Türk Farmakoloji Derneği XXI. Eğitim Sempozyumu Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı işbirliğiyle Farmakolojide Yeni Hedefler: Tanı ve Tedavide mikroRNA'ların Potansiyel Değeri ve Araştırma Yöntemleri 30 Mayıs 2014 Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, 20 Mayıs Amfisi, Bornova İzmir Program 30 Mayıs 2014 08:45-09:30 Kayıt ve kahvaltı 09:30-10:20 miRNA ve Diğer “NonCoding” RNA’ların Tanı ve Tedavi Stratejileri Geliştirilmesindeki Yeri 10:20-10:30 Soru/katkı 10:30-11:10 Prostat Kanserinin İlerleme Sürecinde miRNA’lar 11:10-11:20 Soru/katkı 11:20-11:30 Kahve arası 11:30-12:20 Klinik Genetik Tanıda Yeni Nesil Dizi Analizi Uygulamaları 12:20-12:30 Soru/katkı 12:30-14:30 Öğle yemeği arası E.Ü. Öğretim Üyeleri Lokali 14:30-15:10 İnsan Primer Aort Hücrelerinde miRNA’ların Yeni Nesil Dizi Analizi ile belirlenmesi Yrd. Doç. Dr. Yasemin ERAÇ, Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji AbD 15:10-15:20 Soru/katkı 15:20-16:00 İnsan Hepatoselüler Karsinoma Hücre Hattında Transkriptom Analizi 16:00-16:10 Soru/katkı 16:10-16:20 Kahve arası 16:20-16:50 Laboratuvar tanıtım gezisi 16:50-18:30 Serbest zaman 18:30 Otelden hareket Ege Sağlık Oteli 19:30 Akşam yemeği Levent Marina, İnciraltı Kent Ormanı Prof. Dr. Mehmet S. SERİN, Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji AbD Doç. Dr. Buket KOSOVA, Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji AbD Doç. Dr. Hüseyin ONAY, Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik AbD Dr. Çiğdem SELLİ, Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji AbD Farmasötik Bilimler Araştırma Laboratuvarı TFD XXI.Eğitim Sempozyumu miRNA VE DİĞER “NON-CODING” RNA’LARIN TANI VE TEDAVİ STRATEJİLERİ GELİŞTİRİLMESİNDEKİ YERİ Prof. Dr. Mehmet Sami SERİN MEÜ. Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji AD Yaklaşık 50 yıldan beri “gen” terimi mRNA’ları kodlayarak genetik bilgiyi protein diline tercüme eden bölgelerle aynı anlamda kullanılmıştır. Bununla birlikte son yıllarda yapılan tüm genom ve işlevsel analiz çalışmaları insan genomunun yaygın olarak binlerce düzenleyici “non-coding” RNA (ncRNA)’lar transkribe ettiğini ortaya koymuştur. Bunlar arasında mikro RNA (miRNA)’lar, small interfering RNA (siRNA)’lar, P-element-induced Wimply Testis (PIWI) interacting RNAs (piRNA)’lar ve çeşitli uzun “long non-coding RNA” (lncRNA)’lar bulunmaktadır (1), (Tablo-1). Ayrıca, genom üzerinde yer alan ve hastalıklarla ilişkili olan genetik varyasyonların büyük bir kısmının, protein kodlayan bölgelerin dışında kalan ve transkripsiyonu kontrol eden “promoter”, “enhancer” gibi bölgelerde ve gen ekspresyonunu düzenlemede görev yapan ncRNA’larla ilişkili olduğu da bulunmuştur (2). Tablo-1: Non-coding RNA’lar ve karakteristik özellikleri (1) Başlıca ncRNA Sınıfları Karakteristik Özellikleri Long (regulatory) non-coding > ∼200 nt, epigenetik kontrol, subselüler RNAs (lncRNAs) kompartmanların veya lokalizasyonların spesifik olarak belirlenmesi Small interfering RNAs (siRNAs) ∼21–22 nt. Komplementer dsRNA duplekslerinden Dicer kesimi ile oluşurlar. Gen düzenlenmesi, transpozon kontrolü ve viral savunmada görev alırlar. microRNAs (miRNAs) ∼22 nt. post-transkripsiyonel gen düzenlenmesi PIWI-interacting RNAs (piRNAs) Dicer bağımsız sRNA, ∼26–30 nt. Temel olarak germline ve germline sınırında yer alan somatik hücrelerde bulunur. Transpozon aktivitesi ve kromatin durumunu düzenlerler. Promoter-associated RNAs Promotor bölgeleriyle ilişkili uzun ve kısa (PARs) RNA’lardır. Gen ekspresyonunu regüle ederler. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) Geleneksel olarak rRNA metilasyonu ve yalancı urilasyona klavuzluk yaparlar. Bununla beraber gen düzenleyici işlevlerinin de olduğu ortaya çıkmaktadır. Diğer ncRNA sınıfları X-inactivation RNAs (xiRNAs), Sno-derived RNAs (sdRNAs), microRNA-offset RNAs (moRNAs), tRNA-derived RNAs, MSY2-associated RNAs (MSY-RNAs), Telomere small RNAs (tel-sRNAs), Centrosome-associated RNAs (crasiRNAs) Şimdiye kadar tanımlanan sınıflar içerisinde miRNA’lar, siRNA’lar ve piRNA’lar effektör Argonaute proteinlerin klavuzluğunda genomik lokus veya hedef RNA’lara dizi spesifik bir düzende bağlanarak onları kesime uğratarak susturmaktadır. Bu özelliklerinden dolayı da üzerinde en fazla çalışma yapılan grupları oluşturmaktadırlar (2). Bu küçük RNA’lar tarafından yönlendirilen gen ekspresyonunun kontrolü, hücresel işlevlerin düzenlenmesinde yer alan temel prensiplerden birisi olarak benimsenmiştir. 1 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu Bu süreçte işlev gören temel proteinler Argonaute ailesi üyeleridir. Argonaute proteinleri, miRNA, siRNA ve piRNA gibi küçük RNA komponentlerinin yüksek özgüllükte bağlanacak şekilde özelleşmişler ve diğer bazı proteinlerle de etkileşerek “RNA interferans” (RNAi) olarak da bilinen “downstream” gen susturma olaylarını koordine etmektedirler. Bu diziye özgül özelliklerinden dolayı son yıllarda birçok siRNa-RNAi, shRNA-RNAi ve miRNA-RNAi aracılı terapötik tasarımlar geliştirilmektedir (3). İnsanlarda 1000’den fazla miRNA, yüzlerce siRNA ve binlerce benzersiz piRNA dizisinin varlığı küçük RNA’ların tüm RNA’lar içerisinde önemli bir işlevsel konuma sahip olduğunu ve bazal düzenleyici sistemde yaygın olarak görev aldıklarını ortaya koymaktadır. Ekzojen siRNA’lar 10 yıl önce keşfedilmiş olmakla beraber endojen siRNA’lar meyve sineklerinde ve memelilerde son yıllarda tanımlanmışlardır. Endojen siRNA’lar antiviral savunma, transpozon susturma, kromozomal yeniden modellenme ve posttranskripsiyonel gen susturmada “PTGS” (Argonaute aracılı hedef transkript kesimi) rol oynamaktadır (1,2). Hastalık oluşumlarında küçük ncRNA’lar Küçük RNA’lar kök hücre ve germline sürekliliği, gelişmesi ve farklılaşması, PTGS ve subselüler lokalizasyon gibi hemen hemen tüm gelişim süreçlerinde rol oynamaktadırlar. Bu nedenlerden dolayı süreçteki bir bozukluğun insan hastalıkları ile ilişkili olması sürpriz değildir. Örneğin, karaciğer, pankreatik, özofajiyel, mide, kolon, hematopoietik, over, meme, hipofiz, prostat, tiroid, testiküler ve beyin kanserlerinde miRNA ekspresyonlarında anomaliler gözlenmektedir. miRNA genleri genellikle insan genomunun kırılgan bölgelerinde bulunmakta olup bu bölgeler onkojenik viral integrasyon bölgeleriyle de ilişkilidir. Ayrıca, spesifik küçük RNA lokusunun kaybı, Prader-Willi Sendromu gibi hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir. Protein kodlayan genler gibi küçük RNA’lar da hastalıkların aktivatörleri veya inhibitörleri olarak işlev görebilirler. Bir farklılaşma faktörü olarak rol oynayan let-7 bir tümör baskılayıcı olup ekspresyon düzeyindeki azalma, düşük sağkalım oranına sahip olan insan akciğer kanserleri ile ilişkilendirilmiştir. Bunun aksine mir-29b ekspresyonu ovarian seröz karsinomada hastalıksız bir sağkalım ile ilişkilendirilmiştir. miRNA’ların değişen ekspresyon düzeylerinin önemi, hedeflerine bağlı olarak değişmekte olup, ya tümör baskılayıcı veya onkojenik işlev gösterirler ve bu değişimler, üzerinde çalışılan tüm kanser tiplerinde gösterilmiştir. Benzer ilişki, kardiyovasküler hastalıklarda ve diğer birçok hastalıkta da belirlenmiştir (1,2). Küçük ncRNA’ların Tanı Stratejileri geliştirilmesindeki yeri Yukarıda özetlenen işlevsel özelliklerinden dolayı, kısa ncRNA’lar, özellikle miRNA’lar ekspresyon düzeylerindeki anomaliler veya kendilerini kodlayan genlerdeki varyasyonlardan dolayı ilişkili oldukları protein sentez düzenlenmesini yeterince yapamazlar ve ilişkili oldukları proteinlerin kritik işlevleri ile ilişkili olarak çeşitli hastalıklar ortaya çıkmaktadır. İşte bu anomalilerin belirlenmesi ilişkili oldukları hastalıkların da özgül tanısını sağlayabilmektedir. Çeşitli çalışmalarda yapılan gözlemler, parafine gömülü klinik örneklerde ve insan plazmasında bulunan miRNA’ların yüksek bir stabiliteye sahip olduğunu ve bu örneklerde yapılan miRNA ekspresyon kalıbı analizinin çeşitli hastalıkların durumları hakkında yararlı bilgiler sunabileceğini ortaya koymuştur. Yayınlanan ilk raporlardan birinde 217 memeli miRNA’sı klinik örnekler, yaygın olarak kullanılan kanser hücre 2 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu kültürleri ve fare tümörlerini de içeren yüzlerce örnekte çalışılmış ve miRNA ekspresyon kalıbının tümör gelişimi orijinini belirleyebildiği ve 217 miRNA’nın 129’unun ekspresyonunun kanserlerde genellikle baskılandığı gösterilmiştir. Daha ileri çalışmalarda, miRNA ekspresyon kalıpları kanser alttiplerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Çeşitli kanser türlerinde yapılan araştırmalar, miRNA ekspresyon kalıplarının klinik progresyonun öngörülmesine olanak sağladığını ortaya koymuştur. miR-15a/16-1 kronik lemfositik lösemi (CLL)’de let-7a akciğer kanserlerinde tanısal biyomarkerler olarak değerlendirilmektedir. Kanserlere ek olarak miRNA ekspresyon kalıpları kalp hastalığı, kas rahatsızlıkları ve nörodejeneratif bozuklukların farklı formlarının ayrımında kullanılabilmektedir (4). miRNA ekspresyon