HASTANE KÖKENLĐ MDR-MRSA SUŞLARINDA PROTEĐN A
advertisement
T.C. ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ MĐKROBĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI HASTANE KÖKENLĐ MDR-MRSA SUŞLARINDA PROTEĐN A GENĐ (spa) DĐZĐ ANALĐZĐNĐN KLONAL ĐLĐŞKĐNĐN TESPĐTĐNDEKĐ ROLÜ TANER BOZKURT YÜKSEK LĐSANS TEZĐ TEZ DANIŞMANI Prof.Dr. Fatih KÖKSAL ADANA–2009 T.C. ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTÜTÜSÜ MĐKROBĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI HASTANE KÖKENLĐ MDR-MRSA SUŞLARINDA PROTEĐN A GENĐ (spa) DĐZĐ ANALĐZĐNĐN KLONAL ĐLĐŞKĐNĐN TESPĐTĐNDEKĐ ROLÜ Taner BOZKURT YÜKSEK LĐSANS TEZĐ TEZ DANIŞMANI Prof.Dr. Fatih KÖKSAL Bu çalışma TF2008YL8 nolu proje olarak Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir. ADANA–2009 TEŞEKKÜR Eğitim sürem boyunca bilimsel desteklerini esirgemeyen, her zaman hoşgörülü davranan, her konuda rahatlıkla ulaşıp danıştığım, büyük desteklerini gördüğüm ve engin deneyimlerinden yararlandığım danışman hocam Prof Dr Fatih KÖKSAL başta olmak üzere Sayın Prof Dr Fügen YARKIN’a, Sayın Prof Dr Macit ĐLKĐT’e, Sayın Prof Dr Akgün YAMAN’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tezimle ilgili yaptığım çalışmalara katkılarından dolayı Sayın Jörg Rothgänger’e çok teşekkür ederim. Eğitim hayatım boyunca maddi ve manevi desteğini esirgemeyen başta anneme ve aileme saygılarımı sunarım. Taner BOZKURT iii ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa No Kabul ve Onay ıı TEŞEKKÜR ııı ĐÇĐNDEKĐLER ıv ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ vı TABLOLAR DĐZĐNĐ vıı SĐMGE VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ vııı ÖZET-ANAHTAR SÖZCÜKLER ıx ABSTRACT-KEYWORDS x 1.GĐRĐŞ 1 2.GENEL BĐLGĐLER 3 2.1.Tarihçe 3 2.2.Staphylococcus 4 2.2.1.Genel Özellikleri 4 2.2.2.Kültür Özellikleri 5 2.2.3.Üreme Özellikleri 5 2.2.4.Çeşitliliği 6 2.2.5.Enzim ve Toksinleri 7 2.2.5.1.Katalaz 7 2.2.5.2.Koagülaz ve Clumping Factor 7 2.2.5.3.Diğer Enzimler 7 2.2.5.4.Ekzotoksinler 8 2.2.5.5.Lökosidin 8 2.2.5.6.Eksolyatif Toksin 8 2.2.5.7.Toksik Şok Sendrom Toksini 8 2.2.5.8.Enterotoksinler 9 2.2.6.Tanısal Laboratuvar Testleri 9 2.2.6.1.Gram Boya 9 iv 2.2.6.2.Kültür 9 2.2.6.3.Katalaz Testi 9 2.2.6.4.Koagülaz Testi 10 2.2.6.5.Duyarlılık Testleri 10 2.2.6.6.Serolojik ve Tiplendirme Testleri 10 a.Pulsed-Field Jel Elektroforezi 11 b.spa Dizi Tipleme 13 c.Multilokus Dizi Tipleme 14 2.3.Staphylococcus aureus 18 2.3.1.Bakteriyel Virulans Faktörleri ve Đmmün Sistem 23 2.3.1.1.Spesifik Olmayan Đmmün Yanıt 24 2.3.1.2.Spesifik Đmmün Yanıt 25 2.3.1.3.S.aureus’ un Đmmün Sistemden Kaçışı Sağlayan 26 Virülans Faktörleri 2.4. Toplum ve Hastane Kaynaklı Enfeksiyonlar 28 2.5. Stafilokokal Enfeksiyonların Epidemiyolojisi 29 2.6. Metisiline Dirençli Stapylococcus aureus 30 2.7. MRSA’ nın Epidemiyolojisi 32 2.8. MRSA ve Staphylococcus aureus Đle Kolonizasyon 33 2.9. MRSA Yayılımı için Risk Faktörleri 34 2.10. Klinik Đnfeksiyonlar 35 2.10.1. Deri ve Yumuşak Doku Đnfeksiyonları 35 2.10.2. Sistemik Đnfeksiyonlar 35 2.10.2.1. Bakteriyemi ve Endokardit 35 2.10.2.2. Pnömoni 36 2.10.2.3. Septik Artrit 36 2.10.2.4. Septik Bursit 36 2.10.2.5. Pyomiyozit 37 2.10.2.6. Osteomyelit 37 2.10.3. Toksinle Đlişkili Đnfeksiyonlar 37 2.10.3.1. Haşlanmış Deri Sendromu 37 2.10.3.2. Toksik Şok Sendromu 38 v 2.10.3.2.1. Menstural Toksik Şok Sendromu 38 2.10.3.2.2. Nonmenstural Toksik Şok Sendromu 38 2.10.3.3. Besin Zehirlenmesi 38 2.11. Tedavi 39 3. GEREÇ VE YÖNTEM 41 3.1.Kullanılan Besiyerleri 42 3.2. Kullanılan Solüsyonlar ve Kimyasal Maddeler 44 3.2.1.PFGE Solüsyonları 44 3.3. Yöntemlerin Uygulanması 45 4. BULGULAR 55 5. TARTIŞMA 62 6. SONUÇLAR VE ÖNERĐLER 67 7. KAYNAKLAR 68 8. ÖZGEÇMĐŞ 79 vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil no Sayfa no Şekil 2.1. PFGE’ nin yapılışı 12 Şekil 2.2. PFGE sistemlerinin çeşitleri 13 Şekil 2.3. Protein A gen haritası 14 Şekil 2.4. MLST’nin çalışma prensibi ve analizi 16 Şekil 2.5. MLST’nin çalışma prensibi ve farklı 16 allel numaralarının verilmesi Şekil 2.6. Klonal ataların nokta mutasyonu ve rekombinasyonu 17 ile farklı allel profellerine ayrılması Şekil 2.7. Alt grup ataların belirlenmesi 18 Şekil 2.8. S.aureus suşlarının MLST ve eBURST ile 18 çeşitli klonlara ayrılması S.aureus’un elektron mikroskop görüntüsü 19 Şekil 2.10. Serbest S.aureus’un beyaz kan hücreleri ile 24 Şekil 2.9. fagosite edilmesi Şekil 2.11. S.aureus’un beyaz kan hücreleri ile fagosite 25 edilip yok edilmesi Şekil 2.12. Protein A’nın Etkisi 27 Şekil 3.1. DNA içeren kalıpların agaroz jele gömülmesi 48 Şekil 3.2. Agaroz jelin elektroforez tankına yerleştirilmesi 49 Şekil 3.3. DNA örneklerinde baz dizilerinin hesaplanması 54 Şekil 4.1. S.aureus suşlarının PFGE ile elde edilen DNA bant paternleri 57 Şekil 4.2. S.aureus suşlarının dendogram analizi ile ilişkilendirilmesi 58 Şekil 4.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Protein A’nın tespiti 59 Şekil 4.4. Üç çalışma arasındaki benzerlikler ve farklar 61 vii TABLOLAR DĐZĐNĐ Tablo no Tablo 2.1. Sayfa no Toplum kaynaklı ve nazokomiyal infeksiyonların 31 bir nedeni olarak S.aureus’un gelişimi Tablo 2.2. Hasta yerlerine göre MRSA eğrileri 33 Tablo 2.3. MRSA ile MSSA karşılaştırmasında kolonizasyonu 34 izleyen infeksiyon riski Tablo 3.1. Çalışmaya Dahil Edilen Örneklerin Klinik Birimlere 41 Göre Dağılımı Tablo 4.1. Suşların antibiyotik duyarlılıklarına göre dağımı ve gruplandırılması viii 56 KISALTMALAR MDR-MRSA : Multi-Drug Resistant -Methicillin Resistant Staphylococcus aureus PFGE : Pulsed-field jel elektroforez MLEE : Multilocus enzyme electrophoresis RAPD–PCR : Random amplification of polymorphic DNA-PCR MLTS : Multilocus sequence typing PCR : Polymerase chain reaction spa : Staphyloccal Protein A CDC : Centers for Disease Control DIC : Dissemine intravasküler koagülasyonun SCCmec : Staphylococcal Cassette Chromosome mec PBP2A : Penisilin Bağlayan Protein 2A MIC : Minimum inhibitory concentration VISA : Vancomycin-intermediate S.aureus VRSA : Vancomycin-resistant S.aureus TSST : Toxic Shock Syndrome Toxin MHC-II : Major histocompatibility complex II SSR : Short Sequnce Repeat ST : Sequence Type eBURST : Based Upon Related Sequence Types PVL : Panton-Valentine leukocidin CDC : Centers for Disease Control and Prevention MSSA : Methicillin-sensitive S.aureus NHANES : National Health and Nutrition Examination Survey ETA-ETB : Eksolyatif toksin A-B SEA : Staphylococcal enterotoxin A MHA : Müller Hinton Agar CLSI : Clinical and Laboratory Standarts Institute ix ÖZET Hastane Kökenli MDR-MRSA Suşlarında Protein A Geni ( spa ) Dizi Analizinin Kloanal Đlişkinin Tespitindeki Rolü Metisiline dirençli S.aureus (MRSA), hastane ve toplum kökenli infeksiyonlardan sorumlu olan en önemli ajanlardan biridir. Çoğu ülkede MRSA’nın yayılımı sürekli artış göstermektedir ve bazı bölgelerde, hastanelerde S.aureus’un neden olduğu infeksiyonlara ait tüm izolatların yarısından çoğu MRSA’dır. MRSA izolatlarında çoklu direnç gün geçtikçe artmaktadır. 30 yıldan daha uzun süre MRSA tedavisinde kullanılan vankomisine de bu günlerde direnç gelişmiştir. MDR-MRSA ve Hastane Enfeksiyonlarını kontrol çabalarının başarısı büyük ölçüde, etkenin tespiti ve klonal özellikleri, muhtemel bulaş kaynağı ve taşıyıcılar ile bulaş yolu gibi lokal epidemiyolojik özelliklerin tespitine bağlıdır. Tiplendirme yöntemlerinden fenotipik tiplendirme yöntemlerinin tekrarlanabilirlik düzeyleri düşük ve ayrım güçleri zayıftır. Ayrıca fenotipik olarak aynı fakat genotipik olarak farklı olan suşları ayırt edememektedir. Bu yüzden son yıllarda tekrarlanabilirliği ve ayrım gücü yüksek olan genotipik yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler içerisinde PFGE yöntemi hastane kökenli MRSA suşlarının klonal ilişkilerinin tespitinde altın standart olarak kabul edilmiştir. Bu çalışmada Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi kliniklerinde yatan hastalarda görülen hastane infeksiyonlarından izole edilen MDR-MRSA suşlarının klonal ilişkileri PFGE ve spa dizi analizi yöntemi ile tespit edilmeye çalışılmıştır. Çalışmada 2008-2009 yılları arasında MDR-MRSA’ nın neden olduğu enfeksiyon hastalıklardan izole edilen 27 örnek kullanıldı. Đzolatlara Kirby-Bauer yöntemi ile antibiyotik duyarlılık testi yapıldı ve oluşan profillere göre antibiyotipleme uygulandı. Daha sonra suşlar PFGE ve spa tiplendirme yöntemi ile genotipik olarak incelendi. DNA bant profillerine göre suşlar tiplendirildi. Sonuç olarak çalışılan 27 örnek antibiyotipleme ile 6 ve PFGE ile 10 tipe ayrılmıştır. spa tiplendirme sonuçunda ise çalışılan suşların hemen hepsinde Protein A’ nın varlığı tespit edildi. 27 izolattan sadece 5’i spa tip t190 iken diğer 22 izolat tip t030 olarak tiplendirildi. Çalıştığımız suşların tiplendirilmesinde genotipik yöntemlerin daha duyarlı olduğu ve bu yöntemlerden PFGE’in klonal ilişkinin araştırılmasında daha önemli olduğu sonucuna varıldı. Sadece spa tiplendirme yönteminin taşınabilirlik, tekrarlanabilirlik ve sonuçların kolay karşılaştırılabiliyor olmasından dolayı daha iyi olduğu gözlemlendi. Anahtar Sözcük: MDR-MRSA, fenotipik tiplendirme, genotipik tiplendirme, Protein A, PFGE, spa tiplendirme x ABSTRACT The Role of at Klonal Relation Establishing of Sequence Analysis of the Protein A Gene ( spa ) in Hospital Origined MDR-MRSA Đsolates Methicillin-resistant S.aureus is one of the most significant agent of community-acquired and hospital-acquired infections. The prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in many countries increases consistently and, more than half of all S.aureus disease isolates are MRSA in hospitals and in some areas. MRSA strains are becoming increasingly multiresistant, and have recently developed resistance to vancomycin, used successfully to treat MRSA for more than 30 years. Finding of infections and clonal specialities, source of infections and carrier with transmission ways are important because successfully controling of MDRMRSA and hospital-acquired infections. Reproducibility and discriminatory of phenotypic identification methods which is a typing method are poor. Also, phenotypic identification methods could not distinguish similar phenotypic strains with different genotypes. Therefore, recently, genotyping methods which have high reproducibility and discriminatory are used for identifications. PFGE which is genotypig methods have consented the “gold standard” of molecular typing at klonal relations establishing of hospitalacquired MRSA In this study, it has been tried for identification of at klonal relations establishing of MDR-MRSA that isolated from hospital-acquired infections in clinics of Ç.Ü. Faculty of Medicine Balcalı Hospital with PFGE and spa typing method. In this study, it has been used 27 izolates that izolated from hospital infections determined by MDR-MRSA between 2008-2009. Isolates were characterized by antibiotyping as determined by the disk diffusion method (KirbyBauer). Later, isolates were investigated with PFGE and spa typing metod and typed in accordance with their DNA bant profiles. As a result, of 27 MRSA isolates, 6 types were evaluated with antibiotyping and 10 type with PFGE methods. It was substantiated that all of isolates had protein A. 5 of 27 isolates were spa tip t190 and 22 isolate were spa tip t030. In typing of searching isolates, genotyping metods were found more sensitivite and it was deduced that PFGE was more importand at klonal relation establishing. It was observed that spa typing metod was better than other metods because of reproducibility, transportability and comparability of results. Key words: MDR-MRSA, phenotyping, genotyping, Protein A, PFGE, spa typing xi 1. GĐRĐŞ ve AMAÇ Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) tüm dünyada hastane infeksiyonlarından en sık izole edilen “Çoklu Đlaç Dirençli” mikroorganizmadır. Antibiyotik kullanımının sıkı denetim altına alındığı ve hastane infeksiyonlarının önlenmesi amacı ile büyük çabaların sarf edildiği, düşük epidemiyolojik özellik gösteren, Avrupa Birliğine bağlı ülkelerde bile bütün çabalara rağmen MDR-MRSA insidansının 1994–2004 yılları arasında %16’dan %24’e çıktığı “European Antimicrobial Resistance Surveillance System” raporlarında belirtilmiştir. MDR-MRSA ve Hastane Enfeksiyonlarını kontrol çabalarının başarısı büyük ölçüde, etkenin tespiti ve klonal özellikleri, muhtemel bulaş kaynağı ve taşıyıcılar ile bulaş yolu gibi lokal epidemiyolojik özelliklerin tespitine bağlıdır. Hastane kökenli MRSA suşlarının klonal ilişkilerinin tespitte PFGE altın standart olarak kabul edilmiştir. Son derece yüksek ayırım gücüne sahip olan bu yöntemin uzun sürede sonuç vermesi pahalı ekipmanlara ihtiyaç duyması gibi problemlere sahip olduğu bilinmektedir. Son yıllarda klonal ilişki tespitinde yapısal enzimlerin üretimindeki polimorfizmi dikkate alan Multi lokus enzim elektroforezi (MLEE), genomdaki rastgele bölgelerin amplifiye edildiği; RAPD-PCR ve yapısal genlerin genomik analizini dikkate alan Multilokus dizi analizi (MLST) ve SCC mec Multiplex PCR gibi moleküler temelli yöntemler kullanılmıştır. Bu yöntemlerinde duyarlılıkları düşük (mesela RAPD-PCR) veya maliyetleri yüksek bulunmuştur (MLEE, MLST). Son yıllarda yapısal genlerden olan ve genomik polimorfizmin en sık görüldüğü spa’nın dizi analizi ile hastane enfeksiyonlarında görülen MDR-MRSA suşları arasındaki klonal ilişkinin PFGE kadar duyarlı tespit edilebildiği, ancak yöntemin PFGE’ine göre, daha ucuz ve hızlı sonuç veren bir yöntem olduğu gösterilmiş, lokal epidemiyolojik bilgi oluşturulması ve hastane enfeksiyonlarının önlenmesinde spa-dizi analizi sonuçlarına dayalı bilginin son derece yararlı olduğu ileri sürülmüştür. Üniversitemiz hastanesinde de zaman zaman ciddi problemlere sebep olan, ancak ülkemizde farklı özelliklere sahip hastanelerde sık karşılaşılan hastane infeksiyonlarında MDR-MRSA’nın rolü ile salgınlardan izole edilen suşlar arasındaki 1 klonal ilişkinin tespiti, hem hizmet kalitesinin artırılması hem de hastane infeksiyonlarına bağlı olarak ortaya çıkan maddi kayıpların en aza indirilmesi açısından son derece faydalı olacaktır. Bu çalışmada Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi kliniklerinde yatan hastalarda görülen hastane infeksiyonlarından izole edilen MDRMRSA suşlarının klonal ilişkileri PFGE ve spa dizi analizi yöntemi ile tespit edilmeye çalışılacak ve çalışma sonuçlarına göre spa-dizi analizi yönteminin rutin izlemde kullanımı sağlanacaktır. 2 2. GENEL BĐLGĐLER 2.1. Tarihçe Stafilokoklar 100 yıldan daha uzun bir süredir önemli infeksiyon sebeplerinden biri olarak tıp dünyasını meşgul etmektedir. 1898 yılında ilk kez Robert Koch tarafından tanımlanmıştır. 1881 yılında Alexander Ongston tarafından fare ve kobaylarda stafilokokların hastalık yaptığı gösterilmiştir1,2. Stafilokoklar, o dönemlerde insanlar üzerinde tedavisi güç, çok ağır seyreden ve ölümcül infeksiyonlara neden olmaktaydı. Alexander Fleming’in 1928 yılında Penisilin’i bulmasını takiben 1940 yılında bu antibiyotiğin kullanımına başlanması ile birlikte stofilokokal infeksiyonların tedavisinde önemli başarılar sağlanmıştır. Bununla birlikte, penisilinin çok yaygın kullanımı sonucunda, penisilini parçalayan stafilokok türleri ortaya çıkmıştır. Stafilokoklarda penisilinin direnci 1940’lı yılların ortalarından itibaren gittikçe artmıştır, 1950’li yıllarda penisilinin yanı sıra tetrasiklin, eritromisin ve streptomisin gibi antibiyotiklere de direnç gelişimi gözlenmiştir1,2,3. 1960 yılında stafilokoklar tarafından üretilen penisilini parçalayan enzimlere (penisilinaz) dayanıklı semisentetik bir penisilin olan metisilin geliştirilmiştir. Bu sayede, stafilokok infeksiyonlarının tedavisinde ikinci büyük başarı kazanılmıştır. Ancak bu başarının üzerinden henüz bir yıl geçmişken (1961), stafilokoklarda metisilin direnci tanımlanmış ve 1970’li yılların sonu ile 1980’li yılların başlarından itibaren de MRSA suşlarında çoklu antibiyotik direnci ortaya çıkmaya başlamıştır. Günümüzde direnç sorununun giderek yaygınlaşması ile birlikte MRSA tüm dünyada hastane infeksiyonu salgınlarına yol açan çok ciddi bir sorun haline gelmiştir. Başlangıçta MRSA infeksiyonlarının yalnızca tedavisine yönelik çalışmalar yapılmış, kısıtlı kontrol önlemleri dışında, korunma yöntemlerine çok az başvurulmuş, etkenin eradikasyonu (tamamen ortadan kaldırılması) ise hiç düşünülmemiştir. Bunda biraz da küçük çaplı hastanelerde MRSA infeksiyonu görülmemesinin rolü olmuştur. Bindokuzyüz doksanlı yılların başlarından itibaren MRSA infeksiyonlarının hastane ortamında yayılmasının önlenmesindeki zorluklar fark edilmeye başlanmıştır. Bunun üzerine; söz konusu infeksiyonların kontrol altında tutması ve hastane ortamında yayılmasının en aza 3 indirilmesine yönelik olarak yoğun çalışmalar başlatılmıştır ve halen sürdürülmektedir. Bugün bir çok hastanede bu amaçla; hastanenin işlev ve özelliklerine uygun olarak, hastaların kesin izolasyonu da dahil olmak üzere her türlü önleme başvurulmakta, hastanenin kendi işlev ve özelliklerine uygun ve özgün korunma politikaları geliştirilmeye çalışılmaktadır1,2,3. 