriden sitozole salınan Sitokrom c ve Smac/D miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. Sitozolik kesimde Sitokrom c’nin üst kısmında bulunan bantlar non-spesifik bantlar olup dikkate alınmamıştır. K562 hücrelerine oksidatif stres uygulaması sonucu apoptotik proteinlerden Sitokrom c ve Smac/D’nun mitokondriden sitozole salınımı yani apoptotik sürecin tetiklenmesi üzerine Bcl-2, Apaf-1, AIF, BCL-X, kaspaz-3 gibi diğer pro-apoptotik ve anti-apoptotik proteinlerin mitokondriyal ve sitozolik kesimlerdeki miktarındaki 89 değişiklikler ‘western’ emdirim analizi ile belirlendi. H2O2 derişimine bağlı olarak mitokondriyal antiapoptotik proteinlerden Bcl-2 ve BCL-X’in anlatımının arttığı görülürken mitokondriyal proteinlerden AIF’nin ise H2 O2 derişimi ile doğru orantılı olarak sitozole salındığı belirlendi (Şekil 4-35). Sitoplazmik kesimde apoptotik proteinlerden Kaspaz-3’ün miktarı çok az değişirken Apaf-1 miktarının kontrole göre arttığı, bu artışın en fazla 500 µM’da olduğu görüldü (Şekil 4-36). a b H2O 2 (µM ) 100 K 250 500 1000 Bcl-2 miktarı (%) H2O2 (µM) K 250 500 1000 Bcl-2 BCL-X 80 40 20 AIF 0 Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Mitokondriyal hücre kesimi 100 100 90 90 80 70 K 250 500 1000 60 50 40 30 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi BCL-X miktarı (%) AIF miktarı (%) K 250 500 1000 60 80 70 K 250 500 1000 60 50 40 30 20 10 0 Mitokondriyal hücre kesimi Şekil 4-35: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. a) Fare kökenli anti-Bcl-2, anti-BCL-X ve sıçan kökenli anti-AIF varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı olarak mitokondriyal kesimdeki Bcl-2 ve BCL-X ile sitoplazmik kesimdeki AIF miktarlarındaki değişiklikler. Bant yoğunlukları ‘ImageJ’ programı kullanılarak ölçüldü. 90 a H2O2 (µM ) 250 500 1000 K Kaspaz-3 Apaf-1 Sitozolik hücre kesimi b 90 80 70 K 250 500 1000 60 50 40 30 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi Apaf-1 miktarı (%) Kaspaz-3 miktarı (%) 100 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 250 500 1000 Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-36: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. a) Fare kökenli anti-Apaf-1 ve sıçan kökenli anti-Kaspaz-3 varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı olarak sitozolik kesimdeki Apaf-1 ve Kaspaz-3 miktarlarındaki değişiklikler. Bant yoğunlukları ‘ImageJ’ programı kullanılarak ölçüldü. Oksidatif stres etkisiyle K562 hücrelerinin mitokondriyal ve sitoplazmik kesimlerindeki proapoptotik ve anti-apoptotik protein miktarlarındaki değişiklikler belirlendikten sonra aynı yöntemler kullanılarak, H2O2 uygulamasından önce β-karoten ile işlem görmüş hücre gruplarında bu protein miktarlarında değişiklik olup olmadığı belirlendi. 4.10. Antioksidan-oksidan Etkileşimleri Sonucu K562 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler K562 hücreleri önce 1 µM β-karoten ile 24 saat muamele edildikten sonra normal ( 250, 500 ve 1000 µM) ve yüksek (2000, 4000 ve 10000µM) derişimlerde H2O2 ile 48 saat muamele edildikten sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayrıldı. Daha sonra Cyt c, Smac/D, Bcl-2, Apaf-1, AIF, BCL-X gibi apoptotik ve anti-apoptotik proteinlerin miktarlarında değişiklik olup olmadığı ‘western’ emdirim analizi ile 91 incelendi. Önce normal (250, 500 ve 1000 µM) derişimlerde H2O2 uygulanarak yürütülen deney sonuçlarına göre; bu gruptaki hücrelerde Cyt c ve Smac/D’nun sitozoldeki miktarlarının kontrol grubu ile aynı olduğu yani mitokondriden sitozole salınım olmadığı belirlendi (Şekil 4-37). Anti-apoptotik proteinlerden Bcl-2’nin mitokondriyal kesimde miktarının arttığı, BCL-X’in miktarının ise 1000 µM H2O2 derişiminde % 40 civarında arttığı görüldü (Şekil 4-38). Apoptotik proteinlerden AIF miktarının sitoplazmik kesimde değişmediği, Apaf-1’in ise sitoplazmik hücre kesiminde 500 ve 1000 µM H2O2 derişiminde sırasıyla %10 ve %20 oranında arttığı belirlendi (Şekil 4-39). a K H2O2 (µM) 250 500 1000 K H2O2 (µM ) 250 500 1000 Sitokrom c Smac/D Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 K 250 500 1000 Sitozolik hücre kesimi Smac/Diablo miktarı (%) Sitokrom c miktarı (%) b 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 250 500 1000 Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-37: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. a) Fare kökenli anti-Smac/D ve sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirimi, b) Sitozolik Sitokrom c ve Smac/D miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. 92 a H2O2 (µM) K 250 500 1000 K 250 500 1000 H2O2 (µM ) Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Bcl-2 BCL-X 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 250 500 1000 Mitokondriyal hücre kesimi BCL-X miktarı (%) Bcl-2 miktarı (%) b 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 250 500 1000 Mitokondriyal hücre kesimi Şekil 4-38: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. a) Fare kökenli anti-Bcl-2 ve anti-BCL-X varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı olarak mitokondriyal Bcl-2 ve BCL-X miktarlarındaki değişim. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. 93 a K H2O 2 (µM) 250 500 1000 H2O 2 (µM ) K 250 500 1000 AIF Apaf-1 Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim b 90 K 250 500 1000 Sitozolik hücre kesimi AIF miktarı (%) Apaf-1 miktarı (%) 100 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 80 70 K 250 500 1000 60 50 40 30 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-39: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. a) Fare kökenli anti-Apaf-1 ve sıçan kökenli anti-AIF varlığında western emdirimi, b) Sitozolik AIF ve Apaf-1 miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. Daha sonra K562 hücrelerine önce 24 saat süreyle 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde (2 ve 4 mM) H2 O2 48 saat süre ile uygulandıktan sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayrılan hücrelerde, Cyt c, Smac/D, Bcl-2, Apaf-1, AIF ve BCL-X gibi apoptotik ve anti-apoptotik proteinlerin miktarlarındaki değişiklikler ‘western’ emdirim analizi ile incelendi. Elde edilen sonuçlara göre; bu gruptaki hücrelerde H2O2 derişimine bağlı olarak Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitozole salındığı görüldü (Şekil 4-40). Antiapoptotik proteinlerden Bcl-2’nin mitokondriyal kesimde anlatımının arttığı, BCL-X miktarının ise kontrole göre azaldığı fakat bu azalmanın 2 mM H2 O2 derişiminde daha belirgin olduğu görüldü (Şekil 4-41). Mitokondriyal proapoptotik proteinlerden AIF’nin H2O2 derişimine bağlı olarak sitoplazmik miktarının arttığı, Apaf-1 miktarının ise 2 mM’da arttığı 4 mM’da azaldığı belirlendi (Şekil 4-42). 94 a K H2 O2 2 mM 4mM H 2 O2 2 mM 4mM K Sitokrom c Smac/D Mitokondriyal kesim 100 100 90 90 80 70 60 K 2 mM 4 mM 50 40 30 20 Smac/D miktarı (%) Sitokrom c miktarı (%) b Sitozolik kesim 80 70 50 40 30 20 10 10 0 0 Sitozolik hücre kesimi K 2 mM 4 mM 60 Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-40: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi a) Fare kökenli anti-Smac/D ve sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirimi, b) H2O2 etkisi ile mitokondriden sitozole salınan Sitokrom c ve Smac/D miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. Sitozolik kesimde Sitokrom c’nin üst kısmında bulunan bantlar non-spesifik bantlar olup dikkate alınmamıştır. 95 a K H2O 2 2 mM 4mM H2O 2 2 mM 4mM K Bcl-2 BCL-X Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 2 mM 4 mM Mitokondriyal hücre kesimi BCL-X miktarı (%) Bcl-2 miktarı (%) b 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 2 mM 4 mM Mitokondriyal hücre kesimi Şekil 4-41: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi a) Fare kökenli anti-Bcl-2 ve anti-BCL-X varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı olarak mitokondriyal Bcl-2 ve BCL-X miktarlarındaki değişim. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. 96 a K H2O2 2 mM 4mM H2O2 2 mM 4mM K AIF Apaf-1 Sitozolik Kesim Mitokondriyal kesim 100 100 90 90 80 70 60 K 2 mM 4 mM 50 40 30 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi Apaf-1 miktarı (%) AIF miktarı (%) b 80 70 K 2 mM 4 mM 60 50 40 30 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-42: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi a) Fare kökenli anti-Apaf-1 ve sıçan kökenli anti-AIF varlığında western emdirimi, b) Sitozolik AIF ve Apaf-1 miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. H2O2 grubu, önce β-karoten sonra normal (250, 500, 1000 µM) ve yüksek (2, 4 mM) derişimli H2O2 gruplarındaki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin miktarlarındaki değişimin karşılaştırmalı gösterimi şekil 4-43’de verilmiştir. 97 Sitokrom c a K H2O2 (µM) 250 500 1000 H2O 2 (µM ) K H 2O2 grubu 250 500 1000 100 H2O2 grubu 90 H2O 2 (mM) H2O2 (mM) 2 4 K K 2 4 Önce β-k sonra H2O 2 grubu Mitokondriyal kesim 80 Sitokrom c miktarı (%) Önce β-k sonra H2O2 grubu 70 K 60 250 50 500 40 1000 30 20 Sitozolik kesim 10 0 Mitokondriyal Önce β-k sonra H2O2 grubu (2 -10 mM) Önce β-k sonra H2O2 grubu (250-1000 µM) 100 100 90 90 80 70 K 60 250 50 500 40 1000 30 20 80 Sitokrom c miktarı (%) Sitokrom c miktarı (%) Sitozolik 70 60 K 50 2 mM 40 4 mM 30 20 10 10 0 0 Mitokondriyal Mitokondriyal Sitozolik b Sitozolik Smac/DIABLO K H2O2 (µM) 250 500 1000 H2O 2 (µM ) K H 2O2 grubu 250 500 1000 100 Önce β-k sonra H2O 2 grubu H2O 2 (mM) H2O2 (mM) 2 4 K K 2 4 Önce β-k sonra H2O2 grubu Mitokondriyal kesim Smac/Diablo miktarı (%) H2O2 grubu Sitozolik kesim 90 80 70 K 60 50 250 0 Mitokondriyal 90 80 K 250 500 40 1000 30 20 10 Smac/Diablo miktarı (%) Smac/Diablo miktarı (%) 100 90 50 Sitozolik Önce β-k sonra H2O2 grubu (2 -10 mM) 100 60 1000 20 10 Önce β-k sonra H2O2 grubu (250-1000 µM) 70 500 40 30 80 70 60 K 50 2 mM 40 4 mM 30 20 10 0 0 Mitokondriyal Sitozolik Mitokondriyal Sitozolik 98 c Bcl-2 H2O 2 (µM) 250 500 1000 K K H2O2 (µM ) 250 500 1000 H2O2 grubu 100 H2O 2 grubu 90 80 H2O 2 (mM) 2 4 K K Bcl-2 miktarı (%) Önce β-k sonra H2O2 grubu H2O2 (mM) 2 4 Önce β-k sonra H2O 2 grubu Mitokondriyal kesim 70 K 60 50 250 1000 30 20 10 Sitozolik kesim 0 Mitokondriyal hücre kesimi Önce β-k sonra H2O2 grubu (250-1000 µM) Önce β-k sonra H 2O2 grubu (2 -10 mM) 100 90 80 70 K 60 50 250 40 1000 Bcl-2 miktarı (%) Bcl-2 miktarı (%) 500 40 500 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Mitokondriyal hücre kesimi K 2 mM 4 mM Mitokondriyal hücre kesimi d BCL-X H2O 2 (µM) 250 500 1000 K K H2O2 (µM ) 250 500 1000 H2O2 grubu 100 H2O 2 grubu Önce β-k sonra H2O2 grubu K H2O 2 (mM) 2 4 K H2O2 (mM) 2 4 Önce β-k sonra H2O 2 grubu BCL-X miktarı (%) 90 80 70 K 60 50 250 40 30 1000 20 Mitokondriyal kesim 10 0 Sitozolik kesim Mitokondriyal Önce β-k sonra H2O2 grubu (250-1000 µM) Sitozolik Önce β-k sonra H2O2 grubu (2 -10 mM) 100 100 90 90 80 80 70 K 60 250 50 500 40 1000 30 BCL-X miktarı (%) BCL-X miktarı (%) 500 70 2 mM 50 4 mM 40 30 20 20 10 10 0 K 60 0 Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Mitokondriyal Sitozolik 99 e AIF H2O 2 (µM) 250 500 1000 K H2O2 (µM ) 250 500 1000 K H2 O2 grubu 100 AIF miktarı (%) H2O 2 grubu Önce β-k sonra H2O 2 grubu K H2O2 (mM) H2O2 (mM) 2 4 K 2 4 Önce β-k sonra H2O2 grubu Mitokondriyal kesim 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Sitozolik kesim 0 Mitokondriyal kesim 100 100 90 90 80 80 70 K 250 500 1000 50 40 Sitozolik kesim Önce β-k sonra H2 O2 grubu (2 -10 mM) AIF miktarı (%) AIF miktarı (%) Önce β-k sonra H 2O2 grubu (250-1000 µM) 60 K 250 500 1000 30 70 50 4 mM 40 30 20 20 10 10 0 K 2 mM 60 0 Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Mitokondriyal kesim f Sitozolik kesim Apaf-1 K 250 H2 O2 grubu H2O 2 (µM) 500 1000 H2O2 grubu K Apaf-1 miktarı (%) Önce β-k sonra H2O2 grubu H2O2 (mM) 2 4 Önce β-k sonra H2O 2 grubu Sitozolik hücre kesimi 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 250 500 1000 Sitozolik hücre kesimi 100 90 80 70 60 50 40 30 Önce β-k sonra H 2O2 grubu (2 -10 mM) K 250 500 1000 20 10 0 Sitozolik hücre kesimi Apaf-1 miktarı (%) Apaf-1 miktarı (%) Önce β-k sonra H2O2 grubu (250-1000 µM) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K 2 mM 4 mM Sitozolik hücre kesimi Şekil 4-43: Farklı deney gruplarındaki a) Sitokrom c, b) Smac/D, c) Bcl-2, d) BCL-X, e) AIF, f) Apaf-1’in mitokondriyal ve sitozolik hücre kesimlerindeki miktarlarındaki değişikliklerin western emdirim analizi ile gösterimi ve ImageJ programı kullanılarak belirlenen bant yoğunluklarının histogram gösterimi. 