Transgenik Rodent Üretimi - Journal of Clinical and Analytical
advertisement
ne ci of Clinic M ical edi al and Anal yt al Transgenik Rodent Üretimi · Jour n Haydar Bağış Özet Transgenik hayvanlar kendi genomunda baska bir organizmaya ait rekombinant bir geni tasıyan hayvanlardır. Mikroenjeksiyon teknigi ile üretilen ve daha çok hastalık modellemesi amacıyla gelistirilen transgenik farelerin ilki 1980 yılında yayınlanmıstır. Fakat, özellikle transfer edilen genin ürününün elde edilmesi, yani, transgenik hayvanların bir çesit “protein üreten fabrika” olarak kullanılması hedeflendiginde bu alandaki çalısmalar da farklı bir boyut kazanmıstır. Temel amaç, elde edilecek ürünün –ki bu ürün terapötik degere sahiptir ve tıbbi açıdan son derece degerlidir- bol miktarda ve mümkün oldugunca saf olarak kazanılmasıdır. Aktarılan rekombinant genin (transgenin) ekspresyonunun, promotor gibi gen ekspresyonunu kontrol edici dizilerin yardımıyla transgenik hayvanın belirli dokularına yönlendirilmesi ve böylece hedef proteinin süt ve idrar gibi vücut sıvılarından salgılanmasının saglanması çalısmaları, çok az süt verdiklerinden dolayı farelerin bu amaç için uygun olmadıgını açıkça ortaya koymustur. Varılan nokta, rekombinant proteinlerin üretilmesinde kullanılacak transgenik hayvanların, bol süt veren çiſtlik hayvanlarından seçilmesi gerekliligi olmustur. Teknigin ilk adımında, mezbaha materyalinden veya ovaryumlardan oosit pick-up (OPU) ile elde edilen olgunlasmamıs oositlerin in vitro maturasyonu ve in vitro fertilizasyonu gerçeklestirilmektedir. Daha sonra, pronükleer dönemde bulunan zigotlara mikroenjeksiyon yöntemi ile 2-4 ng/ µl konsantrasyonda gen konstraktından (transgen) 2 piko litre verilmektedir. Süt alınması temel sart oldugundan, in vitro kültür ortamında morula ya da blastosist asamasına gelen embriyolara sex tayini yapılarak disi olanlar belirlenir. Sonraki adım, disi embriyoların tasıyıcı annelere transfer edilmeleridir. Dogan yavrular arasından transgenik olanlar çesitli moleküler biyolojik yöntemlerle (PCR, Southern Blot) saptanır. Transgenik çiſtlik hayvanlarının üretimi ile yılda 1 tona yakın rekombinant protein, ölü insan dokularındakinden çok daha saf, sağlığa uygun ve bol miktarda elde edilebilmektedir. Giriş İlk transgenik rodent 1980 yıllında pronükler DNA mikroenjeksiyon yöntemi ile Gordon ve ark. Tarafından elde edilmiştir [1]. Daha sonra 1985 yılında ilk transgenik tavşan, koyun, domuz ve inekler elde edilmiştir. Yapılan ilk deneysel transgenik çalışma, 1980’li yıllarda rodent metallotiyonin promotorü altında sıçan büyüme hormonu geni kullanılarak gerçekleştirilmiştir [2]. Daha sonraki yıllarda deneysel çalışmalardan elde edilen olumlu sonuçlarla çok sayıda büyüme hormonu geni ekonomik önemi olan çiſtlik hayvanlarda tekrarlanmıştır. Ülkemizde ise ilk doktora tezi düzeyinde çalışma Bağış [3] tarafından rodentlerde gerçekleştirilerek transgenik rodentler elde edilmiştir. Elde edilen transgenik rodentler insan büyüme hormonu geni taşımaktadırlar. Daha sonraki yıllarda insan hepatit B virus genomunu [4], balık antifriz protein (AFP) ve insan gamma interferon genlerini taşıyan ve bu genleri değişik dokularında ifade eden transgenik rodentler elde edilmiştir. [5-7]. Transgenik hayvan kendi genomunda “transgen” olarak adlandırılan yabancı DNA parçası taşıyan hayvan olarak isimlendirilir. Transgenik hayvanların üretim tekniklerinin gelişimi biyoloji, tıp ve veteriner hekimlik alanındaki araştırmalar için çok sayıda yeni fırsatlar sağlamaktadır. Bu teknoloji aynı zamanda tarım, hayvan ve insan sağlığını içeren diğer alanlarda da yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu hayvanlar, geleneksel üretim metotlarının yerine laboratuvarda rekombinant DNA teknolojisinin kullanılmasıyla üretilir. Bunun için bir transgen (aktarılan gen), bir genin kontrol elementlerini (enhancer element ve promotor) ve buna ilaveten diğer bir genin protein kodlayan DNA baz dizisini (cDNA veya genomik DNA) içerebilir. Transgenin kontrol elementi transgenin ekspresyonunu kontrol eder. Bazı kontrol elementleri transgenin dışarıdan uyarılabilir ekspresyonunu sağlar; örneğin, metallothionin promotorlu bir transgenin ekspresyonu içme suyuna Çinko ve Kadmiyum’un ilave edilmesiyle uyarılabilir. Transgenik hayvanların üretiminde en yaygın olarak kullanılan yöntem pronükler DNA mikroenjeksiyondur [8]. Gen transferi, bir hücreli dönemdeki döllenmiş yumurtaların (zigotların) pronukleuslarına DNA mikroenjeksiyonu tekniği ile yapılır ve transfer edilen gen (transgen) embriyonun genomu içerisinde rastgele bir yere yerleşir. Bu rastgele gerçekleşen integrasyonun moleküler mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir [2]. Bu teknoloji sayesinde, doğal yetiştirme yöntemlerinden farklı olarak, pronükler DNA mikroenjeksiyon yöntemi ile türler arasında (türden türe) da gen transferi olayı gerçekleştirilebilmektedir. Örneğin; insan genleri, ekspresyon davranışlarının çalışılabilmesi amacıyla hayvan modellerinin üretilebilmesi için rodent genomu içerisine entegre edilebilmektedir [8]. Transgenik çalışmaların çoğu rodentler ile