2.2. Staphylococcus 2.2.1. Genel Özellikleri Stafilokoklar gram pozitif bakterilerdir ve genellikle üzüm salkımı şeklinde gruplar oluştururlar. Çoğu ortamda kolayca üreyebilirler ve metabolik olarak aktiftirler. Karbonhidratları fermente edebilirler ve beyazdan koyu sarıya kadar değişebilen pigmentler üretirler. Bazı türleri insan müköz membranları ve derilerinde normal flora üyesi olarak yaşarken diğerleri cerahat, apse oluşumu, çeşitli piyojen infeksiyonlar ve öldürücü septisemilere neden olmaktadır4,5. Patolojik stafilokoklar genellikle kanı hemoliz ederler, plazmayı pıhtılaştırırlar ve ayrıca çeşitli ekstrasellüler enzim ve toksinler üretmektedir. Stafilokoklar çok çabuk antimikrobiyal ajanlara direnç geliştirir ve zor tedavi problemlerine yol açmaktadır4,5. Staphylococcus genusu en az 35 türe sahiptir. Klinik açıdan en önemli üç tür, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ve Staphylococcus saprophyticus’tur. Diğer türlerden farklı olarak Staphylococcus aureus, koagülaz pozitiftir ve insanlar için major patojendir. Hemen herkes hayatları süresince S.aureus infeksiyonlarının bazı tiplerine sahip olacaktır. Koagülaz negatif stafilokoklar normal flora üyesidir ve bazen infeksiyonlara neden olabilir. Bu infeksiyonlar genellikle çeşitli araç ve cihazların implante edilmesi ile gerçekleşmektedir (özellikle yaşlılar, çok gençler ve immün yetersizliği olan insanlarda). Koagülaz negatif stafilokokların neden olduğu infeksiyonların yaklaşık %75’i S.epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis gibi suşlardan kaynaklanmaktadır ve diğer türler daha az yaygındır. S.saprophyticus daha çok genç kadınlarda üriner sistem infeksiyonlarına neden olmaktadır. Diğer türler ise daha çok veterinerlikte önemlidir4,5. Stafilokoklar düzensiz üzüm salkımı şeklinde gruplar oluşturan 1µm çapında organizmalardır. Sıvı kültürlerde tek, çift, dörtlü gruplar ve zincir şeklinde 4 görülebilirler. Genç kok suşları kuvvetli pozitiftir, yaşlı olanlar da ise bakterilerin çoğu negatif boyanabilir. Stafilokoklar hareketsizdir ve spor oluşturmazlar. Penisilin gibi ilaçların etkisi altında Stafilokoklar yok olabilir4. Stafilokokların hücre duvarının %50’si peptidoglikandan oluşmuştur. Peptidoglikan zincirleri N-asetilglikozamin ve N-asetilmuromik asitin alternatif polisakkarit alt bitimlerinden oluşmuştur. Bu zincirler, S.aureus için spesifik pentaglisin köprüler ve N-asetilmuramik asite bağlı tetra peptit zincirleri tarafından çapraz bağlanmaktadır. Peptidoglikan endotoksin özellikleri gösterebilmektedir ve suşlar arasındaki yapısal farklılıklar, yaygın damar içi koagülasyona (DIC) yol açabilmektedir. Çoğu Stafilokok, bir kaç polisakkariti içeren mikrokapsülleri üretmektedir. Bilinen 11 polisakkarit tipinden 5 ve 8, insan infeksiyonlarının %75’i ile ilişkilidir6,7. 2.2.2. Kültür Özellikleri Stafilokoklar aerobik veya mikroaerofilik şartlar altında çoğu bakteriyolojik ortamda kolayca üreyebilmektedir. En hızlı 37˚C’de ürerler. Katı ortamda koloniler yuvarlak, düzgün, kabarık ve parlaktırlar. S.aureus genellikle beyazdan altın sarısı şeklinde koloniler oluşturmaktadır. S.epidermidis kolonileri genellikle ilk izolatları griden beyaza doğrudur. Fakat çoğu kolonilerinde uzun inkübasyon sonucunda ancak pigment gelişebilmektedir. Anaerobik şartlar altında veya et suyunda pigment oluşmaz. S.aureus hemoliz yapmaktadır ve bazen diğer organizmalarda da hemoliz görülmektedir. Ayrıca anaerobik koklardan olan Peptostreptococcus türleri morfolojik olarak sıkça Stafilokoklara benzetilmektedir4,10. 2.2.3. Üreme Özellikleri Stafilokaklar, Streptokoklardan farklı olarak katalaz üretmektedirler. Stafilokoklar yavaş bir şekilde karbonhidratları asit oluşturarak fermente ederler fakat gaz üretmezler. Patojenik Stafilokoklar çok sayıda ekstrasellüler madde üretmektedir. Stafilokoklar kuru hava koşullarına, ısıya (50˚C’ye 30 dakika) ve %9 sodyum klorüre dayanıklıdırlar. Fakat %3 Heksaklorofen gibi güçlü kimyasallar ile kolayca inaktive edilebilirler. Stafilokoklar çoğu antimikrobiyal ilaçlara duyarlıdır. Direnç birkaç sınıfa ayrılmıştır4; 5 • Betalaktamaz üretimi yaygındır, plazmid kontrolü altındadır ve birçok penisiline (örneğin; penisilin G, ampisilin, tikarsilin vb. ilaçlar) dirençli suşların oluşmasına yol açmaktadır. Pilazmidler muhtemelen konjugasyon ve transduksiyon ile bulaşmaktadır. • Nafsilin (metisilin ve oksasilin) direnci Beta-laktamaz üretiminden farklıdır. Metisiline (nafsilim, oksasilin) direnci sağlayan mecA geni kromozom üzerinde bulunmaktadır. Ve bu gen penisiline düşük affinite gösteren ‘Penisilin Bağlayan Protein’i (PBP2 veya PBP2A) kodlamaktadır. • Amerika Birleşik Devletlerinde S.aureus ve S.lugdunensis suşlarında, vankomisin direnci, eğer minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) 2 g/ml’ye eşit ya da küçük ise duyarlı, 4–8 g/mL ise orta hassas ve 16’ya eşit ya da büyük ise dirençli olduğu düşünülmektedir. Vankomisine orta derecede hassas S.aureus suşları Japonya, A.B.D. ve diğer birkaç ülkeden izole edilmiştir. Bunlar genellikle vankomisine orta hassas S.aureus [vancomycin-intermediate S aureus (VISA)] olarak bilinmektedir. Bu izolatlar genellikle uzun süre vankomisin tedavisi gören karışık infeksiyonlu hastalardan izole edilmiştir. Direnç mekanizması hücre duvarı sentezinin artışı ve değişimleri ile ilişkilidir. Enterekoklarda bulunana van genleri ile ilişkisi yoktur. VISA suşları daima nafsiline direçlidir fakat genellikle oksazolidinonlara ve kinupristin/dalfopristin’e duyarlıdır4.10. • A.B.D.’de vankomisine dirençli S. aureus (VRSA) suşları hastalardan 2002 yılından buyana izole edilmektedir. Bu izolatlar enterekoklarda bulunan vanA geni ve metisilin direncini sağlayan mecA genini taşımaktadır. • Tetrasiklinler, eritromisinler, aminoglikozidler ve diğer antibiyotiklere plazmid aracılığı ile olan direnç Stafilokoklarda yaygındır. • Stafilokokların bir ilaç tarafından öldürülmeyip üremesinin engellenmesi “Tolerans” olarak tanımlanmaktadır. Yani bir antimikrobiyal ilacın öldürücü ve üremeyi inhibe edici özelliği arasında çok fark vardır. 2.2.4. Çeşitliliği Bir stafilokok kültürü, farklı koloni özellikleri (büyüklük, pigment, hemoliz), enzimatik özellikleri, ilaç direnci ve patojenite gibi ayrımları içermektedir. Bazı 6 özelliklerin belirlenmesi büyüme şartları ile ilişkilidir. Metisiline dirençli S.aureus 37˚C’de kanlı agarda üretildiğinde 107 organizmanın birinde direnç görülür, sodyum klorür içeren agarda 30˚C’de 103 organizmadan biri metisiline dirençlidir4,10. 2.2.5. Enzim ve Toksinleri Stafilokoklar hem dokuda geniş yayılım ile hem de birçok ekstrasellüler madde üretimi ile hastalıklara neden olabilir. Bu ekstrasellüler maddelerin bazıları enzimler diğerleri toksinlerdir. Toksinlerin çoğu plazmidlerin genetik kontrolü altındadır. Bazıları hem kromozomal hem de ekstrakromozomal kontrol altında olabilir4,8,9,10. 2.2.5.1. Katalaz Stafilokoklar Hidrojen peroksit’i su ve oksijene parçalayan Katalaz’ı üretmektedir. Katalaz testi, pozitif olan Stafilokokları, negatif olan Streptokoklardan ayırmaktadır4,8,9,10. 2.2.5.2. Koagülaz ve Clumping Factor S.aureus, sitrat veya oksalat ile muamele edilmiş plazmayı pıhtılaştıran protein benzeri bir enzim olan Koagülaz’ı üretmektedir. Serbest olarak salınabilen koagülaz protrombini bağlamakta ve fibrin polimerizasyonunu başlatmaktadır. Koagülaz Stafilokokların yüzeyinde fibrini biriktirebilir. Koagülaz ürünlerinin invaziv patojenik güç ile benzer olduğu düşünülmektedir. Clumping Factor, organizmanın fibrin ve fibrinojene bağlanmasından sorumlu olan S.aureus’un bir yüzey bileşenidir. Plazma ile karşılaştığında S.aureus kümeler oluşturmaktadır. Clumping Factor, Koagülazdan ayrıdır4,10. 2.2.5.3. Diğer Enzimler Stafilokokların ürettiği diğer enzimler arasında hiyaluronidaz, stafilokinaz, proteinaz, DNAaz, lipaz ve ß-laktamaz gibi farklı özelliklerde enzimler de yer almaktadır. 7 2.2.5.4. Ekzotoksinler Alfa toksin, ökaryotik hücre membranlarının geniş spektrumuna göre davranan heterojen bir proteindir. α toksin güçlü bir hemolizindir (eritrosinlerin parçalanmasına sebep olan madde). ß toksin sfingomiyelini indirgemektedir ve bu yüzden insan kırmızı kan hücrelerini içen birçok hücre için toksiktir. δ toksin heterojendir. Biyolojik membranları parçalar ve S.aureus’a ait diyareik hastalıklarda bir role sahip olabilir. γ hemolizin, 6 adet potansiyel iki parçalı toksinleri oluşturmak üzere Penton-Valentin Lökosidin’i de kapsayan 2 protein ile etkileşen 3 proteini işaret etmektedir. Bu protein toksinlerinin 6’sı, sellüler membranlarda katyon geçirgenliğini artıran por oluşumundan dolayı beyaz kan hücrelerinin parçalanmasına neden olabilmektedir. 2.2.5.5. Lökosidin S.aureus’un bu toksini 2 bileşene sahiptir. Đnsan ve tavşanlarda beyaz kan hücrelerini tahrip edebilmektedir. Bu iki bileşen yukarıda γ toksin için anlatıldığı gibi beyaz kan hücrelerinin membranında sinerjik olarak hareket etmektedir. Bu taksin toplum kaynaklı MRSA suşlarında önemli bir virulans faktörüdür. 2.2.5.6. Eksfolyatif Toksinler S.aureus’un bu epidermolitik toksinleri aynı molekül ağırlığında 2 farklı proteindir. Epidermolitik toksin A kromozomal bir gen ürünüdür ve 20 dk. kaynatmaya dirençlidir. Epidermolitik toksin B plazmid kaylaklıdır. Epidermolitik toksinler, epidermisin mukopolisakkarid kaybı ile oluşan stafilokokal haşlanmış deri sendromunun ilerlemesine yol açmaktadır. 2.2.5.7. Toksik Şok Sendrom Toksini Toksik Şok Sendromlu hastalardan izole edilen çoğu S.aureus suşu, enteretoksin F olarakta anılan Toksik Şok Sendrom Toksini–1 (TSST–1)’i üretmektedir. TSST–1 bir süper antijendir. TSST–1, T hücre stimülasyonuna yol açan MHC-II moleküllerini bağlamaktadır. Bu toksin bir deri döküntüsünü kapsayan ateş, şok ve multisistem tutulumu ile ilişkilidir. 8 2.2.5.8. Enterotoksinler Birçok enterotoksin bulunmaktadır (A-E, G-I, K-M). Yaklaşık olarak S.aureus suşlarının %50’si bunların biri ya da daha fazlasını üretebilmektedir. TSST–1 gibi enterotoksinler de bir süper antijendir. Enterotoksinler ısıya stabildir ve bağırsak enzimlerine dirençlidir. Protein ve karbonhidrat içeren besinlerde S.aureus ürediği zaman enterotoksinlerin üretilmesi besin zehirlenmesinin önemli sebeplerinden biridir. 25µg enterotoksin B’nin mideye alınması kusma ve diyare ile sonuçlanmaktadır. Enterotoksinin kusturucu etkisi, toksinin bağırsakta nöral reseptörlerle etkileşimi ile merkezi sinir sisteminin uyarılması sonucu olmaktadır. Eksolyatif toksinler, TSST–1 ve enterotoksin genleri patojenik adalar olarak anılan kromozomal bir element üzerindedir. 2.2.6. Tanısal Laboratuar Testleri 2.2.6.1. Gram Boya Tipik olarak Stafilokoklar, püy veya balgamın gram boyanması ile pozitif koklar şeklinde görünmektedir. Boyama ile patojenik (S.aureus) organizmaları saprofitik olanlardan (S.epidermitis) ayırmak mümkün değildir. 2.2.6.2. Kültür Stafilokoklar konvansiyonel çoğu besiyerinde rahatlıkla üreyebilmektedirler. Tipik kolonilerin gözlenebilmesi için kanlı agar plaklarına örnekler ekilir ve 37˚C’de 18 saat inkübe edilir. Fakat hemoliz ve pigmet ürünleri ilk günler görülmeyebilir. S.aureus diğer stafilokokların fermente edemediği mannitolü fermente edebilmektedir. Farklı bir flora ile kontamine örnekler %7,5 NaCl içeren bir besiyerine ekimleri yapılarak S.aureus izole edilebilir. Tuz S.aureus hariç diğer organizmaların üremesini engellemektedir. Mannitollü tuz agar veya ticari kromojenik besiyerleri, kistik fibrosisli hastalarda ve S.aureus’un nazal taşıyıcılığını belirlemede kullanılan besiyerleridir. 2.2.6.3. Katalaz Testi Sitokrom Oksidaz enziminin varlığını tespit etmek için bu test kullanılmaktadır. Bir damla %3 Hidrojen Peroksit solüsyonu lam üzerine damlatılır ve bakteri kolonisi ile 9 karıştırılır. Köpürme oluşumu (oksijenin serbest kalması) testin pozitif sonuç verdiğini göstermektedir. 2.2.6.4. Koagülaz Testi 1\5 oranında seyreltilmiş sitratlı tavşan veya insan plazması, et suyu kültürü veya agar üzerindeki kolonilerden eşit oranda alınarak karıştırılır ve 37˚C’de inkübasyona bırakılır. Bir tüp, steril sıvı besiyeri plazma ile karıştırılarak kontrol amaçlı kullanılır. Eğer pıhtılar 1–4 saat içinde toplanırsa test pozitif olarak değerlendirilir. Koagülaz pozitif stafilokokların insanlar için patojen oldukları düşünülmektedir. Fakat köpek (Staphylococcus intermedius) ve yunuslardaki (Staphylococcus delphini) koagülaz pozitif koklar nadiren insanlarda hastalığa sebep olurlar. Prostetik cihazların infeksiyonlar koagülaz negatif Staphylococcus delphini gruplarının organizmaları tarafından meydana gelmektedir. 2.2.6.5. Duyarlılık Testleri Klinik olarak önemli infeksiyonlardan izole edilen stafilokoklar için Broth mikrodilüsyon veya disk difüzyon duyarlılık testleri rutin olarak yapılması önerilmektedir. ß-laktamaz testi pozitif suşlarda Penisilin G direncinden bahsetmek mümkündür. Yaklaşık olarak S.aureus’ların %90’ı ß-laktamaz üretmektedir. Metisilin direnci yaklaşık olarak S.epidermidis suşlarının %35’inde, S.aureus suşlarınında %75’inde gerçekleşmektedir. Metisilin direnci diğer ilaçlara affinitesi olmayan penisilin bağlayan protein-2A (PBP-2A)’yı kodlayan mec geni ile ilişkilidir. Bu gen, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) kullanılarak tespit edilebilir. Çoğu laboratuar direncin göstergesi olarak bir fenotipik yöntem olan oksasilin testini kullanmaktadır. 6 µg/mL oksasilin ve %4 NaCl içeren Müller-Hinton agarda üreyen Stafilokoklar mecA pozitif ve metisiline dirençlidir. Alternatif olarak mecA geninin ürünü PBP-2A için geliştirilmiş ticari testler bulunmaktadır ve bu testler PZR veya oksasilin içeren tuz agar kullanılarak yapılan direnç testlerinden daha hızlıdır. 2.2.6.6. Serolojik ve Tiplendirme Testleri Organizmanın flora elemanı olarak bulunması nedeniyle infeksiyonlarının tanısında serolojik testler çok az pratik değere sahiptir. 10 S.aureus Bununla birlikte antibiyotik duyarlılık paternleri, S.aureus infeksiyonlarının izlenmesine yardım etmektedir. Moleküler tiplendirme teknikleri, epidemik hastalıklara neden olan S.aureus suşlarının yayılımını izlemek için kullanılmıştır. Bunlar arasında pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), spa dizi tiplendirme yöntemi ve multi-locus sequence typing (MLST) yüksek ayrım gücüne sahiptir. 2.2.6.6.a. Pulsed-Field Jel Elektroforezi (PFGE) Pulsed-Field Jel Elektroforezi (PFGE), S.aureus ve diğer birçok patojen bakterilerin genetik farklılıklarını araştırmak için moleküler epidemiyolojide kullanılan önemli bir genetik tiplendirme metodudur. 1990 yılından beri PFGE, birçok bakteri için etkili ve çok yönlü genetik tiplendirme metodudur. PFGE temel olarak bozulmamış bakteri hücrelerinin yumuşak agaroz jele gömülmesini daha sonra hücre duvarı lizizini ve kromozomun kesilmesini içermektedir. Restriksiyon endonükleaz enzimleri ile genomun kesilmesinden sonra agaroz jel elektroforez yöntemi ile ayırma işlemi gerçekleştirilir. Meydana gelen fragmentlerin konvansiyonel elektroforez sistemlerle ayrılması çok zordur. PFGE sistemlerinde bu fragmentleri ayırmak mümkün olabilmektedir. Sistemlerde başlangıç vuruşları kısadır ve elektroforez devam ettiği sürece artar. Bant paternleri 12,13,14,15,16,17,18 değerlendirilir bir (Şekil 2.1). 11 görüntüleme sistemi aracılığı ile Şekil 2.1. PFGE’nin yapılışı. A: besiyerinden kolonilerin toplanması, B: kolonilerin tampon içinde süspanse edilmesi, C: eritilmiş agar ve bakteri süspansiyonunun plastik kalıp içine yerleştirilmesi, D: Agaroz kalıplarının liziz solüsyonuna atılması, E: jellerin elektroforez taraklarına uygun şekilde kesilmesi, F: kesilen kalıpların restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesilmesi, G: kesilen parçaların kuyulara yerleştirilmesi, H: Jelin Chef DrII sistemine yerleştirilmesi ve ayarlanması, I: Jelin Ethidium Bromide ile boyanıp görüntülenmesi12. Counter Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis (CHEF), PFGE’nin dünyada en yaygın kullanılan modelidir. Bu yöntem dışında pulsed field gradient gel electrophoresis (PFGE), Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis (OFAGE), Transverse Alternating Field Electrophoresis (TAFE), Field Đnversion Gel Electrophoresis (FIGE), Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis (OFAGE), crossed field gel electrophoresis (Waltzer) ve Simultaneous Tangential/Rectangular Inversion Decussate Electrophoresis (ST/RIDE) gibi yöntemlerde kullanılabilmektedir19 (Şekil 2.2.). 12 Şekil 2.2. PFGE sistemlerinin çeşitleri19. 2.2.6.6.b. spa Dizi Tipleme spa Dizi Tipleme yöntemi, Protein A geninin kısa tekrar bölgesi [short sequnce repeat (SSR)] veya polimorfik X bölgesinin dizi analizine dayanmaktadır. Bu bölgeler yüksek polimorfizme sahiptir ve böylece salgın araştırmalarında ayrım için potansiyel olarak uygundur12,20. Polimorfik X bölgesi değişken 24 baz çiftlik tekrarları içermektedir ve Cterminal hücre duvarı bağlanma dizisinin kodladığı bölgeye yerleşmektedir21,22,23 (Şekil 2.3). SSR bölgesinin çeşitliliği, tekrarlayan dizilerin duplikasyonu ve delesyonu ile ortaya çıkmaktadır. Ayrıca bu durumdan nokta mutasyonları da sorumlu tutulmaktadır24. Biyolojik fonksiyonlarının bilinmemesine karşın, X bölgesi tarafından kodlanan Protein A, hücre duvarı proteinlerinin N-terminal immünoglobulin G bağlama kısmının genişlemesini sağlamaktadır. spa SSR bölgesinin dizi analizi, MLST yöntemindeki birçok avantajın kombinasyonudur. Fakat spa tiplemesinin tek lokusu içermesinden beri hastane salgın araştırmalarında daha hızlı ve pratik olmuştur. 13 Şekil 2.3. Protein A gen haritası. Kutulardaki gen kodları; S: single dizi, A-D: immünoglobulin G bağlayan bölgeler, E: A-D’ye homolog bölge, X: COOH terminal bölge, Xr: SSR’ler, Xc: hücre duvarı bağlama dizisi23. spa tipleme metodunda ilk olarak yapılacak iş bakteriden DNA extraksiyonunun yapılmasıdır. Đkinci işlem olarak spesifik primerler kullanılarak spa geninin X bölgesi PCR yöntemi ile amplifiye edilir ve bir sekans cihazı kullanılarak DNA dizileri belirlenir. Daha sonra Ridom StaphType veri programları kullanılarak spa tipleri tanımlanır. Belirlenen spa tipleri internet yardımı ile diğer ülkelerdekiler ile karşılaştırılır25. 