deney ı - Marmara Üniversitesi
advertisement
Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 0 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı İçindekiler Laboratuvar Kuralları ve Güvenlik……………………...…………….....2 Deney I Amino Asitlerin Titrasyon Eğrileri Ve İzoelektrik Nokta Tayini ……………….…....3 Deney II Amino Asitlerin Kağıt Kromatografisi İle Ayrılmaları………………………….......7 Deney III Amino Asitlerin Ve Proteinlerin Bazı Özelliklerinin İncelenmesi .……………….…11 Deney IV Tampon Çözeltiler…………………………………………………..……..…………….19 Deney V Katekolün Oksidasyonuna Polifenol Oksidaz Enziminin Etkisi………………………...23 Deney VI Karbonhidratların Bazı Özelliklerinin İncelenme……………………………………...32 Deney VII Lipitlerin Bazı Özelliklerinin İncelenmesi.....................................................40 Deney VIII Kantitatif Askorbik Asit Analizi…………………..………………………....…46 Deney IX Doğal Kaynaklardan Organik Bileşiklerin Elde Edilmesi……………..……49 Deney X Memeli Dokularından DNA İzolasyonu ve Bazı Özelliklerinin İncelenmesi………...…51 Kapak resmi: Canlı yapısındaki önemli biyomoleküller; proteinler, karbohidratlar, nükleik asitler ve lipitler. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 1 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Laboratuvar Kuralları ve Güvenlik Biyokimya laboratuvarında, organizmayı oluşturan temel moleküllerden proteinler, nükleik asitler, karbohidratlar, lipitlerin genel özelliklerinin araştırılması hedeflenmektedir. Her labarotuvardan önce o gün yapılacak olan deneyi mutlaka dikkatle okuyunuz. Her deneyden önce bir kısa sınav yapılacaktır. Bu sınav sonucunda sıfır almış olan öğrenci o deneye alınmaz. Laboratuvarda çalışırken laboratuvar önlüğü ve (steril olmayan) laboratuvar eldiveni kullanılır. Önlük ve eldivenlerinizi laboratuvardan ayrılıncaya kadar çıkarmayınız. Bazı yumuşak lensler laboratuvar kimyasalları ile tepkimeye girerek rahatsızlık oluşturacağından, eğer mümkünse kontak lenslerinizi laboratuvara girmeden önce çıkarınız. Deney esnasında asistanların talimatlarını dikkatle uygulayınız. Deney bitiminde tüm cihazları kapatıp, çalıştığınız yerin temizliğini iyi bir şekilde yapınız. Bazı kimyasallar zehirli, mutajenik, karsinojenik veya teratojenikdir (doğum kusurlarına yol açan). Bu kimyasalların kullanımında ve atılmalarında laboratuvardaki görevlilerin yaptığı uyarıları dikkate alınız. Tüm öğrencilerin bir laboratuvar defteri tutmaları istenmektedir. Deney esnasında yaptığınız her bir ölçümü, deney aşamasını, dikkatle laboratuvar defterinize not alınız. Her deneyin tamamlanmasından sonra en geç bir hafta içinde deney raporlarınızı ilgili asistana teslim ediniz. Bu raporlar aşağıdaki şekilde hazırlanmalıdır. Başlık: Deneyin adı Materyal ve Metod: Kısaca deneyin yapılışı ve kullanılan kimyasallar Sonuçlar ve tartışma: Deney sonunda elde ettiğiniz veriler ve yorumlarınız Çalışma Soruları: Çalışma sorularına verdiğiniz yanıtlar Öğrenciler deneyleri guruplar halinde yapmaktadırlar ancak her bir öğrenci kendi yorumlarını, kendi hazırladığı deney raporu ile sunmalıdır. Birbirinin aynı olan raporlar kabul edilmez. Aynı şekilde çalışma sorularına cevap verilmemiş deney raporları da kabul edilmez. Deneylerin değerlendirilmesinde en önem verilen kısım tartışma kısmıdır. Mutlaka her bir deneyin neden gerçekleştiği (veya neden gerçekleşmediği) konusunda kendi açıklamalarınızı ekleyiniz. Her dönemde bir ara sınav yapılır. Laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney raporlarının %20’si ve ara sınavın %70’i alınarak öğrencinin vize notu saptanır. Ara sınavdan sonra yapılan deneyler için de laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney raporlarının %20’si ve finalin %70’i alınarak öğrencinin final notu saptanır. Biyokimya laboratuvarında devam zorunluluğu %80’dir. 2 kez laboratuvara gelmeyen bir öğrenci devamsızlıktan kalmış olur ve sınavlara alınmaz. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 2 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY I AMİNO ASİTLERİN TİTRASYON İZOELEKTRİK NOKTA TAYİNİ EĞRİLERİ VE Amfoterik maddeler olan amino asitlerde iki fonksiyonel grup bulunur. Bunlar karboksilik asit (-COOH) ve amino (-NH2) gruplarıdır. Bu fonksiyonel gruplar nötral ortamda iç tuz oluştururlar. Nötral Ortamda: (İç Tuz) Asidik Ortamda: (Katyon) Bazik Ortamda: (Anyon) Yukarıdaki denklemlerden de görülebileceği gibi amino asitlerin amino grubu hidrojen iyonu kabul edebilir, karboksil grubu ise hidrojen verebilir. Bu sebepten dolayı amino asitler hem asitler hem de bazlarla titre edilebilirler, yani amfoterik özellik gösterirler. Amino asitlerde titre edilebilir en az iki grubun olması, en az iki denge sabiti (K) ve iki iyonizasyon sabiti (Ki) olduğu anlamına gelir. İzoelektrik nokta (pI), aminoasitte bulunan artı ve eksi yüklerin birbirine eşit olduğu, yani amino asidin net yükünün 0 olduğu pH değeridir, yani K1 ve K2’nin dengede olduğu noktadır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 3 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Asit-baz titrasyonları protonların kademeli olarak eklenmesi veya uzaklaştırılmasıdır. Aşağıdaki şekilde glisinin titrasyon eğrisi gösterilmiştir. Şekilden glisinin iki tamponlama aralığına sahip olduğu görülmektedir. Bunlar pH 2.34 ve pH 9.6 merkezli +/-1 pH aralığına sahip dikdörtgen alanlar olarak gösterilmişlerdir. Glisin bu pH aralıklarında tampon çözelti olarak kullanılabilir. Şekilden de görüldüğü gibi glisinin izoelektrik noktasının teorik değeri 5.97’dir. İyonlaşabilen yan zincire sahip amino asitlerde ise üç bölgeli bir titrasyon grafiği beklenmelidir. Şekil 1.1- Glisinin titrasyon eğrisi KÂĞIT Şekil 1.2- Glutamik asidin titrasyon eğrisi Şekil 1.3- Histidinin titrasyon eğrisi Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 4 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı KİMYASALLAR HCl, NaOH, Glisin. YÖNTEM 50 mL 0.1 N Glisin çözeltisi hazırlanır. pH metrenin kalibrasyonu yapıldıktan sonra, hazırlanan çözeltiden 20 mL’lik bir hacim bir behere aktarılarak pH metre yardımı ile pH tayin edilir. Daha sonra 0.1N HCl ile titre edilir. Her 1 mL asit ilavesinden sonra beher karıştırılarak pH ölçümü yapılır. İşleme pH göreceli olarak sabit kalıncaya kadar devam edilir. pH metrenin elektrodu destile su ile yıkanır, kurulanır. Hazırlanmış olan 0.1N Glisin çözeltisinden bir başka behere 20 mL daha alınır ve pH metre yardımı ile pH ölçümü yapılır. Daha sonra 0.1N NaOH ile titre edilir. Her 1mL baz ilavesinden sonra beher karıştırılarak pH ölçümü yapılır. İşleme pH göreceli olarak sabit kalıncaya kadar devam edilir. Elde edilen değerler veri tablosuna işlenir. Asit titrasyonu veri tablosu: Eklenen HCl (mL) 0 1 pH Eklenen HCl (mL) pH Eklenen HCl (mL) pH Eklenen HCl (mL) pH Baz titrasyonu veri tablosu: Eklenen Baz (mL) 0 1 pH Eklenen Baz (mL) pH Eklenen Baz (mL) pH Eklenen Baz (mL) pH Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 5 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı VERİLERİN KULLANIMI Milimetrik grafik kağıdı kullanarak x eksenine eklenen asit ve eklenen baz hacmini, y eksenine ise ölçülen pH değerlerini koyarak grafiği çiziniz ve grafikten pKa ve pKb değerlerini ve pI değerini bulunuz. Grafik üzerinden elde ettiğiniz verileri teorik değerler ile karşılaştırınız. Şekil 1.4- Glisinin asit ve bazla titrasyon eğrisi ÇALIŞMA SORULARI 1- Glutamik asit ve histidinin pI değeri nasıl hesaplanır? Aminoasitlerin farklı pI değerlerine sahip olmalarının önemi nedir? 2- Genel amino asit denklemi kullanılarak izoelektrik noktası formülü nasıl çıkarılır? Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 6 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY II AMİNO ASİTLERİN KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ İLE AYRILMALARI Kromatografi bir karışımdaki maddelerin iki faz arasında farklı dağılması esasına dayanan bir ayırma yöntemidir. Sistemdeki fazlardan biri sabit (stasyoner) faz, diğeri ise hareketli (mobil) faz olarak adlandırılır. Sabit faz genellikle destek ortamı oluşturmak amacı ile kullanılırken, hareketli faz, karışımı oluşturan bileşenleri taşımak amacı ile kullanılır. Karışımı oluşturan bileşenler hareketli ve sabit faz ile farklı oranlarda etkileşerek farklı hızlarda yürürler. Bu esasa dayalı olarak ayırma yapan yöntemlere kromatografik yöntemler denir ve ayırmayı sağlayan kuvvete göre adsorpsiyon, dağılım, iyon değişim, jel geçirgenlik ve afinite (ilgi) olmak üzere beş sınıfa ayrılır. Kromatografik yöntemler biyokimya alanında, istenen bir maddenin saflaştırılması (örneğin bir bitki ya da bir hayvan dokusundan proteinlerin elde edilmesi), seyreltik çözeltilerin konsantre edilmesi, bir maddenin saflığının kontrol edilmesi ve organizmadaki metabolitlerinin belirlenmesi gibi alanlarda kullanılır. Kâğıt kromatografisi, dağılım kromatografisinin özel bir şeklidir. Burada kullanılan Whatman kromatografi kâğıtları saf selülozdan, herhangi bir katkı maddesi kullanılmadan üretilmiştir ve düzgün gözenek boyutuna sahiptir. Whatman kâğıdı, durağan faz olarak adsorplanmış su içerir. Hareketli fazın kapiler etkisiyle ayrımı yapılacak olan maddeler Whatman kâğıdı boyunca hareketli faz ile etkileşimlerine göre farklı hızlarda ilerlerler. Karışımı oluşturan bileşenler renkli ise kâğıt üzerinde yürüdükleri yerlerde yuvarlağa yakın lekeler şeklinde görülürler. Eğer renksiz iseler üzerlerine bir reaktif püskürtülerek ya da UV ışığı altında renk göstermeleri ile görünür hale getirilirler. Leke büyüklüğü ve renk şiddeti kullanılarak kantitatif veya semi-kantitatif analiz yapılabilir. Retensiyon Faktörü (Rf) lekelerin merkez noktasının başlangıç noktasına uzaklığının, çözücü sınırının başlangıç noktasına olan uzaklığına bölünmesi ile elde edilir. Rf değeri bir karışımı oluşturan bileşenlerin tanımlanması için kullanılır. Aynı şartlarda (sabit ve hareketli fazın cinsi, sıcaklık vb.) kromatografisi yapılan her bir maddenin karakteristik bir Rf değeri vardır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 7 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Şekil 2.1- Amino asitlerin ninhidrin reaksiyonu mekanizması KİMYASALLAR Asetik asit, n-butanol, ninhidrin, aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, fenilalanin, HCl, Whatman No.1 kromatografi kâğıdı. YÖNTEM n-butanol: asetik asit: su (65:15:25) karışımı hareketli faz olarak hazırlanır. Kromatografi tankına 10 mL (yaklaşık 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde) çözücü konulur ve tankın ağzı kapatılır. Tankın çözücü buharı ile dengeye gelmesi için kromatografi kâğıdı yerleştirilinceye kadar kapağı açılmaz. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 8 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Size verilen 5cm x 8cm boyutundaki Whatman No:1 Kromatografi kağıdının kısa kenarından 1.2 cm uzaklığında kurşun kalemle bastırmadan çok hafif bir çizgi çizilir ve bu çizgi üzerinde 1cm aralıkla 4 nokta işaretlenir. 1N HCl içinde çözünmüş aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, fenilalanin çözeltilerinden grubunuza verilmiş olan üçü ve amino asit karışımı bilinmeyen örnek, ayrı ayrı işaretlenmiş 4 noktaya temiz bir kapiler tüp yardımı ile tatbik edilir. Tatbik noktasının çapı 4 mm’yi geçmemelidir. Birden fazla damla tatbikinde, her damla tatbikinden sonra leke yerinin kurutulması ve ikinci damlanın ondan sonra tatbik edilmesi gereklidir. Tatbik edilen noktalar kurutulduktan sonra kâğıt, bir pens ile tutularak tatbik noktaları aşağıya gelecek şekilde tanka yerleştirilir. Kâğıdın, tankın kenarlarına değmemesine ve tatbik noktalarının çözücü ile doğrudan temas etmemesine dikkat edilir. Çözücünün ilerlemesi takip edilir ve üstten yaklaşık Şekil 2.1- Kromatografi kağıdı 0.5 cm boşluk kalıncaya kadar yürütülür (Bu işlem yaklaşık 45 dakika sürer). Çözücünün yürüdüğü mesafe hemen kurşun kalemle işaretlenerek kâğıt etüvde kurutulur. Etüvden çıkartılan kâğıdın üzerine çeker ocakta ninhidrin reaktifi püskürtülür ve kurutulmak üzere yeniden etüve konulur. Oluşan mor lekelerin çevresi kurşun kalemle işaretlenerek Rf değerleri hesaplanır ve veri tablosuna kaydedilir. Karışımda bulunan amino asitlerin hangileri olduğu hesaplanan Rf değerleri ile karşılaştırılarak tayin edilir. Amino Asit Lekenin Rengi Rf Değeri Aspartik Asit Lösin Valin Arjinin Prolin Fenilalanin Örnek Şekil 2.2- Yürümesi tamamlanmış olan kromatografi kağıdı. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 9 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı ÇALIŞMA SORULARI 1- Rf değerlerini hesapladığınız amino asitlerin yürüme hızlarının farklı olmasının nedenlerini araştırınız. Bu amino asitlerin formülleri aşağıda yer almaktadır. 2- Glutamik asit, histidin, glisin, triptofan ve izolösinden oluşan bir amino asit karışımı, NH3:Benzen (10:90) hareketli fazı kullanılarak kağıt kromatografisi ile ayrılmak isteniyor. Amino asitlerin yürüme hızlarının nasıl olmasını beklersiniz? 3- Amino asitler organizmada protein yapısına katılmaktan başka hangi görevleri yaparlar? Şekil 2.3- Protein yapısında yaygın olarak bulunan amino asitler. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 10 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY III AMİNO ASİTLERİN VE PROTEİNLERİN ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ BAZI I- AMİNO ASİTLER Amino asitler yapılarında en az bir karboksil ve bir amino grubu içeren organik bileşiklerdir. Tabiatta bulunan yaklaşık 300 amino asidin 20 tanesi protein yapısına girer. Protein yapısına giren amino asitler L, α- aminoasitlerdir. Amino asitler peptid (amid) bağları ile bağlanarak polipeptid ve proteinleri oluştururlar. Amino asitler polar olmayan organik çözücülerde çok az, etanolde az, suda çok çözünürler ve nötral çözeltiler verirler. Hem asidik, hem de bazik çözeltilerde artan bir çözünürlüğü, yani amfoter bir karaktere sahiptirler. Erime ve bozulma noktaları 120300 °C aralığındadır. Saf bir amino asidin suda çözülmesiyle meydana gelen çözeltinin pH değerine izoiyonik nokta denir. Amino asitlerin ve proteinlerin izoiyonik noktada çözünürlükleri maksimumdur. 8 amino asidi (valin, lösin, izolösin, treonin, metiyonin, fenilalanin, triptofan, lizin) organizma sentezleyemez. Bunlara esansiyel amino asitler denir. Bu amino asitlerin diyetle dışarıdan alınması gereklidir. Şekil 3.1- Alanin amino asidinin stereoizomerleri II- PEPTİDLER Bir amino asidin amino grubu, ikinci bir amino asidin karboksil grubu ile reaksiyona girdiğinde bir molekül su ayrılması ile dipeptid oluşur. Arada oluşan kovalent bağa peptid bağı denir ve rezonans gösterdiği için son derece kararlıdır. 2 amino asit bir dipeptid, 3 amino asit bir tripeptid, 10 veya daha az sayıda amino asit bir oligopeptid, 50-100 amino asit ise bir polipeptid oluşturur. Peptidlerin asidik ve bazik özellikleri zincirin iki ucundaki amino ve karboksil grupları ile yan zincirlerde bulunan iyonlaşabilen gruplara bağlıdır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi Şekil 3.2- Peptid bağının oluşumu 11 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Şekil 3.3- Serilglisiltirozilalanillösin pentapeptidi Peptidler N-terminali (peptid zincirindeki serbest amino grubu) solda, C-terminali (peptid zincirindeki serbest karboksil grubu) sağda kalacak şekilde yazılırlar ve bu şekilde isimlendirilirler. Bu pentapeptid serilglisiltirozilalanillösin veya Ser–Gly–Tyr– Ala–Leu olarak isimlendirilir. III- PROTEİNLER 100’den fazla aminoasit içeren polipeptidlere protein adı verilir. Bazen belirli bir biyolojik fonksiyonu gerçekleştirmek üzere, belirli bir konformasyonu almış olmak şartı ile 100’den daha az sayıda amino asit içeren polipeptidlere de protein adı verilebilir. Canlı hücrelerin kuru ağırlığının yarısından fazlasını proteinler oluşturur. Proteinler organizmada enzimlerin, hormonların, reseptörlerin, bağışıklık sistemi ve pıhtılaşma faktörlerinin yapısında bulunurlar. Yapı ve hareket sistemi içinde görev alırlar. Amino asitler birleşerek peptid zincirini oluştururlar. Bu proteinlerin primer yapısıdır. Peptid zincirleri daha kararlı bir hale gelmek üzere temel bir üç boyutlu yapı oluştururlar. Buna proteinlerin sekonder yapısı denir. Bir polipeptidde birden fazla sekonder yapı bir araya gelerek çeşitli kimyasal etkileşmeler sonucu üç boyutlu yapıda katlanırlar. Buna tersiyer yapı denir. Birden fazla tersiyer yapıda katlanmış polipeptid zincirleri bir araya gelerek kuaterner yapıyı oluştururlar. Şekil 3.4- Proteinlerin yapısı Proteinin doğal yapısındaki herhangi bir değişim denatürasyon olarak adlandırılır. Sıcaklık, asitler (HCl, trikloroasetik asit, perklorik asit vb.) organik çözücüler (etanol, aseton vb.), çapraz bağlayıcılar (formaldehit, glutaraldehit), kaotropik ajanlar (üre 6-8 M, guanidin klorür 6M), indirgeyici ajanlar (2-merkaptoetanol, ditiyotreitol, iyodoasetat), Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 12 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı yüksek konsantrasyonda tuzlar (amonyum sülfat), ağır metal tuzları (cıva(II)klorür, bakır(II)sülfat vb.) ve bazı deterjanlar (sodyumdodesilsülfat) proteinlerde denatürasyona yol açarlar. Eğer denatüre edici faktörün ortamdan kaldırılması ile protein doğal yapısını yeniden kazanabiliyorsa buna geri dönüşümlü denatürasyon denir. Eğer denatüre edici faktörün ortamdan kaldırılması ile protein doğal yapısını yeniden kazanamıyorsa buna geri dönüşümsüz denatürasyon denir. Denatüre olan proteinlerde kuaterner, tersiyer ve kısmen sekonder yapılar bozulur ancak primer yapı bozulmaz. Eğer polipeptid zincirinde kopmalar meydana geliyorsa buna degradasyon adı verilir ve geri dönüşümsüzdür. Düşük konsantrasyonlarda tuzlar proteinlerin çözünürlüğünü arttırırlar. MgCl2, (NH4)2SO4 gibi iki değerlikli tuzlar, NaCl ve NH4Cl gibi tek değerlikli tuzlara göre daha etkilidirler. Bu tuzların konsantrasyonları arttıkça proteinlerin çözünürlükleri azalır ve yüksek tuz konsantrasyonlarında proteinler çöker. KİMYASALLAR Glisin, arjinin, glutamik asit, fenilalanin, tirozin, triptofan, histidin, sistein, sistin, kazein, yumurta albümin, sülfat asidi, nitrat asidi, hidroklorik asit, sodyum hidroksit, cıva(II)klorür, sodyumnitroprussiyat, bakır(II)sülfat, bakır(II)asetat, kadmiyum sülfat ve bizmut(II)nitrat. YÖNTEM I- Amino Asitlerin Reaksiyonları Amino asitlerin çözünürlüğü ve pH’sı: 4 ayrı tüpe az miktarda katı glisin, arjinin, glutamik asit ve fenilalanin alınır. Tüm tüplere eşit miktarda destile su ilave edilir ve karıştırılır. Amino asitlerin çözünürlükleri kaydedilir. Oluşan çözeltilerin pH’ları pH kâğıdı ile tayin edilir. Ksantoprotein Reaksiyonu: Fenil halkası içeren aromatik amino asitler derişik nitrat asidi ile muamele edildiklerinde sarı renkli nitro türevlerine dönüşürler. Nitrat asidinin cilde temas etmesiyle oluşan sararmanın sebebi budur. Şekil 3.5- Ksantoprotein reaksiyonu Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 13 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Tirozin, triptofan, fenilalanin, histidin ve kazein’in sulu çözeltilerinden yaklaşık olarak az miktarda alınarak üzerine 5 damla derişik nitrat asidi konur. Reaksiyona zor giren fenilalanin tüpüne 5 damla daha nitrat asidi ve 5 damla derişik sülfat asidi eklenir. Tüpler su banyosunda ısıtılır ve renk değişimi kaydedilir. Daha sonra tüpler bir portüpe alınarak soğumaya bırakılır. Tüpler oda sıcaklığına geldiğinde %10 NaOH çözeltisi, ortam bazik oluncaya kadar eklenir. Renk değişimi kaydedilir. Millon Reaksiyonu: Millon Reaktifi: 15 g HgCl2, 100 mL %50 HNO3 içinde çözülerek hazırlanır. Fenol içeren bileşikler bu reaksiyonu verir. Tirozin amino asidi fenol