yapılmaktadır. rodentlerin transgenik çalışmalarda yaygın bir şekilde kullanılmalarının sebebi diğer türlerle karşılaştırıldığında maliyetlerinin az olması, biyolojilerinin yoğun biçimde bilinmesi, yavru sayısının çok olması (10-15 ad.), doğum (19-21 gün) ve östrus siklusunun (4 gün) kısa olmasıdır. Ek olarak, transgenik rodentler, genlerin fonksiyonlarının ve gen regülâsyonlarının canlı hayvanda çalışılmasına olanak sağlamaları bakımından diğer sistemlere göre daha üstün avantajlar sunmaktadırlar. Mikroenjeksiyon tekniği ile üretilen ilk transgenik rodent 1980 yılında elde edilmiştir [1]. O zamandan günümüze kadar yüzlerce transgenik rodent hattı geliştirilmiştir. Transgenik rodentler hastalık modeli olarak kanser, AIDS, kistik fibrozis, kronik hipertansiyon, Alzheimer, Sorumlu Yazar: Haydar Bağış, Tıbbi Genetik AD, Adıyaman Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Adıyaman, Türkiye. GSM: +905327337379 E-Mail: hbagis@adiyaman.edu.tr 80 of Clinical andand Analytical Medicine | Journal of Clinical Analytical Medicine 1Journal Transgenik Rodent Üretimi Transgenik Rodent Üretimi Hepatit B, Werner sendromu vs gibi alanlarda, yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde, fonksiyonu bilinmeyen genlerin araştırılmasında kullanılmaktadırlar. Bunlardan başka, transgenik hayvanlar organ naklinde (xenotransplantasyon),gen tedavisinde kullanılması düşünülen bazı vektörlerin araştırılmasında ve tıbbi öneme sahip bazı rekombinant proteinlerin süt, idrar ve kan gibi çeşitli dokularda üretilmesinde de kullanılmaktadır. Çeşitli rekombinant proteinlerin sözü edilen dokularda sentezlenmesi amacıyla üretilen transgenik hayvanlara “biyoreaktörler (Bacasız İlaç fabrikaları)” adı verilmektedir. Bu güne kadar 50-55 rekombinant proteinin transgenik rodent, tavşan, keçi, koyun, domuz ve ineklerin sütünde ekspresyonları sağlanmıştır [9]. Transgenik hayvan teknolojisi ile koyunların yapağı kalitesini artırmaya yönelik birçok çalışma yapılmıştır [10]. Mikroinjeksiyon tekniği ile elde edilen transgenik koyunlarda, yapağı veriminde önemli oranda artış sağlandığı bildirilmiştir. Koyunlarda yapağı kalitesinin artırılması için sistein biyosentezi değiştirilmiş ve sistein üretiminin artırılması sonucu yapağı üretim hızının artırıldığı bildirilmiştir. e)Nükleer Transfer Teknolojisi İle Transgenik Hayvan Eldesi Son yıllarda transgenik çiftlik hayvanlarının üretiminde klonlama teknolojisinden oldukça yararlanılmaktadır. Bunun için aktarılacak gen somatik hücrelere elektroporasyon ile aktarılır (konstrakt Neo resistantlık ve markır genlerini beraber taşımalı) gen transferi yapılan somatik hücreler seçildikten (yeşil görünen veya neomisine dirençli olanlar) sonra Metafaz-II aşamasındaki inek veya keçi yumurtalarının genetik materyali (iğ iplikleri) ve birinci kutup cismi enüklasyon pipeti ile dışarı alınır. Gen transferi yapılmış vücut hücresi (fibroblast, granuloza vs) enükle edilmiş yumurtaların perivitellin boşluğuna enjeksiyon pipeti ile transfer edilir. Hücre transfer sonrası hücrenin yumurtanın sitoplazması içine girmesi için elektrofüzyon yapılır. Füzyon sonrası bu yumurtalar aktive edilerek blastosist dönemine kadar kültüre alınır. Bu dönemde ya uygun bir alıcı ineğin uterusu içersine transfer edilir veya uygun bir dondurma tekniği ile bu embriyolar dondurularak saklanırlar. Bu teknoloji ile elde edilen yavrular hem klon hem de transgenik olacaklardır. Gen Transferinde Kullanılan Teknikler a)Viral Vektörlerle Gen Transferi Tekniği İnsan ve hayvanlara ait çok önemli genlerden bazılarının, ökaryotik viral vektörler aracılığı ile embriyolara nakli ve nakil işleminden sonra bu genlerin entegrasyon ve ekspresyonlarının sağlandığı bildirilmektedir. Bu vektörler, birçok DNA ve RNA karakterinde genetik materyal taşıyan, özellikle RNA karakterindeki genoma sahip olan virüslerden, retrovirüslerin dışardan verilen yabancı DNA ile kombinasyonundan elde edilen rekombinant vektörlerinin kullanılmasıyla transgenik canlılar elde edilmiştir. f)Pronükleer-Dna Mikroenjeksiyon Tekniği Transgenik hayvan üretiminde yukarda açıklanan çeşitli teknikler geliştirilmiş olmasına rağmen pratikte en yaygın kullanılanı tek hücreli embriyonun (zigot) bir pronukleusuna rekombinant DNA’nın doğrudan mikroenjeksiyon ile verilmesi en etkili yol olarak bilinmektedir. b)Embriyonik Kök Hücrelerine Gen Transferi Tekniği Bu teknikle, blastosistin “inner cell mass“ (ICM) hücrelerinden elde edilen embriyonik kök hücrelerine (stem cell) rekombinant DNA (transgen) elektroporasyon tekniği ile transfer edilir. Geni taşıyan 10-15 adet kök hücre seçilerek alıcı blastosistin blastosöl boşluğuna mikroenjeksiyon ile transfer edilir. Kök hücre transferi yapılan 4-10 adet blastosist taşıyıcı farenin kornu uterusuna cerrahi yöntem ile transfer edilirler. Transfer edilen kök hücreler blastosistin “inner cell mass“’leri birbirleri ile kaynaşarak kimerik fareler elde edilir. Kimerik fareler renk ayrımına göre yapılırlar. Renk ayrımında esas gen transferi yapılan kök hücreler siyah ve alıcı blastosistler ise beyaz farelerden elde edildikleri için doğan hayvanların bir kısmı siyah-beyaz (benekli) olacaktır. Seçim buna göre olacaktır. c)Spermatozooitlere Gen Transferi Tekniği Transferi düşülen gen (plazmid-DNA) spermalar ile beraber birlikte birkaç saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda gen transferi yapılan spermalar ile in vitro fertilizasyon yapılarak transgenin yumurtanın içerisine girmesi sağlanır. Ayrıca, kurutulan spermatozoitlere gen transferi yapıldıktan sonra spermatozoitin yumurtaya intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) tekniği ile aktarılması sağlanarak transgenik fare elde edilmiştir. d)Testislere Gen Transferi Tekniği Plazmid-DNA (sirküler formda) yalnız veya lipozomlar ile birlikte testislerin kapsulalarının altına bir ml’lik şırıngaya bağlı 30gauge’lik bir iğne yardımıyla verilir. Gen transferinden 2-4 gün sonra kaput ve korpus epididimislerde yapılan incelemelerde aktarılan genlerin varlığı tespit edilmiştir. 2 | Journal of Clinical and Analytical Medicine Pronükler DNA Mikroenjeksiyon Tekniği ile Transgenik Rodent Üretimi Aşamaları Transgenik hayvan üretiminde çeşitli teknikler geliştirilmiş olmasına rağmen pratikte en yaygın kullanılanı pronükleer safhadaki embriyonun (zigot) bir pronukleusuna rekombinant DNA’nın doğrudan mikroenjeksiyon ile verilmesi en etkili yol olarak bilinmektedir [8,11]. Transgenik hayvan üretiminde kullanılan prosedür aşağıda yazıldığı gibidir. a)Gen Konstraktlarının Dizaynı ve Hazırlanması Amaca uygun bir promotor-enhancer (beta-actin, CMV, betalaktoglobin vs) ve ekspresyon vektörü seçilir. Vektöre önce promotor ve daha sonra transgen (sub-cloning) klonlanır. Rekombinant vektörde bulunan promotor-transgen ve sonlandırıcı dizi (SV40 Poly A) restriksiyon endonüklaz enzimleri ile kesilerek çıkarılır ve agaroz jelden prüfiye edilir (kit ile). Elde edilen gen konstraktı Tris-EDTA tamponu ile konsantre edilir Elde edilen konstrakt hazırlanırken şu hususlara dikkat edilir. Plazmidin kesim şekline, genin kopya sayısına, DNA’nın büyüklüğüne (2-8 kb), temizliğine ve vektör sekanslarının olmamasına dikkat edilir [8]. Gen konstraktının yani dairesel plazmitin bir kısmının enzimler ile kesilerek çıkarılmış bölümü (linner kısım) embriyolara mikroenjeksiyon ile aktarılmaktadır. b)Embriyo Eldesi Rodentlerde ovulasyon ve çiftleşme günlük ışık periyodu ile ilişkili olduğundan, elde edilecek embriyoların ne zaman pronükleer dönemde olacakları yaklaşık olarak belirlenebilmektedir. Pronükleer safhadaki zigotların eldesinde, 10-12 haftalık ve ortalama 150-200 gram ağırlığındaki çeşitli soydaki (Spraque Dawley) sıçanlar kullanılmaktadır. Sıçan barınma odasında lambalar sabah 04.00 de yanıp akşam saat 16.00’da söner. Östrus senkronizasyon için PMSG ve hCG hormonları kullanılır. Bunun için saat 13.00-15.00 arasında 15 IU PMSG ve 48 sat sonra 10-15 IU dozu hCG periton içine enjekte edilir. hCG hormonunun Journal of Clinical and Analytical Medicine 81 Transgenik Rodent Üretimi Transgenik Rodent Üretimi enjeksiyonundan hemen sonra sıçanlar kafeslerde tekli olarak bekletilen fertil erkeklerle bire bir oranında çiftleştirmeye alınır. hCG enjeksiyonundan yaklaşık bir saat sonra vaginal plak kontrolü yapılır. Vajinal plakları görülen sıçanlar ayrı bir kafese toplanarak deneye alınırlar. Plak göstermeyen dişiler ayrılır ve gebelik şüphelerinden dolayı farklı bir kafeste bekletilirler. Plak gösteren tüm sıçanlar CO2 gazı ile itlaf edildikten sonra batın bölgeleri açılarak oviduktları M2 medyum içerisine alınır ve bu oviduktlardan zigotlar elde edilir. Elde edilen zigotlar R1ECM embriyo kültür medyumlarında kültüre alınır. Kültür ortamı olarak %5 CO2, %95 hava, 370C sıcaklık ve %90’nın üzerinde nem içeren inkübatörler kullanılır [12-13]. c)Mikroenjeksiyon İle Gen Konstraktının Aktarımı Pronukleer safhadaki embriyolar, çukur bir lamın ortasında bulunan ve üzeri mineral yağla kapatılmış olan 20-30 μl’lik M2 vasatının içine konur ve ters mikroskopun tablasına yerleştirilmekte ve mikroenjeksiyon setinde gerekli ayarlama işlemleri tamamlandıktan sonra önceden hazırlanan gen konstraktının 1-2 piko litresi mikroenjeksiyon ile erkek pronükleusun içine verilir [11]. Tüm embriyolarda gen aktarım işlemi tamamlandıktan sonra mikroenjeksiyon sonunda sağlam kalmış embriyolar gece boyu KSOM veya CZB vasatlarında % 5 CO2 ‘li ortamda kültüre edilirler. d)Embriyo Transferi ve Doğum Embriyo transferi için yaklaşık 30 ad. Olgun Sprague-Dawley soyu 13 haftalık alıcı dişi sıçanlar kulanılır. Alıcı sıçanların senkronizasyoun için vazektomize edilmiş erkek sıçanlar kullanılmaktadır. Senkronize edilen hayvanları anlamak için vaginal plaklarına veya vaginal semar alınarak içinde lökositlere varlığına bakılır. Vajinal plak gösteren sıçanlar, hCG enjeksiyonunu takiben 21. saatte erkeklerin yanından alınarak ameliyathaneye getirilir. Vaginal plaklı alıcı sıçanlar ketamin ve rompun ile genel anesteziye alınır ve anestezi altındaki sıçanlar sırt bölgesinden açılarak mikroenjeksiyon yapılmış embriyolar infundubulim bölgesinden transfer edilir. Her alıcı anneye 15-20 ad. Embriyo transfer edilebilir. Embriyo transferinden yaklaşık 19-21 gün sonra gebe kalan alıcı annelerin % 70-80’i doğurabilir [8]. e)Genomik DNA Eldesi ve Transgenin Tespit Edilmesi Embriyo transferi sonrası doğan yavrular 21 günlük yaşa eriştikleri zaman kuyruk dokularından 1’er cm kesilerek alınır ve bunlardan genomik DNA izolasyonları yapılır. Bu DNA’larda aktarılan transgenin varlığı için Shouthern blot, Slot blot veya PZR gibi moleküler teknikler kullanılır. Çalışmanın amacına göre, hemizigot veya homozigot rodentler kullanılır. Gen ekpresyonlarına bakmak için Northern blot (RNA ile yapılır), dokularda transkripte bakmak içinde RT-PZR ve protein ekspresyonlarına bakmak için Westhern blot yapılır. Transgenin varlığı tespit edilen yavrulara founder (anaç) ismi verilir ve F0 olarak değerlendirilir. Ancak doğan her anaç rodentden ayrı ayrı üretim hatları oluşturulur. Çünkü her anacın (F0) taşıdığı transgen kromozomların farklı yerlerinde olabilir. Her F0 anaç rodent normal rodentler ile çiftleştirilir ve bunlardan elde edilen F1 rodentler kendi aralarında çiftleştirilir. Bunlardan (%25 homozigot, %75 hemizigot ve %25 boş) elde edilecek erkek ve dişi homozigot rodentler kendi aralarında çiftleştirilerek hattın devamlılığı sağlanır. Elde edilen her homozigot rodent mutlaka normal rodentler ile geri çaprazlamaya alınır ve doğan bütün yavruların hepsinin hemizigot olması gereklidir. Şayet doğan rodentlerin hepsi transgenik değil ise transgenik lokus sıtabil 82 Journal of Clinical and Analytical Medicine 3 | Journal of Clinical and Analytical Medicine olmayabilir veya üreme hücrelerinde kaybolmuş olabilir. Ayrıca, bazı durumlarda transgen üreme hücrelerine girmemiş olabilir ve bu tür hayvanlar mozaik olarak değerlendirilir (yavrularına aktarılan geni transfer edemiyeceğinden dolayı). Bu gibi F0 hayvanları üretimde kullanmamak gerekir [11]. f) Embriyoların dondurulması Mikroenjeksiyon sonrası uygun alıcı rodentler bulunmadığı durumlarda embriyolar dondurularak saklanabilirler. İlk başarılı embriyo dondurma işlemi 1972 yılında fare embriyolarında gerçekleştirilmiştir [14]. Daha sonra Wilmut ve Rowson dondurup çözündürdükleri fare ve sığır embriyolarından gebelik elde ettiklerini bildirmişlerdir [15]. Yapılan bu ilk çalışmalarda DMSO (Dimetilsülfoksit) kriyoprotektan olarak kullanılmış ve dakikada 0,2C’lik bir soğutma hızı uygulanmıştır. Sonraki yıllarda farklı hayvan ve insan embriyoları başarılı şekilde dondurulmuştur [16-17]. Embriyo dondurma ve çözme işlemi, embriyolar kimyasal maddelerle (kriyoprotektan) dengelendikten sonra soğutulması ve -196 santigrat derecede sıvı nitrojen içinde depolanması, çözüldükten sonra da krioprotektan ortamından uzaklaştırılarak ileri gelişimi sağlamak için özel kültür ortamlarının içine alınması işlemlerini kapsamaktadır. Her iki işlem de çok dikkatli yapılmalıdır. Hücre yapısının korunabilmesi için hücrelerin düşük hızda su kaybetmeleri buna bağlı olarak da yavaş soğutma yöntemi ile dondurulmaları sağlanmalıdır. Soğutma sırasında içindeki saf su katılaşır ve sonuçta hücreye göre daha yoğun bir hal alır. Ancak yavaş soğutma yöntemi ile ufak hacimler soğutulduğunda bu kez aşırı soğuma oluşur ve solüsyon donma sıcaklığının altına kadar soğutulduğu halde buz kristalleri oluşur. Bu işlem çok ani olur ise embriyolar zarar görür. Bu zararı engellemek için seeding adı verilen bir teknik ile buz kristalleri çok yavaş oluşturulur. Embriyolar dondurma-çözündürme sonrası canlılık oranları türler arasında bazı farklılıklar göstermektedir. Buna neden olan unsurlar olarak; dondurma ve çözündürme işlemlerinde uygulanan donma ve çözünme hızları, embriyoların büyüklükleri ve gelişim dönemleri, hücrelerin geçirgenlik özellikleri ve kriyoprotektanların ozmotik özellikleri ile toksisiteleri sıralanabilir. Kriyoprezervasyon işleminde kullanılan yöntemleri geleneksel yavaş dondurma (slow freezing), hızlı dondurma (rapid freezing) ve vitrifikasyon olarak üç grupta incelemek mümkündür. Başlangıçta embriyoların dondurulmasında yavaş ya da kademeli soğutmayı gerektiren yavaş dondurma yöntemi kullanılmıştır. Geleneksel bir yöntem olan yavaş dondurmada, embriyoların dondurulması için çok pahalı ve komplike cihazlara gereksinim vardır. Hızlı dondurma işleminde ise, en az iki farklı kriyoprotektan madde ve yüksek donma hızları kullanılır. Yapılan çalışmalar sonucunda, 1985 yılında vitrifikasyon denilen embriyoyu dondurma sistemi geliştirilmiştir [18]. Bahsedilen bu iki yöntem sayesinde yavaş dondurma yönteminde gerekli olan pahalı ve komplike cihazlara olan gereksinim ortadan kalkmıştır. Vitrifikasyonda, buz kristallerinin hiç şekillenmediği vitröz ya da camsı bir durum yaratılarak, hücrelerin, dokuların ve organların direkt olarak sıvı azot içerisine daldırılmasıyla dondurulmaları sağlanmaktadır. Çeşitli kimyasalların sulu çözeltilerinin camsı yapı şekillendirme özelliklerinin önemli derecede değişkenlik gösterdiği belirlenmiştir. Donma ve çözünme işlemlerinde hücrelerin zarar görmesini önlemek amacıyla, dondurma ve çözündürme solüsyonları içerisine kriyoprotektan diye adlandırılan çeşitli kimyasal maddeler katılmaktadır. Günümüzde uygulanan dondurma Transgenik Rodent Üretimi yöntemlerinde çeşitli kriyoprotektanlar