Moleküler Nematoloji

Moleküler Nematoloji
27.08.2014
• Eğitim Süresi: 6 ay (29 Aralık 2013 – 29 Haziran 2014)
• Eğitim Yeri: Kaliforniya Üniversitesi, Davis
Bitki Bilimleri Bölümü
Dr. Gülden HASPOLAT
gulden.haspolat@gthb.gov.tr
Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü
Müdürlüğü
Moleküler Nematoloji Egitimi
• Görev yeri:
• ETAE, Bahçe Bitkileri Bölümü, Sebze ve Süs Bitkileri Şubesi
•
•
•
•
•
•
Çalışma Konuları:
Doku kültürü ile çoğaltma teknikleri
Doğal çiçek soğanları
Projeler:
Süs Bitkileri Genetik Kaynakları Araştırmaları Projesi (Proje lideri)
Türkiye Florasında Yayılış Gösteren Doğal Cyclamen Türlerinin Toplanması,
Muhafazası, Karakterizasyonu ve Değerlendirme Olanakları (Proje lideri)
• Karaburun İlçesinde Nergis ve Sümbül Yetiştiriciliğinde Karşılaşılan Sorunlar
ve Bu Sorunlara Çözüm Önerileri (Yardımcı Araştırıcı)
Moleküler Nematoloji Egitimi
Sunum Planı
•
•
•
•
•
•
Kaliforniya Üniversitesi
Hocalar: Dr. Cai-Zhong Jiang ve Prof. Valerie M. Williamson
Laboratuvar güvenlik eğitimleri
Nematodlara yönelik moleküler çalışmalar
Diger moleküler çalışmalar
Ziyaret edilen fidanlıklar, bahçeler ve kuruluşlar
• 1905 yılında kurulmuştur.
• 2100 ha alanı vardır.
MANN LAB
Botanik Bahçesi
Çalışılan Laboratuvar:
Louis Mann Laboratuvarı
Mann
Laboratuvarında
Çin’de, Japonya’da ve
ABD’nin farklı
eyaletlerinde
moleküler tanımlama
konusunda projeler
yürütmüş bitki
fizyolojisti Dr. CaiZhong Jiang ve ekibi
ile birlikte
çalışılmıştır.
Prof. Valerie M. Williamson
Nematolog
• Boston Northeastern Üniversitesi Biyoloji Bölümü
• UC Davis Bitki Patolojisi Nemataloji Bölümü öğretim üyesi
• Verdiği dersler:
• Moleküler biyoloji laboratuvar tekniği
• Tarımsal Biyoteknoloji
• Çalışma alanı:
• Kök ur nematodları; konukçu ve parazit arasındaki ilişkiyi
moleküler ve genetik yöntemleri kullanarak belirleme
Çalışma Konuları
• Oksin
sentezinde
etkili
olan
(düzenleyici) gen bölgelerini tanıyan
PCR’da çoğaltılmıştır.
regülatör
primerler
• Nematod enfekte edilmiş domates ve petunya
bitkilerinin koklerinden RNA çıkarılmıştır ve cDNA
elde edilmiştir.
• Real time PCR ile cDNA’ların normalizasyonu
sağlanmış ve oksin sentezinde etkili olan genlerin
seviyeleri kontrol edilmiştir.
Çalışma Konuları
• Bitkilere Agrobacterium tumafaciens ile gen
transferi
• Virüs (VIGS) aktararak gen susturma ve gen
susturmaya bağlı olarak bitkilerde oluşan renk
değişimleri
– Laboratuarda yürütülmekte olan çalışmalara aktif
katılım sağlanmıştır.
Derslere Katılım
• Advanced Molecular Biology
• Introduction of Biotechnology
• Functional Genomics
Moleküler Analiz Basamakları
•
•
•
•
•
Örneklerin toplanması
DNA RNA ekstraksiyonu
PCR
Elektroforesis
Moleküler analiz
UC, Davis
Nematoloji
Bölümü
Primer Siparişi
UC Davis, DNA Sıralama Kurumu (UCD DNA Sequencing Facility )
Primerlerin hazırlanması
ARF2, ARF3, ARF4, ARF5, ARF8,PIN3, PIN4-1, PIN4-2, PIN9, PIN101, PGP4-1, PGP4-2, GH3-3, GH3-4, GH3-5, GH3-8 gibi genlere ait
primerler
Saflaştırma – Jeli Temizleme
RNA ekstraksiyonu öncesi hazırlıklar
Trizol ile RNA ekstraksiyonu
DNAse Uygulaması ve cDNA sentezi
Konsantrasyon Ölçümü
Real Time PCR
D1D1 D2D2 D3D3 D4D4 D1D2 D3 D3 PC PC PNPN TC TN TC TC TNTN PCPC PN PNPN D1D0D0 D2D2 D4D4 D6D6 TR TP TLTL
Domates Petunya Nematod RNA
TCR
1 2
3
TVW6R
1 2
3
4
4
TCS
1 2
TVW6S
1 2
3
TVW9P
1 2
4
3
4
3
4
IAA3 IAA7 IAA9 IAA10
C N C N C N C N
PIN1 PIN2 PIN5 PIN6 PIN7
C N C N C N C N C N
SlPIN3 SlPIN4-1 SlPIN4-2 SlPIN9 SlPIN10-1
C N C N C N C N C N
SlGH3-3 SlGH3-4 SlGH3-5 SlGH3-8
C N C N C N C N
PGP4-1
C N
PGP4-2
C N
VIGS (Virus induce gene silencing)
Gen susturma
Geni Bitkiye Aşılama –İnokülasyon-
Geni Bitkiye Aşılama –İnokülasyon-
Geni Bitkiye Aşılama –İnokülasyon-
Seralarda bulunan bitkiler
Gerrardanthus macrorhizus
Welwitschia mirabilis
Davis ve Catalina Botanik Bahçesi
Ulusal Klonal Germplazm Havuzu
(National Clonal Germplasm Repository)
Red Wood Ormani
Biodinamik Tarım
Ziyaret Edilen Üretici Firmalar
Bitki Servisi Kurumu
(Foundation Plant Services)
PCR
PCR, DNA’nın in vitro’da ısınsal döngü makinesi ile
enzimatik sentezletilmesidir.
Prosedür küçük miktardaki spesifik bir DNA parçasının, bir
dizi enzimatik reaksiyon sonucu milyonlarca kez
çoğaltılması esasına dayanmaktadır. DNA’nın tamamı
değil, istenilen bazı bölgeleri çoğaltılmaktadır.
•
•
•
•
•
PCR bileşenleri
Şablon DNA (Template DNA)
Taq DNA polymerase
Primer (forward - reverse)
Buffer
Nukleotidler (dNTP): Adenin, Guanin, Sitozin, Timin
Denaturation (Sarmalın açılması) 96 oC
Annealing (Primer bağlanması) 37 oC
Extention (DNA’nın uzatılması) 72 oC
Yüksek sıcaklıkta (96oC)’de DNA
sarmalı açılmakta (Denaturation),
sıcaklık 37oC’ye düşürüldüğünde
primerler DNA’nın karşılıklı kolları
üzerinde bulunan primer bağlanma
bölgelerine bağlanmakta (Annealing)
ve sıcaklık 72oC’ye çıkarıldığında Taq
DNA polimeraz enzimi ortamdaki
nükleik asitleri (A, G, C ve T) kullanarak
uygun DNA bölgesini çoğaltmaktadır.
Bu döngünün her tekrarında elde
edilen DNA kısmı iki kat artmakta ve 20
döngü sonunda 106 (220) DNA parçacığı
elde edilmektedir.