2.2.6.6.c. Multilokus Dizi Tipleme (Multilocus Sequence Typing, MLST) Hastalıklara neden olan enfeksiyon etkenlerinin tam identifikasyonu ve epidemiyolojik sürveyansı toplum sağlığı için vazgeçilmezdir. Mikroorganizmaların genotiplendirilmesinde henüz kesinleşmiş ve standardize edilmiş bir yöntem yoktur. Birçok laboratuarda halen, zayıf ayrım gücüne sahip, reaktiflerin sınırlı kullanıldığı, laboratuarlar arasında ve içinde zayıf tekrarlanabilirliğe sahip farklı yöntemler kullanılmaktadır. Fakat yaygın olarak kullanılan tiplendirme yöntemlerinin günümüzdeki en önemli problemleri, farklı laboratuarlar tarafından elde edilen sonuçların karşılaştırılmasındaki zorluklardır26,27,29. Moleküler tiplendirme yöntemleri, sıklıkla aynı türe ait iki mikroorganizmanın aynı klondan olup olmadıklarını belirlemek için kullanılmaktadır. Örneğin reenfeksiyon ve re-aktivasyon ayırımı moleküler yöntemlerle gerçekleştirilebilmektedir26,27,29. Multilocus sequence typing (MLST), moleküler biyolojide kullanımı giderek artan ve mikroorganizmaya ait birden çok lokusun tiplendirilmesinde kullanılan bir tekniktir. Yöntem ilk olarak 1990 yılında Prof.Dr.Brian Spratt, Martin Maiden, Dominique Caugant, Ian Feavers ve Mark Achtman tarafından geliştirilmiştir. MLST 14 uygulamasından önce bakteri izolatları genellikle, jelde DNA fragmentlerine bakarak karakterize edilmekteydi. Fakat bu yöntemlerin çoğunda elde edilen verilerle laboratuarlar arasında karşılaştırma yapmak çok zor olmaktaydı28,29. MLST, ilk olarak meningokoksik menenjit ve septisemiye neden olan, Neisseria meningitidis üzerinde çalışılmıştır. Daha sonra bu teknik, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus ve diğer major patojenler için adapte edilmiştir. MLST, çok sayıda bakteriyel patojenin moleküler analizinde yaygın olarak kullanılır hale gelmiştir. Bu yöntemle virulan veya antibiyotiklere dirençli klonların tiplendirilmesi yanında, klonların evrimsel gelişimi de izlenebilmektedir. Yöntemin Klinik Mikrobiyoloji ve Halk Sağlığı laboratuarlarında çok geniş kullanımı bulunmaktadır. MLST, temel metabolik fonksiyonu kodlayan “house-keeping” genlerdeki değişikliğin DNA dizi analizi ile gösterilmesidir. Yedi “ housekeeping ” genin yaklaşık 450-500 baz çiftlik fragmentlerinin dizi analizi çıkarılmaktadır. Örneğin Neisseria meningitidis’de bu genler, abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC ve pgm genleridir. S.aureus için ise bu genler ve kodladığı proteinler; arcC, karbamat kinaz; aroE, shikimate dehydrogenase; glp, gliserol kinaz; gmk, guanilat kinaz; pta, fosfat asetiltransferaz; tpi, triosephosphate isomerase; ve yqiL, asetil koenzim A asetiltransferaz’dır26,27,29. Hedef gene ait her bir lokus için, her farklı dizilim farklı bir allel numarası ile gösterilmekte ve böylece suşa ait bir allelik profil tanımlanmaktadır. Tanımlanan allelik profiller, dizi tipi (sequence type=ST) olarak ifade edilmektedir. Belirlenen allelik profiller, MLST veri bankasındaki (http://www.mlst.net) bilinen allellerle kıyaslanarak, tespit edilen allel profilinin diğer ülkelerdeki yaygınlık derecesi hakkında bilgi edinmek mümkün olabilmektedir. Elektronik ortamda saklanabilir verilerin oluşturulabilmesi MLST’nin en önemli avantajlarından birisidir. Bu sayede yeni izolatlar daha öncekilerle kolay bir şekilde karşılaştırılabilmektedir ve verilerin daha kolay paylaşımı mümkün olabilmektedir. Klinik uygulamalarda araştırmacılar için bu veriler önemi giderek artan kullanım alanlarına sahiptir. Örneğin www.mlst.net adresinden internet yolu ile bu verilere hızlıca ulaşılabilmektedir26,27,29,30. Bir MLST çalışması için öncelikle kültür veya numunenin hazırlanması gerekmektedir. Sonra sırası ile DNA izolasyonu, MLST genlerinin PCR ile 15 amplifikasyonu, PCR ürünlerinin saflaştırılması, dizi analizi ve sonuçların bilgisayar ortamında sorgulanması gerekmektedir (Şekil 2.4-2.5). Şekil 2.4. MLST’nin çalışma prensibi ve analizi31 (Feil, E.J. Nat. Rev. Mic. 2(6): 483-95) Multilocus Sequence Typing (MLST) Kromozomal DNA Yedi houser-keeping genin yaklaşık 450bp’ lik internal fragmentinin amplifikasyonu 7 gen fragmentinin dizisi Bir lokusta her farklı diziye farklı alel numarası verilir 7 MLST lokusunda alel numaraları izolatların alellik profilini vermektedir İnternet yolu (www.mlst.net) ile ağ üzerinde merkezi bir data da tüm izolatların alellik prifilleri karşılaştırılır. Şekil 2.5. MLST’nin çalışma prensibi ve farklı allel numaralarının verilmesi30 16 MLST çok fazla avantaja sahip olmasına rağmen çeşitli zorluklara da sahiptir. Bu zorlukların başında 7 allel üzerinde çok düşük hata oranına sahip dizi analizi yapma zorunluluğu gelmektedir. Çoğu laboratuar için bunları sağlayabilmek oldukça pahalı ve zaman alan bir süreçtir. Dizi analiz cihazları sıklıkla otomatize sistemlerdir ve bu sebeple ile pahalıdırlar. Fakat son dönemlerde kapiller dizi analiz sistemlerinin yeni jenerasyonlarının gelişimi ile çok önemli fiyat avantajları meydana gelmiştir26. MLST veri programı yardımı ile belirlenen ve kıyaslanan alleller, klonal komplekslerin, ilk ata ve alt grup atalara ayrılabilmesi için eBURST (Based Upon Related Sequence Types) uygulamasına geçilmesini gerektirmektedir. Klonal atalara verilen numaralar yardımı ile nokta mutasyonlardan sonra oluşan allellik profiller ve rekombinasyon sonucu oluşan dizilerin ayrımı gerçekleştirilmektedir (Şekil 2.6). Şekil 2.6. Klonal ataların nokta mutasyonu ve rekombinasyonu ile farklı allel profellerine ayrılması31 Klonal komplekslerin ve ilk ataların belirlenmesinden sonra yine eBURST uygulası kullanılarak alt grup atalar belirlenir (Şekil 2.7). Belirlenebilecek alt grup 17 varyasyon seçenekleri www.eburst.mlst.net uygulamasında açıklanmaktadır 31,32 adresinde var olan eBURST v2 . Şekil 2.7. Alt grup ataların belirlenmesi31. Şekil 2.8. S.aureus suşlarının MLST ve eBURST ile çeşitli klonlara ayrılması31 2.3. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus, hayatı tehdit eden bakteriyel infeksiyonların en yaygın nedenlerinden biridir. Her yıl Amerika Birleşik Devletlerinde hastanede tedavi görmekte olan yaklaşık 400,000 hasta, S.aureus tarafından infekte edilmekte ve bu hastaların 100,000 kadarı bu infeksiyonlardan dolayı oluşan komplikasyonlar nedeniyle ölmektedir. Bu ölümler tüm dünyaya dağılmıştır11. 18 S.aureus, Stafilococcus genusunda yaklaşık 32 türden biridir. Diğer suşların çoğu sadece diğer memelilerde bulunur ve insanları enfekte etmez. S.aureus’un kökeni iyi anlaşılır değildir. Fakat güncel teoriler bu bakterilerin tarih öncesi toprak bakterilerinden geliştiğini ileri sürmektedirler. S.aureus ilk kez 1884’te Alman Doktor Anton Rosenbach tarafından kesin olarak tanımlanmıştır. S.aureus üzüm salkımı gibi demetler yaparak büyüyen, hareketsiz bir bakteridir. Aslında ‘staphyle’ Yunanca ‘üzüm salkımı’ ve ‘cocci’ ise ‘küresel bakteri’ anlamına gelmektedir. Bakteri büyük ölçüde sarı renkli koloni oluşturmasından dolayı Latince altın anlamına gelen “aureus” ismi verilmiştir. Hücreler yaklaşık 1 πm çapındadır11,39,47 (Resim 2.9). S.aureus’un 125 yıl önce fark edilmesi ve tanımlanmasına rağmen, binlerce yıl insanlar bu organizma enfekte olmaktaydı ve ölmekteydi. Yaygın S.aureus infeksiyonlarından olan içi cerahat dolu deri lezyonlarından Đncil’de de bahsedilmektedir. Şekil 2.9. S.aureus’un bir elektron mikroskop görüntüsü. Küre biçimindeki bakteri üzüm salkımı şeklinde çoğalmaktadır11. 19 Đtalyan Doktor Girolamo Francastoro 1500’lü yıllarda bakterilerin hastalık taşıyabileceğini ileri sürmüştür. Bu devrimci fikirden sonra dahi, Alman Doğa Bilimci Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) ilkel mikroskop ile 1674’te mikroorganizmaları tam olarak gözlemlemesine kadar 100 yıldan fazla bir süre geçmiştir. ‘Mikrobik Organizmalar’ olarak adlandırdıkları küre biçimindeki koloniler muhtemelen S.aureus’un bazı türleri olmasına rağmen, bilim adamlarının dikkatli bir şekilde çalışmaları ve bu bakteriyi tanımlamalarına kadar bir 200 yıl daha geçmiştir11. S.aureus, sıcakkanlı hayvanların mukoza zarlarında ve derilerinde yaşamaktadır. Đnsanlar bu bakterinin birinci derece taşıyıcılarıdır. Nem ve sıcağı sevdikleri için özellikle nazal membranlar S.aureus için en iyi yaşama ortamını sunmaktadır. Tahminen yetişkin ve sağlıklı insanların %40–10’u burunlarında çoğalan S.aureus kolonilerine sahiptir. Đnsanların son derece uygun olmasına rağmen S.aureus diğer ortamlarda da bulunabilmektedir11,47. S.aureus son derece dayanıklıdır. 15˚C- 45˚C gibi geniş sıcaklık aralıklarında üreyebilmektedir. Üremek için şartlar (örneğin; sıcaklık veya doğal kaynak) uygun değilse S.aureus, metabolik olarak inaktif hale geçip yıllarca canlı kalabilir ve şartlar uygun duruma geldiğinde bakteri tekrar üremeye başlayabilir. S.aureus’un kendini bu kadar çabuk toparlamasının bir nedeni, hücre duvarının diğer bakterilere göre çok daha kalın olmasıdır11. S.aureus, birçok sağlıklı bireyin derisinde kolonize olmasına rağmen çoğu taşıyıcıda infeksiyon oluşturmaz. Deri, bakterinin vücut içine girişi için önemli bir bariyer sağlamaktadır. Fakat cerrahi veya mekanik yaralanmadan dolayı derinin bütünlüğünün bozulması, deriye önceden kolonize olmuş S.aureus için bir giriş noktası sağlamakladır. Çeşitli savaşlar esnasında S.aureus’un yaralardan faydalanma kabiliyeti ile ilgili çok dramatik tarihi kayıtlar mevcuttur. Đkinci Dünya Savaşından önce (1939– 1945) savaşa ait ölümlerin ana sebebi düşman mermileri değil bakteriyel infeksiyonlardı. Bu infeksiyonlar, düzenli olarak savaş alanından taşınan yaralı askerlerden sonra meydana gelmiştir. Bunun sebebi cerrahi yaraların ilkel şartlar altında pansuman edilmesinden kaynaklanmaktadır. Fransız Đmparator Napoleon Bonaparte 1812’de Rusya’ ya saldırdığında, savaş yaralılarından daha fazla asker Tifüs’ten (pire, 20 akar ve keneler tarafından taşınan ciddi bir bakteriyel hastalık) ölmüştür. S.aureus bu infeksiyonların majör sebebidir11,33,39,41. Alexander Fleming’in Penisilini bulması ve 1940’ta seri üretimi, Đkinci Dünya Savaşı sonuna kadar savaş alanındaki infeksiyonların tedavisinde devrim yapmıştır. Bu yüzden S.aureus infeksiyonlarından sonra meydana gelen ölüm oranlarının %80’den fazla düşüşü için etkiliydi ve mucize ilaç sanılmıştır11. Penisilinin ilk önemli kullanımı 1942’de Boston’da Coconut Grove adındaki bir gece kulübünde meydana gelen yangın sonrasında gerçekleşmiştir. 400’den fazla insan yangından ölmüş ve diğerleri hastanelere taşınmıştır. O anda çoğu hastada S.aureus infeksiyonu gelişmiştir. Bu infeksiyonları tedavi edecek ilaçların bulunmamasından çoğu hasta kaybedilmiştir. O sıralar penisilin sadece askerler için ayırtılmıştı ve A.B.D.’de 100’den daha az hastanın tedavisi için kullanılmıştır. Fakat A.B.D. yönetimi yangın mağdurlarının tedavi edilmesi için bu ilacın kullanılmasına izin vermiştir. Đlerleyen yıllarda çok fazla penisilin üretilmiş ve Alexander Fleming 20. yüzyılın bilim adamı olarak tanımlanmıştır34,35,43,44. Penisilinin çok kullanımından dolayı ne yazık ki Fleming, sağlık açısından önemli problemler çıkaran antibiyotik dirençli bakterileri izole etmiştir11. Penisilin üzerinde çalışmalar devam ederken nispeten toksik olmayan ve bakteri ölümünü sağlayan “Sulfonamid” tanımlanmıştır. Penisilinden çok farklı bir mekanizmaya sahiptir. Bakteri üremesi için gerekli bir bileşik olan Folik Asit’in sentezini bozmaktadır. Fakat önemli hastalıklara neden olan S.aureus suşlarını içeren türlerin çoğu bu antibiyotikten etkilenmemiştir. Sulfonamid çoğu ilaç ile karşılaştırıldığında toksik olmamasına rağmen anemi, deri sentizasyonu ve kaşıntısı, baş ağrısı, mide bulantısı ve kusma gibi yan etkilere sahiptir11,42. Bacillus brevis (toprak bakterisi), S.aureus bakterisini öldürebilen bir madde salgılamaktadır. Gram pozitif bakterileri öldürebildiği için “Gramisidin” adı verilmiştir. Đntravenöz olarak verildiğinde toksik olmasına rağmen, cilt infeksiyonlarının lokal tedavisinde kullanıldığı gösterilmiştir ve günümüzde halen kullanılmaktadır11. Streptomisin 1943’te toprak bakterilerinden izole edilmiştir. Bu antibiyotik tüberküloz tedavisinde çok etkileyiciydi. Streptomisin, antibiyotiklerle ilişkili geniş bir ailenin üyesidir. Bu bileşik bakteri ribozomuna etki etmesi ve bakteriyel protein sentezinin bozulması ile bakterileri öldürmektedir. Bu mekanizma diğerlerinden farklı 21 olduğu için direncin daha az problem olması ümit edilmiştir. Fakat direnç meydana gelmiştir. Đlk geniş spektrumlu antibiyotik (hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakterileri öldürebilen) olan Kloramfenikol, Venezuelan’da toprak bakterilerinden 1947’de izole edilmiştir. Kloramfenikol, kene ve böceklerle taşınan Riketsiya bakterilerinin neden olduğu infeksiyonların tedavisi için uygun bulunmuştur. Farklı bir yapıya sahip olmasına rağmen Kloramfenikol’ün çalışması Streptomisine benzemektedir. Bakteriyel ribozoma etki ederek protein sentezini önlemektedir. Fakat tedavi edilen hastaların küçük bir grubunda insan mitokondriyal protein sentezininde kısıtlanması göze çarpmaktadır. Bu durum kemik iliği supresyonu, anemi ve lösemiye yol açabilmektedir. Bu gibi yan etkilere sahip olmasına rağmen ilaç, diğer ilaçlarla sonuç alınmadığında kullanılmaktadır11,42. 1948’de Penisilin ile yakın ilişkili Sefalosporinler bir mantardan izole edilmiştir. Bu mantar, Đtalya yakınında Akdeniz’de bir ada olan Sardinia sahili üzerinde bir lağım çıkışı yakınındaki denizde ürediği bulunan Cephalosporium acremonium’dur. Sefalosporinler, Penisilin gibi antibiyotiklerin bulunduğu ailenin üyesidir ve hücre duvar yapısını bozarak çalışmaktadır. Sefalosporinler üzerinde çalışan bilim adamları bu antibiyotiğin farklı kuşaklarını (birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü kuşak) geliştirmiştir. Sefalosporinlerin bazı tipleri gram-pozitif bakteriler üzerinde etkiliyken diğerleri gram-negatiflere etkilidir. Sefalosporinler, Penisiline benzer bir yol kullandığından dolayı Penisiline dirençli bakteriler bu antibiyotik içinde aynı yol ile direnç geliştirmiştir. Bakteriler sık sık Sefalosporinleri tahrip etmek için Penisilin Bağlayan Proteinlerini (PBP) değiştirmişlerdir. Farklı kuşak Sefalosporinler dirençli bakteriler için kullanılmıştır. Örneğin 4.kuşak Sefalosporinler, ß-laktamaz enzimlerle tahrip edilmez, fakat diğer direnç mekanizmalarına duyarlıdır11,37,42. Çoğu antibiyotik araştırması genellikle yeni Penisilin türevlerinin bulunmasına yönelik olmuştur. Bu yeni ilaçlardan birisi Metisilindir. ß-laktamaz direnç problemlerine çözüm getirebilmesine rağmen tanımlanmasını takiben 2 yıl içerisinde Metisiline dirençli S.aureus suşları (MRSA) ortaya çıkmıştır. MRSA, Metisilini bağlayamayan PBP’leri içeren diğer mekanizmalara dirençlidir42. Vankomisin, S.aureus infeksiyon tedavileri için geliştirilmiş en önemli antibiyotiklerden biridir. Vankomisin büyük bir moleküldür ve oral olarak alındığında 22 iyi bir şekilde absorbe edilmez. Etkili olabilmesi için damar içine enjeksiyon ile verilmelidir. Bu gibi çözümlenebilir problemlere rağmen, işitme kaybı ve böbrek yetmezliği gibi yan etkilere sahiptir42,44,45,46. Vankomisin, Penisilin gibi bakteri duvarının oluşumunu engelleyerek çalışmaktadır. Fakat farklı olarak Vankomisin, bakteri hücre duvarı yapı taşlarına bağlanmaktadır. Bu bağlanma tam olarak PBP’lere bağlanmayı önlemektedir. Sonuçta bakteri yapısal bütünlüğü zayıflamaktadır. Bu mekanizma Penisilin ve Metisilinden farklıdır. Metisiline dirençli suşların neden olduğu infeksiyonların tedavisi için Vankomisin kullanılmıştır ve iyi sonuçlar alınmıştır. Son çare ilaç olarak düşünülen Vankomisine de dirençli S.aureus suşları izole edilmiştir ve kulanımı buna bağlı olarak sınırlandırılmıştır49,50,51. Vankomisine dirençli S.aureus suşları için tedavide yeni bir metod olarak Linezolid kollanılmaktadır. Linezolid antibiyotiklerin yeni bir sınıfında yer almaktadır. Linezolid, Kloramfenikol ve Streptomisin gibi bakteriyel protein sentezine engel olmaktadır. Aslında Linezolid, yeni protein sentezi için gerekli tüm proteinleri engellediğinden diğer antibiyotiklere dirençli olan bakteriler üzerinde kullanılabilmektedir. Fakat Linezolid’e dirençli bakteriler rapor edilmiştir11,51,52. Yapılan uzun çalışmalar sonucunda bakteriyel infeksiyonların tedavisi için 100’den fazla antibiyotik keşfedilmiştir. A.B.D. her yıl çok büyük miktarlarda antibiyotik üretmektedir11,42,53. 2.3.1. Bakteriyel Virulans Faktörleri ve Đmmün Sistem Derinin ilk ve en önemli bariyeri S.aureus ve diğer bakteriler içindir. Deri, bakterinin vücuda kolay giriş yapamaması için koruyucu bir tabaka oluşturmaktadır. Ayrıca ağız, göz, burun gibi müköz membranlar koruyucu bir tabaka olarak görev yapmaktadır. Ek olarak fiziksel bariyerlere deri ve müköz membranlar tarafından şekil verilmektedir. Deri, bakterin üremesini engellemek için yağ üretmektedir, yine gözyaşı ve tükürük bakterilerin ölmesine neden olan Lizozim enzimine sahiptir. Bunlara karşın kistik fibrosis ve yanık gibi yaralanmalardan dolayı oluşan bakteriyel infeksiyonlara karşı insanlar duyarlıdır11. 23 Sindirim sistemi bakteriler için sert bir ortamdır. Örneğin mide çok asidiktir ve sindirim enzimleri bakterilere çok zarar vermektedir. Her gün dışkı ile 100 milyon ile 100 trilyon arasında bakteri atılmaktadır. Normal flora bakterileri olarak bilinen birçok bakteri insan vücudunda zarar vermeden yaşamaktadır. Bu bakteriler genellikle her yerde bulunmazlar (örneğin; kalp, beyin). 2.3.1.1. Spesifik Olmayan Đmmün Yanıt Deride meydana gelecek bir zarar veya kesik bakterilerin oraya yerleşip infeksiyon oluşturması için fırsattır. Bu durumda immün sistem bu saldırıya karşı savaşmalıdır. Đlk yanıt spesifik değildir. Bu ilk yanıt, fagositoz olarak bilinen yol ile S.aureus ve diğer bakterilerin öldürülmesinde etkin olan beyaz kan hücreleri ile ilişkilidir. Fagositoz sırasında beyaz kan hücreleri, tamamen kaplayana kadar bakteri plazma membranlarını sarmaktadırlar11,48. Beyaz kan hücreleri kendi kendilerine bakterilerin farkına varmalarına rağmen, yabancı istilacılar olarak belirlenmiş bakteriler bu hücreler tarafından daha etkili biçimde bağlanır ve içine çeker. Bu hücreler bakterilerin hücre duvarını bileşenleri tanıyan ‘Antikorlar’ ile bağlanmaktadır. Antikorlar immün sistem hücreleri tarafından üretilmektedir. Şaşırtıcı bir şekilde S.aureus suşları, beyaz kan hücreleri içinde yaşayabilmesini sağlayan koruyucu bir protein üretmektedir ve ölmeden kaçmaktadırlar. Bu proteinlere ‘komplement’ proteinler denmektedir ve bakteri hücre duvarı, antikorlara bağlanmaktadır. Bu şekilde bakteri tamamen sarılmaktadır11,48 (Şekil 2.10). Şekil 2.10. Serbest S.aureus’un Beyaz kan hücreleri ile fagosite edilmesi 24 Ayrıca beyaz kan hücrelerinde Đnflamatuar Cevap olarak bilinen daha genel bir cevaba sahiptir bakterilere karşı. Đnfeksiyonlarda beyaz kan hücrelerinin harekete geçmesi ‘sitokinler’ tarafından sağlanır. Sitokinler, kan akımında bir artışa ve doku infeksiyonu içinde bakteri ile savaşmak için beyaz kan hücrelerinin toplanmasına yardım etmektedir. Şekil 2.11. Saldırgan bir S.aureus bakterisi ile karşılaşıldığında beyaz kan hücreleri sitokin salgılamaya başlar. Bu toksinler beyaz kan hücrelerinin toplanmasına yardımcı olmaktadır. Beyaz kan hücreleri bakterileri fark etmektedir ve fagositoz ile öldürmektedir11. 