Bölüm 2 El Kitabinin Sunumu, Çalisma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri

Gıda Örneklerinde
Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs
Bilgileri
M.Querci
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
2
İçindekiler
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
GDO’lar nasıl belirlenir?
3 DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları
4 El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar
7 Kaynaklar
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
11 Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
3
GDO’lar nasıl belirlenir?
Daha önce de belirtildiği gibi transgenik bitkiler genomlarına yeni gen veya genlerin
eklenmesi ile karakterize edilirler. Aktarılan bu yeni gen ile yeni bir protein ifade edilir.
Bu da bitkiye bazı böceklere ve/veya yabancı otlara direnç gibi yeni bir özellık
kazandırı. GDO tanı teknolojisinin temelini değiştirilmemiş çeşit ile transgenik bitki
arasındaki bu farkın kullanılması oluşturur. Bu işlem aktarılan yeni DNA’nın veya
ifade edilen yeni proteinin belirlenmesi, yahut (eğer enzim ise) enzimatik
reaksiyonların ürününü tespit etmek için kimyasal analiz yöntemleri kullanılması yolu
ile olur.
Günümüzde mısır, soya, pamuk gibi tarla bitkilerinde genetik modifikasyonların
belirlenmesi için iki bilimsel yaklaşım kullanılmaktadır. Birincisi, ELISA (Enzyme
linked immuno sorbent assay) antijen ve antikor
arasındaki bağlanma özelliğini
kullanarak özel proteinlerin varlığını test eder, diğeri PCR (Polymerase Chain
Reaction), tahıla aktarılmış olan DNA sekanslarının belirlenmesine dayanır. Bu
yöntemler örnekteki miktar (yüzde) hakkında bilgi verebilir. AB’de geçerliliği
onaylanan ilk yöntem, pazara sunum için onaylanan birçok GDO’nun tespit
edilebildiğii PCR’a dayalı tayin yöntemidir (Lipp ve ark. 1999).
Pietsch ve ark. (1997) tarafından geliştirilen bu metot, aktarılan genin konakçı
organizmada işlevselliği için gerekli olan 35S promotor ve nos terminatör kontrol
tayinine dayanır. Yöntem geçerliliği IHCP (JRC)’nin Gıda Üretimi ve Tüketici Malları
Birimi (Food Products and Consumer Goods Unit) tarafından uygun sertifikalı
referans materyallerinin üretiminden sorumlu olan JRC, IRMM (Referans Materyaller
ve Ölçümler Enstitüsü) ile işbirliği ile koordine edilmiştir.
Yukarıda
bahsedildiği
gibi
araştırmalar
ayrıca
proteine
dayalı
yöntemlerin
geliştirilmesine de yönelmiştir. Roundup Ready® soyanın tayininde hassasiyeti
yüksek, ELISA tabanlı bir yöntem kullanılması geçerlilik onayı almış olup (Lipp ve
ark.
2000)
diğer
yöntemler
de
geliştirilmiştir
(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
4
DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları
DNA’ya dayalı yaklaşım
PCR teknolojisine dayalı analitik yöntemler GDO’larda bulunan DNA sekanslarının
tayininde artarak kullanılmaktadır.
PCR, diğer DNA sekansları ile karışık olan ve düşük miktarlarda bulunan özel DNA
parçalarının seçici olarak çoğaltılmasına izin verir. PCR reaksiyonun başlangıcı için
gerekli olan küçük tamamlayıcı DNA parçaları primer olarak adlandırılır ve çift olarak
kullanılır. Bu primerler ilgilenilen genin zıt dizilerine bağlanmak üzere düzenlenirler (5’
ve 3’). Böylece birçok döngü boyunca primerler arasındaki sekans özel bir DNA
polimeraz tarafından kopyalanarak çoğaltır. Bu çoğaltılan parçalar elektroforeze tabi
tutulur, böylece varlıkları ve boyutları belirlenebilir.
Tarımsal gıda ve yemlik tahıllarda da GDO’nun belirlenmesi ve ölçülmesini sağlayan
bir çok PCR’a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Buna ek olarak, genetik kimliğin
tanımlanması, GDO tahılların destek zinciri (üreticiden tüketiciye) boyunca
ayrılabilmesine ve izlenebilirliğine olanak sağlar.
GDO tayini için önşart, gerçekleştirilmiş olan genetik modifikasyon(lar)un türü
hakkında, kullanılan promotör ve terminatörü de içine alacak biçimde aktarılan genin
moleküler oluşumu üzerine sahip olunan bilgidir. Analiz, hedef geni de kapsayan
bütün DNA’yı içeren minimum miktarda örnek materyal ile yapılır.
PCR, eğitimli eleman ve özel ekipman gerektiren laboratuvara dayalı hassas bir
tekniktir.
PCR’a dayalı tanının bazı ana özellikleri aşağıdaki gibidir:

Bir organizmanın tüm genetik materyali ya da genomunda, araştırılan genin
bir ya da birkaç kopyasını tespit edebilecek kadar hassas olabilir.