düzensizliklerinin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılan 2 temel yaklaşım vardır: 1. Gen ekspresyon kalıplarının belirlenmesi 2. Genetik varyasyonların belirlenmesi Gen ekspreyon kalıplarının belirlenmesi kullanılan teknikler: Northern Blotting In situ Hibridizasyon Mikrodizin platformları Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing, NGS) Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) Yukarıdaki teknikler kullanılmakla birlikte özellikle miRNA’lar için günümüzde en yaygın olarak kullanılan yöntem: miRNA ekspresyon kalıplarının High throughput Stem-loop RT-qPCR ile belirlenmesidir. “High throughput Stem-loop” RT-qPCR miRNA ekspresyon kalıplarının belirlenmesi 2005 yılında Chen ve arkadaşları tarafından yeni bir miRNA nicel belirleme yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemde önce miRNA bir “stem-loop” primeri ile reverse transkripsiyona (RT) uğratılıp daha sonra elde edilen cDNA’nın kalıp DNA olarak kullanıldığı TaqMan PCR analizi uygulanmaktadır. Bu şekilde zaten 19-21 nt.lik olan miRNA’lara primerlerin bağlanma oranı ve fidelite önemli ölçüde arttırılıp geleneksel oligo-dt RT tepkimesine göre çok daha özgül cDNA’ların elde edilmesine de olanak sağlanmıştır. Bu şekilde genomik DNA kontaminasyonu da engellenmektedir. Rutin analizlerde birçok miRNA için 25 pg total RNA bu yöntem için yeterlidir. Diğer yandan akışkan entegre devrelerin geliştirilmesiyle de bir örnek ile aynı anda 300’ün üzerinde qRT-PCR yapma olanağı doğmuştur. Günümüzde geliştirilen daha yüksek kapasiteli akışkan diziler (fluidic arrays) ile tepkime sayısı da gittikçe artmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda doku ve çeşitli hastalıklara özgül, hızlı ve duyarlı miRNA ekspresyon kalıplarının belirlenmesine de olanak vermektedir. Stem-loop qRT-PCR ile aynı zamanda siRNA gibi diğer küçük ncRNA’ların miktarları da belirlenebilmektedir (5). Alternatif olarak mikrodizin tabanlı sistemler de bu amaçla kullanılmaktadır. Az sayıdaki miRNA analizleri için müşteriye özel “custom design” çalışma yapmak da olasıdır. Ekspresyon değişimlerini gösteren miRNA’ların belirlenmesi, ilişkili oldukları protein ekspresyonu ile birlikte hangi hastalıklarla sonuçlanıyor ise ona göre bir 3 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu biyomarker özelliğine sahip olup olmadıkları belirlenir ve bu özelliğe sahip olan değişimler ilişkili hastalığın tanısında kullanılır. Günümüzde çeşitli hastalıkların erken tanısına önemli ölçüde destek veren miRNA biyomarkerleri belirlenmiş ve tanı amaçlı olarak yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. miRNA’ların solid dokulardan elde edilen örneklere ek olarak hasta serum/plazmasında da belirlenebilmesi, kanser gibi tanısında mutlaka girişimsel tekniklerin (biyopsi) kullanılmasını gerektiren hastalıklarda oldukça kolay bir örnek eldesine (kan alma gibi non-invasive işlemlerle) gereksinim duyulması tanısal değerini daha da arttırmaktadır (4). Çalışma grubumuzca yapılan bazı araştırmalarda da gastrik kanserin erken tanısında kullanılabilecek bir biyomarker olarak miR-195-5p, HBV infeksiyonu ile ilişkili olarak gelişen kronik hepatit B, siroz ve hepatosellüler karsinoma’da miR-125b-5p ve miR223-3p, benzer şekilde HCV ile ilişkili olarak gelişen kronik hepatit C, siroz ve hepatosellüler karsinoma’da miR-223-3p, miR-17-5p ve miR-24-3p ekspresyon değişimleri, ayrıca kolorektal kanserlerde miR-150-5p, miR-30a-5p, miR-34a-5p, ve miR-195-5p ekspresyon değişimleri biyomarker olarak kullanılabilecek potansiyelde bulunmuştur (6,7,8,9). Genetik varyasyonların belirlenmesinde özellikle son yıllarda çok daha yaygın olarak kullanım olanağı bulan yeni nesil DNA dizi analizi yöntemleri teknolojide sağlanan önemli gelişmelerle birlikte başarıyla uygulanmaktadır. Küçük ncRNA’ların Tedavi Stratejileri geliştirilmesindeki yeri Yukarıda da belirtildiği gibi miRNA’lar, siRNA’lar ve piRNA’lar gibi sncRNA’lar diziye özgü bir düzende mRNA transkripsiyonunun post transkripsiyonel olarak durdurulmasıyla sonuçlanan bir gen ekspresyonunudüzenlemektedir. Bu özelliklerinden dolayı dizi spesifik gen susturma hedefli ilaç tasarımlarında sıklıkla kullanılmaktadırlar. Gen susturmanın yanı sıra, ekspresyondaki düzensizlik bir hastalıkla ilişkili ise mevcut miRNA’nın veya miRNA biyogenezinin kritik bir yolağının bloke edilmesi ile elde edilen terapötik yarar da ilaç tasarımlarının temelini oluşturmaktadır. Son yıllarda tasarlanan ve üzerinde klinik çalışmaların yapıldığı küçük ncRNA’lar özellikle miRNA-RNAi ve siRNA-RNAi tabanlı olup henüz etkili bir aşısı veya tedavisi olmayan çeşitli viral infeksiyonlar ve bir çok kanser türü üzerine yoğunlaşmış durumdadır. Potansiyonel olarak gen veya protein sentez bozukluğu aracılı her hastalık, hücre tipi veya doku tipi; miRNA, miRNA-RNAi veya siRNA-RNAi tabanlı hedefleri oluşturabilirler. Bu önemli avantajdan dolayı günümüzde sadece kanser tedavisinde kullanılmak üzere 56 şirket 127 kanser araştırma projesi kapsamında 96 sncRNA (miRNA, RNAi & siRNA) tabanlı ilaç geliştirme çalışması yapmaktadır. Onkolojik tedavi amaçlı bu ilaçlar temel 24 hücresel fonksiyon içerisinde yer alan 63 potansiyel molekülü hedeflemektedir (10). Bu hücresel işlevler aşağıda sunulmuştur: - Hücre adezyon molekül aktivitesi - Kofaktör bağlanması - Sitokin aktivitesi - Büyüme faktörü aktivitesi - GTPaz aktivitesi - Kinaz aktivitesi - Liganda-bağımlı nükleer reseptör aktivitesi 4 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu - Metallopeptidaz aktivitesi - Moleküler işlevi bilinmeyenMotor aktivite - Oksidoredüktaz aktivitesi - Peroksidaz aktivitesi - Proteaz inhibitor aktivitesi - Protein serin/treonin kinaz aktivitesi - Protein treonin/tirozin kinaz aktivitesi - Reseptör aktivitesi - Reseptör sinyal kompleks bağlantı aktivitesi - RNA bindingbağlanması - Serine-tip peptidaz aktivitesi - Yapısal molekül aktivitesi - T hücre reseptör aktivitesi - Transkripsiyon faktör aktivitesi - Translasyonel düzenleyici aktivitesi - Transmembran reseptor protein tirozin kinaz aktivitesi (10). Küçük Oligonükleotidlerin Gen Susturmasında Kullanılması 1998’de Fire ve arkadaşları RNA interferans (RNAi) olarak tanımlanan ve küçük tek zincirli ncRNA’lar ile gen ekspresyonunu kontrol eden bir mekanizma keşfetmişlerdir (11). Bu mekanizmanın en önemli kısmının dizi özgüllüğünü sağlayan Argonaute proteinlerinin klavuzluğunda gerçekleşmesi RNAi mekanizmasının araştırmacılar tarafından çeşitli genetik hastalıklar ve kanser tedavisinde kullanılabilecek önemli bir araç haline gelmesine neden olmuştur. RNAi uygulamaları, potansiyel olarak hedefi protein sentezinin inhibisyonu olan her durum için uygulanabilir olmasından dolayı, oldukça büyük bir potansiyel değer oluşturmuştur. Zira günümüzde kullanılan konvansiyonel farmasötik ilaçlar sadece 500 civarındaki farklı protein ve bunlarla ilişkili yolakları hedeflerken, post genomik çağda insan genomunun 20,330 farklı proteini kodladığının belirlenmesi ve her protein hedefe yönelik antisens oligo nülkleotid (ASO) tasarımının mümkün olması, bu alanın önemini vurgulamaktadır (12). RNAi teknolojisinde kullanılan küçük ncRNA’lar 4 temel sınıfa ayrılmışlardır: small interfering RNA (siRNA) short hairpin RNA (shRNA) microRNAs (miRNAs) P-element-induced wimpy testis (PIWI) interacting RNAs (piRNA) Yeni keşfedilen bazıları da benzer amaçlarla tasarlanmaktadırlar. siRNA RNAi teknolojisinde ilk kullanılan sentetik RNA’lardır. Bu süreçte uzun dsRNA molekülleri Dicer adı verilen bir RNAaz III enzimi ile her 2 ucunda 2’şer nüklotidlik tek zincirli uç oluşturacak şekilde 19-23 nükleotidlik siRNA’lara kesilirler. Oluşan siRNA’lar komplementeri olan hedef mRNA’lara bağlanarak onları klevaja uğratarak post transkripsiyonel olarak gen ekspresyonunu durdururlar. Bu siRNA’lar daha sonra, bir multiprotein-RNA nükleaz kompleksi olan, RNA-aracılı ile indüklenen susturma kompleksi (RISC)’ne bağlanır. siRNA, RISC’in klavuzluğunda hedef komplementer mRNA’ya dizi spesifik olarak bağlanır ve kompleks içerisinde yer alan endonükleazlar ile onu sonrasında küçük fragmanlara böler. Kesime uğrayan mRNA daha sonra house-keeping endonükleazlarla sindirilerek hücreden temizlenir. 