DNA İzolasyonu Yöntemin prensibi: Hücrelerin lizis solüsyonu

DNA İzolasyonu
Yöntemin prensibi: Hücrelerin lizis solüsyonu yardımıyla lize edilmesi, DNA, RNA
ve proteinlerin açığa çıkması, proteinlerin tuzla çöktürülmesi sonrasında DNA’nın
izolasyonudur.
Malzemeler
1. Lizis solüsyonu
0.5 M Tris-HCl pH 8.0,
20 mM EDTA
10 mM NaCl
1% SDS
0.5 mg/mL proteinase K
2. Doygun NaCl (6M)
3. Etanol (%96, %70)
Uygulama Basamakları
1. Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir
gece bekletilir.
2. 1 mL doygun NaCL eklenir.
3. Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir.
4. 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir.
5. Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır.
6. Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst
edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.
7. Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır.
Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
8. %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt
üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
9. DNA havada kurutulur.
10. Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10 dakika
tutulur.
11. Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran
>1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile
çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.
Kaynaklar:
1. Miller S.A, Dykes D.D, Polesky H.F.(1988). A simple salting out procedure for
extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16(3):1215
2. Tuo J, Jaruga P, Rodriguez H, Bohr VA, Dizdaroglu M. (2003) . Primary
fibroblasts of Cockayne syndrome patients are defective in cellular repair of 8hydroxyguanine and 8-hydroxyadenine resulting from oxidative stres. FASEB J. 17,
668–674.
3. Tuo, J., Mu¨ftu¨oglu, M., Chen, C., Jaruga, P., Selzer, R. R., Brosh, R. M., Jr.,
Rodriguez, H., Dizdaroglu, M., and Bohr, V. A. (2001). The Cockayne syndrome
group B gene product is involved in general genome base excision repair of 8hydroxyguanine in DNA. J. Biol. Chem. 276, 45772–45779