grubu içeren tek amino asit olduğundan bu reaksiyon tirozine özgüdür. Önce tirozinin fenol grubu reaktif çözeltisindeki nitrik asit tarafından nitratlanır. Daha sonra nitratlanmış tirozin molekülü çözeltideki cıva (I) ve cıva (II) iyonları ile kırmızı renk verir. Ayrı tüplerdeki az miktarda tirozin ve kazeinin sulu çözeltilerine birkaç damla millon reaktifi eklenir ve tüpler kaynar su banyosunda ısıtılır. Renk oluşumu kaydedilir. Nitroprussiyat Reaksiyonu Sülfidril grupları içeren bileşikler ağır metaller ve sodyum nitroprussiyat ile koyu renkli kompleksler oluştururlar. Sistein serbest –SH grupları içerdiğinden bu reaksiyonu verir. Sistin serbest –SH grubu içermediğinden bu reaksiyonu vermez. Şekil 3.6- Sistin oluşumu Şekil 3.7- Sodyum nitroprussiyat 2 tüpe ayrı ayrı sistein, sistin ve kazein çözeltileri alınır ve üzerlerine az miktarda %10 NaOH ve aynı hacimde %2 sodyum nitroprussiyat çözeltisi eklenir. Renk değişimi kaydedilir. Kazein tüpüne bir miktar derişik HCl eklenir ve gözlemler kaydedilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 14 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Triptofan Reaksiyonu İki ayrı tüpteki az miktarda triptofan ve glisin çözeltileri üzerine eşit hacimde derişik asetik asit konulur. Bu karışımın üzerine damla damla, tabaka oluşturacak şekilde derişik sülfat asidi ilave edilir. Turuncu-mor halka oluşumu triptofan varlığını belirtir. Bu triptofana özgü bir denemedir. Aminoasitlerin verdikleri genel tanınma reaksiyonları: Reaksiyon Reaktif Amino asit Renk Ninhidrin Reaksiyonu Ninhidrin Serbest NH2 Grubu Mor Biüret Alkali CuSO4 Amid Bağları Mavi Lowry Reaksiyonu Fosfomolibdat Tirozin Mavi Millon Reaksiyonu HNO3, HNO2, HgNO3 Tirozin Kırmızı Ksantoprotein Kaynar HNO3 Triptofan, Tirozin, Fenilalanin Sarı Ehrlich Reaksiyonu Der. HCl içinde pdimetilamino benzaldehit Triptofan Mavi Sakaguchi Reaksiyonu α- Naftol, NaOCl veya NaOBr Arjinin Kırmızı Nitroprussiyat Reaksiyonu Sodyum nitroprussiyat, NaOH Sistein Kırmızı Sullivan reaksiyonu Sodyum-1,2-naftokinon-4sülfonat ve NaHSO4 Sistein Kırmızı Kurşun Sülfür Reaksiyonu NaOH, Seyreltik Kurşun asetat Sistein Siyah Hopkins-Cole Reaksiyonu Glioksilik asit, Sülfürik Asit Triptofan Mor Pauly Reaksiyonu Sülfanilik asit, HCl, Sodyum Histidin, Triptofan karbonat, Sodyum nitrit Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi Histidin: Sarı Triptofan: Mor 15 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı II- Proteinlerin Reaksiyonları Proteinler ile ilgili denemelerde yumurta albümin çözeltisi kullanılacaktır. Yumurta albümin çözeltisinin hazırlanması için bir yumurtanın akı, sarısından ayrılarak bir behere aktarılır. Hacminin altı katı kadar su ilave edilir ve çözeltinin köpürmemesine dikkat edilerek karıştırılır. Proteinlerin Denatürasyonu: Isının etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve bir süre sıcak su banyosunda tutulur. Gözlemler kaydedilir. Konsantre asitlerin etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve üzerine hacminin iki katı kadar derişik nitrik asit ilave ederek gözlemler kaydedilir. Ağır metal tuzlarının etkisi: 4 ayrı tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve üzerlerine az miktarda bakır(II)asetat, kadmiyumsülfat ve bizmut(II)nitrat ilave edilerek gözlemler kaydedilir. Biüret reaksiyonu: İki veya daha fazla peptid bağı ihtiva eden bileşikler alkali bakır sülfat ile menekşe veya mor renkli kompleksler oluştururlar. Rengin koyuluğu proteindeki peptid bağlarının sayısına bağlıdır. Bu test, peptid bağlarını belirlediğinden amino asitlerle reaksiyon vermez. Bu reaksiyon ayrıca azot veya karbon atomuna bağlı iki karbonil grubu ihtiva eden bileşiklerle de pozitif sonuç verir. Bu test proteinlerin kantitatif olarak tayini için de kullanılmaktadır ancak bu amaçla kullanılan biüret reaktifi sodyum potasyum tartarat, bakır sülfat ve potasyum iyodür içerir. Üç ayrı tüpe az miktarda glisin, yumurta albümin ve kazein çözeltileri alınır. Tüplere aynı hacimde %10 NaOH çözeltisi ve beşer damla %1 CuSO4 çözeltisi eklenir ve renk değişimi kaydedilir. Şekil 3.8- Biüret reaksiyonu sonucunda oluşan bakır-protein kompleksi Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 16 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 17 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı ÇALIŞMA SORULARI 1- Glu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly dizisine sahip peptidi çiziniz. Bu peptidin pH 3, 8 ve 11’deki net yükü nedir? (Bir grubun pKa değerinin altında ve üstünde net yük değişiminin nasıl olduğunu hatırlayın). Bu peptidin pI değeri ne olabilir? 2- Organizmada görev yapan önemli peptidlere birkaç örnek veriniz ve ne görev yaptıklarını belirtiniz. Şekil 3.9- Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının pKa değerleri Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 18 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY IV TAMPON ÇÖZELTİLER Zayıf bir asidin kendisini ve anyonunu (konjuge bazını) veya zayıf bir bazın kendisini ve katyonunu (konjuge asidini) yan yana içeren çözeltilere tampon çözeltiler adı verilir. Tampon çözeltiler az miktarda asit veya baz ilavesiyle belirgin bir pH değişimi göstermezler. Bir çözeltinin tampon etkisini gösterebilmesi için ayrı ayrı hem H+ iyonu veren hem de H+ iyonu alan tanecikleri yeterli konsantrasyonda içermesi gereklidir. Tampon çözeltiler sabit pH aralıklarında çalışmak üzere hazırlanırlar. Henderson-Hasselbalch Denklemi (A-: Tuz / HA: Asit) Bu denklem bir çözeltinin teorik pH değerini hesaplamak için kullanılır. Denklemden de görülebileceği gibi tamponu oluşturan maddeler arasında oran değişiklikleri yapılarak pH’sı farklı tamponlar elde edilebilir. Tampon çözeltiyi oluşturan maddeler her oranda değil sadece belirli bir oranda en iyi tampon etkisini gösterirler. A-/HA oranı bire eşit olduğunda log1 = 0 olacağından pH değeri de pKa değerine eşit olur. Bu pH değerine tamponun optimum pH değeri denir. Bu pH değerinin dışındaki değerlerde tamponun etkisi zayıflar. Tamponlar optimum pH değerlerinin bir birim altı ve bir birim üstündeki pH aralıklarında en etkili olarak kullanılabilirler Tamponlar biyolojik ortamların hazırlanmasında faydalanılan çözeltilerdir. Canlı organizmalarda pH değerleri son derece küçük bir aralıkta sabittir ve bu değerler sıkı bir şekilde kontrol altında tutulur. Çünkü pH’daki değişiklikler enzimler, hücre membranları ve nükleik asitler gibi birçok moleküler yapının yüklü bölgelerine etki eder ve fizyolojik aktivitelerini etkiler. pH değerlerindeki 0.5 birimlik bir değişim canlının yaşamını tehlikeye sokar. Organizmanın farklı bölgeleri farklı pH değerlerine sahiptir. (kan: 7.4, mide özsuyu 1.5, pankreas özsuyu 8.0, beyin omurilik sıvısı 7.4 gibi). Bu bölgelerdeki pH farklı tampon sistemlerince korunur. Bu sistemlere örnek olarak bikarbonat/karbonik asit (HCO3-/H2CO3), protein/proteinat, oksihemoglobin/protonlanmış oksihemoglobin (HbO2/HHbO2) ve fosfat (HPO4-/H2PO4-) tampon sistemleri verilebilir. Organizma sıvılarının asit baz dengesinin asit tarafına kaymasına asidoz, alkali tarafına kaymasına ise alkaloz denir. Asit metabolizma ürünleri artarsa, oluşan H+ iyonları HCO3/CO2 tarafından tutulur ve H2CO3 meydana gelir. Bunun dissosiasyonu ile oluşan H+ iyonları diğer tamponlarca tutulur. Bir kısmı da karbondioksit ve suya dönüşür. Karbondioksidin artması nedeniyle pH 7.4’ün altına düşer. HCO3- konsantrasyonunun azalması ile meydana gelen bu duruma metabolizma asidozu denir. Diyabette, açlıkta ve karbonhidratsız rejimlerde görülen asidozlar buna örnektir. HCO3- konsantrasyonunun artması ile metabolizma alkalozu meydana gelir. Aşırı sodyum bikarbonat alınması ve şiddetli kusma sonucu midede HCl kaybı ile oluşan alkalozlar buna örnektir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 19 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı KİMYASALLAR Monopotasyum fosfat (KH2PO4), disodyum fosfat (Na2HPO4), NaOH, HCl. YÖNTEM Tampon çözelti hazırlama tablolarından yararlanarak 50 mL pH 7.4 Fosfat (Sørensen), 25 mL pH 6 sitrikasit/fosfat tamponlarını hazırlayınız. hazırlayınız. Hazırladığınız tamponun pH değerini ölçünüz. Eğer pH değerleri gerekenden farklı bir değere sahip ise 1N NaOH veya 1N HCl kullanarak pH’sını ayarlayınız. ÇALIŞMA SORULARI 1- Bir tampon litrede 0.01 mol laktik asit (pKa=3.86) ve 0.05 mol sodyum laktat içermektedir. a- Tamponun pH değerini hesaplayınız. b- 1 L tampona 5 mL 0.5 M HCl eklendiğinde pH değişimi ne olur? 2- Organizma sıvılarında pH düzenlemesinde en önemli görev üstlenen organlar nelerdir ve bunu hangi yollarla gerçekleştirirler. