Mikrobiyal ekoloji

Klonlama basamakları:
1. Vektörü içeren plazmid DNA ile hedef geni içeren kromozomal DNA hücrelerden
saflaştırılır.
2. Kromozomal DNA’daki hedef genin yakınında bulunan RE kesim bölgesine uygun bir RE
kesim bölgesi önceden kullanılacak vektörün polilinker bölgesinde bulunan uygun RE
kesim bölgesi ile karşılaştırılır.
3. Her iki DNA^da aynı RE enzimi ile kesilerek yapışkan uçlar oluşturulur.
4. DNA molekülleri aynı tüpün içerisine koyularak DNA ligaz enzimi ile birleştirilir.
5. Plazmit vektöre insert olan DNA’lar ligaz enzimi ile birleştirilerek rekombinant bir vektör
elde edilir.
6. Her plazmit mutlaka istenilen geni içermeyebilir ve yeniden geni insert etmeden
kapanabilir.
7. Bu aşamada aynı tüpe koyulacak hem hedef DNA hem de vektörün miktarı çok önemlidir
ve iyi ayarlanmalıdır.
8. Ortamda bulunan rekombinant plazmitler veya insert almamış plazmitler uygun konağa
transformasyonla aktarılır.
9. Konak bakteri hücresi uygun besiyerinde çoğaltılır.
10. İnsert DNA’yı içeren vektörün varlığını belirleyebilmek için doğru klon, antibiyotik
direnci veya lacZ geni gibi bir raportör gen yönünden taranır.
11. İşaretleyici gen yönünden pozitif olan doğru klonlar petriden seçilir.
12.İnsert DNA’yı içeren doğru klonun varlığı; dizileme veya probla hibridizasyon gibi
yöntemlerle belirlenerek hücre çoğaltılır.
13.Böylece istenilen geni içeren çok sayıda klonla DNA çoğaltılıp konak bakteri içersinde
saklanabilir.
14. Bu şekilde farklı kaynaklardan gelen birden fazla gen füzyona uğratılabilir.