ile yavaş veya hızlı soğutma ve çözündürme yöntemleri kullanılmaktadır [16,19,20,21]. Uygulanmakta olan tüm dondurma yöntemlerindeki temel prensip, donma ve çözünme sırasında oluşabilecek hücre içi buz kristallerinin oluşumunu engelleyerek, hücrelerin buz kristallerinden görecekleri zararı önlemektir. Bunu sağlamak amacıyla hücre içi sıvısının, hücre membranından geçebilen başka bir deyişle nüfuz edebilen ve hücrelere olabildiğince zararsız olan kriyoprotektan maddelerle yer değiştirmesi hedeflenmektedir. Başarılı gamet ve embriyo dondurulması çalışmalarında embriyonun yaşamını doğrudan etkileyen nedenler olarak; dondurmada kullanılan kriyoprotektif ajanlar, embriyo soğutma oranları, embriyo saklama son sıcaklığı ve embriyo çözündürme oranları gibi kriyobiyolojik faktörler sıralanmıştır. Dondurma ile ilgili olarak kullanılan tüm yöntemlerin temel amacı, dondurma süresi boyunca hücre içinde şekillenen hücre içi buz kristallerinin oluşumunun ve çözündürme süresince şekillenecek yeniden kristalleşmenin önlenmesidir.Hücre içi buz kristallerinin şekillenmesinin önlenmesi için, hücre içi sıvının kriyoprotektan maddelerle yer değiştirmesi sağlanarak, embriyoların dehidre olması sağlanır.Dondurma-çözündürme sonu canlılık oranları türler arasında bazı farklılıklar gösterebilmektedir. Örneğin, domuz embriyoları dondurma işlemine karşı daha duyarlıdırlar. Embriyoların dondurulmasında başlangıçta yavaş ya da kademeli bir soğutmayı gerektiren yavaş dondurma (slow freezing) yöntemi kullanılmıştır. Geleneksel bir yöntem olan yavaş dondurmada, embriyoların dondurulması için çok pahalı ve komplike cihazlar gerekmektedir. Son 10-20 yıllık süreç içerisinde ise, dondurma ile ilgili yapılan çalışmalar daha çok sistemi kolaylaştırmaya yönelik olmuştur. Örneğin, tek aşamalı biçimde kriyoprotektan solüsyonun uzaklaştırıldığı veya hiçbir işlem uygulanmadan direkt transfere olanak sağlayan yöntemler geliştirilmiştir. İşlemlerin bu şekilde kolaylaştırılmasıyla, donmuş embriyolardan saha şartlarında yararlanma olanaklarının artırılması amaçlanmaktadır. İşlemlerin kolaylaştırılması için yapılmış çalışmaların sonucunda, 1985 yılında, vitrifikasyon denilen embriyo dondurma sistemi geliştirilmiştir. Böylece, yavaş dondurma yönteminde gerekli olan pahalı ve komplike cihazlara olan gereksinim ortadan kalkmıştır. Günümüzde, embriyoların ve oositlerin dondurulmasında vitrifikasyon yöntemi yaygın biçimde kullanılmaktadır. Vitrifikasyonda, buz kristallerinin hiç şekillenmediği vitröz ya da camsı bir durum yaratılarak, hücrelerin, dokuların ve organların direkt olarak sıvı azot içerisine daldırılmasıyla dondurulmaları sağlanmaktadır. Vitrifikasyon işleminde kriyoprotektan maddelerin soğutma işlemi boyunca buz oluşumunu önleyebilme yeteneği kritik bir unsurdur. Isı derecesi düşürüldükçe solüsyon bütün olarak oldukça viskoz bir hal alır ve sonunda tümüyle viskoz, camsı bir faza geçer. Transgenik Hayvan Modelleri ve Tıbbi Araştırmalarda Kullanımı Transgeniklerle yapılan çalışmalarda yöntemin süresi 6-7 ay sürmekte ve böylece standart 2 yıl süren biyolojik rodent uygulamasından daha kısa bir sürede sonuç alınmaktadır. Bundan başka uygun model seçildiğinde düzenleyici kurallar ve risk değerlendirmelerinde geçerlilik ve kolaylık sağladığından yanıtların daha doğru tahminini de sağlarlar. Böylece; spesifik genetik değişimlerden dolayı transgenik modeller tümörlerin başlaması ve gelişmesindeki mekanizmaların anlaşılmasında 4 | Journal of Clinical and Analytical Medicine Transgenik Rodent Üretimi büyük kazanç oluşturur. Transgenik rodentlerde farklı hastalık modelleri oluşturulmuştur. Bunların başında Alzheimer gelmektedir. Alzheimer hastalığı %50’den daha yüksek bir oranla en sık görülen demans tipidir. İlk olarak 1907 yılında Alman hekim Alois Alzheimer tarafından tanımlanmıştır. Alzheimer hastalığına benzer belirgin bir nöropatoloji sergileyen transgenik model ilk olarak rodentlerde yaratılmıştır. Bu modelde kalıtsal Alzheimer hastalığı ile ilişkili Kromozom 21’deki amiloid prekürsör protein (APP) V717F mutasyonu şifreleyen bir insan APP mini geni taşıyan rodentler (PDAPP rodentler) oluşturulmuştur [22]. PDAPP rodentlerin beyinlerinde Alzheimer hastalığında da gözlenen ekstrasellüler nitelikli tiyoflavin S-pozitif Aβ tortuları, nörotik plaklar, sinaptik kayıplar, astrositlerde ve mikroglialardaki dejenerasyonlar ortaya çıkmaktadır. Bu rodentlerdeki Aβ tortuları nöronal kayıplardan çok nötrofil değişiklikleri ile ilişkilidir [23]. Aβ tabakalarının oluşumunda ApoE geninin rolünü incelemek için ApoE geni ortadan kaldırılmış (ApoE knockout) rodentler oluşturulmuştur. ApoE geni yokluğunda Aβ tabakaları anlamlı ölçüde azalırken, APP ekspresyonu veya Aβ oluşumu değişmemiştir. Bu durum amiloid tortularının veya tabakalarının oluşumunda ApoE geninin katkısına işaret etmektedir [24]. Kistik fibroz hastalarının DNA’larının analiz edilmesi ve DNA dizilimlerinin hasta olmayan kardeşlerinin, anne ve babalarının ve sağlıklı kişilerin DNA dizilimleri ile karşılaştırılması sonucu, hastalığın CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) genindeki mutasyon