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 20 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 21 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 22 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY V KATEKOLÜN OKSİDASYONUNA OKSİDAZ ENZİMİNİN ETKİSİ POLİFENOL Enzimler canlı organizmalardaki reaksiyonları katalizlerler. Laboratuvar ortamında çok yüksek veya çok düşük basınç, pH ve sıcaklıkta oluşan kimyasal değişme ve reaksiyonlar, canlı hücrelerin bozulmadan kalabildikleri dar basınç, pH ve sıcaklık aralığında, ancak enzimler aracılığıyla gerçekleştirilebilirler. Küçük bir grup katalitik RNA moleküllerinin haricinde tüm enzimler protein yapısındadırlar. Katalitik aktiviteleri genellikle proteinin doğal yapısında olmasına bağlıdır. Eğer bir enzim denatüre olur veya alt ünitelerine ayrılırsa katalitik aktivitesi genellikle kaybolur. Bazı enzimler aktivite göstermek için bir veya daha fazla anorganik iyona veya kompleks organik veya metallorganik bileşiklere ihtiyaç gösterirler. Bu iyon ya da bileşiğe kofaktör adı verilir. Organik bileşik enzimin protein kısmı ile çok sıkı bir şekilde bağlanmış ise prostetik grup, çok sıkı bağlanmamış ve dissosiye olabiliyorsa koenzim adını alır. Katalitik olarak etki gösteren tam enzime holoenzim denir. Holoenzimin protein kısmına ise apoenzim adı verilir. Şekil 5.1- Enzim yapısı Enzimin etki ettiği bileşiğe substrat adı verilir. Enzimin katalizlediği reaksiyonu proteinin tamamı değil, sadece “aktif bölge” adı verilen belirli bir bölgesi etkiler. E=Enzim, S= Substrat, ES= Enzim-Substrat kompleksi ve P= Ürün olmak üzere enzim reaksiyonu şu şekilde özetlenebilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 23 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Böyle bir reaksiyon genel kimyasal reaksiyon mekaniğine ve kinetiğine uyar. Diğer katalizörlerde de olduğu gibi enzimler reaksiyonun yönünü değiştirmezler sadece reaksiyonun hızına etki ederler. Reaksiyona ilerleyebileceği daha düşük aktivasyon enerjili ara yollar sunarak reaksiyonu hızlandırırlar. Şekil 5.2- Enzimli reaksiyonun serbest enerji diyagramı Şekilde ΔGEnzimsiz enzimsiz reaksiyonun aktivasyon enerjisi, reaksiyonun aktivasyon enerjisidir. ΔH Reaksiyon entalpisidir. ΔGEnzimli ise enzimli Reaksiyon başında substrat konsantrasyonu yüksek, ürün konsantrasyonu ise ihmal edilecek kadar azdır. ES kompleksi büyük bir serbest enerji düşmesi ile ayrıldığından k4 ihmal edilebilir. Öyleyse ES oluşumunun net hızı, ES bozunmasının net hızına eşit olacaktır ki denklem 1’e göre bu eşitlik; olur. Reaksiyonun başında [P] ihmal edilebilir olduğundan, şeklinde yazılabilir. Burada Km, kontrollü şartlarda reaksiyonun maksimum hızının yarısına eşit hız veren substrat konsantrasyonudur ve Michaelis-Menten sabiti olarak adlandırılır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 24 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı [E0], başlangıçtaki toplam enzim konsantrasyonu ve reaksiyonun herhangi bir anındaki enzim konsantrasyonu [E] ise, [E] = [E0] – [ES] olur. Denklem 3 aşağıdaki şekle dönüşür; Maksimum hız toplam enzim konsantrasyonu ile orantılı olduğu kadar, başlangıç hızıyla da orantılıdır. Böylece Vmaks = K3 [E0] olduğundan denklem 4’te yerine konulursa aşağıdaki denklem elde edilir. Denklem 5’te başlangıç hızı V0 yalnız bırakılacak olursa; eşitliği bulunur. Denklem 6’ya göre V0 ile [S] arasında çizilen grafik aşağıdaki gibi olur. Bu eğriye Michaelis-Menten eğrisi denir. Şekil 5.3- Michaelis-Menten eğrisi Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 25 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Düşük substrat konsantrasyonlarında denklem 6’nın paydasında Km >> [S] olduğunda [S], Km yanında ihmal edilebilir ve = Vmaks [S] / Km olur. Yüksek substrat konsantrasyonlarında denklem 6’nın paydasında Km << [S] olacağından Km, [S] yanında ihmal edilebilir, V0= Vmaks olur ve denklem 6’daki eşitlikle bölünerek doğru denklemi verecek şekle dönüştürülebilir. Y eksenine 1/V0, X eksenine de 1/[S] değerleri yerleştirilerek çizilen grafikte elde edilen doğrunun eğimi Km/Vmaks’a ve Y eksenini kesen nokta 1/Vmaks’a eşit olur. Km değeri de grafikte gösterildiği şekilde bulunabilir. Bu eğriye Lineweaver-Burk eğrisi adı verilir. Eğer V0 değerine karşı V0/[S] grafiği çizilecek olursa bu eğriye Eadie-Hofstee eğrisi elde edilir. Km değerlerinden enzimlerin ayırt edilmesinde, ES komplekslerine ilişkin sabitlerin bulunmasında faydalanılır Km substrat konsantrasyonu birimi cinsindendir (mol/L veya mmol/L). Şekil 5.4- Lineweaver-Burk eğrisi Şekil 5.5- Eadie-Hofstee eğrisi Enzim aktivitesinin ölçülmesinde çeşitli birimler kullanılır. En çok kullanılan aktivite birimi enzim ünitesidir (aktivite). Enzim ünitesi (U): 25°C’de 1 dakikada optimum şartlarda 1µmol substratı ürüne çeviren enzim miktarıdır. Spesifik aktivite (U/mg protein): 1 mg protein başına enzim ünitesidir. Enzimin saflık derecesinin bir göstergesidir. Molar Aktivite: Bir tek enzim molekülü tarafından birim zamanda ürüne çevrilen substrat molekülü sayısıdır. Dönüşüm sayısı olarak da adlandırılır. Katal: 1 saniyede 1 mol substratı reaksiyona sokan enzim miktarıdır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 26 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Enzim miktarı çok küçük olduğundan direkt olarak ölçmek zordur. Optimum şartlarda katalizledikleri reaksiyon hızları diğer şartlar sabit kalmak üzere, enzim konsantrasyonu ile orantılıdır. Böylece enzim konsantrasyonu hız ölçülmesi ile tayin edilebilir. Enzimle katalizlenmiş reaksiyonların hızı inhibitör adı verilen bazı maddeler tarafından azaltılır veya tamamen durdurulur. Buna enzim inhibisyonu denir. Enzim inhibisyonu geri dönüşümlü veya dönüşümsüz olabilir. Polifenol oksidaz enzimi doğada yaygın olarak bulunan, bakır içeren bir enzimdir. Meyve ve sebzelerde hasar görmüş bölgelerin hava ile teması sonucu kararması ve cildin esmerleşmesi (melanin sentezi) gibi reaksiyonlardan sorumludur. Enzimin aktivitesi, fenollerin katekollere orto-hidroksilasyonu ve katekollerin orto-kinonlara oksidasyonu olacak şekilde ikiye ayrılabilir. Aktif merkezde substratın bağlanabileceği bir boşluk vardır ve bu merkezdeki histidin kalıntıları bakır bağlamada görev yaparlar. Şekil 5.6- Polifenol oksidaz enziminin 3 boyutlu yapısı ve aktif merkezi Bu denemede katekolün benzokinona enzimatik dönüşüm reaksiyonunun kinetikleri incelenecektir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 27 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Şekil 5.7- Polifenol oksidaz enziminin katalizlediği oksidasyon reaksiyonunun mekanizması Bu reaksiyonda kullanılan katekol çözeltisi renksizdir, oluşan 1,2-benzokinon ise kahverengidir. Böylece oluşan ürünün miktarı kolorimetrik olarak izlenebilir. 1,2benzokinon 480 nm dalga boyunda maksimum absorbans verdiğinden bu dalga boyunda yapılan spektrofotometrik ölçüm yardımı ile belli bir zamanda çözeltide bulunan ürün miktarı hesaplanabilir. Şekil 5.8- Spektrofotometrenin çalışma prensibi Spektrofotometrik ölçümde bir ışık kaynağı geniş bir spektrumda ışık yayar, monokromatör belirli bir dalga boyundaki ışığı seçer ve örnek küvetine gönderir. Işık küvetten geçerken absorblayıcı moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak bir kısmı absorblanır ve çözeltiden geçen ışık bir dedektör tarafından ölçülür. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 28 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Bu denemede amaç iki anahtar parametrenin bulunmasıdır. Bunlar maksimum hız (Vmaks) ve Michaelis-Menten sabitidir (Km). KİMYASALLAR Sitrik asit-fosfat tamponu pH 6, katekol, benzokinon. YÖNTEM Ham enzimin hazırlanması: Patatesler soyulur ve bıçakla küçük parçalara ayrılır. Daha sonra blender cihazı yardımıyla ve 200 mL pH 6 sitrik asit - fosfat tamponu varlığında homojenize edilir. Enzimlerin aktivitesi sıcaklıktan etkilendiği için bu aşamadan sonraki tüm işlemler hızlı bir şekilde ve buz üzerinde gerçekleştirilir. Elde edilen homojenizat, bir buz banyosuna önceden yerleştirilerek soğutulmuş erlen ve huni yardımıyla cam pamuğundan süzülür ve süzüntü deney süresince buz banyosunda tutulur. Substrat konsantrasyonunun reaksiyon hızına etkisi: 6 adet deney tüpü aşağıdaki tabloda gösterildiği şekilde (enzim konulmadan) hazırlanır. Enzim çözeltisi spektrofotometrik ölçümden hemen önce konulacaktır. Tüp No Substrat Katekol 0.01 M (mL) Su (mL) Enzim (µL) 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3.5 5 7 9 10 9 8 6.5 5 3 1 500 500 500 500 500 500 Absorbans 1. dk. 2. dk 3. dk 4. dk 5.dk 6.dk Grafikten Hesaplanan Hız Sıfırlama yapılır 2-7 numaralı tüplerin dakika başına verdikleri absorbans değeri ölçülecektir. Bu işlem şöyle yapılır; 1 numaralı tüpe 500µL enzim konulur ve tüp iyice karıştırılarak içeriği iki spektrofotometre küvetine aktarılır. Bu çözeltiler bizim şahit çözeltilerimiz olacaktır. İki şahit küveti kullanılarak spektrofotometre 480 nm dalga boyunda sıfırlanır. Daha sonra 2 numaralı tüpe enzim konulur ve enzim konulduğu anda kronometre çalıştırılır. İçinde enzim bulunan 2 numaralı tüp iyice karıştırılır, içeriği bir spektrofotometre küvetine aktarılır ve spektrofotometreye yerleştirilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 29 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Bu sırada kronometre takip edilerek ilk enzimin konulmasından tam 30 saniye sonra 3 numaralı tüpe 500 µL enzim konulur ve iyice karıştırılarak içeriği bir spektrofotometre küvetine aktarılır ancak spektrofotometreye yerleştirilmez. Kronometre 01:00 değerini gösterdiğinde spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir. Spektrofotometrenin içindeki 2 numaralı çözeltiyi içeren küvet çıkarılır ve 3 numaralı çözeltiyi içeren küvet yerleştirilir. Kronometredeki değer 01:30 değerini gösterdiğinde spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir. Küvetler değiştirilerek her bir küvet için dakikada bir absorbans değeri ölçülür. Her bir küvet için 6 değer alınıncaya kadar bu işlem devam eder. Daha sonra aynı işlemler 4-5 ve 6-7 numaralı tüpler için de tekrarlanır. Her işlemin başında spektrofotometre şahit çözeltiler kullanılarak sıfırlanır. Ekstinksiyon sabitinin bulunması: 100 mL 0.01 M benzokinon çözeltisi hazırlanarak 480 nm dalga boyundaki absorbansı ölçülür. Benzokinon zor çözündüğünden bu çözelti deney başladığında hazırlanır ve ölçümü deneyin sonunda yapılır. VERİLERİN KULLANIMI 2-7 numaralı tüpler için 480 nm’de elde edilen absorbans değerleri ayrı ayrı, zamana karşı grafiğe çizilir. Şekil 5.9- Absorbans- zaman grafiği Her grafikte, hiperbolik eğrilere teğet doğrular çizilir ve bu doğruların eğimleri hesaplanır. Eğim = ΔA/Δt, A=ε.c.l olduğundan her bir küvet için başlangıç hızı V = m / ε . l denkleminden hesaplanır. 