5 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu Sonuçta ilgili protein (susturulmuş) olur (12). sentezi post transkripsiyon aşamasında baskılanmış shRNA shRNA’lar genellikle uzun sureli gen susturma proseslerinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. shRNA’lar nükleusta kısa dsDNA’lardan bir saç tokası şekli oluşturacak şekilde transkribe olurlar. shRNA transkripti sentezlendikten sonra siRNA aracılı RNAi sürecinde olduğu gibi dicer enzimi ile kesilir, RISC’e bağlanır ve hedef komplementer mRNA’ya dizi spesifik olarak bağlanarak süreç siRNA aracılı RNAi ile aynı şekilde sonlanır (12). miRNA miRNA’lar ncRNA’ların bir başka grubu olup gen düzenlenmesinde oldukça büyük bir öneme sahiptir. Hücrelerde yüksek düzeyde korunmuş diziler olarak bulunurlar. miRNA ilk olarak intergenik dizilerde veya intronlarda yerleşmiş olan öncüllerden primer transcript (pri-miRNA) olarak transkribe olurlar. Daha sonra, Drosha olarak bilinen RNaz III endonükleaz ile sindirilerek pre-miRNA formuna dönüşür ve sitoplazmaya transfer edilir. Sitoplazmada pre-miRNA aynı siRNA ve shRNA’da olduğu gibi Dicer enzimi ile kesilerek 20-23 bp’lık olgun miRNA molekülüne dönüşür. Olgun miRNA’lar da siRNA ve shRNA’lar gibi RISC kompleksine bağlanarak ilişkili oldukları komplementer mRNA’yı klevaja uğratırlar (12,13). siRNA, shRNA ve miRNA arasındaki bir önemli fark; siRNA ve shRNA’nın hedef mRNA ile tam bir dizi özgüllüğüne gereksinim duymalarına karşın miRNA’da durum farklıdır. miRNA’ların bir kısmı mRNA’lar ile birebir eşleşmezler (12). Bir tek miRNA’nın ekspresyon düzeyindeki değişiklik 100’den fazla farklı geni etkileyebilir. miRNA’ların gen düzenlenmesindeki işlevi farklı şekillerde olabilir. miRNA’lar, hedef mRNA’nın 3’ UTR (untranslated region) bölgesine bağlanarak translasyonu baskılar. Bununla birlikte bazı çalışmalar 3’ UTR’den daha az miktarda olmakla beraber miRNA’ların protein kodlayan bölgeleri ve mRNA’nın 5’ UTR bölgelerine de bağlanabildiğini göstermiştir. Diğer bazı çalışmalarda da mRNA’ların 5’ UTR bölgesine veya DNA’ya bağlanarak gen ekspresyonunu indükleyebildiği de gösterilmiştir (12,13). piRNA piRNA’lar PIWI proteinleri ile etkileşen küçük ncRNA’lardır. PIWI proteinleri, Argonaute protein ailesinde yer alan bir grup proteindir ve Drosophila ve memeliler gibi çeşitli organizmaların germinasyon hatlarında predominant olarak eksprese edilirler. piRNA’lar susturma kompleksi tekrar elementlerinin sürekliliğine, genomun bütünlüğünü korumaya ve gametlerin oluşumuna yardımcı olurlar. Bunlara ek olarak, Drosophila’da piRNA’ların bir alt grubu susturma proteinlerini kodlayan genlerin düzenlenmesinde işlev görmektedirler. piRNA-PIWI komplekslerinin doğrudan transpozon aktivitesini kontrol ettikleri kabul edilmektedir. piRNA’ların PIWI proteinlerine bağlanarak homolojik bir hedef kesimi gerçekleştirdikleri in vitro olarak gösterilmiştir. Bu nedenle, transpozonların olasılıkla post-transkripsiyonel yıkıma uğratılarak susturuldukları düşünülmektedir. piRNA’lar, siRNA ve miRNA’lardan aşağıdaki özellikleri bakımından farklılıklar gösterirler: 1. piRNA’lar genellikle 24-31 nt.lik diziler içerirler. Diğer ncRNA’lar yaklaşık 21 nt.dir. 6 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu 2. miRNA’ların yüzlerce türüne karşın piRNA’lar yaklaşık 50,000 türe sahiptir. 3. Bazı piRNA’lar epigenetik düzenlemelere katılmaktadırlar. siRNA ve miRNA’lar genellikle mRNA’ları hedeflemektedirler (12). İlaç geliştirme süreçleri devam eden bazı spesifik miRNA’lar: Viral Hepatit C hastalığında miR-122 Hepatit C Virüs (HCV)’ünün replikasyonunda, karaciğere özgü bir miRNA olan mir122’nin kritik bir önemi olduğu gösterilmiştir. miR-122’ye komplementer dizi-özgüllüğü olan bir ASO dizi tasarımının operasyonel olarak kullanılması HCV RNA replikasyon düzeyini önemli ölçüde azaltmaktadır. Bu deneysel gözlem miR-122’yi antiviral bir hedef olarak şiddetle önermektedir. Bildirilen ilk raporlardan sadece birkaç ay sonra kimyasal olarak tasarlanmış ve “antagomirler” olarak isimlendirilen yeni bir oligonükleotidler sınıfı ortaya çıkmıştır. İntravenöz olarak uygulanan bu oligonükleotidler olgun miRNA’lara komplementer dizilerden oluşmakta ve hücresel internalizasyonun sağlanması için kolesterol ile konjuge edilmiştir. Yapılan ilk çalışmalarla antagomirlerin intravenöz sistemik teslimatı önemli ölçüde valide edilmiş ve zaman içerisinde birçok dokuda hedef miRNA düzeylerinde önemli azalmalar gözlenmiştir. Daha sonraları sistemik uygulamalarda “Locked Nucleic Acid” (LNA) içeren anti-miR’ler kullanılmış ve fare ve “non-human” primatlarda miR-122 potansiyel olarak antagonize edilmiştir. HCV ile kronik infekte şempanzelerde LNAanti-miR-122 ile yapılan çalışmalarda HCV viremisinin etkili ve güvenli bir şekilde baskılandığı ve HCV infeksiyonu ile indüklenen karaciğer patolojisinin de önemli ölçüde iyi bir prognoz sergilediği bildirilmiştir. Anti-miR-122 ile yapılan klinik çalışmalar halen devam etmektedir (14), (www.clinicaltrials.gov). Patolojik kardiyak yeniden modellenmede miR-208 Genetik bir delesyonun oluşumu ilk defa miR-208a’da bildirilmiştir. Ayrıca miR-208a şimdiye kadar bildirilen tek kardiyo-spesifik miRNA’dır. Kardiyak stres süresince miR208a’nın ekspresyon düzeyi görece stabil kalmakla beraber bu miRNA’nın kardiyak strese yanıt sürecinde βMHC ekspresyonunda, kardiyak hipertrofide ve kardiyak yeniden modellenmede temel işlevi olduğu görülmektedir. miR-208a-null fare torasik aortik kasılma veya bir Ca+2/Kalmodulin bağımlı fosfataz olan “calcineurin” ile oluşan sinyal sonucu gelişen aşırı basınca yanıtta kardiyomiyosit veya fibrötik hipertrofi göstermemiş ve βMHC upregülasyonu yapamamıştır. Streste miR-208a ekspresyonunun önemli değişiklikler göstermediği ancak strese bağlı patolojik kardiyak yeniden modellenmede varlığına gereksinim duyulduğundan LNA-modifiye bir anti-miR’in sistemik olarak kullanımının gelişen bu patolojik yeniden modellenmeyi terapötik olarak baskıladığı gösterilmiştir. LNA-anti-miR208a’nın subkutan uygulanması, diyastolik kalp hastalığında patolojik kardiyak yeniden modellenme, işlevsel bozulma ve letaliteyi önlemektedir(13,14). İnflamatuvar hastalıklarda miR-155 miR-155 immün sistemde görev alan önemli bir regülatördür. miR-155’te görülen genetik delesyonların yardımcı T hücre farklılaşmasında ve en azından sitokin üretimi düzenlenmesinde önemli aksamalara neden olduğunu göstermiştir. Yapılan çeşitli çalışmalarda, makrofaj kültürleri ve fareler LPS (lipopolisakkarid) ile etkileştiklerinde miR-155 ekspreyon düzeylerinde artış meydana geldiğini göstermektedir (14). Gerçekleştirdiğimiz diğer bir çalışmada da LPS verilerek deneysel septik şok modeli oluşturulan farelerde miR-150, miR-223 ve miR-297 ekspresyonunun ciddi şekilde 7 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu arttığı, 5,14-HEDGE verildiğinde ise bu miRNA’ların hızlı bir şekilde azaldığı gösterilmiştir (15). Transkripsiyon faktörü c/ebp β miR-155’in direkt hedefidir. Fare makrofajlarında ve insan monosit hücrelerinde LPS ile stimüle edilen makrofajlarda LNA-modifiye antimiR-155’in sistemik olarak uygulanması ile c/ebp izoformlarının derepresyon ve granulosit koloni stimüle edici faktör (GCSF) ekspresyonunda downregülasyon meydana gelmektedir. Bu bulgular, miR-155 antagonistlerinin kronik inflamatuvar hastalıkların tedavisinde kullanılabilme potansiyelinde olduğunu göstermektedir. Fibroz’da miR-21 miR-21, kanserden kalp hastalıklarına kadar çeşitli patolojik durumlarda oldukça dinamik olarak regüle edilen miRNA’lardan birisidir. Antagomirlerle miR-21’in in vivo şartlarda bloke edilmesi ile kardiyak hipertrofinin baskılandığı, interstisyal fibrozun inhibe edildiği, kardiyak disfonksiyonun azaldığı bildirilmiştir. Henüz açıklanamayan bazı çelişkilere rağmen miR-21’in inhibisyonu hem kanser hem de fibrotik hastalıklara yönelik terapötik uygulamalar için üzerinde aktif olarak çalışmaların yapıldığı bir araştırma alanıdır. Neo-anjiyogenez’de miR92a İntravenöz antagomir uygulaması ile miR-92a’nın inhibisyonu hem yeni kan damarları oluşumunu (anjiyogenez) hem de iskemi ve myokardial infarksiyon modellerindeki hasara uğramış dokularda işlevsel bir iyileşme oluşturmaktadır. Bu özelliğinden dolayı miR-92a inhibisyonu iskemik kalp hastalığı ve periferik arter hastalıkların tedavisi için yeni bir araştırma alanı oluşturmuştur. Metabolik Hastalıklarda miR-33 miR-33a ve miR-33b sterol regulator element-bağlayıcı proteinleri (SREBPs)’nin intronlarında yer almaktadır. SREBP2 miR-33a regülasyonu ile eksprese olurken SREBP1 ekspresyonu miR-33b’den etkilenmektedir. Bu konak genler, kolesterol biyosentezinde anahtar işlev gören transkripsiyonel regülatörlerdir. Çeşitli çalışmalar miR-33a/b’nin, “high density lipoprotein” (HDL) sentezinde ve zıt kolesterol transportunun önemli regülatörlerinden olan “ATP-binding cassette transporter A1” (ABCA1) proteinini hedeflediğini göstermiştir. Farelerde LNA-modifiye anti-miR-33 ile miR-33’ün inhibisyonunun ABCA1 ekspresyonunu ve kolesterol akışını arttırdığını, ayrıca batı tipi beslenme ve LNA-modifiye ASO uygulamalarının, kan HDL seviyelerini yükselttiği gösterilmiştir. Bu veriler, miR-33 inhibisyonunun aterom plak oluşumunu engelleyerek terapötik tasarıma uygun olduğunu vurgulamaktadır (14). Birçok işlevsel genin ekspresyonunun siRNA aracılı baskılanarak terapötik bir yararın sağlandığı çeşitli hastalıklar bulunmaktadır. siRNA tasarım stratejileri siRNA aracılı susturma süreci terapötik yöntem bakımından 3 önemli özelliğe sahiptir: i) Post-transkripsiyonel etkinlik göstermesi ii) Susturma özgüllüğünün yüksekliği iii) Birçok farklı siRNA dizisi aynı hedef mRNA’yı inhibe edebilmektedir. Bu nedenle en doğru hedefin susturulmasına yönelik tasarım ile non-spesifik etkinin minimalize edilmesi önemlidir. 