100 Oksidatif stres ve antioksidan-oksidan etkileşimlerinin K562 hücrelerindeki etkisi belirlendikten sonra farklı bir kanser hücre soyu olan MCF-7 meme kanseri hücrelerinde de bu etkileşimler çeşitli yöntemler kullanılarak belirlendi. 4.11. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücreleri Üzerine Etkisi MCF-7 hücrelerine farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulanarak oksidatif stres etkisine; hücre canlılığı, ∆Ψm’ndeki değişimler, ışık ve floresan mikroskobu görüntüleri, AnnV-PI analizi ve çeşitli antikorlarla yapılan ‘western’ emdirim analizleri ile bakıldı. 4.11.1. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi Oksidatif stresin MCF-7 hücrelerinde etkisini belirlemek amacı ile hücrelere 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2; 24, 48 ve 72 saat süre ile uygulandı. Tripan mavisi hücre canlılık testi sonuçlarına göre, H2O2 derişimi ve uygulama süresi arttıkça MCF-7 hücre canlılığının da hızlı bir şekilde azaldığı belirlendi. Şekil 4-44’e bakıldığında; daha 24. saat 500 µM H2O2 derişiminde hücre canlılığının %50’nin altına düştüğü görülmektedir. Zamana bağlı olarak H2 O2 etkisi incelendiğinde, 1000 µM H2O2 uygulamasında hücre canlılığının 24. saatte %25’lere, 48.saatte %10’lara, 72.saatte ise %5’lere düştüğü görülmektedir. Ayrıca H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak hücre proliferasyonunda da ciddi azalmalar olduğu belirlendi (Şekil 4-45). Hücrelerin ışık mikroskobundan elde edilen yapısal görüntüleri de bu sonuçları desteklemektedir (Şekil 4-46). Elde edilen tüm bu veriler; MCF-7 hücrelerinde de H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça oksidatif stresin arttığı ve bu artışın K562 hücrelerininkinden daha fazla olduğu belirlendi (4-47). 101 Şekil 4-44: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücre canlılığındaki değişim. Şekil 4-45: H2O2 derişim ve uygulama proliferasyonundaki değişim. süresine bağlı olarak MCF-7 hücre 102 24.saat 250 µM H2O2 Kontrol a 750 µM H2O2 500 µM H2O2 1000 µM H2O2 10X büyütme 48.saat 250 µM H2O2 Kontrol b 750 µM H2O2 500 µM H2 O2 1000 µM H2O2 10X büyütme 103 72.saat 250 µM H2O2 Kontrol c 750 µM H2O2 500 µM H 2O2 1000 µM H2O 2 10X büyütme Şekil 4-46: Farklı derişimlerde H2O2 ile a) 24 saat, b) 48 saat, c) 72 saat işlem görmüş MCF-7 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık mikroskobu görüntüsü. 104 MCF-7 K562 Şekil 4-47: Oksidatif stres etkisiyle MCF-7 ve K562 hücre canlılıklarındaki değişimin karşılaştırmalı gösterimi. 4.11.2. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği Değişiklikler MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için hücrelere 24, 48 ve 72 saat süre ile 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 verildi. Akım sitometride yapılan analizlere göre; 100 µM H2O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark olmadığı fakat hücre granülite ve büyüklüğünün değiştiği görüldü (Şekil 4-48). 250 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı, H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça bu 105 popülasyonun büyüklüğünün de hızlı bir şekilde arttığı görüldü. En düşük deney uygulama süresi olan 24 saatte bile, 1000 µM H2O2 derişiminde mitokondri membran potansiyelinin etkili bir şekilde azaldığı görüldü (Şekil 4-49). Hücre profillerindeki değişimin de H2O2 derişim ve uygulama süresiyle doğru orantılı olarak arttığı belirlendi (Şekil 4-50). 24 saat kontrol 100 µM Şekil 4-48: 100 µM H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm ve hücre profilindeki değişim. (Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.) 106 48 saat 72 saat 1000 µM 750 µM 500 µM 250 µM 24 Saat Şekil 4-49: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. (Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.) 107 24 saat kontrol 250 µM 750 µM 500 µM 1000 µM Şekil 4-50: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücre profilindeki değişiklikler. Floresan mikroskobu ile yapılan ∆Ψm analizlerinde de akım sitometri ile yapılan analizleri destekler nitelikte sonuçlar elde edildi. Kontrol grubu hücrelerinde Rho123 yoğunluğu belirgin bir şekilde görülürken (Şekil 4-51), H2 O2 ile işlem görmüş hücrelerde, derişim arttıkça Rho123 yoğunluğunun hızla azaldığı ve hücre profilinin değiştiği görüldü (Şekil 4-52). 108 Şekil 4-51: MCF-7 hücrelerinin Rho123 ile ∆Ψm analizinin floresan mikroskobu görüntüsü. (Oklar Rho123 ile belirgin hale gelen mitokondrileri göstermektedir.) 250 µM 100 µM 750 µM 500 µM 1000 µM Şekil 4-52: Farklı Derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. (40x Büyütme). 109 4.11.3. Oksidatif Stres Etkisiyle MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler MCF-7 hücrelerine artan derişimlerde (0-1000 µM) H2O2 uygulandıktan 24 saat sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayırım işlemi Gereç ve Yöntemler Bölümü’nde anlatıldığı şekilde yapıldı. Daha sonra yapılan ‘western’ emdirim analizleri ile Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya salınımına bakıldı. 250 µ M’dan sonraki H2O2 derişimlerinde Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya salındığı ve bu proteinlerin sitoplazmik miktarlarının H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak arttığı belirlendi (Şekil 4-53). 110 a H2 O2 (µM) K 100 250 H2O2 (µM) 500 K 100 250 500 Sitokrom c Smac/D Glikoz-6-fosfatdehidrogenaz Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim b H2O2 (µM) K 500 750 1000 H2O2 (µM) K 500 750 1000 Sitokrom c Smac/D Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Şekil 4-53: Farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin western emdirim analizi a) 100, 250 ve 500 µM H2O2 b) 500, 750 ve 1000 µM H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış MCF-7 hücrelerinin fare kökenli anti-Smac/D, sıçan kökenli anti-Sitokrom c ve anti-Glikoz-6-fosfat dehidrogenaz varlığında western emdirimi. 111 4.12. β-karoten’in MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi β-karotenin MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi FACS analizleri ile belirlendi. MCF-7 hücreleri 24 saat süreyle 1 µM, 2 µM, 3 µM ve 4 µM β-karoten ile muamele edildi. Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden yapılan analizlerde β-karotenin tek başına MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm açısından bir değişikliğe neden olmadığı görüldü (Şekil 4-54). FACS analizleri sırasında kapılanmış hücre profilleri incelendiğinde hücrelerin granülite ve büyüklüklerinde de herhangi bir farka rastlanmadı (Şekil 4-55). 1 µM 3 µM 2 µM 4 µM Şekil 4-54: Farklı derişimlerde 24 saat β-karoten uygulamasının MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. (Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten uygulanmış hücreleri göstermektedir.) 112 Kontrol 2 µM 1 µM 3 µM 4 µM Şekil 4-55: Farklı derişimlerde β-karoten ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücre profilleri. 4.13. MCF-7 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı β-karotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi MCF-7 hücrelerine 24 saat süreyle farklı derişimlerde uygulanan β-karotenin tek başına ∆Ψm ve hücre profilininde herhangi bir değişikliğe neden olmadığının belirlenmesi üzerine, H2O2’nin meydana getirdiği oksidatif hasarına karşı bir antioksidan etki gösterip gösteremeyeceğini belirlemek amacıyla hücreler, H2O2 ile muamele edilmeden önce β-karoten ile muamele edilerek hücre canlılığı, hücre proliferasyonu ve ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. 4.13.1. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücre Canlılığı ve Proliferasyonunda Meydana Gelen Değişiklikler Hücrelere 24 saat süreyle β-karoten (1 ve 2 µM) verilip uzaklaştırıldıktan sonra 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 24 saat uygulanarak hücre canlılığı ve proliferasyonuna bakıldı. Elde edilen sonuçlara göre, H2O2 uygulanmadan önce 1 µM β-karoten ile muamele gören MCF-7 hücre canlılığının 1000 µM H2O2 derişiminde bile 113 %70’lerde olduğu (Şekil 4-56 a), hücre proliferasyonunun ise hızlı bir şekilde azaldığı, 1000 µM H2O2 derişiminde %20’lere kadar düştüğü görüldü (Şekil 4-56 b). a 100 90 80 Kontrol 70 % Canlılık 100 µM 60 250 µM 500 µM 50 750 µM 1000 µM 40 30 20 10 0 b 100 90 80 Hücre Sayısı (x104 ) 70 Kontrol 100 µM 250 µM 500 µM 750 µM 1000 µM 60 50 40 30 20 10 0 24 saat Şekil 4-56: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde 24 saat H2O2 uygulanmış MCF-7 hücrelerinin a) canlılık b) proliferasyonundaki değişim. 114 β-karoten derişimi arttırılıp MCF-7 hücrelerine H2O2 uygulanmadan 24 saat önce 2 µM β-karoten uygulandığında da hücre canlılığında anlamlı bir değişimin olmadığı, aynı şekilde 1000 µM H2O2 derişiminde bile %70 oranında canlı hücre olduğu görüldü (Şekil 4-57). 100 % canlılık 90 80 Kontrol 70 100 µM 250 µM 60 500 µM 50 750 µM 1000 µM 40 30 20 10 0 24 saat Şekil 4-57: Önce 2 µM β-karoten sonra 24 saat farklı derişimlerde H2O2 uygulanmış MCF-7 hücrelerinin canlılığındaki değişim. 4.13.2. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler MCF-7 hücrelerine önce β-karoten (1-2 µM) sonra farklı derişimlerde (100-1000µM) H2O2 verilerek ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. Hücreler 24 ve 48 saat süre ile H2O2 uygulanmadan önce 1 µM β-karoten ile 24 saat muamele edilerek yapılan FACS analizi sonuçlarına göre, 100 µM H2O2 derişiminde ∆Ψm’nin değişmediği görüldü. Artan H2O2 derişimlerinde (250, 500, 750, 1000 µ M) ise floresan yoğunluğu azalmış ikinci hücre popülasyonunun 24. saatte ortaya çıktığı fakat bu popülasyonun küçük olduğu yani 1 µM β-karoten’in ∆Ψm açısından etkili olduğu ve tam olmasa da bir koruma sağladığı görüldü. Fakat zamana bağlı olarak ∆Ψm’ndeki değişimin arttığı, 1 µM β-karoten’in etkili olamadığı belirlendi (Şekil 4-58). 115 Floresan mikroskobunda elde edilen görüntülerde de Rho123 yoğunluğunun H2O2 grubuna göre daha fazla olduğu görüldü (Şekil 4-59). 48 saat 1000 µM 750 µM 500 µM 250 µM 24 saat Şekil 4-58: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (250-1000 µM) H2O2 ile 24 ve 48 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. (Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise önce 1 µM β-karoten sonra H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.) 