2-7 numaralı tüplerin her biri için katekol konsantrasyonları hesaplanır. Bulunan başlangıç hızları ile substrat konsantrasyonları arasında Michaelis-Menten eğrisi çizilir. Bu hız ve substrat konsantrasyonları için Lineweaver-Burk ve Eadie-Hofstee grafikleri çizilerek Vmaks ve Km değerleri hesaplanır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 30 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı ÇALIŞMA SORULARI 1- Substrat ile doygun olduğu zaman 10-6 M konsantrasyonundaki karbonik anhidraz enzimi saniyede 0.6 mol/L karbonik asit oluşumunu katalizler. Buna göre dönüşüm sayısı nedir. 2- Geri dönüşümlü enzim inhibisyonu, inhibitörün enzime bağlanmasına göre yarışmalı, yarışmasız ve yarı-yarışmalı olmak üzere üçe ayrılabilir. Aşağıda verilen şekilleri ve grafikleri inceleyerek her bir durum için inhibitör konsantrasyonu değişimi ile Vmaks ve Km değerlerinin nasıl değiştiklerini yorumlayınız. Şekil 5.10- Enzim inhibisyon mekanizmaları Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 31 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY VI KARBONHİDRATLARIN İNCELENMESİ BAZI ÖZELLİKLERİNİN Karbonhidratlar, polihidroksi aldehit veya polihidroksi keton yapısında olan veya hidrolizlendiklerinde bu yapılara dönüşebilen organik bileşikler olarak tanımlanabilir. Çoğu karbonhidrat (CH2O)n kapalı formülüne sahiptir, bununla birlikte bazı karbonhidratlar azot, fosfor ve sülfür elementlerini de içerirler. Doğada en çok bulunan biyomoleküllerdir. Genellikle basit karbonhidratlar (monosakkaritler) ve bunların bir araya gelmesiyle oluşan oligosakkaritler ve polisakkaritler halinde bulunurlar. Bazı karbonhidratlar mekanizma için önemli bir enerji sağlayıcısıdır (şekerler), aynı zamanda enerjiyi kısa süreli depolama özelliğine sahiptir (nişasta ve glikojen). Bakteri (proteoglikan) ve bitki hücre duvarlarının (selüloz), bitkilerin odunsu kısımlarının (selüloz), ve nükleik asitlerin yapısal bileşenidir. Bunun yanı sıra, hücre yüzeyinde yer alan ve proteinlere bağlı olan polisakkaritler hücre sinyalizasyonunda molekülü tanımada kullanılırlar. Monosakkaritler ve disakkaritler, beyaz kristal katı veya kıvamlı sıvılardır. Suda kolayca çözünürler ancak organik çözücülerin çoğunda çözünmezler. Katı halde olan karbonhidratlar 200°C’nin üstünde kahverengine dönerek, karakteristik karamel kokusu ile erirler. Derişik sülfat asidi ile kömürleşirler. Polisakkaritler de benzer özelliklere sahiptir ancak suda hemen hemen hiç çözünmezler. Monosakkaritler tek bir birimden oluşan polihidroksi aldehit veya polihidroksi ketonlardır. En basit monosakkaritler 3 karbon içeren gliseraldehit ve dihidroksiasetondur. Dihidroksiaseton dışında tüm monosakkaritler bir veya daha fazla asimetrik (kiral) karbon atomuna ve dolayısıyla optikçe aktif stereoizomerlere sahiptirler. Dörtten fazla karbon içeren monosakkaritler genellikle doğada halkalı halde bulunurlar ve yapıları polihidroksihemiasetal veya polihidroksihemiketal olarak tanımlanabilir. Hemiasetal veya hemiketal yapıdaki bileşikler bir molekül alkolle reaksiyona girerek asetal veya ketal oluştururlar. Asetaller glikozit olarak adlandırılırlar. Reaksiyona giren alkol, başka bir monosakkarit veya disakkarit molekülü ise oligo ve polisakkaritler meydana gelir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 32 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Kuvvetli asidik ortamda karbonhidratların glikozit bağları hidroliz olur ve hidrolizle oluşan monosakkaritler dehidrojenasyona uğrar. Böylece pentozlar furfurale dönüşürken, heksozlar 5-hidroksimetilfurfurale dönüşürler. Bunlar da bozunarak olarak ketoaldehitleri oluştururlar. Bu ketoaldehitler fenollerle birleşerek renkli maddeler verdiklerinden şekerlerin renk reaksiyonlarından sorumludurlar. Bazı organik moleküllerde atomların cinsi, sayısı ve bağ düzeni aynı olduğu halde atom ve atom gruplarının uzaydaki dizilişi (konfigürasyonu) farklı olabilir. Bu özelliğe stereoizomeri denir. Bu izomeri molekülde en az bir tane asimetrik karbon atomunun bulunmasıyla meydana gelir. Bir molekülde karbon atomunun 4 bağında 4 farklı grup veya atom varsa bu karbon atomuna asimetrik karbon denir. Bu tür atoma sahip moleküllerin stereoizomerleri vardır. Molekülün n sayıda asimetrik karbon atomu varsa, 2n sayıda izomeri mevcuttur. Bu tür izomerlerin bütün özellikleri aynı, ancak uzaydaki konumları farklıdır ve polarize ışığın yayılma düzlemini çevirirler. Bu tür moleküllere optikçe aktif moleküller denir. İki izomerden birisi polarize ışığın yayılma düzlemini sağa [dextro, d(+)], diğeri ise sola [levo, l(-)] çevirir. Çevirme açıları eşit fakat zıt yönlüdür. İki izomerin eşit karışımına rasemik karışım denir. Rasemik karışımlarda çevirme açıları birbirini yok ettiğinden ışık düzlemi çevrilmez. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 33 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Monosakkaritlerin tek bir karbon atomundaki konfigürasyonu farklı olduğunda oluşan izomerlere epimer denir. Bu izomerlerin birbirine dönüşümüne de epimerizasyon adı verilir. Optikçe aktif bir maddenin %100’lük çözeltisinin 1dm uzunluğunda tabakadan geçen monokromatik polarize sodyum ışığını 20°C’ deki çevirme açısına spesifik çevirme (özgül çevirme) denir ve şu formül ile hesaplanır; spesifik çevirme (özgül çevirme) α : çözeltinin çevirme açısı ışığın geçtiği tüpün uzuluğu (dm) c : 100ml çözeltide çözünmüş madde (g) Sulu çözeltilerde karbonhidratların spesifik çevirme açıları değişim gösterebilir. Örneğin glukoz suda çözünürse bir süre sonra α ve β izomerlerinin bir karışımı oluşur. Bu karışım rastgele değildir, yaklaşık olarak %33 α-D glukoz ve %67 β-D-glukozdan oluşmuştur. Glukozun başlangıçtaki çevirme açısı +18.7° (β için) veya +112,2° iken, son çözeltinin çevirme açısı +52.7° olur. Bu olaya mutarotasyon adı verilir. Mutorotasyon hızı genellikle düşüktür ancak hafif alkali veya asidik çözeltilerde reaksiyon hızlanır. Sadece Hemiasetal veya hemikatel karbon atomlarında konfigürasyon farklılığı ile oluşan stereoizomerlere anomer adı verilir. Glukozun α ve β formları anomerliğe örnek olarak verilebilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 34 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı YÖNTEM Deneyde Kullanılan Karbonhidratlar Deneyde Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler %1 glukoz, %1 sakkaroz, %1 nişasta, %1 galaktoz, %1 fruktoz, %1 laktoz, %1 maltoz, %1 inülin çözeltileri Doymuş glukoz ve laktoz çözeltisi. Derişik sülfürik asit, fenil hidrazin, asetik asit, sodyum asetat Molisch reaktifi (10 g α-naftol 100 mL etanol içinde), derişik sülfürik asit, Barfoed reaktifi (6g bakır asetat ve 1 mL asetik asit 100 mL’de suda, Fehling Çözelti A (69.8g CuSO4 kristali, 1ml derişik H2SO4 içinde çözülür ve saf su ile 1 L’ye tamamlanır), Fehling Çözelti B (350g sodyum potasyum tartarat ile 120g sodyum hidroksit bir miktar saf suda çözülür ve saf su ile 1lt’ ye tamamlanır), Seliwanoff Reaktifi % 0,5 rezorsin çözeltisi (%25 v/v HCl içinde), Rothenfusser Reaktifi (2g difenilamin 20ml etanolde çözülür, 80ml glasiyel asetik asit çözeltisi ve 100ml derişik HCl çözeltisi ile karıştırılır.) Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 35 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı I- Tüm Karbonhidratların Genel Reaksiyonu (Molisch Testi) Molisch Reaktifi: %10’luk α-naftol (etanol içinde) H2SO4 etkisiyle pentozlardan furfural, heksozlardan 5-hidroksimetilfurfural oluşur. Furfural ve 5-hidroksimetilfurfural α-naftol ile mor renkli trifenil metan oluşturur. Bütün karbonhidratlar bu reaksiyonu verirler. Ayrı tüplere pastör pipeti ile yaklaşık 1 mL glukoz, sakkaroz ve nişasta örneklerinden konulur ve üzerine 4-5 damla Molisch reaktifi ilave edilir. Kuvvetlice vortekslendikten sonra tüp 45 derece eğik tutularak tüpün iç kısmından eşit miktarda (yaklaşık 1 mL) derişik H2SO4 şeker çözeltisinin altında bir tabaka oluşturacak şekilde yavaşça ilave edilir. Pozitif sonuç iki faz arasında kırmızı-mor renkli halka oluşumudur. II- Monosakkaritlerin Genel Reaksiyonu (Barfoed Testi) Barfoed Reaktifi: %6’lık bakır (II) asetat (%1’lik asetik asit içinde) (çözelti taze olarak hazırlanır) Ayrı ayrı tüplere pastör pipeti ile yaklaşık 0,5 ml %1’lik galaktoz, glukoz, fruktoz, sakkaroz, laktoz, maltoz ve nişasta çözeltileri konulur, üzerlerine pastör pipeti ile yaklaşık 1 mL Barfoed reaktifi ilave edilir ve bütün tüpler 95°C su banyosuna yerleştirilir ve 3 dakika ısıtılır. Pozitif testte turuncu-kırmızı renkli Cu2O çöker. Tüm monosakkaritler, asetik asit içerisindeki bakır (II) asetat çözeltisini, bakır (I) okside çevirir. Disakkaritler bu testi uzun süre ısıtıldıklarında verebilirler, çünkü önce monosakkaritlerine hidrolizlenmeleri gerekir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 36 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı III- İndirgen Şekerlerin Reaksiyonu (Fehling Denemesi) Anomerik karbon atomunda serbest hidroksil grubu içeren şekerler indirgen şekerler olarak adlandırılırlar. Bu şekerler girdikleri redoks reaksiyonlarında kendileri yükseltgenirken karşısındaki maddeleri indirgerler. Fehling Reaktifi: Çözelti A: 0,1 mL H2SO4 içeren %4.5 CuSO4 (69.8g CuSO4 kristali, 1ml derişik H2SO4 içinde çözülür ve saf su ile 1 L’ye tamamlanır. Çözelti B: Sodyum potasyum tartarat (KNaC4H4O6, %35) ve sodyum hidroksit (NaOH, %12) karışımı (350g sodyum potasyum tartarat ile 120g sodyum hidroksit bir miktar saf suda çözülür ve saf su ile 1lt’ ye tamamlanır. Fehling Çalışma Çözeltisi: Kullanımdan hemen önce, çözelti A ve çözelti B eşit hacimde karıştırılır. Glukoz, fruktoz, sakkaroz, laktoz ve inülin çözeltilerinden ayrı ayrı tüplere pastör pipeti ile yaklaşık 1 mL alınır ve üzerlerine eşit hacimde fehling reaktifi ilave edilir. Pozitif sonuç kırmızı renkli çökelti oluşumudur. Çökelti oluşmayan tüpler 3 dakika kaynar su banyosunda bekletilir ve sonuçlar kaydedilir. Bu reaksiyon serbest yarı asetal hidroksili içeren monosakkaritlerin, indirgeyici özellikleri ile Cu2+’yı