sonucu ortaya çıktığı 1989 yılında belirlenmiştir. Knock-out, Knock-in ve Knock-down Rodent Üretimi Standard transgenik problemlerinden kaçınmak ve bir proteinin ekzojen ekspresyonunu çalışmak üzere knock-in rodentler oluşturulmaktadır. Homolog rekombinasyonla transgenin çok özel bir bölgesine hedeflenmesine olanak tanır. Yüksek düzeyde ekspresyon kasetini çevreleyen genetik çevrenin tüm kontrolünü elinde bulundurur ve transgen kendisini birden fazla bölgeye yerleştirmemiş olur. Bölgeye özgü “knock-in” ler transgenin nesilden nesile daha tutarlı ekpresyonuyla sonuçlanır çünkü ekspresyon kasetinin tek kopya olarak bulunduğu bilinmektedir. Hedeflenmiş transgen kritik lokus ile çakışmadığından araştırmacı oluşacak fenotipin proteinin ekzojen ekspresyonundan kaynaklandığından daha emin olur. Bu yaklaşım vektörü oluşturmak ve homolog rekombinasyona uğrayan hücreleri seçmek için klasik transgenik rodent eldesine göre daha fazla zaman gerektirir olur. Genin veya proteinin fonksiyonel domainin ortadan kaldırılması söz konusudur. Kimyasal mutagenez, rasgele mutasyon, gene trap yaklaşımı veya gen hedeflemesiyle knock-out rodent oluşturulabilir. Homolog rekombinasyon genden bir veya birden fazla ekzonun çıkarılmasına ve mutant veya kırpılmış protein üretimine veya sıklıkla protein oluşmamasına yol açar. Knock-out rodentlerin fenotipleri çok karmaşık olabilir çünkü rodentlerin tüm dokuları etkilenir, fakat knock-out rodentlerin embriyonik ölüm göstermeleri veya hiç fenotip göstermemeleri de olağandışı değildir. Bir gen knock-down, kromozomunda aktivitesi ya da ekspresyonu azaltılmış bir yahut birden fazla gen taşıyan bir genetiği değiştirilmiş organizmadır veya aktif bir gene ya da onun mRNA transkriptine komplementer dizisi olan kısa bir DNA ya da RNA (oligonükleotid) gibi bir reaktifin kullanılmasıdır. Bu oligonükleotit, özel bir genin ekspresyonunu azaltmak için buna benzer genetik değişikliklerin etkilerini kopyalayarak bu aktif gene (ya da onun transkriptlerine) bağlanır. Şimdiye kadar bu tür Journal of Clinical and Analytical Medicine 83 Transgenik Rodent Üretimi Transgenik Rodent Üretimi organizmalar, araştırma amaçları için çok fazla düzenlenenmiştir. Ayrıca knock-down organizma ya da basitçe knock-downlar olarak da bilinen bu organizmalar, bilinmeyen veya fonksiyonu tam olarak bilinmeyen, dizisi çıkarılmış bir gen hakkında daha fazla bilgi edinmek için ters genetik olarak bilinen deneysel bir yaklaşımla direkt olarak kullanılır. Araştırmacılar, ilgilenen genin etkisiz hale getirilmediği bireyler ile knockdown’ın nasıl farklı olduğu sonucunu araştırdılar. Knockdown, yukarıda açıklanan bir organizmayı düzenleme veya “bir geni knock down”da olduğugibi bir reaktif kullanarak gen ekspresyonunu baskılama süreçlerini içerir. Bir genin ekspresyonunu knock down etmek için kullanılan popüler reaktif-tabanlı metotlar, small interfering RNA (siRNA) ya da Morpholino oligoları kullanarak translasyonun baskılanmasını içermektedir [25]. Transgenik Hayvanların Sütünde Rekombinant Proteinlerin Üretimi Transgenik çiftlik hayvanı elde etmeden önce, bu gen konstraktları transgenik farelerde denenmelidir. Bu şekilde bu konstraktlar farelerde test edilerek konstraktın hakkında bilgi sahibi olunur. Şayet gen konstraktı ile ilgili integrasyon ve ekpresyon yönünden herhangi bir problem olmaz ise bu konstraktlar çiftlik hayvan embriyolarında kullanılabilir diye karar verilir. Bu konstraklar kullanılarak transgenik biyoreaktörler elde edilir ve elde edilen transgenik hayvanların süt, idrar ve kan gibi vücut salgılarında rekombinant proteinlerin üretilir [26-28]. Bu proteinlerin üretimi için, dokuya özgü güçlü promotorlara ihtiyaç vardır. Bunlardan bazıları, koyun -lactoglobulin, fare, rat, tavşan ve keçi whey asid protein (WAP), inek -s1 kazein, rat, tavşan ve keçi -kazein, guniea pig, koyun, keçi ve inek -lactalbumin gibi promotorlardır. Bu güçlü promotorlar, rekombinant proteinlerin sadece hedef dokularda (süt, kan ve idrar) salınmasını sağlarlar. Doğal haldeki süt protein geninin ya da bu genin düzenleyici dizisiyle birleştirilmiş füzyon genin ekspresyonunu, türler arasında bile meme bezine yönlendiren ve süt protein genlerinin 5’ (dokuya özgü transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgesi) ve 3’ ucunda yer alan translasyona katılmayan bölgelerde kısa korunmuş diziler içerildiği bilinmektedi. Hedef dokuya özgü bu tür düzenleyici DNA dizilerinin kullanılmasıyla herhangi bir genin ekspresyonu istenilen dokuda gerçekleştirilebilir. Süt bileşenlerinin genetik modifikasyonu, meme bezine spesifik düzenleyici diziler aracılığıyla ilgili yapısal genlerin yönlendirilebildiği füzyon genlerin oluşturulması stratejisine dayanmaktadır. Transgenik domuzların meme bezinde kemirgen whey asidik protein geninin ve transgenik farelerde koyun -laktoglobulinin yeterli düzeyde ekspresyonunun sağlandığı örneklerde olduğu gibi, hayvanların normalde sahip olmadıkları genlerin ürünü olan süt proteinleri, farklı türlerin meme bezlerinde eksprese edilebilmektedir. Örneğin, insan doku plazminojen aktivatörü, insan ürokinazı, insan büyüme hormonu