2.3.1.2. Spesifik Đmmün Yanıt Bakteri saldırılarında vücudun verdiği yanıtlardan biriside, özel bir organizma saldırısında onun ile savaşmayı amaçlayan spesifik bir cevaptır. Bu cevap çok daha yavaştır ve başlaması için 4–7 gün gerekmektedir. Eğer bakteriler fagositik beyaz kan hücreleri ile ortadan kaldırılmazsa beyaz kan hücreleri Lenf Bezlerine hareket etmektedir. Fagositik hücreler bakteri hücrelerini immün hücrelerine sunar ve spesifik olarak bakteri proteinlerine bağlanan bir reseptörü içeren hücreler aktif hale geçer. Bu durum B Hücrelerinin bakteri saldırısına karşı antikor üretimi ile sonuçlamaktadır. 25 Ayrıca immün sistemin T Hücreleri olarak bilinen, saldırgan patojenlerin ortadan kaldırılmasına yardım eden farklı hücreleri de vardır11,48. 2.3.1.3. S.aureus’un Đmmün Sistemden Kaçışı Sağlayan Virülans Faktörleri Gelişigüzel mutasyonlar bakterilerde bazı avantalara ve ileri jenerasyonlara geçişini sağlayan küçük değişimlere neden olmaktadır. S.aureus virulans faktörlerinin büyük çeşitliliğini göstermektedir. Bu faktörler 3 ana kategoride toplanmıştır11; 1. Bağlanma: Virülans faktörleri efektif olarak bakterinin konağa tutunmasını ve bağlanmasını sağlamaktadır. 2. Konak savunmasından kaçış: Virülans faktörleri immün cevabı önler veya immün cevabının etkilerini azaltmaktadır. 3. Doku invazyonu: Virülans faktörleri belirli bir biçimde konak dokusuna saldırır ve zarar verir. Konağa başarılı bir şekilde bağlanmak için bakteri, proteinler üretmektedir. Bu proteinler konak hücrelerin üzerinde bulunan spesifik proteinleri hedef almaktadır. Bağlanma proteinleri bakteri hücre duvarından hücre membranı dışına salınmaktadır. Bakteriler bu proteinleri yaparken boşa enerji harcamamaktadır. Vücut saldırılardan korunmak için birçok savunmaya sahiptir. Deri, müköz membranlar ve burundaki kıllar vücudun savunma sistemlerinden bazılarıdır. Bu fiziksel bariyerler çeşitli yollarla zarar gördüğünde immün sistemin antikorları ve beyaz kan hücreleri bakterilere karşı önemli bir savunma hattı oluşturmaktadır11,48. Bir konakta infeksiyona karşılık verme yollarından birisi, bakteri membranında küçük delikler açabilen yağ ve yağ asitlerinin üretilmesidir. Đnsan immün sisteminde antikorlar ana savunma hattıdır. S.aureus bu savunma sisteminden kaçmak için kendini geliştirmiştir ve bu immün cevabı baskılayan virulans faktörleri üretmektedir. Örneğin S.aureus diger proteinleri kesen enzimler salmaktadır. Proteazlar olarak adlandırılan bu enzimler antikoları bağlamaktadır ve direkt olarak bunların aktivitelerini kesmektedir. S.aureus ‘Protein A’ olarak bilinen antikorları bağlayan sinsi bir protein üretmektedir. Bakteri, hücre dışına salgılanan Protein A ve hücre duvarına bağlı Protein A’ya sahiptir. Salınan Protein A kompleman ve antikorları bağlamaktadır. Bu, fagositoz için bakterilere bağlanamaması amacı ile hem kompleman hem de antikorları tüketmektedir. Ayrıca dışarı salgılanan Protein A, bakteriye önceden 26 bağlanmış herhangi bir antikoru da bağlamaktadır. Protein A, bakteriyi fagositik beyaz kan hücrelerinden ve diğer antikorlardan gizlemek için bir kamuflaj olarak çalışmaktadır. Hücre duvarına bağlı Protein A, bakterinin etrafındaki herhangi bir antikora bağlanabilir. Ayrıca beyaz kan hücreleri ve kompleman tarafından fark edilmez. Bu, bakterinin etrafını saran alandaki spesifik ve spesifik olmayan antikorları tüketmektedir (Şekil 2.12). Protein A’dan yoksun mutant S.aureus suşları daha az virülandır ve fagositoz ile daha kolay tahrip edilir11. Şekil 2.12. Protein A’nın Etkisi S.aureus, bakterinin konak immün sisteminden kaçışını sağlayan Protein A’yı salgılamaktadır. Protein A olmadan bakteri antikorlar tarafından tam olarak fark edilmektedir (a). Bakteri hücre duvarındaki Protein A, beyaz kan hücrelerinin ürettiği antikorların bakteriye yanlış bağlanmasını sağlamaktadır (b). 27 Protein A, direkt olarak antikor bağlayan B hücrelerine bağlanır ve hücre ölümüne neden olur. Bu, hem spesifik antikor üretimini hem de tekrarlayan infeksiyonların önüne geçmek için çalışan Memory Hücrelerinin oluşumunu önlemektedir. Yine bu konu S.aureus infeksiyonlarının neden çok yaygın olduğunu dolaylı olarak açıklamaktadır. 2.4. Toplum ve Hastane Kaynaklı Enfeksiyonlar Staphylococcus aureus, hem toplum hemde hastane kaynaklı infeksiyonların ana nedenlerinden biridir. Muhtemelen dünya genelinde hastane kaynaklı infeksiyonların en yaygın tek nedenidir54. Toplum kaynaklı infeksiyonlar hakkında elde edilen bilgilerin daha az olmasına rağmen, deri ve yumuşak doku infeksiyonları, bakteriyemi ve endokarditin yaygın nedenidir. Yaygın patojenler arasında neredeyse benzersiz olan S.aureus, epidemiyolojik hareket ve değişen klinik belirtilerin şaşırtıcı bir hikâyesine sahiptir. Toksik Şok Sendromu (TŞS)’nun ani çıkışı, antibiyotik direnci ve virulansın paralel devam eden evrimi iki örnektir62. Stafilokok, normal konakta deri ve yumuşak doku infeksiyonları, osteomiyelizit ve bakteriyeminin en yaygın sebebi olarak tanımlanmaktadır. Toplum kaynaklı bakteriyemi sebebinin son birkaç araştırmasının olmasına karşın S.aureus, sık izole edilen türdür ve belirgin mortalite, morbidite ile ilişkilidir55,56. Çoğu S.aureus infeksiyonu, deri apseleri veya selülitlerin küçük kısmı olmasına rağmen, ciddi sistemik toksisite ve bir ani ölüm ile ilişkili ciddi infeksiyonlar nadir değildir. En deneyimli doktorlar, küçük lokal bir infeksiyondan bakteriyemi ve endokardit gelişen veya stafilokokal pnömoni olabilen ve birkaç günde ölebilen bir veya daha fazla genç hastayı hatırlarlar. Hızlı ilerleyen ve ölümcül enfeksiyonlar, Panton-Valentine leukocidin (PVL) taşıyan izolotların neden olduğu toplum kaynaklı metisiline dirençli S.aureus enfeksiyonları ile enfekte normal genç bireylerde görülmüştür57. Hastanede yatan hastalarda Stafilokokal infeksiyon, yüzyılın üzerinde major ilgi odağı olmuştur. 1880’lerde organizmanın isimlendirilmesinden önce dahi, gram pozitif kok grupları enfekte yaralarda iltihabın olağan nedeni olarak tanımlanmıştır. Aseptik teknik bileşimlerinin tanımı, ameliyat sonrası enfeksiyonların sıklığını azaltmaya yardımcı olmuştur. Penisilin ve Sulfonamidlerin kullanılması, bu enfeksiyonların 28 sıklığında çarpıcı azalmanın gözlenmesi ile takip edilmiştir. Fakat 1950’lerde septisemik penisilinin (örneğin metisilin veya oksasilin) kullanıma girmesinden önce Stafilokoklar, Amerika Birleşik Devletleri hastanelerinde majör problem olmuştur62. Hastane kaynaklı bir patojen olarak MRSA’nın teşhisinden uzun süre önce S.aureus, sağlık hizmetlerinde majör problem olmuştur. 1980’lerde Ulusal Nazokomiyal Enfeksiyon Araştırma verilerinin incelenmesi, S.aureus’un daima hastanelerden en sık kazanılan patojenlerden biri olduğunu ve cerrahi yara enfeksiyonlarının en yaygın nedeni olduğunu göstermektedir. S.aureus, hastane kaynaklı pnömoni, apseler, diğer yumuşak doku enfeksiyonları ve bakteriyeminin en sık nedenlerinden biri olarak tanımlanmıştır58. 2.5. Stafilokokal Enfeksiyonların Epidemiyolojisi Stafilokokal infeksiyonların nasıl geliştiğinin anlaşılmasındaki temel, bu organizmanın yaşamsal özelliklerinin bir değerlendirmesidir59. Doğumdan hemen sonra çoğu bebeğin ön burun deliklerinde S.aureus kolonize olmaktadır. Yetişkin ve normal bireylerin %20’den %45’e değişen oranda burun deliklerinde bu organizmayı taşıyacaklardır. Enjektör kullanan insanlar (insülin kullanan ve uyuşturucu kullananlar) diğer bireylere göre daha yüksek taşıyıcılık oranına sahiptirler. Taşıyıcı durumu, bir deri yırtılması veya yaralanmaya bağlı meydana gelen infeksiyonların gelişmesi ile ilişkili olmak için iyi bir şekilde belgelenir. Nazal bölgede S.aureus’un kolonize olduğu bir hastada cerrahi bir işlemden sonra stafilokokal bir infeksiyonun gelişme riski, kolonizasyonun olmadığı hastalardan daha yüksektir60. S.aureus’ un meydana getirdiği Bakteriyemili hastalar genellikle kandan kazanılan aynı suş ile nazal bölgede kolonizedir61. Taşıyıcılık kompleks bir konudur ve geniş çalışma yapılmıştır. Bazı bireyler de kronik olarak kolonizasyon varken diğerleri aralıklı olarak taşıyıcıdır. Kronik kolonizasyona sahip bireyler ( sürekli taşıyıcılar ), cerrahi bir süreci izleyen infeksiyonların gelişimi için en yüksek riske sahiptirler. Nazal kolonizasyona ek olarak Stafilokokların, kütanöz yara gibi periton kolonizasyonu vardır. Kolonizasyon yaygın olarak boğazda olmasına rağmen, bunun önemi tan olarak anlaşılır değildir. Ev halkı ile birlikte yaşayan hayvanlarda S.aureus’u taşıyabilir ve S.aureus’un neden olduğu bazı aile içi salgınlarında bu durumun önemli bir rolü vardır62. 29 Hastanede çalışan çoğu birey nazal kolonizasyona sahip olabilir. Bu sağlık çalışanları genellikle organizmaları parmak uçları ile taşırlar. Bunun, cansız çevre ve diğer hastalardan bulaşan kontamine eller ve nazal kolonizasyonun bir sonucu olabileceğine inanılmaktadır. Sağlık çalışanlarının elleri ile hastalar arasında Stafilokok geçişi, sağlık kurumlarının çevresinde yayılmış bu organizmalarda sık karşılaşılan bir durumdur. Bu infeksiyonların önlenmesi, dikkatli bir şekilede ellerin yıkanması veya sağlık çalışanları tarafından temizlenmesi ile mümkündür. Birçok bakteri gibi Staphylococcus aureus, yapısal ve enzimatik bileşenlerin çeşitliliğine sahiptir. Bu organizma için en iyi verimliliği sağlamaktadır. Antibiyotikler yokken antibiyotik direncini sürdürmeye gerekte yoktu. 2.6. Metisiline Dirençli Stapylococcus aureus MRSA ilk kez, 1960’larda Boston şehir hastanesinden rapor edilen bir salgında, Amerika’da tanımlanmıştır. Bu dirençli koklar şu anda çoğu Avrupa hastanelerinde tespit edilmiştir63. Majör Avrupa hastanelerine bu dirençli suşlar daha önceden yerleşmiştir. 1975’te özellikle hastaneler, yanık üniteleri ve eğitim hastanelerinden düzenli olarak MRSA salgınları rapor edilmiştir64. O zamandan beri Amerika Birleşik Devletlerinde hastanede yatan hastalarda MRSA görülme sıklığı sürekli artış göstermiştir. Kurumsal ve coğrafik değişimler olmakla beraber, hastaneler ve diğer sağlık kuruluşlarında (örneğin; huzur evleri vs) bu organizmanın görülme sıklığı belirgin olarak artmaktadır. Az sayıdaki görüşlere rağmen MRSA’nın bir patojen olarak daha duyarlı S.aureus’un yerine geçmemiş olması şaşırtıcıdır65. Sağlık kuruluşlarına ait enstitüler, metisiline duyarlı suşların neden olduğu hastane kaynaklı S.aureus infeksiyonlarının bir taban seviye miktarına sahip olmak için üzerine durmaktadır. MRSA’nın neden olduğu infeksiyonlar bu taban seviyesi için katkıda bulunmaktadır. Böylece, MRSA ile karşılaşılan problemlerden önce, S.aureus’un neden olduğu nazokomiyal infeksiyonların %15’ine sahip bir kurum, aşağıdaki yıllarda, duyarlı S.aureus’un neden olduğu nazokomiyal infeksiyonların %15’i ve ilaveten MRSA’nın neden olduğu infeksiyonların %15’ine sahip olmalıdır54. 30 Tablo 2.1. Toplum kaynaklı ve nazokomiyal infeksiyonların bir nedeni olarak S.aureus’un gelişimi. Anahtar: siyah kare, nazokomiyal enfeksiyon; gri kare, toplum kaynaklı infeksiyon54. Amerika Birleşik Devletleri hastanelerinden 2000 ve 2001 yıllarında taburcu edilen hastaların yaklaşık %1’inin S.aureus infeksiyonlarına maruz kaldığı rapor edilmiştir. Bu hastaların üç kez uzun süre hastanede yattıkları ve stafilokokal olmayan hastaneden yatan hastalarla karşılaştırıldığında hastane ölüm riskinin 5 kez daha fazla olduğu bulunmuştur66. Đlk kez 1950’lerde görülen penisiline dirençli stafilokoklar, hastanelerdeki hastalardan izole edilmiştir. Fakat daha sonraki birkaç yılda bu organizmalar, toplum kaynaklı infeksiyonlarda da penisiline duyarlı stafilokokların yerini almaya başlamıştır. Son zamanlarda benzer bir süreç MRSA ile cereyan etmiştir. Bu izolatların büyük ölçüde akut tedavi hastanelerinde görülmelerine karşın, yine bu izolatlar son 10 yılda toplum kaynaklı stafilokokal infeksiyonlar arasında sık görülen suşlar olmuşlardır. Böylece 2007’de bir sivilce veya enfekte bir yara ile acil servis ya da yoğun bakıma gönderilen bir hastadan MRSA izole edilebilme olasılığı yüksektir. Toplum kaynaklı MRSA, hastanelerden kazanılan izolatlardan çeşitli biçimlerde farklıdır. Bunun nedenlerinin kompleks olması ve tam olarak anlaşılır olmamasına rağmen metisilin direncinin genetik faktörleri, epidemiyolojik virulansa sahip S.aureus 31 suşları içine nakil edilmiştir. Bu suşlar, normal bireylerde ciddi akut infeksiyonlara neden olabilmek için gerekli virulans faktörlerine sahiptir. Ayrıca suşlar, bireyler arasında efektif olarak yayılımayı sağlayan farklı genetik bilgileri de taşımaktadırlar. Epidemiyolojik ve klinik virulansa sahip metisiline dirençli suşların genetik faktörlerinin eklenmesi ile (Stafilokokal Kromozam Kaseti tarafından taşınan MecA elementi), tedavi için çok daha problemli olmuştur. Ayrıca bu toplum kaynaklı MRSA’lar hastanelerde birkaç infeksiyon salgını ile ilişkilendirilmiştir62. 2.7. MRSA’nın Epidemiyolojisi Metisiline dirençli S.aureus (MRSA), sağlık hizmetlerine ait kuruluşlarda67 ve çok yakın geçmişte toplum kaynaklı infeksiyonların major nedenidir68,69. MRSA ilk kez, penisiline dirençli S.aureus infeksiyonlarının tedavisi için metisilinin çıkışından 2 yıl sonra 1961’de rapor edilmiştir70.71. Yoğun infeksiyon kontrol çabalarına rağmen S.aureus suşları arasında metisilin direnci sürekli artmıştır. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinin [Centers for Disease Control and Prevention (CDC)] Uluslar arası Hastane Kaynaklı Đnfeksiyon Gözetim Merkezi [National Healthcare-associated Infections Surveillance (NHIS)] verileri, hastane kaynaklı S.aureus izolatlarının %50’sinin şu anda metisiline dirençli olduğunu göstermiştir. S.aureus’taki direnç eğrileri şekil 2.2’de görülmektedir72. Multidrug-rezistant stafilokok suşlarının sıklıkla dünya genelindeki artışı rapor edilmektedir. Bu izolarlar, metisilin, makrolitler, linkosamidler, aminoglikozitler, kinolonlar veya bu antibiyotiklerin kombinasyonuna dirençlidir73. Vankomisne orta derecede dirence sahip S.aureus suşlarının son günlerdeki çıkışları rapor edilmiştir. MRSA infeksiyonları hastanede yatış süresinin uzaması ile ilişkilidir74,75,76. Ayrıca bazı çalışmalar MRSA infeksiyonları ile artan mortalite oranını rapor etmiştir77,78. 32 Tablo 2.2. Hasta yerlerine göre MRSA eğrileri (1998–2005). —■—, tüm hastalar; —♦—, yoğun bakım servisi hastaları; —●—, hastanede yatan hastalar; — ▲—, ayakta tedavi edilen hastalar. Hastane ve toplum kaynaklı MRSA’ların yayılımının kontrolü kesinlikle gereklidir. MRSA infeksiyonu ve kolonizasyonunun epidemiyolojisi ve tabiat bilgisinin anlaşılması, kontrol ve önleme amacı ile tasarlanan etkili stratejiler için gereklidir79,80,81. 2.8. MRSA ve Staphylococcus aureus Đle Kolonizasyon Popülâsyonun yaklaşık %30’u S.aureus taşıyabilir, burun veya deride genellikle metisiline duyarlı suşlar bulunabilmektedir59. S.aureus’un ön burun deliklerindeki kolonizasyonu invaziv infeksiyon için bir risk faktörü olduğu gösterilmiştir. Son çalışmalar, 14 hastanın 12’sinde bakteriyemiye neden olan suşlar ile önceden ön burun deliklerinden alınmış suşların benzer olduklarını göstermiştir61. S.aureus taşınım faktörleri konağı, mikrobiyol ve çevresel faktörleri içermektedir. Çeşitli tedavi merkezlerinde yürütülen çalışmalar, %1 ve %12 arasında değişen bir MRSA taşınım prevalansını göstermektedir82,83,84. Genellikle çoğu toplum kaynaklı infeksiyon üç adımlı bir prosestir: 1- Potansiyel bir patojen tarafından hastanın deri veya mukozasında kolonizasyon, 2- Lokal infeksiyon üretebilen bir bölgeye patojenin erişmesi, 3- Đnvaziv veya cerrahi aygıtlar tarafından lokal konak savunmasının bozulması, invaziv infeksiyonların beslenmesi85. 33 Muhtemelen MRSA ile kolonize hastaların tanımlanması, tedbirlerin acilen uygulanması için bir anahtardır. Jernigan ve arkadaşları, hastane kaynaklı MRSA bulaşmasının oranının günde 0.14 bulaş olduğunu tahmin etmektedir86. Tedbirlerle bu oran 16 kat düşmüştür. Bir akut tedavi hastanesine girişte MRSA’nın kazanılması veya taşınması için birkaç risk faktörü belirtilmiştir. Bunlar gerçek hastalarda risk faktörler içinde geniş bir şekilde kategorize edildi87,88 ( örneğin, cinsiyet, ileri yaş ve antimikrobiyallere maruz kalma, invaziv aletlerin kullanılması ve bir kurumda MRSA’nın yayılmasının temeli gibi dış kökenli risk faktörleri). MRSA kolonizasyonuna karşı bir koruma faktörü metisiline duyarlı S.aureus kolonizasyonudur. MRSA taşınımında harekete geçirici gücün tam olarak anlaşılmamasına karşın, MRSA ile kolonizasyonu izleyen invaziv infeksiyonların riski metisiline duyarlı S.aureus ile kolonizasyonu izleyen infeksiyon riskinden daha büyüktür82,89,90,91. Bu çalışmaların sonuçları tablo 2.3.’te sunulmuştur. Tablo 2.3. MRSA ile MSSA karşılaştırmasında kolonizasyonu izleyen infeksiyon riski MRSA ile kolonize hastaların sayısı MSSA ile kolonize MRSA ile infekte hastaların sayısı hastaların sayısı MSSA ile infekte hastaların sayısı Olasılık Oranı %95 Güvenilirlik aralığı 63 84 24 8 5.85 (2.25–16.31) 26 137 5 2 16.07 (2.37–173.81) 32 44 8 2 7.0 (1.23–71.06) 20 141 3 6 3.97 (0.58–20.50) Toplumda MRSA kolonizasyonunun yayılımı çok daha düşüktür. Ulusal Sağlık ve Besin Kontrol Araştırması’nın [National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES)] verilerini kullanarak yapılan bir çalışma, MRSA kolonizasyonundaki yayılmanın Amerika Birleşik Devletlerinde %0.84 olduğunu göstermiştir92. 