Cu1+’ya indirgemeleri prensibine dayanır. Bu reaksiyonda önce NaOH ile CuSO4 arasındaki tepkime sonucu Cu(OH)2 oluşur. Daha sonra, glukozun serbest yarı asetal hidroksil Cu(OH)2 ile tepkimeye girer; glukoz, Cu(OH)2’i CuOH haline indirger ve kendisi de aldonik asidine (glukonik asit) yükseltgenir. Oluşan CuOH, sarı renkli çökelti halinde çöker. Isıtma sırasında CuOH su kaybederek Cu2O haline dönüşür. Na-K tartarat, Cu(OH)2’i çözünür hale getirerek glukoz ile daha kolay tepkimeye girmesini sağlar; H2SO4 ise Fehling A’ daki CuSO4’ın bozulmasını önler. İndirgen olmayan şekerler bu testle negatif sonuç verecektir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 37 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı IV- Ketoz ve Aldozların Ayrılması için Kullanılan Reaksiyonlar (Seliwanof ve Rothenfusser Reaksiyonları) Seliwanof Testi: Seliwanoff Reaktifi: % 0,5 rezorsin çözeltisi (%25 v/v HCl içinde) Ayrı ayrı tüplere %1’lik glukoz, inülin, laktoz, sakkaroz ve fruktoz çözeltilerinden pastör pipeti ile yaklaşık 0,5 mL alınır üzerlerine 1 mL Seliwanoff reaktifi ilave edilir. Tüpler kaynar su banyosuna yerleştirilir ve 3 dakika ısıtılır. Pozitif sonuç portakal rengi-kırmızı renk oluşumudur. Kaynatma ve asit etkisiyle pentozlardan furfural, heksozlardan 5-hidroksi metil furfural oluşur. Furfural, rezorsin ile mavi-yeşil renkli kompleks, 5-hidroksi metil furfural ise kırmızı renkli bir kompleks oluşturur. Rothenfusser Testi: Rothenfusser Reaktifi: etanol: asetik asit: hidroklorik asit (10:40:50) içinde hazırlanmış %1’lik difenilamin çözeltisi (2g difenilamin 20ml etanolde çözülür, 80ml glasiyel asetik asit çözeltisi ve 100ml derişik HCl çözeltisi ile karıştırılır.) Birer tüpe pastör pipeti ile yaklaşık 0,5mL %1’lik glukoz, inülin, laktoz, sakkaroz ve fruktoz çözeltilerinden konulur, üzerlerine eşit hacimde Rothenfusser reaktifi ilave edilir ve kaynar su banyosunda 3 dakika ısıtılır. Ketozlar mavi renk verirler. V- Karbonhidratların Ayırt Edici Reaksiyonu (Osazon Testi) Osazon Reaktifi: Bu reaktif her bir deneme için ayrı ayrı hazırlanmalıdır. 10 damla fenil hidrazin ile 10 damla glasiyel asetik asit bir tüp içinde karıştırılır ve üzerine 0.5g soydum asetat kristali ilave edilir. Hot plate üzerinde ısıtılarak tamamen çözünür hale getirildikten sonra üzerine derişik glukoz ve laktoz çözeltilerinden 1 mL eklenir ve kaynar su banyosuna yerleştirilir. Pozitif sonuç sarı renklı kristallerin oluşumudur. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 38 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Bu deneme monosakkaritin 1. ve 2. karbon atomlarına fenilhidrazin bağlanmasıyla karakteristik kristalli osazonlar oluşması esasına dayanır. Tüm osazon çökeltileri sarı renklidir ancak farklı kristal yapısına ve erime noktasına sahiptir. Bu sayede örnekteki karbonhidrat örneğinin ne olduğu belirlenebilir. Glukoz, fruktoz ve mannoz yalnızca 2. karbon atomundaki konfigürasyon nedeniyle farklıdır. Bu karbon atomlarına fenilhidrazin bağlanmasıyla farklılık ortadan kalkar. Bu nedenle glukoz, fruktoz ve mannoz aynı osazon kristallerini verir. Çalışma Soruları: 1- Karbonhidratlar organizmada ne gibi görevler üstlenirler? 2- İnvert şeker nedir? Kullanım alanları nelerdir? İnvert şekerin içeriğindeki bileşiklerin Haworth ve Fischer formüllerini çiziniz. Bu bileşiklerin oluşturduğu disakkaridin Haworth ve Fischer formülelrini çiziniz. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 39 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY VII LİPİTLERİN BAZI ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Lipitler kimyasal olarak çok çeşitli özelliklere sahip bir bileşik grubudur. Bu bileşiklerin ortak özellikleri suda çözünmemeleridir. Lipitlerin genel sınıflandırılmaları şu şekilde verilebilir. Lipitlerin biyolojik fonksiyonları da tıpkı kimyasal yapıları gibi çeşitlilik göstermektedir. Yağlar (nötral yağlar veya trigliseritler) pek çok organizma için enerjinin depolanmasında görev alır. Fosfolipitler ve steroller biyolojik membranların yapı taşlarını oluştururlar. Diğer lipitler göreceli olarak daha az miktarlarda bulunurlar ancak enzim kofaktörleri, elektron taşıyıcıları, ışık absorblayıcı pigmentler, proteinler için hidrofobik bağlantı noktaları, sindirim sisteminde emülsiye edici ajanlar, hormonlar ve hücre içi sinyal molekülleri oalrak önemli görevler üstlenirler. Nötral yağlar yağ asitlerinin gliserol ile ester oluşturması sonucu oluşurlar. Yağ asitleri doğada 4-36 karbon uzunluğunda olabilir, bazı yağ asitleri dallanmış bazıları ise düz yapılıdır. Bazı yağ asitleri çifte bağ içerirken bazı yağ asitleri ise içermez. Nötral yağların yapısında genellikle 4-18 karbon uzunluğunda (çift karbon sayılı) çifte bağ içermeyen (doymuş) veya 1-2 çifte bağ içeren (doymamış) yağ asitleri bulunur. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 40 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı YÖNTEM Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler Etil alkol, petrol eteri, kloroform, benzen, CCl4 Wijs Reaktifi (Asetik asit içerisinde ICl çözeltisi) %10’luk KI Çözeltisi (10g KI/100 mL su) 0.07N Na2S2O3 Çözeltisi (17.37g Na2S2O3.5H20 veya 11.06g Na2S2O3 1L suda çözülerek hazırlanır) %1’lik nişasta çözeltisi (1g nişasta 100 mL suda çözülür ve kaynama noktasına kadar sürekli karıştırılarak ısıtılır. Oda sıcaklığına soğutularak kullanılır) 1. Yağların Çözünürlüğü Dikkat! Yağların çözünürlüğü denemesi çeker ocak içinde gerçekleştirilecektir. Atıklar çeker ocak içerisinde toplanacaktır. Bir baget ile çok az miktarda katı yağ 5 ayrı tüpe alınır ve tüplere ayrı ayrı, pastör pipeti kullanılarak yaklaşık 1.5 mL etil alkol, petrol eteri, kloroform, benzen ve su ilave edilir. Vorteks yardımıyla tüpler iyice karıştırılır ve yağın çözünüp çözünmediği incelenir. Etil Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 41 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı alkol içeren tüp 70 °C sıcaklıktaki su banyosunda 3 dakika tutulur ve değişiklik olup olmadığı gözlenir. Aynı işlem 2 damla sıvı yağ örneği ile tekrarlanır. 2. Yağların pH değeri 3 ayrı tüpe pastör pipeti kullanılarak yaklaşık 0,5mL zeytin yağı, 0,5mL ayçiçek yağı ve ve bir baget yardımıyla çok az tereyağı alınır, örneklerin her birine yaklaşık 2.5 mL etil alkol ilave edilir ve tüpler iyice vortekslendikten sonra 70 °C sıcaklıkta su banyosunda 2 dakika tutulur. Yeniden vortekslenir ve bir pH kağıdı yardımıyla pH’sı tayin edilir. 3. Yağların Doymamışlık Derecesinin Tayini Wijs Yöntemi, yağlardaki doymamışlık derecesini belirlemede kullanılan analitik bir yöntemdir. Yöntem, yağlarda bulunan çifte bağlara iyot katılmasına dayanır. 100 gram yağın absorbladığı iyodun gram cinsinden değeri iyot değeri olarak bilinir ve yağların doymamışlığının bir ölçüsüdür. Yüksek iyot değeri, çifte bağ sayısının fazla olduğunu gösterir. R-CH=CH-R + ICl (aşırı) R-CHI-CHCl-R + ICl (kalan) Reaksiyona giren ICl miktarı aradaki farktan hesaplanır. ICl (kullanılan) = ICl (aşırı) – ICl (kalan) Kalan ICl miktarı, KI aşırısının çözeltiye ilave edilmesiyle belirlenir. Böylece açığa çıkan I2, Na2S2O3 çözeltisi ile titre edilebilir. IClkalan + 2KI I2 + nişasta + 2 Na2S2O3 (mavi) KCl + KI + I2 2NaI + nişasta + Na2S4O6 (renksiz) Çözeltiler: Wijs Reaktifi (Glasiyal asetik asit içinde ICl), CCl4, %10’ luk KI Çözeltisi, 0.1N Na2S2O3 Çözeltisi (etkime değerliği 1’dir), %1’lik nişasta çözeltisi Katı yağlar için 0.5g sıvı yağlar için 0.2 g örnek bir erlende tartılır ve 15ml CCl4 ilave edilir. Erlen iyice karıştırılarak yağın tamamen çözünmesi sağlanır. Bu sırada yağın erlenin çeperlerine bulaşmamasına dikkat edilmelidir. 15ml Wijs reaktifi ilave edilir ve erlenin ağzı kapatılarak karanlıkta yarım saat bekletilir. Süre sonunda 15ml %10’luk KI çözeltisi ilave edilir ve kullanılmayan halojen 0.1N Na2S2O3 ile titre edilir. Renk açık sarı olduğunda 1ml nişasta ilave edilerek titrasyona devam edilir. Harcanan toplam Na2S2O3 miktarı kaydedilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 42 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Aynı deneme yağ örneği kullanılmadan sadece 15ml CCl4 ve 15ml Wijs reaktifi ile tekrarlanır. Erlen No 1,2 3,4 5,6 Katı Sıvı CCl4 Wijs yağ yağ (mL) Karıştırılır reaktifi (g) (g) (mL) ve 0,5 0 15 15 yağların çözünmesi 0 0,2 15 15 sağlanır. 0 0 15 15 Erlenin ağzı kapatılır ve karanlıkta yarım saat bekletilir. %10 KI (mL) 15 15 15 Na2S2O3 ile Titrasyon (Dönüm noktasında nişasta) Sarfiyat İYOT DEĞERİ (İD): a: boş denemede harcanan 0.1N Na2S2O3 miktarı, ml b: yağ ile yapılan denemede harcanan 0.1N Na2S2O3 miktarı, ml T: tartılan yağ, g İD: 100g lipid tarafından absorblanan iyot miktarı, g Steroller Bitkisel yağlardaki sabunlaşmayan kısımların miktarı hiçbir zaman %2 oranını geçmez ki steroller bu kısımdadır. Steroller siklopentanoperhidrofenantren halka sistemini içeren sekonder alkollerdir. Bitki ve hayvanlarda serbest ester (steridler: yağ asitleriyle) veya glikozid halde bulunurlar. İlk elde edilen sterol hayvansal bir madde olan kolesteroldür. Bu bileşik safra taşlarından çıkarılmıştır. Mantarlardan çıkarılan ergosterol ile yüksek bitkilerde bulunan stigmasterol en önemli bitkisel sterollerdir. Bazı kalp glikozidleri (Digitalis glikozidleri), saponinler, vitamin D (ergosterol: vitamin D2) ve bazı hormonlarda (stigmasterol: androjen ve östrojen) bulunurlar. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 43 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Sterolün elde edileceği yağlı materyal etanollü ortamda alkali ile sabunlaştırılır, karışım su ile seyreltilerek petrol eteri veya eter ile tüketilir. Organik çözücü uçurulduğunda geriye sterol bakımından zengin bakiye kalır. Steroller renk reaksiyonları ile veya asetatlarının erime noktaları tayin edilerek tanımlanır. Kimyasallar Asetik Asit Anhidridi Derişik Sülfürik Asit Kloroform Kolesterol Ergosterol (3-4 paket bira mayası geniş ağızlı bir erlene konur. %1’ lik alkali çözeltisi bira mayasını 2 parmak kaplayacak şekilde ilave edilir. Erlenin ağzı pamukla kapatılır, 120°C’ lik otoklavda veya etüvde birkaç saat tutularak sıvı hale getirilir. Ergosterol katı halde kalacaktır. Sıvı kısmı süzerek ergosterolü ayırın. Eter ile yıkayarak temizleyin, sonra da kurutun.) 