8 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu Bu özellikler temel olarak 2 sınıfa ayrılabilir; siRNA etkinliği ve siRNA özgüllüğü. siRNA etkinliği, dizi seçimi, mRNA hedef bölgesinin yapısı ve ortalama G/C oranı ile ilişkilidir. siRNA özgüllüğü ise karşılaştırmalı olarak dizi seçimi, seçilen dizinin immünojenisitesi, ve seçilen hedefin benzersizliği ile ilişkilidir. 5’ Nükleotid seçimi siRNA aktivitesi, siRNA içerisinde bulunan bir dizi konuma özgü baz seçimi ile ilişkilidir. Etkinlik ile ilişkili olan baz dizileri genellikle siRNA’nın 5’-ucunda veya bu uca en yakın olanları ile ilişkilidir. Bununla birlikte şu ana kadar özgül baz seçimi konusunda tam bir fikir birliğine varılamamıştır. mRNA hedef bölge mRNA’nın sekonder yapısı RISC bağlanmasını ve kesimini engellemektedir. Ancak bu engellemenin ne ölçüde olacağı ve en uygun bağlanma biyoinformatik veri tabanlanan sağlanan dizilerin in-silico ortamda çeşitli olasılık-öngörü programları ile yapılan analiz ile kolaylıkla belirlenebilmektedir. Özgül olmayan etkiler Bir siRNA’nın özgüllüğü hedef hücrelerin transkriptomu içerisindeki benzersiz dizilerin seçilmesi ile başlar. Bununla birlikte kısmen komplamenter ve miRNA benzeri hedeflerin olası varlığının araştırılması da hedef dışı (off-target) etkilerini azaltabilir. Aynı zamanda, nükleotid tekrarlarından da kaçınmak gerekir. Özellikle GGGG motiflerinin G-quartet sekonder yapı oluşturduğu bilinmektedir. miRNA benzeri hedefler, siRNA’ların tohum (seed) bölgeye sahip olduğu durumlarda hedeflenmemiş transkriptlerin translasyonal represyonuna neden olabilirler. miRNA benzeri dizilerin çoğu tanımlanmış ve “http://www.mirbase.org” biyoinformatik veri tabanında sunulmaktadır. Benzer şekilde diğer birçok veri tabanı ve “on-line” program bir siRNA’nın hedef dışı etki olasılıklarını öngörebilmektedir. Basit bir BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analizi (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ile kolaylıkla olası hedef dışı etkiler algoritmik olarak belirlenebilmektedir. Bununla birlikte, yine de hedef dışı etkiler çeşitli nedenlerle sorun oluşturmaya devam etmektedir. Bu nedenlerden bazıları; eşleşme hatalarının dupleks içerisinde tolere edilmesine karşın hangi eşleşme hatalarının tolere edildiğinin bilinmemesi öngörülen miRNA benzeri hedeflerin her zaman belirlenememesidir. Genetik varyasyonların da özellikle tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNPs) de dikkate alınması gerekmektedir. Bir nükleotidlik farka sahip bir hedef bölgede, hedef susturma etkinliği önemli ölçüde değişebilir. Bu nedenle sıklıkla SNP’lerin belirlenen hedef bölgelerden kaçınmak gerekir. Yakın gelecekte daha da ucuzlayan DNA dizi analizi ve sentez teknolojileri ile doğrudan hastanın kendi genotipine uygun özgül siRNA terapötikler tasarlanabilecektir(16). siRNA’ların hedef doku veya hücrelere ulaştırılması (delivery) siRNA terapötiklerinin etkinliğini en çok zorlayan bariyer, hedeflenen hücre tipi, doku veya organa siRNA’ların ulaştırılmasıdır. siRNA’lar büyüklükleri ve fosfodiester yapılı omurgasının negatif elektrik yükünden dolayı hücre membranından doğrudan geçemezler. Bu nedenle, kimyasal olarak sentezlenmiş veya in vitro olarak transkribe edilmiş siRNA’ların uygulanmasında taşıyıcı olarak genellikle katyonik lipozomtabanlı stratejiler kullanılmaktadır. Bununla beraber, lipid-tabanlı taşıyıcı 9 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu sistemlerinde de karaciğerde hızlı yıkım ve hedef özgüllüğü gibi birçok sorun yaşanmaktadır. Uygulama yöntemleri ve taşıyıcı sistemler; i) fiziksel yöntemler ii) konjugasyon yöntemleri iii) doğal taşıyıcılar (virüsler ve bakteriler) iv) non-viral taşıyıcılar olarak sınıflandırılabilir. DNA-tabanlı ekspresyon kasetleri genellikle virüsler ve bakteriler tarafından hücrelere aktarılırlar ve hücreye girdiğinde küçük firkete (small hairpin, sh) RNA (shRNA) eksprese ederler. Bu amaçla geliştirilmiş en tanınmış taşıyıcılar adenovirüs ve adeno-ilişkili virüs türevi vektörlerdir. Bununla beraber viral vektör kullanımında da insertsiyonel mutajenez ve immünojenisite gibi sorunlar yaşanmaktadır (17,18). Non-viral gen taşıyıcı sistemleri daha güvenli olmaları ve viral vektörlere göre daha kolay tasarlanabilmeleri avantajları vardır. Günümüzde kullanılan non-viral taşıyıcılar organik ve inorganik sistemler olarak sınıflandırılırlar. Organik kompleksler lipid kompleksleri, konjuge polimerler ve katyonik polimerleri içermektedir. İnorganik nanopartiküller ise manyetik nanopartiküller, “quantum dot”lar, karbon nanotüpleri ve altın nanopartikülleridir (17). İletişim Adresi: Prof. Dr. Mehmet Sami SERİN 1. MEÜ. Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji A.Dalı 33169, Yenisehir, Mersin 2. Mersin Üniversitesi İleri Teknoloji Araştırma Uygulama ve Eğitim Merkezi (MEİTAM), Çiftlikköy, Mersin serinm@mersin.edu.tr; serinmss@yahoo.com KAYNAKLAR 1. Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS. “Non-coding RNAs: regulators of disease.” J Pathol 2010; 220: 126–139. 2. Hrdlickova B, de Almeida RC, Borek Z, Withoff S. “Genetic variation in the noncoding genome: Involvement of micro-RNAs and long non-coding RNAs in disease”. Biochim Biophys Acta. 2014 Mar 22. pii: S0925-4439(14)00071-4. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.03.011. 3. Meister G. “Argonaute proteins: functional insights and emerging roles”. Nat Rev Genet. 2013 Jul;14(7):447-59. 4. Hydbring P, Badalian-Very G. “Clinical applications of microRNAs”.Version 3. F1000Res. 2013 Jun 6 [revised 2013 Oct 8];2:136. eCollection 2013. 5. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. “Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR”. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179. 6. Gorur A, Balci Fidanci S, Dogruer Unal N, Ayaz L, Akbayir S, Yildirim Yaroglu H, Dirlik M, Serin MS, Tamer L. “Determination of plasma microRNA for early detection of gastric cancer”. Mol Biol Rep. 2013 Mar;40(3):2091-6. 7. Giray BG, Emekdas G, Tezcan S, Ulger M, Serin MS, Sezgin O, Altintas E, Tiftik EN. “Profiles of serum microRNAs; miR-125b-5p and miR223-3p serve as novel 10 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu biomarkers for HBV-positive hepatocellular carcinoma”. Mol Biol Rep. 2014 Mar 5.DOI 10.1007/s11033-014-3322-3 [Epub ahead of print]. 8. Öksüz Z, Serin MS, Döğen A, Kaplan E, Tezcan S, Aslan G, Emekdaş G, Sezgin O, Altintaş E, Tiftik EN”. Serum/Plazma miR-223-3p, miR-17-5p ve miR-24-3p ekspresyon profilleri Kronik Hepatit C (KHC), Siroz ve Hepatosellüler Karsinoma (HSK)’lı hastalarda HSK’nın non-invasive biyomarkırları olabilecek potansiyeldedir” 9. Ulusal Hepatoloji Kongresi, 28 Mayıs-1 Haziran 2013, Bildiri Kitabı. 9. Akbayir S, Unal ND, Fidanci SB, Gorur A, Yaroglu Hy, Ayaz L, Gundogdu R, Dirlik M, Serin MS, Tamer L. “Evaluation of Plasma microRNA Expression Levels in Early Diagnosis of Colorectal Cancer” Journal of Clinical & Experimental Oncology, in Press. 10. Research and markets 2014, erişim: http://www.researchandmarkets.com/reports/2191815/. 11. Fire, A, Xu, S, Montgomery, M. K, Kostas, S. A, Driver, S. E, & Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. (1998) 391, 806-11. 12. Sakiragaoglu O, Good D, Wei MQ. “Cancer Gene Therapy with Small Oligonucleotides” Novel Gene Therapy Approaches; 2013, erişim: “http://dx.doi.org/10.5772/54782”. 13. Broderick JA and Zamore PD. “MicroRNA therapeutics”. Gene Therapy (2011) 18, 1104–1110. 14. Rooij EV, Purcell AL, Levin AA. “Developing MicroRNA Therapeutics”. Circulation Research 2012; 110: 496-507. 15. Sarı AN, Korkmaz B, Serin MS, Kaçan M, Ünsal D, Buharalıoğlu K, Fırat SŞ, Falck JR, Malik KU, Tunçtan B. “ Sıçanlarda oluşturulan deneysel septik şok modelinde 20-HETE analoğu 5.14-HEDGE’nin yararlı etkilerine MyD88/TAK1/IKKβ/NF-кB yolu etkinliği ile birlikte sistemik miR-150, miR-223 ve miR-297 ekspresyon düzeylerindeki azalmanın katkısı. 22.ci Ulusal Farmakoloji Kongresi, 4-7 Kasım 2013, Antalya, Bildiri Kitabı, s64, ss102. 16. Angart P, Vocelle D, Chan C, Walton SP. “Design of siRNA Therapeutics from the Molecular Scale”. Pharmaceuticals 2013, 6, 440-468. 17. Lee JM, Yoon TJ, Cho YS. “Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy”. BioMed Research International Volume 2013, Article ID 782041, 10 pages http://dx.doi.org/10.1155/2013/782041. 18. Serin MS. “Viral Hepatitlerle ilişkili Olarak Gelişen Hepatosellüler Karsinomanın Tedavisinde Gen Tedavisi”. Viral Hepatit Dergisi, 2004; 9(3), 113-122. 11 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu 12 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu Klinik Genetik Tanıda Yeni Nesil Dizi Analizi Uygulamaları Doç. Dr. Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı İnsanlık tarihinin en büyük bilim projesi olan İnsan Genom Projesi, normal insan DNA’sının şifresini çözmeye çalışırken aynı zamanda DNA dizi analizi teknolojilerinin gelişmesine de ön ayak oldu. Başlarda gözle görülebilir esas gelişme Sanger dizileme temelli kapiler elektorforez sistemlerinde yaşandı. Tek kapilerli sistemlerden 96-384 kapilerli sistemlere geçiş yapılırken okuma uzunluğu 1000 baz çiftine, ham veri doğruluğu da %99,999’a çıktı. Buna rağmen dizilenmesi gereken DNA’nın uzunluğu göz önünde bulundurulduğunda alternatif yöntemlere olan ihtiyaç her geçen gün arttı. İnsan Genom Projesi kapsamında ilk insan konsensus DNA dizisi 2001 yılında yayımlandı. İkinci Nesil Dizi Analizi (Yeni Nesil Dizi Analizi-Next Generation Sequencing, NGS) teknolojisi konusundaki ilk yayınlar 2005 yılında bilim dünyasında yerini almaya bşladı ve 2008 yılında da ilk defa NGS teknolojisi kullanılarak diploid insan genomunun dizisi çıkartıldı. DNA’nın keşfiyle Nobel ödülü kazanan James D. Watson’a ait olan bu DNA’nın dizilenmesi için yaklaşık 1,5 milyon dolar harcandı ve ilk konsesnsus DNA’nın dizilenmesi için harcanan 3 milyar doların yanında son derece mütevazı bir rakamdı. O günden itibaren NGS teknolojileri hızla genetiğin çehresini değiştirmeye başladı. NGS teknolojilerindeki baş döndürücü ilerleme bu teknolojilerin de kendi içinde 2., 3. ve 4. nesil olarak sınıflandırılmasına neden oldu. Sanger sekanslama teknolojisinde esas olarak tek bir fragmanın dizilenmesi söz konusu iken NGS teknolojilerinde aynı anda milyonlarca fragmanın dizilenmesi olasıdır. Bu nedenle birçok farklı isimlendirmesi olan NGS teknolojilerini en iyi anlatan tanımlardan bir tanesi “Massively Parallel Sequencing”tir. Bu tanım milyonlarca amplifiye edilmiş DNA fragmanının katı bir yüzey üzerine sabitlenerek aynı anda dizilenmesini anlatmaktadır ve özetle ikinci nesil NGS’nin temelini oluşturmaktadır. İkinci nesil NGS’de milyonlarca fragmandan gelen veriler birleştirilerek DNA dizisi ortaya çıkartılmaktadır. Dünyada ikinci nesil NGS teknolojileri her geçen daha fazla laboratuvarda yer almaktadır. Burada başta Illumina olmak üzere Roche ve Life Technologies’e ait sistemler bulunmaktadır. Üçüncü nesil NGS teknolojilerinde ise tek molekül sekanslama kullanılmaktadır. Şu anda rutin kullanıma girmemiş olsa da üçüncü nesil teknolojiler kanser gibi klonal değişikliklerin önemli olduğu çalışmalarda büyük bir avantaj sağlayacaktır. Dördüncü nesil NGS ise şu aşamada son derece deneyseldir ve hücre bazında DNA analizi denebilecek bir temelde ilerlemektedir. Özellikle somatik mutasyonların değerlendirilmesinde son derece faydalı olacak bir teknoloji olarak düşünülmektedir. NGS teknolojilerinde meydana gelen bu olağanüstü gelişmelerin kliniğe yansıması yaklaşık 5 yıl içinde gerçekleşmiştir. Bu gelişmenin ilk yanısıması hastalık genlerinin keşfi olmuştur. NGS teknolojilerinin hayatımıza girmesinden itibaren tüm genom sekanslama (Whole Genome Sequencing-WGS) ve tüm ekzom sekanslama (Whole Exome Sequencing-WES) yaklaşık 300’e yakın hastalık geni tanımlanmıştır. Sadece 2012 yılında tanımlanan gen sayısı 130’dur. Teknolojinin bu kadar kolay kullanılabilir olması özellikle gen tanımlama algortimalarında NGS temelli yaklaşımları ilk sıraya oturtmuştur. NGS’nin rutin tanıya girmesi ise “benchtop sequencer” denilen grubun piyasaya sürülmesi ile gerçekleşmiştir. Illumina Miseq, Roche 454 GS Junior ve Life Technologies Ion Torrent sistemleri bu grubun öncüleridir. Bu sistemler kullanım 13 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu kolaylığı son derece yüksek, düşük kapasiteli, düşük maliyetli NGS sistemleridir. Sistem maliyetlerinin kapiler dizileme cihazları maliyetine düşmesi, bu sistemlerin rutin laboratuvarlarda geçen iki yıl içinde yoğun olarak kullanılmasını sağlamıştır. Bu sistemlerde DNA etiketlemesi denilebilecek olan indeksleme yöntemiyle birlikte yüzlerce hastaya ait DNA tek seferde analiz edilebilmektedir. Sistemin rutine bu kadar rahat girmiş olmasının nedeni, hiçbir optimizasyona gerek kalmadan amplikon sekanslama yapabilmesidir. Sanger sekanslama için hazırlanan PCR amplikonları ekstra bir işleme gerek kalmadan örnek hazırlama basamağından sonra sisteme yüklenebilmektedir. Örneğin rutin bir MiSeq çalışmasında 500’e yakın hastanın tek seferde sonucunun alınması mümkün olmaktadır. Bu sistemler sayesinde kistik fibroz, FMF, talasemi gibi yaygın görülen hastalıklara ait genler çok daha düşük maliyetle çalışılır hale gelmiştir. Buna ek olarak BRCA1 ve BRCA2 gibi büyüklüğü nedeniyle çalışılması zor olan genler rutinde daha yaygın bir şekilde bakılır hale gelmiştir. Ayrıca sağırlık, MODY, Bardet Biedel Sendromu gibi genetik heterojenite gösteren hastalıklarda, o hastalığa neden olan genlerin tamamının tek seferde bir panel şeklinde çalışılabiliyor olması da sistemin avantajları arasındadır. Şu anda laboratuvarımızda kullanılan MiSeq sistemi ile rutinde 3 hastaya ait 4800 gen tek seferde analiz edilebilmektedir. Kanser araştırmaları ve tanısı NGS teknolojilerinden en fazla faydalanılan alanlardan bir tanesi olmuştur. Kanser, tek bir hücreden köken alan genetik bir hastalıktır. Tek hücreden köken alan bozukluğun yıllar içinde klinik bir kanser olarak ortaya çıkabilmesi için, birçok moleküler mekanizmadaki bozukluğun tabloya eşlik etmesi gerekmektedir. Bu nedenle kanser aynı zamanda birçok genin etkilendiği kompleks bir hastalıktır. Hemen her kanserde farklı yolaklar ve genler etkilenmektedir. Tüm bu faktörler nedeniyle kanser genetiği ile ilgili çalışmalar uzun yıllar istenilen düzeyde olmamıştır. NGS teknolojileri kanser genomu araştırmalarına bütüncül bir yaklaşım getirmiştir. Örneğin kanserin ortaya çıkmasına neden olan genler, yatkınlık yaratan genler ve farmakogenetik açıdan önemli olan genler tek seferde incelenebilir hale gelmiştir. Bundan sonraki süreçte kansere neden olan moleküler mekanizmaların çok hızlı bir şekilde aydınlatılacağı düşünülmektedir. Özetle, NGS teknolojileri genetik anazlilerin süresinde ve maliyetinde çok kısa bir süre içinde dramatik düşüşlere neden olmuştur. İnsan genomunun dizilenmesinin bu yıl 1000 doların altına düşmesi beklenmektedir. Bunun yarattığı olumlu etki hem genetik tanıda hem de araştırmalarda kendisini çok kısa sürede gösterecektir. 14 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu PROSTAT KANSERİNİN İLERLEME SÜRECİNDE miRNA’ LAR Doç. Dr. Buket KOSOVA Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İzmir Prostat kanseri erkeklerde en sık görülen kanser türü olup, kansere bağlı ölüm nedenleri arasında da akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır. Normal prostat dokusunun gelişimi, farklılaşması ve devamlılığının sürdürülmesinden androjen hormonları sorumludurlar. Androjenler prostat hücreleri üzerindeki proliferatif ve farklılaştırıcı etkilerini androjen reseptörü (AR) aracılığıyla gerçekleştirirler. Ancak, AR prostat kanseri hücrelerinin yaşamı, canlılığı, apoptoz, hücresel çoğalma ve anjiyogenezin uyarılması gibi tedaviyi olumsuz yönde etkileyebilecek değişimler üzerinde de işlevseldir. Androjen-baskılama tedavilerine, yani kastrasyona, dirençli prostat kanseri hücre seri modellerinde AR ekspresyonunun baskılanmasının hücre proliferasyonunu inhibe ettiğinin gözlenmesiyle AR’nin kastrasyona-dirençli prostat kanseri hücrelerinin büyümesinden de sorumlu olduğu anlaşılmıştır. Bu nedenle AR, androjene duyarlı ve dirençli prostat kanseri tedavilerinde artık önemli bir terapötik hedef olmuştur. Günümüzde araştırmalar prostat kanserinde AR düzenleme mekanizmasına odaklanarak AR ekspresyonunu etkin bir şekilde baskılayan yeni tedavi stratejileri üzerinde yoğunlaşmıştır. Endojen olarak kodlanan ve insanda sayıları bini geçen ~17–23 nükleotid uzunluğundaki tek zincirli mikroRNA (miRNA)’lar hedef mRNA’ larına özgül olarak bağlanarak translasyonlarını inhibe edebilmektedirler. Genellikle bir miRNA birden fazla farklı mRNA’yı hedefleyebildiğinden ilgili mRNA’ları kodlayan genlerin ekspresyonları da tek bir miRNA tarafından düzenlenebilmektedir. Bu nedenle, miRNA’ların anormal ekspresyon kalıpları başta kanser olmak üzere çeşitli hastalıklara da yol açabilmektedirler. Gerçekten de miRNA’ların ekspresyonlarındaki değişimler prostat, böbrek ve mesane başta olmak üzere birçok ürolojik kanserin patofizyolojisinde işlev görmektedir. Bu nedenle, özellikle kastrasyona-dirençli prostat kanseri modelinden yola çıkarak androjene karşı gelişen dirençte önemli olan ve aynı zamanda AR’yi de hedefleyen miRNA’ları araştırmaktayız. Çalışmamızda ilgili miRNA’ların etkiledikleri ve direnç gelişiminde önemli hücresel yolaklarda yer alan diğer hedef genlerin bozulan işlevlerini belirlemek amaçlanmıştır. Direnç gelişim mekanizmasının alt basamaklarının aydınlatılması prostat kanserinde özgül terapötik hedeflerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. 15 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu 16 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu İnsan Primer Aort Hücrelerinde miRNA’ların Yeni Nesil Dizi Analizi Yöntemi ile belirlenmesi Yrd.Doç.Dr. Yasemin Eraç E.Ü. Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji AD, 35100 İzmir Sıçan aortunda TRPC ekspresyonlarındaki yaşa bağlı değişimleri incelediğimiz çalışmalarımızda (TÜBİTAK 103S176) hücrenin birçok yaşamsal sürecinde işlev gören depo-kontrollü kalsiyum kanallarının (Store-operated Ca+2 Channels, SOCC) temel bileşenini kodlayan TRPC1 (transient receptor potential canonical 1) geninin ekspresyonu azalırken TRPC6 düzeylerinin artması (ERAC, 2010) yaşlanma sürecinde bu iyon kanallarının işlevsel önemine dikkat çekmiştir. Alfa-adrenerjik reseptörler (α AR) ile aktive olan Ca+2 kanallarının bir bileşeni olduğu önerilen TRPC6 protein düzeylerindeki artışla beraber α AR yanıtlarının yaşlanma sürecinde potansiyelize olması aynı zamanda proliferasyonla ilişkili TRPC6 artışlarının yaşa bağlı gelişen vazospastik olgularla ilişkili olduğunu düşündürmüştür. Yaşlanma sürecinde görülen TRPC1 düzeylerindeki azalmayı embriyonik sıçan aort hücre kültürlerinde (A7r5) post-transkripsiyonel gen susturma (post-transcriptional gene silencing, PTGS veya RNA interferans, RNAi) yöntemi kullanılarak taklit ettiğimizde TRPC6 artışının (TÜBİTAK 104S568) yanı sıra SOC girişi (store-operated Ca2+ entry, SOCE) de anlamlı olarak artmıştır (SELLI, 2009). Normal deneysel koşullarda gözlemlediğimiz bu sonuçların patolojik koşullarda da incelenmesi amacıyla karaciğer kanseri hücre serisinde (Huh-7) TRPC1’in baskılandığı koşullarda SOCE’nin artması (TÜBİTAK 108S072), TRPC1 proteininin SOCC’lerin hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda temel düzenleyicisi olduğu yönündeki hipotezimizi desteklemektedir. Kanal bileşimine katılan proteinleri hedefleyen spesifik blokörlerinin olmaması in vivo koşullarda TRPC kanallarının damar düz kas sistemindeki işlevinin belirlenmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle TRPC kanallarının işlevine yönelik yapılan çalışmalar “knock-out” fare modelleri, hücre kültürlerinde PTGS ile yapılan “knock-down” ya da aşırı ekspresyon (over expression, OE) modellerinde gerçekleştirilmektedir. Damar dokusundaki mekanizmayı algılamak amacıyla insan primer aortik düz kas (Human Aortic Primary Smooth Muscle, HASM) hücrelerinde plazmid vektör aracılı PTGS ve OE yöntemi ile TRPC1 geninin ekspresyonu sırasıyla azaltılmış ve artırılmıştır. TRPC proteinleri damar düz kasında başlıca damar bariyerinin sürdürülmesi, oksidatif stres aktivasyonu, vazokonstriksiyon/dilatasyon, proliferasyon, anjiyojenez, “remodeling” gibi süreçlerde işlev görmektedir. TRPC proteinlerinin birçok nörodejeneratif hastalık ve kanser olguları ile ilişkilendirilmesinin yanı sıra kalp damar sistemi ile ilgili birçok hastalıkta da ekspresyonel değişimleri bu proteinlerin terapötik hedef olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, TRPC genlerinin ekspresyonlarının düzenlenmesine yönelik mekanizmaların aydınlatılması Ca +2 homeostazı ile ilişkili hastalıkların ayrımsal tanı ve tedavisinde kolaylık sağlayacaktır. Dokuya spesifik miRNA ekspresyon kalıplarının bilinmesinin hastalıkların ayrımsal tanısında ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde yaşamsal değeri vardır. Bu amaçla, TRPC1 “knock-down” ve OE edildiği HASM hücrelerinde miRNA ifade kalıplarının belirlenmesi amacıyla FLX 454 Genome Sequencer GS (Roche) sisteminde yeni nesil dizileme (Next Generation Sequencing, NGS) çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Pirodizileme (Pyrosequencing, PS) sistemi geleneksel Sanger dizileme sistemine alternatif ilk otomatize yüksek kazançlı tüm genom dizileme sistemidir. Jonathan 17 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu Rothberg tarafından kurulan 454 Life Sciences’ın düşük-maliyetli gen dizileme metodu 2005 yılında Biotech-Medical kategorisinde “Wall Street Journal’s Gold Medal for Innovation” ödülünü kazanmıştır. Kasım, 2006’da Rothber, M. Egholm ve arkadaşları, Svante Paabo ile birlikte Nature’da bir makale yayınlamışlardır. 454 platformunda gerçekleştirilen bu çalışmada Neandertal genomunun ilk bir milyon baz çifti dizilenmiştir. Aynı grup tarafından Neandertal genomunun tümünün dizilenmesi amacıyla 2006 yılında “Neandertal Genom Projesi” başlatılmış ve bu projenin sonuçları 2010 yılında Science dergisinde yayınlanmıştır (Green RE, Krause J, Briggs AW, et al. (May 2010). "A draft sequence of the Neandertal genome". Science 328 (5979): 710–22). İlk bireysel dizinin belirlenmesi amacıyla Rothberg ve 454 Life Sciences tarafından başlatılan “Jim” projesi Mayıs, 2007’de James Watson’ın genomunun dizilenmesinin ardından tamamlanmıştır. Genomik DNA dizilendiği durumda DNA’nın sistem için uygun 300-800 baz büyüklüğündeki fragmanlara ayrılma aşaması sRNA’ların boyutlarının zaten küçük olması nedeniyle gerçekleştirilmesine gerek yoktur. GS FLX sistemine uygun cDNA kütüphanesinin hazırlanması için iki alternatif yöntem bulunmaktadır. Birinci metoda göre, standart GS FLX DNA kütüphane hazırlama protokolü (Rapid Library Preperation Kit, Roche) ile cDNA’lar dizilemeye hazır hale getirilmektedir. GS sürecine spesifik A ve B adaptörleri (44mer adaptörler) sRNA’ların çift-sarmal (double-strand, ds) cDNA kopyalarını “blunt-end” oluşturacak şekilde eklenir. Bu şekilde oluşturulan ds kütüphane ile klonal amplifikasyon için emülsiyon PCR (emPCR) basamağı tamamlanır. Amplifikasyon sonrası her sRNA molekülünün dizileme aşaması gerçekleştirilir. İkinci yönteme göre ise GS-spesifik A ve B adaptörleri sRNA’nın ds cDNA kopyalarına PCR ile eklenir. Bu yöntemde, PCR amplifikasyon primerleri füzyon primer çiftidir ve her biri ~20 bç’lik sRNA adaptörleri (3’ ya da 5’ adaptör) ve 19-bç sabit diziyi (Primer A ya da Primer B) içermektedir. Füzyon primerlerinin primer A ve primer B bölgeleri klonal amplifikasyon (emPCR aşaması) ve dizileme için bağlanma bölgesi olarak görev yapmaktadır. Çalışmamızda GS FLX sistemine uygun cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasına yönelik olarak ikinci yöntem uygulanmıştır. Her iki yöntem ile hazırlanan sRNA’ların ds cDNA kopyaları GS FLX sisteminin ortak süreçleri olan sırasıyla emPCR ve PS aşamalarına transfer edildiler. GS FLX NGS sistemi ile yapılacak olan PS için örneklerin hazırlanması amacıyla öncelikle küçük RNA’lardan (small RNA, sRNA) çift-sarmal cDNA oluşturulur. sRNA’lar (~15-30 baz) ile çalışmayı kolaylaştırmak ve ters transkriptaz reaksiyon primerleri ile eşleşme amacıyla bu moleküllerin 5’ ve 3’ uçlarına uygun adaptörler (~20 bç) eklenir ve ardından cDNA’ya dönüştürülürler. Bir sonraki aşama elde edilen cDNA’ların PCR ile çoğaltılmasıdır. miRNA’ların kalıp olarak kullanılması ile oluşturulan cDNA’lar GS FLX sistemi ile dizilemeye uygun hale getirilmek amacıyla 454 sekans primerleri ile PCR reaksiyonu gerçekleştirilir. Bu PCR sonucunda elde ettiğimiz DNA kütüphanesine ait her bir kalıp dizinin 5’ ve 3’ uçlarında emülsiyon PCR ve PS için gerekli diziler eklenmiş olur. TRPC1 geninin baskılandığı ve aşırı düzeyde ifade edildiği HASM hücrelerinde miRNA ifade kalıplarının belirlenmesi amacıyla FLX 454 GS (Roche) sisteminde yeni nesil dizileme (Next Generation Sequencing, NGS) çalışmaları gerçekleştirilmiştir. miRNA ifade kalıplarının belirleneceği GS FLX Sistemi NGS çalışmalarına ait süreçler aşağıda özetlenmiştir. I. cDNA kütüphanesinin hazırlanması: 18 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu 1. Total RNA izolasyonu: Trizol (Invitrogen) ile total RNA izolasyonu gerçekleştirilir. 2. sRNA’ların ayrılması: Kullanıma hazır %15’lik poliakrilamid (PAA) üre jele (Biorad) yüklenen total RNA elektroforez ile farklı molekül ağırlıklarına göre ayrılır. 15-30 nükleotid büyüklüğündeki sRNA’lar jelden ayrıştırılır. 3. 3’ ligasyon: sRNA’ların 3’ ucuna, 3’ Modban adaptörün eklenmesi amacıyla mutant T4 RNA ligaz varlığında (ATP bulunmayan tampon çözelti ile) 2 saat oda sıcaklığında bekletilerek ligasyon işlemi gerçekleştirilir. 3’ ucuna başarı ile adaptör eklenen sRNA’ları ayırmak amacıyla ligasyon ürünü %15 PAA üre jele yüklenir ve yaklaşık 40 bç RNA’lar jelden ayrıştırılır. 4. 5’ ligasyon: 3' ucuna adaptör eklenen sRNA’ların jelden saflaştırılması sonrasında bu RNA’ların 5' ucuna Nelson adaptörünün eklenmesi amacıyla T4 RNA ligaz enzimi varlığında ligasyon reaksiyonu gerçekleştirilir. 5. Ters transkripsiyon reaksiyonu: 5'-fosfat (PO4) ve 3’-OH uçlarına adaptör eklenen sRNA fragmanları kalıp olarak kullanılarak ters transkriptaz enzimi ile cDNA’ların sentezi gerçekleştirilir. Bu amaçla öncelikle Modban adaptörüne komplementer diziye sahip BanOne primeri ile bağlanma (annealing) reaksiyonu gerçekleştirilir. Bağlanma reaksiyonunu takiben birinci tek sarmal cDNA sentezi için “SuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR” (Invitrogen) kiti kullanılmıştır. 6. Birinci sarmal cDNA’nın PCR ile çoğaltılması: Çalışmanın bu aşamasında RNA örneklerinde bulunan tüm miRNA’ların kalıp olarak kullanılması ile elde edilen cDNA’lar çift iplikli cDNA’lara dönüştrülerek PCR ile çoğaltılmışlardır. Bu yöntemle miRNA’lara ait cDNA kütüphanesi oluşturulmuştur. Bu amaçla Taq DNA Polymerase, dNTPPack (Roche) kiti kullanılarak PCR reaksiyon gerçekleştirilmiştir. 4. cDNA’nın jelden ekstraksiyonu: Bu amaçla yüksek çözünürlüğe sahip ve küçük DNA fragmanlarının ayrılmasını sağlayan MetaPhor Agarose (Cambrex) kullanılmıştır. MetaPhor agaroz ile 20 bç- 800 bç DNA fragmanları yüksek çözünürlükle ayrılabilmektedir. PCR ürünü cDNA’lar %4 MetaPhor Agaroz jele yüklenir. Yaklaşık 70mer DNA fragmanı jelden ayrıştırılır. 