116 100 µM 250 µM 750 µM 500 µM 1000 µM Şekil 4-59: 1 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. (40x Büyütme) β-karoten derişimi arttırılıp MCF-7 hücreleri aynı şekilde H2 O2 uygulanmadan önce 2 µM β-karoten ile muamele edildiğinde ise floresan yoğunluğu azalmış hücre grubunun ortaya çıkmadığı yani ∆Ψm’nin değişmediği (kontrol gubu ile aynı olduğu) görüldü (Şekil 4-60 a). FACS analizleri sırasında kapılanmış hücre profilleri incelendiğinde ise 250-1000 µM H2O2 derişimlerinde hücrelerin granülite ve büyüklüklerinin az miktarda değiştiği gözlemlendi (Şekil 4-60 b). Bu sonuçlara göre, β-karoten, MCF-7 hücrelerine H2O2 uygulanmadan önce verildiğinde 2 µM derişimde ∆Ψm açısından koruma sağlamaktadır. Floresan mikroskobu ile elde edilen görüntülerde de Rho123 alımının bu gruptaki hücrelerde arttığı, kontrol grubu hücreleri ile benzer olduğu görüldü (Şekil 4-61). 117 a 100 µM 250 µM 750 µM 500 µM 1000 µM b Kontrol 500 µM 100 µM 750 µM 250 µM 1000 µM Şekil 4-60: Önce 2 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin a) ∆Ψm’ndeki değişiklikler, b)hücre profillerindeki değişiklikler. (Şekil a’da siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise önce 2 µM β-karoten sonra H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.) 118 100 µM 250 µM 750 µM 500 µM 1000 µM Şekil 4-61: 2 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. Şekil 4-62’de yalnız H2O2 uygulanan MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonunun H2 O2 derişimi ile doğru orantılı olarak arttığı fakat hücrelere önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulandığında, bu popülayonunazaldığı; önce 2 µM β-karoten sonra H2O2 uygulandığında ise β-karoten’in H2O2’nin oksidatif etkisine karşı ∆Ψm açısından tam koruma sağladığı görülmektedir. 119 1 µM β-karoten-H2O2 2 µM β-karoten-H2O2 1000 µM 750 µM 500 µM 250 µM H2O2 Şekil 4-62: Önce β-karoten (1 µM ve 2 µM) sonra H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi. (Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra (1 ve 2 µM) H2O2’yle işlem görmüş hücreleri göstermektedir.) 4.13.3. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlerindeki Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler MCF-7 hücrelerine önce β-karoten (1 ve 2 µM) sonra artan derişimlerde (500, 750 ve 1000 µM) H2O2 uygulandıktan 24 saat sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayırım işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra yapılan ‘western’ emdirim analizleri ile sitokrom c miktarındaki değişiklikler incelendi. Hücrelere önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulandığında sitokrom c’nin mitokondriden sitozole salındığı görüldü. β-karoten derişimi 2 µM’a çıkarıldığında ise sitokrom c salınımının olmadığı görüldü (Şekil 4-63). Bu sonuç, H2O2 ile oluşturulan oksidatif stresin 2 µM β-karoten ile önlenebildiği sonucunu desteklemektedir. 120 H2O 2 (µM) K 500 750 1000 H2O2 (µM) K 500 750 1000 1 µM β-karoten 2 µM β-karoten Mitokondriyal kesim Sitozolik kesim Şekil 4-63: Önce β-karoten (1 ve 2 µM) sonra H2O2 (500, 750 ve 1000 µM) ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış MCF-7 hücrelerinin sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirim analizleri. 121 5. TARTIŞMA Organizmada moleküler düzeyde birçok biyolojik etkiye sahip olan ve normal metabolik olaylar sırasında doğal olarak oluşan reaktif oksijen türleri, vücutta antioksidanlar tarafından dengelenmektedir. Antioksidan-oksidan dengesinin bozulduğu durumlar da ise birçok hastalığın oluşumuna neden olan oksidatif stres meydana gelir. Başta kanser olmak üzere oksidatif stresin neden olduğu hastalıkların tanı ve tedavisine yönelik çalışmalarda, antioksidan uygulamaları ve farklı hücre ölüm süreçlerinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, antioksidan-oksidan etkileşimlerinin oksidatif stres ve farklı hücre ölüm süreçlerine etkisi; K562 ve MCF-7 hücrelerine, oksidan (H2O2) ve antioksidan (β-karoten) maddeler farklı şekillerde uygulanarak çeşitli analiz yöntemleri kullanılarak belirlendi. Hücre canlılıkları tripan mavisi testiyle, mitokondri membran potansiyelindeki değişiklikler floresan mikroskobu ve FACS analizleriyle, erken apoptotik süreçteki hücreler Ann V analiziyle, apoptotik ve nekrotik hücreler AnnV-PI analiziyle, hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler DNA analiziyle, sitozolik ve mitokondriyal hücre kesimlerindeki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin miktarındaki değişiklikler ‘western’ emdirim analiziyle, yapısal değişiklikler ise ışık ve floresan mikroskobu ile belirlendi. Oksidatif stres hücre içinde birçok molekülü etkileyerek hücre hasarına ve buna bağlı olarak da hücrelerin canlılığını yitirmesine neden olmaktadır. Hücrelerin geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz ölüm sürecine girmesi, oksidanların derişimine ve etki sürelerine bağlı olarak değişmektedir. Farklı derişim (100-1000 µM) ve sürelerde (24-72 saat) H2O2 uygulanarak oksidatif strese maruz bırakılan K562 hücrelerinde, H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça hücre canlılığının azaldığı belirlendi. Hücrelerin ışık mikroskobu ile elde edilen yapısal görüntülerinin de canlılık testi sonuçlarını destekler nitelikte olduğu görüldü. Kontrol hücrelerinin tamamı canlı iken H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça canlı hücre sayısının azaldığı ve hücre yapılarının bozulduğu gözlemlendi. 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile muamele görmüş hücrelerin tamamına yakınının ölü (parçalanmış ve membran bütünlüğü bozulmuş) hücreler olduğu görüldü. Aynı şekilde MCF-7 hücrelerine oksidatif stress uygulandığında, H2O2 derişimi ve uygulama süresi arttıkça MCF-7 hücre canlılığının da 122 hızlı bir şekilde azaldığı belirlendi. Ayrıca H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak hücre proliferasyonunda da ciddi azalmalar olduğu görüldü. Hücrelerin ışık mikroskobunda elde edilen yapısal görüntüleri de elde edilen verilerle uyuşmaktadır. MCF-7 hücrelerinde oksidatif stress etkisi ile hücre ölümünün tetiklenmesi ve hücre canlılığındaki azalmanın, K562 hücrelerininkinden daha fazla olduğu görüldü. MCF-7 hücrelerinin K562 hücrelerine göre oksidatif stresten daha fazla etkilenmeleri; ROS’ların farklı hücre soylarında yarattığı etkinin de farklı olabileceği teziyle uyuşmaktadır. Son yıllarda, ROS’ların hücre ölümünü tetikleme kapasitesinin belirlenmesi ve kanser tedavisinde ROS’ların kemoterapatik ajanları destekleyici olarak kullanılması son derece önem kazanmıştır. ROS’ların apoptoz tetikleme mekanizmalarında etkili oldukları ve apoptotik sürecini gen düzeyinde etkiledikleri yapılan in vitro ve in vivo çalışmalar sonucunda ıspatlanmıştır. ROS’lar hücre içi ve hücre dışı birçok etkenle oluşabilmektedirler. Hücre içi ROS oluşturan etkenlerin başında mitokondri gelir. Tüm aerobik organizmalarda mitokondriyal solunum zinciri ROS ürünlerinin ana kaynağını oluşturmaktadır. Hücre ölüm mekanizmalarıyla ilgili yapılan çalışmaların büyük bir bölümü apoptoz düzenlenmesinde önemli rolü olan mitokondride yoğunlaşmaktadır. Antioksidan enzimler ve birçok antioksidan sistem mitokondride bulunmasına rağmen mitokondri ROS’ların hem birincil kaynağı hem de ana hedefi konumundadır. ROS’ların oluşumu, ∆Ψm’nde azalmaya ve membranda por oluşumuna neden olmaktadır. ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler ve oluşan porlar apoptotik ve proapoptotik proteinlerin sitoplazmaya salınımına ve apoptotik sürecin tetiklenmesine neden olmaktadır. Dolayısı ile ∆Ψm analizi hücrenin apoptoza yönlendiğini gösteren önemli belirteçlerden biridir. Bu nedenden dolayı oksidatif stresle ilgili çalışmalarda mitokondriyal parametrelerin incelenmesi de büyük önem taşımaktadır. Çalışmamızda, hidrojen peroksidin farklı kanser hücre soylarında oluşturduğu oksidatif hasar, ∆Ψm’nde meydana getirdiği değişiklikler açısından FACS analizleri ile Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden belirlendi. Lipofilik katyonik bir boya olan Rho123 hücre içine girdiğinde yüksek negatif membran potansiyeline sahip olan mitokondride birikmektedir. ∆Ψm depolarize olduğunda Rho123’ün mitokondride tutulumu azalır ve bu durum hücre içi floresan yoğunluğunun azalması şeklinde sonuçlanır. Farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulanan K562 hücrelerinde 100 µM H2 O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark görülmedi. 250 µM 123 H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı ve bu popülasyonun büyüklüğünün H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça arttığı belirlendi. 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile muamele gören hücrelerin ise tamamına yakınının floresan yoğunluğunun azaldığı görüldü. Floresan yoğunluğundaki bu düşüş ∆Ψm depolarizasyonunu göstermektedir. Depolarizasyonun tetiklenmesi için minimum 250 µM H2 O2 derişimine gereksinim olduğu ve H2O2 derişimi ile uygulama süresi arttıkça K562 hücrelerinin ∆Ψm’nin azaldığı belirlendi. FACS analizlerinde, kapılanmış hücrelere bakıldığında ise, hücrelerin granülite ve büyüklüklerindeki değişiklikler de bu bulguları destekledi. MCF-7 hücrelerine aynı şekilde oksidatif stres uygulayarak yapılan ∆Ψm analizi sonuçlarına göre de 100 µM H2O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark olmadığı fakat hücre granülite ve büyüklüğünün değiştiği görüldü. Bu da, hücrelerin 100 µM H2O2 derişiminde henüz ∆Ψm değişim aşamasına gelmese de bir şekilde oksidatif stresten etkilendiğini göstermektedir. 250 µ M H2 O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı, H2 O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça bu popülasyonun büyüklüğünün de hızlı bir şekilde arttığı görüldü. En düşük deney uygulama süresi olan 24 saatte bile, 1000 µM H2O2 derişiminde ∆Ψm etkili bir şekilde azalmaktadır. Kapılanmış hücre profillerindeki değişim de, H2O2 derişim ve uygulama süresiyle doğru orantılı olarak artmaktadır. H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin K562 hücrelerininkinden daha fazla olduğu görüldü. Canlılık testinde olduğu gibi ∆Ψm analizinde de, oksidatif stresin MCF-7 hücrelerini K562 hücrelerine göre daha fazla etkilediği görülmektedir. Rho123 ile yapılan floresan mikroskobu çalışmasında, MCF-7 hücrelerinin mitokondrileri kontrol grubu hücrelerinde çok net bir şekilde noktasal olarak görüntülenirken, H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde, derişim arttıkça Rho123 yoğunluğunun yani mitokondri sinyallerinin hızla azaldığı ve hücre profilinin değiştiği görüldü. Mitokondri sinyallerinin hücre içinde difüzlenmiş bir görüntü oluşturması, mitokondri yapılarınının bozulduğunu dolayısıyla ∆Ψm’ndeki değişimi göstermektedir. Mitokondriyal oksidatif stres etkisi ile hücre yaşamını yakından ilgilendiren protein, lipid ve membran yapılarının hasarlanması hücre ölümünün aktifleşmesine yol açmaktadır. Dolayısıyla, H2O2’nin oluşturduğu oksidatif hasar apoptotik süreci tetiklediği sonucuna varıldı. 