1. Liebermann Reaksiyonu Deneyin Yapılışı: Spatül ucu ile az miktarda kolesterol deney tüpüne konur. 5ml kloroform ile çözülür. Çözelti hacminin 1/5’ i miktarında asetik asit anhidridi ilave edilerek karıştırılır. Karışıma damla damla derişik sülfürik asit ilave edilir. Sterollerin varlığında karışımın rengi önce menekşe, sonra lacivert, en sonunda da yeşil olur. Aynı test ergosterol ile de tekrarlanır. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 44 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Prensip: Bu renk reaksiyonu kolesteroldeki çift bağdan ileri gelir. 2. Hager-Salkowski Reaksiyonu Deneyin Yapılışı: Spatül ucu ile az miktarda kolesterol deney tüpüne konur. 1-2ml kloroform ile çözülür. Üzerine eşit hacimde derişik sülfürik asit ilave edip çalkalayın. Sterollerin varlığında kloroformlu tabaka kan kırmızısı bir renk alırken, asitli tabaka yeşil bir floresans gösterir. Aynı test ergosterol ile de tekrarlanır. ÇALIŞMA SORULARI 1- Lipoprotein ne demektir? Birkaç örnek vererek organizmadaki görevlerini açıklayınız. 2- Membrandaki lipidlerin yapısal ve fonksiyonel önemleri nelerdir? Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 45 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY VIII KANTİTATİF ASKORBİK ASİT ANALİZİ Askorbik asit, endiol yapısında ve lakton halkalı bir heksoz türevidir. Suda çözünür, renksiz ve kokusuz, kristal şeklindedir. Kuru halde ışık görmeyen ortamlarda uzun süre depolanabilir. Pek çok hayvan ve bitki askorbik asidi sentezleyebilir ancak memeli hayvanların bazıları ve insanlar için C vitamini esansiyeldir ve günde yaklaşık 75mg kadar diyetle alınması gereklidir. Taze sebze ve meyvelerde bol miktarda bulunan askorbik asit kuvvetli bir indirgeyici ajandır. Vücutta antioksidan olarak hareket eder. Yaşlanmanın geciktirilmesinde ve kanserin önlenmesinde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Soğuk algınlıklarında ve soğuk algınlıklarını önlemek için yaygın olarak kullanılan C vitamininin çok yüksek dozda alınmasının kansere karşı koruduğu Linus Pauling tarafından ileriye sürülmüştür. Son yıllarda yapılan araştırmalarda ise aşırı C vitamini tüketmenin kanseri tetiklediği ileri sürülmüştür. C vitamini eksikliğinde kapiler damar kanamaları, diş eti enfeksiyonları ve diş çürümeleri şeklinde ortaya çıkan skorbit hastalığı meydana gelir. Sentetik olarak hazırlanan askorbik asidin meşrubatlara katılmasıyla, günümüzde ender olarak bu hastalığa rastlanır. C vitaminin fazlasın idrarla dışarı atılır. Askorbik asit asidik çözeltilerde kararlıdır. Kuvvetli indirgen etki gösteren askorbik asit ısıtıldığında bozularak etkisini yitirir. Gıda maddeleri ilaçlar ve doğal ürünlerde askorbik asit tayini, bileşiğin bu indirgen özelliğine dayanır. Titrimetrik teknikler tayinde kullanılan analitik yöntemlerin başında gelir. İyot ve 2,6-diklorofenolindofenol ile titrasyonlar, florometrik işlemler, metilen mavisi ile fotokimyasal reaksiyonlar bunlar arasında sayılabilir. Çok sayıda analiz yapılacağı zaman askorbik asit tayini için gaz kromatografisi, elektrokimyasal (polarografik, kulometrik, amperometrik) yöntemler de kullanılabilir. YÖNTEM Deneyde kullanılan çözelti ve kimyasallar %0.25’lik nişasta çözeltisi (0,625g nişasta tartılarak sıcak 250 mL suda çözülür çözelti berrak oluncaya kadar kaynatılır) 0.7 M sodyum tiyosülfat (0.1 g Na2CO3 ve 11.08g Na2S2O3 /1000 mL su) %0.2 KIO3 çözeltisi (2g KIO3 /1000 mL su) %5’lik KI çözeltisi (2,5g/50 mLsu (her grup ayrı hazırlayacaktır)) % 0.1 Askorbik asit standart çözeltisi (0.1g askorbik asit/ 100 mL su) 0.3 M H2SO4 çözeltisi (16,65 mL der. H2SO4 / 1000 mL) Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 46 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Deneyin Yapılışı 0,3M Askorbik Meyve Su KI Erlen KIO3 Nişasta H2SO4 Asit Suyu (mL) (mL) Sarfiyat No (mL) (mL) Na2S2O3 Na2S2O3 (mL) (mL) (mL) ile ile 1 50 2,5 0 17,5 15 10 Titrasyon 2 Titrasyon (Açık sarı (Renksiz 2 50 5 0 15 15 10 2 olana olana 3 50 10 0 10 15 10 2 kadar) kadar) Örnek 50 0 20 0 15 10 2 Askorbik asit (C vitamini) orta kuvvetli bir indirgeyici ajandır. Sudaki iyot molekülünü askorbik asit ile indirgenmesi reaksiyonu şu şekilde verilebilir; (1) KIO3(aq) + 6 H+(aq) + 5 I- (aq) 3 I2(aq) + 3 H2O(l) + K+(aq) (I2 oluşumu) (2) C6H8O6(aq) + I2(aq) C6H6O6(aq) + 2 I- (aq) + 2 H+(aq) (C vitamininin oksidasyonu) 1. reaksiyon ile I2 oluşur, bu oluşan I2 2. Reaksiyon ile okside olur. Her iki reaksiyon da seyreltik asidik ortamda gerçekleşir ayrıca 1. Reaksiyon I- iyonlarına ihtiyaç duyar. İlgili yarı reaksiyonlar şu şekilde verilebilir; I2 + 2e⎯ → 2 I⎯ Toplam reaksiyon şu şekildedir; Askorbik asit + I2 (aq) + H2O Dehidroaskorbik asit + 2I- + 2H+ Bu reaksiyonun denge sabiti büyüktür ve girenler tamamen ürüne dönüşürler. Ancak I2’nin sudaki çözünürlüğü düşüktür. Bu nedenle I- kullanılarak I3- kompleksi oluşturulur. I2(aq)+ I- I3Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 47 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı I3- kompleksi triiyodür olarak adlandırılır. Triiyodür iyodat kullanılarak da üretilebilir. IO3- + 8I- + 6H+ 3I3- + 3H2O Triiyodür askorbik asitle reaksiyona girer. Askorbik asit + I3- + H2O Dehidroaskorbik asit + 3I- + 2H+ Askorbik asit konsantrayonu dolaylı yolla reaksiyona girmeden kalan I3- iyonlarını tayin ederek bulunur. Bu amaçla tiyosülfat kullanılır. I3- + 2S2O32- 3I- + S4O62S4O62- tiyonat iyonu olarak isimlendirilir. İndikatör olarak nişasta kullanılır. Triiyodür nişasta ile koyu mavi renkli bir kompleks oluşturur. VERİLERİN KULLANIMI 1, 2 ve 3 numaralı erlenlerdeki askorbik asit miktarı mg cinsinden hesaplanarak tiyosülfat sarfiyatına karşı grafiğe çizilir. Örneğin sarfiyatı grafik üzerinden okunarak askorbik asit konsantrasyonu tayin edilir ve mg/100mL cinsinden ifade edilir. ÇALIŞMA SORULARI 1- Askorbik asit hangi organizmalarca ve hangi metabolik yol ile sentezlenir? 2- Kolajen yapısını kısaca açıklayınız. Askorbik asit eksikliğinde kolajen yapısında ne gibi değişiklikler olur. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 48 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY IX DOĞAL KAYNAKLARDAN ORGANİK BİLEŞİKLERİN ELDE EDİLMESİ Alkaloidler nitrojen içeren organik bazlar olup, aminoasit metabolizmasının ürünleridir. Bitkiler nitrojenli ürünleri dışarıya atamazlar çünkü asimile edilebilen Nbileşikleri genelde bitki gelişmesinde sınırlayıcı faktördür. Yeterli nitrojen kaynağıyla, bazı aminoasitler fazla sentezlenirler ve bunlar metabolizmanın son ürünü olan alkaloidlere çevrilerek birikirler. Bitkilerde sekonder metabolitlerin oluşumu şekilde verilmiştir. Alkaloidlerin ortak öncül maddesi ornitin, lizin, fenilalanin, tirozin ve nikotinik asittir. Nikotin [1-metil-2-(3-piridil)pirrolidin], en fazla tütünde, az miktarda da domates, patlıcan ve yeşil biberde bulunur. Piridin ve pirrolidin halkalarındaki N-atomları nikotine bazik bir karakter verir. Ticari amaçlarla insektisid, veterinerlikte parasitisid olarak kullanılan nikotinin yüksek dozları insan için toksiktir. Renksiz bir yağ görünümünde olan nikotin 246°C’ de kaynar. Su ve pek çok organik çözücüde kolaylıkla çözünür. Bitkilerde asitlerle birlikte bulunan nikotin (kuru tütünde %2-8 oranında sitrik ve malik asitlerle birlikte) seyreltik alkali çözeltileri ile ekstre edilir. Alkali çözeltilerinden eter fazına alınan nikotin, saflaştırılır. Nikotinin kimyasal karakterizasyonu gerek sıvı gerekse çok az miktarda elde edildiğinden zordur. Bunun için elde edilen nikotin pikrik asit ile reaksiyona sokularak nikotin dipikrat tuzuna dönüştürülerek izole edilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 49 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Deneysel Kısım Çözeltiler Tütün (8 adet sigara) Eter Metanol %5’ lik NaOH Çözeltisi Pikrik Asit Çözeltisi (metanolde doymuş) %50’ lik Etanol Çözeltisi Deneyin Yapılışı 1. Yaklaşık 8.0-8.5g tütün (8 sigara), 400ml’ lik bir behere konur, üzerine %5’ lik 2. 3. 4. 5. NaOH çözeltisinden 100ml ilave edilir ve karıştırılır. az miktarda cam pamuğu yerleştirilmiş Buchner Hunisinden süzülür. Alkali ekstraktın tamamını alabilmek için ufak bir beherin tabanı ile yavaşça bastırılır. 20ml su ile yıkanan tütün tekrar süzülür. Ekstrakt çözeltisi kahverengidir. 250ml’ lik ayırma hunisine konur ve 25ml eter eklenip hafifçe çalkalanır. Alt faz ayırma hunisinden alınır. İşlem 25ml’ lik eter ile 2 kez tekrarlanır. Toplam 75ml civarındaki alt faz 5-10dk bekletildikten sonra temiz olan tabaka gerekirse büyük bir pipetle alınarak 100ml’ lik erlene konur. Çözelti çeker ocakta ve su banyosunda 10ml kalana kadar uçurulur. Soğutulduktan sonra 50ml’ lik behere aktarılır, erlen bir miktar eterle (2-3ml) çalkalanarak behere ilave edilir. Çeker ocakta kuruyana kadar uçurulur. Kalıntı kısmen katı kısmen yağ görünümlü bir sıvıdır. Beher soğutulduktan sonra 10ml saf su behere konur ve katı çevirerek çözünürleştirilir. 4ml etanol eklendikten sonra bir parça cam pamuğundan bir huni ile süzülür. 