2.9. MRSA Yayılımı için Risk Faktörleri Öncelikli hastane kurumları ile teması yansıtan fikir ayrılıkları, girişte MRSA taşınımı ile ilişkilendirilir. Girişte MRSA taşınımı ile öngörülen hastalar için bir risk indeksi, aşağıdakilerden herhangi birinin bulunması olduğu bulunmuştur. Bunlar; yaşı 34 80’den büyük olmak, 12 aydan fazla hastanede tedavi görmek, 6 aydan fazla antibiyotik kullanmak, üriner sistem sondalarının kullanımıdır93. 697 hastanın olası bir çalışmasında Furuno ve arkadaşları, MRSA ile kolonize hastaların tanımlanmasında, önceki yılda bir hastane kabulünün hastanın kendi raporunun %76 sensitiviteye sahip olduğunu bulmuştur83. Amerika’nın Epidemiyolojisi için Sağlık Hizmetlerinden yönergeler, periyodik olarak hastane kalma süresince ve girişte, nazal kültürlerle MRSA taşınımında yüksek riskli hastaların araştırılmasını tavsiye etmektedir94. Hasta odasına girmeden önce steril elbise ve eldiven kullanılmasını içeren tedbirler, kolonizasyonu olan hastalar için başlatılmaktadır. 2.10. Klinik Đnfeksiyonlar 2.10.1. Deri ve Yumuşak Doku Đnfeksiyonları S.aureus vücudun herhangi bir organ veya dokuyu infekte edebilmektedir. Deri, yumuşak doku ve kemik infeksiyonları en sık görülenlerdendir. Bu infeksiyonlar lokalize bir infeksiyondan sellülit, impetigo, follikülit, fronkül, karbonkül ve cerrahi yara infeksiyonları gibi daha genel infeksiyonlara sıralanabilmektedir. Stafilokokal kemik iliği iltihabı (osteomyelitis) tipik olarak genç çocuklarda bakteriyeminin sonucudur. Septik Burşit ise diğer stafilokokal infeksiyonlar arasındadır. S.aureus infeksiyonlarından bazılarının TSS’nin gelişimi ile ilgili olabilmesine rağmen günümüzde bu hastalık ile çoğu hasta deri ve yumuşak doku infeksiyonlarına sahiptir. Aslında S.aureus ile vajinal kolonizasyona sahip kadınlarda tampon kullanımının bir komplikasyonu olarak rapor edilmiştir62. 2.10.2. Sistemik Đnfeksiyonlar 2.10.2.1.Bakteriyemi ve Endokardit Geniş çaplı çalışmalar S.aureus’un bakteriyemi vakalarının %15–25’inden sorumlu olduğunu göstermiştir55. Toplumda bu infeksiyonun geliştiği bireylerde, damar yetmezliği ve insülin bağımlı diyabet, stafilokokal bakteriyeminin artışı ile yakından ilişkilidir. Hastanede yatan hastalarda genellikle izleme cihazları ve kateterlerden kaynaklanan hastalıklar gösterilmektedir. Etkili antibiyotik kullanımında dahi S.aureus 35 bakteriyemisi ile hastalarda ölüm oranı %5 ile %30 arasında sabit kalmaktadır. Yaşlılık ve diğer ciddi hastalıklarında bulunması önemli risk faktörleri arasındadır. Kateterin erken uzaklaştırılması dahil bakteriyemi kaynağının bulunması ve belirlenmesi zorunludur. Staphylococcus aureus, akut bakteriyel Endokarditis’in en sık nedenidir. Hastane ya da toplum kaynaklı olabilmektedir. Bunlar arasında birçok vakanın hastane çalışanlarından kazanıldığı bildirilmiştir95. Ayrıca Staphylococcus aureus, daha önceden kalp kapağı ile ilgili rahatsızlığı olmayan bireylerde ölümcül infeksiyonlara da neden olabilmektedir. Genelde bu infeksiyonlar kalbin sol tarafında oluşmaktadır ve tedavi için kalp kapağının değişmesi gerekmektedir. Stafilokokal kalp infeksiyonlarının belirlenmesi için kan kültürü ve kalp grafiği yapılması gerekmektedir97. Tedavi edilemeyen S.aureus bakteriyemisi metastatik infeksiyonlarla ilişkilidir. Hatta hastaların karaciğer, dalak ve kas dokularında apselere neden olabilmektedir. 2.10.2.2. Pnömoni S.aureus pnömonisi önceleri daha az sıklıkta tanımlanmıştır ve ilk olarak influenza’nın bir komplikasyonu olarak görülmüştür. 1918’lerde genç bireylerdeki influenza pandemilerinden elde edilen kayıtlarda ölümlerin çoğu S.aureus’un yol açtığı bakteriyel süper infeksiyonlar ile ilişki kurulmuştur. Son yıllarda, PVL toksini üreten S.aureus izolatları sağlıklı genç bireylerdeki pnömoni gibi deri ve yumuşak doku infeksiyonları ile ilişkilendirilmiştir96. PVL beyaz kan hücrelerini hızlı bir şekilde parçalayan toksindir. Ayrıca bu suşlar, diğer virülans faktörleri ve toksinlerini de içerebilmektedir. Sonuç olarak bu infeksiyonlar yüksek ölüm oranlarına sahiptir. 2.10.2.3. Septik Artrit S.aureus, erişkinlerdeki non-gonokokal artrit ve çocuklardaki septik artrite neden olan en sık etkendir117. Septik artrit, lokal travma gibi durumlardan sonra hematojen veya iyatrojenik olarak meydana gelebilir. Semptomlar akut ağrı ve eklem şişmesi olarak görülmektedir. Birkaç gün içinde bireylerdeki bakteriyel infeksiyonlardan dolayı eklem yıkımı gerçekleşir. Bu durumlardan dolayı hastalara hemen kültür, kan ve biyokimyasal testler uygulanır118,121. 36 2.10.2.4. Septik Bursit Septik bursit çoğunlukla dirsek ve diz kapağı gibi bölgelerde görülmektedir. Hastalık eklemlerdeki akut bir infeksiyon olarak tanımlanmaktadır. Eklem üzerindeki deri genellikle iltihaplanmıştır. Artrit ve osteomyelitin aksine septik bursitte eklem üzerini örten deride hareket veya baskı durumlarında ağrı oluşmamaktadır. Septik bursit olgularının %80’inden çoğu S.aureus infeksiyonlarından dolayıdır119,121. 2.10.2.5. Pyomiyozit Pyomiyozit, ilk önceleri tropikal miyozit, infektif miyozit ve piyojenik miyozit olarak isimlendirilmiştir. Nadir olarak görülen bir kas infeksiyonudur. Afrika ve Güney Pasifik’te sık görülürken Kuzey yarımkürede nadirdir. Pyomiyozit vakalarının yaklaşık %80’i S.aureus infeksiyonlarından dolayıdır120,121. 2.10.2.6. Osteomyelit Osteomyelit çok eskiden beri bilinmektedir. Vakaların %50-70’ine S.aureus infeksiyonları neden olmaktadır. Bakterinin kemikte meydana getirdiği infeksiyonlar sonucu bu hastalık meydana gelmektedir. Antibakteriyel tedavilerin uygulanmasından sonra hem ölüm hemde osteomyelit yaygınlığında önemli bir azalma görülmüştür112,113,114,115,116. 2.10.3. Toksinle Đlişkili Đnfeksiyonlar 2.10.3.1. Haşlanmış Deri Sendromu Haşlanmış deri sendromu yüzeysel bir deri infeksiyonudur. Đlk kez Alman Doktor Baron Gotfried Ritter von Rittershain tarafından 1878 yılında tanımlanmıştır104. Bazen “Ritter’in hastalığı” olarakta anılmaktadır. Tipik olarak S.aureus’ta bulunan eta ve etb genlerinin kodladığı Eksolyatif toksin A veya B’den (ETA-ETB) biri ile meydana gelmektedir. Bu genler faj veya plazmid üzerinde bulunmaktadır102. Haşlanmış deri sendromu sık sık klonal olarak ilişkili suşlar tarafından kreşlerde küçük epidemilere yol açmaktadır. Organizma sağlık çalışanları ve bakıcılar tarafından taşınabileceği için tüm çalışanların araştırılması gerekmektedir. 37 Toksin keratinize edilmiş stratum granulozum tabakasına direkt etki etmektedir. Mukoza dâhil edilmemektedir. Tutulan deri bölgesinde mikroorganizma yoktur. Toksin yüzeysel olarak tüm vücuda yayılır ve haşlanmış bir deri görünümü meydana gelir. Deriye dokunulduğunda hemen dökülme gerçekleşir. Meydana gelen kabarcıklar içindeki sıvı temizdir. Hastalık 4-7 gün içinde kendiliğinden düzelir. Tedavide spesifik antibiyotikler de kullanılabilir100,105,106. 2.10.3.2. Toksik Şok Sendromu Toksik şok sendromu (TŞS), 1927 yıllında stafilokokal kızıl ateşi olarak rapor edilmiştir107. 1980’li yılların başında mensturasyon sırasında tampon kullanan genç bayanlarda stafilokokal TŞS’nin ciddi bir şekilde arttığı görülmüştür108. Hastalığın toksijenik suşlar tarafından üretilen Toksik Şok Sendrom Toksin-1 (TŞST-1) tarafından meydana geldiği gösterilmiştir. Đki klinik şekilde meydana gelmektedir; 2.10.3.2.1. Menstural Toksik Şok Sendromu Menstural dönemin başlangıcı veya bitimi sırasındaki 2 gün içinde hastalık meydana gelmektedir ve bu durum tampon kullanımı ile ilişkilidir. Klinik olarak belirtileri yüksek ateş, hipertansiyon ve hipoalbüminemi ile kaçış sendromu hastalığı (capillary leak syndrome) ve kızamık benzeri kaşıntıyı içermektedir. Toksin lokal olarak üretilir ve kan kültürleri tipik olarak negatiftir101,103,121. 2.10.3.2.2. Nonmenstural Toksik Şok Sendromu Nonmenstural TŞS, menstural TŞS’den daha az ilgi çekmiştir. TŞST-1’e ek olarak nonmenstural TŞS, agr geni tarafından düzenlenen enterotoksin SEB ve SEC’den dolayı olabilmektedir. Sorumlu organizmalar, cerrahi yara (cerrahi TŞS), akciğer (influenza ile ilişkili TŞS) ve diyalize bağımlı hastalarda diyaliz kateterlerinin bulunduğu vücudun herhangi bir bölgesinde kolonize olabilir. Deri kaşıntısı ve yüksek ateş gibi genel semptomların meydana gelmesi hastalarda nonmenstural TŞS’nin olabileceği ihtimalini düşündürmelidir109,121. 38 2.10.3.3. Besin Zehirlenmesi S.aureus, kusma ve ishal gibi gastrointestinal semptomlara neden olan SAg olarak tanımlanan 15’ten fazla egzotoksini içermektedir98,99. Bu toksinlerin çoğu potansiyel SAg aktivitesine sahip olmasına rağmen hepsi insanlarda hastalığa neden olmayabilir. Stafilokokal enterotoksin A, B, C (SEA, SEB, SEC) besin zehirlenmesi ile ilgili enterotoksinlerdir. Besin zehirlenmesi önemli bir sağlık sorunudur. S.aureus’a bağlı besin zehirlenmesi kontamine yiyecek ve içeceklerin tüketilmesi sonucu toksinlerin açığa çıkması ile olmaktadır. Hastalık sindirimden 2-6 saat sonra halsizlik, mide bulantısı, kusma, karın ağrısı ve diare ile başlar. Ateş yoktur fakat hastalık ızdıraplıdır110,111. 2.10. Tedavi Birçok kişi deri, burun ve boğaz florasında stafilokokları barındırmaktadır. Deri stafilokoklardan temizlense bile damlacıklar ile yeniden infekte olabilir. Kıyafet ve parmaklar aracılığı ile infeksiyon bir bölgeden vücudun diğer bölgelerine yayılabilmektedir. Fronkül gibi lezyonların kontrolü için lokal antiseptik ürünler önemlidir121. Ciddi deri infeksiyonlar (akne ve fronkül) çoğunlukla adolesan dönemlerde görülmektedir. Benzer deri infeksiyonları uzun süre kortikosteroid tedavisi alan hastalarda görülür. Aknede stafilokok ve korinebakterilere ait lipaz enzimi yağlardaki yağ asitlerinin serbest kalmasını sağlamaktadır ve bundan dolayı dokuda irinli bölgeler oluşmaktadır. Bunların tedavisinde tetrasiklin uzun süre kullanılabilmektedir. Apseler ve cerrahi lezyonlar antimikrobiyol tedavide gerekli olan drenaj uygulaması ile tedavi edilir. Birçok antimikrobiyal ilaç in vitroda stafilokoklara karşı aynı etkiye sahiptir. Fakat infekte insanlardan patojenik stafilokokların tamamen temizlenmesi zordur. Çünkü mikroorganizmalar çok hızlı bir şekilde antibiyotik ajanlara karşı direnç geliştirmektedir. Akut osteomyelitte antimikrobiyal ajanlar kullanıldığında iyi sonuçlar alınmaktadır. Kronik ve rekürren osteomyelitte, cerrahi drenaj ve ölü kemiklerin uzaklaştırılması uygun ilaçların uzun süre kullanılması ile mümkündür. Fakat yine stafilokokların tamamen yok edilmesi zordur. Bu hastalıkta hiperbarik oksijen tedavisi de önerilmektedir. 39 S.aureus’un sebep olduğu bakteriyemi, endokardit, pnömoni ve diğer infeksiyonlarda bir β-laktamaza dirençli penisilinin intravenöz olarak uzun süre kullanımı gerekmektedir. Metisiline dirençli suşlarda vankomisin tercih edilmektedir. Eğer infeksiyon β-laktamaz üretmeyen S.aureus’tan dolayı ise penisilin G seçilmelidir. Fakat sadece S.aureus’ların bir kısmı penisilin G’ye hassastır. Dirençli suşların sıklığından dolayı, önemli stafilokok izolatları sistemik ilaçların seçimine yardım etmek için antibiyogram testi yapılmalıdır. Eritromisin grubu ilaçlara olan direnç çok hızlı gelişebildiği için kronik infeksiyonların tedavisinde bu ilaç kullanılmamalıdır. Plazmitler tarafından belirlenen ilaç direnci (penisilin, tetrasiklin, aminoglikozit ve eritromisine) transdüksiyon ve konjugasyon yolu ile diğer stafilokoklara taşınabilir. Klinik infeksiyonlardan izole edilen penisilin G’ye dirençli S.aureus suşları daima penisilinaz üretirler. Bu suşlar genellikle β-laktamazlara dirençli penisilinlere, sefalosporinlere veya vankomisine duyarlıdır. Metisilin direnci β-laktamaz üretiminden bağımsızdır. Metisilindeki direnç farklı ülke ve zamanlarda değişiklilik göstermektedir. Vankomisin’e intermediate düzeyde hassas olan S.aureus suşları diğerlerine nazaran daha az yaygın bulunmuştur. Ve vankomisine dirençli suşların izolasyonu nadirdir. Yaygın ilaç direnci olan ciddi stafilokokal veya enterokokal infeksiyonlu hastalarda daha yeni antimikrobiyal ajanlar olan linezolit, daptomisin ve dalfopristin kullanılabilmektedir. 40 3. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışmada kullanılan 27 S.aureus (MRSA) suşu, 2008-2009 tarihlerinde Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı hastanesi kliniklerinden Merkez laboratuvarına gönderilen çeşitli materyallerden izole edilmiştir (Tablo 3.1). Tablo 3.1.Çalışmaya Dahil Edilen Örneklerin Klinik Birimlere Göre Dağılımı Merkez laboratuvarından gelen örneklerin S.aureus olup almadığını doğrulamak amacı ile bu örnekler %5 koyun kanlı agar ve Endo agar besiyerlerine ekilerek aerop şartlarda 37ºC’de 1 gün süre ile inkübe edildi. Endo agar besi yerinde üreme olmaması ve Koyun kanlı agarda üreyen kolonilerin olması Gram (+) bakterileri tanısını koymuştur. Ayrıca koyun kanlı agarda β-hemolizin görülmesi, katalaz pozitif liği ve gram boyadaki üzüm salkımı şeklinde kümeler oluşturan gram pozitif kokların görülmesi Stafilokok olabileceği ön tanısı konmuştur. Daha sonra üreyen koloniler Mannitollü Tuz agara (chapman besiyeri) ekildi ve plazma koagülaz testine tabi tutuldu. Suşların S.aureus olduğu, koagülaz testi pozitifliği ve mannitolün kullanımına bağlı oluşan sarı rengin görülmesi ile doğrulanmıştır. S.aureus olarak tanımlanan suşların disk difüzyon metodu ile antibiyogramları yapıldı. Antibiyogramları doğrulamak amacı ile otomatize bir sistem olan Vitek 2 cihazı ile suşların tekrar antibiyogramları yapıldı. 41 Saf olarak Koyun kanlı agarda üretilen baktariler, %10 gliserol ve %10 kan içeren Triptik Soy agar saklama besiyerine alınarak -20ºC’de saklanmıştır. 3.1. Kullanılan Besiyerleri Bu çalışmada bakterilerin tespiti için rutin olarak; kanlı agar ve endo agar besiyeri kullanılmıştır. Daha ileri identifikasyon için Mannitollü tuz agar kullanılmıştır ve suşların kullanılana kadar bekletilmesi saklama besiyeri ile yapılmıştır. Antibiyotik duyarlılık testleri Müller Hinton agar (MHA) besiyerinde Kırby-Bauer disk diffüzyon yöntemi kullanılarak yapılmıştır. 3.1.a. Koyun Kanlı Agar Çeşitli klinik ve polikliniklerden gelen örneklerden S.aureus’un izolasyonu amacı ile koyun kanlı agar kullanılmıştır. Pepton (DIFCO 63928JB) 5gr Et ekstresi (MERCK 1.03979) 5gr NaCl (MERCK 1.06400) 5gr Agar (LAB M MC2) 12gr Distile Su 1000ml pH : 7.3 ± 0.2 37 gr toz besiyeri 1000ml distile suda çözülerek 121ºC’de 15 dakikada otoklavda steril edildi. Daha sonra üzerine 50ml defibrine koyun kanı eklendi. 3.1.b. Endo Agar S.aureus izolasyonu amacı ile kullanılmıştır. Et ekstresi (MERCK 1.03979) 3gr Pepton (DIFCO 63928JB) 1gr NaCl (MERCK 1.06400) 5gr Agar (LAB M MC2) 20gr Distile Su 1000ml 42 pH: 7,3 ± 0,2 Karışım 121ºC’de 15 dakikada otoklavda steril edildi. Soğuduktan sonra üzerine, %20’lik laktozdan (EGAŞ DMV) 50ml, %10 Na2SO3 (SIGMA 239321)’den 24ml ve %10 fuksin (SIGMA B0904)’den 4ml eklendi. 3.1.c. Müller Hinton Agar Müller Hinton agar, stafilokokların saflaştırılması ve antibiyotik duyarlılık testlerinin uygulanmasında kullanılmıştır (MERCK 1.05437.0500). Et infüzyonu 2 gr Nişasta 1.5 gr Kazein hidtolizat 17,5 gr Agar 12gr Distile su 1000ml pH : 7.3 ± 0.2 34 gram toz besiyeri 1000ml distile suda çözülerek 121ºC’de 15 dakikada otoklavda steril edildi. Besiyerleri hazırlandıktan sonra en geç bir hafta içinde kullanılmak üzere buzdolabında muhafaza edildi. 3.1.d. Mannitollü tuzlu agar (chapman) Mannitollü Tuzlu Agar ayırt edici ve seçici bir besiyeridir. S.aureus’un saf olarak elde edilmesi ve laboratuarda tanımlanabilmesi açısından önemli olan mannitol fermantasyonunun gözlenebilmesi için Mannitollü tuz agar kullanıldı. Et özeti 10gr Pepton 10gr Sodium chloride, NaCI 75gr Mannit 75gr Agar (LAB M MC2) 15gr Phenol kırmızısı, % 0.5 aq.sol. 5ml Distile su 1000ml 43 Agar, 500ml suda 121ºC’de 20 dakika otoklavlanarak eritildi. Et özeti geri kalan 500ml suda eritildi. pH 8.4 olacak şekilde ayarlandı, kaynar hale getirildi ve süzgeç kağıdından süzüldü. 500ml’ye tamamlandı ve pepton, tuz ve mannit eritildi. Solüsyon sıcak iken erimiş olan agar ile birleştirildi, reaksiyon kontrol edildi. Fenol kırmızısı eklendi, iyice karıştırıldı ve 121ºC’de 15 dakika otoklavda bekletildi. Yaklaşık 60ºC’ye gelince petrilere döküldü. 3.2. Kullanılan Solüsyonlar Ve Kimyasal Maddeler 3.2.1.PFGE Solüsyonları Hücre Süspansiyon Tamponu (pH 7.2) Tris-HCl (SIGMA T-3253) 1,576gr EDTA (AMRESCO 0105-500) 18,61gr NaCI 1,17gr Ultra pure su 100ml’ye tamamlandı ve pH: 7.2’ye ayarlandı. Lizis I Solüsyonu (pH:8,0) Tris-HCl (SIGMA T-3253) 0,788gr EDTA (AMRESCO 0105-500) 9,306gr NaCI 1,461gr N-lauryl Sarcosine (AMRESCO 0719-500) 2,5gr Deoxicolot 1gr Ultra pure su 100ml’ye tamamlandı ve pH: 7.2’ye ayarlandı. Lizis II Solüsyonu 250 mM EDTA (AMRESCO 0105-500) 44 18,612gr N-lauryl Sarcosine (AMRESCO 0719-500) 5gr Ultra pure su 100ml’ye tamamlandı. 0,5 M EDTA pH: 9.0’a ulaşana kadar tam olarak çözünmedi. Bu nedenle NaOH pelletleri kullanıldı. Her örnek solüsyonuna Proteinaz K (50 µg/ml) eklendi. 10xTE Solüsyonu (pH 7.6) Tris-HCl (SIGMA T-3253) 1,576gr EDTA (AMRESCO 0105-500) 0,372gr Ultra pure su 100ml’ye tamamlandı. 10xTBE Solüsyonu (pH 8.4 ) Tris-base (SIGMA T-1503) 108gr Borik Asit (MERCK 1.00165.0500) 55gr EDTA (AMRESCO 0105-500) 7,44gr Ultra pure su 1000ml’ye tamamlandı. 3.3. Yöntemlerin Uygulanması 3.3.1. Antibiyotik Duyarlılık Tesleri 3.3.1.a. Disk Difüzyon Testi 1. Đdentifikasyonu yapılan S.aureus suşları öncelikle serum fizyolojikle süspanse edildi ve bulanıklığı McFarland 0, 5’e göre ayarlandı. 2. Bulanıklığı ayarlanan bakteri süspansiyonu eküvyon aracılığı ile Müller-Hinton besiyerine ekildi. 45 3. Besiyeri üzerine Ampicillin/sulbactam (Oxoid), Clindamycin (Oxoid) Ciprofloxacin (Oxoid), Erithromycin (Oxoid), Đmpenem (Oxoid CT0455B), Fusidic Acid (Oxoid), Gentamicin (Oxoid), Oxacillin (Oxoid), Quinopristin/dalfopristin (Oxoid), Trimethoprim/ sulfa (Oxoid), Tetracyclin, Teicoplanin, Vancomycin, Rifampin ve Linezolid diskleri steril pens ile yerleştirilerek 370C’de 1 gece inkübasyona bırakıldı. 