5. cDNA’lara 454 sekans primerlerinin eklenmesi: cDNA’ların GS FLX sistemine uygun hale getirilmesi ve çoğaltılması amacıyla F ve R 454 füzyon primerleri ile Taq polimeraz enzimi varlığında PCR işlemi gerçekleştirilir. PCR ürünü Qiaex II Gel Extraction Kiti (Qiagen) ile %2 MetaPhor agaroz jelden ayrıştırılır. Elde edilen cDNA’lar GS FLX sekanslama sistemine hazır hale gelir. II. emPCR: Bu kapsamda öncelikle cDNA kütüphanesinin miktar tayini ve gerekli seyreltmeler gerçekleştirilmiştir. cDNA kütüphanesinin konsantrasyon değerleri (ng/μl) Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent (Invitrogen) kiti kullanılarak Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo) çoklu plak okuyucuda fluorometrik olarak belirlenmiştir. cDNA ng/μl konsantrasyon değerlerinin molekül/μl olarak hesaplanabilmesi için aşağıdaki formül kullanılmıştır. emPCR gerçekleştirilmeden önce yakalama boncuklarına eklenecek uygun DNA miktarının belirlenmesi amacıyla titrasyon yapılmıştır. Emülsiyon titrasyonu ile 19 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu dizileme kalitesinin bir göstergesi olan boncuk zenginleştirme yüzdesinin (% bead enrichment, % BE) belirlenmesi sağlanmaktadır. Emülsiyon titrasyon aşamasında, sabit DNA yakalama boncuk sayısına karşılık farklı miktardaki DNA miktarları ile gerçekleştirilen emPCR amplifikasyonu sonrasında, DNA taşıyan boncuklar zenginleştirilmiş ve % BE değerleri hesaplanmıştır. En iyi dizileme sonuçları yaklaşık %8 EB ile elde edilirken, % 5-20 EB değerleri de kabul edilebilir değerler olarak bildirilmiştir. Kütüphane oluşturulduktan sonra cDNA fragmanları boncuklara sabitlenir. Bu aşamada her DNA bağlayıcı boncuğa “DNA Capture beads” sadece bir DNA fragmanının bağlanması önem taşımaktadır. Bu nedenle 1:1 oranını sağlamak amacıyla farklı cDNA ve DNA Capture oranları denenerek optimum miktarlar bulunur. DNA’nın boncuk üzerine bağlanması kütüphane hazırlanması aşamasında DNA’nın her iki ucuna PCR ile eklenen 454 F ve R füzyon primerleri ile sağlanmaktadır. Boncuklar üzerinde bu dizilere karşılık gelen oligonükleotidler bulunmaktadır. Her bir mikroküre içerisindeki PCR ajanlarının varlığında DNA Capture boncuğunun üzerinde bulunan 454 füzyon primerlerine karşılık gelen diziler ile PCR’ın her döngüsünde boncuğa bağlı DNA fragmanları çoğaltılmaktadır. Emülsiyon PCR (emPCR), GS FLX Titanium SV emPCR (Lib-A) kiti (Roche, Tablo 5.2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. III. PS: Pirodizileme aşaması için GS FLX Titanim Sequencing XLR70 (Roche) ve GS FLX Titanium PicoTiterPlate 70x75 (Roche) kitleri kullanılmıştır. PS aşaması 29 ya da 44 μm çapında kuyucuklar içeren “PicoTiterPlate, PTP” üzerinde gerçekleşmektedir. PTP (70x75 mm) yaklaşık 1,6-3,4 milyon kuyucuktan oluşmaktadır. Her bir kuyucuk tek bir DNA boncuğunun girmesine izin verecek büyüklüktedir. Ortalama DNA boncuğu: kuyucuk çapı 28:44 ve 20:29 μm’dir. “Sentez ile dizileme” mantığına dayanan PS aşamasında boncuk üzerindeki tek sarmal DNA dizisine komplementer primerler bağlanır. Ardından ardışık olarak gönderilen T, C, A ve G bazlarının (deoxynucleoside triphosphate, dNTP) kalıp DNA’ya komplementer olması durumunda oluşan ışıma CCD kamera ile belirlenir. Nükleotid akışı sırasında komplementer bazın DNA polimeraz aracılığı ile bağlanması dNTP’den pirofosfat (pyrophosphate, PPi) açığa çıkmasına neden olur. Ortamda bulunan ATP sülfürilazın PPi’yi ATP’ye dönüştürmesi sonrasında lüsiferaz enzimi lüsiferini oksilüsiferine dönüştürür. Oluşan oksilüsiferin ise ışık yayılmasına neden olur. Işığın şiddeti bazın bağlanması ile açığa çıkan ATP ile doğru orantılıdır ve o anda sisteme gönderilen bazdan kaç tane bağlandığı belirlenebilir. PTP aşağıdaki sıraya göre yüklenir: 1. Enzim boncukları (ön-tabaka), 2. DNA ve dolgu boncukları 3. Enzim boncukları (üst-tabaka) 4. PPiaz boncukları Enzim boncukları üzerine, kemilüminesans sistem enzimleri sülfirilaz ve lüsiferaz sabitlenmiştir. PPiaz boncukları, herbir nükleotid akışı süresince kuyucuklar arası sinyal girişimini azaltmak ve arka plan gürültüyü azaltmak amacıyla inorganik pirofosfatı (PPi) uzaklaştırır. Dolgu boncukları, dizileme süresince kuyucuklardaki sabitlenmiş tüm bileşenlerin stabil halde kalmasını sağlar. PS sistemi geleneksel Sanger dizileme sistemine alternatif ilk otomatize yüksek kazançlı tüm genom dizileme sistemidir. Jonathan Rothberg tarafından kurulan 454 Life Sciences’ın düşük-maliyetli gen dizileme metodu 2005 yılında Biotech-Medical 20 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu kategorisinde “Wall Street Journal’s Gold Medal for Innovation” ödülünü kazanmıştır. Kasım, 2006’da Rothber, M. Egholm ve arkadaşları, Svante Paabo ile birlikte Nature’da bir makale yayınlamışlardır. 454 platformunda gerçekleştirilen bu çalışmada Neandertal genomunun ilk bir milyon baz çifti dizilenmiştir. Aynı grup tarafından Neandertal genomunun tümünün dizilenmesi amacıyla 2006 yılında “Neandertal Genom Projesi” başlatılmış ve bu projenin sonuçları 2010 yılında Science dergisinde yayınlanmıştır (Green RE, Krause J, Briggs AW, et al. (May 2010). "A draft sequence of the Neandertal genome". Science 328 (5979): 710–22). İlk bireysel dizinin belirlenmesi amacıyla Rothberg ve 454 Life Sciences tarafından başlatılan “Jim” projesi Mayıs, 2007’de James Watson’ın genomunun dizilenmesinin ardından tamamlanmıştır. 21 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu 22 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu İnsan Hepatoselüler Karsinoma Hücre Hattında Transkriptom Analizi Arş.Gör. Dr. Çiğdem Selli E.Ü. Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Gelişmekte olan mikroRNA tedavileri mikroRNA (miRNA)’lar birçok hastalığın düzenlenmesinde görev alan yeni tedavi hedefleridir. Küçük olmaları ve korunmuş bir diziye sahip olmaları ilaç geliştirme süreçlerinde avantaj sağlamaktadır. Belirli bir miRNA dizisini spesifik olarak inhibe eden “anti-mir” ler yeni bir ilaç grubu olma potansiyeli taşımaktadır. Tek bir miRNA’nın belirli bir hücresel süreçte veya yolakta görev alan çok sayıda genin ekspresyonunu düzenler ve bu nedenle “anti-mir” tedavi belirgin bir etki oluşturur. Günümüzde hastalık durumları ile ilişkili miRNA’lar belirlenmekte ve bu miRNA’ları hedefleyen spesifik anti-mir ilaçlar geliştirilmektedir. Ateroskleroz, kalp yetmezliği, HCV enfeksiyonu, inflamasyon ve anjiojenezden sorumlu miRNA’lar (sırasıyla miR33, miR-208, miR-122, miR-155, miR-92a) üzerinde çalışılan tedavi hedefleridir (JacksonLevin, 2012) (van Rooij et al., 2012). Transkriptom analizi, anti-mir tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılan bir yöntemdir. Tedavi sonrası ilgili miRNA’nın hedeflediği genlerin ekspresyon düzeylerinin artması beklenmektedir. Faz II klinik çalışmalarda kronik HCV enfeksiyonunun tedavisinde test edilen ilk anti-mir ilaç miR-122’yi hedefleyen miravirsen (SPC3949)’dir. miR-122, karaciğer spesifik bir miRNA’dır ve HCV çoğalmasını destekleyici yönde rol oynar (Jopling, 2008). Azalmış miR-122 düzeyleri hepatoselüler karsinoma ile ilişkilidir (Koberle et al., 2013). Kronik HCV enfeksiyonu taşıyan şempanzelerin karaciğer dokusunda yapılan transkriptom analizi sonucunda, miravirsen uygulaması sonrasında miR-122 hedef bölgesini (seed region) taşıyan mRNA düzeylerinde belirgin artış belirlenmiştir (NormanSarnow, 2010). Transkriptom analizi Karaciğer kanseri hücrelerinde (Huh7) yaptığımız çalışmalarımızda, depo-kontrollü kalsiyum girişine aracılık ettiği düşünülen TRPC1 geni susturulduğunda, hücre proliferasyonunun baskılandığı belirlenmiştir (Selli C, 2012). TRPC1 düzeyleri baskılanmış Huh7 hücrelerinde gerçekleştirdiğimiz tüm genom gen ekspresyonu çalışmasına ilişkin bilgiler aşağıda verilmiştir. Transkriptom analizi, Illumina HumanHT-12 BeadChip v3 gen çipi kullanılarak direkt hibridizasyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. RNA örnekleri çip üzerine hibridize edilmeden önce çoğaltılmış ve biotin ile işaretlenmiştir. Hibridizasyon sonrası Cy3streptavidin ile işaretleme yapılmış ve çip görüntülenmiştir. Kullanılan gen çipi üzerinde 12 adet örnek haznesi ve her bir haznede, tanımlanmış 25.000 adet gene spesifik 48.000 adet prob bulunmaktadır. 