124 Kanser gelişiminde ve özellikle kanser tedavisi sürecinde sıklıkla karşılaşılan hücre ölüm mekanizmalarından biri de kontrolsüz hücre ölümü olarak adlandırılan nekrozdur. Bağışık yanıtı uyarabilen nekroz sürecinin, doğal olarak tümör gelişimini de engelleyebileceği öngörülmüştür. Kanser ilaçlarının bir kısmı da tümör hücrelerinde nekrozu uyararak etkili olmaktadır. Bu nedenle, apoptotik hücreler ile birlikte nekrotik hücrelerin belirlenmesi de önem taşımaktadır. Ayrıca hücrelerin apoptozun hangi aşamasında olduğu da tedavide belirleyici bir özelliktir. Bu nedenle, K562 hücrelerine 24 saat süreyle artan derişimlerde H2O2 uygulandıktan sonra Ann V-PI boyama ile FACS analizleri yapıldı. Canlı ve ölü hücrelerin ayrı kapılandığı noktasal grafikler incelendiğinde; canlı hücre popülasyonunun H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak azaldığı, ölü hücre popülasyonunun ise giderek arttığı belirlendi. Canlı kabul edilen boyanmamış hücre popülasyonunun giderek azaldığı, yalnız AnnV, yalnız PI ve AnnV + PI ile boyanmış hücre popülasyonlarının giderek arttığı gözlemlendi. Analiz sonucu elde edilen sayısal değerlere göre; canlı hücre popülasyonunun kontrol hücrelerine göre 1000µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 74 oranında düştüğü belirlendi. Apoptotik hücre popülasyonunun, kontrol hücrelerine göre, 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 66 oranında arttığı görüldü. Erken apoptotik hücre popülasyonunun % 2,6 , nekrotik hücre popülasyonunun ise %6 oranında arttığı görüldü. Bu veriler, hücrelerin büyük bir kısmının geç apoptotik evrede olduğunu yani apoptozun geri dönüşümsüz aşamasına girdiğini göstermektedir ve bu sonuçlar ∆Ψm ve canlılık analizlerinden elde edilen sonuçlarla da uyuşmaktadır. Oksidatif stres vücuttaki antioksidan mekanizmalarıyla önlenir ya da onarılır. Antioksidanlar, serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel düzeydeki hasarı engellemekte ve birçok hastalığın oluşumunu durdurmaktadırlar. A vitamini oksidatif nedenlerle oluşan hücre yıkımının tamirinde önemli rolü olan bir vitamindir. A vitamininin suda eriyebilen öncülü olan β-karoten ise güçlü bir antioksidan olup dokularda peroksil radikallerinin yakalanmasından sorumludur ve serbest oksijen radikallerinin oluşumunu önlemesinin yanı sıra radikallerle doğrudan reaksiyona girebilir10. β-karoten kanser ve hücre ölümü çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Bunun nedeni β-karotenin birçok ülkede yetişen meyve ve sebzelerde en çok görülen ortak karotenoid olmasıdır. Bazı epidemiyolojik çalışmalar, ateroskleroz va kanser insidansının uygun miktarda β-karoten ve diğer karotenoidleri alan kişilerde daha düşük olduğunu göstermektedir57. β-karoten’nin apoptoz ve hücre döngüsünü G2/M fazında 125 tutuklayarak, birçok insan kolon adenokarsinoma hücre soyunun çoğalmasını engellediği bildirilmiştir12. β-karoten’nin, melanoma95, prostat96, ağız, akciğer ve göğüs97 kanseri hücrelerini de içeren daha birçok tümör hücresinin çoğalmasını inhibe edici etkisi olduğu bilinmektedir. Fakat, β-karoten’nin kronik farmakolojik dozları kullanılarak yapılan insan aracılı denemelerde beklenmedik bir şekilde β-karotenin, sigara içenlerde akciğer kanseri oluş sıklığını düşürmediği hatta daha da arttırdığı görülmüştür65,68,69. Bu nedenle; β-karoten’nin, kendi özelliklerinin yanında, etki gösterdiği biyolojik çevrenin redoks potansiyeline de bağlı olarak; serbest radikal üretimini engelleyerek antioksidan55,65,67,70 ya da serbest radikallerle indüklenen reaksiyonları ilerleterek prooksidan olarak görev yaptığı düşünülmektedir65,72,73. Bu nedenle, birçok deneysel kemoterapötiklerin çalışmada; sitotoksisitesini β-karoten, arttırmak için kolon kanserine önerilmektedir12,86. karşı Ayrıca, β-karoten’nin bcl-2 gen ailesinden olan ve programlı hücre ölümünde inhibitör olarak görev yapan Bcl-2 ve Bcl-xL anlatımlarını da azalttığı gösterilmiştir65. Bu bulgular, β-karoten’nin derişime ve hücrenin biyolojik çevresine bağlı olarak antioksidan ya da prooksidan olarak etki eden bir hücreiçi redoks ajanı olabileceğini göstermektedir65. Bu bilgiler ışığında, K562 ve MCF-7 hücrelerinde H2O2’nin neden olduğu oksidatif hasara karşı antioksidanların etkisini belirlemek amacıyla, hücrelere H2O2 uygulanmadan önce, sonra ve H2O2 ile eş zamanlı olarak β-karoten verildi. Öncelikle, β-karoten’in tek başına etkisinin olup olmadığı ve uygulanacak uygun dozun belirlenebilmesi amacıyla hücrelere 24 saat süreyle farklı derişimlerde (0,1 nM-100 µM) β-karoten uygulanarak Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden FACS analizleri yapıldı. β-karotenin uygulanan dozlarda tek başına ∆Ψm’ni değiştirmediği görüldü. Deneylerde kullanılacak β-karoten derişimi 1µM olarak seçildi ve bu derişimde β-karotenin zamana bağlı (24-72 saat) olarak da ∆Ψm’nde kontrole kıyasla herhangi bir değişikliğe neden olmadığı belirlendi. FACS analizleri sırasında kapılanmış hücre profilleri incelendiğinde, hücrelerin granülite ve büyüklüklerinde de herhangi bir farka rastlanmadı. Bunun üzerine, β-karoten’nin H2O2’nin meydana getirdiği oksidatif hasarına karşı, bir antioksidan etki gösterip gösteremeyeceğini belirlemek için, hücrelere farklı derişimlerde H2O2 ile birlikte 1 µM β-karoten verilerek ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. Đlginç bir şekilde β-karoten’nin H2O2’nin oksidatif etkisini daha da arttırdığı görüldü. β-karoten, H2O2 uygulandıktan sonra hücrelere verildiğinde ise 24. ve 72. saatlerdeki ∆Ψm değişikliklerinin, yalnız H2O2 ile muamele edilen hücre 126 gruplarındaki ∆Ψm değişiklikleri ile benzer olduğu fakat 48. saatte β-karotenin H2O2’nin yarattığı oksidatif etkiyi arttırıcı yönde etki ettiği görüldü. Hücreler H2O2 uygulanmadan önce β-karoten ile muamele edildiğinde ise ∆Ψm’nin hiçbir şekilde değişmediği görüldü. β-karoten hücrelere H2O2 uygulanmadan önce verildiğinde antioksidan özelliği ön plana çıkmış, H2 O2’nin oksidatif etkisine karşı incelenen parametreler açısından tam koruma sağlamış ve hücrelerin apoptoza gitmesini tamamen engellemiştir. Uygulama şekline ve zamana bağlı olarak β-karoten, antioksidan ve prooksidan olarak etki göstermiştir. β-karoten’nin farklı şekillerde oksidanlarla etkileşime sokulması sonucu elde edilen bu veriler daha önce bahsedilen literatür bilgisiyle de uyuşmaktadır; hücrelere H2O2 ile aynı anda uygulandığında, H2 O2’nin sitotoksitesini arttırırken, öncesinde uygulandığında ise oksidatif etkisini azalttığı hatta tamamen ortadan kaldırdığı görüldü. Hücrelere önce β-karoten sonra H2O2 uygulandığında, ∆Ψm’nde depolarizasyon söz konusu değilken hücre profilinin kontrole kıyasla az da olsa değiştiği gözlemlendi. ∆Ψm değişmezken hücre granülite ve büyüklüğünün değişmesi, bu hücrelerin apoptoza yönlenmiş olabileceğini düşündürdü, çünkü apoptotik sürecin ilk belirtisi hücre profilinin değişmesidir, ∆Ψm değişimi ise bundan sonraki aşamadır. Normalde hücrelerde hücre zarının iç yüzünde membran lipidlerinden biri olan PS bulunmaktadır ve eğer hücre apoptoza yönlenmiş ise PS molekülleri hücre membranının dış yüzeyine transloke olurlar. Bu yer değiştirme hücre membran bütünlüğünün bozulmadığı apoptotik hücre ölümünün erken dönemlerinde meydana gelir. AnnV, PS’e bağlanabilen bir protein olduğundan, floresan bir madde ile işaretlenek erken apoptotik hücreler belirlenebilir. Bu nedenle, hücreler floresan işaretli AnnV ile muamele edilerek, AnnV'ın PS'e bağlanma oranı FACS analizleri ile belirlendi. Sonuçlar, H2O2 derişim ve uygulama süresi ile doğru orantılı olarak floresan yoğunluğunun arttığını yani AnnV cevabının pozitif çıktığını, hücrelerin apoptoza yönlendiğini gösterdi. Bunun üzerine, hücrelere 1µM β-karoten uygulandıktan sonra yüksek derişimlerde (2-10 mM) H2O2 verilerek, β-karotenin K562 hücrelerinde H2O2’nin hangi derişimine kadar koruyucu etki göstereceği test edildi. Elde edilen verilere göre, daha 2 mM H2 O2 derişiminde ∆Ψm’nin hızlı bir şekilde değiştiği görüldü. 24. ve 48. saatlerde 10 mM H2O2 derişiminde hücrelerin tamamının ∆Ψm’nin azaldığı, 72. saatte ise daha 4 mM H2O2 derişiminde hücrelerin tamamının floresan yoğunluğunun azaldığı belirlendi. Yalnız H2O2 uygulanan hücrelerde, daha 1000 µM derişimde hücrelerin tamamında ∆Ψm 127 değişimi görülürken, 1000 µM’dan daha yüksek derişimlerde H2O2 uygulanmadan önce β-karoten ile muamele edilen hücrelerde, çok yüksek derişimlere çıkılmasına rağmen β-karoten’in antioksidan olarak etkili olduğu fakat yüksek H2O2 derişimlerinde oksidatif hasara karşı tam olarak etki göstermesi için bu dozun (1 µM) yeterli olmadığı görülmüştür. Önce 1 µM β-karoten sonra 1000 µM’dan daha yüksek derişimde H2O2 ile muamele edilen hücrelerin yapıları ışık mikroskobunda incelendiğinde ise oldukça ilginç görüntüler elde edildi. Yalnız H2 O2 uygulanan hücre grubunda 1000 µM derişimde bile hücrelerin tamamına yakını ölü ve parçalanmış hücreler olmasına rağmen, önce β-karoten sonra yüksek derişimde H2 O2 uygulanan hücre grubunda ise 10 mM H2 O2 derişiminde bile hücrelerin membran bütünlüklerinin bozulmadığı, hücre içeriklerinin kutuplaşmış olduğu görüldü. Elde edilen bu görüntülere dayanarak hücrelerin ölüm şeklinin apoptoz dışında farklı bir programlanmış hücre ölüm şekli olduğu sonucuna varıldı. Literatürde K562 hücreleri ile yapılan bir çalışmada219 elde ettiğimiz görüntülerle benzer hücre profili elde edilmiş ve bu hücre ölüm şekli ‘nekrozbenzeri hücre ölümü’ şeklinde yorumlanmıştır. Şartlara ve uygulama şekline göre, bazı hücre ölümü morfolojilerinin birkaç tipi aynı hücrede görülebilmektedir ve bu da aynı hücrede birden fazla hücre ölüm mekanizmasının aynı uyaran tarafından etkinleştirilebileceğini göstermektedir. Şimdiye kadar literatürde birçok hücre ölüm tipi tanımlanmıştır. Fakat, çeşitli hücresel strese karşı ortaya çıkan ve birbirinden farklı mekanizmalara sahip olan hücre ölümleri; genel olarak apoptotik, nekrotik ve otofajik hücre ölümü olmak üzere üç tipte toplanmaktadır. Diğerleri ise normalden farklı olan hücre ölüm modellerinin geçici (kesin olmayan) tanımlarıdır. Hücre ölümü ile ilgili çalışmalar hızla devam etmekte olup doğru bir sınıflandırmanın yapılabilmesi ve hücre ölüm tipinin doğru bir şekilde belirlenebilmesi için hücre ölümlerini ayırt edici özellikler gözönüne alınarak farklı biyokimyasal ve işlevsel yöntemler kullanılarak daha fazla araştırmaya gereksinim vardır. β-karotenin K562 hücrelerinde oluşturulan oksidatif strese karşı etkisi belirlendikten sonra farklı kanser hücre soylarında meydan gelen oksidatif hasara karşı etkisi ise MCF-7 hücreleri üzerinden belirlendi. Hücreler 24 saat süreyle (1-4 µM) β-karoten ile muamele edildi ve bu derişimlerde β-karotenin tek başına MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm açısından bir değişikliğe neden olmadığı, hücre granülite ve 128 büyüklüklerinin de değişmediği gözlemlendi. Hücreler H2O2 uygulanmadan önce 24 saat süreyle β-karoten (1 ve 2 µM) ile muamele edildiğinde ise hücre canlılıklarının her iki β-karoten derişiminde de korunduğu (1000 µM’da bile % 70), hücre proliferasyonunun ise azaldığı görüldü. Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gören hücrelerin ∆Ψm analizlerine bakıldığında, 100 µM H2O2 derişiminde ∆Ψm’nin değişmediği, diğer derişimlerde (250-1000 µ M) ise floresan yoğunluğu azalmış ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı fakat bu popülasyonun az olduğu yani 1 µM β-karoten’in ∆Ψm açısından etkili olduğu fakat bu dozun MCF-7 hücreleri için yeterli olmadığı sonucuna varıldı. Bunun üzerine β-karoten derişimi 2 µM’a kadar arttırıldı ve bu derişimde ∆Ψm’nin değişmediği, floresan yoğunluğunun kontrol grubu hücreleri ile bire bir örtüştüğü belirlendi. Sonuç olarak, yalnız H2O2 uygulanan MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonu H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak artarken önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulanan hücrelerde, bu popülayonun büyüklüğünün azaldığı; β-karoten derişimi 2 µM’a çıkarıldığında ise ∆Ψm düşük olan ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıkmadığı yani β-karoten’in, H2O2’nin oksidatif etkisine karşı, incelenen parametreler açısından tam koruma sağladığı belirlendi. Floresan mikroskobu ile yapılan analizlerde de Rho123 alımının önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulanan hücre grubunda arttığı görüldü. β-karoten derişimi 2 µM’a çıkarıldığında ise Rho123 ile işaretlenen mitokondrilerin sayılarının daha da arttığı yani mitokondri yapılarının korunduğu görülmüştür. Hücre morfolojilerinin 1000 µM H2O2 derişiminde bile kontrol grubu hücreleri ile benzer olduğu dikkat çekmiştir. Bu sonuçlara göre; β-karoten K562 hücrelerinde oksidatif hasara karşı 1 µM derişimde etkili olurken, MCF-7 hücrelerinde H2O2’nin neden olduğu oksidatif hasara karşı ancak 2 µM derişimde tam olarak antioksidan etki göstermektedir. Bunun nedeni ise daha önce elde ettiğimiz sonuçlardan da görülebileceği gibi MCF-7 hücrelerinin oksidanlara karşı K562 hücrelerinden daha duyarlı olması ve oksidatif stresten daha fazla etkilenmeleridir. Bu nedenle, β-karoten’in antioksidan olarak etki gösterebileceği doz da yükselmiştir. Oksidatif stress etkisiyle apoptotik ölüm sinyallerinin alınması, mitokondri membranının iyon geçirgenliğini değiştirmekte ve bunu ∆Ψm’ndeki değişiklikler izlemektedir. Membrandaki bu değişimler ve oluşan porlar nedeniyle sitokrom c, Smac/D ve AIF gibi mitokondriyal kesimde yer alan moleküller sitoplazmaya salınırlar. AIF, doğrudan yoğunlaşan kromatine ve parçalanan çekirdeğe yönelirken, 129 sitoplazmadaki sitokrom c ise Apaf-1’e bağlanarak prokaspaz-9’u aktifleştirir (apoptozom) ve prokaspaz-9’un aktifleşmesi bir seri kaspazın aktifleşmesine neden olur. Yapılan analizler sonucu, K562 hücrelerinde H2 O2’nin neden olduğu oksidatif stresin apoptotik hücre ölümünü tetiklediğinin belirlenmesi üzerine, hücreler sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayrıldıktan sonra proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin (Cyt c, Smac/D, Bcl-2, Bcl-X, AIF, Kaspaz-3, Apaf-1 gibi) miktarlarındaki değişiklikler ‘western’ emdirim analizleri ile belirlendi ve bant yoğunlukları ‘ImageJ’ programı kullanılarak değerlendirildi. Farklı derişimlerde (250-1000 µM) H2O2 uygulanmış hücre grubu ile önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde (2, 4 mM) H2O2 uygulanmış hücre grubunda Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya salındığı ve bu proteinlerin sitoplazmik miktarlarının H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak arttığı görüldü. Önce 1 µM β-karoten sonra 250, 500 ve 1000 µM derişimlerinde H2O2 uygulanarak yürütülen deneylerin sonuçlarına göre; bu gruptaki hücrelerde Cyt c ve Smac/D’nun sitozoldeki miktarlarının kontrol grubu ile aynı olduğu yani mitokondriden sitoplazmaya herhangi bir şekilde salınım olmadığı görüldü. Mitokondriyal proteinlerden AIF’nin de yalnız H2O2 grubu ve önce β-karoten sonra yüksek derişimli H2O2 (2, 4 mM) uygulanan hücre grubunda mitokondriden sitoplazmaya salındığı, önce β-karoten sonra H2O2 (250-1000 µM) grubunda ise değişmediği belirlendi. Sitozolik proteinlerden Apaf-1 miktarı yalnız H2O2 grubu ve önce β-karoten sonra yüksek derişimli H2 O2 grubunda artarken önce β-karoten sonra H2O2 (250-1000 µM) grubunda ise anlamlı bir değişikliğin olmadığı görüldü. Mitokondriyal proteinlerden Bcl-2 ve BCL-X anlatımının yalnız H2O2 grubu ve önce β-karoten sonra H2O2 (250-1000 µM) grubunda arttığı, önce β-karoten sonra yüksek derişimli H2 O2 grubunda ise Bcl-2 nlatımı artarken BCL-X miktarının azaldığı belirlendi. Tüm bu sonuçlar, H2O2 ile oksidatif strese maruz kalan hücrelerin geri dönüşümsüz apoptotik sürece girdiğini ve 250, 500, 1000 µM H2O2 uygulanmadan önce β-karoten ile muamele edilen hücrelerin ise beklendiği gibi apoptotik ölüm sürecine girmediği görüldü. Elde edilen bu veriler, diğer tüm analiz sonuçları ile de uyuşmaktadır. Mitokondriyal ve sitozolik kesimlere ayrılan MCF-7 hücrelerinde ise 250 µM’dan sonraki H2O2 derişimlerinde Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitozole salındığı belirlendi. Hücrelere farklı derişimlerde H2O2 uygulanmadan önce 1 µM β-karoten verildiğinde Cyt c ve Smac/D’nun sitozole salındığı; H2O2 uygulanmadan önce 2 µM β-karoten verildiğinde ise bu proteinlerin sitozole salınmadığı görüldü. 130 Çeşitli hastalıkların tedavisinde kaspaz ailesi üyeleri ve Bcl-2/Bax ailesindeki genlerin anlatımları önemli yer tutmaktadır. Temel olarak kanser kemoterapilerinin amacı hücre ölümünü apoptoz yolu ile uyarmaktır220. Apoptoz ve hücre çoğalması arasında kontrollü ve hassas bir denge vardır. Bu dengenin apoptoz lehine bozulması Alzheimer, Parkinson gibi hastalıklara, hücre çoğalması lehine bozulması ise kanser ve otoimmün hastalıklara neden olmaktadır. Tüm bu hastalıkların oluşumunun engellenmesi, tedavi edilebilmesi amacı ile apoptozu kontrol eden mekanizmaların daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Kanserlerde apoptoz tetikleyici mekanizmalarda işlev kaybı ya da hücre çoğalmasını tetikleyici mekanizmalarda aşırı aktiflik görülmektedir. Bu nedenle, apoptotik mekanizmalar, kanser tedavisinde hedef alınmakta ve daha az yan etkiye sahip ilaçların geliştirilmesine çalışılmaktadır. Kanserle ilgili yapılan çalışmalarda hücre ölüm şekilleri ile birlikte hücre döngüsü çalışmaları da son 25 yılın araştırma konularının başında gelir. Çünkü kanser aşırı hızda bölünen ya da apoptoza direnen hücrelerin yarattığı bir sorundur. Oksidanlara maruz kalan hücrelerin ölüme yönlenmesinde hücre çevriminin hangi aşamasında olduğu da belirleyici bir etmendir. Hücre çevrimi farklı moleküler mekanizmaların tetiklenmesiyle farklı metabolik süreçlerin işlev gördüğü fazlardan oluşmakta ve her bir fazda enerji gereksinimleri farklı olduğundan, enerji üretiminden sorumlu olan mitokondri reaksiyonları da farklılık göstermektedir. Hücreler bir sorun ile karşılaştıklarında, önce DNA’da oluşan hasarlarını hücre döngüsünü G2 fazında tutuklayarak DNA tamir mekanizmaları ile tamir etmekte, çevresel faktörlerin iyi olmaması durumunda ise hücre bölünmesini G1 fazında durdurarak şartların iyileşmesini beklemektedirler. Bu şekilde de mümkün olmuyorsa apoptotik yolla intihar etmekte ya da farklı programlı hücre ölümleri ile elimine edilmektedirler. Dolayısıyla, oksidatif stres ve hücre ölümüyle ilgili çalışmaların DNA analizleriyle de desteklenmesi son derece önemlidir. Bu nedenle K562 hücrelerine 48 saat süreyle artan derişimlerde (100-1000 µM) H2O2 uygulandıktan sonra hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler FACS analizleri ile belirlendi ve bu derişimlerde H2O2’nin hücre döngüsü fazlarındaki değişimi indüklediği görüldü. 100 µM H2O2 derişiminde hücre döngüsü fazlarında anlamlı bir değişiklik olmazken, 500 ve 1000 µ M H2O2 derişiminlerinde G1 fazındaki hücre popülasyonunun azaldığı belirlendi. G1 fazındaki azalmayı; 500 µM H2O2 derişiminde G2’deki artış izlerken, 1000 µM H2O2 derişiminde ise S fazındaki artış izlemektedir. 1000 µM’da S fazındaki bu akümülasyon hücre döngüsü inhibisyonunu 131 işaret etmektedir. Bu gruptaki hücreler apoptotik yolla ölüme gitmektedirler. Literatürde, farklı hücre soylarında aynı H2O2 derişimleri uygulanarak yapılan bir çalışmada221, hücre döngüsü fazlarındaki değişim bizim bulgularımızla örtüşmektedir. Hücrelere yalnız 1 µM β-karoten uygulandıktan sonra yapılan DNA analizlerinde ise, beklendiği gibi hücre döngüsü fazlarında herhangi bir değişikliğe rastlanmamıştır. K562 hücrelerine önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 (100-1000 µM) uygulandıktan sonra yapılan DNA analizleri; hücrelerin G2 fazında tutuklandığını (500 µM’da %55, 1000 µM’da %58 oranında artış), G1 ve S fazlarındaki hücre popülasyonunun azaldığını göstermektedir. Bu gruptaki hücrelerin ∆Ψm’nin değişmediği, hücreler ölüme gitmediği halde granülite ve büyüklüklerinin değiştiği, AnnV cevabının da pozitif çıktığını gösterdik. DNA analizlerinden elde edilen sonuçlar da bu bulgularımızı desteklemektedir. Bu gruptaki hücrelerin, DNA’da oluşan hasarı hücre döngüsünü G2 fazında tutuklayarak DNA tamir mekanizmaları ile tamir ettiklerini ve bu nedenle geri dönüşümsüz apoptotik sürece girmeden, H2 O2’nin neden olduğu oksidatif hasarın onarıldığını düşünmekteyiz. 100 µM H2O2 derişiminde ise bu grupta da anlamlı bir değişikliğe rastlanmadı. K562 hücrelerine yüksek derişimde (2-10 mM) H2O2 uygulanmadan önce 1 µM β-karoten uygulanarak yapılan DNA analizleri ise ilginç bir şekilde hücre döngüsü fazlarında herhangi bir değişikliğin olmadığını, kontrol grubu ile aynı hücre döngüsü profilinin ortaya çıktığını göstermektedir. Elde edilen bu veriler, bu gruptaki hücrelerin ölümünün hücre döngüsünden bağımsız olarak gerçekleştiğini göstermektedir. Farklı gruplardaki hücrelerin farklı metabolik süreçlerden geçtiği görülmektedir. Literatürde, oksidatif stresle indüklenen hücre ölümünün, hücre döngüsü bağımlı veya bağımsız yolla gerçekleşebileceğini gösteren çalışmalar bulunmaktadır222, bu da bizim bulgularımızı desteklemektedir. Ayrıca, önce β-karoten sonra yüksek derişimde H2 O2 uygulanan hücrelerin ∆Ψm analizi, yapısal görüntüleri ve DNA analizlerinden elde edilen sonuçlar, bu gruptaki hücrelerin apoptoz dışında farklı bir ölüm sürecinden geçtiğini göstermektedir. Đnsan kanserlerinin yarısından fazlasında hücre ölümü yolaklarında rol alan genlerden bir veya birkaçında mutasyon izlenmektedir. Bu yolakların çalışılması ve farklı hücre ölüm şekillerinin belirlenmesi, özellikle kanserli hastaların prognozunu saptamada, tedavi yanıtını izlemede ve yeni tedavi hedeflerini bulma açısından büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada antioksidan-oksidan etkileşimlerinin oksidatif stres ve farklı hücre ölüm süreçlerine etkisi farklı kanser hücre soyları üzerinden gösterildi. Özetle, K562 ve 132 MCF-7 kanser hücrelerinde hidrojen peroksit ile indüklenen oksidatif stres arttıkça hücre canlılıklarının azaldığı; K562 hücrelerinin oksidatif strese karşı MCF-7 hücrelerinden daha dirençli olduğu gösterildi. K562 hücrelerinde H2O2 ile indüklenen oksidatif stres etkisiyle hücrelerin apoptotik yolla ölüme gittiği gösterildi. Hücrelere farklı derişimlerde uygulanan β-karotenin tek başına her iki hücre soyunda da kullanılan dozlar ve incelenen parametreler açısından herhangi bir değişikliğe neden olmadığı gösterildi. β-karotenin, K562 hücrelerinde H2O2 ile farklı şekillerde etkileşime sokulduğunda ise uygulama şekline ve zamana bağlı olarak, antioksidan veya oksidan olarak etkili olduğu gösterildi. Hücrelere oksidanlarla birlikte verildiğinde sitotoksik etkiyi arttırdığı; oksidanlardan önce uygulandığında ise oksidatif hasarı azalttığı ya da önlediği gösterildi. K562 hücrelerine hidrojen peroksitten önce uygulanan 1 µM β-karoten antioksidan olarak etki gösterirken, oksidatif strese daha duyarlı olan MCF-7 hücrelerinde ise ancak 2 µM derişimde antioksidan olarak etkili olduğu gösterildi. K562 hücrelerine 1 µM β-karoten uygulandıktan sonra 1000 µ M’dan daha yüksek derişimlerde H2O2 uygulanarak oksidatif stres arttırıldığında ise hücrelerin apoptoz dışında farklı bir programlanmış hücre ölüm sürecine girdiği ve bu ölüm şeklinin hücre döngüsü fazlarından bağımsız olarak gerçekleştiği gösterildi. Elde edilen tüm bu bulgular, sadece kanser değil oksidatif stresin neden olduğu birçok hastalığın tanı ve tedavisine yönelik çalışmalara katkı sağlayacaktır. Bugün birçok hastalığın hücre ölümü ya da yaşamı ile ilgili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle apoptotik sürece müdahale ederek yeniden düzenlenmesi, önemli tedavi yöntemlerini gündeme getirmektedir. Ayrıca apoptoz dışında farklı hücre ölüm şekillerinin belirlenmesi ve bunların mekanizmalarının anlaşılması da birçok hastalığa karşı tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır. Günümüzde kanser tedavisinde hücreleri genellikle apoptoz yoluyla ölüme götürmek için radyoterapi ve kemoterapiden sıklıkla yararlanılmaktadır. Fakat bu yöntemler normal hücrelerde de apoptozu başlatabilmekte ve birçok olumsuz yan etkiye neden olabilmektedirler. Bu nedenle antioksidan-oksidan etkileşim mekanizmalarının anlaşılması geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. ve antioksidan tedavi yöntemlerinin 133 KAYNAKLAR 1. Matés JM, Sánchez-Jiménez FM. Role of reactive oxygen species in apoptosis: implications for cancer therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2000;32:157-170. 