4. Đnkübasyondan sonra zon çapları ölçülerek dirençlilik ve duyarlılıkları profilleri çıkarıldı. 3.3.2. PFGE Yönteminin Uygulanması Bu yöntem Mulvey ve arkadaşlarının PFGE protokolüne göre uygulanmıştır133. 3.3.2.a. Đzolatların Hazırlanması 1. S.aureus suşlarını ilk olarak canlandırmak amacı ile %5 Koyun kanlı agara pasajlandı. 2. Daha sonra triptik soy agara, tek koloni pasajı yapılarak bir gece inkübasyona bırakıldı. 3. Saf kültür halinde üreyen koloniler plastik öze ile 1 ml hücre süspansiyon tamponu (HST) içinde süspanse edildi. 4. Hücre süspansiyonu, 13.000g’de 4°C’de 3 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrasında süpernatant atıldı (HERAEUS Biofuge Primo R). 5. Pelletin üzerine tekrar 1 ml soğuk HST eklendi ve pipetajla pellet homojen bir şekilkde dağıtıldı. 6. Bakteri yoğunluğu, spektrofotometre (CHEBIOS s.r.l) yardımı ile 590nm’de 1 absorbans (yaklaşık McFarland 4 bulanıklığı) olacak şekilde ayarlandı. 3.3.2.b. Đzolatların Agaroza Gömülmesi 1. Kalıpların hazırlandığı agaroz kalıp aparatı buzdolabına konuldu. 2. HST’dan alınan 9 ml içerisinde 0,2gr low melting agar (BIO-RAD 1613113EDU) eklendi ve mikrodalga fırında eritildi (BEKO MD1505). 46 3. Agarozdan 150µl ependorf tüplere dağıtılarak ve 50°C’deki kuru ısı bloğunda beklemeye alındı. 4. HST içinde hazırlanmış bakteri süspansiyonundan 150µl alınarak, 50°C’de bekleyen 150µl agaroz bulunan tüpe eklendi. 5. Üzerine 2µl lizostafin eklenerek karışımın homojen olabilmesi için birkaç defa pipetaj işlemi yapıldı. 6. Bekletilmeden, hücre-agaroz karışımından agaroz kalıp aparatına dağıtıldı. Kalıplar, agaroz katılaşıncaya kadar +4°C’de bekletildi. 3.3.2.c. Agaroz Đçindeki Hücrelerin Parçalanması 1. Her agaroz kalıp için 5 ml’lik steril kapaklı tüplere, 0,5ml lizis I solüsyonu konuldu. 2. Đçerisinde bakteri bulunan agaroz, kalıptan çıkarılarak lizis I solüsyonuna yerleştirildi. 3. Lizis I solüsyonuna alınan kalıplar 37°C’de 1 saat çalkalamalı su banyosunda bekletildi (MEMMERT WNE-14 WATERBATH). 4. Bu işlemin sonunda Lizis I solüsyonu dökülerek, yerine 0.5 ml hücre lizis solusyon II eklendi ve 50°C’de yarım saat çalkalamalı su banyosunda bekletildi. 3.3.2.d. Hücre Lizizinden Sonra Agaroz Kalıplarının Yıkanması 1. Lizis aşamasından sonra yumuşayan agaroz kalıplarının katılaşması için tüpler buz içerisinde en az 15 dakika bekletildi ve lizis solüsyonu döküldü. 2. Daha sonra agaroz kalıpları 50°C’de 4 ml TE tamponuyla her yıkama 15 dakika olmak üzere 3 kez yıkandı. Son olarak örnekler TE içerisine konularak 4°C’de saklandı. 3.3.2.e. Agaroz Kalıpları Đçindeki DNA’nın RE Đle Kesilmesi 1. Agaroz kalıbı bir lam üzerine alınarak bir bistürü yardımıyla 1/3 oranında kesildi. 47 2. Parçalardan biri, 100 µl 1x SmaI tamponu içine alınarak oda sıcaklığında 10 dakika bekletildi ve daha sonra bu tampon boşaltıldı. 3. Her agaroz kalıbı için aşağıdaki enzim karışımı hazırlandı. 10 µl 10x SmaI tamponu, 2,5µl SmaI enzimi (10 U /µl) (Fermentas) 1µl BSA (10 mg /ml) 86,5µl steril ultra saf su 4. Agaroz kalıbına bu karışım eklenerek çalkalamalı su banyosunda 30°C’de 2 saat inkübe edildi. 5. Đnkübasyon sonunda tüpler buzdolabında 15 dakika bekletildi. 3.3.2.f. Elektroforez Jelinin Hazırlanması ve Kalıpların Jele Yüklenmesi 1. 2 litre 0.5x TBE buffer hazırlandı ve içerisinden 100 ml ayrılarak kalan tampon elektroforez tankına döküldü. 2. Ayrılan 100ml tampon içersine 1,1 gr pulsed-field certified (BĐO-RAD) agaroz eklenerek %1,1’lik agaroz hazırlandı ve mikrodalga fırında eritildi. 3. Agaroz dökülecek kaset hazırlandı, SmaI ile kesilmiş olan agaroz kalıpların her biri tarak dişlerinin uç kısmına yerleştirildi. 4. Tarağın kenar ve ortasındaki dişlerine marker kalıplar yüklendi ve kurutma kâğıdı ile agaroz kalıplarının kenarındaki sıvının fazlası alındı. 5. Tarak kalıplarla birlikte agaroz dökülecek kaset içine yerleştirildi. 6. Agaroz dikkatli bir şekilde hava kabarcığı oluşturulmadan kaset içine döküldü (Şekil 3.1). Şekil 3.1. DNA içeren kalıpların agaroz jele gömülmesi 48 7. Oda ısısında 20 dakika katılaşmaya bırakıldı, dikkatlice tarak çekildi ve elektroforez tankına yerleştirildi. 8. Agaroz kasetinin çerçeveleri çıkarıldı ve tabla ile agaroz alındı. Daha sonra içerisinde 1900ml 0.5x TBE tamponu bulunan PFGE tankına yerleştirildi. 3.3.2.g. Elektroforez 1. CHEF-DR II sisteminde (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, Belgium) elektoforez koşulları ayarlandı (Şekil 3.4). Şekil 3.2. Agaroz jelin elektroforez tankına yerleştirilmesi BLOK-1 Başlangıç vuruş süresi 5,3 sn Bitiş vuruş süresi 34,9 sn Vuruş açısı 120° Akım 6 V/cm2 Sıcaklık 14°C Süre 20 saat 3.3.2.h. Sonucun Gözlenmesi ve Analiz 1. Elektroforezden sonra jel, 5 µg/ml etidyum bromür içeren 500 ml ultra saf su içine alındı ve 20 dakika boyandı. 49 2. UV ışığa altında görüntülendi. Gel logic 1500 imaging system (ayrım gücü: 1708x1280 pixel, Kodak Company, NY, USA) kullanılarak DNA bant görüntülerinin fotoğrafı çekildi. 3. Resimler TIFF formatında kaydedildi. GelCompar II yazılım sistemi (version 4.0; Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) kullanılarak bant profilleri analiz edildi. 3.3.2. spa Dizi Analiz Yöntemi 3.3.3.a. Đzolatların Hazırlanması ve DNA Extraksiyonu 1. S.aureus suşları canlandırmak amacı ile %5 Koyun kanlı agara pasajlandı. 2. Steril cam tüplere yaklaşık 2ml distile su eklendi. 3. Bakteriler steril öze yardımı ile toplanarak distile su içinde homojen dağılması sağlandı. 4. McFarland cihazı ile bakteri süspansiyonları McFarland 5 olacak şekilde ayarlandı. 5. Hazırlanan hücre süspansiyonlarından 500µl ependorf tüplerine alındı. 6. Sonra 8000xg’de 3 dakika santrifüj edilerek süpernatant atıldı. 7. Altta kalan pellet üzerine 500µl 1x TE tamponu eklendi. 8. Daha sonra ependorf tüpleri 100ºC’de 10 dakika ısı bloğunda tutuldu. 9. 500µl bakteri süspansiyonu olan bu ependorflara yaklaşık 150µl boncuk (sigma) konuldu. 10. 10 hızda 7 dakika Mickle (Mickle Tissue Disintegrator, Mickle Labratory Engineering Co.Ltd.) cihazında mekanik lizise uğratıldı. 11. Daha sonra 12000 xg’de 10 dakika santrifüj edildi. 12. Son olarak 200µl süpernatant alınıp yeni ependorfa aktarıldı ve çalışma yapılana kadar -20ºC’de saklandı. 50 3.3.3.b. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) DNA’nın istenilen bir bölgesinin in vitro şartlarda uygun primer ve enzimler yardımı ile çoğaltılmasıdır. PCR, reaksiyonu DNA’nın iki zincirinin yüksek ısı ile birbirinden ayrılmasını (denatürasyon), daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanmasını (hibridizasyon), sonra zincir uzamasını (polimerizasyon) ve bu siklusların belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu üç adım (denatürasyon/ bağlanma/ DNA sentezi) bir PCR siklusunu oluşturmaktadır. PZR Buffer A MgCI2 dNTP Primer F Primer R Taq DNA Polimeraz Saf Su Genomik DNA Toplam Hacim 5µl 2µl 1µl 0.4µl 0.4µl 0.25µl 35.95µl 5µl 50µl PCR şartları aşağıdaki tabloda gösterilmektedir. Döngüler başlamadan önce örnekler 80°C’de 5 dakika bekletildikten sonra her örnek için yukarıdaki kadar Taq DNA Polimeraz enzimi eklendi. Daha sonra aşağıdaki şartlar ile çalışma yapıldı. 80°C 5dk 94°C 45sn 53°C 60sn 72°C 90sn 72°C 7dk +4°C ∞ 1 Döngü 38 Döngü 1 Döngü Yaptığımız işlemlerde amplifikasyonun doğru bir şekilde yapılıp yapılmadığını test etmek için jel elektroforez yöntemini kullanıldı. 51 3.3.3.c. Agaroz Jel Elektrofozi Agaroz, deniz yosunlarından elde edilen, dallanmamış zircirli bir polimedir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Oluşam bu jel ile elektroforez adı verilen bir cihaz yardımı ile DNA molekülleri, molekül ağırlıklarına, yapılarına, elektron yüklerine ve molekül ağırlıklarına göre farklı hızda hareket ederler. Bu harekete göre küçük molekül ağırlığına sahip DNA bantları daha büyük olanlara göredaha hızlı bir şekilde hareket ederek farklılaşır. Yaptıgımız çalışmada extraksiyon ve amplifikasyonun doğru bir şekilde gerçekleştiğini test etmek amacı ile agaroz jel elektroforezini kullandık. 200ml 1xTBE ve 4gr agaroz ile %2’lika garoz jel hazırlandı. Agarozun kaynatılması ile agaroz jel hazırlandı. Oda şartlarında yaklaşık 50-60ºC’ye kadar soğuyan agaraz jel üzerine 10µg/ml konsantrasyonda Etidyum Bromür’den 10µg eklendi. Etidyum Bromür çift iplikçikli DNA arasındaki H bağları ile kompleks oluşturarak ultraviyole ışınları üzerinde florasan özellik kazandırmaktadır. Agaroz jel içerisinde Etidyum bromür iyice karıştırıldıktan sonra agar tablasına döküldü. PZR örneklerini yüklememiz için gerekli olan kuyuları oluşturak için uygun olan tarak terleştirildi. Oda ısısında katılaşan jelden tarak dikkatli bir şekilde çıkarıldı ve içerisinde 1xTBE tamponu olan tank içerisine yerleştirildi. Jel üzerindeki kuyulara 16µl örnek ile 4µl loading buffer karıştırılarak yükleme yapıldı. Örnekleri doğru bir şekilde değerlendirebilmek için de molekül büyüklükleri bilinen marker DNA’lar jelde yer alan bir kuya yüklendi. Marker ve örneklerin yüklenmesinden sonra tank güç kaynağına (biorad) bağlandı. 120 volt akımda 1 saat yürütme işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra DNA bantları jel görüntüleme sistemi ile incelenmiştir. PZR çalışmamızı doğrulamak ve daha yüksek ayrımları gerçekleştirebilmek için Origins Jel Elektroforez Sistemi (Elchrom Scientific AG) ve Hydro Hazır Jeller (Elchrom Scientific AG) kulanıldı. Sistem, ısı kontrolünü ve tampon sürkülasyonunu sağlamaktadır. Ayrıca stabil elektrik akımı sayesinde düzgün bantlar elde etmemize olanak vermektedir. Jeller hazır halde firmadan temin edilmektedir. 10 kez tekrar tekrar kullanabildiğimiz PCR CheckIT (wide mini S 2x25) jeller dayanıklı ve yüksek ayrım gücü ile daha doğru sonuçlar vermektedir. Sisteme firma tarafından verilen 40x TAE tamponu sulandırılarak yaklaşık 2 litre 1x TAE tamponu konuldu. Jel ambalajından 52 çıkarılarak tank içerisine yerleştirildi. Jel üzerindeki kuyulara 10µl örnek ile yaklaşık 2µl loading buffer karıştırılarak yükleme yapıldı. Daha sonra ElQuant™ programı kullanılarak PCR şartları belirlendi. 20°C’de 110 voltta 1 saat 43 dakika yürütme işlemi gerçekleştirildi. 3.3.3.d. DNA Dizi Analizi DNA dizi analizi, DNA örneklerindeki nükleotit baz dizilerinin (A, G, T ve C) doğru bir şekilde sırasını ortaya çıkarmak için kullanılan bir genetik şifre çözme yöntemidir. Baz dizilerinin belirlenmesi için iki temel teknik geliştirilmiştir. Bunlardan biri Frederick Sanger ve arkadaşları tarafından geliştirilmiş olan dideoksi enzimatik yöntemidir. Diğeri ise Allan Maxam ve Walter Gilbert tarafından geliştirilmiş kimyasal degradasyon (yıkım) yöntemidir. Her iki yöntem de 3 ana aşamayı kapsamaktadır. Bunlar; dizi analizi yapılacak DNA’nın hazırlanması, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezidir. Yaptığımız çalışmada, S.aureus Protein A (spa) genlerinin DNA dizi analizi otomatik DNA dizi analiz cihazıyla Đontek Firması tarafından yapıldı. Otomatik DNA dizi analizinde, Sanger tarafından geliştirilen enzimatik sentez yöntemi gelişmiş bir kapiller sisteme uyarlanmıştır. Boya terminasyon işaretleme adı verilen bir metod kullanılarak farklı bazlarda (A, G, T, C) sonlanan DNA sentez ürünlerine florasan işaretli boyalar iliştirilir. Elektroforez, örnekler bir kapillerden geçirilirken uygulanır. Floresan işaretli boyaları uyarmak için bir lazer, boyaların yaydığı ışığı toplamak içinse bir CCD kamera kullanılır. Böylece, lazer uyarımının ardından dört boya tarafından yayılan farklı dalga boylarındaki ışık tek kulvarda ayırdedilebilir. Floresan miktarlarının ölçülmesi ve yorumlanmasının ardından DNA örneğindeki baz dizisi saptanır (Şekil 3.1). 53 Şekil 3.3. DNA örneklerinde baz dizilerinin hesaplanması (http://www.iontek.com.tr) Firmanın isteği üzerine dizi analizi için gönderilen 10 örneğin spektrofotometre yardımı ile 260nm’de optik dansite de DNA miktarları ölçüldü. Elde edilen DNA dizileri StaphType yazılım programının yardımı ile spa tiplerinin belirlenmesi için kullanıldı. Elde edilen spa tipleri internet yardımı ile Ridom SpaServer adresinden diğer bilgileri elde edildi. Konu ile ilgili site editörlerinden yardım ve destek alındı. 54 4.BULGULAR Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi kliniklerinde yatan ve hastane enfeksiyonu tanısı konulmuş hastalardan izole edilen örneklerin ilk olarak S.aureus olup olmadıkları belirlendi. Bunun için koloni morfolojisi, pigment oluşumu, mikroskobik özellikleri, katalaz ve koagülaz aktiviteleri, %10 NaCI içeren besiyerinde üremeleri gibi birçok özellik değerlendirildi. Bunlara ek olarak antibiyotik duyarlılık testleri de yapıldı. Antibiyogram duyarlılık testi Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi kullanılarak yapıldı. 17 antibiyotiğe ait CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) standartlarına göre hazırlanmış antibiyotik diskleri kullanıldı (Tablo 4.1). 55 Tablo 4.1. Suşların antibiyotik duyarlılıklarına göre dağımı ve gruplandırılması H: Hassas, D: Dirençli AMP/SUL: Ampisilin/Sulbaktam, DA: Klindamisin, CIP: Siprofloksasin, E: Eritromisin, FD: Fusidik Asit, FOS: Fosfomisin, CN: Gentamisin, IPM: Đmipenem, OX: Oksasilin, Quini/Dalfo: Kuinupristin/Dalfopristin, RA: Rifampin, SXT: Trimetoprim-sulfametaksazol, TE: Tetrasiklin, TEi: Teikoplanin, VA: Vankomisin, LZD: Linezolid Yapılan antibiyotipleme sonucunda 3 küme içinde 6 farklı profil ortaya çıktı. Bunlar içerisinde en büyük kümeyi 11 (% 40.74) üye ile X kümesi oluşturmaktadır. Bu küme ile yakın ilişkili olan X1 kümesi 6, X2 kümesi 2, X3 kümesi 4 izolattan oluşurken bu alt kümeler A kümesinden 1 veya 2 farklı antibiyotik duyarlılığı ile ayrıldı. 56 Yaptığımız antibiyotiplemede suşların % 88.88’i imipeneme, %74.074’ü klindamisine, % 88.88’i moksifloksasine dirençli ve suşların % 100’ü teikoplanine hassas bulundu. En fazla üyeye sahip X kümesindeki izolatların % 100’ünün imipeneme, klindamisine ve moksifloksasine dirençli olduğu belirlendi. Diğer taraftan epidemiyolojik çalışmalarda suşlar arasında evrimsel ilişkinin tespiti ve tiplendirilmesi amacı ile kullanılan PFGE ile S.aureus suşlarının DNA analizleri yapıldı (Şekil 4.1). Şekil 4.1. S.aureus suşlarının PFGE ile elde edilen DNA bant paternleri PFGE bant profilleri, Kodak Gel Logic 1500 imaging sistemi ile görüntülenip, Gel Compar II (Applied Maths, Belgium) yazılım programı ile değerlendirildi (Şekil 4.2). 57 Şekil 4.2. S.aureus suşlarının dendogram analizi ile ilişkilendirilmesi Ayrıca PFGE yöntemi kullanarak oluşturduğumuz gruplar ile antibiyotiplemede oluşan grupları karşılaştırdığımızda; PFGE ile en büyük ilişkili grup olan A grubunun 58 tamamının antibiyotiplemedeki majör X (X, X1, X2, X3) grubu içerisinde yer aldıkları tespit edildi. PFGE’de ikinci büyük grup olan B grubunda yer alan izolatların biri hariç (MRKSa 30) tamamının antibiyotiplemedeki büyük X grubu içerisinde yer aldığı tespit edildi. spa tiplendirme yönteminde kullanılan Polimeraz Zincir Reaksiyonuna (PZR) göre suşların hemen hepsi 300bp uzunluğunda çıkarken sadece 5 tanesi 400bp uzunluğunda bulundu. Şekil 4.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Protein A’nın tespiti Yaptığımız dizi analizi sonucu elde ettiğimiz DNA dizileri ile Protein A’ya göre belirlediğimiz spa tiplerimiz StaphType yazılım programı ile MRKSA38,52, 54, 66 ve 80’in t190 ve diğerlerinin hepsinin t030 olduğu belirlendi. spa tiplendirme sonuçları ile antibiyotipleme karşılaştırıldığında sonuçların uyumlu olduğu gözlendi. spa tip t190’a ait olan MRKSA66, 52, 54 antibiyotiplemede aynı grup içerisinde ( Z ) bulunurken MRKSA80, Y gurubunda ve MRKSA 38 ise X 59 grubunda yer aldığı tespit edildi. Geriye kalan t030’ait suşların tümü büyük X grubu ve onun alt gruplarına dağılmıştır. Sonuçların PFGE metodunda elde edilen gruplara göre dağılımı incelendiğinde spa tip t190’a ait MRKSA 52 ve MRKSA80, PFGE’ye göre %70’in üzerinde benzer bulunurken sırası ile D ve E gruplarında yer almaktadırlar. Diğer 3 izolat olan MRKSA38, 54 ve 66 ise sırası ile F, J ve C gruplarında yer almaktadır. Bunlar dışında tip t030’da yer alan izolatların tamamı A, B, C, G, H, I ve J grupları içerine dağılmıştır. Çalışmamızda uygulanan üç metot arasındaki uyum incelendiğinde; MRKSA78, 79 ve 85 izolatları antibiyotiplemeye göre üçü de X3 grubunda yer alırken aynı izolatlar PFGE’ye göre A grubu içine yer aldığı ve kendi aralarında %95’in üzerinde benzer bant paternlerine sahip olduğu gözlendi. spa tiplendirme yöntemi sonuçlarına göre ise üçü de spa tip t030 olarak tespit edildi. MRKSA76 ve 77 ise antibiyotiplemeye göre X2 grubu içinde, PFGE’ye göre A grubu içinde ve aralarında %100 bant patern benzerlikleri tespit edilmiştir ve tip t030 olarak tespit edildi. Bunlar dışında MRKSA32 ve 36, PFGE’ye göre %100 uyumlu bant paternine sahip ve B grubu içinde yer alırken MRKSA31 ve 33, yine PFGE’ye göre %100 uyumlu bant paternine sahip ve B grubu içerisinde yer aldığı tespit edilmiştir. Ayrıca bu ikişerli uyumlu izolatlar (MRKSA32-36 ve MRKSA31-33) kendi aralarında da %96 uyumlu pant paternlerine sahip olduğu ve spa tiplendirmesine göre de hepsinin t030 tipi olduğu tespit edildi (Tablo 4.4). 60 Şekil 4.4. Üç çalışma arasındaki benzerlikler ve farklar 61 5.TARTIŞMA 1980’li yıllardan beri çeşitli yara ve doku infeksiyonları, bakteriyemi, pnömoni ve vücut kangrenleri ile ilişkili infeksiyonlara neden olan patojenik bir gram pozitif bakteri olarak S.aureus tanımlanmıştır122. Đnsanlar S.aureus’un doğal rezervuarıdır. Sağlıklı bireylerin çoğunda geçici veya kalıcı olarak kolonize olmaktadır ve ayrıca kolonizasyon infeksiyonlar için kolaylaştırıcı bir faktördür. S.aureus genellikle kişiden kişiye doğrudan temas ile ve nadiren çevresel kaynaklardan veya yanık ünitelerinden bulaşmaktadır6. Son yıllarda özellikle hastanelerde gram pozitif bakteri infeksiyonları önemli artışlar göstermiştir. Bu patojenler arasında S.aureus yaygın olarak nazokomiyal pinömoni ve cerrahi yaralardan izole edilmektedir123. S.aureus hem nazokomiyal hemde toplum kaynaklı kan infeksiyonlarının sebebi olduğundan beri en yaygın izole edilen patojen olmuştur6. Penisilin keşfedilene kadar S.aureus ile infekte hastalardaki ölüm oranı %80’di. 1940’ların başında S.aureus infeksiyonları penisilin ile tedavi edilmiştir. Fakat bu antibiyotiğe karşı ilk dirençli suşlar, hastanelerde ve daha sonra toplumda 1942 yılında izole edilmiştir. Bu direnç, penisilinin parçalanmasını sağlayan penisilinaz gibi enzimleri kodlayan bir plazmit tarafından meydana gelmiştir. 