50mer uzunluğundaki problar adres dizi ile 3 mikron çapındaki küreler üzerine bağlıdır. Kullanılan gen çipi ve direkt hibridizasyon çalışma prensibi Şekil 1’de verilmiştir. Transkriptom analizinde, vektör-aracılı geçici PTGS uygulamasından 48 saat sonra izole edilen, gerçek zamanlı qRT-PCR analizi ile TRPC1 düzeylerinin %50 oranında azaldığı belirlenen RNA örnekleri ile çalışılmıştır. a) RNA amplifikasyonu RNA amplifikasyonu, RNA örneklerinin çoğaltıldığı ve biotin ile işaretli cRNA’lar oluşturulduğu basamaktır. Çalışmamızda HuH-7 hücrelerinden izole edilen RNA 23 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu örnekleri (500 ng) Illumina Total Prep RNA Amplification Kit (Ambion) ile çoğaltılmış ve işaretlenmiştir. Çalışmanın basamakları Şekil 2’de verilmiştir. A B Şekil 1. Transkriptom analizinde kullanılan gen çipi (A) ve direkt hibridizasyon çalışma prensibi (B).www.illumina.com. Şekil 2. RNA amplifikasyonunun basamakları. cDNA, komplementer DNA; dsDNA, çift sarmal DNA; cRNA, komplementer RNA. Özetle, RNA örneklerinden ters transkripsiyon ile birinci sarmal cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla T7 “promoter” taşıyan oligo(dT) primerleri, dNTP karışımı, RNaz inhibitörü ve yüksek verimli ve “full-length” cDNA oluşturan ters transkriptaz (reverse transcriptase, RT, ArrayScript) kullanılmıştır.Daha sonra in vitro transkripsiyonda kalıp olarak kullanılacak çift sarmal DNA (dsDNA) oluşturulmuştur. Bu amaçla dNTP karışımı, RNaz H ve DNA polimeraz kullanılmıştır. Oluşan dsDNA’lar kartuş filtrelerden geçirilerek saflaştırılmıştır. Transkripsiyon kalıbı dsDNA’lardan biotin işaretli RNA’lar (cRNA) oluşturulmuştur. Bu amaçla biotin işaretli NTP’ler ve T7 RNA polimeraz enzimi kullanılmıştır. Oluşan cRNA’lar kartuş filtrelerden geçirilerek saflaştırılmış ve miktar tayini yapılmıştır. Kartuş filtrelerden örnek içine karışabilecek silis kumu OD260 ölçümlerini yanıltabilmektedir. Bu nedenle Quant-iT RNA boyası kullanılarak fluorometrik yöntemle cRNA miktar tayini yapılmıştır (Qubit fluorometre, Invitrogen). 24 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu b) Direkt hibridizasyon ve görüntüleme Çalışmamızda iki grup örnek (kontrol grubu: pSUPERIOR ve uygulama grubu pSUPERIOR.shTRPC1 ile transfekte hücrelerden elde edilen cRNA örnekleri), 3 biyolojik ve 2 teknik örnekleme olacak şekilde hibridizasyon yapılmıştır (Direct Hybridization Assay Kit, Illimuna). Her bir kuyucuğuna 750 ng cRNA yüklenen çip, 16 saat boyunca hibridizasyon fırınında (58°C) inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası sırasıyla yıkama, bloklama ve Cy3-Streptavidin (Amersham) ile işaretleme yapılmıştır. İşaretleme yapılan çip, 0,8 µm çözünürlüğe sahip lazer tarayıcılı konfokal mikroskop içeren sistemde (Illumina BeadArray Reader) ile görüntülenmiş ve sonuçlar GenomeStudio yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Veri analizine geçilmeden önce sistem kontrollerinden alınan sinyaller değerlendirilmiştir. Sistemde kullanılan kontrol problar; hibridizasyon kontrolü, biotin kontrolü ve negatif kontroldür (Şekil 3). Sistem kontrollerinin beklenen şekilde gözlenmesi sonrası veri analizine geçilmiştir. Hibridizasyon kontrolleri, çip üzerinde hibridizasyon aşamasında kullanılan çözelti içinde bulunan Cy3-işaretli oligonükleotidlerle eşleşen 6 adet hibridizasyon probu bulunmaktadır. Bu problar, hibridizasyon doğru şekilde gerçekleştiğinde RNA kalitesinden ve örnek hazırlama işlemlerinden bağımsız olarak sinyal oluştururlar. Cy3-işaretli oligonükleotidler, kademeli hibridizasyon yanıtları oluşturacak şekilde 3 farklı konsantrasyonda (düşük, orta ve yüksek) bulunmaktadır. Çalışmamız sonucunda beklendiği gibi hibridizasyon probları ile kademeli sinyal artışı belirlenmiştir. Biotin kontrolü (sinyal oluşumu kontrolü), hibridizasyon aşamasında kullanılan çözelti içinde bulunan biotin-işaretli oligonükleotidlerle eşleşen 2 adet prob bulunur. Bu problardan pozitif sinyal alınması Cy3 işaretlemesinin başarılı olduğunu göstermektedir. Negatif kontrol, genomdaki herhangi bir hedef ile eşleşmeyen problardan oluşur. Bu problardan alınan sinyalin ortalaması sistemin “background” değerini oluşturur. Analiz aşamasında gen ekspresyon limitlerinin belirlenmesinde bu sinyal ve standart sapması kullanılmaktadır. Çalışmamızda elde edilen “background” sinyal, olması gerektiği gibi 600 değerinin altında bulunmuştur. Hibridizasyon probu Biotin probu Negatif kontrol prob Şekil 3. Transkriptom analizinde kullanılan kontrol probları. 25 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu d) Veri analizi Bu amaçla GenomeStudio (Illumina) ve R yazılımı (lumi paketi) kullanılmıştır. Veri analizi 4 basamakta özetlenebilir: Arka plan sinyalinin çıkarılması: öncelikle sistemden alınan negatif kontrol sinyali tüm örneklerden çıkarılır. Normalizasyon: örnekler arasındaki sinyal şiddetindeki dağılım farklılıklarının en aza indirilmesi için uygulanır. Farklı normalizasyon yaklaşımları bulunmaktadır. Çalışmamızda 7 farklı normalizasyon yaklaşımı (quantile, rsn, vsn, ssn, rank invariant, average, cubic spline) kullanılmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Şekil 4’de quantile normalizasyon uygulanan örneklerdeki sinyal şiddeti dağılımı görülmektedir. A B Şekil 4. Transkriptom örneklerinde quantile normalizasyon öncesi (A) ve sonrası (B) sinyal şiddetinin dağılımı. X ekseni: örnekler, Y ekseni: sinyal şiddeti (intensity). Filtreleme: İfadesi belirgin düzeyde değişen genleri diğer genlerden ayırmak için kullanılır. Filtreleme kriteri değişkendir. Kat değişim (1,3 kat) ve istatistiksel anlamlılık (P<0.05) en çok kullanılan kriterlerdir. Çalışmamızda farklı filtreleme kriterleri kullanılmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Ekspresyon faklılıklarının belirlenmesi (differential expression, DE): Kontrol ve uygulama grubu arasında ekspresyonu anlamlı olarak farklılık gösteren genleri belirlemek için kullanılır. Çalışmamızda az sayıdaki veri setlerinde tercih edilen “rank product” algoritması uygulanmıştır. Sonuç Çalışmamızda TRPC1 proteinin Huh7 karaciğer kanseri hücrelerinin proliferasyonunda rol oynadığı gösterilmiştir (Selli C, 2012). Transkriptom analizi sonucunda hücre döngüsü kontrolünde ve proliferasyonda görev alan bazı proteinlerin mRNA düzeylerinin değiştiği belirlenmiştir. TRPC1’in bu proteinlerle ile etkileşimi ve antiproliferatif etkinin mekanizması ileri çalışmalarda test edilecektir. Transkriptom analizi, tüm genlerin ekspresyonunun belirlenmesini sağlayan ve gelecekte klinik uygulamalarda kullanılma potansiyeli taşıyan bir yöntemdir. Günümüzde belirli genlerin ekspresyon düzeyleri belirlenerek ilaçlı tedaviye yön 26 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu verilmektedir. Örneğin trastuzumab, Her-2 aşırı ekspresyonu olan meme kanserinin tedavisinde kullanılmaktadır (Viani et al., 2007). Gen ekspresyonun belirlenmesi direnç gelişiminin izlenmesi açısından da önemlidir. Örneğin gefitinib, epidermal büyüme faktörü reseptörü tirozin kinaz (EGFR-TK) aktive edici mutasyonu taşıyan küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin tedavisinde etkindir. EGFR mutasyonu bulunmayan hücrelerin bazı pompa proteinlerini (BCRP/ABCG2) aşırı eksprese ederek gefitinibe karşı direnç kazandığı gösterilmiştir (Chen et al., 2011). Özetle, gen ekspresyon profilinin belirlenmesi, özellikle kanser gibi çok faktörlü ve çoklu gen hastalıklarının tedavisinde önem taşımaktadır. Yakın gelecekte miRNA’lara yönelik girişimler ile hastalık durumlarında bozulmuş olan gen ekspresyonu düzenlenebilecektir. Destekler Deneysel çalışmalar, Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) Araştırma Projeleri (104S568, 108S072, proje yürütücüsü Prof.Dr. Metiner Tosun) ve Yurt İçi Doktora Burs Programı (BİDEB 2211, 2005-2010, Çiğdem Selli) tarafından desteklenmiştir. Transkriptom veri analizi, Avrupa Moleküler Biyoloji Organizasyonu burs (EMBO short-term fellowship) desteği ile Edinburgh Üniversitesi, Kanser Araştırma Merkezi’nde Kanserde Uygulamalı Biyoinformatik Çalışma Grubu lideri Dr. Andrew Sims desteği ile gerçekleştirilmiştir. Referanslar Chen Y J, Huang W C, Wei Y L, Hsu S C, Yuan P, Lin H Y, et al. (2011). Elevated BCRP/ABCG2 expression confers acquired resistance to gefitinib in wild-type EGFR-expressing cells. PLoS One 6: e21428. Jackson a L, Levin a A (2012). Developing microRNA therapeutics: approaching the unique complexities. Nucleic Acid Ther 22: 213-225. Jopling C L (2008). Regulation of hepatitis C virus by microRNA-122. Biochemical Society transactions 36: 1220-1223. Koberle V, Kronenberger B, Pleli T, Trojan J, Imelmann E, Peveling-Oberhag J, et al. (2013). Serum microRNA-1 and microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma. Eur J Cancer 49: 3442-3449. Norman K L, Sarnow P (2010). Hepatitis C virus' Achilles' heel--dependence on liver-specific microRNA miR-122. Cell research 20: 247-249. Selli C E Y, Kosova B, Erdal E, Tosun M (2012). TRPC1 silencing suppresses proliferation of HuH-7 human hepatoma cell line. Cell membranes and Free Radical Research 4: 57. Van Rooij E, Purcell a L, Levin a A (2012). Developing microRNA therapeutics. Circulation research 110: 496-507. Viani G A, Afonso S L, Stefano E J, De Fendi L I, Soares F V (2007). Adjuvant trastuzumab in the treatment of her-2-positive early breast cancer: a meta-analysis of published randomized trials. BMC Cancer 7: 153. Whole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guide http://support.illumina.com/documents/MyIllumina/3466bf71-78bd-4842-8bfc393a45d11874/WGGEX_Direct_Hybridization_Assay_Guide_11322355_A.pdf HumanHT-12 v3 Expression BeadChip http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_humanht_12.pdf] Illumina® BeadStudio http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_beadstudio.pdf 27 TFD XXI.Eğitim Sempozyumu 28