2. Ambs S, Hussain SP, Marrogi AJ, Harris CC. Cancer-prone oxyradical overload disease. IARC Sci Publ. 1999:295-302. 3. Lee JM, Bernstein A. Apoptosis, cancer and the p53 tumour suppressor gene. Cancer Metastasis Rev. 1995;14:149-161. 4. Suzuki YJ, Forman HJ, Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction. Free Radic Biol Med. 1997;22:269-285. 5. Al-Omar MA., Beedham C., Alsarra IA. Pathological roles of reactive oxygen species and their defence mechanisms. Saudi Pharm J. 2004;12:1-18. 6. Alles a, Alley K, Barrett JC, et al. Apoptosis: a general comment. FASEB J. 1991;5:2127-2128. 7. Hoye AT, Davoren JE, Wipf P, Fink MP, Kagan VE. Targeting mitochondria. Acc Chem Res. 2008;41:87-97. 8. Sun K-H, de Pablo Y, Vincent F, Shah K. Deregulated Cdk5 promotes oxidative stress and mitochondrial dysfunction. J Neurochem. 2008;107:265-278. 9. Tosun Đ, Karadeniz B. Çay ve çay fenoliklerinin antioksidan aktivitesi. Zir Fak Derg. 2005;20:78-83. 10. Burton GW. Antioxidant action of carotenoids. J Nutr. 1989;119:109-111. 11. Prakash P, Russell RM, Krinsky NI. In Vitro Inhibition of Proliferation of Estrogen-Dependent and Estrogen-Independent Human Breast Cancer Cells Treated with Carotenoids or Retinoids. J Nutr. 2001;131:1574-1580. 12. Palozza P. Induction of cell cycle arrest and apoptosis in human colon adenocarcinoma cell lines by beta-carotene through down-regulation of cyclin A and Bcl-2 family proteins. Carcinogenesis. 2002;23:11-18. 13. Chen QM, Liu J, Merrett JB. Apoptosis or senescence-like growth arrest: influence of cell-cycle position, p53, p21 and bax in H2O2 response of normal human fibroblasts. Biochem J. 2000;347:543-551. 14. Gutteridge JMC. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin Chem. 1995;41:1819-1828. 134 15. Toyokuni S, Akatsuka S. Pathological investigation of oxidative stress in the post-genomic era. Pathol Int. 2007;57:461-473. 16. Halliwell B. Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem J. 2007;401:1-11. 17. Halliwell B. The wanderings of a free radical. Free Radic Biol Med. 2009;46:531-542. 18. Dröge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 2002;82:47-95. 19. Thannickal VJ, Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000;279:L1005-L1028. 20. Mercan U. Toksikolojide Serbest Radikallerin Önemi. 2004;15:91-96. 21. Adali M, Inal-Erden M, Akalin A, Efe B. Effects of propylthiouracil, propranolol, and vitamin E on lipid peroxidation and antioxidant status in hyperthyroid patients. Clin Biochem. 1999;32:363-367. 22. Cherubini A, Ruggiero C, Polidori MC, Mecocci P. Potential markers of oxidative stress in stroke. Free Radic Biol Med. 2005;39:841-852. 23. Altınışık M. Serbest oksijen radikalleri ve antioksidanlar. www.mustafaaltinisik.org.uk/21-adsem-01.pdf. May 28, 2007. 24. Singal PK, Khaper N, Palace V, Kumar D. The role of oxidative stress in the genesis of heart disease. Cardiovasc Res. 1998;40:426-432. 25. Fleury C, Mignotte B, Vayssière J-L. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie. 2002;84:131-141. 26. Kannan K, Jain S. Oxidative stress and apoptosis. Pathophysiology. 2000;7:153163. 27. Maxwell SR. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs. 1995;49:345361. 28. Behl C. Vitamin E protects neurons against oxidative cell death in vitro more effectively than 17-beta estradiol and induces the activity of the transcription factor NF-kappaB. J Neural Transm. 2000;107:393-407. 29. Hill MF, Singal PK. Antioxidant and oxidative stress changes during heart failure subsequent to myocardial infarction in rats. Am J Pathol. 1996;148:291-300. 30. Giordano FJ. Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure. J Clin Invest. 2005;115:500-508. 135 31. Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:7915-7922. 32. Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 1993;262:689-695. 33. Halliwell B. Cellular stress and protection mechanisms. Biochem Soc Transac. 1996;24:78-83. 34. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem. 1999;64:555-559. 35. O’Neill ME, Thurnham DI. Intestinal Absorption of Beta-Carotene, Lycopene and Lutein in Men and Women Following a Standard Meal: Response Curves in the Triacylglycerol-Rich Lipoprotein Fraction.; 1998. 36. Young JF, Nielsen SE, Haraldsdóttir J, et al. Effect of fruit juice intake on urinary quercetin excretion and biomarkers of antioxidative status. Am J Clin Nutr. 1999;69:87-94. 37. Scambia G, Ranelletti FO, Benedetti Panici P, et al. Synergistic antiproliferative activity of quercetin and cisplatin on ovarian cancer cell growth. Anticancer Drugs. 1990;1:45-48. 38. Sanz MJ, Ferrandiz ML, Cejudo M, et al. Influence of a series of natural flavonoids on free radical generating systems and oxidative stress. Xenobiotica. 1994;24:689-699. 39. Prasad K, Laxdal VA, Yu M, Raney BL. Antioxidant activity of allicin, an active principle in garlic. Mol Cell Biochem. 1995;148:183-189. 40. Lotito SB, Fraga CG. (+)-Catechin prevents human plasma oxidation. Free Radic Biol Med. 1998;24:435-441. 41. Brown JE, Rice-Evans CA. Luteolin-rich artichoke extract protects low density lipoprotein from oxidation in vitro. Free Radic Res. 1998;29:247-255. 42. Jang DS, Kang BS, Ryu SY, Chang IM, Min KR, Kim Y. Inhibitory effects of resveratrol analogs on unopsonized zymosan-induced oxygen radical production. Biochem Pharmacol. 1999;57:705-712. 43. Barceló S, Macé K, Pfeifer AMA, Chipman JK. Production of DNA strand breaks by N-nitrosodimethylamine and 2-amino- 3-methylimidazo[4,5f]quinoline in THLE cells expressing human CYP isoenzymes and inhibition by sulforaphane. In: Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis.Vol 402.; 1998:111-120. 136 44. Lopaczynski W, Zeisel SH. Antioxidants, programmed cell death, and cancer. Nutr Res. 2001;21:295-307. 45. Evelson P, Ordónez CP, Llesuy S, Boveris A. Oxidative stress and in vivo chemiluminescence in mouse skin exposed to UVA radiation. J Photochem Photobiol B Biol. 1997;38:215-219. 46. Cooke MS, Evans MD, Dizdaroglu M, Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 2003;17:1195-1214. 47. Van Der Meulen JH, McArdle A, Jackson MJ, Faulkner JA. Contraction-induced injury to the extensor digitorum longus muscles of rats: the role of vitamin E. J Appl Physiol. 1997;83:817-823. 48. Packer L. Protective role of vitamin E in biological systems. Am J Clin Nutr. 1991;53:1050S - 1055S. 49. Stratton S, DC L. Determination of singlet oxygen-specific versus radicalmediated lipid peroxidation in photosensitized oxidation of lipid bilayers: Effect of beta-carotene and alpha-tocopherol. Biochemistry. 1997;36:12911-12920. 50. Prasad KN, Kumar A, Kochupillai V, Cole WC. High doses of multiple antioxidant vitamins: essential ingredients in improving the efficacy of standard cancer therapy. J Am Coll Nutr. 1999;18:13-25. 51. Hanukoglu I. Antioxidant protective mechanisms against reactive oxygen species (ROS) generated by mitochondrial P450 systems in steroidogenic cells. Drug Metab Rev. 2006;38:171-196. 52. Paiva SA, Russell RM. Beta-carotene and other carotenoids as antioxidants. J Am Coll Nutr. 1999;18:426-433. 53. Gerster H. The potential role of lycopene for human health. J Am Coll Nutr. 1997;16:109-126. 54. Bendich A. Biological functions of dietary carotenoids. Ann N Y Acad Sci. 1993;691:61-67. 55. Stahl W, Sies H. Lycopene: a biologically important carotenoid for humans? Arch Biochem Biophys. 1996;336:1-9. 56. Aras K, Erşen G, Karahan S. Tıbbi Biyokimya. Ankara: Ankara Üniversitesi Basımevi; 1976. 57. Di Mascio P, Murphy ME, Sies H. Antioxidant defense systems: The role of carotenoids, tocopherols, and thiols. In: American Journal of Clinical Nutrition.Vol 53.; 1991. 137 58. Divisi D, Di Tommaso S, Salvemini S, Garramone M, Crisci R. Diet and cancer. Acta Biomed. 2006;77:118-123. 59. Larsson SC, Bergkvist L, Näslund I, Rutegård J, Wolk A. Vitamin A, retinol, and carotenoids and the risk of gastric cancer: a prospective cohort study. Am J Clin Nutr. 2007;85:497-503. 60. Mayne ST. Beta-carotene, carotenoids, and disease prevention in humans. FASEB J. 1996;10:690-701. 61. Nagata Y, Sonoda T, Mori M, et al. Dietary isoflavones may protect against prostate cancer in Japanese men. J Nutr. 2007;137:1974-1979. 62. Touillaud MS, Thiébaut ACM, Fournier A, Niravong M, Boutron-Ruault MC, Clavel-Chapelon F. Dietary lignan intake and postmenopausal breast cancer risk by estrogen and progesterone receptor status. J Natl Cancer Inst. 2007;99:475486. 63. Weinstein SJ, Wright ME, Lawson KA, et al. Serum and Dietary Vitamin E in Relation to Prostate Cancer Risk.; 2007. 64. Pfahl M. Retinoid related molecules: new promises against lung and breast cancer. Expert Opin Investig Drugs. 1998;7:601-606. 65. Palozza P. Can beta-carotene regulate cell growth by a redox mechanism? An answer from cultured cells. Biochim Biophys Acta. 2005;1740:215-221. 66. Ziegler RG, Mayne ST, Swanson CA. Nutrition and lung cancer. Cancer Causes Control. 1996;7:157-177. 67. Krinsky NI. Actions of carotenoids in biological systems. Annu Rev Nutr. 1993;13:561-587. 68. Group. TA-TBCCPS. The effect of vitamin E and beta carotene on the incidence of lung cancer and other cancers in male smokers. N Engl J Med. 1994;330:10291035. 69. Omenn GS, Goodman GE, Thornquist MD, et al. Effects of a combination of beta carotene and vitamin A on lung cancer and cardiovascular disease. N Engl J Med. 1996;334:1150-1155. 70. Palozza P, Krinsky NI. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro: an overview. Methods Enzymol. 1992;213:403-420. 71. Sies H, Stahl W. Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids as antioxidants. Am J Clin Nutr. 1995;62:1315S - 1321S. 72. Burton GW, Ingold KU. beta-Carotene: an unusual type of lipid antioxidant. Science. 1984;224:569-573. 138 73. Palozza P. Prooxidant actions of carotenoids in biologic systems. Nutr Rev. 1998;56:257-265. 74. Jacobson MD. Reactive oxygen species and programmed cell death. Trends Biochem Sci. 1996;21:83-86. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8882579. April 13, 2015. 75. K. Ashfaq, Hina S. Zuberi, M. Anwar M. Vitamin E and β-carotene affect natural killer cell function. Int J Food Sci Nutr. 2000;51:S13-S20. 76. Peto R, Doll R, Buckley JD, Sporn MB. Can dietary beta-carotene materially reduce human cancer rates? Nature. 1981;290:201-208. 77. Ziegler RG. A review of epidemiologic evidence that carotenoids reduce the risk of cancer. J Nutr. 1989;119:116-122. 78. Prabhala RH, Garewal HS, Hicks MJ, Sampliner RE, Watson RR. The effects of 13-cis-retinoic acid and beta-carotene on cellular immunity in humans. Cancer. 1991;67:1556-1560. 79. Ringer T V., DeLoof MJ, Winterrowd GE, et al. Beta-carotene’s effects on serum lipoproteins and immunologic indices in humans. Am J Clin Nutr. 1991;53:688694. 80. Van Poppel G, Spanhaak S, Ockhuizen T. Effect of Beta-Carotene on Immunological Indexes in Healthy Male Smokers.; 1993. 81. Giovannucci E, Stampfer MJ, Colditz G, Rimm EB, Willett WC. Relationship of diet to risk of colorectal adenoma in men. J Natl Cancer Inst. 1992;84:91-98. 82. Giovannucci E. Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the epidemiologic literature. J Natl Cancer Inst. 1999;91:317-331. 