1960’dan beri tüm S.aureus suşlarının %80’inde penisilin direnci bulunmuştur. Buna ek olarak S.aureus suşlarında mecA geni varlığı ile metisiline, vanA geni yardımı ile de vankomisine direnç geliştiği tespit edilmiştir122,124,125. Ekim 1960 yılında araştırılan 5000 klinik izolattan sonra 6 ay içerisinde 3 tane metisiline dirençli S.aureus (MRSA) rapor edilmiştir. Bu 3 izolat fenotipik olarak aynı ve Đngiltere’nin güneyinde aynı hastaneden izole edilmiştir. Daha sonra 1967 yılında çoklu ilaç direnci görülen MRSA suşları, Đsviçre, Fransa, Danimarka, Đngiltere, Avusturalya ve Hindistan gibi ülkelerde rapor edilmiştir126. Hastane kaynaklı olan bu MRSA suşlarının daha sonra toplumda da salgınlar meydana getirmesi ile büyük bir problem olmuştur. Bu suşlar daha çok insanlarda çıbandan fronküle kadar uzanan septisemi, pnömoni ve endokardit gibi ciddi hastalara neden olmaktadır. MRSA toplum kaynaklı infeksiyonların önemli bir sebebi olmasına 62 rağmen, en önemli hastalıklar hastane kökenlidir ve çoğunlukla kateter gibi ekipmanlar ile ilişkilidir127. Çoğu bakteride olduğu gibi MRSA’nın epidemiyolojik amaçlı çalışmalarında, tiplendirme amacı ile kullanılan fenotipik ve genotipik yöntemlerin ayırım güçleri kıyaslanmış, birçok çalışmada bakteri genomundaki polimorfik bölgelerde oluşan tek nokta mutasyonlarını bile ortaya koyabilen genotiplendirme yöntemlerinin fenotipik yöntemlerden daha yüksek ayırım gücüne sahip oldukları gösterilmiştir. MRSA’nın hızlı bir şekilde yayılımının önüne geçmek için genotiplendirme metotları ile doğru bilginin elde edilmesi gerekmektedir. Bu amacı yerine getirebilmek için birçok moleküler teknik geliştirilmiştir. Bu tekniklerin başında PFGE, MLST, SCCmec ve S.aureus Protein A genine ait tekrarlayan bölgelerin tiplendirilmesini (spa tipleme) sayabiliriz122. Bu çalışmada MDR-MRSA suşlarının uzun yıllardan beri kullanılan antibiyotipleme metodu ile bu suşların klonal ilişkilerini tespit etmek için kullanılan PFGE ve spa dizi analizi yöntemi ile karşılaştırılması hedef alınmıştır. A.Hoefnagels-Schuermans ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada epidemiyolojik ve genetik olarak ilişkili olduğu düşünülen MRSA izolatlarını antibiyotipleme, Protein A geninin analizi, PFGE gibi metodlar kullanılarak analiz etmişlerdir. PFGE çalışmasına dahil edilen izolatlar DNA bant paternlerine göre 3 klonal gruba ayrılmıştır. Diğer taraftan antibiyotipleme sonucunda da 11 farklı antibiyotip tanımlamışlardır. Bunlar; antibiyotip a (11 suş), b (1 suş), c (3 suş), d (1), e (4 suş), f (6 suş), g (1 suş), h (1 suş), i (13 suş), j (1 suş), k (1 suş)’dır. 15 epidemik MRSA (EMRSA) suşlarından 7’sini antibiyotip a, 5’ini antibiyotip f ve 3’ünü antibiyotip e grupları içerisinde tanımlamışlardır. PFGE sonuçlarına göre oluşturulan klon 1 grubunda yakın ilişkili olan 10 izolatın 4’ü antibiyotip a ve 2’si antibiyotip c grubu ile uyumlu olduğunu tespit etmişlerdir. Klon 1’e ait izolatların tümümünün eritromisin, klindamisin, gentamisin ve tobramisine dirençli olduğunu tespit etmişlerdir. Đzolatların %76’sı rifampisine, %69’u ise amikasine dirençli olduğunu bulmuşlardır. PFGE’de belirlenmiş olan klon 2 grubundaki tüm izolatların antibiyotip i grubuna ait olduğunu tespit etmişlerdir. Çalışmanın sonucu olarak antibiyotiplemenin rutin çalışmalar için önemli olduğunu fakat moleküler çalışmalar kadar ayrım gücünün olmadığını belirtmişlerdir128. 63 Elsa Velazco ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada 43 S.aureus izolatının fenotipik ve genotipik yöntemler kullanarak aralarındaki ilişkileri araştırılmıştır. Bunun için antipiyotipleme, PFGE, PCR ve fajtipleme gibi bazı metotları kullanmışlardır. Çalışması yapılan 43 suşun %76.7’sinin gentamisine, %74.4’ünün eritromisine, %74’ünün tobramisine ve %72.1’inin oksasiline dirençli olduğunu bulmuşlardır. MRSA suşlarının %75’inde oksasiline karşı değişken bir dirençlilik tespit etmişlerdir. PCR metodu ile mecA geninin varlığı suşların %86.6’sında var olduğunu tanımlamışlardır. Faj tiplemesi ile oluşan tip-II grubundaki izolatların mecA geni içerdiğini tespit etmişlerdir. PFGE’ye göre suşları 3 gruba ayrılmış ve bunların tip-II faj grubu ile uyumlu olduğunu belirlemişlerdir. Sonuç olarak MRSA salgınlarını kontrol etmek ve önüne geçmek için el hijyeni, yeni doğan infeksiyonların tanımlanması, kolonizasyonların önlenmesi ve en önemlisi salgınlarda moleküler araştırmaların yapılmasını önermişlerdir129. Nuno A.Faria ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada çeşitli bölgelerden S.aureus suşları için SCCmec tiplemesi, MLST, spa tipleme ve PFGE gibi moleküler yöntemler arasındaki farklar araştırılmıştır. Bunlardan PFGE sonuçlarına göre MRSA suşlarında 32 tip ve 92 alttip, MSSA suşlarında 30 tip ve 63 alttip bulmuşlardır. Diğer bir yöntem olan spa tiplendirme yöntemi ile MRSA için 51, MSSA için ise 55 alt tip bulmuşlardır. MLST yöntemini kullanarak da suşları klonal kompleksler (CC) içerisinde gruplandırmışlardır. Simpson’un ayrım indeksini (SID) kullanarak metotlar arasındaki ayrım güçlerini incelemişlerdir. Bunlar arasında en yüksek SID’ye PFGE’in sahip olduğunu tespit etmişlerdir. Fakat PFGE tipleri ile spa tipleri karşılaştırıldığında ayrım güçlerinde benzerliğin olduğunu bulmuşlardır. MLST ve spa tiplendirme gibi metotların PFGE’ye göre daha taşınabilir olduğunu ve global epidemiyolojik çalışmalar için daha uygun olduğunu ileri sürmüşlerdir130. Strommenger ve arkadaşları yaptıkları çalışmada, MRSA suşlarını da içine alan 99 izolatın MLST, PFGE ve spa tipleme metodu ile sınıflandırmasını ve aralarındaki ilişkiyi incelemişlerdir. PFGE çalışması sonucunda Tenover ve arkadaşlarının kriterlerine göre 99 suş 74 farklı grup altında toplamışlardır. Yapmış oldukları diğer bir çalışma olan spa tiplemeye göre de izolatlar 2 (t586) ile 16 (t032) tekrarı içeren 44 farklı spa tipini tespit etmişlerdir. MLST çalışmasına göre de 22 farklı dizi tipi [sequence type (ST)] tanımlamışlardır. Yaptıkları bu çalışmalar sonunda 64 gruplara ayrılan izolatları birbirleri ile eşleştirmişler ve metotlar arasındaki avantajları ve dezavantajları kıyaslamışlardır. Bunlar içinde PFGE yönteminin S.aureus suşlarının tiplendirmesinde diğer genotiplendirme metotları ile karşılaştırıldığında altın standart olduğunu ileri sürmüşlerdir. Buna karşılık, MLST ve spa tipleme metotlarının yardımı ile elde edilen sonuçların taşınabilmesi, karşılaştırmaya uygun olması ve tekrarlanabilmesi bakımından diğer metotlara göre avantajlı olduğunu tespit etmişlerdir. Bu iki metot arasında spa tipleme MLST’ye göre daha avantajlı olduğunu bulmuşlar ve rutin çalışmalar için spa tiplemenin daha uygun olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bunların yanı sıra yaptıkları çalışmada bu 3 metottan elde ettikleri sonuçların birbiri ile uyumlu olduğunu da göstermişlerdir131. Fred C. Tenover ve arkadaşları metisiline duyarlı ve dirençli suşların karakterizasyounu için Amerika’da 4 yıl boyunca nazal kültürlerden çok sayıda suş elde etmişlerdir. Yaptıkları çalışmada suşların 14 antimikrobiyal ajana duyarlılıklarını incelemiş ve tüm MRSA-MSSA izolatlarını PFGE ile tiplendirmişlerdir. PFGE sonucunda MSSA’larda toplam 11 farklı PFGE tipi saptanırken, MRSA’larda 8 farklı PFGE tipi saptamışlardır. Ayrıca suşları topladıkları yıllara göre de ayrı sınıflandırmışlardır. MSSA suşlarında en yaygın PFGE tiplerinin USA200, USA600 ve USA900 olduğunu tespit etmişlerdir. Az bir grubun USA300 tipinde yer aldığını belirlemişlerdir. 2001 ve 2002 yılları arasında USA100, USA800 ve USA300 MRSA izolatlarının %79.2’sini oluştururken 2003 ve 2004 tarihleri arasında USA100, USA800 ve USA700 %80’ini oluşturmuştur. Ayrıca USA300 ve USA800’ü yapılan tüm çalışma süresince tespit etmişlerdir. Yaptıkları duyarlılık testine göre MRSA izolatlarındaki PFGE tipleri ile uyumluydu. USA100’deki izolatlardan bir kaçı hariç tümü eritromisine ve levofloksasine dirençliyken gentamisine, linezolite, tetrasikline, kuinopristindalfopristine duyarlı olduğunu tespit etmişlerdir. Klindamisin direncinde yıllara göre 2001 yılından 2004 yılına %32’den %33.6’ya artışı tespit etmişlerdir. Yaptıkları çalışmanın sonucunda bir PFGE tipi olan USA300’ün MRSA izolatı ile nazal kolonizasyonda 2003-2004 yılları arasında belirgin bir artışın olduğunu tespit etmişlerdir. Fakat USA100’ün hala daha baskın olduğunu ileri sürmüşlerdir132. Bu çalışmada fenotipik bir yöntem olan antibiyotipleme ile 6 farklı küme oluşurken, genotipik yöntem olan PFGE’ye göre 10 farklı ilişkide küme gözlemlenmiştir. Antibiyotiplemeye göre PFGE’deki kümelerin fazla olmasının sebebi 65 fenotipe yansımayan genomdaki nokta mutasyonları veya sessiz mutasyonlardan olabileceğini düşündürmektedir. A.Hoefnagels-Schuermans ve arkadaşlarının yaptığı fenotipik ve genotipik araştırmalardaki sonuçlarla benzer sonuçlar elde edildi. Elde ettikleri sonuçlar doğrultusunda antibiyotiplemenin rutin çalışmalar için uygun olduğu fakat yeteri kadar ayrım gücüne sahip olmaması bizim çalışmamız ile de vurgulandı. Antibiyotipleme sonucu elde ettiğimiz kümeler ile PFGE kümeleri ve elde edilen spa tiplari karşılaştırıldığında birçok izolat (örneğin; MRKSA32, 36, 31, 33, 34, 76, 77) yüksek oranlarda benzerlik göstermiştir. Bu benzerliğe bağlı olarak izolatlarda merdana gelen genotipik değişimler belirgin bir şekilde fenotipede yansımıştır. Yaptığımız çalışmaların bir sonucu olarak MRSA’nın neden olduğu infeksiyonların tanımlanmasında, kolonizasyonların önlenmesinde ve en önemlilerinden birisi olan salgınların araştırılmasında moleküler araştırmalarım yeri büyüktür. Vurguladığımız bu önem Elsa Velazco ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmanın sonucu ile de benzerdir. Ayrıca bu moleküler çalışmalarda PFGE yöntemi en yüksek ayrım gücüne sahip olduğu da tespit edildi. Bu yöntemin ayrım gücü ile spa tiplendirme yöntemi arasında benzerlikler bulundu. Sadece spa tiplendirme yöntemi PFGE’ye göre sonuçların laboratuarlar arasında taşınabilirliğinin daha yüksek ve global epidemiyoloji çalışmalarında daha uygun olduğu tespit edildi. Bu sonuca göre de Nuno A.Faria ve arkadaşları ile Strommenger ve arkadaşlarının yaptığı çalışmaların sonucuna benzer olduğu görüldü. 66 6.SONUÇLAR VE ÖNERĐLER Ç.Ü. Balcalı Hastanesinde ciddi hastane enfeksiyonlarına neden olan 27 MDRMRSA suşu 2008-2009 tarihleri arasında toplanarak fenotipik olarak incelenip, PFGE ve spa tiplendirme metodu gibi genotiplendirme metodları ile aralarındaki klonal ilişkinin tespiti amacı ile yapılan çalışmalar ve sonuçları incelendiğinde; 1. Çalışmada ilk olarak, koyun kanlı agara ekimi yapılan izolatların S.aureus olup olmadığı katalaz testi, gram boyama ve mannitollü tuz tarama testi ile belirlendi. 2. Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi kullanılarak yapılan antibiyograma göre yapılan antibiyotiplemede 3 küme içinde (X, Y, Z) 6 farklı hassasiyet profili belirlendi. En fazla üyeye sahip X kümesindeki izolatların %100’ünün imipeneme, klindamisine ve moksifloksasine dirençli olduğu tespit edildi. 3. Fenotipik bir yöntem olan antibiyotiplemenin yanı sıra önemli bir genotiplendirme metodu olan PFGE ile tespit edilen DNA bant paterlerine göre 10 farklı grup oluşturuldu (A-J). 4. PFGE ile en büyük ilişkili grup olan A grubunun tamamının antibiyotiplemedeki majör X (X, X1, X2, X3) grubu içerisinde yer aldıkları tespit edildi. PFGE’de ikinci büyük grup olan B grubunda yer alan izolatların biri hariç (MRKSa 30) tamamının antibiyotiplemedeki büyük X grubu içerisinde yer aldığı görüldü. 5. Diğer bir genotiplendirme metodu olan spa tiplendirme yöntemine göre yapılan PZR sonucunda tüm izolatların Protein A içerdiği bulundu. Dizi analizi sonucu elde edilen DNA dizileri kullanılarak StaphType yazılım programı ile 22 izolat spa tip t030 bulunurken diğer 5 izolatın t190 olduğu tespit edildi. Kullandığımız fenotipik ve genotipik tiplendirme yöntemleri ışığında PFGE, MRSA infeksiyonlarının araştırılmasında, hastaların epidemiyolojik olarak birbiriyle olan ilişkilerinin ortaya çıkarılmasında yüksek tekrarlanabilirlik ve ayrım gücü bakımından en iyi yöntemlerden biridir. Buna karşın spa tiplendirme metodunda sonuçların kolay karşılaştırılabiliyor olması ve internet yolu ile tüm dünyadaki verilere ulaşılması global salgın araştırmaları için daha uygun olduğunu sonucunu düşündürmektedir. 67 7.KAYNAKLAR 1. Haznedaroğlu T. Metisilin dirençli S.aureus (MRSA). 2009 (Erişim: http://www.gata.edu.tr/infkom/MRSA.pdf ) 2. Boyce JM, Et al. Methicillin resistant Staphylococccus aureus (MRSA): a briefing for acute care hospitals and nursing facilities. Infection Control and Epidemiology, 1994; 15(2):105-115 3. Wenzel RP, et all. Methicillin-resistant Staphylococcus autbreak: A consensus panel’s defination and management quidelines. American Journal of Infection Control, 1998: 26(2):102-110. 4. Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA. The Staphylococci. In: Jawetz, Melnick and Adelberg's medical microbiology. 24th ed. New York: McGraw-Hill, 2007. 5. Koneman EW, Allen SD, William MJ, Schereckenberger PC, Winn WC. Gram-positive cocci, Part I: Staphylococci and related gram-positive cocci. Winn WC Jr et al (editors). Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 6th ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2006: 623–71. 6. Fong IW, Kolia M. MRSA in the 21st Century: Emerging Challenges. Fong and Karl Drlica (editors). Reemergence of Established Pathogens in the 21st Century. Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York, 2003: 99-138 7. Franklin DL. Staphylococcus aureus infections. N EnglJ Med, 1998; 339:520-32. 8. Bronner S, Monteil H, Prévost G. Regulation of virulence determinants in Staphylococcus aureus: Complexity and applications. FEMS Microbiol Rev 2004; 28:183. 9. Novick RP, Schelievert P, Ruzin A. Pathogenicity and resistance islands of staphylococci. Microbes and Infect 2001;3:585. 68 10. Waldvogel FA. Staphylococcus aureus (including staphylococcal toxic shock). Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th. ed. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (editors). Churchill Livingstone, 2000. 11. Freeman-Cook L, Freeman-Cook K. Staphylococcus aureus infections. 2005: 8-118. 12. Kurt D Reed, Mary E Stemper, and Sanjay K Shukla. Pulsed-Field Gel Electrophoresis of MRSA. In Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ProtocolsEbook MRSA protocol. Yinduo Ji. 2007; 321:59-70 13. Matushek MG, Bonten MJ, and Hayden MK. Rapid preparation of bacterial DNA for pulsedfield gel electrophoresis. J Clin Microbiol, 1996: 2598–2600. 14. Maslow JN, Mulligan ME, and Arbeit RD. Molecular epidemiology: application of contemporary techniques to the typing of microorganisms. Clin Infect Dis, 1993; 17:153–162. 15. Tenover FC, Arbeit RD, Archer G. Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Stalphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 1994; 32:407–415. 16. Goering RV and Winters MA. Rapid method for the epidemiological evaluation of grampositive cocci by field inversion gel electrophoresis. J Clin Microbiol, 1992; 30:577–580. 17. Stemper ME, Shukla SK, and Reed KD. Emergence and spread of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in rural Wisconsin, 1989–1999. J Clin Microbiol, 2004. 42:5673–5680. 18. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995. 33:2233–2239. 69 19. Birren, Bruce and Lai, Eric. Pulsed Field Gel Electrophoresis: A Practical Guide. San Diego, California: Academic Press Inc, 1993: 8 20. Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, et al. Evaluation of Protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of strains. J Clin Microbiol, 1999; 37:3556–3563. 21. Guss B, Uhlen M, Nilsson B, Lindberg M, Sjoquist J, and Sjodahl J. RegionX, the cell-wallattachment part of staphylococcal Protein A. Eur J Biochem, 1984; 138:413-420. 22. Schneewind O, Model P, and Fischetti VA. Sorting of Protein A to the staphylococcal cell wall. Cell, 1992; 70:267-281. 23. Uhlen M, Guss B, Nilsson B, Gatenbeck S, Philipson L, and Lind-berg M. Complate sequence of the staphlococcal gene encoding Protein A. A gene envolved through multiple duplications. J Biol Chem, 1984; 259:1695-1702. 24. Brigido MDM, Barardi CR, Bonjardin CA, Santos CL, Junqueira ML, and Brentani RR. Nucleotide sequence of a variant Protein A of Staphylococcus aureus suggests molecular heterogeneity among strains. J Basic Microbiol 1991; 31:337-345. 25. Harmsen D, Claus H, Witte W, Rothganger J, Claus H, Turnwald D, et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J Clin Microbiol, 2003; 41:5442-8. 26. Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell JE, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant DA, Feavers IM, Achtman M, and Spratt BG. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95;3140-3145. 70 27. Professor Brian Spratt: Multilocus sequence typing. Tangible Impacts On Health 2005/2006. http://www.wellcome.ac.uk/stellent/groups/corporatesite/@msh_publishing_group/documents/web _document/wtd026694.pdf. 08.10.2009. 28. Feil E. Moleculer evolution, recombination and population structure of microbial pathogens. IMS, Imperial College. 2007. 29. Aanensen, DM and Spratt, BG. The multilocus sequence typing network: mlst.net. Nucleic Acids Res, 2005; 33:728–733. 30. http://www.mlst.net. 2009 31. Feil, EJ. Small Change: Keeping pace with micro-evolution. Nature Rev. Microbiol. 2004; 2(6):483-95. 32. Feil EJ, Li, BC, Aanensen DM, Hanage WP and Spratt, BG. eBURST: Inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence typing data. J Bact, 2004; 186(5):1518-30. 