Bu yüksek hassasiyetin sonucu olarak, dikkatsizlik sonucu meydana gelen
çok düşük seviyelerdeki kontaminasyon dahi yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu
nedenle çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkat edilmelidir.

İmmunolojik
analizlerle
kıyasla
(primer
sentezi
ile
antikor
üretimi
karşılaştırıldığında) çok daha kısa bir kimyasal hazırlık süresi gerektirir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri

5
Analiz için gerekli olan kimyasalların hemen hepsi ticari olarak mevcut olup,
bir çok kaynaktan kolayca temin edilebilmektedir. Ancak bunların bazıları,
tanısal kullanım için lisans gerektirmektedir.

Numune analizi yaklaşık bir gün sürmektedir.

Uygun şekilde geliştirilirse PCR, farklı genetik modifikasyon tipleri (transgenik
hat olarak da tanımlanır) arasında ayrım yapabilme özelliğine sahiptir. Özel
transgenik hatların tanımlanması için var olan tanı yöntemleri ekstra bir
geliştirme süreci ve geçerlilik çabasını gerektirir.
Proteine dayalı yaklaşım
Proteine dayalı yaklaşım, ilgi duyulan proteine karşı geliştirilmiş özel antikorlar
kullanır. ELISA özel olarak, yahut diğer benzer olmayan proteinlerin de bulunduğu
örnekte, ilgi duyulan proteini belirler veya ölçer. ELISA yöntemi özel bir proteine
bağlanması için bir antikor, tespiti çoğaltabilmek için ikinci bir antikor (tercihe bağlı)
ve ilgilenilen protein standardı ile karşılaştırılarak, reaksiyonun sonucunu bir renk
ürünü olarak ölçebileceğimiz, antikora bağlı bir enzim kullanır.
Testin doğru biçimde yapılabilmesi için eğitilmiş personel ve özel ekipman
gerekmektedir.
ELISA analizinin anahtar özellikleri;

PCR’dan daha az hassastır, bu nedenle, düşük seviyelerdeki kontaminasyon
sonucu oluşan “yanlış pozitif” sonuçlarla PCR’a nazaran daha nadiren
karşılaşılır.

Analiz geliştirilmesi ve antikor ve protein standartları oluşturmanın yüksek ön
maliyeti vardır.

Kimyasallar geliştirildikten sonra örnek başına maliyeti düşüktür.

Aynı protein özelliğini gösteren farklı transgenik vakalar arasında farkı ayırt
edemeyebilir.

Proteine dayalı yöntemler kimyasallar ve yöntem gelişimi için önemli bir ön
hazırlık zamanı gerektirir.

Proteine dayalı testler, ölçülebilir bir protein üretildiğinde pratik ve etkili bir
analiz yöntemidir. Ancak genetik olarak değiştirilmiş ürünler yalnızca bazı
gelişim safhalarında veya belli bitki bölümlerinde üretilirler ve bunları ELISA
ile kolayca ölçmek mümkün olmayabilir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri

6
Buna ek olarak, özellikle endüstriyel işlemler proteinlerin kolayca bozulmasına
sebep olabilir ve bu nedenle işlenmiş gıdalarda ELISA yöntemini kullanmak
problemli olabilir.
Bu noktalar düşünüldüğünde ELISA ve PCR
ayrı ve biri diğerinin yerine geçer
yaklaşımlar olarak değil, birbirini tamamlayıcı yöntemler olarak dikkate alınmalıdır.
Tablo 1. ELISA ve PCR yöntemlerinin karşılaştırılması
Yöntem
Test
yapılan
molekül
Süre
Kullanım kolaylığı
Sonuçlar
ELISA
Protein
2-8
saat
Orta; laboratuar bilgisi
gerektirir; testler
tahıla ve çeşide
özeldir
Özel genetik modifikasyonu
tespit edebilir, test numunesinde
GDO için nicel tayin yapmak
mümkündür
PCR
DNA
1-3
gün
Zor; özelleşmiş alet
ve eğitim gerektirir
Çok hassas, yanlış pozitiflere
maruz kalabilir; GDO DNA’nın
varlığını tespit eder, test
numunesinde GDO için nicel
tayin yapmak mümkündür
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
7
El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar
Yöntem geçerliliği hem laboratuvar hem de kontrol otoriteleri açısından kritiktir.
İdealinde, performans doğrulama amaçlı olarak, her yöntem hassas, tekrarlanabilir
ve hedefe özel sonuçlar sağlamak açısından, sınırlı sayıda deneyimli laboratuarlarca
onaylanmalıdır. AB’nin JRC birimi ilk olarak
Roundup Ready® soya içeren
işlenmemiş materyal için ELISA ve PCR yöntemlerine, Maximizer mısır (Bt-176) için
PCR yöntemine ve işlenmiş gıdada Bt-176 ve Roundup Ready® için PCR yöntemine
geçerlilik onayı vermiştir (Lipp ve ark. 1999, 2000, 2001). O zamandan beri, hem nitel
hem de nicel analizler geliştirilmiş ve onaylanmıştır (GDO tayini ve ölçümü için
onaylanmış
yöntemler
hakkında
son
bilgi
için
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm). Gerek DNA’ya, gerekse
de proteine dayalı yöntemlerde GDO belirleme ve miktar ölçme işlemleri için örnek
hazırlama aşaması kritiktir. İlgilenilen soruna bağlı olarak (örn. nitel veya nicel) her
prosedürün sınırlarını bilmek önemlidir. Hem örnek boyutu, hem de örnekleme
işlemleri herhangi bir test yönteminden elde edilecek sonuçlar üzerinde büyük etkiye
sahiptir.
Uygun sertifikalı referans materyallerinin (RM) bulunabilirliği her tayin yöntemi için
temel gerekliliktir. Bu kursta kullanılan referans materyaller JRC IRMM’de üretilmiştir
(Trapmann ve ark. 2002 ve 2001). RM özellikleri ve sertifikaları Bölüm 3’de
verilmiştir. Örnek homojenizasyonu kurs kapsamında yer almamakla beraber önemli
bir işlemdir.
Şekil 1. Kurs sürecinde gerçekleştirilen farklı analiz basamaklarını özetlemektedir.
DNA izolasyonunun optimize edilmesi, PCR ile çoğaltılmaya uygun DNA’nın kalitesi
ve varlığı için temel işlemdir. Bu konu, özellikle marketteki bir çok gıda ürünü,
endüstriuel olarak işlenmiş soya ve mısırdan türetildiği için çok önemlidir. DNA
gıdanın işlenmesi esnasında, özellikle suyun varlığındaki ısıl işlemler sebebi ile
parçalanabilir. Böylece gıdadaki GDO’ ların varlığının belirlenmesine izin verecek
kadar uzun olan DNA parçalarının miktarı( araştırmaya konu olan yeni gen diziliminin
tamamını içerene), gıda işlendikçe azalabilir. Ek olarak, uygun DNA izolasyonu,
örnekte bulunan önleyici maddelerin ortamdan ayrıştırılmasına olanak vermelidir. Bu
konudan
Bölüm
4’de
bahsedilecektir.
DNA
izolasyonu
için
farklı
metotlar
geliştirilmiştir. Bir çok ticari şirket tarafından özel kullanıma hazır kitler de piyasa da
mevcuttur. Farklı uygun protokollerin performans ve geçerliliği kurs esnasında
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
8
tartışılacaktır. Ancak ticari şirketler ile ilişiklendirilmemek için,farklı örneklerde
uygunluğu gösterilmiş, geçerli ve çok yönlü ir protokol olan CTAB metodu DNA
izolasyonu için kullanılmıştır.
DNA izolasyonundan sonra örnekler (ve PCR ürünleri) agaroz jel elektroforezi ile
analiz edilir (Bölüm 5). PCR yönteminin prensipleri , avantajları ve zorluklarından
Bölüm 6’da bahsedilmiştir.
Yukarıda belirtildiği gibi, GDO tayini için modern tekniklerin etkili kullanımı, yeterli
bilginin varlığına bağlıdır. GDO tayini, genetik modifikasyonun tipi ve hedef gen
sekansı hakkında en azından kısmi bilgi de gerektirir. Transgenik hatlar MON810
mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın özellikleri Bölüm 7’de verilmiştir.
Onaylanmış GDO’ların tayininde farklı PCR yaklaşımları geliştirilmiştir. PCR
hassasiyeti doğru primerlerin seçilmesine dayanır. PCR primerleri, transformasyon
işleminde kullanılan farklı genetik elementlere yönlendirilebilir. “Genel kapsamlı” PCR
tayin
sistemleri
–
genellikle
“tarama
yöntemleri”
olarak
adlandırılır
–