83. Cahill RJ, O’Sullivan KR, Mathias PM, Beattie S, Hamilton H, O’Morain C. Effects of vitamin antioxidant supplementation on cell kinetics of patients with adenomatous polyps. Gut. 1993;34:963-967. 84. Phillips RW, Kikendall JW, Luk GD, et al. beta-Carotene inhibits rectal mucosal ornithine decarboxylase activity in colon cancer patients. Cancer Res. 1993;53:3723-3725. 85. Tang G, Shiau A, Russell RM, Mobarhan S. Serum Retinoic Acid Levels in Patients with Resected Benign and Malignant Colonic Neoplasias on BetaCarotene Supplementation.; 1995. 86. Conklin KA. Dietary antioxidants during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects. Nutr Cancer. 2000;37:1-18. 139 87. Temple NJ, Basu TK. Protective effect of beta-carotene against colon tumors in mice. J Natl Cancer Inst. 1987;78:1211-1214. 88. Alabaster O, Tang Z, Frost A, Shivapurkar N. Effect of beta-carotene and wheat bran fiber on colonic aberrant crypt and tumor formation in rats exposed to azoxymethane and high dietary fat. Carcinogenesis. 1995;16:127-132. 89. Tanaka T, Kawamori T, Ohnishi M, et al. Suppression of azoxymethane-induced rat colon carcinogenesis by dietary administration of naturally occurring xanthophylls astaxanthin and canthaxanthin during the postinitiation phase. Carcinogenesis. 1995;16:2957-2963. 90. Kim JM, Araki S, Kim DJ, et al. Chemopreventive effects of carotenoids and curcumins on mouse colon carcinogenesis after 1,2-dimethylhydrazine initiation. Carcinogenesis. 1998;19:81-85. 91. Iftikhar S, Lietz H, Mobarhan S, Frommel TO. In vitro beta-carotene toxicity for human colon cancer cells. Nutr Cancer. 1996;25:221-230. 92. Palozza P, Maggiano N, Calviello G, et al. Canthaxanthin induces apoptosis in human cancer cell lines. Carcinogenesis. 1998;19:373-376. 93. Palozza P, Calviello G, Maggiano N, Lanza P, Ranelletti FO, Bartoli GM. Betacarotene antagonizes the effects of eicosapentaenoic acid on cell growth and lipid peroxidation in WiDr adenocarcinoma cells. Free Radic Biol Med. 2000;28:228234. 94. Palozza P, Calviello G, Serini S, et al. β-Carotene at high concentrations induces apoptosis by enhancing oxy-radical production in human adenocarcinoma cells. Free Radic Biol Med. 2001;30:1000-1007. 95. Hazuka MB, Edwards-Prasad J, Newman F, Kinzie JJ, Prasad KN. Beta-carotene induces morphological differentiation and decreases adenylate cyclase activity in melanoma cells in culture. J Am Coll Nutr. 1990;9:143-149. 96. Williams AW, Boileau TW, Zhou JR, Clinton SK, Erdman JW. Beta-carotene modulates human prostate cancer cell growth and may undergo intracellular metabolism to retinol. J Nutr. 2000;130:728-732. 97. Schwartz J, Shklar G. The selective cytotoxic effect of carotenoids and alphatocopherol on human cancer cell lines in vitro. J Oral Maxillofac Surg. 1992;50:364-367. 98. Wei RR, Wamer WG, Lambert LA, Kornhauser A. beta-Carotene uptake and effects on intracellular levels of retinol in vitro. Nutr Cancer. 1998;30:53-58. 99. Kane DJ, Sarafian TA, Anton R, et al. Bcl-2 inhibition of neural death: decreased generation of reactive oxygen species. Science. 1993;262:1274-1277. 140 100. Güneş HV. Moleküler Hücre Biyolojisi. Eskişehir: Kaan Kitabevi; 2006. 101. Kroemer G, Galluzzi L, Vandenabeele P, et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 2009;16:3-11. 102. Melino G. The Sirens’ song. Nature. 2001;412:23. 103. Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11:700-714. 104. Christofferson DE, Yuan J. Necroptosis as an alternative form of programmed cell death. Curr Opin Cell Biol. 2010;22:263-268. 105. Lippens S, Hoste E, Vandenabeele P, Agostinis P, Declercq W. Cell death in the skin. Apoptosis. 2009;14:549-569. 106. Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:328-340. 107. Lippens S, Denecker G, Ovaere P, Vandenabeele P, Declercq W. Death penalty for keratinocytes: apoptosis versus cornification. Cell Death Differ. 2005;12 Suppl 2:1497-1508. 108. Counis MF, Chaudun E, Arruti C, et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 1998;5:251-261. 109. Testa U. Apoptotic mechanisms in the control of erythropoiesis. Leuk Off J Leuk Soc Am Leuk Res Fund, UK. 2004;18:1176-1199. 110. Garrido C, Kroemer G. Life’s smile, death's grin: Vital functions of apoptosisexecuting proteins. Curr Opin Cell Biol. 2004;16:639-646. 111. Galluzzi L, Joza N, Tasdemir E, et al. No death without life: vital functions of apoptotic effectors. Cell Death Differ. 2008;15:1113-1123. 112. Weber GF, Menko AS. The canonical intrinsic mitochondrial death pathway has a non-apoptotic role in signaling lens cell differentiation. J Biol Chem. 2005;280:22135-22145. 113. Yan Q, Liu JP, Wan-Cheng Li D. Apoptosis in lens development and pathology. Differentiation. 2006;74:195-211. 114. Lang KS, Lang PA, Bauer C, et al. Mechanisms of suicidal erythrocyte death. Cell Physiol Biochem. 2005;15:195-202. 141 115. Remijsen Q, Kuijpers TW, Wirawan E, Lippens S, Vandenabeele P, Vanden Berghe T. Dying for a cause: NETosis, mechanisms behind an antimicrobial cell death modality. Cell Death Differ. 2011;18:581-588. 116. Piacentini M, Fesus L, Farrace MG, Ghibelli L, Piredda L, Melino G. The expression of “tissue” transglutaminase in two human cancer cell lines is related with the programmed cell death (apoptosis). Eur J Cell Biol. 1991;54:246-254. 117. Mantovani A, Cassatella M a, Costantini C, Jaillon S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 2011;11:519-531. 118. Roninson IB, Broude E V, Chang BD. If not apoptosis, then what? Treatmentinduced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug Resist Updat. 2001;4:303-313. 119. Castedo M, Perfettini J-L, Roumier T, Andreau K, Medema R, Kroemer G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene. 2004;23:28252837. 120. Okada H, Mak TW. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nat Rev Cancer. 2004;4:592-603. 121. Vakifahmetoglu H, Olsson M, Zhivotovsky B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 2008;15:1153-1162. 122. Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 2012;19:107-120. 123. Gilmore AP. Anoikis. Cell Death Differ. 2005;12:1473-1477. 124. Vural F, Cebesoy S, Karakaş M. Classification of cell death. 2013;1:120-126. 125. Raff MC, Whitmore A V, Finn JT. Axonal self-destruction and neurodegeneration. Science. 2002;296:868-871. 126. Sperandio S, de Belle I, Bredesen DE. An alternative, nonapoptotic form of programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:14376-14381. 127. Sperandio S, Poksay K, de Belle I, et al. Paraptosis: mediation by MAP kinases and inhibition by AIP-1/Alix. Cell Death Differ. 2004;11:1066-1075. 128. Brennan MA, Cookson BT. Salmonella induces macrophage death by caspase-1dependent necrosis. Mol Microbiol. 2000;38:31-40. 129. Martinon F, Tschopp J. Inflammatory caspases and inflammasomes: master switches of inflammation. Cell Death Differ. 2007;14:10-22. 142 130. Fink SL, Cookson BT. Pyroptosis and host cell death responses during Salmonella infection. Cell Microbiol. 2007;9:2562-2570. 131. Labbé K, Saleh M. Cell death in the host response to infection. Cell Death Differ. 2008;15:1339-1349. 132. Mormone E, Matarrese P, Tinari A, et al. Genotype-dependent priming to selfand xeno-cannibalism in heterozygous and homozygous lymphoblasts from patients with Huntington’s disease. J Neurochem. 2006;98:1090-1099. 133. Overholtzer M, Mailleux AA, Mouneimne G, et al. A Nonapoptotic Cell Death Process, Entosis, that Occurs by Cell-in-Cell Invasion. Cell. 2007;131:966-979. 134. Yuan J, Kroemer G. Alternative cell death mechanisms in development and beyond. Genes Dev. 2010;24:2592-2602. 135. Doukoumetzidis K, Hengartner MO. Cell biology: dying to hold you. Nature. 2008;451:530-531. 136. Kerr J. F. R., Wyllie A. H. C a. R. Apoptosis : a Basic Biological Phenomenon With Wide-. Br J Cancer. 1972;26:239-257. 137. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007;35:495-516. 138. Thompson CB. Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment of Disease. Science (80- ). 1995;267:1456-1462. 139. Vaux DL, Flavell RA. Apoptosis genes and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 2000;12:719-724. 140. Thompson EB. Apoptosis and steroid hormones. Mol Endocrinol. 1994;8:665673. 141. Akşit H, Bildik A. Apoptozis. YYÜ Vet Fak Derg. 2008;19:55-63. 142. Erdoğan BB, Uzaslan EK. Apoptozis Mekanizmaları: Tümör Gelişiminde FasFasL Bağımlı Apoptozis. Turkiye Klin Arch Lung. 2003;4:165-174. 143. Hikim AP, Wang C, Leung A, Swerdloff RS. Involvement of apoptosis in the induction of germ cell degeneration in adult rats after gonadotropin-releasing hormone antagonist treatment. Endocrinology. 1995;136:2770-2775. 144. McPhie DL, Coopersmith R, Hines-Peralta A, et al. DNA synthesis and neuronal apoptosis caused by familial Alzheimer disease mutants of the amyloid precursor protein are mediated by the p21 activated kinase PAK3. J Neurosci. 2003;23:6914-6927. 143 145. Kerr JF, Winterford CM, Harmon B V. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer. 1994;73:2013-2026. 146. Rashed MM, Ragab NM, Haematol TJ. The pattern of expression of the apoptotic inducer Fas and the apoptotic inhibitor bcl-2 oncogenes immunohistochemicaly in bone-marrow invaded by the non-Hodgkin lymphomas. 2004:141-147. 147. Estaquier J, Idziorek T, de Bels F, et al. Programmed cell death and AIDS: significance of T-cell apoptosis in pathogenic and nonpathogenic primate lentiviral infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9431-9435. 148. Roshal M, Zhu Y, Planelles V. Apoptosis in AIDS. Apoptosis. 2001;6:103-116. 149. Staley K, Blaschke AJ, Chun J. Apoptotic DNA fragmentation is detected by a semi-quantitative ligation-mediated PCR of blunt DNA ends. Cell Death Differ. 1997;4:66-75. 150. Cohen JJ. Programmed cell death and apoptosis in lymphocyte development and function. Chest. 1993;103:99S - 101S. 151. Squìer MK, Miller AC, Malkinson AM, Cohen JJ. Calpain activation in apoptosis. J Cell Physiol. 1994;159:229-237. 152. Mountz J, Zhou T. Apoptosis and autoimmunology. In: Koopman WJ, ed. Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. 14th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001. 153. Pınarbaşı E. Apoptozis (Programlı Hücre Ölümü). In: Yıldırım A, Bardakçı F, Karataş M, Tanyolaç B, eds. Moleküler Biyoloji. Ankara: Nobel Yayın; 2007:423-468. 154. Trump BF, Berezesky IK, Chang SH, Phelps PC. The pathways of cell death: oncosis, apoptosis, and necrosis. Toxicol Pathol. 25:82-88. 155. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovasc Res. 2000;45:528-537. 156. Bortner CD, Oldenburg BEN, Cidlowski JA, Oldenburg NBE. The role of DNA fragmentation in apoptosis. Trends Cell Biol. 1995;5:21-26. 157. Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet. 1993;341:1251-1254. 158. Final stage of apoptosis. 2015. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/apoptosismacrophage. 159. Öktem S, Özhan MH, Özol D. Apoptozisin Önemi. Toraks Derg. 2001;2:91-95. 160. Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell. 1997;88:355-365. 144 161. Kaneda K, Kashii S, Kurosawa T, et al. Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transient ischemia of the rat retina. Brain Res. 1999;815:11-20. 162. TOMATIR AG. Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü. Türkiye Klin Tıp Bilim Derg. 2003;23:499-508. 163. Droin N, Cathelin S, Jacquel A, et al. A role for caspases in the differentiation of erythroid cells and macrophages. Biochimie. 2008;90:416-422. 164. Lamkanfi M, Festjens N, Declercq W, Vanden Berghe T, Vandenabeele P. Caspases in cell survival, proliferation and differentiation. Cell Death Differ. 