33. Armstrong D, and Cohen J. Infectious Diseases. London: Mosby, Harcourt Publishers. 1999. 34. Bassetti S, and Battegay M. Staphylococcus aureus Infections in Injection Drug Users: Risk Factors and Prevention Strategies. Infection, 2004; 32:163-169. 35. Brickner, SJ. Multidrug-resistant Bacterial Infections: Driving the Search for New Antibiotics. Chemistry and Industry 17. 1997; 131-135. 71 36. Cafferkey MT (ed). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Clinical Management and Laboratory Aspects. New York: Marcel Dekker, 1992. 37. CBS News 60 Minutes Report. Super-resistant Superbugs, 2004. Available online at https://www.cbsnews.com 38. Charlebois ED, Perdreau-Remington F, Kreisworth B, et al. Origins of Community Strains of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus. Clinical Infectious Diseases, 2004; 39:47–54. 39. Crossley KB, and Archer GL, eds. The Staphylococci in Human Disease. New York: Churchill Livingstone, 1997. 40. Eady EA, and Cove JH. Staphylococcal Resistance Revisited: Community-acquired Methicillin Resistant Staphylococcus aureus—An Emerging Problem for the Management of Skin and Soft Tissue Infections. Current Opinions in Infectious Disease, 2003; 16:103–124. 41. Evans AS, and Brachman SP, eds. Bacterial Infections of Humans. New York: Plenum Medical Book Company, 1998. 42. Evans G (ed). Antibiotic Resistance Sourcebook. Atlanta: American Health Consultants, 1996. 43. Fischetti VA. Killing Drug Resistance Pathogens: A New Strategy. New York Academy of Sciences Lecture. January 21, 2004. Available online at http://www.nyas.org/ebrief/miniEB.asp?ebriefID=249. 44. Gillespie SH (ed). Management of Multiple Drug-Resistant Infections. Totowa, NJ: Humana Press, 2004. 45. Hageman J, Pegues AD, Jepson C, et al. Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in a Home Health-care Patient. Emerging Infectious Diseases, 2001; 7:1023–1025. 72 46. Hiramatsu K. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: A New Model of Antibiotic Resistance. The Lancet Infectious Diseases 1, 2001; 147–155. 47. Honeyman AL, Friedman H, and Bendinelli M, eds. Staphylococcus aureus Infection and Disease. New York: Kulwer Academic Publishers, 2002. 48. Janeway CA, Travers P, Walport M, and Shlomchik MJ. ImmunoBiology: The Immune System in Health and Disease. New York: Garland Science, 2005. 49. Khurshid MA, Chou T, Carey R, Larsen R, Conover C, and Bornstein SL. Staphylococcus aureus With Reduced Susceptibility to Vancomycin. Morbidity and Mortality Weekly Report, 2000; 48:1165–1167. 50. Lewis K, Salyers AA, Taber HW, and Wax RG, eds. Bacterial Resistance to Antimicrobials. New York: Marcel Dekker, 2002. 51. Martin R, and Wilcox KR. Staphylococcus aureus With Reduced Susceptibility to Vancomycin. Morbidity and Mortality Weekly Report, 1997; 46:765–766. 52. Miller D, Urdaneta V, and Weltman A. Public Health Dispatch: Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. Morbidity and Mortality Weekly Report, 2002; 51:902. 53. Weems JJ. The Many Faces of Staphylococcus aureus Infection: Recognizing and Managing Its Life-threatening Manifestations. Postgraduate Medicine, 2001; 110:24–36. 54. McDonald LC. Trends in antimicrobial resistance in health care-associated pathogens and effect on treatment. Clin Infect Dis, 2006; 42:65–71. 73 55. Shorr AF, Tabak YP, Killian AD, Gupta V, Liu LZ, Kollef MH. Healthcareassociated bloodstream infection: a distinct entity? Insights from a large U.S. database. Crit Care Med, 2006; 34(10):2588–2595. 56. Kluytmans-Vandenbergh MF, Kluytmans JA. Community-acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus: current perspectives. Clin Microbiol Infect, 2006; 12(1):9–15. 57. Diep BA, Sensabaugh GF, Somboona NS, Carleton HA, Perdreau-Remington F. Widespread skin and soft-tissue infections due to two methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains harboring the genes for Panton–Valentine leucocidin. J Clin Microbiol, 2004; 42:2080–2084. 58. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System. A report from the National Nosocomial Infections Surveillance System—data summary from October 1986–April 1996, issued May 1996. Am J Infect Control, 1996; 24:380–388. 59. Wertheim HF, Melles DC, Vos MC, et al. The role of nasal carriage in Staphylococcus aureus infections. Lancet Infect Dis, 2005; 5:751–762. 60. Herwaldt LA. Staphylococcus aureus nasal carriage and surgical-site infections. Surgery, 2003; 134:2–9. 61. Von Eiff C, Becker K, Machka K, Stammer H, Peters G. Nasal carriage as a source of Staphylococcus aureus bacteremia. Study Group. N Engl J Med, 2001; 344:11–16. 62. John A Weigelt, MD. MRSA (Methicillin‑resistant Staphylococcus aureus). New York, Informa Healthcare USA, Inc, 2007. 63. Barrett FF, McGehee RF Jr, Finland M. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus at Boston City Hospital. Bacteriologic and epidemiologic observations. N Engl J Med, 1968; 279:441–448. 74 64. Crossley K, Landesman B, Zaske D. An outbreak of infections caused by strains of Staphylococcus aureus resistant to methicillin and aminoglycosides. II. Epidemiologic studies. J Infect Dis, 1979; 139:280–287. 65. Lowy FD. Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med, 1998; 339:520–532. 66. Noskin GA, Rubin RJ, Schentag JJ, et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Arch Intern Med, 2005; 165:1756–1761. 67. Panlilio AL, Culver DH, Gaynes RP, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in U.S. hospitals, 1975–1991. Infect Control Hosp Epidemiol, 1992; 13:582–586. 68. Drews TD, Temte JL, Fox BC. Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: review of an emerging public health concern. WMJ, 2006; 105:52–57. 69. Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, et al. Community-acquired methicillinresistant Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerg Infect Dis, 2003; 9:978–984. 70. Enright MC, Robinson DA, Randle G, et al. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:7687–7692. 71. Jevons MP, Coe AW, Parker MT. Methicillin resistance in staphylococci. Lancet, 1963; 1:904– 907. 72. Styers D, Sheehan DJ, Hogan P, et al. Laboratory-based surveillance of current antimicrobial resistance patterns and trends among Staphylococcus aureus: 2005 status in the United States. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2006; 5:2. 75 73. Deshpande LM, Fritsche TR, Jones RN. Molecular epidemiology of selected multidrug-resistant bacteria: a global report from the sentry antimicrobial surveillance program. Diagn Microbiol Infect Dis, 2004; 49:231–236. 74. Chang S, Sievert DM, Hageman JC, et al. Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene. N Engl J Med, 2003; 348:1342–1347. 75. Sieradzki K, Roberts RB, Haber SW, et al. The development of vancomycin resistance in a patient with methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. N Engl J Med, 1999; 340:517– 523. 76. Smith TL, Pearson ML, Wilcox KR, et al. Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. Glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus working group. N Engl J Med, 1999; 340:493–501. 77. Cosgrove SE, Qi Y, Kaye KS, et al. The impact of methicillin resistance in Staphylococcus aureus bacteremia on patient outcomes: mortality, length of stay, and hospital charges. Infect Control Hosp Epidemiol, 2005; 26:166–174. 78. Engemann JJ, Carmeli Y, Cosgrove SE, et al. Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect Dis, 2003; 36:592–598. 79. Chang FY, MacDonald BB, Peacock JE Jr, et al. A prospective multicenter study of Staphylococcus aureus bacteremia: incidence of endocarditis, risk factors for mortality, and clinical impact of methicillin resistance. Medicine , 2003; 82:322–332. 80. Ridenour GA, Wong ES, Call MA, et al. Duration of colonization with methicillin-resistant Staphylococcus aureus among patients in the intensive care unit: implications for intervention. Infect Control Hosp Epidemiol, 2006; 27:271–278. 76 81. Zahar JR, Clec’h C, Tafflet M, et al. Is methicillin resistance associated with a worse prognosis in Staphylococcus aureus ventilator-associated pneumonia? Clin Infect Dis, 2005; 41:1224–1231. 82. Davis KA, Stewart JJ, Crouch HK, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) nares colonization at hospital admission and its effect on subsequent MRSA infection. Clin Infect Dis, 2004; 39:776–782. 83. Furuno JP, Harris AD, Wright MO, et al. Prediction rules to identify patients with methicillinresistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci upon hospital admission. Am J Infect Control, 2004; 32:436–440. 84. Samad A, Banerjee D, Carbarns N, et al. Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization in surgical patients, on admission to a Welsh hospital. J Hosp Infect, 2002; 51:43–46. 85. Bonten MJ, Weinstein RA. The role of colonization in the pathogenesis of nosocomial infections. Infect Control Hosp Epidemiol, 1996; 17:193–200. 86. Jernigan JA, Titus MG, Groschel DH, et al. Effectiveness of contact isolation during a hospital outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Am J Epidemiol 1996; 143:496–504. 87. Safdar N, Maki DG. The commonality of risk factors for nosocomial colonization and infection with antimicrobial-resistant Staphylococcus aureus, enterococcus, gram-negative bacilli, Clostridium difficile, and Candida. Ann Intern Med, 2002; 136:834–844. 88. Dall’Antonia M, Coen PG, Wilks M, et al. Competition between methicillinsensitive and resistant Staphylococcus aureus in the anterior nares. J Hosp Infect, 2005; 61:62–67. 89. Fishbain JT, Lee JC, Nguyen HD, et al. Nosocomial transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a blinded study to establish baseline acquisition rates. Infect Control Hosp Epidemiol, 2003; 24:415–421. 77 90. Pujol M, Pena C, Pallares R, et al. Nosocomial Staphylococcus aureus bacteremia among nasal carriers of methicillin-resistant and methicillin-susceptible strains. Am J Med, 1996; 100:509–516. 91. Muder RR, Brennen C, Wagener MM, et al. Methicillin-resistant staphylococcal colonization and infection in a long-term care facility. Ann Intern Med, 1991; 114:107–112. 92. Graham PL III, Lin SX, Larson EL. A U.S. population-based survey of Staphylococcus aureus colonization. Ann Intern Med, 2006; 144:318–325. 93. Harbarth S, Sax H, Fankhauser-Rodriguez C, et al. Evaluating the probability of previously unknown carriage of MRSA at hospital admission. Am J Med, 2006; 119:275. 94. Muto CA, Jernigan JA, Ostrowsky BE, et al. SHEA guideline for preventing nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus and enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol, 2003; 24:362–38 95. Fowler VG Jr, Miro JM, Hoen B, et al. Staphylococcus aureus endocarditis: a consequence of medical progress. JAMA, 2005; 293:3012–3021. 96. Francis JS, Doherty MC, Lopatin U, et al. Severe community-onset pneumonia in healthy adults caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the Panton–Valentine leukocidin genes. Clin Infect Dis, 2005; 40:100–107. 97. Habib G, Derumeaux G, Avierinos JF, et al. Value and limitations of the Duke criteria for the diagnosis of infective endocarditis. J Am Coll Cardiol, 1999; 33:2023–2029. 98. Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev, 2000; 13:16–34. 99. Balaban N, Rasooly A. Staphylococcal enterotoxins. Int J Food Microbiol, 2000; 61:1–10. 78 100. Ladhani S, Joannou CL, Lochrie DP, et al. Clinical, microbial, and biochemical aspects of the exfoliative toxins causing staphylococcal scalded-skin syndrome. Clin Microbiol Re, 1999; 12:224–242. 101. McCormick JK, Yarwood JM, Schlievert PM. Toxic shock syndrome and bacterial superantigens: An update. Annu Rev Microbiol, 2001; 55:77–104. 102. Baba T, Takeuchi F, Kuroda M, et al. Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA. Lancet, 2002; 359:1819–1827. 103. Yarwood JM, McCormick JK, Schlievert PM. Identification of a novel two-component regulatory system that acts in global regulation of virulence factors of Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 2001; 183:1113–1123. 104. Von Rittershain GR. Die exfoliative Dermatitis jungere Senglinge. Z Kinderheilkd, 1878; 2:3–23. 105. Becker K, Friedrich AW, Lubritz G, et al. Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins among strains of Staphylococcus aureus isolated from blood and nasal specimens. J Clin Microbiol, 2003; 41:1434–1439. 106. Lina G, Gillet Y, Vandenesch F, et al. Toxin involvement in staphylococcal scalded skin syndrome. Clin Infect Dis. 1997; 25:1369–1373. 107. Stevens F. The occurrence of Staphylococcus aureus infection with a scarlatiniform rash. JAMA, 1927; 88:1957–1958. 108. Shands KN, Schmid GP, Dan BB, et al. Toxic-shock syndrome in menstruating women: Association with tampon use and Staphylococcus aureus and clinical features in 52 cases. N Engl J Med, 1980; 303:1436–1442. 79 109. Cone LA, Woodard DR, Byrd RG, et al. A recalcitrant, erythematous, desquamating disorder associated with toxin-producing staphylococci in patients with AIDS. J Infect Dis, 1992; 165:638– 643. 110. Altekruse SF, Cohen ML, Swerdlow DL. Emerging foodborne diseases. Emerg Infect Dis, 1997; 3:285–293. 111. Hamad AR, Marrack P, Kappler JW. Transcytosis of staphylococcal superantigen toxins. J Exp Med, 1997; 185:1447–1454. 112. Lew DP, Waldvogel FA. Osteomyelitis. N Engl J Med, 1997; 336:999–1007. 113. Tice AD, Hoaglund PA, Shoultz DA. Risk factors and treatment outcomes in osteomyelitis. J Antimicrob Chemother, 2003; 51:1261–1268. 114. Blyth MJ, Kincaid R, Craigen MA, et al. The changing epidemiology of acute and subacute haematogenous osteomyelitis in children. J Bone Joint Surg Br, 2001; 83:99–102. 115. Bonhoeffer J, Haeberle B, Schaad UB, et al. Diagnosis of acute haematogenous osteomyelitis and septic arthritis: 20 years experience at the University Children’s Hospital Basel. Swiss Med Wkly, 2001; 131:575–581. 116. White M, Dennison WM. Acute haematogeneous osteitis in childhood: A review of 212 cases. J Bone Joint Surg Br, 1952; 34:608–623. 117. Shirtliff ME, Mader JT. Acute septic arthritis. Clin Microbiol Rev, 2002; 15:527–544. 118. Broy SB, Schmid FR. A comparison of medical drainage (needle aspiration) and surgical drainage (arthrotomy or arthroscopy) in the initial treatment of infected joints. Clin Rheum Dis, 1986; 12:501–522. 80 119. Zimmermann B 3rd, Mikolich DJ, Ho G Jr. Septic bursitis. Semin Arthritis Rheum, 1995; 24:391–410. 120. Bickels J, Ben-Sira L, Kessler A, et al. Primary pyomyositis. J Bone Joint Surg Am, 2002; 84:2277–2286. 121. Moreillon P et al. Staphylococcus aureus (including staphylococcal toxic shock). In Mandell, Douglas and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (editors). Elsevier Churchill Livingstone, 2006: 2324. 122. Deurenberg RH, Vink C, Kalenic S, Friedrich AW, Bruggeman CA and Stobberingh EE. The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect, 2007; 13:222–235 123. Emori TG‚ and Gaynes RP. An overview of nosocomial infections‚ including the role of the microbiology laboratory. Clin Microbiol Rev‚ 1993; 6:428–442. 124. Lowy FD. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. J Clin Invest, 2003; 11:1265–1273. 125. Berger-Bachi B, Rohrer S. Factors influencing methicillin resistance in staphylococci. Arch Microbiol, 2002; 178:165–171. 126. Hajo Grundmann, Marta Aires-de-Sousa, John Boyce, Edine Tiemersma. Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat. Lancet, 2006; 368:874-85 127. Mark C Enright. The evolution of a resistant pathogen – the case of MRSA. Current Opinion in Pharmacology, 2003; 3:474–479 81 128. Hoefnagels-Schuermans A, Peetermans WE, Struelens MJ, Van Lierde S, and Van Eldere J. Clonal analysis and identification of epidemic strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by antibiotyping and determination of Protein A gene and coagulase gene polymorphisms. J Clin Microbiol, 1997; 35:2514-2520. 129. Velazco E, Nieves B, Vindel A, Alviarez E, Gutierrez B, Bianchi G. Molecular study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates at a neonatal high-risk unit in Merida, Venezuela. Med Sci Monit, 2008; 14(9):25-31. 130. Nuno A Faria, João A Carrico, Duarte C Oliveira, Mário Ramirez, and Hermínia de Lencastre. Analysis of Typing Methods for Epidemiological Surveillance of both MethicillinResistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Strains. J Clin Microbiol, 2008; 46:136-144. 131. Strommenger B, Kettlitz C, Weniger T, Harmsen D, Friedrich AW, and Witte W. Assignment of Staphylococcus isolates to groups by spa typing, SmaI macrorestriction analysis, and multilocus sequence typing. J Clin Microbiol, 2006; 44:2533-2540. 132. Fred C Tenover, Sigrid McAllister, Gregory Fosheim, Linda K McDougal, Roberta B Carey, Brandi Limbago, David Lonsway, Jean B Patel, Matthew J Kuehnert, Rachel Gorwitz. Characterization of Staphylococcus aureus isolates from nasal cultures collected from individuals in the United States in 2001 to 2004. J Clin Microbiol, 2008; 46(9):2837-41. 133. Mulvey MR, Chui L, Ismail J, Louie L, Murphy C, Chang N, Alfa M and Canadian Committee for the Standardization of Molecular Methods. Development of a Canadian standardized protocol for subtyping methicillin-resistant Staphylococcus aureus using pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol, 2001; 39:3481–3485. 82 8. ÖZGEÇMĐŞ Taner BOZKURT, Adana’da 1983’te doğdu. Đlkokul öğrenimini Adana’nın Ceyhan ilçesinde yaptı. Ortaokul ve lise öğrenimini Adana’da yaptı. Đnönü Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji bölümünü 2000’de kazandı ve 2004’de mezun oldu. Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans eğitimini 2007’de kazandı. Halen aynı Anabilim Dalı’ nda Yüksek Lisans eğitimime devam etmektedir. Taner BOZKURT 83