ve insan 1-antitripsin gibi birçok farmasötik protein biyoreaktör farelerin meme bezinde üretilmiştir. Laktasyondaki farelerin sadece birkaç ml süt üretmelerinden dolayı farelerin biyoreaktör olarak kullanımları oldukça güçtür. Fakat iki yüz adet süt üreten fareden ham rekombinant protein (insan büyüme hormonu gibi) üretimi, meme bezinin disseksiyonuyla ve bunların soğukta birkaç saat süreyle inkübe edilmesiyle 1 grama kadar varan miktarlara yükseltilebilir. Tavşanlar ise süt verimleri endüstriyel uygulama sınırları içerisinde olduğundan biyoreaktör olarak kullanılabilirler ve günlük süt üretimleri dişi başına yaklaşık 100 gramdır. Ayrıca, kısa gebelik süresi (30 gün), çok sayıda yavru (onbeşe kadar) ve sütün yüksek protein içeriği (sığırınkinin üç katı) 84 Journal of Clinical and Analytical Medicine 5 | Journal of Clinical and Analytical Medicine transgenik tavşanların biyoreaktör olarak kullanımını sağlayan diğer avantajlardır. Transfer edilen genin ekspresyon düzeyinin (tavşan -kazein promotörünün kontrolü altında) düşük olmasına rağmen, araştırmacılar süt veren tavşanların biyoreaktör olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Bu bağlamda, insan interlökin-2 proteini ve insan doku plazminojen aktivatörü transgenik tavşanların sütlerinde eksprese edilmiştir. Transgenik biyoreaktörlerde salgılanan rekombinant proteinler genellikle proteolitik yıkımlanmaya karşı dayanıklıdırlar ve çok miktarda elde edilebilirler. Bu bize şimdiye kadar insan materyalinden ya da yetersiz hücre kültürlerinden üretilen proteinleri sınırsız miktarda üretme imkânını sağlamaktadır. Transgenik hayvanların vücut sıvılarından elde edilen rekombinant proteinler insan plazmasından elde edilenlerden çok daha saftır ve insan infeksiyon ajanlarını barındırmamaktadır (hepatit B ve C, HIV ve AIDS). Saflaştırma aşamasında viral inaktivasyon yapılması, transgenik hayvanların spesifik patojen-free şartlarda barındırılması ve üretim standartlarına uyulmasıyla rekombinant proteinler çok saf ve temiz olarak elde edilebilmekte ve böylece ürün kaliteleri yükseltilebilmektedir. İnsan plazmasında sadece eser miktarda bulunan proteinler, transgenik biyoreaktörlerde endojen düzeylerinin 100-500 katı oranında üretilebilmektedir. Alınan sonuçlar insan Factor VIII (kanın pıhtılaşmasını sağlayan mekanizmada rol oynayan proteinlerden biri) gibi üretilmesi çok zor olan proteinlerin bile transgenik biyoreaktörlerin meme bezinde sentezlenebileceğini göstermiştir [29]. Sonuç Transgenik hastalık modeli rodentler gün geçtikçe yaygın bir şekilde kullanılmaya devam etmektedir. Transgenik biyoreaktörlerde salgılanan farmasötik proteinler genellikle proteolitik yıkımlanmaya karşı dayanıklıdırlar ve çok miktarda elde edilebilirler. Bu bize şimdiye kadar insan materyalinden ya da yetersiz hücre kültürlerinden üretilen proteinleri sınırsız miktarda üretme imkânını sağlamaktadır. Transgenik hayvanların vücut sıvılarından elde edilen rekombinant proteinler insan plazmasından elde edilenlerden çok daha saftır ve insan infeksiyon ajanlarını barındırmamaktadır (hepatit B ve C, HIV ve AIDS). Rekombinant proteinlerin serum, süt veya idrardan saflaştırma aşamasında viral inaktivasyon yapılması, transgenik hayvanların spesifik patojen-free şartlarda barındırılması, üretim standartlarına uyulmasıyla rekombinant proteinler çok saf ve temiz olarak elde edilebilmekte ve böylece ürün kaliteleri yükseltilebilmektedir. Transgenik çiftlik hayvanlarının üretimi sonucunda yılda 500 kg ile 1 tona yakın rekombinant protein (alpha-antitripsin-III, faktör VIII ve IX vs) bu biyoreaktörlerin sütünden izole edilebilir. Tıbbi öneme sahip terapötik poteinlerin kullanımının sağlanması ile milyonlarca insan bunlardan çok daha kolay faydalanacak ve herhangi bir kontaminasyon riski ile karşı karşıya kalmayacaktır. Özellikle çiftlik hayvanlarında klonlama ve transgenik teknolojisinin gelişimine engel teşkil eden bazı teknik güçlükler ortadan kalktıkça bu üretim teknolojisi tüm dünyada pratik uygulama alanları bulabilecektir. Çok yakın zamanda transgen ve kopyalama teknolojileri yaşamın içinde kendine bir yer bularak uygulamaya dönüşebilirler. Bu teknolojiler sonunda transgen-klon domuzlar üretilip bunların bazı organları insanlara transfer edilebilir (xenotransplantasyon) (karaciğer gibi). Ayrıca, insanlarda kullanılan bazı tedavi edici proteinler (biofarming) transgenik hayvanların sütünden izole edilebilecektir. Ayrıca, terapötik kopyalama teknolojisinin ilerlemesi ile kişilere özgü blastositler ex-vivo ortamlarda üretilebilecektir. Üretilen bu blastositlerden elde edilecek ICM hücreleri (pluripotent hücreler) Transgenik Rodent Üretimi Transgenik Rodent Üretimi çeşitli ortamlarda her dokuya dönüşebilme özelliğine sahip olabilecektir. Özellikle de son yıllarda biyomühendislik bilim dalının gelişmesi ile de bu teknolojiler hız kazanacaktır. Böylelikle kişilere çok özel olarak organlar üretilebilecektir. Böylece bu teknolojiler sayesinde her yıl organ yetersizliği nedeniyle yaşamını kaybeden milyonlarca insan hayata döndürülebilecektir [30]. Kaynaklar 1. Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH. 1980. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Nat Acad Sci. USA 77, 7380-7384 2. Brinster RL, Chen HY, Trumbauer ME, Yagle MK, Palmiter RD. 1985. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci 82: 4438-4442 3. Bağış H, Papuççuoğlu S . 1997. Studies on The production of Transgenic Mice. T Jr of Vet Anim Sci 21 (4): 287-292. 4. Bagis H, Aktoprakligil D, Mercan HO, Yurdusev N, Turgut G, Sekmen S, Arat S, Cetin S. 2006a. Stable transmission and transcription of Newfoundland ocean pout type III fish antifreeze protein (AFP) gene in transgenic mice and hypothermic storage of mouse gamets with AFP. Mol.Rep.Dev. 73: 1404-1411. 5. Bagis H, Arat S, Mercan HO, Aktoprakligil D, Caner M, Turanlı ET, Baysal K, Turgut G, Sekmen S, Cirakoglu B. 2006b. Stable transmission and expression of the hepatitis B virus genome in hybrid transgenic mouse until F10 generation. J Exp Zoo 305A. 6. Bagis H, Tas A, Kankavi O. 2008a. Determination of the Expression of Fish Antifreeze Protein (AFP) in several Tissues and Serum of Transgenic Mice in F7 generation at the Room Temperatura. J Exp Zool Part A Ecol Genet Physiol. 309: 255-61. 7. Bagis H, Akkoc T, Tas A, Aktopraklıgil D. 2008b. Cryogenic Effect of Antifreeze Protein on Transgenic Mouse Ovaries and Production of Live Offspring by Orthotopic Transplantation of Cryopreserved Mouse Ovaries. Mol. Rep.Dev. 75: 608-613. 8. Hogan B, Beddigton R, Costantini F, Lacy, E .1994. Manipulating the mouse embryo:A laboratory manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 494p. expressing small interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 2003 100:1844-1848 9. Stinnakre M.-G., Devinoy E., Thepot D., Chene N., Bayat-Samardi M., Grabowski H. and Houdebin L.-M. (1992) Quantitative collection of milk and active recombinant proteins from the mammary glands of transgenic mice. Anim. Biotechnol. 3, 245-255. 10. Roger, G.E. 1990. Improvement of Wool Production Through Genetic Engineering. TRENDS in Biotechnol., 8: 6-11 11. Bağış H, Keskintepe L.2001. Application of Green Flourescent Protein as a Marker for Selection of Transgenic Mouse Embryos before Implantation. Turk J of Biology 25 (2):123-131. 12. Pinkert, CA. 1994. Transgenic Animal Technology. A Laboratory Handbook Academic Press. 13. Akkoc T. 2007. Sıçan embriyo eldesi ve değişik gelişim dönemlerinde bulunan sıçan embriyolarının vitrifikasyon yöntemiyle dondurulması. Trakya Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü. 14. Whittingham Dg, Leibo Sp, Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to –196 and -269C. Science 1972; 178: 411-414. 15. Wilmut I, Rowson Lea. The successful low temperature preservation of mouse and cow embryos. J. Reprod. Fertil. 1973; 33: 352-353. 16. Bağış H, Odaman H, Sağırkaya H, Dinyéss A. 2002. Production of Transgenic Mice from Vitrified PronuclearStage Embryos. Mol Reprod Dev 61:3. 17. Lane M, Bavister BD, lyons EA, Forest KT (1999): Containerless vitrification of mammalian oocytes and embryos. Nat Biotecnol. 17: 1234-6 18. Rall Wf, Fahy Gm. Ice-free cryopreservation of mouse embryos. Nature 1985; 313: 573-574. 19.Bagis H., Mercan Odaman H. (2004a): Effect of Culture Medium Supplemented With Beta Mercaptoethanol and Amino Acids on Implantation and Development of Different Stage In Vivo- or In Vitro-Derived Mouse Embryos. Mol Reprod Dev. 69: 52-59. 20. Bagis H., Sağırkaya H., Odaman H., Dinyéss A. (2004b): Pronuclear-stage mouse embryos vitrification on solid surface (SSV) vs. in cryotube: Comparison of the effect of equilibration time and different sugars in the vitrification solution. Mol.Reprod.Dev. 67:186-192. 21. Bagis H. Mercan Odaman H.,Cetin S, Sekmen S (2005): The Effect of Equilibration Time on Survival and Development Rates of Mouse Pronucler-Stage Embryos Vitrified in Solid Surface (SSV) and Convential Straws: In Vitro and In Vivo Evaluations. . Mol Reprod Dev. 72: 494-501.22. 22. Games D, Adams D, Alessandrini R ve ark. (1995) Alzheimertype neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F β-amyloid precursor protein. Nature, 373:523-527. 23. Irizarry MC, McNamara M, Fedorchank K ve ark. (1997). Appsw transgenic mice develop age-related Aβ deposits and neutrophil abnormalities, but no neuronal loss in CA1. J Neuropathol Exp Neurol, 56:965-973. 25. Tiscornia G, Singer O, Ikawa M, Verma IM. A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors 27. Clark AJ, Bessos H, Bishop JO, Brown P, Harris S, Lathe R, McClenaghan M, Prowse C, Simons J, Whitelaw CBA, Wilmut I. 1989. Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep. Biotechnology 7, 487-492. 28. Houdebine LM. 2000. Transgenic animal bioreactors. Transgenic Research 9: 305-320. 29. Wall RJ, Pursel VG, Shamay A, McKnight RA, Pittius CW, Hennighausen L. 1991. High-level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine. Proc Nat Acad Sci. USA 88: 1696-1700. 30. White D, Dunning J. 1994. Wal1work J. Transgenic pigs as potential donors for xenografts. Nefrología 14: 7073. 6 | Journal of Clinical and Analytical Medicine Journal of Clinical and Analytical Medicine 85