2007;14:44-55. 165. Nhan TQ, Liles WC, Schwartz SM. Physiological functions of caspases beyond cell death. Am J Pathol. 2006;169:729-737. 166. Heath-Engel HM, Shore GC. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 2006;1763:549-560. 167. Kim R, Emi M, Tanabe K, Murakami S, Uchida Y, Arihiro K. Regulation and interplay of apoptotic and non-apoptotic cell death. J Pathol. 2006;208:319-326. 168. Kumar S. Mechanisms mediating caspase activation in cell death. Cell Death Differ. 1999;6:1060-1066. 169. Salvesen GS. Caspases and apoptosis. Essays Biochem. 2002;38:9-19. 170. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science. 1998;281:1309-1312. 171. Yıldırım A, Fevzi B, Karataş M, Tanyolaç B, eds. Moleküler Biyoloji. 1st ed. Ankara: Nobel Yayın; 2007. 172. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000;407:770-776. 173. Lüleyap HÜ. Moleküler Genetiğin Esasları. 1st ed. Adana: Nobel Kitabevi; 2008. 174. Golstein P, Kroemer G. Cell death by necrosis: towards a molecular definition. Trends Biochem Sci. 2007;32:37-43. 175. Festjens N, Vanden Berghe T, Vandenabeele P. Necrosis, a well-orchestrated form of cell demise: Signalling cascades, important mediators and concomitant immune response. Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2006;1757:1371-1387. 176. Arslan DÖ, Korkmaz G, Gözüaçık D. Otofaji: Bir Hücresel Stres Yanıtı ve Ölüm Mekanizması. 2011. 145 177. Ohsumi Y. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:211-216. 178. Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a double-edged sword. Science. 2004;306:990-995. 179. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 2008;451:1069-1075. 180. Yang Z, Klionsky DJ. Eaten alive: a history of macroautophagy. Nat Cell Biol. 2010;12:814-822. 181. Xie Z, Klionsky DJ. Autophagosome formation: core machinery and adaptations. Nat Cell Biol. 2007;9:1102-1109. 182. Gozuacik D, Kimchi A. Autophagy and cell death. Curr Top Dev Biol. 2007;78:217-245. 183. Levine B, Yuan J. Autophagy in cell death: An innocent convict? J Clin Invest. 2005;115:2679-2688. 184. Kroemer G, Mariño G, Levine B. Autophagy and the Integrated Stress Response. Mol Cell. 2010;40:280-293. 185. Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, Codogno P. Overview of macroautophagy regulation in mammalian cells. Cell Res. 2010;20:748-762. 186. Wirawan E, Berghe T Vanden, Lippens S, Agostinis P, Vandenabeele P. Autophagy: for better or for worse. Cell Res. 2012;22:43-61. 187. Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon H-U, Kimchi A. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Differ. 2009;16:966-975. 188. Karantza-Wadsworth V, Patel S, Kravchuk O, et al. Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis. Genes Dev. 2007;21:1621-1635. 189. Mathew R, Kongara S, Beaudoin B, et al. Autophagy suppresses tumor progression by limiting chromosomal instability. Genes Dev. 2007;21:13671381. 190. Qu X, Zou Z, Sun Q, et al. Autophagy Gene-Dependent Clearance of Apoptotic Cells during Embryonic Development. Cell. 2007;128:931-946. 191. Bermek E, Nurten R, Tiryaki D, Gökçe S. Biyofizik Ders Notları (in Turkish). Đstanbul: Đstanbul Tıp Fakültesi Yayınevi; 1997. 146 192. Lozzio CB, Lozzio BB. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with positive Philadelphia chromosome. Blood. 1975;45:321-334. 193. Klein E, Ben-Bassat H, Neumann H, et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J cancer. 1976;18:421431. 194. Koeffler HP, Golde DW. Human myeloid leukemia cell lines: a review. Blood. 1980;56:344-350. 195. Nakajima O, Hashimoto Y, Iwasaki S. Enhancement by retinoid of hemininduced differentiation of human leukemia K562 cell line. FEBS Lett. 1993;330:81-84. 196. ANDERSSON LC, JOKINEN M, GAHMBERG CG. Induction of erythroid differentiation in the human leukaemia cell line K562. Nature. 1979;278:364365. 197. Davis MG, Kawai Y, Arinze IJ. Involvement of Gialpha2 in sodium butyrateinduced erythroblastic differentiation of K562 cells. Biochem J. 2000;346 Pt 2:455-461. 198. LOWRY OH, ROSEBROUGH NJ, FARR AL, RANDALL RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193:265-275. 199. Singhal SS, Awasthi S, Pandya U, et al. The effect of curcumin on glutathionelinked enzymes in K562 human leukemia cells. Toxicol Lett. 1999;109:87-95. 200. Saydam G, Aydin HH, Sahin F, et al. Involvement of protein phosphatase 2A in interferon-alpha-2b-induced apoptosis in K562 human chronic myelogenous leukaemia cells. Leuk Res. 2003;27:709-717. 201. Şencan S, Onaran Đ, Demirtaş H. Warfarin’in sitotoksik etkisinin K562 lösemik hücre soyunda çalışılması. 2007;16:11-16. 202. Soule HD, Vazguez J, Long A, Albert S, Brennan M. A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst. 1973;51:1409-1416. 203. Sun J, Hai Liu R. Cranberry phytochemical extracts induce cell cycle arrest and apoptosis in human MCF-7 breast cancer cells. Cancer Lett. 2006;241:124-134. 204. Lowe SW, Lin AW. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 2000;21:485-495. 205. Parton M. Studies of apoptosis in breast cancer. BMJ. 2001;322:1528-1532. 206. Yu Z, Zhang L, Wu D, Liu F. Anti-apoptotic action of zearalenone in MCF-7 cells. Ecotoxicol Environ Saf. 2005;62:441-446. 147 207. Dilsiz N. Hücre ve hücre döngüsü. In: Moleküler Biyoloji. Ankara: Palme Yayıncılık; 2004:111-113. 208. Caspari T. Checkpoints: How to activate p53. Curr Biol. 2000;10. 209. Prives C, Hall PA. The p53 pathway. J Pathol. 1999;187:112-126. 210. Niida H, Nakanishi M. DNA damage checkpoints in mammals. Mutagenesis. 2006;21:3-9. 211. Nojima H. Cell cycle checkpoints, chromosome stability and the progression of cancer. Hum cell Off J Hum Cell Res Soc. 1997;10:221-230. 212. Hartwell L, Weinert T, Kadyk L, Garvik B. Cell cycle checkpoints, genomic integrity, and cancer. In: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology.Vol 59.; 1994:259-263. 213. Çoğulu Ö, Alpman A, Durmaz B, Özkınay F. Mitoz ve Mayozun Moleküler Temelleri. Türkiye Klin Tıp Bilim Derg. 2007;27:725-737. 214. Fei P, El-Deiry WS. P53 and radiation responses. Oncogene. 2003;22:5774-5783. 215. Gatti R, Belletti S, Orlandini G, Bussolati O, Dall’Asta V, Gazzola GC. Comparison of annexin V and calcein-AM as early vital markers of apoptosis in adherent cells by confocal laser microscopy. J Histochem Cytochem. 1998;46:895-900. 216. Koopman G, Reutelingsperger CPM, Kuijten GAM, Keehmen RMJ, Pais ST, van Oers MHJ. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood1. 1994;84:1415-1420. 217. Zhang G, Gurtu V, Kain SR, Yan G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 1997;23:525-531. 218. Tesarik J, Greco E, Cohen-Bacrie P, Mendoza C. Germ cell apoptosis in men with complete and incomplete spermiogenesis failure. Mol Hum Reprod. 1998;4:757-762. 219. Verrax J, Stockis J, Tison A, Taper HS, Calderon PB. Oxidative stress by ascorbate/menadione association kills K562 human chronic myelogenous leukaemia cells and inhibits its tumour growth in nude mice. Biochem Pharmacol. 2006;72:671-680. 220. Yurtcu E. Vinkristinin Uyardığı Apoptozis Üzerine β-Karoten ve Folik. Apoptosis. 2007;14:237-240. 221. Pizarro JG, Folch J, Vazquez De la Torre A, et al. Oxidative stress-induced DNA damage and cell cycle regulation in B65 dopaminergic cell line. Free Radic Res. 2009;43:985-994. 148 222. Langley B, Ratan RR. Oxidative stress-induced death in the nervous system: cell cycle dependent or independent? J Neurosci Res. 2004;77:621-629. 149 ÖZGEÇMĐŞ Kişisel Bilgiler Adı Doğ.Yeri Uyruğu Email Soyadı Doğ.Tar. TC Kim No Tel Sabiha Đstanbul/Bakırköy T.C. toks@istanbul.edu.tr Tok 15/12/1979 23447731900 0533 423 94 05 Eğitim Düzeyi Doktora Yük.Lis. Lisans Lise Mezun Olduğu Kurumun Adı Đstanbul Üniversitesi/Đstanbul Tıp Fakültesi/Biyofizik ABD Đstanbul Üniversitesi/ Đstanbul Tıp Fakültesi/Biyofizik ABD Işık Üniversitesi/Fen Edebiyat Fakültesi/Fizik Bölümü Ataköy Hasan Polatkan Süper Lisesi, Uğur Koleji Mez. Yılı 2015 2009 2005 1999 Đş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın) Görevi Kurum 1. Araştırma görevlisi Đstanbul Üniversitesi/ ĐTF / Biyofizik 2. Araştırma görevlisi 3. Işık Üniversitesi / Fizik Bölümü Yabancı Dilleri Đngilizce Okuduğunu Anlama* iyi Konuşma* Yazma* iyi iyi KPDS/ÜDS Puanı 62,5 Süre (Yıl - Yıl) 2006-devam etmekte 2005-2006 (Diğer) Puanı 67,5 *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin LES Puanı (Diğer) Sayısal 65,8 Eşit Ağırlık 65,2 Puanı Bilgisayar Bilgisi Program MS Office C Matlab Zemax Image J Kullanma becerisi iyi iyi iyi iyi iyi Sözel 65,7 150 Uluslararası Yayın ve Bildiriler 1. Handan Akcakaya, Fulya Dal, Sabiha Tok, Suzan-Adin Cinar and Rustem Nurten. K562 cells display different vulnerability to H2O2 induced oxidative stres in differing cell cycle phases. Cell Biol Int 9999, 1-9, 2015. 2. Tok S, Zengin A, Nurten A, Nurten R. The Effect of Diphtheria Toxin on Different Tissues of Guinea Pig and the Role of Antioxidants on this Effect. 2nd International Biophysics Congress and Biotechnology at GAP & 21st National Biophysics Congress Abstract Book, p.37, Diyarbakır (Turkey), 5-9 October, 2009. Ulusal Bildiriler 1. Tok S., Çınar S., Nurten R. MCF-7 hücrelerinde Hidrojen Peroksidin Oksidatif Etkisine Karşı β-Karotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi. 25.Ulusal Biyofizik Kongresi, Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bildiri Özet Kitabı, P-47, Trabzon, 24-27 Eylül, 2013. 2. Dal F., Akçakaya H., Tok S., Adın Çınar S., Nurten R. Oksidatif Stresin Hücre Döngüsü Fazları Üzerindeki Etkileri. 25.Ulusal Biyofizik Kongresi, Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bildiri Özet Kitabı, P-36, Trabzon, 24-27 Eylül, 2013. 3. Güven C., Tok S., Akçakaya H., Nurten R. NIH3T3 Fibroblast ve HUVEC Hücrelerine Uygulanan Streptozotosin ve Leptin’in Aktin Flamentlerine Etkisi. 24.Ulusal Biyofizik Kongresi, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, P-15, Đstanbul, 25-28 Eylül, 2012. 4. Fulya DAL, Handan AKÇAKAYA, Sabiha TOK, Suzan ADIN ÇINAR, Rüstem NURTEN. Eşfazlı K562 hücrelerinin elde edilmesinde mimozin ve genisteinin etkisi. 23.Ulusal Biyofizik Kongresi,Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, s-48, P-28, Edirne, 13-16 Eylül, 2011. 5. Tok S., Dal F., Akçakaya H., Adın-Çınar S., Nurten R. β-Karotenin K562 hücrelerindeki antioksidan etkisi. 22.Ulusal Biyofizik Kongresi, Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, s-53, P-58, Aydın, 28 Eylül-1 Ekim, 2010. 6. Akçakaya H., Tok S., Dal F., Adın-Çınar S., Nurten R. K562 hücrelerinde H2O2’nin oksidatif etkisinin belirlenmesi. 22.Ulusal Biyofizik Kongresi, Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, s-30, P-15, Aydın, 28 Eylül-1 Ekim, 2010. 7. Tok S, Zengin A, Nurten A, Nurten R. Kobay Sinir-Kas Kavşağında Difteri Toksini ve Antioksidanların Etkisi. 15th National Biomedical Engineering Meeting (BIYOMUT), IEEE XPLORE Conference Proceedings DOI:10.1109/BIYOMUT2010.5479768, Antalya, 21-24 Nisan, 2010. 151 Sözlü Sunum Tok S., Akçakaya H., Dal F., Adın-Çınar S., Nurten R. Antioksidan ve oksidan etkileşimlerinin K562 hücrelerinde farklı ölüm süreçlerine etkisi. 23.Ulusal Biyofizik Kongresi, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, s-15, Edirne, 13-16 Eylül, 2011. Ödüller Poster bildirisi 1. lik ödülü. 25.Ulusal Biyofizik Kongresi, 2013. Özel Đlgi Alanları (Hobileri): Yelken, sörf, kayak, buz pateni, müzik, go oynamak, bisiklete binmek, balık tutmak, şiir okumak-yazmak. Diğer Ödüller • Channel Regatta Rodos-Marmaris, 22-24 Haziran 2013 (2. lik ve 3. lük) • Su-Sail Match Race 2013 (2. lik)