transformasyonda en sıklıkla kullanılan ortak sekanslara özel primerlerin dizaynı ile
elde edilebilir. Bunlar genellikle promotör ve terminatör gibi düzenleyici sekanslardır.
Genetik olarak değiştirilmiş bitkiler, aktarılan yapısal gene göre kategorize edilebilir.
Reaksiyon hassasiyetini yönlendirmenin diğer bir yolu, değişik genetik elementlerdeki
yerleşmiş DNA sekanslarına özel (promotor-yapısal gen, yapısal gen-terminatör)
primerler seçmektir. Özel ve tam sekans bilgisi varlığında ise, genetik olarak
değiştirilmiş bitki için gerçekten özel analiz metotları geliştirmek mümkün olur.
Yalnızca bu özel hatta bulunan “özgün” bir sekans kombinasyonu seçme yolu ile bu
hatta özel analiz yöntemleri geliştirilebilir. Bu genellikle entegre edilen yabancı DNA
ile konak DNA arasındaki birleşme bölgesini boydan boya kapsayan DNA dizilimine
karşılık gelen bir primer geliştirilerek elde edilir. Eklenen DNA (T-DNA) ile konak-DNA
arasındaki birleşme bölgesi, oldukça hassas PCR testi için ideal bir hedef sağlayan,
gerçekten özgün bir nukleotid sekansıdır.
Kurs boyunca uygulanan metotlar Şekil 1’de özetlenmiştir. Bölüm 8’de detaylı bir
biçimde açıklanacaktır. Metotların deneysel kısımları ve protokoller Bölüm 9’da
bulunabilir.
Yukarıda belirtildiği gibi numunede GDO varlığının nicel tespitine duyulan ihtiyaç,
yalnızca nitel cevaba (varlığı/yokluğu) değil, verilen numunede GDO varlığının
göreceli ölçümün az veya çok hassas göstergesine (seçilen metoda bağlı olarak) izin
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
9
veren bir çok PCR’a dayalı yöntemin geliştirilmesine neden olmuştur. En sıklıkla
kullanılan DNA’ya dayalı iki yaklaşım karşılaştırmalı PCR ve real-time PCR’dır
(Bölüm 10).
Real time PCR halihazırda sadece bir kaç ticari şirket tarafından üretilen çok özel ve
karmaşık bir cihaz kullanılarak yapılır. Kurs süresince takip edilecek protokoller
Bölüm 11’de bulunabilir.
Son olarak, Bölüm 12’de , genetik olarak değiştirilmiş organizmaların varlığının tespiti
için serolojik yaklaşım hakkında genel bilgi verilerek özellikle ELISA tekniği
anlatılacak ve Roundup Ready® özel ELISA testinin protokolü sağlanacaktır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
10
Örnekleme
Homojenizasyon
Kurs sırasında
uygulanmayacaktır.
İşlenmiş ve
işlenmememiş
materyaller
DNA ekstraksiyonu
Bitki DNA’sının PCR ile kontrolü
+
-
Bitki DNA’sı
saptandı
Bitki DNA’sı
saptanamadı
PCR ile tarama
+
GD bitki
Soya için lektin-PCR
ve mısır için zein-PCR
Düzenleyici elementlerin
saptanması (35S promotör
ve nos terminatör)
GD olmayan bitki
GD bitkiyi
nested PCR ile
tanımlama
GD bitkiyi
ELISA ile
tanımlama
Spektrofotometre ile
DNA miktarının
belirlenmesi
Real-time PCR ile
GD miktar
tayini
Şekil 1. Kurs sırasında uygulanacak yöntemler için iş akış şeması
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri
11
Kaynaklar
Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an Immunoassay for
detection and quantification of a genetically modified soybean in food and
food fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of
AOAC International 83, 919-927.
Lpp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain
reaction for the detection of genetically modified organisms in various
processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J., and Anklam,E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans
and maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923-928.
Pietsch, K., Waiblinger, H.U., Brodmann, P., and Wurz, A. (1997). ScreeningVerfahren
zur
Identifizierung
“gentechnisch
veranderter”
plfanzlicher
Lebenmittel. Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35-38.
Trapmann, S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,
Le Guern, L., Kramer, G.N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny,
R. Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M and Anklam, E.
(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with
different mass fractions of Roundup Ready
TM
soya. Certified Reference
Materials
IRMM-410S.
(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/
attachements/ERM-BF410_report.pdf) (accessed January 2010)
Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G.N., Schimmel, H.,
Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede,
and Anklam, E. (2002). The
certification of reference materials of dry-mixed maize powder with different
mass fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413.
(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/
attachements/ERM-BF413_report.pdf) (accessed January 2010)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 2