5ml etanolle beher ve huni yıkanarak süzüntüye eklenir. Nikotin ekstresine 10ml pikrik asit ilave edilir ve hafifçe çalkalanır. Sarı renkli köpüklü görünümlü nikotin dipikrat oluşur. Hirsh hunisinden süzülür ve kurutulur. Yaklaşık 50mg kadar nikotin türevi elde edilir. Türevin erime noktası 222-224°C’ dir. Kurutulan ürün metal spatül ile 50ml’ lik bir behere alınır, üzerine %50’ lik etanolden 20ml eklenir, kaynamaya yakın (95-100°C) ısıtılarak çözünür. Ağzı gevşek kapatılan erlen soğumaya bırakılarak uzun açık sarı, prizmatik kristallerin oluşumu beklenir. Sonra süzülür, kurutulur, erime noktası tayin edilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 50 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DENEY X MEMELİ DOKULARINDAN DNA İZOLASYONU VE BAZI ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ DNA ve RNA nükleik asitler olarak adlandırılırlar ve nesilden nesile kalıtımsal bilginin aktarılmasını sağlayan uzun zincirli polimerlerdir. Bu makromoleküllerin yapı taşları nükleotidlerdir. Her nükleotid bir şeker, bir fosfat ve bir bazdan oluşur. Şekil 4.1- DNA ve RNA yapısında yer alan azotlu bazların yapıları Şekil 4.2- Deoksinükleotid yapısı Nükleik asitler nükleotidlerin 3′, 5′-fosfodiester köprüleri ile bir araya gelmesinden oluşmuştur. Bu zincirlerde fosfodiester köprüleri ile bağlanmış şeker molekülleri nükleik asitlerin iskeletini oluşturur. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 51 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Şekil 4.3- Nükleik asit yapısı DNA ikili sarmalında adenin-timin (A-T) ve guanin-sitozin (G-C) yer bağları kurulur. Şekil 4.4- DNA yapısında alan baz çiftleri DNA ikili sarmalını bir arada tutan kuvvetler, nükleotid zincirleri arasındaki A-T ve G-C Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 52 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı çiftleri arasındaki hidrojen köprüleri (yatay interaksiyon) ve nükleotid zincirleri üzerindeki bazlar arasındaki etkileşimlerdir (dikey interaksiyon). Şekil 4.5- DNA çift sarmal yapısı Protein molekülünde olduğu gibi DNA molekülünün yapısındaki herhangi bir bozulmaya da denatürasyon denir. DNA denatürasyonu yatay ve dikey çekici güçlerden herhangi birindeki azalma veya kopma sonucu olur. Yatay güçlerdeki azalma ya da kopma sonucu olan denatürasyon DNA’nın 260 nm’deki absorbansının artması ile belirlenebilir. Dikey güçlerdeki azalma ya da kopma sonucu olan denatürasyon (hipokromisite) tek başına 260 nm’de absorbans değişikliğine sebep olmaz. Ancak DNA’nın 210 nm civarındaki 2. pikinin absorbansında azalma hatta tamamen yok olma ve pikin dalga boyunun daha yüksek dalga boylarına kayması meydana gelir. DNA sarmalını oluşturan zincirlerin birindeki veya her ikisindeki bazlardan bir veya bir kaçının kopması sonucu nükleotid zincirde kısalma meydana geliyorsa bu olaya DNA’nın degradasyonu denir. Degradasyon gerçekleştiğinde 260 nm’deki absorbansta azalma meydana gelir. 42°C’ın üzerindeki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı arasındaki hidrojen köprüleri öncelikle A-T zengin bölgelerde olmak üzere gevşeyip açılmaya başlar. Kullanılan tampon çözeltiye bağlı olarak 56-80°C arasındaki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı kendisini oluşturan nükleotid zincirlerine ayrılır. Buna DNA’nın erimesi denir. DNA heliksinin %50’sinin denatüre olduğu sıcaklığa DNA’nın erime sıcaklığı (Tm) adı verilir. Tm değeri o DNA’nın A-T/G-C oranına bağlı olduğundan, DNA’nın tanımlanmasını sağlayan spesifik bir değerdir (yani bir fareden alınan DNA’nın Tm değeri, bir insandan alınan DNA’nın Tm değerinden farklı olacaktır veya aynı bakterinin iki farklı suşunun Şekil 4.6- DNA‘nın erimesi DNA’larının Tm değerleri farklı olacaktır). Ayrıca Tm değeri kullanılan tampon çözeltinin iyonik şiddetine ve pH’sına da bağlıdır. Bu nedenle Tm değeri verilirken mutlaka deneyin hangi, şartlarda yapıldığı da belirtilmelidir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 53 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DNA erimesi sıcaklık 90-100 °C’nin üzerine çıkılmadığı sürece geri dönüşümlüdür. Eğer 80°C’ye ısıtılmış bir DNA çözeltisi, oda sıcaklığında yavaş yavaş soğumaya bırakılırsa iki sarmal tekrar birleşerek DNA ikili sarmalını oluştururlar (hibridizasyon). Ancak aynı DNA oda sıcaklığında değil de bir buz banyosunda ani soğutmaya bırakılacak olursa DNA sarmalarında hibridizasyon gerçekleşmez ve nükleotid zincirleri birleşmezler. Ayrıca DNA boyunda kısalmalar, yani DNA degradasyonu meydana gelebilir. Eğer degradasyon meydana gelmediyse bu çözeltiler yeniden ısıtılıp yavaş yavaş soğumaya bırakılırlarsa DNA ikili sarmalını yeniden oluşturabilirler. Şekil 4.7- DNA’nın erimesine G-C içeriğinin etkisi Yukarıda anlatıldığı gibi nükleik asitler 260 nm dalga boyunda absorbans piki verirler. Bu absorbans değeri kullanılarak nükleik asidin konsantrasyonu tayin edilebilir. 260 nm dalga boyunda, 1 cm’lik kuartz küvetlerde 1’lik bir absorbans 50µg/mL DNA konsantrasyonuna karşılık gelir. Tek zincirli DNA veya RNA içinse bu değer 40 µg/mL’dir. Nükleik asitlerin saflığını tayin etmek için nükleik asit çözeltilerinin absorbanslarının 240-300 nm arasında ölçülmesi gerekir. Proteinler 280 nm’de pik verdiklerinden A260 nm/ A280 nm oranından yararlanılarak saflık tayini yapılabilir. DNA için bu oran 1.8, RNA içinse 2.0 olmalıdır. Eğer bu verilen değerlerden daha düşük değerler elde ediliyorsa, bu örneğin proteinlerle kontamine olduğunu gösterir. Kontaminasyon bir kimyasal karışım içinde düşük miktarlarda (genellikle istenmeyen) başka maddelerin var olmasıdır. Hücreler (hücre tiplerine göre farklılık göstermekle birlikte) büyük ölçüde su içerdiklerinden, hücre organellerinin yapısal özellikleri su ile reaksiyonları sonucu ortaya çıkar. Hücreler ve hücre organelleri yapısal özellik ve bütünlüklerini izotonik çözeltiler içinde koruyabilirler. Hücrelerle aynı osmatik basınca sahip çözeltilere izotonik çözeltiler denir. İzotonik çözeltilerde hücre ile etrafındaki çözelti arasındaki su alış verişi dengededir. %0.876’lık NaCl (serum fizyolojik), %5 dekstroz (serumda kullanılır) gibi çözeltiler yaygın olarak kullanılan izotonik çözeltilere örnek olarak verilebilirler. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 54 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı Her ne kadar hemen hemen tüm hücreler DNA içerseler de bazı dokularda bu miktar çok az olduğundan bu tip dokular DNA izole etmek için iyi bir kaynak değildirler. Bazı dokular ise yüksek deoksiribonükleaz aktivitesine sahip olduklarından DNA izolasyon esnasında küçük parçalara ayrılır. Bu nedenle DNA elde etmek için yüksek DNA ve düşük nükleaz aktivitesine sahip dokular tercih edilmelidir. Bu amaçla en iyi kaynaklar timus ve lenf en iyi dokulardır. Dalak, testis ve yumurtalıklarda DNA elde etmek için kullanılabilirler. KİMYASALLAR NaCl, EDTA, SDS, etanol. YÖNTEM Çözeltilerin hazırlanması: Ekstraksiyon çözeltisi: 0.15 M NaCl ve 0.1 M EDTA çözeltisinden oluşur. 0,925 g EDTA ve 2,19 g NaCl 250 mL destile su içinde çözülerek hazırlanır. Deneyde soğuk olarak kullanılır. 2M NaCl çözeltisi: 11.7 g NaCl 100 mL destile suda çözülerek hazırlanır. DNA’nın İzolasyonu: DNA izolasyonunun yapılacağı dokudan yaklaşık 10 g alınır ve 100 mL ekstraksiyon çözeltisi ilave edilir. Daha sonra kısa sürelerle ve DNA içeren çözeltinin ısınmamasına dikkat edilerek homojenizatörde homojenize edilir. DNA’nın bozulmaması için bu işlemler soğukta yapılmalı ve kullanılan çözeltiler önceden soğutulmuş olmalıdır. Homojenize hale getirilmiş olan çözeltiye 1 mL %10 SDS ilave edilir. Hafifçe alt üst edilerek çözelti karıştırılır (SDS deterjan olduğundan köpürmemesine dikkat edilir). Daha sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Üstteki çözelti (süpernatant) dikkatle alınır ve temiz bir santrifüj tüpüne hacim 4 mL olacak şekilde aktarılır. Süpernatant çözeltisine 8 mL soğuk 2M NaCl çözeltisi ilave edilir ve dikkatle karıştırılır. Daha sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant yaklaşık 4 mL hacimde olacak şekilde dikkatle temiz bir santrifüj tüpüne alınır. Süpernatanta yaklaşık 8 mL soğuk etanol yavaş yavaş ilave edilir ve tüpteki değişim gözlenir. Daha sonra 4000 rpm’de 1-2 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonunda üstteki süpernatant dekante edilir ve beyaz renkli DNA presipitatı alınır. Etanol kalıntısını uzaklaştırmak için 1-2 mL 0.1 M EDTA çözeltisi ile, karıştırılmadan kalıntılar yıkanır, yıkama çözeltisi dekante edilerek uzaklaştırılır ve daha sonra yeterli miktarda ekstraksiyon çözeltisinde çözülür. Çözünmeyen kısımlar santrifüj ile uzaklaştırılır. Elde edilen DNA çözeltisi derin dondurucuda uzun süre saklanabilir. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 55 Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı DNA’nın Erimesi: DNA çözeltisinin 260 nm ve 280 nm’deki absorbansları ölçülür ve konsantrasyonu ve saflığı tayin edilir. 4 cam tüpe elde edilen DNA çözeltisinden yaklaşık 5’er mL alınır. Tüplerden bir tanesi oda sıcaklığında bekletilirken diğer üçü 80°C sıcaklıktaki su banyosunda 10 dakika bekletilir. Bu sürenin sonunda bir tüp oda sıcaklığında, bir tüp buz banyosunda ve bir tüp de –80°C soğutucuda 5 dakika tutulur. Soğutulmuş olan tüplerin oda sıcaklığına gelmesi beklenir ve 4 tüpün absorbans değerleri 260 nm’de ekstraksiyon çözeltisi kör olarak kullanılarak ölçülür. Tüp Hacim No (mL) Uygulanan işlem Oda sıcaklığında bekletilir. 1 5 2 5 80°C ısıtıtma (10 dakika) 3 5 80°C ısıtıtma (10 dakika) 4 5 80°C ısıtıtma (10 dakika) Uygulanan işlem Oda sıcaklığında bekletilir. Oda sıcaklığında bekletilir. Buz Banyosunda Bekletilir (5 dakika) -80°C soğutucuda bekletilir (5 dakika) Uygulanan işlem Oda sıcaklığında bekletilir. Oda sıcaklığında bekletilir. Oda sıcaklığında bekletilir. Absorbans Absorbans (260 nm) (280 nm) Ölçüm yapılmaz Oda sıcaklığında bekletilir. ÇALIŞMA SORULARI 1- Genomik (Genomics) nedir? Genomik çalışmalar niçin önemlidir? 2- Bilimsel araştırmalarda DNA izolasyonunda genellikle fenol ekstraksiyonu kullanılır. Bu yöntemin nasıl yapıldığını ve prensibini araştırın. Biyokimya Laboratuvarı Kimya Eğitimi 56
